JP3718887B2 - Porphyrin derivatives and their uses - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ポルフィリン誘導体とその用途、特に新規なポルフィリン誘導体を有効成分とする光物理化学的診断用および治療用の増感剤および／または光物理化学による癌の診断および治療に用いる薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌の新しい治療法として光物理化学的診断治療（ＰＤＴ）が行われている。これはある種のポルフィリン化合物を静脈注射などの方法により投与し、癌組織に保持させた後、レーザー光を照射して癌組織のみを選択的に破壊するというものである。ＰＤＴは、ポルフィリンの癌組織に保持される時間が正常組織に比べて長いという性質と光増感作用を持つという２つの性質を利用している。過去１５年間に世界中で５０００人以上の人々がＰＤＴによる悪性腫瘍の治療を受けており、癌治療法の１つとして定着しつつある。ＰＤＴにより良好な治療成績が報告されている癌種は、網膜癌、皮膚癌、食道癌、表在性膀胱癌、初期の肺癌など多岐に渡っている。
【０００３】
現在ＰＤＴに使用されている薬剤は主としてヘマトポルフィリン誘導体（ＨＰＤ）およびｐｈｏｔｏｆｒｉｎ ＩＩ▲Ｒ▼（ＨＰＤのエーテル体および／またはエステル体の二量体）である。ＨＰＤはヘマトポルフィリンを酢酸中硫酸処理し、さらに０．１Ｎ水酸化ナトリウムで処理して得られる混合物である。また、ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ ＩＩ▲Ｒ▼は１９９５年より日本で臨床応用されているが、ＨＰＤの疎水性の高い成分を主として含んでおり、ＨＰＤとともに複雑な混合物であり活性成分が不明である。また成分比が一定でないために治療効果が極めて不安定である。
【０００４】
一方、ＰＤＴのための新しいポルフィリン誘導体が特開平１−２４６２８６号、昭６３−１４５２８３号、昭６２−２０５０８２号、昭６２−１６７７８３号、特開昭６２−２４９９８６号、昭６２−２４６５８０号、昭６２−２４６５７９号および昭６２−２０５０８１号に、そしてＪ．Ｆ．Ｅｖｅｎｓｅｎらにより［Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５５，４８３（１９８７）］に開示されている。また、クロリン誘導体が特開平１−２５０３８１号、昭６３−２９０８８１号、昭６２−５９８６号、昭６２−５９８５号、昭６２−５９２４号、昭６２−５９１２号、昭５８−９８１号および昭５７−１８５２２０号に、ポルフィリンダイマー誘導体が米国特許４６４９１５１号（１９８７）、特開昭６２−６３５８６号および昭６０−５００１３２号に、ポルフィリン金属錯体が特開平１−２２１３８２号、昭６３−１０４９８７号および昭５７−３１６８８号に開示されている。ごく最近になって、６７０ｎｍ付近に吸収を持つメターテトラヒドロキシフェニル クロリン（ｍ−ＴＨＰＣ）やベンゾポルフィリン誘導体（ＢＰＤ）などのポルフィリン誘導体も開発されてきた。我々も種々検討し、クロリン誘導体を特開昭６１−７２７９号および昭６０−９２２８７号に、ポルフィリン金属錯体を特開平２−１３８２８０号、昭６２−１７４０７９号、特公平４−２４６６１号、平６−１５５４５号および平７−２５７６３号に、バクテリオクロリン誘導体を特開昭６３−１９６５８６号に開示してきた。しかしながら、ＰＤＴ用の増感剤として用いるには上記化合物では合成、安定性、水溶性の面において実用化が困難であった。そこで更に検討を行い、アルコキシポルフィリンアミノ酸誘導体およびクロリン誘導体を特開平５−９７８５７号に開示し、ＰＤＴ用の増感剤としての有効性を示したが、さらに高い治療効果の得られる誘導体が期待されている。
【０００５】
またＰＤＴに使われるレーザー光の組織透過性の問題もある。ＨＰＤやｐｈｏｔｏｆｒｉｎ ＩＩ▲Ｒ▼は最大吸収波長が６３０ｎｍであり、モル吸光係数も３０００と低い。６３０ｎｍの光では組織透過性が悪く、ＰＤＴの治療効果が５〜１０ｍｍの表層癌に限定されてしまっている。
【０００６】
一方レーザー装置の方にも問題がある。現在最もよく使用されている色素レーザーは安定性が悪く、運用上取扱いが難しい。チタンサファイアレーザーを用いれば運用がかなり簡単になる。しかしこのレーザーを用いると６７０ｎｍ以上６００ｎｍ以下の吸収波長に限られ、６３０ｎｍ付近の吸収波長を持つＨＰＤやＰｔｏｆｒｉｎ ＩＩ▲Ｒ▼には適用できない。最近、半導体レーザー（６７０ｎｍ）も開発され６７０ｎｍに吸収を持つ化合物が有利とされてきた。
【０００７】
更に薬剤の副作用として一時的な光過敏症を引き起こすことが知られている。このため薬剤投与後、皮膚などの正常組織が光増感作用で破壊されないように患者を長期間暗所に閉じ込めておかなければならない。ＨＰＤおよびＰｔｏｆｒｉｎ ＩＩ▲Ｒ▼は正常組織からの排出速度が遅いので長いときには６週間以上も光過敏症が残ることもある。現在使用されている薬剤はこうした多くの問題点を抱えておりＨＰＤおよびＰｈｏｔｏｆｒｉｎ ＩＩ▲Ｒ▼に代わる新しい薬剤の開発が強く望まれている。そこで上記薬剤が持つ欠点を克服するものとして単一化合物でありかつより長波長領域（６５０〜８００ｎｍ）に吸収を持つ化合物が第２世代の薬物として提案されている。現在フタロシアニンなどのアザポルフィリン類、クロリン・バクテリオクロリンなどのポルフィリン類、テキサフィリンなどの環拡張型ポルフィリン類などさまざまな化合物が研究されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、単一成分であり安定かつ癌組織に対する良好な集積性を維持したまま、正常組織からは排出速度が速く光毒性を低減させ、しかもできうればチタンサファイアレーザー（６７０ｎｍ以上６００ｎｍ以下の波長）ならびに半導体レーザー（６７０ｎｍ）の使用が可能であるボルフィリン誘導体を探索し、ＰＤＴに適した光増感剤を提供することを目的として、種々の研究を重ねた。
【０００９】
【問題を解決するための手段】
その結果、以前出願の誘導体（特開平５−９７８５７号）の中で血液由来のプロトポルフィリンより合成誘導体化したクロリン類の側鎖に、ある種のイミノ基およびアスパラギン酸残基を結合させると、単一成分で癌組織に対して優れた集積性と正常組織より速やかな排出性を、更に６７０ｎｍ以上の最長波長吸収端を持ち、かつ良好なＰＤＴ効果を有することを見出した。
【００１０】
また本発明者らは以前出願の誘導体（特開平５−９７８５７号）と同様に、これらクロリン誘導体とアルブミンの混液の紫外線吸収（ＵＶ）スペクトルを分析したところ、スペクトルの動向が正の方向すなわち特定臓器、特に癌への親和性につながっていることが分かった。
【００１１】
一方、本発明者らは以前出願の誘導体（特願平４−２７６４８８号）と同様に薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により光に対する反応性の強弱を簡便に評価できるダンシルメチオニン基質の系を用いる光増感酸化反応によりこれらクロリン誘導体を評価したところ、強い作用を持つことがわかった
【００１２】
本発明は上記の知見に基づいて完成されたものであって、その要旨は
一般式（Ｉ）化１
〔式中、Ｒ１はＣ２Ｈ５，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２，ＣＨ２Ｃ６Ｈ５，ＣＨ２Ｃ６Ｆ５を表わし、Ｒ２は化２（アスパラギン酸から水素を除いた残基）〕で示されるポルフィリン化合物、である。
【００１３】
本発明のポルフィリン化合物は、自体常套によって製造することができる。一般式（Ｉ）に対応するポルフィリン化合物にあっては、まずアルデヒド基を有する化合物に誘導体化し（工程ａ）、得られたクロリン誘導体にアスパラギン酸の残基を結合せしめる（工程ｂ）、そして種々のヒドロキシルアミン誘導体を縮合させる（工程ｃ）。また必ずしも工程（ｂ）、（ｃ）は順次反応させる必要はなく（ｃ）、（ｂ）のように工程順が代わっても良い。
【００１４】
構成工程（ａ）はＪ．Ｅ．Ｆａｌｋ著［Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｌｌｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ］（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ発行、１９７５年）およびＤ．Ｄｏｌｐｈｉｎ著［Ｔｈｅ Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ］（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ発行、１９７８年）等に記載された常套の方法によってこれを行うことができる。
【００１５】
例えば（Ｉ）に対応するＲ１、Ｒ２を有するポルフィリン化合物であるものは、特開昭６１−７２７９号、特公昭６３−１３９９７号、特公平６−１５５４５、特公平７−２５７６３号、特開平２−１３８２８０号、特開平４−５９７７９号、特開平５−９７８５７号および特願平３−３２３５９７号に記載された方法に従ってこれを調製すれば良い。すなわちクロリン化工程（ａ）についてはプロトポルフィリン ジメチルエステル（以下ＰＰ−Ｍｅと言う）を光化学反応処理して得られた１−ヒドロキシ−２−ホルミルエチリデン−プロトポルフィリンジメチルエステル（以下Ｐ−Ｍｅと言う）を調製する（ただし、４つのテトラピロール環のうちＡおよびＢ環の側鎖の官能基がそれぞれ入れ替わった３−ヒドロキシ−４−ホルミルエチリデン−プロトポルフィリン ジメチルエステル体も含む。）。
【００１６】
次にアミノ酸の残基の結合工程（ｂ）に付す。すなわち、Ｒ２が水酸基であるポルフィリン化合物（Ｉ）にアスパラギン酸を反応させて、Ｒ２がアスパラギン酸担持ポルフィリン化合物（Ｉ）を製造する。このものは泉屋ら著［ペプチド合成の基礎と実験］（丸善発行、１９８５年）等に記載された常套の方法によってこれを行うことができ、特開昭６４−６１４８１号、特公平７−２５７６３号、特開平２−１３８２８０号および特開平４−５９７７９号に記載された方法に従ってこれを調製すればよい。
【００１７】
この場合、要はポルフィリン化合物の側鎖にアスパラギン酸の残基を導入すればよいから、（Ｉ）のＲ２側鎖のカルボキシル基とアスパラギン酸のアミノ基との間で反応を進行させることが好ましく、このため前者のカルボキシル基および／または後者のアミノ基を常套の反応性基に変換したり、両者に存在する反応に関与することが好ましくない官能基を適宜に保護することが考慮されてよい。なお、いずれの場合も適宜脱水剤や脱酸剤のような反応促進剤や縮合剤の使用も考慮されてよい。
【００１８】
以上のようにして構成したクロリン化合物を縮合工程（ｃ）に付す。Ｐ−Ｍｅに、ヒドロキシルアミン誘導体を反応させて縮合体ポルフィリン化合物を製造する。このものは一般有機化学実験書中［ヒドロキシルアミンとアルデヒド化合物との縮合反応］に記載された常套の方法によってこれを行うことができる。なお人為的に合成する代わりに、植物や動物のような天然資源からこれを採取してもよい。
【００１９】
以下、代表例を挙げてポルフィリン化合物（Ｉ）の調製を更に具体的に説明する。例えばＰ−Ｍｅを加水分解して得られた１−ヒドロキシ−２−ホルミルエチリデン−プロトポルフィリン（以下Ｐと言う）を調製する（ただし、４つのテトラピロール環のうちＡおよびＢ環の側鎖の官能基がそれぞれ入れ替わった３−ヒドロキシ−４−ホルミルエチリデン−プロトポルフィリンも含む。）。これに、アスパラギン酸 メチルエステル等を溶媒中で縮合剤［例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）や水溶性カルポジイミド（ＷＳＣ）］等を用いて反応せしめて、Ｒ２の側鎖にアスパラギン酸残基が結合したポルフィリン化合物（Ｉ）を得る。次いで、ヒドロキシルアミン誘導体（例えばＯ−メチルヒドロキシルアミン、Ｏ−エチルヒドロキシルアミン、Ｏ−ベンジルヒドロキシルアミン等）を溶媒中で縮合剤（例えばピリジン、ピペリジン、酸、アルカリ等）を用いて反応せしめて、Ｒ１の側鎖にこれらの化合物が縮合したポルフィリン化合物（Ｉ）を得る。その具体例としては以下のものを挙げることができる。
【００２０】
（１）１３、１７−ビスプロピオニルアスパラギン酸−３−エテニル−７−ヒドロキシ−８−メトキシイミノエチリデン−２、７、１２、１８−テトラメチル−ポルフィン（以下ＮＯＭｅ−Ｐ−ｄｉＡｓｐと言う）
（２）１３、１７−ビスプロピオニルアスパラギン酸−３−エテニル−７−ヒドロキシ−８−エトキシイミノエチリデン−２、７、１２、１８−テトラメチル−ポルフィン（以下ＮＯＥｔ−Ｐ−ｄｉＡｓｐと言う）
（３）１３、１７−ビスプロピオニルアスパラギン酸−３−エテニル−７−ヒドロキシ−８−イソブトキシイミノエチリデン−２、７、１２、１８−テトラメチル−ポルフィン（以下ＮＯｉｓｏＢｕ−Ｐ−ｄｉＡｓｐと言う）
（４）１３、１７−ビスプロピオニルアスパラギン酸−３−エテニル−７−ヒドロキシ−８−ベンジルオキシイミノエチリデン−２、７、１２、１８−テトラメチル−ポルフィン（以下ＮＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５−Ｐ−ｄｉＡｓｐと言う）
（５）１３、１７−ビスプロピオニルアスパラギン酸−３−エテニル−７−ヒドロキシ−８−ペンタフルオロベンジルオキシイミノエチリデン−２、７、１２、１８−テトラメチル−ポルフィン（以下ＮＯＣＨ２Ｃ６Ｆ５−Ｐ−ｄｉＡｓｐと言う）
【００２１】
本発明によるポルフィリン誘導体の医薬品製剤の製造は自体公知法により行われ、本発明による誘導体を適当な緩衝液で溶解するだけでよい。好適な添加物として例えば医薬的に認容できる溶解補助剤（例えば有機溶媒）、ｐＨ調製剤（例えば酸、塩基、緩衝液）、安定剤（例えばアスコルビン酸）、賦形剤（例えばグルコース）、等張化剤（例えば塩化ナトリウム）などが配合されても良い。
【００２２】
本発明による薬剤はＰＤＴ用薬剤としての必要十分な特性すなわち長燐光寿命、アルブミンに対する親和性、特定臓器特に癌に対する特異的集積性、ダンシルメチオニン評価による光殺細胞効果、吸収波長、水溶性、純度などを充分満足しているものである。本発明による薬剤の良好な水溶性は、高濃度溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）の製造を可能とし、更に本発明による薬剤は試験管内だけでなく生体内でも高い安定性を示す。一般に、ＰＤＴ用薬剤として適用するためには本発明の薬剤を１ｍｇ〜５ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与するのが望ましい。
【００２３】
【作用】
本発明にかかるポルフィリン化合物は、ポルフィリン骨格の側鎖にアミノ酸残基、またはアルデヒド縮合体を有する点に化学構造上の特徴を有し、その結果種々の生理学的もしくは薬理学的特性を発揮する。
【００２４】
これらポルフィリン誘導体は癌細胞に選択的に集積し、かつ癌細胞からの排泄が遅い。なお、正常な臓器や細胞からは速やかに排泄されるため、それらに損傷を与えることはない。元来、ポルフィリン誘導体の殆んどのものは光に対して強い作用を有するが、本発明に従ってポルフィリン誘導体の側鎖に多官能性化合物残基を導入することによって正常組織からの排泄性を高めるとともに、光毒性の発現を極力抑制するようデザインした誘導体が可能となった。また、ポルフィリンをクロリン誘導体化して波長がレッドシフトすることにより治療効果の深達度をはかることができた。これらの特性（癌親和性、光殺細胞効果、吸収波長、水溶性）に基づき、本発明のポルフィリン誘導体は特定の臓器、特に癌や悪性腫瘍に対するＰＤＴ薬剤として有用である。
【００２５】
以下実施例を挙げて説明する。なお、実施例での収率はすべて出発原料であるＰＰ−Ｍｅから換算して求めた値である。
【００２６】
【実施例】
実施例 １
Ｐの合成
Ｒ．Ｋ．Ｄｉｎｅｌｌｏらの方法［Ｔｈｅ Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ発行、Ｖｏｌ．１，３０３（１９７８）］に準じて合成した。ＰＰ−Ｍｅ１００ｇをクロロホルム１０ｌに溶解し、光照射下一週間反応させた。（ポルフィリンからクロリン誘導体化）反応後減圧濃縮し、残渣を得た。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ−（溶離液：ｎ−ヘキサン−クロロホルム）にて精製して、Ｐ−Ｍｅを得た。（５０．０ｇ）続いて、これをピリジン・メタノール混液中で加水分解して暗緑色結晶のＰを得た。（４３．０ｇ、収率４２．７％）
【００２７】
実施例 ２
ポルフィリンのアスパラギン酸誘導体化
実施例１で得たＰ２ｇをテトラヒドロフランに溶解しジシクロヘキシルアミン（ＤＣＨＡ）にて常法によりＰ−ＤＣＨＡ塩（２．０ｇ）とした。本ＤＣＨＡ塩をクロロホルム１５０ｍｌに溶解し、アスパラギン酸 ジメチルエステル（ＡｓｐＭｅ）塩酸塩２ｇを加え、撹拌下に水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）２ｇを徐々に加えて１．５時間反応せしめた。反応後（ＴＬＣにて反応終末点を確認）、反応液を水洗分液後、クロロホルム層を減圧濃縮した。得られた濃縮物を酢酸エチル−エーテル−ｎ−ヘキサンにて再沈殿および再結晶化を繰り返し行い、暗緑色結晶のフォトプロトポルフィニル−６、７−ビスアスパラギン酸テトラメチルエステル（以下Ｐ−ＡｓｐＭｅと言う）を得た。（１．２ｇ、収率１７．３％）
【００２８】
実施例 ３
ＮＯＭｅ−Ｐ−ｄｉＡｓｐ（１）の合成
実施例２で得られたＰ−ＡｓｐＭｅ５００ｍｇをピリジン２０ｍｌに溶解し室温撹拌下にＯ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩１５０ｍｇを添加、３０分間反応せしめた。反応後、反応液にクロロホルムを加え、水洗分液後クロロホルム層を減圧濃縮した。得られた濃縮物を酢酸エチル−ｎ−ヘキサンにて再沈殿を行い沈殿を濾取乾燥後、ピリジン１０ｍｌに溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム１０ｍｌを加え加水分解を行った。１Ｎ塩酸で中和後、クロロホルムにて分液し、クロロホルム層を減圧濃縮した。濃縮物をメタノール−酢酸エチル−ｎ−ヘキサンにて再沈殿を行い、暗緑色結晶のＮＯＭｅ−Ｐ−ｄｉＡｓｐ（１）を得た。（３９０ｍｇ、１３．９％）
【００２９】
実施例 ４
ＮＯＥｔ−Ｐ−ｄｉＡｓｐ（２）の合成
実施例２で得られたＰ−ＡｓｐＭｅ５００ｍｇをピリジン２０ｍｌに溶解し、室温撹拌下にＯ−エチルヒドロキシルアミン塩酸塩１５０ｍｇを添加、３０分間反応せしめた。反応後、反応液にクロロホルムを加え、水洗分液後クロロホルム層を減圧濃縮した。得られた濃縮物を酢酸エチル−ｎ−ヘキサンにて再沈殿を行い沈殿を濾取乾燥後、ピリジン１０ｍｌに溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム１０ｍｌを加え加水分解を行った。１Ｎ塩酸で中和後、クロロホルムにて分液し、クロロホルム層を減圧濃縮した。濃縮物をメタノール−酢酸エチル−ｎ−ヘキサンにて再沈殿を行い、暗緑色結晶のＮＯＥｔ−Ｐ−ｄｉＡｓｐ（２）を得た。（４２０ｍｇ、１４．８％）
【００３０】
実施例 ５
ＮＯｉｓｏＢｕ−Ｐ−ｄｉＡｓｐ（３）の合成
実施例２で得られたＰ−ＡｓｐＭｅ５００ｍｇをピリジン２０ｍｌに溶解し、室温撹拌下にＯ−イソブチルヒドロキシルアミン塩酸塩１５０ｍｇを添加、３０分間反応せしめた。反応後、反応液にクロロホルムを加え、水洗分液後クロロホルム層を減圧濃縮した。得られた濃縮物を酢酸エチル−ｎ−ヘキサンにて再沈殿を行い沈殿を濾取乾燥後、ピリジン１０ｍｌに溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム１０ｍｌを加え加水分解を行った。１Ｎ塩酸で中和後、クロロホルムにて分液し、クロロホルム層を減圧濃縮した。濃縮物をメタノール−酢酸エチル−ｎ−ヘキサンにて再沈殿を行い、暗緑色結晶のＮＯｉｓｏＢｕ−Ｐ−ｄｉＡｓｐ（３）を得た。（４５０ｍｇ、１５．３％）
【００３１】
実施例 ６
ＮＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５−Ｐ−ｄｉＡｓｐ（４）の合成
実施例２で得られたＰ−ＡｓｐＭｅ５００ｍｇをピリジン２０ｍｌに溶解し、室温撹拌下にＯ−ベンジルヒドロキシルアミン塩酸塩１５０ｍｇを添加、６０分間反応せしめた。反応後、反応液にクロロホルムを加え、水洗分液後クロロホルム層を減圧濃縮した。得られた濃縮物を酢酸エチル−ｎ−ヘキサンにて再沈殿を行い沈殿を濾取乾燥後、ピリジン１０ｍｌに溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム１０ｍｌを加え加水分解を行った。１Ｎ塩酸で中和後、クロロホルムにて分液し、クロロホルム層を減圧濃縮した。濃縮物をメタノール−酢酸エチル−ｎ−ヘキサンにて再沈殿を行い、暗緑色結晶のＮＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５−Ｐ−ｄｉＡｓｐ（４）を得た。（４００ｍｇ、１３．１％）
【００３２】
実施例 ７
ＮＯＣＨ２Ｃ６Ｆ５−Ｐ−ｄｉＡｓｐ（５）の合成
実施例２で得られたＰ−ＡｓｐＭｅ５００ｍｇをピリジン２０ｍｌに溶解し、室温撹拌下にＯ−（ペンタフルオロベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩１５０ｍｇを添加、１２０分間反応せしめた。反応後、反応液にクロロホルムを加え、水洗分液後クロロホルム層を減圧濃縮した。得られた濃縮物を酢酸エチル−ｎ−ヘキサンにて再沈殿を行い沈殿を濾取乾燥後、ピリジン１０ｍｌに溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム１０ｍｌを加え加水分解を行った。１Ｎ塩酸で中和後、クロロホルムにて分液し、クロロホルム層を減圧濃縮した。濃縮物をメタノール−酢酸エチル−ｎ−ヘキサンにて再沈殿を行い、暗緑色結晶のＮＯＣＨ２Ｃ６Ｆ５−Ｐ−ｄｉＡｓｐ（５）を得た。（３９０ｍｇ、１１．７％）
【００３３】
実施例 ８
摘出器官でのレーザー照射（励起蛍光スペクトル）
ニトロソアミン発癌の膵癌細胞を移植した１４〜２１日目のゴールデンハムスター（１群五匹）にリン酸緩衝液（１ｍｌ）にて希釈した５ｍｇの被験薬剤ＮＯＭｅ−Ｐ−ｄｉＡｓｐ（１）を静注後、癌を含む各臓器を摘出し、得られた各器官にＮ２−ｐｕｌｓｅｄ ｌａｓｅｒ（Ｎ２、３３７ｎｍ、２ｎｓ、４００〜１０００ｎｍ）を照射、励起蛍光スペクトルを測定し、４７０ｎｍのＮＡＤＨのピーク波長を基準として６００〜９００ｎｍの波長を検討した。（Ｎ２−ＰＬＳ測定）以下同様にして得られた結果（癌／各臓器 比）を表１に示す。表１は薬剤投与３時間後に摘出した各器官の各励起蛍光スペクトルを測定し、４７０ｎｍのピーク波長を基準１として６００〜９００ｎｍでのピーク波長を算出した値を示す。
【００３４】
【表１】
実施例 ９
ダンシルメチオニンを用いる光増感酸化反応の評価
基質（ダンシルメチオニン）１０μＭをクロロホルム１ｍｌに溶解し、前記実施例で得られた増感剤０．１μＭを加え、攪拌下にＣｏｌｄ Ｓｐｏｔ ＰＩＣＬ−ＳＸ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｐ．Ｉ．Ｃｏ．．Ｌｔｄ．）（ハロゲンランプ、１５０Ｗ、８０，０００Ｌｕｘ）で照射した。光照射１分毎に反応液をＴＬＣ板（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ Ｆ２５４）にスポットし、クロロホルム−メタノール（３：２）で展開後、ＵＶランプ（２５４ｎｍ）でダンシルメチオニンとその酸化生成物（ダンシルメチオニン スルホキシド）を確認した。ＴＬＣ板上でダンシルメチオニンが完全に消失した時間を反応終了時間とし、各増感剤の光酸化反応の強弱を比較検討した。その結果を図１および表２に示す。なお、図１中縦軸はＲｆを横軸は時間（分）を示し、Ｒｆ値０．７９はダンシルメチオニン、０．４３はダンシルメチオニン スルホキシドのスポットである。また、表２の数値は反応完了時間を分で示し、この値（分）が小さければ小さいほど光酸化反応が強いことを意味する。
【００３６】
【表２】
実施例 １０
紫外線吸収スペクトル分析（アルブミンテスト）
ポルフィリン化合物はアルブミン溶液中で、二単量体あるいは多量体を形成することが知られている。この性質はアルブミン濃度を種々変えて分析を行うことで極大吸収値の移動または吸光係数の変動がみられることで判る。したがって癌細胞との親和性を検討するには簡単なスクリーニングテストである。アルブミン５４ｍｇを３ｍｌの生理食塩水に溶解し、１．８％濃度とする。次いでこれを１０倍希釈して０．１８％とした液を公比３で希釈して各アルブミン濃度（１．８、０．１８、０．０６、０．０２、０．００６６、０．００２２％）の液を調製した。一方、ポルフィリン誘導体１ｍｇをリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌに溶解し、生理食塩水で１００ｍｌにした。そしてアルブミン希釈液２ｍｌとポルフィリン溶液２ｍｌを混合し、混液のアルブミン最終濃度を０．９、０．０９、０．０３、０．０１、０．００３３、０．００１１％とし紫外線吸収スペクトル測定（３５０〜９００ｎｍ）を行った。またアルブミン希釈液のかわりに生理食塩水およびメタノール溶液中でも同様に測定した。これらの測定結果を表３に示す。その代表例として、ＮＯＭｅ−Ｐ−ｄｉＡｓｐ（１）の紫外線吸収スペクトルを図２および図３に示す。
【００３８】
【表３】
実施例 １１
赤外吸収スペクトル分析
赤外分光光度計によりＫＢｒ錠剤法にて本誘導体の赤外吸収スペクトルを測定した。その代表例として、ＮＯＥｔ−Ｐ−ｄｉＡｓｐ（２）の赤外吸収スペクトルを図４に示す。
【００４０】
【発明の効果】
本発明のポルフィリン誘導体は癌細胞への集積性、外部エネルギーに対する反応性ならびに癌細胞の破壊作用を有し、しかも正常細胞に対して毒性を発現することがないから、癌治療薬あるいは癌診断薬として究めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＮＯｉｓｏＢｕ−Ｐ−ｄｉＡｓｐ（３）テトラメチルエステルを増感剤として用いた薄層クロマトグラムを示す図である。
【図２】ＮＯＭｅ−Ｐ−ｄｉＡｓｐ（１）の紫外吸収スペクトルを示す図である。
【図３】ＮＯＭｅ−Ｐ−ｄｉＡｓｐ（１）の紫外吸収スペクトルを示す図である。
【図４】ＮＯＥｔ−Ｐ−ｄｉＡｓｐ（２）の赤外吸収スペクトルを示す図である。
【符号の説明】
１ ポルフィリン溶液と生理食塩水の混液
（アルブミン濃度０％）
２ ポルフィリン溶液とアルブミン溶液の混液
（アルブミン濃度０．００１１％）
３ ポルフィリン溶液とアルブミン溶液の混液
（アルブミン濃度０．００３３％）
４ ポルフィリン溶液とアルブミン溶液の混液
（アルブミン濃度０．０１％）
５ ポルフィリン溶液とアルブミン溶液の混液
（アルブミン濃度０．０３％）
６ ポルフィリン溶液とアルブミン溶液の混液
（アルブミン濃度０．０９％）
７ ポルフィリン溶液とアルブミン溶液の混液
（アルブミン濃度０．９％）
８ ポルフィリン溶液とメタノールの混液[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a porphyrin derivative and its use, particularly to a photophysical diagnostic and therapeutic sensitizer comprising a novel porphyrin derivative as an active ingredient and / or a drug used for diagnosis and treatment of cancer by photophysical chemistry.
[0002]
[Prior art]
As a new treatment method for cancer, photophysicochemical diagnosis treatment (PDT) is performed. In this method, a certain kind of porphyrin compound is administered by a method such as intravenous injection and held in the cancer tissue, and then the laser beam is irradiated to selectively destroy only the cancer tissue. PDT utilizes the two properties that porphyrin is held in cancer tissue for a longer time than normal tissue and that it has a photosensitizing action. Over the last 15 years, more than 5,000 people worldwide have been treated for malignant tumors by PDT and are becoming established as a cancer treatment. Cancer types for which good therapeutic results have been reported by PDT are diverse, such as retinal cancer, skin cancer, esophageal cancer, superficial bladder cancer, and early lung cancer.
[0003]
The drugs currently used in PDT are mainly hematoporphyrin derivatives (HPD) and photofrin II® (HPD ether and / or ester dimer). HPD is a mixture obtained by treating hematoporphyrin with sulfuric acid in acetic acid and further treating with 0.1N sodium hydroxide. Photofrin II (R) has been clinically applied in Japan since 1995, but mainly contains a highly hydrophobic component of HPD, and is a complex mixture with HPD and the active component is unknown. Moreover, since the component ratio is not constant, the therapeutic effect is extremely unstable.
[0004]
On the other hand, new porphyrin derivatives for PDT are disclosed in JP-A-1-246286, Sho-63-145283, Sho-62-205082, Sho-62-167783, JP-A-62-249986, Sho-62-246580, Sho 62-246579 and Sho 62-205081; F. Evensen et al [Br. J. et al. Cancer, 55, 483 (1987)]. Further, chlorin derivatives are disclosed in JP-A-1-250381, Sho63-290881, Sho62-5986, Sho62-5985, Sho62-5924, Sho62-5912, Sho58-981 and Sho57. -185220, porphyrin dimer derivatives are disclosed in U.S. Pat. No. 4,649,151 (1987), JP-A-62-263586 and JP-A-60-500132, and porphyrin metal complexes are disclosed in JP-A-1-221382, 63-104987 and Sho-A. No. 57-31688. Very recently, porphyrin derivatives such as meta-tetrahydroxyphenyl chlorin (m-THPC) and benzoporphyrin derivative (BPD) having absorption around 670 nm have been developed. We have also studied variously, chlorin derivatives in JP-A-61-2279 and JP-A-60-92287, porphyrin metal complexes in JP-A-2-138280, JP-A-62-174079, JP-B-4-24661, and JP-A-6. Bacteriochlorin derivatives have been disclosed in JP-A 63-196586 in JP-A-15545 and JP-A-7-25563. However, for use as a sensitizer for PDT, it has been difficult to put the above compounds into practical use in terms of synthesis, stability and water solubility. Therefore, further investigation was made, and alkoxyporphyrin amino acid derivatives and chlorin derivatives were disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 5-97857, and showed effectiveness as sensitizers for PDT. However, derivatives with higher therapeutic effects are expected. ing.
[0005]
There is also a problem of tissue permeability of laser light used for PDT. HPD and photofrin II® have a maximum absorption wavelength of 630 nm and a low molar extinction coefficient of 3000. With 630 nm light, tissue permeability is poor, and the therapeutic effect of PDT has been limited to surface cancer of 5 to 10 mm.
[0006]
On the other hand, there is a problem with laser devices. The dye lasers that are most often used at present are poorly stable and difficult to handle in operation. Using a titanium sapphire laser makes it much easier to operate. However, when this laser is used, it is limited to an absorption wavelength of 670 nm or more and 600 nm or less, and cannot be applied to HPD or Ptofrin II <R> having an absorption wavelength near 630 nm. Recently, a semiconductor laser (670 nm) has been developed, and a compound having an absorption at 670 nm has been advantageous.
[0007]
Furthermore, it is known to cause temporary photosensitivity as a side effect of the drug. For this reason, after drug administration, the patient must be kept in a dark place for a long time so that normal tissues such as skin are not destroyed by photosensitization. Since HPD and Ptofrin II® are slow to excrete from normal tissues, photosensitivity may remain for more than 6 weeks when they are long. Currently used drugs have many of these problems, and the development of new drugs to replace HPD and Photofrin II® is strongly desired. Therefore, a compound that is a single compound and has absorption in a longer wavelength region (650 to 800 nm) has been proposed as a second generation drug to overcome the drawbacks of the above-mentioned drugs. Various compounds such as azaporphyrins such as phthalocyanine, porphyrins such as chlorin and bacteriochlorin, and ring-expanded porphyrins such as texaphyrin are currently being studied.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
The inventors of the present invention have a single component, are stable and maintain good accumulation on cancer tissues, have a high discharge rate from normal tissues, reduce phototoxicity, and preferably a titanium sapphire laser (670 nm to 600 nm). In order to provide a photosensitizer suitable for PDT, a variety of studies were repeated in order to search for a vorphyrin derivative capable of using a semiconductor laser (670 nm) as well as the following wavelengths).
[0009]
[Means for solving problems]
As a result, when a certain imino group and an aspartic acid residue are bonded to the side chain of chlorins synthesized and derivatized from blood-derived protoporphyrin in the derivative of the previous application (Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-97857), It has been found that a single component has excellent accumulation properties for cancer tissues and quicker discharge than normal tissues, and further has a longest wavelength absorption edge of 670 nm or more and a good PDT effect.
[0010]
Moreover, the present inventors analyzed the ultraviolet absorption (UV) spectrum of a mixture of these chlorin derivatives and albumin as in the derivative of the previous application (Japanese Patent Laid-Open No. 5-97857). It has been found that it leads to affinity for organs, especially cancer.
[0011]
On the other hand, the present inventors can easily evaluate the intensity of reactivity to light by thin layer chromatography (TLC) or high performance liquid chromatography (HPLC) in the same manner as the derivative of the previous application (Japanese Patent Application No. 4-276488). When these chlorin derivatives were evaluated by photosensitized oxidation using a dansylmethionine substrate system, they were found to have strong effects.
[0012]
The present invention has been completed based on the above findings, and its gist is
Formula (I)
[In the formula, R 1 Is C 2 H 5 , CH 2 CH (CH 3 ) 2 , CH 2 C 6 H 5 , CH 2 C 6 F 5 And R 2 Is a porphyrin compound represented by the formula 2 (residue obtained by removing hydrogen from aspartic acid)].
[0013]
The porphyrin compound of the present invention can be produced by conventional methods. In the porphyrin compound corresponding to the general formula (I), first, it is derivatized to a compound having an aldehyde group (step a), the residue of aspartic acid is bonded to the obtained chlorin derivative (step b), and various Of the hydroxylamine derivative is condensed (step c). The steps (b) and (c) do not necessarily have to be sequentially reacted, and the order of the steps may be changed as in (c) and (b).
[0014]
The construction step (a) E. By Falk [Porphyrins and Metallophyrins] (published by Elsevier, 1975); This can be done by conventional methods as described by Dolphin [The Porphyrins] (Academic Press, 1978).
[0015]
For example, R corresponding to (I) 1 , R 2 JP-A-61-2279, JP-B-63-13997, JP-B-6-15545, JP-B-7-25563, JP-A-2-138280, JP-A-4-59779 These may be prepared according to the methods described in JP-A-5-97857 and Japanese Patent Application No. 3-323597. That is, in the chlorination step (a), 1-hydroxy-2-formylethylidene-protoporphyrin dimethyl ester (hereinafter referred to as P-Me) obtained by photochemical reaction treatment of protoporphyrin dimethyl ester (hereinafter referred to as PP-Me). (Including 3-hydroxy-4-formylethylidene-protoporphyrin dimethyl ester in which the functional groups of the side chains of the A and B rings of the four tetrapyrrole rings are respectively replaced).
[0016]
Next, it attaches | subjects to the coupling | bonding process (b) of an amino acid residue. That is, R 2 Aspartic acid is reacted with the porphyrin compound (I) in which is a hydroxyl group, and R 2 Produces an aspartic acid-supported porphyrin compound (I). This can be carried out by a conventional method described in Izumiya et al. [Peptide Synthesis Fundamentals and Experiments] (published by Maruzen, 1985) and the like, and disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 64-61481 and Japanese Patent Publication No. 7-25563. This may be prepared according to the methods described in JP-A-2-138280 and JP-A-4-59779.
[0017]
In this case, the main point is to introduce an aspartic acid residue into the side chain of the porphyrin compound. 2 The reaction is preferably allowed to proceed between the side chain carboxyl group and the aspartic acid amino group, so that the former carboxyl group and / or the latter amino group can be converted into a conventional reactive group or present in both. It may be considered to appropriately protect functional groups that are not preferred to participate in the reaction. In any case, the use of a reaction accelerator such as a dehydrating agent or a deoxidizing agent or a condensing agent may be considered as appropriate.
[0018]
The chlorin compound constituted as described above is subjected to the condensation step (c). P-Me is reacted with a hydroxylamine derivative to produce a condensate porphyrin compound. This can be carried out by a conventional method described in [Condensation reaction of hydroxylamine and aldehyde compound] in general organic chemistry experiments. In place of artificial synthesis, it may be collected from natural resources such as plants and animals.
[0019]
Hereinafter, the preparation of the porphyrin compound (I) will be described more specifically with reference to typical examples. For example, 1-hydroxy-2-formylethylidene-protoporphyrin (hereinafter referred to as P) obtained by hydrolysis of P-Me is prepared (however, the side chains of the A and B rings of the four tetrapyrrole rings) Also included is 3-hydroxy-4-formylethylidene-protoporphyrin, each with a functional group interchanged. This is reacted with methyl aspartate in a solvent using a condensing agent [for example, dicyclohexylcarbodiimide (DCC) or water-soluble carpositimide (WSC)], and R 2 To obtain a porphyrin compound (I) having an aspartic acid residue bonded to the side chain thereof. Next, a hydroxylamine derivative (for example, O-methylhydroxylamine, O-ethylhydroxylamine, O-benzylhydroxylamine, etc.) is reacted with a condensing agent (for example, pyridine, piperidine, acid, alkali, etc.) in a solvent, R 1 The porphyrin compound (I) in which these compounds are condensed to the side chain is obtained. Specific examples thereof include the following.
[0020]
(1) 13,17-bispropionylaspartic acid-3-ethenyl-7-hydroxy-8-methoxyiminoethylidene-2,7,12,18-tetramethyl-porphine (hereinafter referred to as NOMe-P-diAsp)
(2) 13,17-bispropionylaspartic acid-3-ethenyl-7-hydroxy-8-ethoxyiminoethylidene-2,7,12,18-tetramethyl-porphine (hereinafter referred to as NOEt-P-diAsp)
(3) 13,17-bispropionylaspartic acid-3-ethenyl-7-hydroxy-8-isobutoxyiminoethylidene-2,7,12,18-tetramethyl-porphine (hereinafter referred to as NOisoBu-P-diAsp)
(4) 13,17-bispropionylaspartic acid-3-ethenyl-7-hydroxy-8-benzyloxyiminoethylidene-2,7,12,18-tetramethyl-porphine (hereinafter referred to as NOCH) 2 C 6 H 5 -P-diAsp)
(5) 13,17-bispropionylaspartic acid-3-ethenyl-7-hydroxy-8-pentafluorobenzyloxyiminoethylidene-2,7,12,18-tetramethyl-porphine (hereinafter referred to as NOCH) 2 C 6 F 5 -P-diAsp)
[0021]
Production of a pharmaceutical preparation of a porphyrin derivative according to the present invention is carried out by a method known per se, and the derivative according to the present invention only needs to be dissolved in an appropriate buffer. Suitable additives such as pharmaceutically acceptable solubilizers (eg organic solvents), pH adjusters (eg acids, bases, buffers), stabilizers (eg ascorbic acid), excipients (eg glucose), etc. A tonicity agent (for example, sodium chloride) or the like may be blended.
[0022]
The drug according to the present invention has the necessary and sufficient properties as a drug for PDT, that is, a long phosphorescence lifetime, an affinity for albumin, a specific accumulation property for a specific organ, particularly cancer, a photocidal effect by dansylmethionine evaluation, an absorption wavelength, water solubility, purity That is enough. The good water solubility of the drug according to the invention makes it possible to produce highly concentrated solutions (50 mg / ml), and the drug according to the invention exhibits a high stability not only in vitro but also in vivo. In general, for application as a PDT drug, it is desirable to administer the drug of the present invention in an amount of 1 mg to 5 mg / kg body weight.
[0023]
[Action]
The porphyrin compound according to the present invention has chemical structural characteristics in that it has an amino acid residue or an aldehyde condensate in the side chain of the porphyrin skeleton, and as a result, exhibits various physiological or pharmacological properties.
[0024]
These porphyrin derivatives accumulate selectively in cancer cells and are slowly excreted from cancer cells. In addition, since it is rapidly excreted from normal organs and cells, they are not damaged. Originally, most porphyrin derivatives have a strong effect on light. According to the present invention, by introducing a polyfunctional compound residue into the side chain of the porphyrin derivative, the excretion from normal tissues is enhanced. Derivatives designed to suppress the occurrence of phototoxicity as much as possible have become possible. Moreover, the depth of the therapeutic effect was able to be measured by converting the porphyrin into a chlorin derivative and the wavelength being red-shifted. Based on these characteristics (cancer affinity, photocidal effect, absorption wavelength, water solubility), the porphyrin derivative of the present invention is useful as a PDT drug for specific organs, particularly cancer and malignant tumors.
[0025]
Hereinafter, examples will be described. In addition, all the yield in an Example is the value calculated | required in conversion from PP-Me which is a starting material.
[0026]
【Example】
Example 1
Synthesis of P
R. K. Dinello et al. [The Porphyrins, Academic Press, Vol. 1, 303 (1978)]. 100 g of PP-Me was dissolved in 10 l of chloroform and reacted for 1 week under light irradiation. (Chlorine derivatization from porphyrin) After the reaction, it was concentrated under reduced pressure to obtain a residue. The obtained residue was purified by silica gel column chromatography (eluent: n-hexane-chloroform) to obtain P-Me. (50.0 g) Subsequently, this was hydrolyzed in a pyridine / methanol mixture to obtain dark green crystalline P. (43.0 g, yield 42.7%)
[0027]
Example 2
Aspartic acid derivatization of porphyrin
P2g obtained in Example 1 was dissolved in tetrahydrofuran, and converted into a P-DCHA salt (2.0 g) with dicyclohexylamine (DCHA) by a conventional method. This DCHA salt was dissolved in 150 ml of chloroform, 2 g of aspartic acid dimethyl ester (AspMe) hydrochloride was added, and 2 g of water-soluble carbodiimide (WSC) was gradually added with stirring to react for 1.5 hours. After the reaction (the end point of the reaction was confirmed by TLC), the reaction solution was washed with water and separated, and the chloroform layer was concentrated under reduced pressure. The obtained concentrate was repeatedly reprecipitated and recrystallized with ethyl acetate-ether-n-hexane to give dark green crystalline photoprotoporphinyl-6,7-bisaspartic acid tetramethyl ester (hereinafter referred to as P-AspMe). Say). (1.2 g, yield 17.3%)
[0028]
Example 3
Synthesis of NOMe-P-diAsp (1)
500 mg of P-AspMe obtained in Example 2 was dissolved in 20 ml of pyridine, 150 mg of O-methylhydroxylamine hydrochloride was added with stirring at room temperature, and the mixture was reacted for 30 minutes. After the reaction, chloroform was added to the reaction solution, and after separation with water, the chloroform layer was concentrated under reduced pressure. The obtained concentrate was reprecipitated with ethyl acetate-n-hexane, and the precipitate was collected by filtration, dried, dissolved in 10 ml of pyridine, and hydrolyzed by adding 10 ml of 1N sodium hydroxide. After neutralizing with 1N hydrochloric acid, the mixture was separated with chloroform, and the chloroform layer was concentrated under reduced pressure. The concentrate was reprecipitated with methanol-ethyl acetate-n-hexane to obtain NOMe-P-diAsp (1) as dark green crystals. (390 mg, 13.9%)
[0029]
Example 4
Synthesis of NOEt-P-diAsp (2)
500 mg of P-AspMe obtained in Example 2 was dissolved in 20 ml of pyridine, and 150 mg of O-ethylhydroxylamine hydrochloride was added with stirring at room temperature and reacted for 30 minutes. After the reaction, chloroform was added to the reaction solution, and after separation with water, the chloroform layer was concentrated under reduced pressure. The obtained concentrate was reprecipitated with ethyl acetate-n-hexane, and the precipitate was collected by filtration, dried, dissolved in 10 ml of pyridine, and hydrolyzed by adding 10 ml of 1N sodium hydroxide. After neutralizing with 1N hydrochloric acid, the mixture was separated with chloroform, and the chloroform layer was concentrated under reduced pressure. The concentrate was reprecipitated with methanol-ethyl acetate-n-hexane to obtain NOEt-P-diAsp (2) as dark green crystals. (420 mg, 14.8%)
[0030]
Example 5
Synthesis of NOisoBu-P-diAsp (3)
500 mg of P-AspMe obtained in Example 2 was dissolved in 20 ml of pyridine, 150 mg of O-isobutylhydroxylamine hydrochloride was added with stirring at room temperature, and the mixture was reacted for 30 minutes. After the reaction, chloroform was added to the reaction solution, and after separation with water, the chloroform layer was concentrated under reduced pressure. The obtained concentrate was reprecipitated with ethyl acetate-n-hexane, and the precipitate was collected by filtration, dried, dissolved in 10 ml of pyridine, and hydrolyzed by adding 10 ml of 1N sodium hydroxide. After neutralizing with 1N hydrochloric acid, the mixture was separated with chloroform, and the chloroform layer was concentrated under reduced pressure. The concentrate was reprecipitated with methanol-ethyl acetate-n-hexane to obtain dark green crystalline NOisoBu-P-diAsp (3). (450 mg, 15.3%)
[0031]
Example 6
NOCH 2 C 6 H 5 -Synthesis of P-diAsp (4)
500 mg of P-AspMe obtained in Example 2 was dissolved in 20 ml of pyridine, and 150 mg of O-benzylhydroxylamine hydrochloride was added with stirring at room temperature and reacted for 60 minutes. After the reaction, chloroform was added to the reaction solution, and after separation with water, the chloroform layer was concentrated under reduced pressure. The obtained concentrate was reprecipitated with ethyl acetate-n-hexane, and the precipitate was collected by filtration, dried, dissolved in 10 ml of pyridine, and hydrolyzed by adding 10 ml of 1N sodium hydroxide. After neutralizing with 1N hydrochloric acid, the mixture was separated with chloroform, and the chloroform layer was concentrated under reduced pressure. The concentrate was reprecipitated with methanol-ethyl acetate-n-hexane, and dark green crystalline NOCH 2 C 6 H 5 -P-diAsp (4) was obtained. (400 mg, 13.1%)
[0032]
Example 7
NOCH 2 C 6 F 5 -Synthesis of P-diAsp (5)
500 mg of P-AspMe obtained in Example 2 was dissolved in 20 ml of pyridine, and 150 mg of O- (pentafluorobenzyl) hydroxylamine hydrochloride was added with stirring at room temperature and reacted for 120 minutes. After the reaction, chloroform was added to the reaction solution, and after separation with water, the chloroform layer was concentrated under reduced pressure. The obtained concentrate was reprecipitated with ethyl acetate-n-hexane, and the precipitate was collected by filtration, dried, dissolved in 10 ml of pyridine, and hydrolyzed by adding 10 ml of 1N sodium hydroxide. After neutralizing with 1N hydrochloric acid, the mixture was separated with chloroform, and the chloroform layer was concentrated under reduced pressure. The concentrate was reprecipitated with methanol-ethyl acetate-n-hexane, and dark green crystalline NOCH 2 C 6 F 5 -P-diAsp (5) was obtained. (390 mg, 11.7%)
[0033]
Example 8
Laser irradiation in the isolated organ (excitation fluorescence spectrum)
After intravenous injection of 5 mg test drug NOMe-P-diAsp (1) diluted with phosphate buffer (1 ml) to golden hamsters (1 group, 5 animals) on days 14 to 21 transplanted with nitrosamine-carcinogenic pancreatic cancer cells , Each organ containing cancer was removed and N 2 -Pulsed laser (N 2 337 nm, 2 ns, 400 to 1000 nm), the excitation fluorescence spectrum was measured, and the wavelength of 600 to 900 nm was examined based on the peak wavelength of NADH of 470 nm. (N 2 -PLS measurement) Table 1 shows the results (cancer / each organ ratio) obtained in the same manner. Table 1 shows the values obtained by measuring the excitation fluorescence spectrum of each organ extracted 3 hours after drug administration and calculating the peak wavelength at 600 to 900 nm with reference to the peak wavelength of 470 nm.
[0034]
[Table 1]
Example 9
Evaluation of photosensitized oxidation using dansylmethionine
The substrate (dansylmethionine) 10 μM was dissolved in 1 ml of chloroform, the sensitizer 0.1 μM obtained in the above Example was added, and Cold Spot PICL-SX (Nippon PI Co. Ltd.) (with stirring) was added. Irradiation with a halogen lamp, 150 W, 80,000 Lux). The reaction solution was added to a TLC plate (Kieselgel 60 F) every minute of light irradiation. 254 ) And developed with chloroform-methanol (3: 2), and dansylmethionine and its oxidation product (dansylmethionine sulfoxide) were confirmed with a UV lamp (254 nm). The time at which dansylmethionine completely disappeared on the TLC plate was defined as the reaction end time, and the strength of the photooxidation reaction of each sensitizer was compared. The results are shown in FIG. In FIG. 1, the vertical axis represents Rf, the horizontal axis represents time (minutes), Rf value 0.79 is a dansylmethionine sulfoxide spot, and 0.43 is a dansylmethionine sulfoxide spot. The numerical values in Table 2 indicate the reaction completion time in minutes, and the smaller this value (minute), the stronger the photooxidation reaction.
[0036]
[Table 2]
Example 10
UV absorption spectrum analysis (albumin test)
Porphyrin compounds are known to form dimonomers or multimers in albumin solutions. This property can be understood by the movement of the maximum absorption value or the fluctuation of the extinction coefficient by analyzing the albumin concentration in various ways. Therefore, it is a simple screening test to examine the affinity with cancer cells. 54 mg of albumin is dissolved in 3 ml of physiological saline to a concentration of 1.8%. Next, this solution was diluted 10 times to 0.18% and diluted with a common ratio of 3 to obtain each albumin concentration (1.8, 0.18, 0.06, 0.02, 0.0066, 0.0022). %) Solution was prepared. On the other hand, 1 mg of the porphyrin derivative was dissolved in 1 ml of a phosphate buffer (pH 8.0) and made up to 100 ml with physiological saline. Then, 2 ml of the diluted albumin solution and 2 ml of the porphyrin solution were mixed, and the final concentration of albumin in the mixed solution was 0.9, 0.09, 0.03, 0.01, 0.0033, 0.0011%, and ultraviolet absorption spectrum measurement (350 ~ 900 nm). Moreover, it measured similarly also in the physiological saline and the methanol solution instead of the albumin dilution liquid. These measurement results are shown in Table 3. As a typical example, the ultraviolet absorption spectrum of NOMe-P-diAsp (1) is shown in FIGS.
[0038]
[Table 3]
Example 11
Infrared absorption spectrum analysis
The infrared absorption spectrum of this derivative was measured by the KBr tablet method using an infrared spectrophotometer. As a typical example, an infrared absorption spectrum of NOEt-P-diAsp (2) is shown in FIG.
[0040]
【The invention's effect】
Since the porphyrin derivative of the present invention has accumulation properties in cancer cells, reactivity to external energy, and destruction of cancer cells, and does not exhibit toxicity to normal cells, it is a therapeutic agent for cancer or a diagnostic agent for cancer. It is useful as a research.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a thin layer chromatogram using NOisoBu-P-diAsp (3) tetramethyl ester as a sensitizer.
FIG. 2 is a diagram showing an ultraviolet absorption spectrum of NOMe-P-diAsp (1).
FIG. 3 is a diagram showing an ultraviolet absorption spectrum of NOMe-P-diAsp (1).
FIG. 4 is an infrared absorption spectrum of NOEt-P-diAsp (2).
[Explanation of symbols]
1 Mixture of porphyrin solution and physiological saline
(
2 Mixture of porphyrin solution and albumin solution
(Albumin concentration 0.0011%)
3 Mixture of porphyrin solution and albumin solution
(Albumin concentration 0.0033%)
4 Mixture of porphyrin solution and albumin solution
(Albumin concentration 0.01%)
5 Mixture of porphyrin solution and albumin solution
(Albumin concentration 0.03%)
6 Mixture of porphyrin solution and albumin solution
(Albumin concentration 0.09%)
7 Mixture of porphyrin solution and albumin solution
(Albumin concentration 0.9%)
8 Mixture of porphyrin solution and methanol
Claims (3)
〔式中、Ｒ１はＣ２Ｈ５，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２，ＣＨ２Ｃ６Ｈ５，ＣＨ２Ｃ６Ｆ５を表わし、Ｒ２は化２（アスパラギン酸から水素を除いた残基）〕で示されるポルフィリン化合物。
[Wherein R 1 represents C 2 H 5 , CH 2 CH (CH 3 ) 2 , CH 2 C 6 H 5 , CH 2 C 6 F 5 , R 2 represents chemical formula 2 (hydrogen is removed from aspartic acid) Porphyrin compounds represented by the residue)].
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1995
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