JP3722522B2 - Process for producing β-1,3-glucan - Google Patents

Description

【０００４】
一方、β−１，６−結合でグルコース１個が高度に分岐したβ−１，３−グルカンは安定性に優れ、経口投与により免疫賦活活性を有しており感染症予防剤、抗腫瘍剤として、さらには凝集剤や乳化安定剤としての工業的な利用も拡大してきている。このような用途の拡大と共に多種多様の分岐度、分子量を有する各種のβ−１，３−グルカンが求められるようになっている。従来、きのこ類や微生物など種々の生物を用いて多種類のβ−１，３−グルカンが生産されきたが、通常、同一の生物で得られるものはほぼ同一の分岐度、ほぼ同一の分子量を有するβ−１，３−グルカンであり、同一生物で異なった分岐度のものを生産することは行われていなかった。
【０００５】
本発明者らは、先にオーレオバシディウム属に属する微生物を用いて高度に分岐したβ−１，３−グルカンを生産することを見いだした（特開平6-340701号）。この高分岐度β−１，３−グルカンは分岐鎖の分布に偏りがなく、均一な分布を持つβ−１，３−グルカンであった。しかしこの方法によればプルランを産生せず、β−１，３−グルカンのみを生産するためには炭素源としてキシロースおよびビタミンＣを必須とした。またオーレオバシディウム属に属する微生物は本来メラニン色素を産生するため培養液が緑黒色となり、そのため得られるβ−１，３−グルカンも着色するという問題があった。またpHが高いところでは着色の程度が増加するために、特に高いpHでの培養では生産性を損なうという問題があった。このため培地のpHは 4.5〜6.5 の範囲内に厳密に制御する必要があった（特開平6-340701、特開平7-51080)。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このように従来の方法では培養液のpHや培養条件を大きく変化させて培養することが事実上不可能であり、その結果得られるβ−１，３−グルカンは生産量も低く、分子量および分岐度も限られた範囲のものしか得ることができず、用途の広がりに対して十分に対応できるものではなかった。このため生産性が高く、着色のない、しかも目的に応じた分子量および分岐度を有するβ−１，３−グルカンを生産する方法が強く望まれていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題を解決すべく鋭意研究を重ねたところ、オーレオバシディウム属に属する微生物を突然変異させて得られるβ−１，３−グルカン産生能を有し、メラニン色素を実質的に産生しない変異株を所定のpHに制御した液体培地中で培養することにより、プルランの産生が全くなく、無着色で高分岐度のβ−１，３−グルカンを高生産量で生産することができることを見いだし、本発明を完成するに至った。さらに本発明においては、後述するように種々の条件を適宜設定することにより広範囲の分岐度、分子量を有するβ−１，３−グルカンを製造することも可能となった。
すなわち、本発明はpHを 6.8〜8.5 の範囲内に制御した液体培地中で、オーレオバシディウム属に属する微生物を突然変異させて得られるβ−１，３−グルカン産生能を有し、メラニン色素を実質的に産生しない変異株を培養し、β−１，３−グルカンを産生せしめ、これを採取することによりなるβ−１，３−グルカンの製造法に関する。
【０００８】
以下に本発明を詳述する。
本発明において用いられるオーレオバシディウム属に属する微生物を突然変異させて得られるβ−１，３−グルカン産生能を有し、メラニン色素を実質的に産生しない変異株としては、例えばオーレオバシディウム プルランス ATCC 9348株、ATCC 3092 株、ATCC 42023株、IFO 4464株、IFO 4466株、IFO 6353株、IFO 7757株などを突然変異処理し、実質的にメラニン色素を産生しない菌株を選別し、その中からβ−１，３−グルカンを高生産する変異株を選別することにより得ることができる。
【０００９】
突然変異処理はＵＶ照射あるいは化学的処理により行うことができる。化学的処理としては、たとえばニトロソグアニジン、エチディウム ブロマイド、メタンスルホン酸エチルまたは亜硝酸ナトリウムなど一般的に行われている変異処理剤を用いることができる。次に、突然変異株をコロニーの形に培養し、コロニーに着色させ、親株の着色量よりも低い菌株を採取する場合はメラニン色素を産生し易いように、平板培地で培養した後、通常５〜20℃程度の温度に保ってメラニン色素の産生を促進させた後に、着色していないコロニーを選別して、実質的にメラニン色素を産生しない菌株を選別する。
本発明に用いるオーレオバシディウム属に属する微生物を突然変異させて得られるβ−１，３−グルカン産生能を有し、メラニン色素を実質的に産生しない変異株としては、具体的には工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されているFERM P-15096が好ましく用いられる。
【００１０】
この変異株をpHが 6.8〜8.5 の範囲内に制御した液体培地中で培養することにより高分岐度のβ−１，３−グルカンを得ることができる。
培養中は、培地のpHが大きく変動するが、本発明においてはpHを 6.8〜8.5 の範囲内に制御することが重要である。好ましくは、pHを 7.0〜8.5 、より好ましくは 7.0〜8.0 に制御する。本発明の変異株を上記範囲内のpHで培養することによりプルランの生産が著しく抑制されるため、β−１，３−グルカンのみが生産される。
pHが 6.5より低い場合にはプルランなどの他の生産物が主に生成するようになり、また 8.5よりも高くなるとβ−１，３−グルカンの生産は著しく減少する。本発明においては、培養中のpHを上記範囲内に制御することにより高分岐度のβ−１，３−グルカンを生産できるが、好ましくはpHの変動値を±0.2 以内、より好ましくは±0.1 以内に制御するのが所定の高分岐度、高分子量を有するβ−１，３−グルカンを生産するうえで好ましい。
【００１１】
pHを制御する方法としては、酸およびアルカリを用いる方法が採用される。pHの制御のために用いる酸およびアルカリの種類は特に限定されず、酸としては、例えば塩酸、硫酸、硝酸、燐酸、炭酸、シュウ酸，酢酸などの各種の鉱酸や有機酸を用いることができる。またアルカリとしては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、アンモニアなどを用いることができる。
本発明における酸とアルカリのpH調製剤の組み合わせとしては、β−１，３−グルカンの高生産性の観点から強酸と強アルカリまたは弱酸と弱アルカリの組み合わせが好ましく用いられる。具体的には、塩酸と水酸化ナトリウムの組み合わせ、または酢酸と炭酸ナトリウムの組み合わせが好ましく用いられる。
一方、高分子量のβ−１，３−グルカンを生産する観点からは、弱酸と強アルカリの組み合わせからなるpH調製剤が好ましく用いられる。具体的には、酢酸と水酸化ナトリウムの組み合わせを挙げることができる。
用いられる酸およびアルカリの各溶液の濃度は特に限定されないが、通常0.1 〜１０規定、好ましくは１〜５規定である。
添加量は、pHが 6.8〜8.5 の範囲を逸脱しない量であれば特に制限はなく、適宜適当量を添加するが、通常はpHセンサーと連動した添加装置が使用され、pHの変動値が±0.2 以内になるようにpH調製剤が添加される。
【００１２】
本発明においては、pH値、その変動幅、pH調製剤の組み合わせを種々設定することにより、所望の分岐度および分子量を有するβ−１，３−グルカンを生産することができる。
本発明においては、分岐度が60％以上の高分岐度のβ−１，３−グルカンを得ることができ、上記条件の設定により60〜95％の範囲の分岐度のものを目的に応じて調製することができる。
【００１３】
ここで分岐度は下記式で示される。
〔（分岐したβ−１，６−結合のグルコース単位の数）／（主鎖のβ−１，３−結合のグルコース単位の数) 〕×100(％）
すなわち、式［Ｉ］と式［II］を用いれば下記式で示される。
〔 [I]／([I]＋ [II])〕×100(％）
従って、本発明においては主鎖のβ−１，３−結合のグルコース単位１０に対し、分岐したβ−１，６−結合のグルコース単位が６以上、例えば６〜9.5 の割合で有する高分岐度のβ−１，３−グルカンを生産することができる。
【００１４】
分岐度の測定は通常ＮＭＲスペクトルにより行うことができる。
例えば、高分岐度のβ−１，３−グルカンを 100℃でジメチルスルホキシドに溶解し、100 ℃に保持したまま測定した¹³C −ＮＭＲスペクトルの１例を図１に示す。ここでＳ₁ は式［Ｉ］中のＣ−６の炭素に帰属するピーク、Ｓ₂ は式［Ｉ］および式［II］のＣ−３の炭素に帰属するピーク、Ｓ₃ は式［Ｉ］および式［II］のＣ−１の炭素に帰属するピークである。この図１のδ値８4.5 〜87.0ppm 域のスペクトルを拡大したのが図２である。図２のδ値85.7ppm のシグナルＳ_a は式［Ｉ］のＣ−３炭素に帰属し、86.2ppm のシグナルＳ_b は式［II］のＣ−３炭素に帰属される。
【００１５】
さらに本発明においては、分子量を調整したβ−１，３−グルカンを得ることができる。
特にpH調整剤としての酸およびアルカリの組み合わせを適宜選択することにより所望の分子量を有するβ−１，３−グルカンを得ることができ、通常、数平均分子量が50万〜500 万（ゲル濾過法）のものが任意に得られる。
【００１６】
本発明で使用する培地としては、炭素源、窒素源、リン、カリウム、マグネシウム等の炭素化合物、窒素化合物、無機塩などの必要な栄養成分を適宜含有する液体培地が用いられる。
炭素源としては、グルコース、スクロース、キシロース、マンノース、シュークロース、フラクトース、ビタミンＣなどが適宜用いられる。窒素源としては、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等が用いられ、無機塩としては、リン酸カリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄などが用いられる。また必要に応じビタミンＢ₁ を添加することもできる。
【００１７】
培養は、通常温度０〜60℃、好ましくは10〜40℃にて、通常１〜10日間、好ましくは２〜５日間、通気下に行われる。培養液中の溶存酸素量には特に制限はないが、10％以上、好ましくは15％以上に保つことがβ−１，３−グルカンの生産量を増加させるうえで好ましい。
本発明の好気培養においては、通常、培地を撹拌しながら培養が行われ、撹拌回転数は菌の生育とグルカンの生産が増大するに従い増加させる方法が採用される。この方法により溶存酸素量を10％以上に保つことができる。例えば、培養液の撹拌翼段数を２〜４段として撹拌回転数を培養初期は少なく、菌の生育とグルカンの生産に応じて徐々に増加させる。例えば培養初期では撹拌回転数を 200rpm で行い、グルカンの生産が増大するに従い、徐々に回転数を600rpmまで増加させることにより溶存酸素量を10％以上、好ましくは15％以上に保持して培養を行う。これによりβ−１，３−グルカンの生産量を大幅に増加させることができる。しかしながら、培養初期に撹拌回転数を必要以上に上げすぎると菌体に負荷がかかりすぎるため生産量は反対に低下してしまうので注意する必要がある。
【００１８】
培養終了後、培養液に遠心分離や濾過等の分離手段を施して培養液から菌体を除去し、培養上清からβ−１，３−グルカンを採取する。採取方法は特に限定されないが、培養上清に有機溶媒を加えてβ−１，３−グルカンを沈殿させる方法を好ましく用いることができる。有機溶媒としては特に制限はないが、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノールなどのアルコール類、アセトンなどのケトン類、アセトニトリルなどのニトリル類等を好ましく用いることができ、特にエタノールが好ましい。得られるβ−１，３−グルカンはそのまま種々の用途に使用することができるが、用途に応じ精製することもできる。
【００１９】
本発明により得られるβ−１，３−グルカンは経口あるいは非経口投与によって抗腫瘍活性あるいは免疫賦活活性を示し、医薬としてあるいは食品添加剤、飼料添加剤として用いることができる。
【００２０】
【発明の効果】
本発明の方法により、高分岐度のβ−１，３−グルカンを高生産量で生産することができ、さらにその培養条件を適宜設定することにより所定の分岐度及び分子量を有するβ−１，３−グルカンを製造することが可能となった。
また、培養により培地が着色せず、着色していないβ−１，３−グルカンを得ることができ、精製が容易となった。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
オウレオバシディウム プルランス(Aureobasidium pullulan）をポテトデキストロース寒天斜面培地で培養し、保存菌株とし、表１に示す組成を有する液体培地Ａ(pH5.0〜6.0)10mLを試験管に入れたものに接種して28℃、一夜培養した培養液１mLを集菌し、0.2 Ｍ酢酸緩衝液（pH5.6)１mLで２回洗浄後、0.04重量％のＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを含む 0.2Ｍ酢酸緩衝液（pH5.6)を調製し、該溶液中に30℃で60分間静置して突然変異処理を行った。次に、この変異処理液を集菌し、0.2moL/L酢酸緩衝液（pH5.6)で洗浄した後、寒天培地（表２に示す組成を有する液体培地Ｂに寒天を1.5 重量％添加したもの）上に塗布して２〜３日間培養後、さらに４〜10℃の低温中に１〜２日静置した。低温に静置するとほとんどの菌株は緑黒色のコロニーを形成するが、無色あるいは着色量の少ないコロニーを選択した。この選択したコロニーについて500mL の坂口フラスコに培地Ａ 200mLを用いて、30℃、120rpmで４日間振とう培養した後にβ−１，３−グルカンの生産量を測定し、生産量の高い変異株を選別した。その結果を表３に示した。この変異株を工業技術院生命工業技術研究所に寄託し、受託番号FERM P-15096を得た。
【００２２】
【表１】
液体培地Ａの組成
スクロース 3 0 ｇ
ビタミンＣ 3 ｇ
NaNO₃ 2.5 ｇ
K₂HPO₄ 0.4 ｇ
KH₂PO₄ 2.0 ｇ
KCl 0.5 ｇ
MgSO₄ ・ ７H₂O 0.5 ｇ
FeSO₄ ・ ７H₂O 0.01ｇ
蒸留水 1 Ｌ
pH 6.0
【００２３】
【表２】
液体培地Ｂの組成
グルコース 3 0 ｇ
酵母エキス 2.0 ｇ
NaNO₃ 0.5 ｇ
K₂HPO₄ 0.4 ｇ
KH₂PO₄ 2.0 ｇ
KCl 0.5 ｇ
MgSO₄ ・ ７H₂O 0.5 ｇ
FeSO₄ ・ ７H₂O 0.01ｇ
蒸留水 １Ｌ
pH 6.0
【００２４】
【表３】

【００２５】
【実施例２】
表４に示す組成の培地を調製し、pH7.0 に調整した。次に、実施例１で得られた変異株 (FERM P-15096) を２〜３白金耳でかきとり、試験管中に入れた上記培地10mLに植菌し、25℃、120rpmで往復振とう培養を３日間行い、さらに 500mLの坂口フラスコを用いて同様の培地 200mL中に２重量％になるように接種して30℃、120rpmで30時間振とう培養した後、２段のディスクタービン翼付きの５Ｌの小型発酵槽に同様の培地2.5 Ｌにフラスコ培養液を10重量％を植菌して、通気量１vvm 、撹拌回転数を200rpmから600rpmまで徐々に上げて溶存酸素量を15％以上に保持して28℃で４日間培養した。培養の間、pH調整剤はアルカリとして５Ｎ水酸化ナトリウムを、酸として５Ｎ塩酸を用い、添加によりpHを7.0 ±0.1 に調整して培養を行った。
【００２６】
培養後、約1.5 Ｌの水を加え、遠心分離機を用いて菌体を取り除いた。次いで、得られた培養上清を 120℃、20分間オートクレーブにより加熱した。その後、同量のエタノールを加えて室温で数時間撹拌した。得られた沈殿物を遠心分離により分取し、沈殿物に0.5 Ｎ水酸化ナトリウムを加えて室温で撹拌し、溶解させた。次に、未溶解物を取り遠心分離により除いた後、濃塩酸を用いて中和し、同量のエタノール中に添加してβ−１，３−グルカンを沈殿させた。得られたβ−１，３−グルカンの収量は15ｇ／Ｌであった。
得られたβ−１，３−グルカンの¹³C −ＮＭＲスペクトルを図３に示す。また85.0〜87.0ppm 域の拡大スペクトルを図４に示した。このスペクトルを測定したところβ−１，３−グルカンの分岐度は90％であり、また数平均分子量は 300万（ゲル濾過法）であった。
【００２７】
【表４】
培地の組成
グルコース 5 0 ｇ
NaNO₃ 2.5ｇ
K₂HPO₄ 1.7ｇ
KH₂PO₄ 0.7ｇ
KCl 0.5ｇ
MgSO₄ ・ ７H₂O 0.5ｇ
FeSO₄ ・ ７H₂O 0.01 ｇ
蒸留水 １Ｌ
【００２８】
【実施例３】
実施例２において、pHを変更した以外は実施例２と同様にし変異株の培養を行った。その結果を表５に示した。表５から明らかなように培養条件を変更することにより得られるβ−１，３−グルカンの分岐度を制御することができた。なお、いずれの場合においてもプルランを産生しなかった。
【００２９】
【表５】

【００３０】
【実施例４】
実施例２において、pH調整剤を表６に示す各種酸とアルカリの組み合わせに変更した以外は実施例２と同様にして変異株の培養を行った。その結果を表６に示した。表６から明らかなよう pH調整剤の組み合わせを適宜設定することにより得られるβ−１，３−グルカンの分子量を制御することができた。
【００３１】
【表６】

【００３２】
【実施例５】
実施例２において、撹拌回転数を一定のまま培養した以外は実施例２と同様にして変異株の培養を行った。その結果を表７に示した。
表７から明らかなようにβ−１，３−グルカンの生産の増加に従い撹拌回転数を徐々に増加させて溶存酸素量１５％以上に保持した実施例２に比べ、生産量は低かった。
【００３３】
【表７】

【図面の簡単な説明】
【図１】高分岐度のβ−１，３−グルカンの¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】図１のδ値84.5〜87.0ppm 域を拡大したスペクトルを示す。
【図３】本発明の実施例２で得られた高分岐度β−１，３−グルカンの¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図４】図３のδ値85.0〜87.0ppm 域を拡大したスペクトルを示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to β-1,3-glucan, in particular β-branch in which one glucose residue is highly branched by β-1,6-linkage, using a mutant strain of a microorganism belonging to the genus Aureobasidium. The present invention relates to a method for producing -1,3-glucan.
The β-1,3-glucan obtained by the method of the present invention can be used as a medicine, food additive, or feed additive.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, a high molecular weight β-1,3-glucan in which one glucose is branched by a β-1,6-bond composed of the formulas [I] and [II] is known. For example, schizophyllan is obtained by culturing mycelium of Shirohirotake and has been reported to have antitumor activity. In addition, lentinan has been isolated from shiitake ( Lentinus edodes ) as having the same structure and used as a pharmaceutical having antitumor activity. Branched β-1,6-linked to the degree of branching of these β-1,3-glucans (the number of β-1,3-linked glucose units in the main chain (number of formulas [I] + [II])) The number of glucose units (the ratio of the number of formula [I]) is as low as about 30 to 35%, and is only used parenterally.
[0003]
[Chemical 1]

[0004]
On the other hand, β-1,3-glucan, in which one glucose is highly branched by β-1,6-linkage, is excellent in stability and has immunostimulatory activity by oral administration. Furthermore, industrial use as a flocculant and an emulsion stabilizer is also expanding. With the expansion of such applications, various β-1,3-glucans having various branching degrees and molecular weights have been demanded. Conventionally, various types of β-1,3-glucan have been produced using various organisms such as mushrooms and microorganisms, but those obtained from the same organism usually have almost the same degree of branching and almost the same molecular weight. It is β-1,3-glucan having, and it has not been performed to produce the same organism with different branching degrees.
[0005]
The present inventors have previously found that a highly branched β-1,3-glucan is produced using a microorganism belonging to the genus Aureobasidium (Japanese Patent Laid-Open No. 6-340701). This highly branched β-1,3-glucan was a β-1,3-glucan having a uniform distribution with no distribution of branch chains. However, according to this method, pullulan is not produced, and xylose and vitamin C are essential as carbon sources in order to produce only β-1,3-glucan. In addition, since microorganisms belonging to the genus Aureobasidium originally produce melanin pigment, the culture solution becomes greenish black, and thus the obtained β-1,3-glucan is also colored. In addition, since the degree of coloring increases at a high pH, there is a problem that productivity is impaired particularly in culture at a high pH. For this reason, the pH of the medium must be strictly controlled within the range of 4.5 to 6.5 (JP-A-6-340701, JP-A-7-51080).
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Thus, in the conventional method, it is practically impossible to cultivate by greatly changing the pH and culture conditions of the culture solution, and the resulting β-1,3-glucan has a low production amount and has a molecular weight and branching. Only a limited range could be obtained, and it was not able to sufficiently cope with the spread of applications. Therefore, a method for producing β-1,3-glucan having high productivity, no coloring, and having a molecular weight and a degree of branching according to the purpose has been strongly desired.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have the ability to produce β-1,3-glucan obtained by mutating a microorganism belonging to the genus Aureobasidium, By culturing a mutant strain that does not substantially produce in a liquid medium controlled to a predetermined pH, there is no production of pullulan, and high production of β-1,3-glucan with no coloration and high branching degree is produced. It has been found that it can be done, and the present invention has been completed. Furthermore, in the present invention, β-1,3-glucan having a wide range of branching degrees and molecular weights can be produced by appropriately setting various conditions as described later.
That is, the present invention has the ability to produce β-1,3-glucan obtained by mutating a microorganism belonging to the genus Aureobasidium in a liquid medium whose pH is controlled within the range of 6.8 to 8.5, The present invention relates to a method for producing β-1,3-glucan obtained by culturing a mutant strain that does not substantially produce a pigment, producing β-1,3-glucan, and collecting this.
[0008]
The present invention is described in detail below.
Examples of mutant strains having β-1,3-glucan production ability obtained by mutating microorganisms belonging to the genus Aureobasidium used in the present invention and that do not substantially produce melanin pigment include, for example, Aureobasidium Umpurlans ATCC 9348, ATCC 3092, ATCC 42023, IFO 4464, IFO 4466, IFO 6353, IFO 7757, etc. were mutated to select strains that do not substantially produce melanin. It can be obtained by selecting a mutant strain that produces β-1,3-glucan at a high level.
[0009]
Mutation treatment can be performed by UV irradiation or chemical treatment. As the chemical treatment, for example, a commonly used mutation treatment agent such as nitrosoguanidine, ethidium bromide, ethyl methanesulfonate or sodium nitrite can be used. Next, when the mutant strain is cultured in the form of a colony, the colony is colored, and when a strain lower than the coloring amount of the parent strain is collected, the strain is usually cultured on a plate medium so that melanin pigment can be easily produced. After maintaining the temperature at about -20 ° C to promote the production of melanin pigment, a non-colored colony is selected to select a strain that does not substantially produce melanin pigment.
As a mutant having β-1,3-glucan production ability obtained by mutating a microorganism belonging to the genus Aureobasidium used in the present invention and substantially not producing a melanin pigment, specifically, industrial FERM P-15096 deposited at the Institute of Biotechnology, Institute of Technology is preferably used.
[0010]
A highly branched β-1,3-glucan can be obtained by culturing this mutant strain in a liquid medium whose pH is controlled within the range of 6.8 to 8.5.
During culture, the pH of the medium varies greatly. In the present invention, it is important to control the pH within the range of 6.8 to 8.5. Preferably, the pH is controlled to 7.0 to 8.5, more preferably 7.0 to 8.0. Since the production of pullulan is remarkably suppressed by culturing the mutant strain of the present invention at a pH within the above range, only β-1,3-glucan is produced.
When the pH is lower than 6.5, other products such as pullulan are mainly produced, and when it is higher than 8.5, the production of β-1,3-glucan is significantly reduced. In the present invention, β-1,3-glucan having a high degree of branching can be produced by controlling the pH during the cultivation within the above range, but preferably the pH fluctuation value is within ± 0.2, more preferably ± 0.1. Is preferably controlled to produce β-1,3-glucan having a predetermined high degree of branching and high molecular weight.
[0011]
As a method for controlling pH, a method using an acid and an alkali is employed. The type of acid and alkali used for pH control is not particularly limited, and examples of the acid include various mineral acids and organic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, carbonic acid, oxalic acid, and acetic acid. it can. As the alkali, sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, ammonium carbonate, ammonia or the like can be used.
As the combination of the acid and alkali pH adjuster in the present invention, a combination of a strong acid and a strong alkali or a weak acid and a weak alkali is preferably used from the viewpoint of high productivity of β-1,3-glucan. Specifically, a combination of hydrochloric acid and sodium hydroxide or a combination of acetic acid and sodium carbonate is preferably used.
On the other hand, from the viewpoint of producing high molecular weight β-1,3-glucan, a pH adjuster comprising a combination of a weak acid and a strong alkali is preferably used. Specifically, a combination of acetic acid and sodium hydroxide can be given.
The concentration of each acid and alkali solution used is not particularly limited, but is usually 0.1 to 10 N, preferably 1 to 5 N.
The addition amount is not particularly limited as long as the pH does not deviate from the range of 6.8 to 8.5, and an appropriate amount is appropriately added. Usually, an addition device linked with a pH sensor is used, and the fluctuation value of pH is ± A pH adjuster is added so that it is within 0.2.
[0012]
In the present invention, β-1,3-glucan having a desired degree of branching and molecular weight can be produced by setting various combinations of pH values, their fluctuation ranges, and pH adjusting agents.
In the present invention, a highly branched β-1,3-glucan having a branching degree of 60% or more can be obtained, and those having a branching degree in the range of 60 to 95% depending on the purpose can be obtained by setting the above conditions. Can be prepared.
[0013]
Here, the degree of branching is expressed by the following formula.
[(Number of branched β-1,6-linked glucose units) / (Number of β-1,3-linked glucose units in the main chain)] × 100 (%)
That is, if the formula [I] and the formula [II] are used, the following formula is obtained.
[[I] / ([I] + [II])] x 100 (%)
Accordingly, in the present invention, the degree of branching is high at a ratio of 6 or more, for example, 6 to 9.5, of branched β-1,6-linked glucose units to β-1,3-linked glucose units 10 in the main chain. Β-1,3-glucan can be produced.
[0014]
The degree of branching can usually be measured by NMR spectrum.
For example, FIG. 1 shows an example of ¹³ C-NMR spectrum measured by dissolving highly branched β-1,3-glucan in dimethyl sulfoxide at 100 ° C. and keeping at 100 ° C. Here, S ₁ is a peak attributed to carbon of C-6 in formula [I], S ₂ is a peak attributed to carbon of C-3 in formula [I] and formula [II], and S ₃ is formula [I ] And a peak attributed to C-1 carbon of formula [II]. FIG. 2 shows an enlarged spectrum in the range of δ value 84.5 to 87.0 ppm in FIG. In FIG. 2, the signal S _a having a δ value of 85.7 ppm belongs to the C-3 carbon of the formula [I], and the signal S _b of 86.2 ppm belongs to the C-3 carbon of the formula [II].
[0015]
Furthermore, in the present invention, β-1,3-glucan having an adjusted molecular weight can be obtained.
In particular, a β-1,3-glucan having a desired molecular weight can be obtained by appropriately selecting a combination of an acid and an alkali as a pH adjuster, and usually has a number average molecular weight of 500,000 to 5,000,000 (gel filtration method ) Can be obtained arbitrarily.
[0016]
As the medium used in the present invention, a liquid medium appropriately containing necessary nutrient components such as a carbon source, a nitrogen source, a carbon compound such as phosphorus, potassium, and magnesium, a nitrogen compound, and an inorganic salt is used.
As the carbon source, glucose, sucrose, xylose, mannose, sucrose, fructose, vitamin C and the like are appropriately used. As the nitrogen source, sodium nitrate, ammonium nitrate, ammonium sulfate and the like are used, and as the inorganic salt, potassium phosphate, potassium chloride, magnesium sulfate, iron sulfate and the like are used. It is also possible to add vitamin B ₁ necessary.
[0017]
Cultivation is usually performed at a temperature of 0 to 60 ° C., preferably 10 to 40 ° C. under aeration for 1 to 10 days, preferably 2 to 5 days. Although there is no restriction | limiting in particular in the amount of dissolved oxygen in a culture solution, It is preferable when increasing the production amount of (beta) -1, 3- glucan to keep 10% or more, Preferably it is 15% or more.
In the aerobic culture of the present invention, a method is usually employed in which the culture is performed while stirring the medium, and the rotation speed of stirring is increased as the growth of bacteria and the production of glucan increase. By this method, the amount of dissolved oxygen can be kept at 10% or more. For example, the number of stirring blade stages of the culture solution is set to 2 to 4, and the number of stirring rotations is small at the initial stage of the culture, and is gradually increased according to the growth of the bacteria and the production of glucan. For example, at the initial stage of culture, the stirring speed is 200 rpm, and as the production of glucan increases, the number of dissolved oxygen is maintained at 10% or more, preferably 15% or more by gradually increasing the speed to 600 rpm. Do. Thereby, the production amount of β-1,3-glucan can be greatly increased. However, it should be noted that if the stirring rotation speed is increased more than necessary at the initial stage of the culture, the bacterial mass is excessively loaded, and the production amount is decreased.
[0018]
After completion of the culture, the culture solution is subjected to separation means such as centrifugation and filtration to remove the cells from the culture solution, and β-1,3-glucan is collected from the culture supernatant. Although the collection method is not particularly limited, a method in which an organic solvent is added to the culture supernatant to precipitate β-1,3-glucan can be preferably used. Although there is no restriction | limiting in particular as an organic solvent, For example, alcohols, such as methanol, ethanol, and isopropanol, ketones, such as acetone, nitriles, such as acetonitrile, etc. can be used preferably, and ethanol is especially preferable. The obtained β-1,3-glucan can be used for various purposes as it is, but can also be purified according to the purpose.
[0019]
The β-1,3-glucan obtained by the present invention exhibits antitumor activity or immunostimulatory activity by oral or parenteral administration, and can be used as a medicine, food additive or feed additive.
[0020]
【The invention's effect】
According to the method of the present invention, β-1,3-glucan having a high degree of branching can be produced in a high production amount, and β-1, It became possible to produce 3-glucan.
Further, the culture medium was not colored by the culture, and an uncolored β-1,3-glucan could be obtained, which facilitated purification.
[0021]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
[Example 1]
Aureobasidium pullulan is cultured on a potato dextrose agar slant medium, used as a storage strain, and 10 mL of liquid medium A (pH 5.0 to 6.0) having the composition shown in Table 1 is placed in a test tube. Inoculate and culture 1 mL of the overnight culture at 28 ° C, wash twice with 1 mL of 0.2 M acetate buffer (pH 5.6), and then 0.04 wt% N-methyl-N'-nitro-N-nitroso. A 0.2 M acetate buffer solution (pH 5.6) containing guanidine was prepared, and the mutation treatment was performed by allowing it to stand in the solution at 30 ° C. for 60 minutes. Next, the mutation treatment solution was collected and washed with 0.2 moL / L acetate buffer (pH 5.6), and then 1.5% by weight of agar was added to the agar medium (liquid medium B having the composition shown in Table 2). The product was applied to the product and cultured for 2 to 3 days. Most strains formed greenish black colonies when allowed to stand at low temperatures, but colorless or less colored colonies were selected. About the selected colony, 200 mL of medium A was used in a 500 mL Sakaguchi flask and shake cultured at 30 ° C. and 120 rpm for 4 days, and then the production amount of β-1,3-glucan was measured. Sorted. The results are shown in Table 3. This mutant strain was deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, and the accession number FERM P-15096 was obtained.
[0022]
[Table 1]
Composition of liquid medium A 30 g
Vitamin C 3 g
NaNO ₃ 2.5 g
K ₂ HPO ₄ 0.4 g
KH ₂ PO ₄ 2.0 g
KCl 0.5 g
MgSO ₄・ 7H ₂ O 0.5 g
FeSO ₄・ 7H ₂ O 0.01g
Distilled water 1 L
pH 6.0
[0023]
[Table 2]
Composition of liquid medium B Glucose 30 g
Yeast extract 2.0 g
NaNO ₃ 0.5 g
K ₂ HPO ₄ 0.4 g
KH ₂ PO ₄ 2.0 g
KCl 0.5 g
MgSO ₄・ 7H ₂ O 0.5 g
FeSO ₄・ 7H ₂ O 0.01g
1L of distilled water
pH 6.0
[0024]
[Table 3]

[0025]
[Example 2]
A medium having the composition shown in Table 4 was prepared and adjusted to pH 7.0. Next, the mutant strain (FERM P-15096) obtained in Example 1 was scraped with 2 to 3 platinum loops, inoculated into 10 mL of the medium placed in a test tube, and reciprocally shaken at 25 ° C. and 120 rpm. For 3 days, inoculate to 2% by weight in 200 mL of the same medium using a 500 mL Sakaguchi flask, incubate at 30 ° C. and 120 rpm for 30 hours, and then with a 2-stage disk turbine blade. Inoculate 10% by weight of flask culture solution into 2.5L of the same medium in a 5L small fermenter, gradually increase the aeration rate from 1vvm and the stirring speed from 200rpm to 600rpm, and maintain the dissolved oxygen content at 15% or more. And cultured at 28 ° C. for 4 days. During the culture, the pH adjusting agent was 5N sodium hydroxide as an alkali and 5N hydrochloric acid as an acid, and the pH was adjusted to 7.0 ± 0.1 by addition to carry out the culture.
[0026]
After culturing, about 1.5 L of water was added, and the cells were removed using a centrifuge. Subsequently, the obtained culture supernatant was heated by an autoclave at 120 ° C. for 20 minutes. Thereafter, the same amount of ethanol was added and stirred at room temperature for several hours. The resulting precipitate was collected by centrifugation, 0.5 N sodium hydroxide was added to the precipitate, and the mixture was stirred at room temperature to dissolve. Next, the undissolved material was taken out and removed by centrifugation, neutralized with concentrated hydrochloric acid, and added to the same amount of ethanol to precipitate β-1,3-glucan. The yield of β-1,3-glucan obtained was 15 g / L.
The ¹³ C-NMR spectrum of the obtained β-1,3-glucan is shown in FIG. The expanded spectrum in the 85.0-87.0 ppm region is shown in FIG. When this spectrum was measured, the degree of branching of β-1,3-glucan was 90%, and the number average molecular weight was 3 million (gel filtration method).
[0027]
[Table 4]
Medium composition glucose 50 g
NaNO ₃ 2.5g
K ₂ HPO ₄ 1.7g
KH ₂ PO ₄ 0.7g
KCl 0.5g
MgSO ₄・ 7H ₂ O 0.5g
FeSO ₄・ 7H ₂ O 0.01 g
1L of distilled water
[0028]
[Example 3]
In Example 2, the mutant strain was cultured in the same manner as in Example 2 except that the pH was changed. The results are shown in Table 5. As apparent from Table 5, the degree of branching of β-1,3-glucan obtained by changing the culture conditions could be controlled. In either case, pullulan was not produced.
[0029]
[Table 5]

[0030]
[Example 4]
In Example 2, the mutant strain was cultured in the same manner as in Example 2 except that the pH adjuster was changed to a combination of various acids and alkalis shown in Table 6. The results are shown in Table 6. As is apparent from Table 6, the molecular weight of β-1,3-glucan obtained by appropriately setting the combination of pH adjusters could be controlled.
[0031]
[Table 6]

[0032]
[Example 5]
In Example 2, the mutant strain was cultured in the same manner as in Example 2 except that the culture was performed with the stirring rotation speed kept constant. The results are shown in Table 7.
As is clear from Table 7, the production amount was lower than that in Example 2 in which the stirring rotation speed was gradually increased as the production of β-1,3-glucan was increased and the dissolved oxygen amount was maintained at 15% or more.
[0033]
[Table 7]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a ¹³ C-NMR spectrum of β-1,3-glucan having a high degree of branching.
FIG. 2 shows a spectrum obtained by enlarging the δ value 84.5 to 87.0 ppm region in FIG.
FIG. 3 shows a ¹³ C-NMR spectrum of a highly branched β-1,3-glucan obtained in Example 2 of the present invention.
4 shows a spectrum obtained by enlarging the δ value range of 85.0 to 87.0 ppm in FIG.

Claims (4)

It has β-1,3-glucan production ability obtained by mutating microorganisms belonging to the genus Aureobasidium in a liquid medium whose pH is controlled within the range of 6.8 to 8.5. And producing a β-1,3-glucan by culturing a mutant strain that does not substantially produce a melanin pigment to produce β-1,3-glucan.   2. The method according to claim 1, wherein the β-1,3-glucan is β-1,3-glucan in which one glucose residue is highly branched by a β-1,6-linkage. Mutant strain Aureobasidim pullulans ( Aureobasidim pullulans ) accession number FERM P-15096. Aureobasidium in a liquid medium controlled to maintain a dissolved oxygen concentration of 10% or more within a pH range of 6.8 to 8.5. (Aureobasidium) A mutant strain having the ability to produce β-1,3-glucan obtained by mutating a microorganism belonging to the genus and producing substantially no melanin pigment is cultured to produce β-1,3-glucan. A method for producing β-1,3-β-glucan, characterized in that

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