JP3729206B2

JP3729206B2 - Purified mite allergen

Info

Publication number: JP3729206B2
Application number: JP23562293A
Authority: JP
Inventors: 和久小埜; 征子重田; 武志和田
Original assignee: Fumakilla Ltd; Hiroshima University NUC
Current assignee: Fumakilla Ltd; Hiroshima University NUC
Priority date: 1993-08-27
Filing date: 1993-08-27
Publication date: 2005-12-21
Anticipated expiration: 2020-12-21
Also published as: JPH0769925A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はアレルゲン活性を有する精製ダニアレルゲンに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
屋内塵性ダニは、アトピー性気管支喘息等のアレルギー疾患の主要な原因として重要である。従来、アレルギー疾患の治療法としては、アレルギーの原因物質であるアレルゲンを投与して減感作する減感作療法が、最も重要な根本療法とされ、特に花粉症を始め昆虫アレルギー等、抗原が特定され易い疾患においては、その評価は今や確立されたものといえる。しかしながら、この減感作療法ではアレルゲンによるアナフィラキシーの危険が伴う為、安全な治療用抗原の投与が必要とされる。
【０００３】
ダニアレルギー疾患については、屋内塵中のダニアレルゲンとして、ヤケヒョウヒダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）及びコナヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae）の２種が重要であると報告されている[ J. Allergy : 42,14-28,(1968)] 。従来、主要ダニアレルゲンとしては、ダニ排泄物、ダニ虫体中に含有されている分子量24〜28kDの糖蛋白質（pI 4.6〜7.2)および分子量14.5〜20kDの蛋白質（pI 5〜8.3)等が報告されている[J. Immunol. : 125,587-592,(1980）／ J. Allergy Clin. Immunol. : 76,753-761,(1985)／ Immunology : 46,679-687,(1982）／ Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. : 81,214-223,(1986)／ J. Allergy Clin. Immunol. : 75,686-692,(1985)等] 。
【０００４】
一方、本発明者らは、前記の主要ダニアレルゲンよりも高分子量の画分及び低分子量の画分に、ダニ喘息患者血清IgG に特異的反応性を示し、ダニ喘息患者の白血球ヒスタミン遊離を誘発する成分が存在することを報告した（日本農芸化学会，62:411, 1988）。しかし、一部を除き、減感作治療用抗原として用いることができる程度までの精製は、未だなされていなかった。
【０００５】
ダニアレルギー疾患の診断方法としては、従来、問診を主体とし、屋内塵（ハウスダスト）抽出物またはダニ虫体抽出物を用いる皮内反応試験を併用するのが殆どであり、まれにRAST法による血清中のIgE 抗体価の測定値（相対値）をも併用する程度であって、ダニアレルギー疾患を直接的に診断するのはかなり困難であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従来、屋内塵性ダニを特異抗原とする気管支喘息の減感作治療法には、屋内塵（ハウスダスト) 抽出液が用いられてきているが、化学的にはその組成が極めて不明確であり、また多種類の不純物を含み、アナフィラキシー誘発の可能性があるために投与量が極度に制限され、治療効果が極めて低いのが現状である。したがって、有効性及び安全性の観点から、有用な減感作治療用抗原の出現が期待されている。
また、ダニアレルギー疾患の迅速かつ正確な診断は、ダニアレルギー疾患の適切な治療を行う上で重要であり、診断システムの確立が期待されている。
【０００７】
本発明の目的は、まさにこの点にあり、ダニアレルギー疾患の治療剤、診断薬として極めて有用な新規な精製ダニアレルゲンを提供することにある。
即ち、本発明の目的は、ダニ培養中の排泄物から抽出しうる、アレルゲン活性を有する新規な精製ダニアレルゲンおよび当該新規な精製ダニアレルゲンの製造方法を提供すること、並びに新規なダニアレルギー疾患治療剤および新規なダニアレルギー疾患診断薬を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ダニアレルギー疾患の治療剤、診断薬を開発することを目的として、コナヒョウヒダニ排泄物の抽出液中のアレルゲンについて鋭意研究を重ねた。その結果、各種ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーとダニアレルギー患者血清中のＩｇＧ、ＩｇＥ等を用いるＥＬＩＳＡ法とを組合せて分画することにより、各種の画分に含まれる糖蛋白質に強いアレルゲン活性を見出し、さらに研究を重ねて本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明の要旨は、下記の理化学的性質および生物学的性質を有する５種類の精製ダニアレルゲン、即ちＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、およびＨＭ１−２−１Ｍに関するものである。
【００１０】
（１）精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆの理化学的性質および生物学的性質は、▲１▼ダニ培養中の排泄物抽出液に含まれ、ウルトロゲルＡｃＡ５４でのゲル濾過（生理食塩水）によりボイドボリュウムおよびその直後に溶出する画分（ＨＭ１）に含まれ、ついでセファローズ６Ｂでのゲル濾過（生理食塩水）によりＨＭ１−２の画分に含まれ、ＤＥＡＥ−トヨパールのカラムクロマトグラフィーから０．０１ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）により溶出される画分に含まれる成分であり、▲２▼約９０％の糖質を含む糖蛋白質であり、▲３▼分子量（セファローズ６Ｂゲル濾過法）が約１５０，０００〜１５５，０００であり、そして▲４▼アレルゲン活性を有する。
【００１１】
（２）精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−０．１Ｂの理化学的性質および生物学的性質は、▲１▼ダニ培養中の排泄物抽出液に含まれ、ウルトロゲルＡｃＡ５４でのゲル濾過（生理食塩水）によりボイドボリュウムおよびその直後に溶出する画分（ＨＭ１）に含まれ、ついでセファローズ６Ｂでのゲル濾過（生理食塩水）によりＨＭ１−２の画分に含まれ、ＤＥＡＥ−トヨパールのカラムクロマトグラフィーから０．１ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）により溶出される画分に含まれる成分であり、▲２▼約８３％の糖質を含む糖蛋白質であり、▲３▼分子量（セファローズ６Ｂゲル濾過法）が約１５０，０００〜１５５，０００であり、そして▲４▼アレルゲン活性を有する。
【００１２】
（３）精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−０．３Ａの理化学的性質および生物学的性質は、▲１▼ダニ培養中の排泄物抽出液に含まれ、ウルトロゲルＡｃＡ５４でのゲル濾過（生理食塩水）によりボイドボリュウムおよびその直後に溶出する画分（ＨＭ１）に含まれ、ついでセファローズ６Ｂでのゲル濾過（生理食塩水）によりＨＭ１−２の画分に含まれ、ＤＥＡＥ−トヨパールのカラムクロマトグラフィーから０．３ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）により溶出される画分に含まれる成分であり、▲２▼約７６％の糖質を含む糖蛋白質であり、▲３▼分子量（セファローズ６Ｂゲル濾過法）が約１５０，０００〜１５５，０００であり、そして▲４▼アレルゲン活性を有する。
【００１３】
（４）精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−０．３Ｂの理化学的性質および生物学的性質は、▲１▼ダニ培養中の排泄物抽出液に含まれ、ウルトロゲルＡｃＡ５４でのゲル濾過（生理食塩水）によりボイドボリュウムおよびその直後に溶出する画分（ＨＭ１）に含まれ、ついでセファローズ６Ｂでのゲル濾過（生理食塩水）によりＨＭ１−２の画分に含まれ、ＤＥＡＥ−トヨパールのカラムクロマトグラフィーから０．３ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）により溶出される画分に含まれる成分であり、▲２▼約７１％の糖質を含む糖蛋白質であり、▲３▼分子量（セファローズ６Ｂゲル濾過法）が約１５０，０００〜１５５，０００であり、そして▲４▼アレルゲン活性を有する。
【００１４】
（５）精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−１Ｍの理化学的性質および生物学的性質は、▲１▼ダニ培養中の排泄物抽出液に含まれ、ウルトロゲルＡｃＡ５４でのゲル濾過（生理食塩水）によりボイドボリュウムおよびその直後に溶出する画分（ＨＭ１）に含まれ、ついでセファローズ６Ｂでのゲル濾過（生理食塩水）によりＨＭ１−２の画分に含まれ、ＤＥＡＥ−トヨパールのカラムクロマトグラフィーから１．０ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ６．０）により溶出される画分に含まれる成分であり、▲２▼約４８％の糖質を含む糖蛋白質であり、▲３▼分子量（セファローズ６Ｂゲル濾過法）が約１５０，０００〜１５５，０００であり、そして▲４▼アレルゲン活性を有する。
【００１５】
また、本発明は、ダニ培養中の排泄物を飽和食塩水および／または中程度イオン強度の緩衝液により抽出処理し、得られた抽出液をゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー等の手法およびダニアレルギー患者血清ＩｇＧ、ＩｇＥを用いるＥＬＩＳＡ法の手法を組合せて分画することを特徴とする前記の精製ダニアレルゲンの製造方法を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は前記の精製ダニアレルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患治療剤、ダニアレルギー疾患診断薬を提供する。
【００１７】
本発明において、各精製ダニアレルゲンは、それぞれ前記の▲１▼〜▲４▼の要件を満足する限り、単一の精製ダニアレルゲンよりなるもの、また複数のダニアレルゲンよりなるもの（すなわち、精製ダニアレルゲンの混合物の態様）のいずれでもよい。
【００１８】
以下、本発明の精製ダニアレルゲンについてより詳細に説明する。
即ち、本発明の精製ダニアレルゲンの性状は、次のとおりである。
（１）精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ
▲１▼色および性状：白色（凍結乾燥物）
▲２▼水溶性：易溶性
▲３▼分子量：セファローズ６Ｂゲル濾過法により約１５０，０００〜１５５，０００である。本物質は糖含量の高い糖蛋白質であるため、実際よりも高い分子量が得られていると思われる。
▲４▼組成成分：組成成分からの解析では、糖蛋白質であって、糖含量が約９０％を占める。またアミノ酸組成は表６に記載のとおりである。
▲５▼アレルゲン活性を有する。
▲６▼アナフィラキシー反応を誘発しない。
【００１９】
（２）精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−０．１Ｂ
▲１▼色および性状：白色（凍結乾燥物）
▲２▼水溶性：易溶性
▲３▼分子量：セファローズ６Ｂゲル濾過法により約１５０，０００〜１５５，０００である。本物質は糖含量の高い糖蛋白質であるため、実際よりも高い分子量が得られていると思われる。
▲４▼組成成分：組成成分からの解析では、糖蛋白質であって、糖含量が約８３％を占める。またアミノ酸組成は表６に記載のとおりである。
▲５▼アレルゲン活性を有する。
▲６▼アナフィラキシー反応を誘発しない。
【００２０】
（３）精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−０．３Ａ
▲１▼色および性状：白色（凍結乾燥物）
▲２▼水溶性：易溶性
▲３▼分子量：セファローズ６Ｂゲル濾過法により約１５０，０００〜１５５，０００である。本物質は糖含量の高い糖蛋白質であるため、実際よりも高い分子量が得られていると思われる。
▲４▼組成成分：組成成分からの解析では、糖蛋白質であって、糖含量が約７６％を占める。またアミノ酸組成は表６に記載のとおりである。
▲５▼アレルゲン活性を有する。
▲６▼アナフィラキシー反応を誘発しない。
【００２１】
（４）精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−０．３Ｂ
▲１▼色および性状：白色（凍結乾燥物）
▲２▼水溶性：易溶性
▲３▼分子量：セファローズ６Ｂゲル濾過法により約１５０，０００〜１５５，０００である。本物質は糖含量の高い糖蛋白質であるため、実際よりも高い分子量が得られていると思われる。
▲４▼組成成分：組成成分からの解析では、糖蛋白質であって、糖含量が約７１％を占める。またアミノ酸組成は表６に記載のとおりである。
▲５▼アレルゲン活性を有する。
▲６▼アナフィラキシー反応を誘発しない。
【００２２】
（５）精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−１Ｍ
▲１▼色および性状：白色（凍結乾燥物）
▲２▼水溶性：易溶性
▲３▼分子量：セファローズ６Ｂゲル濾過法により約１５０，０００〜１５５，０００である。本物質は糖含量の高い糖蛋白質であるため、実際よりも高い分子量が得られていると思われる。
▲４▼組成成分：組成成分からの解析では、糖蛋白質であって、糖含量が約４８％を占める。またアミノ酸組成は表６に記載のとおりである。
▲５▼アレルゲン活性を有する。
▲６▼アナフィラキシー反応を誘発しない。
【００２３】
本発明の精製ダニアレルゲンの分子量は、セファローズ６Ｂゲル濾過法により測定する。糖含量が高いため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法は不適当であった。
【００２４】
本発明の精製ダニアレルゲンのアミノ酸組成はすべて、次の操作により得られる。即ち、0.2%サンプル溶液２００μl を１２Ｎ塩酸２００μｌと混合し、Ｎ₂置換をした密封試験管内で、１１０℃で２４時間加水分解する。乾固させた後、少量の水を加え再び乾固させるという操作を３回繰り返すことによって脱塩酸を行い、これをアミノ酸アナライザー用の希釈用緩衝液１mlに溶解し、アミノ酸アナライザー（日立製作所）により定量する。
【００２５】
本発明の精製ダニアレルゲンの糖含量は、全中性糖をGlucose を標準としてフェノール硫酸法で定量した結果である。
【００２６】
アレルゲン活性については、ダニアレルギー患者に対する皮内反応活性、ＨＰＬＣを用いた患者白血球ヒスタミン遊離試験、ドットブロットテスト等により判断する。
アナフィラキシー反応については、常法により、モルモットを免疫し、追加免疫時のアナフィラキシー反応について観察する。
【００２７】
本発明の精製ダニアレルゲンの製造方法としては、たとえば次のような方法が例示される。
ａ）粗ダニ排泄物抗原の調製
ダニ抗原の製造原料として、特に制限されるものではないが例えばコナヒョウヒダニまたはヤケヒョウヒダニのいずれを用いてもよい。これらのダニをダニ培養培地で培養し、これを抽出処理する。
抽出処理は飽和食塩水および／またはリン酸緩衝液を加えて攪拌し、室温で30分間静置した後に、遠心分離(3000 rpm 、30分) を行い上清をプールする。この際、抽出溶媒としては他に、中程度イオン強度の緩衝液であればいずれを用いてもよい。例えば、乳酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。上清表面にダニ虫体が浮遊するのでこれを濾過して取り除く。プールした上清を濾過およびイオン交換水に対して透析したもの（粗ダニ排泄物抽出液）を出発材料とする。
次に、この粗ダニ排泄物抽出液を、例えば分子量１万カットの限外濾過膜（UF-20CS-10PS) に通し、この膜を通過しない高分子粗ダニ排泄物抗原と通過する低分子粗ダニ排泄物抗原に分画し、高分子粗ダニ排泄物抗原についてさらに分画を進める。
【００２８】
ｂ）高分子粗ダニ排泄物抗原から各精製ダニアレルゲンの調製
高分子粗ダニ排泄物抗原の分画は、
(i) ダニアレルギー患者血清中のダニアレルゲンに特異的なIgE 、IgG 、ウサギ抗ダニ排泄物抗血清、ウサギ抗ダニ排泄物抗体、排泄物抗原に特異的なマウスモノクローナル抗体等との反応を酵素免疫測定法(ELISA) により測定することによる、各フラクションの抗原活性の測定(Immunochemistry: 8, 871,(1971))、 (ii) ウサギ抗ダニ排泄物抗血清を用いたラジオイムノアッセイによる、各フラクションの抗原活性の測定、
(iii) 皮内反応活性による、各フラクションのアレルゲン活性の測定、
(iv) ダニアレルギー患者白血球ヒスタミン遊離活性による、各フラクションのアレルゲン活性の測定、
等のモニターの下に公知の精製法、例えばゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、焦点電気泳動法、ゲル電気泳動法等を適宜組み合わせて精製することができる。
【００２９】
例えば、具体的には高分子粗ダニ排泄物抗原をウルトロゲルＡｃＡ５４でゲル濾過する。その時の溶出液を、ダニアレルギー患者血清中のＩｇＧ、ＩｇＥおよびウサギ抗高分子粗ダニ排泄物抗原血清中のＩｇＧに対する反応性をＥＬＩＳＡ法によりモニターし、蛋白含量および２８０ｎｍの吸収をガイドに分画する。
強い皮内反応活性が認められる画分を、更にゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、デュアルモードクロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ等の精製手段を適宜組み合わせることにより本発明の精製ダニアレルゲンである活性成分を精製することができる。
【００３０】
例えば、まず、ウルトロゲルＡｃＡ５４で分画された各種の画分のうち、最も強い皮内反応活性を示した画分について、セファローズ６Ｂによるゲル濾過をさらに行い、溶出液を前記のようにＥＬＩＳＡ法により幾つかの画分に分画する。これらのうち、最も高い抗原活性を示す画分を用いてさらに精製を進める。
次には、一般に、イオン交換クロマトグラフィーを行うのが効果的である。本発明においては、アニオン交換樹脂によるイオン交換クロマトグラフィーが効果的である。例えば、ＤＥＡＥ−トヨパールカラム（ｐＨ６．０リン酸緩衝液，１０ｍＭ−ＮａＣｌ）に活性画分をチャージし、ＮａＣｌ濃度を変えた同リン酸緩衝液を用いて溶出する。溶出液の分画は、ＥＬＩＳＡ法、蛋白質量、糖含有量等を指標として行う。
こうして得られる精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、ＨＭ１−２−１Ｍの色および性状はそれぞれ白色（凍結乾燥物）であり、水には易溶性のものである。また、モルモットを用いたアナフィラキシー反応試験では、アナフィラキシー反応を誘発しないものである。
【００３１】
本発明の精製ダニアレルゲンはダニアレルギー疾患治療剤として適用することができ、例えば減感作治療剤として有用である。ここでダニアレルギー疾患とは、アトピー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎等、ダニの特異抗原が原因となるあらゆるアレルギー疾患をいう。
【００３２】
前記の方法により精製された精製ダニアレルゲンは、濃縮して溶液状又はシロップ状として採取するか、更に乾燥して粉末状で採取してダニアレルギー疾患に対する減感作治療剤として用いられる。本減感作治療剤はそのままで、又は必要に応じて一般的に用いられるアジュバントや各種の添加剤、例えば安定剤、賦形剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、着色剤等を添加した配合剤として用いることができる。
【００３３】
本減感作治療剤は、通常の投与経路、例えば、経口、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等の投与方法により行うことができる。
更に、例えばトローチ、舌下錠、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パップ剤、クリーム剤、ローション剤等の経皮、経粘膜薬としても使用することができる。本減感作治療剤の投与量及び投与回数は、投与経路、症状等に応じて成人１回当たり約20μｇ以下の範囲となるように適宜選択し、毎週１回程度投与される。
また、本減感作治療剤はダニアレルギー疾患に対する治療剤のみならず予防剤としても有用である。本減感作治療剤は、アナフィラキシー誘発作用もなく、人体に対して安全に用いることができる。
【００３４】
本発明の精製ダニアレルゲンはダニアレルギー疾患の診断薬として有用である。即ち、患者の血液、及びこの血液から遠心分離により得られた血球画分を緩衝液に懸濁した血球浮遊液の一定量を、それぞれ精製ダニアレルゲンを滴定試薬として用いて滴定し、アレルゲン刺激により好塩基球（白血球の一種）から遊離するヒスタミン量を測定する[ アレルギー：33,692,(1984) ／アレルギー：33,733,(1984)]。
【００３５】
このヒスタミン遊離滴定では、最大遊離量の50％量( 滴定曲線の変曲点) から遊離されるヒスタミン量を求める。この滴定では、
（i) 血球浮遊液の滴定値から患者のアレルゲン感受性を直接測定することになる。
（ii）血液の滴定値は、通常、血球浮遊液の値より高い値が得られる。これは、血漿中にアレルゲン中和能を持つIgG 抗体（遮断抗体）が存在するためである。
【００３６】
従って、対血液滴定曲線の、対血球浮遊液滴定曲線からのシフトの大きさから、遮断抗体価が得られる。感受性とこの遮断抗体価から表１のように、ダニアレルギーの正確な診断が可能となる。また、減感作治療効果のモニターとしても有用である。
【００３７】
【表１】

【００３８】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何等限定されるものではない。
なお、以下の実施例において使用される各種分析方法については、一部を除き、実施例１０の末尾にまとめて記述する。
【００３９】
実施例１
高分子粗ダニ排泄物抗原の調製：
ラット、マウス、ハムスター用飼料Ｍ（オリエンタル酵母社）中で、温度２６±２℃、湿度７５％ＲＨの環境で、ダニ密度が２〜３万匹／ｇ培地になるようにコナヒョウヒダニを飼育し、ダニ培養培地１００ｇに対して、飽和食塩水を１リットル加えてよく攪拌した。室温で３０分間静置した後、３０００ｒｐｍ、３０分遠心分離を行った。この時、ダニ虫体は上清表面に浮遊するので、これを濾過して取り除いた。沈澱に再び飽和食塩水を加えて同じ操作を繰り返した。さらに沈澱に１０ｍＭリン酸緩衝液を１リットル加えて飽和食塩水の場合と同じ操作を繰り返した（２回）。得られた抽出液を水道水に対して一夜透析し、分画分子量１万の限外濾過（膜はUF-20CS-10PS，東ソー) により分子量１０ｋＤ以上とそれ以下に分画した。各分画を濃縮し凍結乾燥して、それぞれ高分子粗ダニ排泄物抗原および低分子粗ダニ排泄物抗原とした。
ダニ培養物２２．５ｋｇから、高分子粗ダニ排泄物抗原（ＨＭ）１２４ｇを得た。これは、低分子粗ダニ排泄物抗原（ＬＭ）を約０．２％含んでいた。
【００４０】
実施例２
高分子粗ダニ排泄物抗原（ＨＭ）のウルトロゲルＡｃＡ５４による分画：
実施例１で得られた高分子粗ダニ排泄物抗原（ＨＭ）９９０ｍｇ（濃度９９０ｍｇ／３０ｍｌ生理食塩水）をウルトロゲルＡｃＡ５４カラム(IBF, サイズ 4.4×70ｃｍ）にチャージし、溶出液に生理食塩水を用いて、流速２ｍｌ／分でゲル濾過して３２ｍｌずつのフラクションに分画した。各フラクションについて、ダニアレルギー患者血清中のＩｇＧ、ＩｇＥおよびウサギ抗高分子粗ダニ排泄物抗原血清中のＩｇＧに対する反応性を測定し、また、フェノール硫酸法により中性糖量を、フォリンローリー法により蛋白質量を、そして２８０ｍμにおける吸光度をそれぞれ測定した。
これらの結果から、図１、２に示すように、これらのフラクションをＨＭ１〜ＨＭ４に分画した。ＨＭ抗原３０ｇから、ＨＭ１が６．４７ｇ、ＨＭ２が７．３６ｇ、ＨＭ３が７．４８ｇ、およびＨＭ４が０．２２ｇ得られた。
この４画分について、ダニアレルギー患者に対する皮内反応活性を調べた結果を表２に示した。
【００４１】
【表２】

【００４２】
表２から明らかなように、ＨＭ１、ＨＭ２、ＨＭ３、およびＨＭ４のすべてがダニ陽性患者に対し強い皮内反応活性を示したが、患者のＩｇＧ、ＩｇＥともに強い反応をしめしたＨＭ１についてさらに精製を進めた。
【００４３】
実施例３
ダニアレルゲンＨＭ１のセファローズ６Ｂを用いるゲル濾過による分画：
ウルトロゲルＡｃＡ５４での分画で活性の高かったＨＭ１（９９０ｍｇ／３０ｍｌ生理食塩水）をセファローズ６Ｂゲルカラム（４．４×７０ｃｍ）にチャージし、溶出液として生理食塩水を用いて、流速２ｍｌ／分でゲル濾過して３２ｍｌずつのフラクションに分けた。各フラクションについて、ダニアレルギー患者血清中のＩｇＧ、ＩｇＥおよびウサギ抗高分子粗ダニ排泄物抗原血清中のＩｇＧに対する反応性を測定し、また、フェノール硫酸法により中性糖量を、フォリンローリー法により蛋白質量を、さらに２８０ｍμにおける吸光度をもそれぞれ測定した（図３および４）。
【００４４】
これらの結果より、図３および４の上部に示すように、ＨＭ１（５．６ｇ）からＨＭ１−１（０．７３ｇ）、ＨＭ１−２（２．８７ｇ）、およびＨＭ１−３（０．５７ｇ）の３つの分画を得た。このうち、主画分であるＨＭ１−２についてさらに精製を進めた。
【００４５】
実施例４
ＤＥＡＥトヨパールを用いるイオン交換クロマトグラフィーによる、ＨＭ１−２画分からの精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、ＨＭ１−２−１Ｍの調製：
ＨＭ１−２について、ＤＥＡＥトヨパールとＣＭトヨパールのいずれに吸着するかを調べたところ、ＤＥＡＥトヨパールに吸着することが確認されたので、これを用いてイオン交換クロマトグラフィを行った。
【００４６】
まず、予め１０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいたＤＥＡＥトヨパールのカラム（３．０×１３ｃｍ）にＨＭ１−２（２００ｍｇ）をチャージし、溶出は、０．１ＭのＮａＣｌ、０．３ＭのＮａＣｌ、または１．０ＭのＮａＣｌを含む同一の緩衝液を用いて、流速３０ｍｌ／時で行い、素通り画分、０．１Ｍ画分、０．３Ｍ画分、１．０Ｍ画分に分画した。各フラクションについて、ダニアレルギー患者血清中のＩｇＧ、ＩｇＥおよびウサギ抗高分子粗ダニ排泄物抗原血清中のＩｇＧに対する反応性を測定し、また、フェノール硫酸法により中性糖量を、フォリンローリー法により蛋白質量、２８０ｍμにおける吸光度をそれぞれ測定した（図５および６）。
【００４７】
図５のヒストグラムは、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定したウサギＩｇＧに対する各フラクションの抗原性を示す。また、図中の各フラクションの総蛋白質量および中性糖量は、フォリンローリー法およびフェノール硫酸法により測定した。
図６のヒストグラムは、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した患者のＩｇＧおよびＩｇＥに対する各フラクションの抗原性を示す。
【００４８】
患者ＩｇＧおよびＩｇＥおよびウサギＩｇＧを用いたＥＬＩＳＡ法の結果より、同一画分に二つのピークをもつ０．１Ｍ画分および０．３Ｍ画分についてはそれらを各ピークで分け、それぞれＡおよびＢとした。ＨＭ１−２の２．６７ｇから素通り画分が０．５１ｇ、０．１Ａ画分が０．２７ｇ、０．１Ｂ画分が０．２９ｇ、０．３Ａ画分が０．５３ｇ、０．３Ｂ画分が０．３７ｇ、１．０Ｍ画分が０．１６ｇ得られた。
【００４９】
実施例５
精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、ＨＭ１−２−１Ｍについてのダニアレルゲン活性およびアナフィラキシー誘発試験：
本発明の精製ダニアレルゲンは、下記の実験によりアレルゲン活性を有し、アナフィラキシー誘発性は無いことが判明した。
【００５０】
実験例１
Balb/Cマウス（４週令）３匹の腹腔内に、精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、またはＨＭ１−２−１Ｍの各100 μg をフロイントの完全アジュバンド（Difco)と混合して注入することにより、０週目に初回免疫をした。追加免疫は２週目と４週目に行った。
マウスの血清中の抗ＨＭ１−２−ｅｆｆ抗体価等は、明らかな上昇が認められ、充分な免疫原性が認められた。従って、いずれも遮断抗体誘導能があり、治療用抗原として用いることができると判断された。
【００５１】
実験例２
モルモット２匹の腹腔内に、精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、またはＨＭ１−２−１Ｍの各水溶液１mgをAlumに加えて注入することにより、０週目に初回免疫をし、追加免疫は３週目に行った。対照は、モルモット１匹の腹腔内にAlumを加えた生理食塩水を同様に注入した。モルモットの血清中の抗ＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、またはＨＭ１−２−１Ｍの抗体価は、明らかな上昇を認め、充分な免疫原性が認められた。しかし、３週目の追加免疫の直後の観察では、アナフィラキシー症状は全く認められなかった。このことから、精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、およびＨＭ１−２−１Ｍにはアナフィラキシー誘発性はいずれも無いと判断された。
【００５２】
実験例３
精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、およびＨＭ１−２−１Ｍのアレルゲン活性をダニアレルギー患者に対する皮内反応試験で検定した。皮内反応試験の方法は、後述のとおりである。その結果を表３に示す。
【００５３】
【表３】

【００５４】
実験例４
ドットブロットテスト（Ｄｏｔｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｅｓｔ）
ＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、およびＨＭ１−２−１Ｍの０．００１％、０．０１％または０．１％溶液の各１μｌをニトロセルロースフィルム（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃニトロセルロース、０．４μ、アマシャム社製）にブロットし、５％スキムミルク、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ溶液に室温で１時間浸漬した。ついで、ＩｇＧ染色のために、ダニアレルギー患者のプール血清の１００倍スキムミルク希釈液をシート上に注ぎ、冷所で一夜インキュベートした。ＩｇＥ染色のためには、同血清の１０倍希釈液が用いられた。
【００５５】
このシートを０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で完全に洗浄したのち、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を含む水溶液またはビオチンと結合したヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体を含むＰＢＳＴ溶液中に室温で１時間反応した。ついで、後者については、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを含むＰＢＳＴ溶液に室温で１時間浸漬した。ＰＢＳＴで完全に洗浄した後、免疫反応をしたスポットは、シートを０．０３％の過酸化水素、０．０３％塩化ニッケル、０．０６％ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を含む５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．６）とともにインキュベートすることにより、検出した。
シートを乾燥した後、着色したスポットをポジティブの対照およびネガティブの対照として用いたｆ１（ダニアレルゲンＤｅｒｆ１）、ｆ２（ダニアレルゲンＤｅｒｆ２）およびＢＳＡと比較した。
【００５６】
その結果を表４に示す。表中、＋、＋＋および＋＋＋は、それぞれ着色した抗原濃度が０．１％、０．０１％および０．００１％であることを示す。
驚くべきことに、この実験では、代表的なダニアレルゲンであるｆ１、ｆ２よりもはるかに強い抗原性をＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、およびＨＭ１−２−１Ｍのすべてが示した。
【００５７】
【表４】

【００５８】
実施例６
精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、ＨＭ１−２−１Ｍのアレルゲン活性をダニアレルギー患者白血球ヒスタミン遊離試験により測定した。
白血球ヒスタミン遊離試験は、後述のように公知の方法に準じて行った[ アレルギー：33，692,(1984)] 。その結果を図７に示す。精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、およびＨＭ１−２−１Ｍのいずれにもヒスタミン遊離活性を認めた。
【００５９】
実施例７
精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、およびＨＭ１−２−１Ｍについて、中性糖量はフェノール硫酸法により、また蛋白質量はフォリンローリー法によりそれぞれグルコース換算又はウシ血清アルブミン換算で表示し、その重量比を表５に示す。
【００６０】
【表５】

【００６１】
表５から明らかなように、これらの精製ダニアレルゲンは、ＨＭ１−２−１Ｍを除き、５０％以上の糖を含む点で極めて特徴的である。
【００６２】
実施例８
精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、およびＨＭ１−２−１Ｍについてのアミノ酸組成分析：
各精製ダニアレルゲンについて、蛋白質の構成アミノ酸を後述の方法で分析した。その結果を表６に示す。
【００６３】
【表６】

【００６４】
実施例９
減感作治療用抗原製剤の調製：
0.5 ％フェノールを添加した 0.9％食塩水を溶媒とし、実施例４で得られた精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、またはＨＭ１−２−１Ｍをそれぞれ１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、減感作治療用抗原の原液とした。
【００６５】
実施例１０
ダニアレルギー診断用滴定試薬の調製：
ハンクス緩衝液を溶媒とし、実施例４で得られた精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、またはＨＭ１−２−１Ｍをそれぞれ１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、ヒスタミン遊離滴定用試薬の原液とした。
【００６６】
以下に、上記実施例で使用した各種分析方法および特殊な材料について述べる。
（１）ゲルクロマトグラフィー
０．９％ＮａＣｌ（生理食塩水）溶液で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ５４（カラムサイズ４．４×７０ｃｍ）又はセファローズ６Ｂ（カラムサイズ４．４×７０ｃｍ）に、遠心分離で不溶物を除いた高分子粗ダニ排泄物抗原溶液（３．３％）を３０ｍｌ添加し、生理食塩水を２ｍｌ／分の流速で流し、３２ｍｌずつのフラクションに分画した。溶出液は、ＵＶ２８０ｎｍの吸収でモニターした。
【００６７】
（２）イオン交換クロマトグラフィー
１ＮのＨＣｌ、水、１ＮのＮａＯＨ、水、１Ｎのリン酸で順次洗浄したＤＥＡＥ−トヨパール６５０ｇを詰めたカラム（３．０×１３ｃｍ）を、１０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化する。これに、同緩衝液に溶解したサンプルを加え、素通りする画分が溶出したのち、ＮａＣｌ濃度を変えて溶出を行った。
【００６８】
（３）ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）
ゲルクロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーの際の各フラクションの抗原活性、及びマウス、ウサギの抗体価の測定を本法で行った。
最初にＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレート（９６穴）に、ゲル濾過やイオン交換クロマトグラフィーでの各フラクション５０μｌ、またはマウス、ウサギの抗体価の測定の時には免疫抗原を重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．２）に溶かしたものを、５０μｌずつ入れ、３７℃で１時間インキュベートした。
溶液を吸引除去し、ウエルを洗浄用緩衝液で３回洗浄後、２００μｌの１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液をウエルに入れ、３７℃で１時間インキュベートした（ブロッキング）。
【００６９】
ウエルを洗浄後、ＥＬＩＳＡ用希釈用緩衝液で適当な濃度に希釈した血清（患者血清、ウサギ抗血清）を５０μｌ入れ室温で、１時間インキュベートした。
ウエルを洗浄後、希釈用緩衝液で希釈したペルオキシダーゼ標識の第二抗体溶液を５０μｌ入れ、室温で１時間インキュベートした。
ウエルを洗浄後、基質として０．１％のＡＢＴＳを含む０．１Ｍクエン酸緩衝液、０．３％過酸化水素を１００μｌ加え室温で反応させた。
反応時間は、１〜４０分（発色の度合いで決定）。続けて、１０ｍＭアジ化ナトリウム溶液を１００μｌ加えることにより反応を停止し、溶液の４２０ｎｍの吸収を測定した。
【００７０】
（４）皮内反応試験
サンプルを０．９％塩化ナトリウム、０．５％フェノール溶液に溶解しツベルクリン用注射器で、２０μｌをダニアレルギー患者の前腕、屈側皮内に注射し、約１５分後に現れた、赤疹、膨疹の長径、短径を測定し、その平均値で検定を行った。検定の基準は表７のとおりである。
但し、紅斑が１９ｍｍ以下でも膨疹が８ｍｍ以上ならば、陽性とする。
【００７１】
【表７】

【００７２】
（５）白血球ヒスタミン遊離試験
イオン交換クロマトグラフィーの各フラクションのアレルゲン活性の測定を本法で行った。
１．洗浄全血球浮遊液の調製法
血液サンプル１０ｍｌを遠心分離（１４００ｒｐｍ、１０分）にかけ、血球と血漿に分ける。血球は、５０ｍｌの遠心管に入れ、ハンク緩衝液を４０ｍｌ加えて遠心洗浄（１４００ｒｐｍ、１０分）を行う。上清はアスピレーターで吸引除去し、得られた血球部分を後二回ハンク緩衝液で洗浄する。この血球をハンク緩衝液で１０ｍｌに定容し洗浄全血球浮遊液とする。
【００７３】
２．ヒスタミン遊離試験法
抗原画分をハンク緩衝液に溶かし、用いたい抗原濃度の４倍濃度の抗原液を調製する。この抗原液１００μｌにハンク緩衝液を１００μｌ、上記１で調製した洗浄全血球浮遊液を２００μｌ加え、３７℃で３０分インキュベートする。
ヒスタミンが遊離した上清を、１４００ｒｐｍ、１０分の遠心分離によって２００μｌ採取し、この上清中に６０％過塩素酸を１０μｌ加え撹拌後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）によって、除タンパクした上清１４０μｌを採取する。これをヒスタミン定量ＨＰＬＣにかけ、上清中に含まれるヒスタミンを定量する。
【００７４】
血球中に含まれる全ヒスタミン量測定のために、全血球浮遊液２００μｌに直接６０％過塩素酸４０μｌを加えて、血球を破壊する。これを、３０００ｒｐｍ、１０分の遠心分離にかけ、得られた上清中に含まれるヒスタミンをヒスタミン定量ＨＰＬＣで測定し、総ヒスタミン量とする。また、非特異的に遊離するヒスタミン量を測定するために、抗原液の代わりにハンク緩衝液を用いてヒスタミン遊離試験を行い、コントロールとする。
【００７５】
（６）フェノール硫酸法（中性糖の定量法）
常法により、サンプル０．２ｍｌを試験管にとり、７％フェノール水を０．１ｍｌ加え、１０分間室温でインキュベートし、これに８５％濃硫酸１．２ｍｌを氷冷しつつ加えたのち、１００℃で１０分間加熱し、その後冷水中に３０分放置したのち、ＯＤ４９０ｎｍの吸収を測定する。
【００７６】
（７）フォリンローリー法（蛋白質の定量法）
常法により、サンプル０．２ｍｌを試験管にとり、アルカリ性銅塩溶液を１ｍｌ加え、室温で１０分間インキュベートする。これに１Ｎフェノール試薬液１ｍｌを加え、撹拌した後、室温で３０分間インキュベートし、ＯＤ７５０ｎｍの吸収を測定する。
【００７７】
（８）蛋白質のアミノ酸分析
０．２％サンプル溶液２００μｌを１２Ｎ塩酸２００μｌと混合し、Ｎ₂置換をした密封試験管内で、１１０℃、２４時間加水分解した。乾固させた後少量の水を加え再び乾固させるという操作を３回繰り返すことによって脱塩酸を行い、これをアミノ酸アナライザー用の希釈用緩衝液１ｍｌに溶解しアミノ酸アナライザー（（株）島津製作所製）により定量した。
【００７８】
（９）ウサギ抗血清
０．２％サンプル溶液５００μｌとフロイントの完全アジュバント５００μｌとを混合し乳化したものを、一週置きに、ウサギの前足の付け根のリンパ節付近に注射した。採血は、毎週、耳の静脈から行った。８週間免疫を続け、ＥＬＩＳＡ法により抗体価の上昇を確認した後、最終免疫を行い、その三日後に、耳から吸引により全採血を行った。
【００７９】
【発明の効果】
本発明の精製ダニアレルゲンは有効性および安全性の観点から有用な減感作治療用抗原であり、ダニアレルギー疾患に対する減感作治療剤・予防剤として有用である。また、本発明の精製ダニアレルゲンは、ダニアレルギー疾患の迅速かつ正確な診断において有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例２において得られた、高分子粗ダニ排泄物抗原のウルトロゲルＡｃＡ５４でのゲル濾過による溶出パターンを示す。各フラクションについて、ＥＬＩＳＡ法により測定されたウサギ血清ＩｇＧに対する抗原活性（ヒストグラム）、中性糖、蛋白質、および２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収の値がプロットしてある。
【図２】図２は、図１と同様に、実施例２において得られた、高分子粗ダニ排泄物抗原のウルトロゲルＡｃＡ５４でのゲル濾過による溶出パターンを示す。各フラクションについての患者血清ＩｇＧおよびＩｇＥに対する抗原活性（ヒストグラム）を、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収の値と共に示したものである。
【図３】図３は、実施例３において得られた、ダニアレルゲンＨＭ１のセファローズ６Ｂを用いるゲル濾過による溶出パターンを示したものである。各フラクションについて、ＥＬＩＳＡ法により測定されたウサギ血清ＩｇＧに対する抗原活性（ヒストグラム）、中性糖、蛋白質、および２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収の値がプロットしてある。
【図４】図４は、図３と同様に、実施例３において得られた、ダニアレルゲンＨＭ１のセファローズ６Ｂを用いるゲル濾過による溶出パターンを示したものである。各フラクションについての患者血清ＩｇＧおよびＩｇＥに対する抗原活性（ヒストグラム）を、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収の値と共に示したものである。
【図５】図５は、実施例４において得られた、ダニアレルゲンＨＭ１−２画分のＤＥＡＥ−トヨパールを用いるイオン交換クロマトグラフィーによる溶出パターンを示したものである。各フラクションについて、ＥＬＩＳＡ法により測定されたウサギ血清ＩｇＧに対する抗原活性（ヒストグラム）、中性糖、蛋白質、および２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収の値がプロットしてある。
【図６】図６は、図５と同様に、実施例４において得られた、ダニアレルゲンＨＭ１−２画分のＤＥＡＥ−トヨパールを用いるイオン交換クロマトグラフィーによる溶出パターンを示したものである。各フラクションについての患者血清ＩｇＧおよびＩｇＥに対する抗原活性（ヒストグラム）を、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収の値と共に示したものである。
【図７】図７は、実施例６において得られた、精製ダニアレルゲンＨＭ１−２−ｅｆｆ、ＨＭ１−２−０．１Ａ、ＨＭ１−２−０．１Ｂ、ＨＭ１−２−０．３Ａ、ＨＭ１−２−０．３Ｂ、およびＨＭ１−２−１Ｍについてのダニアレルギー患者白血球ヒスタミン遊離試験の結果を示したものである。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a purified mite allergen having allergen activity.
[0002]
[Prior art]
Indoor dust mites are important as a major cause of allergic diseases such as atopic bronchial asthma. Conventionally, as a treatment method for allergic diseases, desensitization therapy in which allergen that is the causative agent of allergy is administered and desensitized is the most important fundamental therapy, and antigens such as hay fever and insect allergies are particularly important. For easily identified diseases, the assessment is now established. However, since this hyposensitization therapy involves the risk of anaphylaxis due to allergens, it is necessary to administer a safe therapeutic antigen.
[0003]
For mite allergic diseases, as a mite allergen in indoor dust, Dermatophagoides pteronyssinus ) And mushroom mites ( Dermatophagoides farinae ) Are reported to be important [J. Allergy: 42,14-28, (1968)]. Conventionally, major mite allergens include mite excreta, glycoproteins with a molecular weight of 24-28 kD (pI 4.6-7.2) and proteins with a molecular weight of 14.5-20 kD (pI 5-8.3) contained in mite bodies. [J. Immunol.: 125 , 587-592, (1980) / J. Allergy Clin. Immunol. 76, 753-761, (1985) / Immunology: 46 , 679-687, (1982) / Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 81, 214-223, (1986) / J. Allergy Clin. Immunol. 75, 686-692, (1985) etc.].
[0004]
On the other hand, the present inventors showed a specific reactivity to the serum IgG of mite asthma patients in the higher molecular weight fraction and the lower molecular weight fraction than the main mite allergens, and induced leukocyte histamine release in tick asthma patients. Have been reported to exist (Japan Agricultural Chemical Society, 62 : 411, 1988). However, with the exception of some, purification to the extent that it can be used as an antigen for desensitization treatment has not yet been made.
[0005]
Conventionally, as a method for diagnosing mite allergic diseases, most of them have been interrogative reaction tests using indoor dust (house dust) extract or mite worm extract, mainly through interviews. The measurement value (relative value) of IgE antibody titer in serum was also used together, and it was quite difficult to directly diagnose mite allergic diseases.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Conventionally, indoor dust (house dust) extract has been used as a desensitization treatment for bronchial asthma using indoor dust mites as a specific antigen, but its composition is extremely unclear chemically. In addition, since it contains many kinds of impurities and may induce anaphylaxis, the dosage is extremely limited and the therapeutic effect is extremely low. Therefore, the appearance of useful antigens for desensitization treatment is expected from the viewpoints of efficacy and safety.
In addition, rapid and accurate diagnosis of tick allergic diseases is important for appropriate treatment of tick allergic diseases, and establishment of a diagnostic system is expected.
[0007]
The object of the present invention is exactly this point, and is to provide a novel purified mite allergen that is extremely useful as a therapeutic agent and diagnostic agent for mite allergic diseases.
That is, an object of the present invention is to provide a novel purified mite allergen having allergen activity that can be extracted from the excreta in tick culture, a method for producing the novel purified mite allergen, and a novel mite allergic disease treatment It is to provide an agent and a novel diagnostic agent for mite allergic diseases.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
In order to develop a therapeutic agent and a diagnostic agent for mite allergic diseases, the present inventors have conducted intensive studies on allergens in the extract of the mite allergic excrement. As a result, by combining various gel filtration, ion exchange chromatography and ELISA method using IgG, IgE, etc. in mite allergic patient serum, it has strong allergen activity against glycoproteins contained in various fractions. The present invention was completed through heading and further research.
[0009]
That is, the gist of the present invention is that five types of purified mite allergens having the following physicochemical and biological properties: HM1-2-eff, HM1-2-0.1B, HM1-2-0.3A, It relates to HM1-2-0.3B and HM1-2-1M.
[0010]
(1) The physicochemical and biological properties of purified mite allergen HM1-2-eff are contained in the extract of the excreta during mite culture and voided by gel filtration (saline) with Ultrogel AcA54. It is contained in the volume and the fraction eluted immediately thereafter (HM1), and then contained in the HM1-2 fraction by gel filtration (physiological saline) with Sepharose 6B. It is a component contained in a fraction eluted with 0.01 M phosphate buffer (pH 6.0) containing 01 M NaCl, and (2) is a glycoprotein containing about 90% of sugar, and (3) molecular weight. (Sepharose 6B gel filtration method) is about 150,000-155,000 and has (4) allergen activity.
[0011]
(2) The physicochemical and biological properties of the purified mite allergen HM1-2-0.1B are contained in the excrement extract during mite culture and gel filtration with Ultrogel AcA54 (saline) Is contained in the void volume and the fraction (HM1) eluting immediately thereafter, and then in the HM1-2 fraction by gel filtration (saline) with Sepharose 6B, and from DEAE-Toyopearl column chromatography. It is a component contained in a fraction eluted with a 0.01 M phosphate buffer (pH 6.0) containing 0.1 M NaCl, and (2) a glycoprotein containing about 83% of a carbohydrate, (3) (2) The molecular weight (Sepharose 6B gel filtration method) is about 150,000 to 155,000, and (4) has allergen activity.
[0012]
(3) The physicochemical and biological properties of the purified mite allergen HM1-2-0.3A are as follows: (1) Gel filtration with urtrogel AcA54 (saline) Is contained in the void volume and the fraction (HM1) eluting immediately thereafter, and then in the HM1-2 fraction by gel filtration (saline) with Sepharose 6B, and from DEAE-Toyopearl column chromatography. It is a component contained in a fraction eluted with a 0.01 M phosphate buffer (pH 6.0) containing 0.3 M NaCl, and (2) a glycoprotein containing about 76% of a carbohydrate, (3) (2) The molecular weight (Sepharose 6B gel filtration method) is about 150,000 to 155,000, and (4) has allergen activity.
[0013]
(4) The physicochemical and biological properties of the purified mite allergen HM1-2-0.3B are as follows: (1) Gel filtration with urtrogel AcA54 (saline) Is contained in the void volume and the fraction (HM1) eluting immediately thereafter, and then in the HM1-2 fraction by gel filtration (saline) with Sepharose 6B, and from DEAE-Toyopearl column chromatography. It is a component contained in a fraction eluted with 0.01 M phosphate buffer (pH 6.0) containing 0.3 M NaCl, and (2) is a glycoprotein containing about 71% of carbohydrate, and (3) (2) The molecular weight (Sepharose 6B gel filtration method) is about 150,000 to 155,000, and (4) has allergen activity.
[0014]
(5) The physicochemical and biological properties of the purified mite allergen HM1-2-1M are contained in (1) excrement extract during mite culture and voided by gel filtration (physiological saline) with Ultrogel AcA54. It is contained in the volume and the fraction eluted immediately thereafter (HM1), and then contained in the HM1-2 fraction by gel filtration (physiological saline) with Sepharose 6B, and 1. from DEAE-Toyopearl column chromatography. It is a component contained in the fraction eluted with 0.01 M phosphate buffer (pH 6.0) containing 0 M NaCl, (2) is a glycoprotein containing about 48% carbohydrate, and (3) molecular weight. (Sepharose 6B gel filtration method) is about 150,000-155,000 and has (4) allergen activity.
[0015]
The present invention also provides a method for extracting excrement in mite culture with saturated saline and / or a medium ionic strength buffer, and subjecting the resulting extract to gel filtration, ion exchange chromatography, and mite allergy. Provided is a method for producing the purified mite allergen as described above, wherein fractionation is performed by combining ELISA methods using patient serum IgG and IgE.
[0016]
Furthermore, the present invention provides a tick allergic disease therapeutic agent and a tick allergic disease diagnostic agent comprising the purified mite allergen as an active ingredient.
[0017]
In the present invention, each purified mite allergen is composed of a single purified mite allergen or a plurality of mite allergens (ie, purified mite allergens) as long as the requirements (1) to (4) are satisfied. Any embodiment of the allergen mixture) may be used.
[0018]
Hereinafter, the purified mite allergen of the present invention will be described in more detail.
That is, the properties of the purified mite allergen of the present invention are as follows.
(1) Purified mite allergen HM1-2-eff
(1) Color and properties: White (freeze-dried product)
(2) Water-soluble: Easily soluble
(3) Molecular weight: about 150,000 to 155,000 by Sepharose 6B gel filtration method. Since this substance is a glycoprotein with a high sugar content, it seems that the molecular weight is higher than the actual one.
(4) Composition component: According to the analysis from the composition component, it is a glycoprotein and the sugar content occupies about 90%. The amino acid composition is as shown in Table 6.
(5) Has allergen activity.
(6) Does not induce anaphylactic reaction.
[0019]
(2) Purified mite allergen HM1-2-0.1B
(1) Color and properties: White (freeze-dried product)
(2) Water-soluble: Easily soluble
(3) Molecular weight: about 150,000 to 155,000 by Sepharose 6B gel filtration method. Since this substance is a glycoprotein with a high sugar content, it seems that the molecular weight is higher than the actual one.
(4) Composition component: According to the analysis from the composition component, it is a glycoprotein and the sugar content occupies about 83%. The amino acid composition is as shown in Table 6.
(5) Has allergen activity.
(6) Does not induce anaphylactic reaction.
[0020]
(3) Purified mite allergen HM1-2-0.3A
(1) Color and properties: White (freeze-dried product)
(2) Water-soluble: Easily soluble
(3) Molecular weight: about 150,000 to 155,000 by Sepharose 6B gel filtration method. Since this substance is a glycoprotein with a high sugar content, it seems that the molecular weight is higher than the actual one.
(4) Composition component: According to the analysis from the composition component, it is a glycoprotein and the sugar content occupies about 76%. The amino acid composition is as shown in Table 6.
(5) Has allergen activity.
(6) Does not induce anaphylactic reaction.
[0021]
(4) Purified mite allergen HM1-2-0.3B
(1) Color and properties: White (freeze-dried product)
(2) Water-soluble: Easily soluble
(3) Molecular weight: about 150,000 to 155,000 by Sepharose 6B gel filtration method. Since this substance is a glycoprotein with a high sugar content, it seems that the molecular weight is higher than the actual one.
(4) Composition component: According to the analysis from the composition component, it is a glycoprotein and the sugar content occupies about 71%. The amino acid composition is as shown in Table 6.
(5) Has allergen activity.
(6) Does not induce anaphylactic reaction.
[0022]
(5) Purified mite allergen HM1-2-1M
(1) Color and properties: White (freeze-dried product)
(2) Water-soluble: Easily soluble
(3) Molecular weight: about 150,000 to 155,000 by Sepharose 6B gel filtration method. Since this substance is a glycoprotein with a high sugar content, it seems that the molecular weight is higher than the actual one.
(4) Composition component: According to the analysis from the composition component, it is a glycoprotein and the sugar content occupies about 48%. The amino acid composition is as shown in Table 6.
(5) Has allergen activity.
(6) Does not induce anaphylactic reaction.
[0023]
The molecular weight of the purified mite allergen of the present invention is measured by the Sepharose 6B gel filtration method. The SDS-PAGE method was inappropriate due to the high sugar content.
[0024]
The amino acid composition of the purified mite allergen of the present invention can be obtained by the following procedure. That is, 200 μl of 0.2% sample solution is mixed with 200 μl of 12N hydrochloric acid. ₂ Hydrolyze at 110 ° C. for 24 hours in a substituted sealed tube. After drying to dryness, the procedure of adding a small amount of water and drying again is repeated three times to remove hydrochloric acid, which is dissolved in 1 ml of dilution buffer for amino acid analyzer, and amino acid analyzer (Hitachi) Quantify.
[0025]
The sugar content of the purified mite allergen of the present invention is the result of quantification of total neutral sugars by the phenol sulfate method using Glucose as a standard.
[0026]
The allergen activity is judged by intradermal reaction activity for patients with mite allergy, patient leukocyte histamine release test using HPLC, dot blot test and the like.
As for the anaphylactic reaction, guinea pigs are immunized by a conventional method, and the anaphylactic reaction during booster immunization is observed.
[0027]
Examples of the method for producing the purified mite allergen of the present invention include the following methods.
a) Preparation of crude mite excretion antigen
The raw material for producing the mite antigen is not particularly limited, and for example, either a mite leopard mite or a yellow leopard mite may be used. These ticks are cultured in a tick culture medium and extracted.
Extraction is carried out by adding saturated saline and / or phosphate buffer, stirring, and allowing to stand at room temperature for 30 minutes, followed by centrifugation (3000 rpm, 30 minutes) and pooling the supernatant. At this time, any other extraction solvent may be used as long as it is a buffer solution having a moderate ionic strength. For example, a lactic acid buffer solution, an acetic acid buffer solution, a citrate buffer solution, a tris hydrochloric acid buffer solution, a borate buffer solution and the like can be mentioned. Mite bodies float on the surface of the supernatant and are removed by filtration. The pooled supernatant is filtered and dialyzed against ion-exchanged water (crude mite excrement extract) as a starting material.
Next, this crude mite excrement extract is passed through, for example, an ultrafiltration membrane (UF-20CS-10PS) having a molecular weight of 10,000 cut, and a low molecular weight crude tick excretion antigen that does not pass through this membrane. Fractionation into tick excretion antigens and further fractionation of high molecular crude tick excretion antigens.
[0028]
b) Preparation of each purified mite allergen from high molecular crude mite excretion antigen
The fraction of macromolecular mite fecal antigen is
(i) IgE, IgG specific for mite allergen in sera of mite allergic patients, rabbit anti-tick excrement antiserum, rabbit anti-tick excretion antibody, mouse monoclonal antibody specific for excrement antigen, etc. Measurement of the antigenic activity of each fraction by measuring by immunoassay (ELISA) (Immunochemistry: 8, 871, (1971)), (ii) measurement of the antigenic activity of each fraction by radioimmunoassay using rabbit anti-tick excreta antiserum,
(iii) measurement of allergen activity of each fraction by intradermal reaction activity,
(iv) Measurement of allergen activity of each fraction by leukocyte histamine releasing activity of mite allergy patients,
Purified by a suitable combination of known purification methods such as gel filtration chromatography, ultrafiltration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, focal electrophoresis, gel electrophoresis, etc. be able to.
[0029]
For example, specifically, the crude crude mite excretion antigen is subjected to gel filtration with Ultrogel AcA54. The eluate at that time was monitored by ELISA for IgG, IgE in tick allergic patient serum and IgG in rabbit anti-polymer crude tick excrement antigen serum, and fractionated using protein content and absorption at 280 nm as a guide. To do.
The fraction in which strong intradermal reaction activity is recognized is further purified with the purified mite allergen of the present invention by appropriately combining purification means such as gel filtration, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, dual mode chromatography, and reverse phase HPLC. Certain active ingredients can be purified.
[0030]
For example, first, among the various fractions fractionated with Ultrogel AcA54, the fraction showing the strongest intradermal reaction activity was further subjected to gel filtration with Sepharose 6B, and the eluate was subjected to the ELISA method as described above. To fractionate into several fractions. Of these, further purification is carried out using the fraction showing the highest antigen activity.
Next, it is generally effective to perform ion exchange chromatography. In the present invention, ion exchange chromatography using an anion exchange resin is effective. For example, a DEAE-Toyopearl column (pH 6.0 phosphate buffer, 10 mM NaCl) is charged with the active fraction and eluted using the same phosphate buffer with different NaCl concentrations. Fractionation of the eluate is performed using the ELISA method, protein mass, sugar content and the like as indices.
The purified mite allergens HM1-2-eff, HM1-2-0.1B, HM1-2-0.3A, HM1-2-0.3B, and HM1-2-1M thus obtained are white (freeze) Dried product) and easily soluble in water. In the anaphylactic reaction test using guinea pigs, the anaphylactic reaction is not induced.
[0031]
The purified mite allergen of the present invention can be applied as a therapeutic agent for mite allergic diseases, and is useful as a therapeutic agent for desensitization, for example. Here, mite allergic diseases refer to allergic diseases caused by mite specific antigens such as atopic bronchial asthma, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, atopic dermatitis and the like.
[0032]
The purified mite allergen purified by the above method is concentrated and collected as a solution or syrup, or further dried and collected as a powder and used as a desensitization treatment for mite allergic diseases. The present desensitization treatment agent is used as it is, or, if necessary, adjuvants and various additives that are generally used, such as stabilizers, excipients, solubilizers, emulsifying agents, buffering agents, soothing agents. , Preservatives, colorants and the like can be used as a compounding agent.
[0033]
The present desensitization therapeutic agent can be administered by a usual administration route such as oral, intradermal, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal administration.
Furthermore, it can also be used as transdermal and transmucosal drugs such as lozenges, sublingual tablets, eye drops, intranasal sprays, poultices, creams, lotions and the like. The dose and frequency of administration of this desensitization therapeutic agent are appropriately selected according to the route of administration, symptoms, etc. so that it is in a range of about 20 μg or less per adult, and are administered about once a week.
In addition, the present desensitization therapeutic agent is useful not only as a therapeutic agent for mite allergic diseases but also as a preventive agent. This therapeutic agent for desensitization has no anaphylaxis-inducing action and can be safely used for the human body.
[0034]
The purified mite allergen of the present invention is useful as a diagnostic agent for mite allergic diseases. That is, a certain amount of a blood cell suspension obtained by suspending a patient's blood and a blood cell fraction obtained by centrifugation from this blood in a buffer solution is titrated using purified mite allergen as a titration reagent, and allergen stimulation is performed. Measure the amount of histamine released from basophils (a type of white blood cell) [Allergy: 33 , 692, (1984) / Allergy: 33 , 733, (1984)].
[0035]
In this histamine free titration, the amount of histamine released is determined from the 50% maximum release amount (the inflection point of the titration curve). In this titration,
(I) The patient's allergen sensitivity will be measured directly from the titration value of the blood cell suspension.
(Ii) The blood titration value is usually higher than that of the blood cell suspension. This is because IgG antibody (blocking antibody) having allergen neutralizing ability is present in plasma.
[0036]
Therefore, the blocking antibody titer is obtained from the magnitude of the shift of the blood titration curve from the blood cell suspension droplet titration curve. From the sensitivity and this blocking antibody titer, as shown in Table 1, an accurate diagnosis of tick allergy becomes possible. It is also useful as a monitor for desensitization treatment effects.
[0037]
[Table 1]

[0038]
【Example】
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
Various analysis methods used in the following examples are collectively described at the end of Example 10 except for some of them.
[0039]
Example 1
Preparation of macromolecular crude mite excretion antigen:
In a diet M for rats, mice, and hamsters (Oriental Yeast Co., Ltd.) One liter of saturated saline was added to 100 g of mite culture medium and stirred well. After leaving still at room temperature for 30 minutes, it centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes. At this time, the mite bodies floated on the surface of the supernatant and were removed by filtration. Saturated saline was added again to the precipitate, and the same operation was repeated. Further, 1 liter of 10 mM phosphate buffer was added to the precipitate, and the same operation as in the case of saturated saline was repeated (twice). The obtained extract was dialyzed overnight against tap water and fractionated to a molecular weight of 10 kD or more by ultrafiltration with a molecular weight cut off of 10,000 (membrane is UF-20CS-10PS, Tosoh). Each fraction was concentrated and freeze-dried to obtain a high molecular weight crude mite excretion antigen and a low molecular weight crude mite excretion antigen, respectively.
From 22.5 kg of mite culture, 124 g of high molecular crude mite excretion antigen (HM) was obtained. This contained about 0.2% of low molecular weight crude tick excretion antigen (LM).
[0040]
Example 2
Fractionation of macromolecular mite excretion antigen (HM) with Ultrogel AcA54:
Charge 990 mg (concentration 990 mg / 30 ml physiological saline) of the macromolecular crude mite excretion antigen (HM) obtained in Example 1 to an Ultrogel AcA54 column (IBF, size 4.4 × 70 cm), and add physiological saline to the eluate. Using, gel-filtered at a flow rate of 2 ml / min and fractionated into 32 ml fractions. For each fraction, the reactivity of IgG in the mite allergy patient serum and IgG in the serum of rabbit anti-polymer crude mite excrement antigen was measured. Protein mass and absorbance at 280 mμ were measured respectively.
From these results, as shown in FIGS. 1 and 2, these fractions were fractionated into HM1 to HM4. From 30 g of HM antigen, 6.47 g of HM1, 7.36 g of HM2, 7.48 g of HM3, and 0.22 g of HM4 were obtained.
Table 2 shows the results of examining the intradermal reaction activity of tick allergic patients for these four fractions.
[0041]
[Table 2]

[0042]
As is clear from Table 2, HM1, HM2, HM3, and HM4 all showed strong intradermal activity against tick-positive patients, but further purification was performed on HM1 that showed strong responses to both patient IgG and IgE. Proceeded.
[0043]
Example 3
Fractionation by gel filtration using mite allergen HM1 Sepharose 6B:
HM1 (990 mg / 30 ml physiological saline), which was highly active in fractionation with Ultrogel AcA54, was charged to a Sepharose 6B gel column (4.4 × 70 cm), and physiological saline was used as the eluent, and the flow rate was 2 ml / min. And gel-filtered into 32 ml fractions. For each fraction, the reactivity of IgG in the mite allergy patient serum and IgG in the serum of rabbit anti-polymer crude mite excrement antigen was measured. Protein mass was also measured for absorbance at 280 mμ (FIGS. 3 and 4), respectively.
[0044]
From these results, as shown at the top of FIGS. 3 and 4, HM1 (5.6 g) to HM1-1 (0.73 g), HM1-2 (2.87 g), and HM1-3 (0.57 g) 3 fractions were obtained. Of these, HM1-2, the main fraction, was further purified.
[0045]
Example 4
Purified mite allergens HM1-2-eff, HM1-2-0.1A, HM1-2-0.1B, HM1-2-0.3A, HM1 from the HM1-2 fraction by ion exchange chromatography using DEAE Toyopearl Preparation of -2-0.3B, HM1-2-1M:
When HM1-2 was adsorbed on DEAE Toyopearl or CM Toyopearl, it was confirmed that it was adsorbed on DEAE Toyopearl, and ion exchange chromatography was performed using this.
[0046]
First, HM1-2 (200 mg) was charged to a DEAE Toyopearl column (3.0 × 13 cm) that had been equilibrated in advance with 10 mM phosphate buffer (pH 6.0) containing 10 mM NaCl. , Using the same buffer containing 1 M NaCl, 0.3 M NaCl, or 1.0 M NaCl at a flow rate of 30 ml / hr, passing through, 0.1 M, 0.3 M, Fractionated into 1.0M fractions. For each fraction, the reactivity of IgG in the mite allergy patient serum and IgG in the serum of rabbit anti-polymer crude mite excrement antigen was measured. The protein mass and absorbance at 280 mμ were measured (FIGS. 5 and 6).
[0047]
The histogram of FIG. 5 shows the antigenicity of each fraction against rabbit IgG as measured using ELISA. In addition, the total protein amount and neutral sugar amount of each fraction in the figure were measured by the Folin Lory method and the phenol sulfate method.
The histogram of FIG. 6 shows the antigenicity of each fraction against IgG and IgE of the patient as measured using the ELISA method.
[0048]
From the results of ELISA using patient IgG, IgE, and rabbit IgG, the 0.1M and 0.3M fractions having two peaks in the same fraction were separated by each peak, did. From 2.67 g of HM1-2, the flow-through fraction was 0.51 g, the 0.1A fraction was 0.27 g, the 0.1B fraction was 0.29 g, the 0.3A fraction was 0.53 g, and the 0.3B fraction. A fraction of 0.37 g and a 1.0M fraction of 0.16 g were obtained.
[0049]
Example 5
Mite allergens for purified mite allergens HM1-2-eff, HM1-2-0.1A, HM1-2-0.1B, HM1-2-0.3A, HM1-2-0.3B, HM1-2-1M Activity and anaphylaxis induction test:
The purified mite allergen of the present invention was found to have allergen activity and not to induce anaphylaxis by the following experiment.
[0050]
Experimental example 1
In the abdominal cavity of three Balb / C mice (4 weeks old), purified mite allergens HM1-2-eff, HM1-2-0.1A, HM1-2-0.1B, HM1-2-0.3A, HM1 Initial immunization was performed at week 0 by injecting 100 μg each of -2-0.3B or HM1-2-1M with Freund's complete adjuvant (Difco). Booster immunizations were performed at 2 and 4 weeks.
The anti-HM1-2-eff antibody titer and the like in the mouse serum was clearly increased and sufficient immunogenicity was observed. Therefore, it was judged that all have blocking antibody induction ability and can be used as therapeutic antigens.
[0051]
Experimental example 2
In the abdominal cavity of two guinea pigs, purified mite allergens HM1-2-eff, HM1-2-0.1A, HM1-2-0.1B, HM1-2-0.3A, HM1-2-0.3B, or By adding 1 mg of each aqueous solution of HM1-2-1M to Alum and injecting it, the first immunization was performed at week 0, and boosting was performed at week 3. As a control, physiological saline supplemented with Alum was injected into the abdominal cavity of one guinea pig in the same manner. Anti-HM1-2-eff, HM1-2-0.1A, HM1-2-0.1B, HM1-2-0.3A, HM1-2-0.3B, or HM1-2-1M in guinea pig serum The antibody titer was clearly increased and sufficient immunogenicity was observed. However, the observation immediately after the booster immunization at 3 weeks showed no anaphylactic symptoms. From this, purified mite allergens HM1-2-eff, HM1-2-0.1A, HM1-2-0.1B, HM1-2-0.3A, HM1-2-0.3B, and HM1-2-2- It was determined that 1M was not anaphylaxis-induced.
[0052]
Experimental example 3
Allergen activity of purified mite allergens HM1-2-eff, HM1-2-0.1A, HM1-2-0.1B, HM1-2-0.3A, HM1-2-0.3B, and HM1-2-1M Were tested in an intradermal reaction test for mite allergic patients. The method of the intradermal reaction test is as described below. The results are shown in Table 3.
[0053]
[Table 3]

[0054]
Experimental Example 4
Dot immunoblot test
0.001% of HM1-2-eff, HM1-2-0.1A, HM1-2-0.1B, HM1-2-0.3A, HM1-2-0.3B, and HM1-2-1M, 1 μl each of 0.01% or 0.1% solution was blotted onto nitrocellulose film (Hybond-C nitrocellulose, 0.4 μ, Amersham), 5% skim milk, 0.2% Tween 20, 0.02 It was immersed in a PBS solution containing% sodium azide for 1 hour at room temperature. Subsequently, for IgG staining, a 100-fold skim milk dilution of tick allergic patient pool serum was poured onto the sheet and incubated overnight in a cold place. A 10-fold dilution of the same serum was used for IgE staining.
[0055]
This sheet is thoroughly washed with PBS containing 0.2% Tween 20 (PBST), and then an aqueous solution containing a goat anti-human IgG antibody conjugated with horseradish peroxidase or a PBST solution containing a goat anti-human IgE antibody conjugated with biotin. For 1 hour at room temperature. Subsequently, the latter was immersed in a PBST solution containing streptavidin-peroxidase for 1 hour at room temperature. After thorough washing with PBST, the immunoreacted spots were obtained in 50 mM Tris buffer (pH 7. 5) containing 0.03% hydrogen peroxide, 0.03% nickel chloride, 0.06% diaminobenzidine (DAB). It was detected by incubating with 6).
After the sheets were dried, the colored spots were compared to f1 (mite allergen Der f1), f2 (mite allergen Der f2) and BSA used as positive and negative controls.
[0056]
The results are shown in Table 4. In the table, +, ++ and +++ indicate that the colored antigen concentrations are 0.1%, 0.01% and 0.001%, respectively.
Surprisingly, in this experiment, HM1-2-eff, HM1-2-0.1A, HM1-2-0.1B, HM1 have a much stronger antigenicity than the typical mite allergens f1, f2. All of -2-0.3A, HM1-2-0.3B, and HM1-2-1M were shown.
[0057]
[Table 4]

[0058]
Example 6
Allergen activity of purified mite allergens HM1-2-eff, HM1-2-0.1A, HM1-2-0.1B, HM1-2-0.3A, HM1-2-0.3B, HM1-2-1M It was measured by leukocyte histamine release test in patients with mite allergy.
The leukocyte histamine release test was performed according to a known method as described below [Allergy: 33 , 692, (1984)]. The result is shown in FIG. Purified mite allergen HM1-2-eff, HM1-2-0.1A, HM1-2-0.1B, HM1-2-0.3A, HM1-2-0.3B, and HM1-2-1M Also showed histamine releasing activity.
[0059]
Example 7
For purified mite allergens HM1-2-eff, HM1-2-0.1A, HM1-2-0.1B, HM1-2-0.3A, HM1-2-0.3B, and HM1-2-1M, The amount of saccharides is expressed in terms of glucose or bovine serum albumin by the phenol-sulfuric acid method, and the protein mass by the Follin-Lory method. The weight ratios are shown in Table 5.
[0060]
[Table 5]

[0061]
As is apparent from Table 5, these purified mite allergens are very characteristic in that they contain 50% or more sugars, except for HM1-2-1M.
[0062]
Example 8
Amino acids for purified mite allergens HM1-2-eff, HM1-2-0.1A, HM1-2-0.1B, HM1-2-0.3A, HM1-2-0.3B, and HM1-2-1M Composition analysis:
For each purified mite allergen, the constituent amino acids of the protein were analyzed by the method described below. The results are shown in Table 6.
[0063]
[Table 6]

[0064]
Example 9
Preparation of antigen preparation for desensitization treatment:
The purified mite allergens HM1-2-eff, HM1-2-0.1A, HM1-2-0.1B, and HM1-2 obtained in Example 4 were prepared using 0.9% saline with 0.5% phenol added as a solvent. 0.3A, HM1-2-0.3B, or HM1-2-1M was dissolved at a concentration of 1 mg / ml, respectively, to prepare a stock solution for antigen for desensitization treatment.
[0065]
Example 10
Preparation of titration reagent for tick allergy diagnosis:
Purified mite allergens HM1-2-eff, HM1-2-0.1A, HM1-2-0.1B, HM1-2-0.3A, HM1-2 obtained in Example 4 using Hanks buffer as a solvent -0.3B or HM1-2-1M was dissolved at a concentration of 1 mg / ml, respectively, to prepare a stock solution for a histamine free titration reagent.
[0066]
The various analysis methods and special materials used in the above examples are described below.
(1) Gel chromatography
A high concentration of Ultrogel AcA54 (column size 4.4 × 70 cm) or Sepharose 6B (column size 4.4 × 70 cm) equilibrated with 0.9% NaCl (saline) solution to remove insolubles by centrifugation. 30 ml of a crude molecular mite excrement antigen solution (3.3%) was added, and physiological saline was flowed at a flow rate of 2 ml / min, and fractionated into 32 ml fractions. The eluate was monitored by UV 280 nm absorption.
[0067]
(2) Ion exchange chromatography
A column (3.0 × 13 cm) packed with 650 g of DEAE-Toyopearl washed successively with 1N HCl, water, 1N NaOH, water and 1N phosphoric acid was added to a 10 mM phosphate buffer (pH 6. 0) equilibrate. A sample dissolved in the same buffer was added to this, and after passing through the fraction eluted, elution was carried out by changing the NaCl concentration.
[0068]
(3) ELISA method (enzyme immunoassay)
The antigenic activity of each fraction during gel chromatography and ion exchange chromatography, and the antibody titers of mice and rabbits were measured by this method.
First, in an ELISA microtiter plate (96 wells), 50 μl of each fraction by gel filtration or ion exchange chromatography, or when measuring the antibody titer of mice or rabbits, the immune antigen is bicarbonate buffer (pH 9.2). 50 μl each was dissolved in and incubated at 37 ° C. for 1 hour.
The solution was removed by aspiration, and the well was washed 3 times with washing buffer, and then 200 μl of 1% bovine serum albumin (BSA) solution was added to the well and incubated at 37 ° C. for 1 hour (blocking).
[0069]
After washing the wells, 50 μl of serum (patient serum, rabbit antiserum) diluted to an appropriate concentration with ELISA dilution buffer was added and incubated at room temperature for 1 hour.
After washing the wells, 50 μl of a peroxidase-labeled second antibody solution diluted with a dilution buffer was added and incubated at room temperature for 1 hour.
After washing the wells, 100 μl of 0.1 M citrate buffer containing 0.1% ABTS as a substrate and 0.3% hydrogen peroxide was added and allowed to react at room temperature.
The reaction time is 1 to 40 minutes (determined by the degree of color development). Subsequently, the reaction was stopped by adding 100 μl of 10 mM sodium azide solution, and the absorbance at 420 nm of the solution was measured.
[0070]
(4) Intradermal reaction test
The sample was dissolved in 0.9% sodium chloride and 0.5% phenol solution, and 20 μl was injected with a tuberculin syringe into the forearm and flexor skin of a tick allergic patient. The major axis and the minor axis were measured and the average value was used for the test. Table 7 shows the standard of the test.
However, if erythema is 19 mm or less and wheal is 8 mm or more, it is considered positive.
[0071]
[Table 7]

[0072]
(5) Leukocyte histamine release test
The allergen activity of each fraction of ion exchange chromatography was measured by this method.
1. Preparation of washed whole blood cell suspension
A 10 ml blood sample is centrifuged (1400 rpm, 10 minutes) and divided into blood cells and plasma. Blood cells are put into a 50 ml centrifuge tube, 40 ml of Hank's buffer solution is added, and centrifugal washing (1400 rpm, 10 minutes) is performed. The supernatant is removed by suction with an aspirator, and the resulting blood cell portion is washed twice with Hank's buffer. The blood cells are made up to a volume of 10 ml with Hank's buffer and used as a washed whole blood cell suspension.
[0073]
2. Histamine release test method
The antigen fraction is dissolved in Hank's buffer to prepare an antigen solution having a concentration 4 times the antigen concentration to be used. Add 100 μl of Hank's buffer and 200 μl of the washed whole blood cell suspension prepared in 1 above to 100 μl of this antigen solution, and incubate at 37 ° C. for 30 minutes.
200 μl of the supernatant from which histamine was released was collected by centrifugation at 1400 rpm for 10 minutes, 10 μl of 60% perchloric acid was added to the supernatant, and the protein was deproteinized by centrifugation (3000 rpm, 10 minutes). Collect 140 μl of clean. This is subjected to histamine quantitative HPLC, and histamine contained in the supernatant is quantified.
[0074]
In order to measure the total amount of histamine contained in blood cells, 40 μl of 60% perchloric acid is directly added to 200 μl of whole blood cell suspension to destroy the blood cells. This is subjected to centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes, and histamine contained in the obtained supernatant is measured by histamine quantitative HPLC to obtain the total amount of histamine. In addition, in order to measure the amount of nonspecifically released histamine, a histamine release test is performed using a Hank buffer instead of the antigen solution, and used as a control.
[0075]
(6) Phenolic sulfate method (quantitative determination of neutral sugars)
In a conventional manner, 0.2 ml of a sample is placed in a test tube, 0.1 ml of 7% phenol water is added, and incubated at room temperature for 10 minutes. To this, 1.2 ml of 85% concentrated sulfuric acid is added with ice cooling, and then 100 ° C. For 10 minutes and then left in cold water for 30 minutes before measuring the absorbance at OD490nm.
[0076]
(7) Fallin-lorry method (protein quantification method)
In a conventional manner, 0.2 ml of a sample is taken into a test tube, 1 ml of an alkaline copper salt solution is added, and incubated at room temperature for 10 minutes. To this, 1 ml of 1N phenol reagent solution is added, stirred, and incubated at room temperature for 30 minutes, and the absorbance at OD 750 nm is measured.
[0077]
(8) Amino acid analysis of proteins
Mix 200 μl of 0.2% sample solution with 200 μl of 12N hydrochloric acid, ₂ Hydrolysis was performed at 110 ° C. for 24 hours in the replaced sealed test tube. Dehydration is performed by repeating the operation of adding a small amount of water and drying again after drying three times. This is dissolved in 1 ml of dilution buffer for amino acid analyzer and dissolved in amino acid analyzer (manufactured by Shimadzu Corporation). ).
[0078]
(9) Rabbit antiserum
An emulsified mixture of 500 μl of a 0.2% sample solution and 500 μl of Freund's complete adjuvant was injected into the vicinity of the lymph node at the base of the rabbit's front foot every other week. Blood collection was performed weekly from the ear vein. Immunization was continued for 8 weeks, and after confirming an increase in antibody titer by ELISA, final immunization was performed. Three days later, whole blood was collected by aspiration from the ear.
[0079]
【The invention's effect】
The purified mite allergen of the present invention is a useful antigen for desensitization treatment from the viewpoint of efficacy and safety, and is useful as a desensitization treatment / prevention agent for mite allergic diseases. Moreover, the purified mite allergen of the present invention is useful for rapid and accurate diagnosis of tick allergic diseases.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows an elution pattern obtained by gel filtration of a crude crude mite excretion antigen obtained in Example 2 with Ultrogel AcA54. For each fraction, the antigenic activity (histogram) against rabbit serum IgG, neutral sugar, protein, and UV absorption at 280 nm measured by ELISA are plotted.
FIG. 2 shows the elution pattern of the crude crude mite excretion antigen obtained in Example 2 by gel filtration with Ultrogel AcA54, as in FIG. Antigen activity (histogram) against patient serum IgG and IgE for each fraction is shown along with the value of UV absorption at 280 nm.
FIG. 3 shows the elution pattern obtained by gel filtration using mite allergen HM1 Sepharose 6B obtained in Example 3. For each fraction, the antigenic activity (histogram) against rabbit serum IgG measured by ELISA, neutral sugar, protein, and UV absorption values at 280 nm are plotted.
FIG. 4 shows the elution pattern by gel filtration using Sepharose 6B of mite allergen HM1 obtained in Example 3, as in FIG. Antigen activity (histogram) against patient serum IgG and IgE for each fraction is shown along with the value of UV absorption at 280 nm.
FIG. 5 shows the elution pattern obtained by ion exchange chromatography using DEAE-Toyopearl of the mite allergen HM1-2 fraction obtained in Example 4. For each fraction, the antigenic activity (histogram) against rabbit serum IgG measured by ELISA, neutral sugar, protein, and UV absorption values at 280 nm are plotted.
FIG. 6 shows the elution pattern by ion exchange chromatography using DEAE-Toyopearl of the mite allergen HM1-2 fraction obtained in Example 4, as in FIG. Antigen activity (histogram) against patient serum IgG and IgE for each fraction is shown along with the value of UV absorption at 280 nm.
7 shows purified mite allergens HM1-2-eff, HM1-2-0.1A, HM1-2-0.1B, HM1-2-0.3A, and HM1 obtained in Example 6. FIG. The result of the leukocyte histamine release test for mite allergy patients for -2-0.3B and HM1-2-1M is shown.

Claims

A purified mite allergen having the following physicochemical and biological properties:
1) The excrement extract in mite culture is fractionated to a molecular weight of 10 kD or more, and the obtained fraction having a molecular weight of 10 kD or more is charged to a 4.4 × 70 cm size Ultrogel AcA54 column, This is a fraction group that elutes into void fractions and the fractions that elute immediately after the gel filtration using a saline solution at a flow rate of 2 ml / min and fractionated into 32 ml fractions. The first fraction group (HM1) was obtained, and the HM1 was charged onto a 4.4 × 70 cm Sepharose 6B column , and subjected to gel filtration at a flow rate of 2 ml / min using physiological saline as an eluent. To obtain a second fraction group ( HM1-2 ) when the total elution fraction is roughly divided into three fractions , and the obtained HM1-2 is preliminarily mixed with 10 mM NaCl. Including 10m Was charged to a column (3.0 × 13cm) of DEAE Toyopearl that had been equilibrated with phosphate buffer (pH 6.0), it is a component contained in the fraction that passed through,
2) a glycoprotein containing about 90% of carbohydrates,
3) The molecular weight (Sepharose 6B gel filtration method) is about 150,000-155,000,
4) Has allergen activity.

A purified mite allergen having the following physicochemical and biological properties:
1) The excrement extract in mite culture is fractionated to a molecular weight of 10 kD or more, and the obtained fraction having a molecular weight of 10 kD or more is charged to a 4.4 × 70 cm size Ultrogel AcA54 column, This is a fraction group that elutes into void fractions and the fractions that elute immediately after the gel filtration using a saline solution at a flow rate of 2 ml / min and fractionated into 32 ml fractions. The first fraction group (HM1) was obtained, and the HM1 was charged onto a 4.4 × 70 cm Sepharose 6B column , and subjected to gel filtration at a flow rate of 2 ml / min using physiological saline as an eluent. To obtain a second fraction group ( HM1-2 ) when the total elution fraction is roughly divided into three fractions , and the obtained HM1-2 is preliminarily mixed with 10 mM NaCl. Including 10m It was charged to a column of DEAE-Toyopearl that had been equilibrated with phosphate buffer (pH6.0) (3.0 × 13cm) , 0.01M phosphate buffer containing 0.1M NaCl and (pH 6.0) It is a component contained in the fraction eluted by using it as an eluate.
2) is a glycoprotein containing about 83% carbohydrates,
3 ) The molecular weight (Sepharose 6B gel filtration method) is about 150,000-155,000,
4) Has allergen activity.

A purified mite allergen having the following physicochemical and biological properties:
1) The excrement extract in mite culture is fractionated to a molecular weight of 10 kD or more, and the obtained fraction having a molecular weight of 10 kD or more is charged to a 4.4 × 70 cm size Ultrogel AcA54 column, This is a fraction group that elutes into void fractions and the fractions that elute immediately after the gel filtration using a saline solution at a flow rate of 2 ml / min and fractionated into 32 ml fractions. The first fraction group (HM1) was obtained, and the HM1 was charged onto a 4.4 × 70 cm Sepharose 6B column , and subjected to gel filtration at a flow rate of 2 ml / min using physiological saline as an eluent. To obtain a second fraction group ( HM1-2 ) when the total elution fraction is roughly divided into three fractions , and the obtained HM1-2 is preliminarily mixed with 10 mM NaCl. Including 10m It was charged to a column of DEAE-Toyopearl that had been equilibrated with phosphate buffer (pH6.0) (3.0 × 13cm) , 0.01M phosphate buffer containing 0.3M of NaCl and (pH 6.0) It is a component contained in the fraction eluted by using it as an eluate.
2) a glycoprotein containing about 76% of carbohydrates,
3) The molecular weight (Sepharose 6B gel filtration method) is about 150,000-155,000,
4) Has allergen activity.

A purified mite allergen having the following physicochemical and biological properties:
1) The excrement extract in mite culture is fractionated to a molecular weight of 10 kD or more, and the obtained fraction having a molecular weight of 10 kD or more is charged to a 4.4 × 70 cm size Ultrogel AcA54 column, This is a fraction group that elutes into void fractions and the fractions that elute immediately after the gel filtration using a saline solution at a flow rate of 2 ml / min and fractionated into 32 ml fractions. The first fraction group (HM1) was obtained, and the HM1 was charged onto a 4.4 × 70 cm Sepharose 6B column , and subjected to gel filtration at a flow rate of 2 ml / min using physiological saline as an eluent. To obtain a second fraction group ( HM1-2 ) when the total elution fraction is roughly divided into three fractions , and the obtained HM1-2 is preliminarily mixed with 10 mM NaCl. Including 10m It was charged to a column of DEAE-Toyopearl that had been equilibrated with phosphate buffer (pH6.0) (3.0 × 13cm) , 0.01M phosphate buffer containing 0.3M of NaCl and (pH 6.0) It is a component contained in the fraction eluted by using it as an eluate.
2) is a glycoprotein containing about 71% of carbohydrates,
3) The molecular weight (Sepharose 6B gel filtration method) is about 150,000-155,000,
4) Has allergen activity.

A purified mite allergen having the following physicochemical and biological properties:
1) The excrement extract in mite culture is fractionated to a molecular weight of 10 kD or more, and the obtained fraction having a molecular weight of 10 kD or more is charged to a 4.4 × 70 cm size Ultrogel AcA54 column, This is a fraction group that elutes into void fractions and the fractions that elute immediately after the gel filtration using a saline solution at a flow rate of 2 ml / min and fractionated into 32 ml fractions. The first fraction group (HM1) was obtained, and the HM1 was charged onto a 4.4 × 70 cm Sepharose 6B column , and subjected to gel filtration at a flow rate of 2 ml / min using physiological saline as an eluent. To obtain a second fraction group ( HM1-2 ) when the total elution fraction is roughly divided into three fractions , and the obtained HM1-2 is preliminarily mixed with 10 mM NaCl. Including 10m It was charged to a column (3.0 × 13cm) of DEAE Toyopearl that had been equilibrated with phosphate buffer (pH 6.0), 0.01 M phosphate buffer containing 1.0M NaCl and (pH 6.0) It is a component contained in the fraction eluted by using it as an eluate.
2) A glycoprotein containing about 48% of carbohydrates,
3) The molecular weight (Sepharose 6B gel filtration method) is about 150,000-155,000,
4) Has allergen activity.

Excrement in mite culture is extracted with saturated saline and / or medium ionic strength buffer, and the resulting extract is used with techniques such as gel filtration and ion exchange chromatography, and using tick patient serum IgG and IgE The method for producing purified mite allergen according to any one of claims 1 to 5, wherein fractionation is performed by combining ELISA techniques.

A therapeutic agent for mite allergic diseases comprising the purified mite allergen according to any one of claims 1 to 5 as an active ingredient.

A tick allergic disease diagnostic agent comprising the purified mite allergen according to any one of claims 1 to 5 as an active ingredient.