JP3734593B2

JP3734593B2 - Novel expression plasmid vector and method for producing heterologous gene product using Bacillus bacteria containing the expression plasmid vector

Info

Publication number: JP3734593B2
Application number: JP12157597A
Authority: JP
Inventors: 好司八代; 省吾恵比須; 広明高木
Original assignee: ヒゲタ醤油株式会社
Priority date: 1997-04-25
Filing date: 1997-04-25
Publication date: 2006-01-11
Anticipated expiration: 2017-04-25
Also published as: JPH10295378A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バイオテクノロジーに関するものであり、更に詳細には、本発明は新規発現プラスミドベクター及び異種遺伝子を結合した該発現プラスミドでバチルス属細菌を形質転換し、該形質転換体を培養し、培養物中に異種遺伝子産物を生成蓄積せしめこれを採取することを特徴とする該異種遺伝子産物の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、食品、薬品、化粧品その他の産業において、遺伝子組換え技術及び組換え体を用いて生産した異種遺伝子産物が広く利用されている。遺伝子組換えの宿主としては、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）などの細菌や酵母、糸状菌または動物細胞などが使用されているが、遺伝子組換え技術は大腸菌の系を中心に発展してきたため、大腸菌が宿主菌として最も頻繁に用いられている。
【０００３】
しかし大腸菌を宿主とする系では、生産される異種遺伝子産物は細胞質中またはペリプラズム空間にとどまり、培地中へ分泌生産させることは困難であった。また、細胞内の異種遺伝子産物の蓄積は量的に限界があり、その上菌体を破砕して回収しなければならず、菌体内成分である核酸などの共存物質から目的とする異種遺伝子産物を分離、精製することが必要であった。さらに、生産されたペプチドやタンパク質が封入体（inclusion body）を形成するものもあり、封入体が形成された場合再生操作を行って活性型にする必要があるなどの欠点があった。
【０００４】
バチルス属細菌には酵素タンパク質を大量に分泌生産するものが多く、この性質を利用した宿主ベクター系の開発が活発に行われている。バチルス属細菌、なかでも枯草菌は、遺伝学的にも生化学的にもよく研究され、異種遺伝子産物の分泌生産に関する研究も数多くなされている。しかし、枯草菌を宿主とする系では菌体内外の強いプロテアーゼにより生産したペプチドやタンパク質などの異種遺伝子産物が分解されてしまうなどの問題があった。
【０００５】
これらの欠点を解消し、異種遺伝子産物を効率的に生産する宿主を求めて鋭意研究を行ったところ、鵜高らは、バチルス・ブレビスには菌体外にプロテアーゼを生産しない菌株が多いことを見いだし、その１菌株バチルス・ブレビス４７（S. Udaka and H. Yamagata, Methods in Enzymology、217 23-33(1993)）の主要菌体外蛋白質（H. Yamagata et al, J. Bacteriol., 169, 1239(1987)；塚越規弘、日本農芸化学会誌、61, 68(1987)にそれぞれ“outer wall protein and middle wall protein”、“主要菌体外蛋白質”として記載されている。）遺伝子のプロモーター及び該主要菌体外蛋白質の１種であるＭＷタンパク質（middle wall protein：MWP）のシグナルペプチドをコードする領域を用いて分泌ベクターを作製し、本菌株を宿主としてα−アミラーゼ（H. Yamagata et al, J. Bacteriol., 169, 1239(1987)）やブタペプシノーゲン（鵜高重三、日本農芸化学会昭和６２年度大会講演要旨集、ｐ８３７−８３８；塚越規弘、日本農芸化学会誌、61, 68(1987)）の分泌生産に成功した。
【０００６】
また、高木らは、プロテアーゼを菌体外に生産しない菌株バチルス・ブレビスＨＰＤ３１（なお、この菌株はバチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭＢＰ−１０８７）と同一菌株である）を分離し、そしてこのバチルス・ブレビスＨＰＤ３１を宿主として耐熱性α−アミラーゼの高分泌生産（H. Takagi et al, Agric, Biol. Chem., 53, 2279-2280(1989)）に成功した。さらに、山形らは、ヒト上皮細胞増殖因子（human Epidermal Growth Factor：h-EGF）の高分泌生産（H. Yamagata et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86, 3589-3593(1989))にも成功している。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
このバチルス・ブレビスをはじめ、バチルス属細菌を宿主とする異種遺伝子産物の生産系に用いる発現プラスミドベクターは、バチルス属細菌で複製可能なプラスミドを用い、発現調節領域として適合するプロモーター及びＳＤ配列を組み込み、さらにその下流には翻訳開始コドンから始まる分泌シグナル配列、異種遺伝子、ターミネーターを接続している。この時に使用される発現プラスミドベクターは、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来のプラスミドｐＵＢ１１０（T. McKenzie, et al., Plasmid. 15, 95-103(1986))をベースに構築されたものが多い。
【０００８】
ｐＮＨ２００、ｐＮＨ４００（Ishihara, T., et al. J. Bacteriol., 177, 745-749(1995))、ｐＮＨ３００は、ｐＵＢ１１０をベースに構築された発現プラスミドベクターで、バチルス・ブレビスを宿主菌とする系で頻繁に利用されている。このｐＮＨ系の発現プラスミドベクターは前記したＭＷＰのプロモーター（配列番号１）を使用しているが、従来５個タンデムに存在するＭＷＰプロモーターをそのまま用いたものがｐＮＨ２００であり、５個から３個に減少させたものがｐＮＨ４００、１個に減少させたものがｐＮＨ３００である。異種遺伝子の発現においては必ずしも強いプロモーターを有することが高生産性を示すとは限らず、高生産形質転換株を得るためにプロモーター活性の強弱の異なるどのベクターを使用するかを検討することは重要である。
【０００９】
しかし、これらｐＮＨ系で代表されるｐＵＢ１１０系の発現プラスミドベクターは、その分子内にｐＵＢ１１０由来のブレオマイシン（Bleomycin）耐性遺伝子を保有しており、このブレオマイシン耐性遺伝子から翻訳された蛋白質の発現量が多く、目的とする異種遺伝子産物の発現の阻害要因の１つになっている可能性があった。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはこのような現状に鑑み、バチルス属細菌で安定かつ高発現が可能な発現プラスミドベクターを開発すべく鋭意検討を行った。
【００１１】
本発明者らは、ｐＮＨ系で代表されるｐＵＢ１１０系の発現プラスミドベクターからブレオマイシン耐性遺伝子を除去した新規発現プラスミドベクターｐＮＹを構築し、バチルス・ブレビスを形質転換して異種遺伝子産物を生産させたところ異種遺伝子産物の生産量がｐＮＨ系の発現プラスミドベクターに比べて増加することを確認し本発明を完成した。
【００１２】
すなわち本発明は、バチルス属細菌で安定かつ高発現が可能な新規発現プラスミドベクターに関するものである。また本発明は、この発現プラスミドベクターに目的とするペプチドやタンパク質などの異種遺伝子産物をコードする遺伝子を連結した発現プラスミドでバチルス属細菌を形質転換し、該形質転換体を培養することによる異種遺伝子産物の製造方法に関するものである。
以下、本発明について詳しく説明する。
【００１３】
本発明発現プラスミドベクターは、ブレオマイシン耐性遺伝子を除去したｐＵＢ１１０由来のプラスミドに関するものであり、その分子内にはバチルス属細菌の遺伝子より調製した発現調節領域の遺伝子を保有させることができる。
発現調節領域は、転写開始部位であるプロモーター及びリボソーム結合領域（ＳＤ配列）を含むが、本発明プラスミドベクターの発現調節領域のプロモーターとしては、バチルス属細菌の遺伝子より調製し、バチルス属細菌内で機能するプロモーターであればどのプロモーターを使用してもよい。
【００１４】
例えば、バチルス・ブレビスのＭＷＰプロモーター（配列番号１：前述）やＨＷＰプロモーター（配列番号２：特公平８−４５１１）、バチルス・ズブチリスのＳｐａｃプロモーター（Methods in enzymology, 185, 199-228(1990))やレバンスクラーゼプロモーター(Appl. Environ. Microbiol., 55,2739-2744(1989))、バチルス・アミロリキファシエンス（B. amyloliquefaciens）のアルカリプロテアーゼプロモーター（Methods in enzymology, 185, 1992-228(1990))やα−アミラーゼプロモーター（J. Bacteriol., 165, 796-804(1986)）または中性プロテアーゼプロモーター（J. Biotechnol., 3, 73-84(1985))、バチルス・sp.KSM-64のエンドヌクレアーゼプロモーター（Biosci. Biotech. Biochem., 59, 2172-2175(1995)）そしてバチルス・ステアロサーモフィラス（B. stearothermophilus）の耐熱性枝つくり酵素プロモーター（Appl. Environ. Microbiol., 60, 3096-3104(1994))などバチルス属細菌の遺伝子より調製したプロモーターを使用することができる。
【００１５】
これらのプロモーターはこれらのプロモーターを保持する細胞から遺伝子組換え法によって調製してもよいし化学的に合成したものを用いてもよい。遺伝子組換えによって調製する場合には、例えばプロモーターを保有する細胞のゲノムＤＮＡを鋳型とし、プロモーターの塩基配列を基に調製したプライマーＤＮＡを用いポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法（Molecular Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989）で調製することができる。
【００１６】
一方、化学合成法としては、例えば、１００塩基以下の長鎖のＤＮＡを合成する場合にはホスホアミダイト法（Methods Enzymol., 154, 287-313(1987))によって市販のＤＮＡ合成機で合成することができる。１００塩基以上のＤＮＡの場合には、塩基配列を１００塩基未満の長さに区切り、それぞれのＤＮＡ断片を前記のように化学合成した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてこれらのＤＮＡ断片を連結すればよい。
【００１７】
ＳＤ配列もバチルス属細菌の遺伝子より調製したものを使用すればよい。例えばバチルス・ブレビスや枯草菌の１６ＳｒＲＮＡの配列に対応して合成した配列を使用すればよく、具体的には図２及び図３に示したＳＤ１やＳＤ２などを用いることが出来る。
【００１８】
このバチルス属細菌由来のプロモーター及びＳＤ配列を含む発現調節領域遺伝子は、ブレオマイシン耐性遺伝子を除去したｐＵＢ１１０由来の分子内のＯｒｉ領域（複製開始点）、Ｒｅｐ領域（複製開始タンパク質遺伝子）、Ｎｍ r領域（ネオマイシン耐性遺伝子）以外のどの部分に組み込んでもよく、その数も特に制限されない。
例えば、図１に示すブレオマイシン耐性遺伝子を除去したプラスミドｐＵＢ１１０由来のプラスミドベクターにおいて、Ａ、Ｂ、及び／又はＣで示した領域に発現調節領域遺伝子を保有させることができる。
【００１９】
また、発現調節領域の下流には各種制限酵素切断部位を設けたマルチクローニングサイトを組み込んでおけば、各種異種遺伝子のクローニングが容易である。マルチクローニングサイトとしては図２及び図３に示した配列などを用いることが出来る。
さらにペプチドやタンパク質などの異種遺伝子産物をコードする遺伝子の下流、すなわち３′側に転写終了遺伝子であるターミネーターを連結してもよい。ターミネーターは特に限定されず、例えば、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１株より単離したＨＳ遺伝子（図２、図３）等のターミネーターを用いればよい。
【００２０】
本発明の発現プラスミドベクターの構築にはスタフィロコッカス・アウレウス由来のｐＵＢ１１０系の発現プラスミドベクターを用いることができる。ｐＮＨ系の発現プラスミドベクターは、ｐＵＢ１１０にＭＷＰのプロモーターを組み込んだ発現プラスミドベクターであり、本発明発現プラスミドベクターの構築に利用できる。具体的にはプロモーターの数が１個のｐＮＨ３００シリーズ（後述）やプロモーターの数が３個のｐＮＨ４００シリーズ（Ishihara, T., et al. J. Bacteriol., 177, 745-749(1995))やプロモーターの数が５個のｐＮＨ２００シリーズを用いることができる。
【００２１】
このｐＮＨ系の発現プラスミドベクターの中のｐＵＢ１１０由来のブレオマイシン耐性遺伝子以外の部分をプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲ法によって増幅、回収した後ライゲーションを行えば、ブレオマイシン耐性遺伝子が除去された新規発現プラスミドベクターｐＮＹを得ることができる。
例えば、ｐＮＨ３００シリーズの発現プラスミドベクターを鋳型にＰＣＲを行えばＭＷＰプロモーターが１個の発現プラスミドベクターｐＮＹ３００シリーズを得ることが出来、ｐＮＨ４００シリーズの発現プラスミドベクターを鋳型にＰＣＲを行えばプロモーターが３個の発現プラスミドベクターｐＮＹ４００シリーズを、ｐＮＨ２００シリーズの発現プラスミドベクターを鋳型にＰＣＲを行えばプロモーターが５個の発現プラスミドベクターｐＮＹ２００シリーズを得ることが出来る。
【００２２】
こうして調製した本発明の発現プラスミドベクターに連結する有用なペプチドやタンパク質などの異種遺伝子産物をコードする遺伝子は、バチルス属細菌で発現可能な遺伝子であれば何れの生物由来の遺伝子でもよく、ヒト、動物、鳥類、魚類、微生物、ウイルスその他各種生物由来の遺伝子産物（酵素、ホルモン、サイトカイン、免疫グロブリンその他生理活性ペプチド、抗原蛋白質など）の生産に適用できる。
【００２３】
これらの異種遺伝子産物をコードする遺伝子は、公知の方法に従って本発明発現プラスミドベクターのプロモーター、ＳＤ配列、シグナルペプチドをコードする遺伝子の下流のクローニング用制限酵素サイトに組み込めばよく、例えば、モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Molecular Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989）に記載の方法で行えばよい。
【００２４】
遺伝子の発現に用いる宿主としては、バチルスに属する細菌であればよく、例えば、バチルス・ブレビス、バチルス・チョーシネンシス（B. choshinensis）などが好適に使用できる。
【００２５】
宿主菌を形質転換する方法は公知の方法でよく、例えば、バチルス・ブレビス、バチルス・チョーシネンシスではTakahashiらの方法（J. Bacteriol., 158, 1130(1983))またはTakagiらの方法（Agric. Biol. Chem., 53, 3099-3100(1989))などが例示される。
【００２６】
得られた形質転換体の培養に用いる培地は、形質転換体が生育して目的とする異種遺伝子産物を生産しうるものであれば如何なるものでもよい。
該培地に含有させる炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、グリセロール、澱粉、デキストリン、糖蜜、有機酸などが用いられる。また窒素源としては、カゼイン、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、尿素、グリシンなどの有機窒素源、硫酸アンモニウムなどの無機窒素源などが用いられる。その他、塩化カリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウムなどの無機塩が必要に応じて培地に加えられる。栄養要求性を示す菌は、その生育に必要な栄養物質を培地に添加すればよい。該栄養物質としては、アミノ酸類、ビタミン類、核酸などが挙げられる。
【００２７】
また、培養に際して必要があれば、培地に抗生物質例えばペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、バシトラシン、Ｄ−サイクロセリン、アンピシリン、ネオマイシンなどを加える。更に必要により、消泡剤、例えば大豆油、ラード油、各種界面活性剤などを培地に加えてもよい。
【００２８】
培地の初発ｐＨは、５．０〜９．０、さらに好ましくは６．５〜７．５である。培養温度は、通常、１５℃〜４２℃、さらに好ましくは２４℃〜３７℃であり、培養時間は、通常、１６〜１６６時間、さらに好ましくは２４〜９６時間である。
【００２９】
本発明で、形質転換体を前記の条件で培養することによって、培養物中に異種遺伝子産物が生成、蓄積される。このようにして得られた異種遺伝子産物は、公知の方法により、例えば膜処理、硫安分画法、クロマトグラフィーなど（蛋白質・核酸の基礎実験法、南江堂、（1985)）で精製することができる。
【００３０】
以下本発明を実施例により更に詳しく説明するが、これは例示的なものであり、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３１】
【実施例１】
プラスミドベクターｐＮＹ３０１の構築
【００３２】
（１）ｐＮＨ３０１の構築
ＭＷＰ遺伝子のＰ５プロモーター、シグナル配列を得るために、ｐＮＵ２１０（S. Udaka, et al. Methods in Enzymology, 217, 23-33(1993))を鋳型に、配列番号３のプライマーと配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【００３３】
ＰＣＲは、配列番号３のプライマーと配列番号４のプライマーを各々１００ｐｍｏｌ、Ｔａｑポリメラーゼ２．５単位、ｄＮＴＰ２００μＭ、ｐＮＵ２１０鋳型ＤＮＡ１ｎｇ、１００μｌＴａｑ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）、２．５ｍＭＭｇ++、５０ｍＭ塩化カリウム、１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）を混合し、９６℃で３０秒保持した後、ＤＮＡの熱変性（９４℃、６０秒）、プライマーのアニーリング（５４℃、６０秒）、プライマーの伸長（７０℃、６０秒）を２５サイクルさせることによって行った。
【００３４】
ＰＣＲで増幅した約２６０ｂｐの遺伝子を制限酵素ＡａｔIIとＸｂａＩで切断し、プラスミドｐＧＥＭ−７Ｚｆ（プロメガ社製）のＡａｔII，ＸｂａＩサイトにＴ４リガーゼを用いて連結後、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９に形質転換し、プラスミドｐＧＥＭ−Ｐ５を得た。
【００３５】
バチルス・ブレビスＨＰＤ３１の染色体より得た約１５０ｂｐのステムループ構造を有するＨＳ遺伝子（ターミネーター遺伝子：特願平８−１２３９７０）の両端がＨｉｎｄIIIとＮｓｉＩサイトになるように前記と同じ条件にてＰＣＲで増幅し、ｐＧＥＭ−Ｐ５のＨｉｎｄIIIとＮｓｉＩサイトに挿入し、ｐＧＥＭ−Ｐ５ＨＳを得た。
【００３６】
ｐＧＥＭ−Ｐ５ＨＳをＡａｔIIとＮｓｉＩで切断しＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化したＤＮＡ断片４５４ｂｐを、ｐＵＢ１１０（T. McKenzie, et al, Plasmid, 15. 95-103(1986))をＰｖｕIIとＡｃｃＩで切断後ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した３４４７ｂｐのＤＮＡ断片に連結し、これをバチルス・ブレビスＨＰＤ３１にエレクトロポレーション法（Agric. Biol. Chem., 53, 3099-3100(1989))で導入しプラスミドベクターｐＮＨ３０１を得た。
ｐＮＨ３０１の制限酵素地図及びプロモーターを含む一部の塩基配列を図２に示した。
【００３７】
（２）ｐＮＹ３０１の構築
ｐＮＨ３０１を鋳型に、配列番号５のプライマーと配列番号６のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【００３８】
ＰＣＲは、配列番号５のプライマーと配列番号６のプライマーを各々１００ｐｍｏｌ、Ｔａｑポリメラーゼ２．５単位、ｄＮＴＰ２００μＭ、ｐＮＨ３０１鋳型ＤＮＡ１ｎｇ、１００μｌＴａｑ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）、２．５ｍＭＭｇ++、５０ｍＭ塩化カリウム、１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）を混合し、９６℃で３０秒保持した後、ＤＮＡの熱変性（９４℃、６０秒）、プライマーのアニーリング（５４℃、１２０秒）、プライマーの伸長（７０℃、１８０秒）を２５サイクルさせることによって行った。ＰＣＲで増幅した約３．４ｋｂの遺伝子をＳｓｅ８３８７Ｉで切断、Ｔ４リガーゼを用いて連結しバチルス・プレビスＨＰＤ３１にエレクトロポレーション法で導入し、プラスミドベクターｐＮＹ３０１を得た。
【００３９】
ｐＮＹ３０１の制限酵素地図及びプロモーターを含む一部の塩基配列を図３に示した。プラスミドベクターｐＮＹ３０１を保持するバチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＹ３０１は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＰ−１５９３４として寄託されている。
【００４０】
【実施例２】
プラスミドベクターｐＮＹ３０１の形質転換効率
実施例１で得たプラスミドベクターｐＮＹ３０１及びｐＮＨ３０１各々１ｎｇをバチルス・ブレビスＨＰＤ３１にエレクトロポレーション法で導入した。反応終了後、各々の反応液１μｌをＴＭＮ平板培地（ネオマイシン５０μｇ／ｍｌを含む）に塗抹し、生じたコロニーを計数し、各々のプラスミドベクターの形質転換効率を求めた。
表７に結果を示した。プラスミドベクターｐＮＹ３０１はｐＮＨ３０１に比べ５倍以上の形質転換率を示し、より効率的に宿主に形質転換出来ることが分かった。
【００４１】
【表７】

【００４２】
【実施例３】
プラスミドベクターｐＮＹ３０１の宿主中での保持率
組換え体を用いて大型培養槽にて異種遺伝子産物の大量生産を行う場合、小スケールから段階的にスケールアップする必要があり、大量培養では植継ぎでの安定性が必要とされる。
【００４３】
実施例２で得たバチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＹ３０１、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＨ３０１各々をＴＭ液体培地を３ｍｌ分注した試験管に植菌し、３０℃で培養した。２４時間培養後、培養液４μｌをとり、うち３μｌをＴＭ液体培地に植継ぎ同じ条件で培養した。残りの培養液１μｌをＴＭ平板培地に塗抹し、一晩３０℃で培養し、生じたコロニーを計数した。さらにこのプレートをＴＭＮ平板培地にレプリカし３０℃で一晩培養を行い、生じたコロニーを計数し、下記式にて各々のプラスミドベクターの保持率を求めた。
プラスミドベクター保持率（％）＝
（ＴＭＮ平板培地で生じたコロニー数／ＴＭ平板培地で生じたコロニー数）×１００
【００４４】
更に上記操作を繰り返し、各植継ぎ回数によるプラスミドベクターの保持率を調べた。植継ぎ後のプラスミドベクターの保持率を図４に示した。
【００４５】
上記結果から明らかなように、プラスミドベクターｐＮＹ３０１は、５回植継ぎ後も安定に宿主に保持されたが、対照であるプラスミドベクターｐＮＨ３０１は植継ぎを重ねるに従って宿主での保持率は低下した。
【００４６】
【実施例４】
プラスミドベクターｐＮＨ３０１ＢＬＡ及びｐＮＹ３０１ＢＬＡの構築
実施例１で構築したプラスミドベクターｐＮＨ３０１及びｐＮＹ３０１を制限酵素ＡｐａＬＩ、ＢａｍＨＩで消化し、各々３．９、３．４ｋｂの断片を得た。一方、プラスミドベクターｐＨＴ１１０ＢＬＡ（特開平６−１３３７８２）をＡｐａＬＩ、ＢｃｌＩで消化して、ＭＷＰのシグナルペプチドの一部とバチルス・リケニホルミス（B. licheniformis）のα−アミラーゼ（ＢＬＡ）遺伝子を含む約１．５ｋｂの断片を得、先に得た各々の３．９ｋｂと３．４ｋｂ断片とＴ４リガーゼで連結し、プラスミドベクターｐＮＨ３０１ＢＬＡ及びｐＮＹ３０１ＢＬＡを得た（図５）。
【００４７】
【実施例５】
プラスミドベクターｐＮＨ３０１ＢＬＡ及びｐＮＹ３０１ＢＬＡを用いてのＢＬＡの分泌生産
実施例４で得たプラスミドベクターｐＮＨ３０１ＢＬＡ及びｐＮＹ３０１ＢＬＡ各々でバチルス・ブレビスＨＰＤ３１をエレクトロポレーション法で形質転換し、ｐＮＨ３０１ＢＬＡ、ｐＮＹ３０１ＢＬＡ各々を保持する形質転換体、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＨ３０１ＢＬＡ、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＹ３０１ＢＬＡを得た。各々３株の形質転換体を、５００ｍｌ容三角フラスコにＴＭＮ培地１００ｍｌを分注し、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した後、冷却した培地に接種し、３０℃で３日間振とう培養した。この培養液を遠心分離し、その培養上清のアミラーゼ活性を可溶性澱粉を基質として斎藤の方法（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１５５，２９０（１９７３）を用いて測定した（図６）。
バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＹ３０１ＢＬＡは、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＨ３０１ＢＬＡの２倍以上のＢＬＡを生産し、各々の形質転換体の生産量のバラツキも少なく安定していた。
【００４８】
【実施例６】
プラスミドベクターｐＮＹ３０１／ＢＬＡの安定性
実施例５で調製したバチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＹ３０１ＢＬＡ、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＨ３０１ＢＬＡを、ＴＭＮ液体培地３ｍｌを分注した試験管に植菌し２日間培養した。１０⁵倍希釈した培養液０．１ｍｌを、デンプンを３％含んだＴＭＮ寒天培地に塗末し一晩培養した。生じたコロニー周辺のハローの有無を肉眼で観察した（表８）。
【００４９】
【表８】

【００５０】
バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＨ３０１ＢＬＡを塗末したプレートに生じたコロニーの５％程が周辺にハローを形成しなくなっていたが、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＹ３０１ＢＬＡを塗末したプレートでは、全てのコロニーが周辺にハローを形成していた。バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＨ３０１ＢＬＡを塗末したプレートのハローを形成しない形質転換体を液体培養し、プラスミドベクターをアルカリ抽出法（Birnboim H. C, and Doly J. Nucleic Acid Res., 7. 1513(1979)）によって抽出した。抽出したプラスミドベクターをアガロースゲル電気泳動に供し、その泳動パターンを調べた（図７）。
【００５１】
ハローを形成しなかったｐＮＨ３０１ＢＬＡは、そのほとんどが小さなサイズになっており、プラスミドの一部欠失が起っているものと思われた。この結果から、ｐＮＹ３０１ＢＬＡは、ｐＮＨ３０１ＢＬＡより安定であり、プラスミドベクターとしての有用性がより高いことが確認された。
【００５２】
【実施例７】
プラスミドベクターｐＮＨ３０１ｈＥＧＦ及びｐＮＹ３０１ｈＥＧＦの構築
プラスミドベクターｐＮＨ３０１及びｐＮＹ３０１を制限酵素ＡｐａＬＩ、ＰｓｔＩで消化し、各々３．９ｋｂおよび３．４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。
一方、プラスミドベクターｐＨＴ１１０ＥＧＦ（特開平６−１３３７８２）をＡｐａＬＩ、ＰｓｔＩで消化してＭＷＰのシグナルペプチドの一部とｈ−ＥＧＦ遺伝子を含む約２００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片と先に得た各々３．９ｋｂおよび３．４ｋｂのＤＮＡ断片とをＴ４リガーゼで連結し、プラスミドベクターｐＮＨ３０１ｈＥＧＦ及びｐＮＹ３０１ｈＥＧＦを得た（図８）。
【００５３】
【実施例８】
プラスミドベクターｐＮＨ３０１ｈＥＧＦ及びｐＮＹ３０１ｈＥＧＦを用いてのｈ−ＥＧＦの分泌生産
実施例７で得たプラスミドベクターｐＮＨ３０１ｈＥＧＦ及びｐＮＹ３０１ｈＥＧＦ各々でバチルス・ブレビスＨＰＤ３１をエレクトロポレーシヨン法で形質転換し、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＨ３０１ｈＥＧＦ、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＹ３０１ｈＥＧＦを得た。各々の形質転換体を５００ｍｌ容三角フラスコに２ＳＬＮ培地（ペプトン４％、酵母エキス０．５％、グルコース２％、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．００１％、ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ０．００１％、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０００１％、ネオマイシン５０μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．２）１００ｍｌを分注し、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した後、冷却した培地に植菌し、３０℃で３日間振とう培養した。この培養液を遠心分離しその培養上清中のｈ−ＥＧＦ量をＨＰＬＣ（カラム：Ｃ１８−１００Ａ、径４ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、バッファー：０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｈ₂Ｏ、０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル、リニアグラジエント、検出：ＵＶ２７６ｎｍ）分析し、市販ｎ−ＥＧＦ（フナコシ（株）社製）を標準品として同条件でＨＰＬＣを行った時のピーク面積と比較して生産量を求めた（ｎ＝３：図９）。
【００５４】
バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＹ３０１ｈＥＧＦは、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１／ｐＮＨ３０１ｈＥＧＦの２倍以上のｈ−ＥＧＦを生産した。
【００５５】
【発明の効果】
本発明によって新規発現プラスミドベクターｐＮＹが開発された。本プラスミドベクターに異種遺伝子を結合してなる発現プラスミドでバチルス属細菌を形質転換し、該形質転換体を培養することにより、該異種遺伝子産物を効率よく製造することができる。
【００５６】
【配列表】
バチルス・ブレビスのＭＷＰプロモーター及びＨＷＰプロモーターの塩基配列を配列番号１、２に示す。配列番号３〜６は、ＰＣＲ用プライマーを示す。
下記表１〜６に、配列番号１〜６で示される各配列を示す。
【００５７】
【表１】

【００５８】
【表２】

【００５９】
【表３】

【００６０】
【表４】

【００６１】
【表５】

【００６２】
【表６】

【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＵＢ１１０由来のプラスミドベクターの制限酵素地図を示す。
【図２】プラスミドベクターｐＮＨ３０１の制限酵素地図及びプロモーターを含む一部の塩基配列を示す。
【図３】プラスミドベクターｐＮＹ３０１の制限酵素地図及びプロモーターを含む一部の塩基配列を示す。
【図４】プラスミドベクターｐＮＨ３０１、ｐＮＹ３０１の宿主での保持率を示す。
【図５】プラスミドベクターｐＮＨ３０１ＢＬＡ、ｐＮＹ３０１ＢＬＡの構築図である。
【図６】ＢＬＡの生産性を示す。
【図７】プラスミドベクターｐＮＨ３０１ＢＬＡ、ｐＮＹ３０１ＢＬＡのアガロース電気泳動図である。
【図８】プラスミドベクターｐＮＨ３０１ｈＥＧＦ、ｐＮＹ３０１ｈＥＧＦの構築図である。
【図９】ｈＥＧＦの生産性を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to biotechnology, and more specifically, the present invention transforms a Bacillus bacterium with a novel expression plasmid vector and the expression plasmid combined with a heterologous gene, and cultures the transformant. The present invention relates to a method for producing a heterologous gene product, which comprises collecting and collecting a heterologous gene product in a product.
[0002]
[Prior art]
Currently, heterogeneous gene products produced using genetic recombination techniques and recombinants are widely used in food, medicine, cosmetics and other industries. As a host for gene recombination, Escherichia coli (Escherichia coli), Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), Bacillus brevis (Bacillus brevisBacteria, yeast, filamentous fungi, or animal cells are used. However, since genetic recombination techniques have been developed mainly in the E. coli system, E. coli is most frequently used as a host fungus.
[0003]
However, in a system using Escherichia coli as a host, the produced heterologous gene product remains in the cytoplasm or the periplasmic space, and it is difficult to secrete it into the medium. In addition, accumulation of heterologous gene products in cells is limited in quantity, and in addition, cells must be crushed and collected, and target heterologous gene products from coexisting substances such as nucleic acids that are components of the cells Needed to be separated and purified. Furthermore, some of the peptides and proteins produced form an inclusion body, and when the inclusion body is formed, there is a disadvantage that it is necessary to perform a regeneration operation to make it active.
[0004]
Many bacteria of the genus Bacillus secrete and produce enzyme proteins in large quantities, and development of host vector systems utilizing this property has been actively carried out. Bacillus bacteria, especially Bacillus subtilis, have been well studied both genetically and biochemically, and many studies have been conducted on the secretory production of heterologous gene products. However, in a system using Bacillus subtilis as a host, there is a problem that heterologous gene products such as peptides and proteins produced by strong proteases inside and outside the cell are degraded.
[0005]
As a result of diligent research to eliminate these drawbacks and to find a host that efficiently produces heterologous gene products, Takataka et al. Found that there are many strains of Bacillus brevis that do not produce protease outside the cell. One of the strains, Bacillus brevis 47 (S. Udaka and H. Yamagata, Methods in Enzymology,217 23-33 (1993)), the major extracellular protein (H. Yamagata et al, J. Bacteriol.,169, 1239 (1987); Norihiro Tsukagoshi, Journal of the Japanese Society for Agricultural Chemistry,6168 (1987) are described as “outer wall protein and middle wall protein” and “main extracellular protein”, respectively. ) A secretory vector was prepared using a gene promoter and a region encoding the signal peptide of MW protein (middle wall protein: MWP), which is one of the major extracellular proteins, and α-amylase ( H. Yamagata et al, J. Bacteriol.,169, 1239 (1987)) and porcine pepsigenogen (Shigezo Tsujitaka, Japanese Society of Agricultural Chemistry, 1987 Annual Meeting, p837-838; Norihiro Tsukagoshi, Journal of the Japanese Agricultural Chemistry Society,61, 68 (1987)).
[0006]
Takagi et al. Isolated a strain Bacillus brevis HPD31 (which is the same strain as Bacillus brevis H102 (FERM BP-1087)) that does not produce protease outside the cell, and this Bacillus brevis. High-secretion production of thermostable α-amylase using HPD31 as a host (H. Takagi et al, Agric, Biol. Chem.,53, 2279-2280 (1989)). Furthermore, Yamagata et al. (H. Yamagata et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, Human Epidermal Growth Factor: h-EGF)86, 3589-3593 (1989)).
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
The expression plasmid vector used in the production system of the heterologous gene product using Bacillus brevis and other Bacillus bacteria as a host is a plasmid that can be replicated in Bacillus bacteria and incorporates a suitable promoter and SD sequence as an expression control region. Further downstream, a secretory signal sequence starting from the translation initiation codon, a heterologous gene, and a terminator are connected. The expression plasmid vector used at this time is Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) -Derived plasmid pUB110 (T. McKenzie, et al., Plasmid.15, 95-103 (1986)).
[0008]
pNH200, pNH400 (Ishihara, T., et al. J. Bacteriol.,177, 745-749 (1995)), pNH300 is an expression plasmid vector constructed based on pUB110, and is frequently used in a system using Bacillus brevis as a host fungus. This pNH-based expression plasmid vector uses the above-described MWP promoter (SEQ ID NO: 1). However, pNH200 is obtained by directly using the 5 MWP promoters existing in tandem, from 5 to 3 The reduced number is pNH400, and the decreased number is pNH300. In expressing heterologous genes, having a strong promoter does not necessarily indicate high productivity, and it is important to consider which vector has different promoter activity to obtain a high-producing transformant. It is.
[0009]
However, pUB110 expression plasmid vectors represented by these pNH systems have a pUB110-derived bleomycin resistance gene in their molecules, and the expression level of the protein translated from this bleomycin resistance gene is large. This may be one of the factors that inhibit the expression of the target heterologous gene product.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
In view of this situation, the present inventors have intensively studied to develop an expression plasmid vector capable of stable and high expression in Bacillus bacteria.
[0011]
The present inventors constructed a novel expression plasmid vector pNY in which a bleomycin resistance gene has been removed from an expression plasmid vector of the pUB110 system represented by the pNH system, and transformed Bacillus brevis to produce a heterologous gene product. The present invention was completed after confirming that the production amount of the heterologous gene product was increased as compared with the expression plasmid vector of pNH system.
[0012]
That is, the present invention relates to a novel expression plasmid vector capable of stable and high expression in Bacillus bacteria. The present invention also provides a heterologous gene obtained by transforming a Bacillus bacterium with an expression plasmid in which a gene encoding a heterologous gene product such as a target peptide or protein is linked to the expression plasmid vector, and culturing the transformant. The present invention relates to a method for producing a product.
The present invention will be described in detail below.
[0013]
The expression plasmid vector of the present invention relates to a plasmid derived from pUB110 from which the bleomycin resistance gene has been removed, and a gene in an expression control region prepared from a gene of a Bacillus bacterium can be retained in the molecule.
The expression control region includes a promoter that is a transcription initiation site and a ribosome binding region (SD sequence). The promoter of the expression control region of the plasmid vector of the present invention is prepared from a gene of the genus Bacillus, Any promoter that functions can be used.
[0014]
For example, the Bacillus brevis MWP promoter (SEQ ID NO: 1 described above), the HWP promoter (SEQ ID NO: 2: JP 8-4511), the Bacillus subtilis Spac promoter (Methods in enzymology,185, 199-228 (1990)) and levansucrase promoter (Appl. Environ. Microbiol.,55, 2739-2744 (1989)), Bacillus amyloliquefaciens (B. amyloliquefaciens) Alkaline protease promoter (Methods in enzymology,185, 1992-228 (1990)) and α-amylase promoter (J. Bacteriol.,165796-804 (1986)) or neutral protease promoter (J. Biotechnol.,Three73-84 (1985)), Bacillus sp. KSM-64 endonuclease promoter (Biosci. Biotech. Biochem.,59, 2172-2175 (1995)) and Bacillus stearothermophilus (B. stearothermophilus) Thermostable branching enzyme promoter (Appl. Environ. Microbiol.,60, 3096-3104 (1994)) and the like, promoters prepared from genes of the genus Bacillus can be used.
[0015]
These promoters may be prepared by a gene recombination method from cells retaining these promoters or chemically synthesized. In the case of preparation by gene recombination, for example, a polymerase chain reaction (PCR) method (Molecular Cloning 2nd ed ed) using a primer DNA prepared based on the base sequence of the promoter using a genomic DNA of a cell having a promoter as a template. , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).
[0016]
On the other hand, as a chemical synthesis method, for example, when synthesizing a long-chain DNA of 100 bases or less, the phosphoramidite method (Methods Enzymol.,154287-313 (1987)) and can be synthesized with a commercially available DNA synthesizer. In the case of DNA having 100 bases or more, the base sequence is divided into lengths of less than 100 bases, and each DNA fragment is chemically synthesized as described above, and then these DNA fragments are ligated using T4 DNA ligase. .
[0017]
What is necessary is just to use what prepared the SD arrangement | sequence from the gene of the genus Bacillus. For example, a sequence synthesized corresponding to the sequence of 16S rRNA of Bacillus brevis or Bacillus subtilis may be used. Specifically, SD1 and SD2 shown in FIGS. 2 and 3 can be used.
[0018]
This Bacillus bacterium-derived promoter and the expression regulatory region gene containing the SD sequence are the Ori region (replication origin), Rep region (replication initiation protein gene), Nm r region in the molecule derived from pUB110 from which the bleomycin resistance gene has been removed. It may be incorporated into any part other than (neomycin resistance gene), and the number is not particularly limited.
For example, in the plasmid vector derived from plasmid pUB110 from which the bleomycin resistance gene shown in FIG. 1 has been removed, the expression regulatory region gene can be retained in the region indicated by A, B, and / or C.
[0019]
In addition, if a multicloning site provided with various restriction enzyme cleavage sites is incorporated downstream of the expression control region, various heterologous genes can be easily cloned. As the multicloning site, the sequences shown in FIGS. 2 and 3 can be used.
Furthermore, a terminator, which is a transcription termination gene, may be linked downstream of a gene encoding a heterologous gene product such as a peptide or protein, that is, on the 3 ′ side. The terminator is not particularly limited, and for example, a terminator such as an HS gene (FIGS. 2 and 3) isolated from Bacillus brevis HPD31 may be used.
[0020]
For the construction of the expression plasmid vector of the present invention, a pUB110-based expression plasmid vector derived from Staphylococcus aureus can be used. The pNH-based expression plasmid vector is an expression plasmid vector in which an MWP promoter is incorporated into pUB110, and can be used to construct the expression plasmid vector of the present invention. Specifically, the pNH300 series having one promoter (described later) and the pNH400 series having three promoters (Ishihara, T., et al. J. Bacteriol.,177, 745-749 (1995)) and the pNH200 series having 5 promoters.
[0021]
A new expression plasmid vector pNY from which the bleomycin resistance gene has been removed can be obtained by amplifying and recovering a portion other than the bleomycin resistance gene derived from pUB110 in this pNH-based expression plasmid vector by PCR using a primer DNA. Can be obtained.
For example, if PCR is performed using a pNH300 series expression plasmid vector as a template, one MWP promoter can be obtained as an expression plasmid vector pNY300 series. If PCR is performed using a pNH400 series expression plasmid vector as a template, three promoters can be obtained. By carrying out PCR using the expression plasmid vector pNY400 series and the pNH200 series expression plasmid vector as a template, an expression plasmid vector pNY200 series having 5 promoters can be obtained.
[0022]
The gene encoding a heterologous gene product such as a useful peptide or protein linked to the expression plasmid vector of the present invention thus prepared may be a gene derived from any organism as long as it is a gene that can be expressed in Bacillus bacteria. It can be applied to the production of gene products (enzymes, hormones, cytokines, immunoglobulins, other physiologically active peptides, antigen proteins, etc.) derived from animals, birds, fish, microorganisms, viruses, and other organisms.
[0023]
The gene encoding these heterologous gene products may be incorporated into the restriction enzyme site downstream of the gene encoding the promoter, SD sequence, and signal peptide of the expression plasmid vector of the present invention according to a known method, for example, molecular cloning. -A laboratory manual 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (Molecular Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).
[0024]
The host used for gene expression may be a bacterium belonging to Bacillus, such as Bacillus brevis, Bacillus chosinensis (B. choshinensisEtc.) can be suitably used.
[0025]
Methods for transforming host bacteria may be known methods. For example, in Bacillus brevis and Bacillus chosinensis, the method of Takahashi et al. (J. Bacteriol.,158, 1130 (1983)) or Takagi et al. (Agric. Biol. Chem.,53, 3099-3100 (1989)).
[0026]
The medium used for culturing the obtained transformant may be any medium as long as the transformant can grow and produce the desired heterologous gene product.
Examples of the carbon source contained in the medium include glucose, sucrose, glycerol, starch, dextrin, molasses, and organic acids. As the nitrogen source, casein, peptone, meat extract, yeast extract, organic nitrogen sources such as casamino acid, urea and glycine, inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate, and the like are used. In addition, inorganic salts such as potassium chloride, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, sodium chloride and magnesium sulfate are added to the medium as necessary. A bacterium exhibiting auxotrophy may be added to the medium with nutrients necessary for its growth. Examples of the nutrient substance include amino acids, vitamins, and nucleic acids.
[0027]
If necessary for the culture, antibiotics such as penicillin, erythromycin, chloramphenicol, bacitracin, D-cycloserine, ampicillin, neomycin and the like are added to the medium. Further, if necessary, an antifoaming agent such as soybean oil, lard oil, various surfactants and the like may be added to the medium.
[0028]
The initial pH of the medium is 5.0 to 9.0, more preferably 6.5 to 7.5. The culture temperature is usually 15 ° C to 42 ° C, more preferably 24 ° C to 37 ° C, and the culture time is usually 16 to 166 hours, more preferably 24 to 96 hours.
[0029]
In the present invention, by culturing the transformant under the above conditions, a heterologous gene product is generated and accumulated in the culture. The heterologous gene product thus obtained can be purified by known methods, for example, by membrane treatment, ammonium sulfate fractionation, chromatography, etc. (basic experimental methods for proteins and nucleic acids, Nanedo, (1985)). .
[0030]
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, which are illustrative only and the present invention is not limited thereto.
[0031]
[Example 1]
Construction of plasmid vector pNY301
[0032]
(1) Construction of pNH301
To obtain the P5 promoter and signal sequence of the MWP gene, pNU210 (S. Udaka, et al. Methods in Enzymology,217, 23-33 (1993)) as a template, PCR was performed using the primer of SEQ ID NO: 3 and the primer of SEQ ID NO: 4.
[0033]
PCR was performed using 100 pmol each of the primer of SEQ ID NO: 3 and primer of SEQ ID NO: 4, 2.5 units of Taq polymerase, 200 μM of dNTP, 1 ng of pNU210 template DNA, 100 μl Taq buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.5), 2. 5 mM Mg ++, 50 mM potassium chloride, 100 μg / ml bovine serum albumin) was mixed and held at 96 ° C. for 30 seconds, followed by heat denaturation of DNA (94 ° C., 60 seconds), primer annealing (54 ° C., 60 seconds) ), And extending the primer (70 ° C., 60 seconds) by 25 cycles.
[0034]
The approximately 260 bp gene amplified by PCR was cleaved with restriction enzymes AatII and XbaI, and ligated to AatII and XbaI sites of plasmid pGEM-7Zf (Promega) using T4 ligase. E. coli JM109 was transformed into plasmid pGEM-P5.
[0035]
Amplified by PCR under the same conditions as described above so that both ends of the HS gene (terminator gene: Japanese Patent Application No. Hei 8-123970) having a stem loop structure of about 150 bp obtained from the chromosome of Bacillus brevis HPD31 are HindIII and NsiI sites. And inserted into the HindIII and NsiI sites of pGEM-P5 to obtain pGEM-P5HS.
[0036]
A DNA fragment 454 bp obtained by cleaving pGEM-P5HS with AatII and NsiI and smoothing with DNA polymerase was converted into pUB110 (T. McKenzie, et al, Plasmid,1595-103 (1986)) was ligated to a 3447 bp DNA fragment cut with PvuII and AccI and then blunted with DNA polymerase, and this was ligated to Bacillus brevis HPD31 by electroporation (Agric. Biol. Chem.,533099-3100 (1989)) to obtain plasmid vector pNH301.
FIG. 2 shows a partial nucleotide sequence including a restriction enzyme map of pNH301 and a promoter.
[0037]
(2) Construction of pNY301
PCR was performed using pNH301 as a template and the primer of SEQ ID NO: 5 and the primer of SEQ ID NO: 6.
[0038]
PCR was performed using 100 pmol each of the primer of SEQ ID NO: 5 and the primer of SEQ ID NO: 6, 2.5 units of Taq polymerase, 200 μM dNTP, 1 ng of pNH301 template DNA, 100 μl Taq buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.5), 2. 5 mM Mg ++, 50 mM potassium chloride, 100 μg / ml bovine serum albumin) was mixed and held at 96 ° C. for 30 seconds, followed by heat denaturation of DNA (94 ° C., 60 seconds), primer annealing (54 ° C., 120 seconds) ), And extending the primer (70 ° C., 180 seconds) by 25 cycles. A gene of about 3.4 kb amplified by PCR was cleaved with Sse8387I, ligated with T4 ligase, and introduced into Bacillus previs HPD31 by electroporation to obtain a plasmid vector pNY301.
[0039]
FIG. 3 shows a partial nucleotide sequence including a restriction enzyme map of pNY301 and a promoter. Bacillus brevis HPD31 / pNY301 carrying the plasmid vector pNY301 is deposited as FERM P-15934 at the Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry.
[0040]
[Example 2]
Transformation efficiency of plasmid vector pNY301
1 ng each of the plasmid vectors pNY301 and pNH301 obtained in Example 1 was introduced into Bacillus brevis HPD31 by electroporation. After completion of the reaction, 1 μl of each reaction solution was smeared on a TMN plate medium (containing 50 μg / ml neomycin), and the resulting colonies were counted to determine the transformation efficiency of each plasmid vector.
Table 7 shows the results. The plasmid vector pNY301 showed a transformation rate of 5 times or more compared to pNH301, and was found to be able to transform the host more efficiently.
[0041]
[Table 7]

[0042]
[Example 3]
Retention rate of plasmid vector pNY301 in the host
When large-scale production of heterologous gene products is performed in a large culture tank using recombinants, it is necessary to scale up from a small scale step by step, and in large-scale culture, stability at planting is required.
[0043]
Each of Bacillus brevis HPD31 / pNY301 and Bacillus brevis HPD31 / pNH301 obtained in Example 2 was inoculated into a test tube in which 3 ml of TM liquid medium was dispensed, and cultured at 30 ° C. After culturing for 24 hours, 4 μl of the culture solution was taken, 3 μl of which was transferred to TM liquid medium and cultured under the same conditions. The remaining 1 μl of the culture solution was smeared on a TM plate medium, cultured overnight at 30 ° C., and the resulting colonies were counted. Furthermore, this plate was replicated on a TMN plate medium and cultured overnight at 30 ° C., and the resulting colonies were counted, and the retention rate of each plasmid vector was determined by the following formula.
Plasmid vector retention (%) =
(Number of colonies generated in TMN plate medium / number of colonies generated in TM plate medium) × 100
[0044]
Furthermore, the said operation was repeated and the retention rate of the plasmid vector by each transplanting frequency was investigated. The retention rate of the plasmid vector after inoculation is shown in FIG.
[0045]
As is clear from the above results, the plasmid vector pNY301 was stably retained in the host even after 5 passages, but the plasmid vector pNH301 as a control decreased in the host as the passage was repeated.
[0046]
[Example 4]
Construction of plasmid vectors pNH301BLA and pNY301BLA
The plasmid vectors pNH301 and pNY301 constructed in Example 1 were digested with restriction enzymes ApaLI and BamHI to obtain fragments of 3.9 and 3.4 kb, respectively. On the other hand, plasmid vector pHT110BLA (Japanese Patent Laid-Open No. 6-133382) was digested with ApaLI and BclI, and a part of MWP signal peptide and Bacillus licheniformis (B. licheniformis) Fragments of about 1.5 kb containing the α-amylase (BLA) gene, and ligated with each of the 3.9 kb and 3.4 kb fragments obtained above with T4 ligase to obtain plasmid vectors pNH301BLA and pNY301BLA ( FIG. 5).
[0047]
[Example 5]
  Secretion production of BLA using plasmid vectors pNH301BLA and pNY301BLA
  Bacillus brevis HPD31 was transformed with each of the plasmid vectors pNH301BLA and pNY301BLA obtained in Example 4 by electroporation, and transformants carrying pNH301BLA and pNY301BLA, Bacillus brevis HPD31 / pNH301BLA, Bacillus brevis HPD31 / pNY301BLA was obtained. Three transformants of each strain were dispensed with 100 ml of TMN medium in a 500 ml Erlenmeyer flask, autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes, inoculated into the cooled medium, and cultured with shaking at 30 ° C. for 3 days. The culture broth was centrifuged, and the amylase activity of the culture supernatant was analyzed by the method of Saito (Arch. Biochem. Biophys., Using soluble starch as a substrate).155, 290 (1973) (FIG. 6).
  Bacillus brevis HPD31 / pNY301BLA produced BLA more than twice as many as Bacillus brevis HPD31 / pNH301BLA, and was stable with little variation in the production amount of each transformant.
[0048]
[Example 6]
Stability of plasmid vector pNY301 / BLA
Bacillus brevis HPD31 / pNY301BLA and Bacillus brevis HPD31 / pNH301BLA prepared in Example 5 were inoculated into a test tube dispensed with 3 ml of TMN liquid medium and cultured for 2 days. 10^FiveA 0.1-fold diluted culture solution was smeared on a TMN agar medium containing 3% starch and cultured overnight. The presence or absence of halo around the resulting colonies was observed with the naked eye (Table 8).
[0049]
[Table 8]

[0050]
About 5% of the colonies generated on the plate coated with Bacillus brevis HPD31 / pNH301BLA no longer formed halo around the plate, but on the plate coated with Bacillus brevis HPD31 / pNY301BLA, all colonies A halo was formed. Transformants that do not form halos on plates coated with Bacillus brevis HPD31 / pNH301BLA are liquid-cultured, and plasmid vectors are extracted by alkaline extraction (Birnboim H. C, and Doly J. Nucleic Acid Res.,71513 (1979)). The extracted plasmid vector was subjected to agarose gel electrophoresis, and the migration pattern was examined (FIG. 7).
[0051]
Most of the pNH301BLA that did not form a halo had a small size, and it was considered that partial deletion of the plasmid had occurred. From this result, it was confirmed that pNY301BLA is more stable than pNH301BLA and is more useful as a plasmid vector.
[0052]
[Example 7]
Construction of plasmid vectors pNH301hEGF and pNY301hEGF
Plasmid vectors pNH301 and pNY301 were digested with restriction enzymes ApaLI and PstI to obtain DNA fragments of 3.9 kb and 3.4 kb, respectively.
On the other hand, plasmid vector pHT110EGF (JP-A-6-133382) was digested with ApaLI and PstI to obtain a DNA fragment of about 200 bp containing a part of MWP signal peptide and h-EGF gene. This DNA fragment and the previously obtained 3.9 kb and 3.4 kb DNA fragments were ligated with T4 ligase to obtain plasmid vectors pNH301hEGF and pNY301hEGF (FIG. 8).
[0053]
[Example 8]
Secretion production of h-EGF using plasmid vectors pNH301hEGF and pNY301hEGF
Bacillus brevis HPD31 was transformed by the electroporation method with the plasmid vectors pNH301hEGF and pNY301hEGF obtained in Example 7, respectively, to obtain Bacillus brevis HPD31 / pNH301hEGF and Bacillus brevis HPD31 / pNY301hEGF. Each transformant was placed in a 500 ml Erlenmeyer flask with 2SLN medium (4% peptone, 0.5% yeast extract, 2% glucose, FeSO_Four・ 7H₂O 0.001%, MnSO_Four・ 4H₂O 0.001%, ZnSO_Four・ 7H₂100 ml of O 0.0001%, neomycin 50 μg / ml, pH 7.2) was dispensed, autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes, inoculated into a cooled medium, and cultured with shaking at 30 ° C. for 3 days. The culture broth was centrifuged, and the amount of h-EGF in the culture supernatant was determined by HPLC (column: C18-100A, diameter 4 mm × length 250 mm, buffer: 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) / H₂O, 0.1% TFA / 50% acetonitrile, linear gradient, detection: UV 276 nm) analysis, and peak area when HPLC was performed under the same conditions using commercially available n-EGF (Funakoshi Co., Ltd.) as a standard product. The production amount was obtained by comparison (n = 3: FIG. 9).
[0054]
Bacillus brevis HPD31 / pNY301hEGF produced more than twice as much h-EGF as Bacillus brevis HPD31 / pNH301hEGF.
[0055]
【The invention's effect】
According to the present invention, a novel expression plasmid vector pNY has been developed. By transforming a Bacillus bacterium with an expression plasmid obtained by binding a heterologous gene to this plasmid vector and culturing the transformant, the heterologous gene product can be efficiently produced.
[0056]
[Sequence Listing]
The nucleotide sequences of the Bacillus brevis MWP promoter and HWP promoter are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively. Sequence number 3-6 shows the primer for PCR.
Tables 1 to 6 below show the sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 6, respectively.
[0057]
[Table 1]

[0058]
[Table 2]

[0059]
[Table 3]

[0060]
[Table 4]

[0061]
[Table 5]

[0062]
[Table 6]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a restriction map of a plasmid vector derived from pUB110.
FIG. 2 shows a partial base sequence including a restriction enzyme map and a promoter of plasmid vector pNH301.
FIG. 3 shows a partial base sequence including a restriction enzyme map and promoter of plasmid vector pNY301.
FIG. 4 shows the retention rate of plasmid vectors pNH301 and pNY301 in the host.
FIG. 5 is a construction diagram of plasmid vectors pNH301BLA and pNY301BLA.
FIG. 6 shows BLA productivity.
FIG. 7 is an agarose electrophoresis diagram of plasmid vectors pNH301BLA and pNY301BLA.
FIG. 8 is a construction diagram of plasmid vectors pNH301hEGF and pNY301hEGF.
FIG. 9 shows hEGF productivity.

Claims

The origin of replication from the plasmid pUB110, replication protein gene Rep, has a neomycin resistance gene Nm ^r, and, P5 promoter from the MWP promoter region, SD sequence, a sequence encoding a secretion signal peptide, multiple cloning site and Plasmid vector pNY301 whose base sequence of the region containing the HS gene is as shown in the following figure and whose restriction enzyme map is as shown in the figure below.

A Bacillus bacterium is transformed with an expression plasmid obtained by binding a heterologous gene to the plasmid vector according to claim 1, and the transformant is cultured to produce and accumulate a heterologous gene product in the culture. A method for producing a heterologous gene product, characterized in that