JP3726875B2

JP3726875B2 - Periodontal disease bacterial endotoxin neutralizer, periodontal disease causative agent inhibitor and oral composition

Info

Publication number: JP3726875B2
Application number: JP29867399A
Authority: JP
Inventors: 修二佐々木
Original assignee: Lion Corp
Current assignee: Lion Corp
Priority date: 1999-09-14
Filing date: 1999-09-14
Publication date: 2005-12-14
Anticipated expiration: 2019-09-14
Also published as: JP2001089339A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、歯周病細菌内毒素中和剤、歯周病原因菌付着抑制剤、更には、歯周病細菌内毒素を中和し、また歯周病原因菌の付着を抑制することにより歯周疾患の予防や治療用に有効な口腔組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
歯周疾患の病原性因子として、付着因子（線毛、レクチン様リガンド）、内毒素、組織破壊性酵素（コラゲナーゼ、トリプシン様酵素）、白血球抵抗因子（莢膜、スーパーオキサイドデスムターゼ、ロイコトリエン）及び細胞毒性代謝物（硫化水素、脂肪酸）などがある。なかでも細菌内毒素は、直接あるいは間接的に歯周組織に対して炎症を惹起したり、歯槽骨吸収を促進したりすることが確認されている。
【０００３】
そこで内毒素の関与する歯周疾患の予防、治療の従来技術として、マクロライド系抗生物質による歯周組織再生の前処置剤（特開平７−２６７８６７号公報）、オクタデシルプロピルジメチルアンモニウム固定の水不溶性固体による内毒素吸着除去剤（特開平８−２６９５４号公報）が提案されている。
【０００４】
しかしながら、これらの技術を歯周疾患の予防、治療に応用するには、耐性菌の出現、副作用および歯牙へのステイン付着等の問題があった。従って、細菌内毒素を中和し得るより有効な技術の開発が望まれていた。
【０００５】
一方、歯周病原因菌の付着を抑制、防止する代表薬剤としてクロルヘキシジンがあるが、歯牙への着色問題や味覚への影響があった（縁下プラークの抑制法、クインテッセンス出版株式会社発行、１９９１年９月３０日）。
【０００６】
このように本発明は、上記事情に鑑みなされたもので、優れた細菌内毒素活性抑制作用を有し、また、細菌の歯牙、粘膜に対する付着抑制効果も期待でき、しかも長期間使用しても安全な歯周病細菌内毒素中和剤、歯周病原因菌付着抑制剤及び口腔用組成物を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
本発明者は上記目的を達成するため鋭意検討を重ねた結果、（Ｉ）ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物およびラクトフェリン関連ペプチドから選ばれる１種以上と（ＩＩ）構成アミノ酸数が１〜３個である成分とを組み合わせた場合、後述する実験例から認められるように、アクチノバシルス・アクチノマイセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、フゾバクテリウム・ヌクレエータム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍ）等の歯周病細菌の内毒素を効果的に中和し得ること、また、アクチノマイセス・ナエスランデイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）等の歯周病原因菌の付着を抑制し得ることから、歯周疾患の予防及び治療に応用できる口腔用組成物が得られることを知見し、本発明をなすに至った。
【０００８】
従って、本発明は、（Ｉ）ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物およびラクトフェリン関連ペプチドから選ばれる１種以上と、（ＩＩ）グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、アラニン、ロイシン、ヒスチジンおよびプロリンから選ばれる１種又は２種以上のアミノ酸からなり、構成アミノ酸数が１〜３個であるアミノ酸又はペプチド成分とからなる、アクチノバシルス・アクチノマイセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、フゾバクテリウム・ヌクレエータム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍ）から選ばれる歯周病細菌内毒素中和剤およびアクチノマイセス・ナエスランデイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）の歯周病原因菌付着抑制剤、上記（Ｉ）成分を組成物全体に対して固形分重量で０．００１〜３％と（ＩＩ）成分を組成物全体に対して固形分重量で０．００１〜５％とを、前記（Ｉ）／（ＩＩ）の配合比率（モル比）が０．０００１〜１０の範囲で、上記特定菌の歯周病細菌内毒素中和および／または歯周病原因菌付着抑制有効成分として含有してなることを特徴とする口腔用組成物を提供する。
【０００９】
以下、本発明を具体的に説明する。本発明で用いられるラクトフェリンは動物の体内に広く分布しているものであり、ラクトフェリンの生物学的機能としては、抗菌作用、抗ウイルス作用、生体防御作用および内毒素中和作用を有し、ムチン産生促進剤（特開平９−１２４７３号公報）、新規医薬組成物（特開平８−２１７６９３号公報）等が特許出願されている。
【００１０】
本発明に提供されるラクトフェリン関連成分の資源としては、哺乳動物の乳牛からの生産物、植物（トマト、イネ、タバコ）からの生産物、麹カビからの生産物、牛乳中で産生したヒト型ラクトフェリンおよび合成品のいずれであっても良い。本発明に提供するラクトフェリンは、特にウシ由来のものが好ましい。
【００１１】
本発明に提供するラクトフェリン分解物とは、酸分解物、ペプシン分解物を指し、ラクトフェリンと同様の生物学的機能を有している。ラクトフェリン酸加水分解物を有効成分とする抗菌剤およびそれを配合した化粧料（特開平６−２７９３１０号公報）、抗菌剤とこの抗菌剤を用いて物品を処理する方法（特開平５−３２００６７号公報）等が特許出願されている。本発明に用いるラクトフェリン分解物は、特に酸分解物が好ましい。
【００１２】
本発明に提供されるラクトフェリン関連ペプチドとは、１５個から５０個のアミノ酸で構成されたラクトフェリンおよびその分解物由来のペプチドを指す。これらペプチドの生物学的機能としては、強い抗菌作用、生体防御作用および内毒素中和作用があげられ、抗菌剤とこの抗菌剤を用いて物品を処理する方法（特開平５−３２００６７）が特許出願されている。ラクトフェリン関連ペプチドは、特に２５個のアミノ酸からなるウシ・ラクトフェリンのＮ−末端から調製したラクトフェリシンＢが良い。
【００１３】
ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物およびラクトフェリン関連ペプチド（Ｉ）の配合量は、口腔用組成物全体の０．００１〜３％（固形分重量、以下同様）、特に０．０１〜１．５％とすることが好ましい。０．００１％未満であると、アミノ酸、又は２〜３個のアミノ酸からなるペプチドと組み合わせた場合、口腔唾液中および歯肉溝滲出液中の内毒素を十分に抑制できないし、又、歯周病原因菌の歯牙、粘膜への付着抑制も十分でない。３％を超えると、効果が定常に達し、又、製剤中での溶解性、安定性に問題が生ずる。
【００１４】
本発明で提供される（ＩＩ）構成アミノ酸数が１〜３個である成分はグルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、アラニン、ロイシン、ヒスチジンおよびプロリンから選ばれる１種又は２種以上のアミノ酸からなり、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニン、ＤＬ−アラニル−ＤＬ−アラニン、グリシル−Ｌ−ロイシン、グリシル−Ｌ−プロリン、グリシル−グリシン、ＤＬ−アラニル−ＤＬ−ノルバリン、Ｌ−ロイシル−グリシル−グリシン、グリシル−グリシル−Ｌ−ヒスチジン、グリシル−グリシル−グリシン等があり、特にＬ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニン、ＤＬ−アラニル−ＤＬ−アラニンおよびＬ−ロイシル−グリシル−グリシンが配合成分として好ましい。
【００１５】
これらの成分の配合量（ＩＩ）は、口腔用組成物全体の０．００１〜５％、特に０．０１〜３％とすることが好ましい。０．００１％未満であると、ラクトフェリン類と組み合わせた場合、口腔唾液中および歯肉溝滲出液中の内毒素を十分に抑制できず、又、歯周病原因菌の歯牙、粘膜への付着抑制も期待できない。５％を超えると、効果が定常に達し、又、製剤中での溶解性、安定性に問題が生ずる。
【００１６】
（Ｉ）／（ＩＩ）の配合比率（モル比）は０．０００１〜１０とすることが好ましい。１０^-5未満であると、期待以上の相乗効果が出にくく、１０００を超えると相乗効果が定常に達する。
【００１７】
本発明の口腔用組成物には、上記以外の成分とし通常の口腔用組成物に使用されている成分を用いることができ、これらの成分の添加量は、本発明の効果を妨げない範囲で通常量とすることができる。
【００１８】
歯磨類の場合は、例えば、研磨剤、粘結剤、粘稠剤、界面活性剤、甘味剤、防腐剤、香料、着色剤、上記以外の各種有効成分などを常用量配合し得、これら成分を水と混合して製造することができる。
【００１９】
本発明の口腔用組成物は、（Ｉ）ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物およびラクトフェリン関連ペプチドから選ばれる１種以上と（ＩＩ）構成アミノ酸数が１〜３個である成分とを組み合わせたものを有効成分として含有するもので、練歯磨、液状歯磨などの歯磨剤、口腔用軟膏、洗口剤、うがい用錠剤、トローチ、チュウインガムなどとして調製される。
【００２０】
【発明の効果】
本発明によれば、優れた細菌内毒素活性抑制、細菌付着抑制効果を有し、しかも長期間使用しても安全であり、歯周疾患の予防や治療に好適に利用することができる。
【００２１】
【実験例】
以下、調製例、実験例、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に制限されるものではない。
【００２２】
［調製例１］ウシ・ラクトフェリンの調製
新鮮なウシ・ホエーの硫安沈殿物を水に溶解して、セファデックスＧ−２５のカラムを通し脱塩を行った。脱塩蛋白をｐＨ７．３のリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、抗ウシ・ラクトフェリンモノクローナル抗体アフィニテイカラムに通し、さらにリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。その後、０．１５Ｍの食塩を含むｐＨ３．７の０．２５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液でカラムよりウシ・ラクトフェリンを溶出し、凍結乾燥により目的物を得た。
【００２３】
［調製例２］ウシ・ラクトフェリン酸分解物の調製
ラクトフェリン酸分解物は、凍結乾燥前のカラム溶出物を５０％クエン酸にてｐＨを３以下に調製後、加水分解処理を行った（９５℃まで加熱後、１時間放置）。分解物を冷却後、２Ｎ水酸化ナトリウム溶液にてｐＨを中性付近に調整し、精製水で３日間透析し、透析物を凍結乾燥してラクトフェリン酸加水分解物を得た。
【００２４】
［調製例３］ラクトフェリンペプチドの調製
目的のラクトフェリンペプチドは、上記の調製例１、２で得られたラクトフェリン加水分解物を通常の液体クロマトグラフィー法を用いて単離することができる。例えば、ＴＳＫゲルＯＤＳ１２０Ｔ（東ソー社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー法で、アセトニトリルのグラジエントで分画溶出させて単離することができる（特開平５−３２００６７号公報参考）。
その他の方法としては、上記のようにして得たペプチドのアミノ酸配列を公知の方法（気相シークエンサーを用いる方法など）によって決定し、それらのアミノ酸配列を有するペプチドを公知の方法（ペプチド自動合成装置など）で合成して目的のペプチドを調製することができる（例：配列番号１、２）。
【００２５】
〔実験例１〕インビトロ内毒素活性抑制試験
エンドスペーシー法（生化学工業（株）製）を変法して、下記方法でインビトロ内毒素活性抑制試験を行った。
歯周病の原因菌であるアクチノバシルス・アクチノマイセテムコミタンスＹ４、ポルフィロモナス・ジンジバリス３８１及びフゾバクテリウム・ヌクレエータムの内毒素（以下、それぞれＡａＬＰＳ、ＰｇＬＰＳ、ＦｎＬＰＳと略す）各１μｇ／ｍｌと表１〜４に示すような各種薬剤（１×１０^−４Ｍ）１ｍｌとを３７℃、３０分インキュベーション後、各ＬＰＳが１００ｐｇ／ｍｌになるように希釈して、エンドスペシー法による内毒素活性抑制率を測定した。結果を表１〜４に示す。なお、表中の内毒素活性抑制率は下記式により算出した。
内毒素活性抑制率（％）＝（Ａ−Ｂ）／Ａ× １００
Ａ＝（内毒素単独のＡＢＳ）−（注射用蒸留水のＡＢＳ）
Ｂ＝（（薬剤＋内毒素）のＡＢＳ）−（注射用蒸留水のＡＢＳ）
ＡＢＳ：５４５ｎｍの吸光度
【００２６】
表１〜表４の結果より、（Ｉ）ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物およびラクトフェリン関連ペプチドから選ばれる１種以上と（ＩＩ）構成アミノ酸数が１〜３個である成分とを組み合わせたものが、インビトロ内毒素活性抑制効果に優れていることが確認された。
【００２７】
【表１】

【００２８】
【表２】

【００２９】
【表３】

【００３０】
【表４】

【００３１】
〔実験例２〕家兎皮内毒性試験による細菌内毒素活性抑制試験
内毒素活性抑制（Ｐｒｉｍａｒｙｓｋｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）試験
家兎腹部をバリカンで除毛後、皮内に表５に示すように内毒素又は内毒素と薬剤の混合液（注射前に３７℃、３０分間反応）をそれぞれ家兎腹部に０．１ｍｌ注射した。４８時間後に注射部位の発赤、腫脹の大きさ（縦×横）を測定して内毒素活性抑制を評価した。なお、抑制率は下記式により算出した。
抑制率（％）＝（Ａ−Ｂ）／Ａ× １００
Ａ＝内毒素注射部位の面積
Ｂ＝（内毒素＋検体）注射部位の面積
【００３２】
【表５】

【００３３】
〔実験例３〕局所シュワルツマン反応（ＬｏｃａｌＳｃｈｗａｒｚｍａｎｒｅａｃｔｉｏｎ）
Ｐｒｉｍａｒｙｓｋｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ判定後、家兎耳静脈に表６に示すように細菌内毒素を１００μｇ／ｋｇ（体重）注射し、２４時間後に皮内注射部位の紅斑、出血性壊死の大きさ（縦×横）や程度を測定して内毒素活性抑制を評価した。結果を表６に示す。なお、抑制率は下記式により算出した。
抑制率（％）＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×１００
Ａ＝内毒素注射部位の面積
Ｂ＝（内毒素＋検体）注射部位の面積
【００３４】
【表６】

【００３５】
〔実験例４〕アクチノマイセス・ナエスランディ付着阻止実験
ハイドロオキシアパタイト粉末（ＢＨＤケミカル社製）（以下、ＨＡと略す）５ｍｇをポリスチレン製マルチプレート（住友ベークライト社製）の各ウエルに入れ、ＫＣｌ緩衝液（５０ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、１ｍＭＣａＣｌ₂、０．１ｍＭＭｇＣｌ₂、ｐＨ６．０）で洗浄後、ヒト全唾液の遠心上清（１２，０００ｒｐｍ、２０分間）１２５μｌを加えて、室温で６０分間反応させた。次に、ＨＡをＫＣｌ緩衝液で洗浄し、表７、８に示す０．１％の各薬剤１２５μｌを加えて３０分間反応させた。
【００３６】
ＨＡを緩衝液で洗浄した後、³Ｈ−チミジンを含む培地で培養して放射ラベルしたアクチノマイセス・ナエスランディＴ１４Ｖ（１×１０⁸／ｍｌ）１２５μｌを加えて、室温で６０分間反応させた。ＨＡをＫＣｌ緩衝液で洗浄し、ＨＡに付着した細菌の放射活性を液体シンチュレーションカウンターで測定した。結果を表７、８に示す。なお、付着抑制率は下記式より算出した。
付着抑制率（％）＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×１００
Ａ：検体無添加時の細菌付着数
Ｂ：検体添加時の細菌付着数
【００３７】
【表７】

【００３８】
【表８】

【００３９】
以下、実施例を示す。

【００４０】

【００４１】

【００４２】

【００４３】

【００４４】

【００４５】

【００４６】

【００４７】

【００４８】

【００４９】

【００５０】
【配列表】

[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a periodontal disease bacterial endotoxin neutralizing agent, a periodontal disease causative bacteria adhesion inhibitor, and further to neutralize periodontal disease bacterial endotoxin and to inhibit the adhesion of periodontal disease causative bacteria. yo Ri to an effective oral composition for the prevention and treatment of periodontal disease.
[0002]
[Prior art and problems to be solved by the invention]
As pathogenic factors for periodontal diseases, adhesion factors (pilus, lectin-like ligand), endotoxin, tissue destructive enzymes (collagenase, trypsin-like enzyme), leukocyte resistance factor (capsule, superoxide desmutase, leukotriene) and Examples include cytotoxic metabolites (hydrogen sulfide, fatty acids). Among them, bacterial endotoxins have been confirmed to cause inflammation or periodontal bone resorption directly or indirectly against periodontal tissue.
[0003]
Therefore, as a conventional technique for the prevention and treatment of periodontal diseases involving endotoxin, a pretreatment agent for periodontal tissue regeneration with macrolide antibiotics (Japanese Patent Laid-Open No. 7-267867), water-insoluble with octadecylpropyldimethylammonium fixation A solid endotoxin adsorption / removal agent (JP-A-8-26954) has been proposed.
[0004]
However, when these techniques are applied to the prevention and treatment of periodontal diseases, there have been problems such as the appearance of resistant bacteria, side effects, and adhesion of stains to teeth. Therefore, development of a more effective technique capable of neutralizing bacterial endotoxin has been desired.
[0005]
On the other hand, chlorhexidine is a representative agent for suppressing and preventing periodontal disease-causing bacteria, but there was a coloring problem on the teeth and an effect on taste (publishing method of submarine plaque, published by Quintessence Publishing Co., Ltd., 1991). September 30th).
[0006]
Thus, the present invention has been made in view of the above circumstances, has an excellent inhibitory effect on bacterial endotoxin activity, can also be expected to have an inhibitory effect on bacterial teeth and mucous membranes, and can be used for a long time. It is an object to provide a safe periodontal disease bacterial endotoxin neutralizing agent, a periodontal disease causative agent inhibitor and an oral composition.
[0007]
Means for Solving the Problem and Embodiment of the Invention
As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventor has (I) one or more selected from lactoferrin, a lactoferrin degradation product and a lactoferrin-related peptide, and (II) a component having 1 to 3 constituent amino acids. As shown in the experimental examples to be described later, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Fuzobacterium um The ability to effectively neutralize endotoxins of peri-bacterial bacteria; and Actinomyces naeslundii It was found that an oral composition that can be applied to the prevention and treatment of periodontal diseases can be obtained from the fact that the adhesion of periodontal disease-causing bacteria such as
[0008]
Accordingly, the present invention provides (I) one or more selected from lactoferrin, lactoferrin degradation products and lactoferrin-related peptides, and (II) one or two selected from glutamic acid, aspartic acid, glycine, alanine, leucine, histidine and proline. Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas gingivalis, consisting of more than one kind of amino acid and consisting of an amino acid or peptide component having 1 to 3 constituent amino acids Periodontal bacterial endotoxin neutralizer and actinomyces selected from nucleatum (Fusobacterium nucleatum) Esurandei periodontal disease-causing bacteria adhesion inhibitor (Actinomyces naeslundii), the (I) a solid component and from 0.001 to 3% by solids weight of the total composition of component (II) of the total composition 0.001 to 5% by weight, neutralization of periodontal disease bacterial endotoxin of the specific bacteria and (I) / (II) in the range of 0.0001 to 10 (molar ratio) Provided is an oral composition characterized in that it is contained as an active ingredient for inhibiting periodontal disease-causing adhesion.
[0009]
Hereinafter, the present invention will be specifically described. The lactoferrin used in the present invention is widely distributed in the body of an animal, and the biological functions of lactoferrin have antibacterial action, antiviral action, biological defense action and endotoxin neutralizing action, and mucin Patent applications have been filed for production promoters (JP-A-9-12473), novel pharmaceutical compositions (JP-A-8-217693), and the like.
[0010]
Examples of the resources of the lactoferrin-related components provided in the present invention include products from mammalian dairy cows, products from plants (tomatoes, rice, tobacco), products from bran mold, human forms produced in milk Either lactoferrin or a synthetic product may be used. The lactoferrin provided in the present invention is particularly preferably derived from bovine.
[0011]
The lactoferrin degradation product provided in the present invention refers to an acid degradation product and a pepsin degradation product, and has the same biological function as lactoferrin. Antibacterial agent containing lactoferric acid hydrolyzate as an active ingredient and cosmetics containing the same (Japanese Patent Laid-Open No. 6-279310), antibacterial agent and method for treating articles using this antibacterial agent (Japanese Patent Laid-Open No. 5-320067) (Patent Publication) etc. have been applied for patents. The lactoferrin degradation product used in the present invention is particularly preferably an acid degradation product.
[0012]
The lactoferrin-related peptide provided in the present invention refers to a peptide derived from lactoferrin composed of 15 to 50 amino acids and a degradation product thereof. Biological functions of these peptides include strong antibacterial action, bioprotective action and endotoxin neutralizing action. An antibacterial agent and a method for treating articles using this antibacterial agent (Japanese Patent Laid-Open No. 5-320067) are patented. An application has been filed. The lactoferrin-related peptide is particularly preferably lactoferricin B prepared from the N-terminus of bovine lactoferrin consisting of 25 amino acids.
[0013]
The blending amount of lactoferrin, lactoferrin degradation product and lactoferrin-related peptide (I) should be 0.001 to 3% of the whole oral composition (solid content weight, the same applies hereinafter), particularly 0.01 to 1.5%. Is preferred. When it is less than 0.001%, when combined with an amino acid or a peptide consisting of 2 to 3 amino acids, endotoxin in oral saliva and gingival crevicular fluid cannot be sufficiently suppressed, and periodontal disease Inhibition of causative bacteria on teeth and mucous membranes is not sufficient. If it exceeds 3%, the effect reaches a steady state, and there is a problem in solubility and stability in the preparation.
[0014]
The component (II) having 1 to 3 constituent amino acids provided in the present invention consists of one or more amino acids selected from glutamic acid, aspartic acid, glycine, alanine, leucine, histidine and proline, and L -Aspartic acid, L-glutamic acid, glycine, L-alanine, L-leucine, L-histidine, L-proline, L-leucyl-L-alanine, DL-alanyl-DL-alanine, glycyl-L-leucine, glycyl- L-proline, glycyl-glycine, DL-alanyl-DL-norvaline, L-leucyl-glycyl-glycine, glycyl-glycyl-L-histidine, glycyl-glycyl-glycine, etc., especially L-aspartic acid, L-glutamic acid , L-Leucyl-L-alanine, DL-alanyl-DL-ara Emissions and L- leucyl - glycyl - glycine is preferred as a blending component.
[0015]
The blending amount (II) of these components is preferably 0.001 to 5%, particularly 0.01 to 3% of the whole oral composition. If it is less than 0.001%, endotoxin in oral saliva and gingival crevicular fluid cannot be sufficiently suppressed when combined with lactoferrin, and adhesion of periodontal disease-causing bacteria to teeth and mucous membranes is suppressed. I can't expect. If it exceeds 5%, the effect reaches a steady state, and there is a problem in solubility and stability in the preparation.
[0016]
The blending ratio (molar ratio) of (I) / (II) is preferably 0.0001-10. If it is less than 10 ^−5, it is difficult to produce a synergistic effect more than expected, and if it exceeds 1000, the synergistic effect reaches a steady state.
[0017]
In the composition for oral cavity of the present invention, components other than those described above, which are used in ordinary oral compositions, can be used, and the amount of these components added is within a range that does not hinder the effects of the present invention. It can be a normal amount.
[0018]
In the case of dentifrice, for example, abrasives, binders, thickeners, surfactants, sweeteners, preservatives, fragrances, colorants, various active ingredients other than the above, etc. Can be mixed with water.
[0019]
The composition for oral cavity of the present invention comprises (I) one or more selected from lactoferrin, a lactoferrin degradation product and a lactoferrin-related peptide and (II) a combination of components having 1 to 3 constituent amino acids as an active ingredient It is prepared as toothpaste such as toothpaste and liquid toothpaste, oral ointment, mouthwash, gargle tablet, troche, chewing gum and the like.
[0020]
【The invention's effect】
According to the present invention, it has excellent bacterial endotoxin activity suppression and bacterial adhesion suppression effects, is safe even when used for a long time, and can be suitably used for the prevention and treatment of periodontal diseases.
[0021]
[Experimental example]
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to preparation examples, experimental examples, and examples, but the present invention is not limited to the following examples.
[0022]
[Preparation Example 1] Preparation of bovine lactoferrin Fresh ammonium sulfate precipitate of bovine whey was dissolved in water, and desalted through a Sephadex G-25 column. The desalted protein was dissolved in phosphate buffered saline at pH 7.3, passed through an anti-bovine lactoferrin monoclonal antibody affinity column, and further washed with phosphate buffered saline. Thereafter, bovine lactoferrin was eluted from the column with a 0.25 M sodium acetate buffer solution having a pH of 3.7 containing 0.15 M sodium chloride, and the desired product was obtained by lyophilization.
[0023]
[Preparation Example 2] Preparation of Bovine Lactoferric Acid Decomposition Product The lactoferric acid decomposition product was hydrolyzed after adjusting the pH of the column eluate before lyophilization to 3 or less with 50% citric acid (95 ° C). Until heated for 1 hour). After the degradation product was cooled, the pH was adjusted to near neutral with 2N sodium hydroxide solution, dialyzed against purified water for 3 days, and the dialyzate was freeze-dried to obtain a lactoferric acid hydrolyzate.
[0024]
[Preparation Example 3] The lactoferrin peptide intended for preparation of the lactoferrin peptide can be isolated from the lactoferrin hydrolyzate obtained in Preparation Examples 1 and 2 using a conventional liquid chromatography method. For example, it can be isolated by fractionating and eluting with a gradient of acetonitrile by high performance liquid chromatography using TSK gel ODS120T (manufactured by Tosoh Corporation) (see JP-A-5-320067).
As other methods, the amino acid sequence of the peptide obtained as described above is determined by a known method (such as a method using a gas phase sequencer), and a peptide having those amino acid sequences is determined by a known method (peptide automatic synthesizer). Etc.) to prepare the target peptide (eg, SEQ ID NOs: 1 and 2).
[0025]
[Experimental Example 1] In vitro endotoxin activity inhibition test An in vitro endotoxin activity inhibition test was performed by the following method, using a modified endospace method (Seikagaku Corporation).
Actinobacillus actinomycetemcomitans Y4, Porphyromonas gingivalis 381 and Fusobacterium nucleatum endotoxin (hereinafter abbreviated as Aa LPS, Pg LPS, and Fn LPS, respectively) 1 μg / 1 ml of various drugs (1 × 10 ⁻⁴ M) as shown in Tables 1 to ⁴ after incubation at 37 ° C. for 30 minutes, diluted so that each LPS becomes 100 pg / ml, and endotoxin by the end specie method The activity inhibition rate was measured. The results are shown in Tables 1-4. In addition, the endotoxin activity inhibition rate in the table was calculated by the following formula.
Endotoxin activity inhibition rate (%) = (A−B) / A × 100
A = (ABS of endotoxin alone) − (ABS of distilled water for injection)
B = ((Drug + Endotoxin ABS) − (ABS of distilled water for injection)
ABS: Absorbance at 545 nm
From the results of Tables 1 to 4, the combination of (I) one or more selected from lactoferrin, a lactoferrin degradation product and a lactoferrin-related peptide and (II) a component having 1 to 3 constituent amino acids is in vitro. It was confirmed that the effect of suppressing endotoxin activity is excellent.
[0027]
[Table 1]

[0028]
[Table 2]

[0029]
[Table 3]

[0030]
[Table 4]

[0031]
[Experimental Example 2] Bacterial Endotoxin Activity Inhibition Test by Rabbit Endodermal Toxicity Test Endotoxin Activity Inhibition Test (Primary skin reaction) 0.1 ml of a mixed solution of endotoxin and drug (reacted at 37 ° C. for 30 minutes before injection) was injected into the rabbit abdomen. 48 hours later, redness and swelling (length × width) at the injection site were measured to evaluate endotoxin activity inhibition. In addition, the suppression rate was computed by the following formula.
Inhibition rate (%) = (A−B) / A × 100
A = area of endotoxin injection site B = (endotoxin + specimen) area of injection site
[Table 5]

[0033]
[Experimental Example 3] Local Schwarzman reaction
After determining the primary skin reaction, 100 μg / kg (body weight) of bacterial endotoxin was injected into the rabbit ear vein as shown in Table 6. After 24 hours, the size of erythema and hemorrhagic necrosis at the site of intradermal injection (vertical x horizontal) ) And the degree were measured to evaluate the inhibition of endotoxin activity. The results are shown in Table 6. In addition, the suppression rate was computed by the following formula.
Inhibition rate (%) = (A−B) / A × 100
A = area of endotoxin injection site B = (endotoxin + specimen) area of injection site
[Table 6]

[0035]
[Experimental Example 4 ] Actinomyces naeslandi adhesion inhibition experiment 5 mg of hydroxyapatite powder (BHD Chemical) (hereinafter abbreviated as HA) was placed in each well of a polystyrene multiplate (Sumitomo Bakelite) and KCl. After washing with a buffer (50 mM KCl, 1 mM KH ₂ PO ₄ , 1 mM CaCl ₂ , 0.1 mM MgCl ₂ , pH 6.0), 125 μl of human whole saliva centrifugal supernatant (12,000 rpm, 20 minutes) was added. And reacted at room temperature for 60 minutes. Next, HA was washed with KCl buffer, and 125 μl of each 0.1% drug shown in Tables 7 and 8 was added and allowed to react for 30 minutes.
[0036]
After washing HA with a buffer, 125 μl of Actinomyces naeslandi T14V (1 × 10 ⁸ / ml) radiolabeled by culturing in a medium containing ³ H-thymidine was added and reacted at room temperature for 60 minutes. . HA was washed with KCl buffer, and the radioactivity of bacteria attached to HA was measured with a liquid scintillation counter. The results are shown in Tables 7 and 8 . In addition, the adhesion suppression rate was computed from the following formula.
Adhesion suppression rate (%) = (A−B) / A × 100
A: Number of bacteria attached when no sample is added B: Number of bacteria attached when the sample is added [0037]
[Table 7]

[0038]
[Table 8]

[0039]
Examples will be described below.

[0040]

[0041]

[0042]

[0043]

[0044]

[0045]

[0046]

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[0049]

[0050]
[Sequence Listing]

Claims

(I) One or more amino acids selected from lactoferrin, lactoferrin degradation products and lactoferrin-related peptides, and (II) one or more amino acids selected from glutamic acid, aspartic acid, glycine, alanine, leucine, histidine and proline. A periodontal disease bacterial endotoxin neutralizing agent selected from Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum, and comprising an amino acid or peptide component having 1 to 3 constituent amino acids .

(I) One or more amino acids selected from lactoferrin, lactoferrin degradation products and lactoferrin-related peptides, and (II) one or more amino acids selected from glutamic acid, aspartic acid, glycine, alanine, leucine, histidine and proline. An inhibitor of periodontal disease-causing bacteria adhesion of Actinomyces naeslandi, comprising an amino acid or peptide component having 1 to 3 constituent amino acids.

(I) One or more selected from lactoferrin, a lactoferrin degradation product, and a lactoferrin-related peptide with a solid content weight of 0.001 to 3% , and (II) glutamic acid, aspartic acid, glycine, alanine, leucine An amino acid or peptide component consisting of one or two or more amino acids selected from histidine and proline and having 1 to 3 constituent amino acids as a solid content weight with respect to the whole composition is 0.001 to 5% A tooth selected from Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum in a blending ratio (molar ratio) of (I) / (II) of 0.0001 to 10 Periodontal bacterial endotoxin neutralization and / or periodontal disease causes of Actinomyces naeslandi Oral composition characterized by containing as an adhesion inhibiting active ingredient.