JP3717955B2

JP3717955B2 - Pharmaceutical composition

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Publication number: JP3717955B2
Application number: JP19266194A
Authority: JP
Inventors: 昭粟屋; 昶小林; 勉上山; 道夫藤原
Original assignee: 道夫藤原
Priority date: 1994-07-14
Filing date: 1994-07-14
Publication date: 2005-11-16
Anticipated expiration: 2020-11-16
Also published as: JPH0827019A

Description

【０００１】
【技術分野】
本発明は、人間用又は動物用の新規な医薬に関するものであり、さらに詳しく言えば、造血系細胞、即ち骨髄、胸腺、リンパ組織の細胞、末梢血幹細胞、臍帯血幹細胞および血液、あるいはそれらの個々の成分を体内に移植あるいは輸血する、医療・治療処置において、本来目的とするその治療効果を高め、かつそれに伴う副反応・副作用を抑制・阻止することを目的とする薬剤に関する。
【０００２】
【背景技術】
造血系の異常・不全な患者には、骨髄、胸腺、リンパ組織の細胞、末梢血幹細胞、臍帯血幹細胞あるいはそれらの個々の成分の移植が行われる。一方、癌、腫瘍、白血病、リンパ腫等の治療に化学療法剤の大量投与あるいは放射線の大量照射が行われる。これら腫瘍細胞の徹底的除去のあとには、骨髄等の再建が必須である。癌患者自身の骨髄、末梢血幹細胞を前もって体外に取り出し、凍結保存しておき、骨髄破壊的な癌治療実施後、骨髄、末梢血幹細胞をその患者本人にもどす方法が自家骨髄移植、自家末梢血幹細胞移植である。
【０００３】
一方腫瘍細胞を化学療法、放射線療法等により骨髄破壊的に叩き、根絶した後、ドナーである親・兄弟・同胞、他人の骨髄を移植するのが他家（まれに同系）骨髄移植である。このようにして移植された骨髄は宿主の造血系や免疫系を再構築する。
【０００４】
この移植医療において、骨髄、末梢血幹細胞、臍帯血幹細胞の移植細胞数を充分確保することが重要である。また移植した骨髄、胸腺、リンパ組織の細胞が宿主において確実に生着すること、即ち宿主対移植片反応［ＨＶＧＲ］などの拒絶反応を抑えること、さらには移植片対宿主疾患（反応）［ＧＶＨＤ（Ｒ）］を顕著に起こさないこと、そして必要な免疫系を早期に回復させる手段を講じて、感染症などにより移植患者を早期に死亡に至らしめないことが重要である。
【０００５】
しかしながら、急性ＧＶＨＤあるいは慢性ＧＶＨＤにより、折角の骨髄移植の医療後に、早期にあるいは晩発的に死亡する患者が数多く存在する現状であり、かかる状況に対し、適切、有効な医療対策を行うことが求められている。また骨髄移植医療においては、提供される骨髄を、広く量的に確保することは緊急問題であるところ、骨髄バンクの設立などの対策も講じられつつあるとはいえ、需要量に対し極めて不充分な現状にある。
【０００６】
一方、白血病患者への骨髄移植後のＧＶＨＤがたとえばサイクロスポリンＡとメソトレキセートとの併用などにより、比較的効果的に予防されることが知られているが、それは同時に、ＧＶＨＲによる白血病の再発の抑制効果（ＧＶＬ）が抑えられることにもつながる。そこでＧＶＨＤを抑制し、しかもＧＶＬも持続・維持する、あるいはＧＶＬを抑制しない程度にＧＶＨＤを効果的に抑制するような、骨髄等の移植医療に際し、支持的に用いられうる予防・治療剤を開発することは意義のあることである。
【０００７】
他方輸血医療においても、輸血後ＧＶＨＤが少なからず発生し、輸血後に、死亡する患者は少なくなく、これも解決を要する問題とされている。
【０００８】
【発明の開示】
本発明者は、骨髄提供者から１回に採取・提供される骨髄細胞の量をふやせる方法、採取する骨髄細胞数を減らしても同程度の移植の効果を達成・維持しうる方法の開発につき検討を続け、このような目的に適合するような薬剤を、生体に本来存在し、生体防御能を有する物質の中に求め、安全性の高い天然由来の各種ペプチド類につき、骨髄移植および輸血などの医療において、その医療効果を高め、ＧＶＨＤのような副作用を減らしうる予防・治療剤、また免疫系の再構築などを通して感染症などによる早期死亡を食い止めうる予防・治療剤として有用な物質を鋭意探索した。
【０００９】
その結果、血清胸腺因子（Ｆａｃｔｅｕｒｔｈｙｍｉｑｕｅｓｅｒｉｑｕｅ：ＦＴＳ）として知られるノナペプチドおよびその誘導体又はそれらの塩類又はそれら各化合物と金属との結合物をマウス、ラット、モルモット等に投与することにより、骨髄移植時の移植に要するドナーから採取する骨髄細胞数を大幅に減らしても、同等の移植の成績を達成できることを見出した。また骨髄を移植したマウス、ラット等、および脾臓細胞、血液あるいはその白血球成分（リンパ球等）を輸血・移入したマウス、ラット等に惹起・発生するＧＶＨＤが、ＦＴＳノナペプチドの投与により抑制されることを見出した。
【００１０】
またマウスの白血病の発症がＦＴＳの投与により抑制されることを見出した。本発明はかかる知見に基づいてなされたものであり、骨髄および血液あるいは、造血幹細胞あるいはリンパ球など、それらの個々の成分を生体に移植あるいは輸血する医療において、それらの宿主への生着を確実にし、その目的とする治療効果を高め、好ましからぬＧＶＨＤなどの副反応・副作用を減少・抑制するための予防・治療剤、また免疫系の再構築などを通して感染症などによる早期死亡を食い止めるための予防・治療剤を提供するものである。
【００１１】
先に、ＦＴＳとして知られるノナペプチドを有効成分とする多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、炎症性神経炎、多発性神経炎などや他の免疫性脱髄疾患などの免疫不全を伴う各種疾患の治療剤および老化防止、細胞賦活、老人病予防・治療のための薬剤は知られているが、（特開昭５８−５２２２５、特開平１−３１６３２８）、ＦＴＳノナペプチドが、造血系・血液成分の生体への投与の際に併用し、それらの宿主への生着を確実にし、移植・輸血の治療効果を高め、かつそれに伴う副作用を減らしうるという事実・知見は、従来技術からは全く予期し得ないことであり、本発明者らによって初めて見出されたことである。
【００１２】
かくして本発明は、下記のアミノ酸配列：
ｐＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎを有するノナペプチド又はそのＣ末端のアスパラギンのカルボキシル基におけるエステル又はアミド又はそれら各化合物の薬学的に許容し得る塩又はそれら各化合物と金属との結合物を有効成分として含有することを特徴とする、造血系・血液成分の生体への投与の際に併用し、それらの宿主への生着を確実にし、移植・輸血の治療効果を高め、かつそれに伴う副作用を減らすことを目的とする予防・治療剤を提供するものである。
【００１３】
本発明において使用される前記のノナペプチドは公知物質であって、通常ペプチド合成に慣用されている液相又は固相におけるペプチド合成法例えば、特開昭５４−１６４２５号公報、ＵＳＰ４，３０１，０６５記載の方法により、困難なく製造することができる。あるいはまた、このノナペプチドは、遺伝子工学的方法、細胞工学的方法によっても調製することができる。
【００１４】
本発明において使用される前記のノナペプチドのＣ末端のアスパラギンのカルボキシル基におけるエステルは、薬学的に許容し得るカルボン酸のエステル類であり、
【００１５】
その例としては、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、イソブチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ｎ−ペンチルエステル、イソペンチルエステル、ネオペンチルエステル、ｔｅｒｔ−ペンチルエステル、ｎ−ヘキシルエステル、ｓｅｃ−ヘキシルエステル、ヘプチルエステル、オクチルエステル、ｓｅｃ−オクチルエステル、ｔｅｒｔ−オクチルエステル、ノニルエステル、デシルエステル、ウンデシルエステル、ドデシルエステル、トリデシルエステル、テトラデシルエステル、ヘキサデシルエステル、オクタデシルエステル、ノナデシルエステル、エイコシルエステル、
【００１６】
シクロペンチルエステル、シクロヘキシルエステル、シクロヘプチルエステル、シクロオクチルエステル、アリルエステル、イソプロペニルエステル、ベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−クロルベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−フルオルベンシルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−ブロムベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−ヨードベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−メチルベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−エチルベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−イソプロピルベンジルエステル、シンナミルエステル、アミノエチルエステル、
【００１７】
ｏ−、ｍ−、又はｐ−アミノベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−ニトロベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−メトキシベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−エトキシベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−アミノフエネチルエステル、α−フルフリルエステル、α−チエニルメチルエステル、α−ピリジルメチルエステル、α−ピリジルエチルエステル、ピペリジノメチルエステル、α−ビペリジルメチルエステル、モルホリノエチルエステル、α−モルホリニルメチルエステルなどがあげられる。
【００１８】
また、本発明において使用される前記のノナペプチドのＣ末端のアスパラギンのカルボキシル基におけるアミドは、薬学的に許容し得るカルボン酸のアミド類であり、
【００１９】
その例としては、アミド、メチルアミド、エチルアミド、プロピルアミド、イソプロピルアミド、ｎ−ブチルアミド、イソブチルアミド、ｔｅｒｔ−ブチルアミド、ｎ−ペンチルアミド、イソペンチルアミド、ネオペンチルアミド、ｔｅｒｔ−ペンチルアミド、ｎ−ヘキシルアミド、ｓｅｃ−ヘキシルアミド、ヘプチルアミド、オクチルアミド、ｓｅｃ−オクチルアミド、ｔｅｒｔ−オクチルアミド、ノニルアミド、デシルアミド、ウンデシルアミド、ドデシルアミド、トリデシルアミド、テトラデシルアミド、ヘキサデシルアミド、オクタデシルアミド、ノナデシルアミド、エイコシルアミド、
【００２０】
シクロペンチルアミド、シクロヘキシルアミド、シクロヘプチルアミド、シクロオクチルアミド、アリルアミド、イソプロペニルアミド、ベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−クロルベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−フルオルベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−ブロムベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−ヨードベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−メチルベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−エチルベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−イソプロピルベンジルアミド、シンナミルアミド、アミノエチルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−アミノベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−ニトロベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−メトキシベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−エトキシベンジルアミド、
【００２１】
ｏ−、ｍ−、又はｐ−アミノフエネチルアミド、α−フルフリルアミド、α−チエニルメチルアミド、α−ピリジルメチルアミド、α−ピリジルエチルアミド、ピペリジノメチルアミド、α−ピペリジルメチルアミド、モルホリノエチルアミド、α−モルホリニルメチルアミド、メトキシカルボニル−（α−メルカプトメチル）メチルアミド、エトキシカルボニル−（α−メルカプトメチル）メチルアミドなどがあげられる。
【００２２】
また、前述の薬学的に許容し得る塩としては、前記のノナペプチドのアミノ基における酸付加塩およびカルボキシル基における塩基塩があげられる。酸付加塩としては、有機酸又は無機酸との各塩があげられ、それらの例としては、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸、酒石酸、フマル酸、りんご酸、マレイン酸、しゅう酸、ナフトエ酸などのカルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸などのスルホン酸との塩、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸との塩、があげられる。
【００２３】
上記の塩基塩としては、無機塩基との塩すなわち、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、あるいは有機塩基との塩すなわち、アミンとの塩があげられ、それらの例としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、トリエチルアミン塩、エタノールアミン塩、トリス塩、ジシクロヘキシルアミン塩などがあげられる。
【００２４】
前記の各化合物と金属との結合物における金属としては亜鉛、鉄、マグネシウム、コバルト、ニッケル、クロム、金、ゲルマニウム、ガリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、銅、マンガン、セレンなどの１価、２価、３価又は４価の金属が例示される。
【００２５】
本発明に係わる造血系・血液成分の生体への投与の際に併用し、その治療効果を高め、かつ副作用を減らすことを目的とする予防・治療剤は、その剤型に応じて通常慣用の製剤手段を用いて調製される。すなわち、上記のノナペプチドならびにそのエステル又はアミド誘導体もしくはそれらの塩類又はそれら各化合物と金属との結合物から選ばれた有効成分物質を、適宜、薬学的に許容し得る担体、賦形剤、希釈剤などを用いて、適当な剤型に調製する。剤型は外用、経口投与、非経口投与等々の投与経路に適した種種の剤型とするこがができる。
【００２６】
本発明に係わる造血系・血液成分の生体への投与の際に併用し、その治療効果を高め、かつ副作用を減らすことを目的とする予防・治療剤の効果は下記の如き試験により確認されている。
【００２７】
すなわち、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、モルモット等哺乳動物を用い、これら動物に対し、致死量の放射線を照射するか、あるいは各用量、致死量の抗癌剤等を投与して、これら動物の骨髄の機能を障害し、ついで予め上記のノナペプチドの所定量を連日あるいは隔日に一定期間、腹腔内注射、皮下注、筋注、静注、経口などの各種の投与ルートで同種同系の動物に投与し、対照として同様に生食を同種同系の動物に投与し、しかる後それぞれ採取した骨髄細胞を、上記の骨髄障害動物に移入し、その骨髄、脾コロニー形成数等の造血系に対する効果や延命効果を比較検討した。
【００２８】
また骨髄を移植し合わせて脾臓細胞を移入するか、あるいは骨髄のみ、脾臓細胞のみ、リンパ球のみを移入してＧＶＨＤを惹起せしめたマウス、ラット等に、上記のノナペプチドの所定量をＧＶＨＤ発症に先立って、あるいは発症直後から、連日あるいは隔日に、所定の期間、腹腔内注射、皮下注、筋注、静注、経口などの各種の投与ルートで投与し、対照群とノナペプチド投与群との間の血液、尿検査値、各臓器の重量測定値、各リンパ節の重量測定値、体重測定値さらには生存率、各臓器の傷害の病理所見などを比較・観察した。
【００２９】
本発明に係わる薬剤における有効成分物質の毒性を検討するため、マウスに対し、有効成分物質ノナペプチド１００ｍｇ／ｋｇを連日１４日間皮下投与したが外見的に何ら異常は見られなかった。また、ラットに対し、有効成分物質３０ｍｇ／ｋｇ連日２１日間、皮下投与したが、外見的にも血清生化学的にも、また病理解剖を行った結果でも、何ら異常は見られなかった。このように、本発明に係わる薬剤は、きわめて毒性の少ない安全な薬剤であり、長期間投与することが可能である。
【００３０】
本発明に係わる薬剤を投与することができる対象動物としては、例えばヒト及びウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコなどの家畜、ライオン、ゾウ、キリン、クマ、ゴリラ、サル、チンパンジーなどの動物園等で飼育されている哺乳類動物、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、モルモットほか各種の実験動物、ニワトリ、七面鳥などの家禽類、ペット用の鳥類、爬虫類、両棲類、魚類などがあげられる。
【００３１】
その投与量はこれら動物の体重１ｋｇあたり通常、０．１μｇ／５００ｍｇ／日で、これらは、例えば、１日１回〜６回に分割投与してもよく、また投与対象者の年齢、病状などにより適宜投与量を増減することができる。その投与経路は特に限定されないが、静脈内、筋肉内、皮内、皮下に注射投与することもできる。また軟膏剤を調製することにより、眼部、口腔内、鼻腔内、皮膚などに塗布することができ、坐薬やゼリー剤、点眼剤、点鼻剤、鼻口腔吸収剤、エアロゾル剤、噴霧剤、局所留置ペレット剤、経口剤などとして投与することもできる。有効成分物質の生体内での急速な分解あるいは不活性化を阻止するために、有効成分物質を適当な製剤成分、たとえば、アルコール性、レシチンなどの油性、脂肪性の生理的に無害な固体または液体材料あるいはそれらの懸濁物リポソームなどを用いて製剤とし長時間活性が持続する製剤とすることもできる。
【００３２】
本発明に係わる薬剤は、他の薬剤、たとえば免疫抑制剤、免疫調節剤また免疫賦活剤等のｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｐｏｎｓｅｍｏｄｉｆｉｅｒや、各種のＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＬＩＦなどの造血因子や、ムロクタシン、化学療法剤などとともに投与することができ、また、これらを製剤中に添加し、合剤として投与し、臨床効果を高めることができる。
【００３３】
以下に実施例および実験例を記載し、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら各例によって限定されるものではない。なお、例中の記載において、前記のノナペプチドを便宜上、ＦＴＳと略記する。
【００３４】
【実施例】
実施例１注射用バイアル製剤
ＦＴＳ・ＣＨ_３ＣＯＯＨ・２Ｈ_２Ｏ（三井製薬工業社製）１ｍｇを蒸留水に溶解し、除菌濾過し、バイアル内に充填し、凍結乾燥した。
【００３５】
実施例２注射用アンプル製剤
ＦＴＳ・ＣＨ_３ＣＯＯＨ・２Ｈ_２Ｏ（三井製薬工業社製）５ｍｇを生理食塩水に溶解し、除菌濾過し、アンプル内に充填した。
【００３６】
実施例３皮下注射用注射剤
ＦＴＳ・ＣＨ_３ＣＯＯＨ・２Ｈ_２Ｏ（三井製薬工業社製）を単位投与量あたり２ｍｇを２％カルボキシメチルセルロースＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液中に懸濁し、大豆ホスフアチドからなるＬｉｐｏｍａｌ（ＨｕｈｔａｍａｋｉＯｙ／ＬｅｉｒａｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製）あるいは静脈用水中油型乳濁液であるＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（ＣｕｔｔｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）と混合した。Ｌｉｐｏｍａｌを用いる場合は、ＦＴＳ溶解ＰＢＳ溶解とＬｉｐｏｍａｌは等量ずつ混ぜ合わせた。Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄを用いる場合は、ＦＴＳ溶解ＰＢＳ溶液２．５ｍｌ、Ｔｗｅｅｎ８０（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌｓ社製）０．１ｍｌ及びＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ４．６ｍｌを混ぜ合わせた。
【００３７】
実施例４リポソーム製剤
リポソーム製剤には、電荷の異なる３種類があり、それらが、更に構造上から、４種類に分類される。
電荷は中性、陽性、陰性の３種であり、構造的には多重層リポソーム（ＭＬＶ、ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒｖｅｓｉｃｌｅ）、小さな一枚膜リポソーム（ＳＵＶ、Ｓｍａｌｌｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒｖｅｓｉｃｌｅ）、および大きな一枚膜リポソーム（ＬＵＶ、ｌａｒｇｅｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒｖｅｓｉｃｌｅ）、更にＬＵＶに近似の構造を有しながら数枚膜のもの（ＲＥＶ、ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎｖｅｓｉｃｌｅ）の４種類が知られている。
【００３８】
▲１▼ ＦＴＳ封入中性電荷リポソーム
ホスフアチジルコリン類、スフインゴミエリン等のリン脂質、およびコレステロールのクロロホルム溶液をモル比２：１、４：１、あるいは１：１となるように混合し、一旦溶媒を減圧留去したものに、脂質量に対し１／１００〜１／１０００当量のＦＴＳのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液を添加し、Ｖｏｒｔｅｘｍｉｘｅｒにて十分混和すると、ＭＬＶが得られた。
更に、リン脂質の相転移温度（Ｔｃ）以上で超音波処理することによりＳＵＶが得られた。
【００３９】
得られたＳＵＶに塩化カルシウム水溶液を加え、３７℃で１時間インキュベートして融合させた後、ＥＤＴＡを添加し、３７℃で３０分間インキュベートしてＣａ^＋＋を除くと、ＬＵＶが得られた。
ＲＥＶは以下の通りにして調製される。すなわち脂質のクロロホルム溶液から溶媒を減圧留去した後、ジエチルエーテルを適当量加えて充分に溶解したものに、ＦＴＳのＰＢＳ溶液を加え、超音波処理すると均一な単相の溶液となった。得られた溶液を室温にて減圧濃縮した後、ＰＢＳ溶液を加え、Ｖｏｒｔｅｘｍｉｘｅｒにて充分に混和すると、ＲＥＶが得られた。
【００４０】
▲２▼ ＦＴＳ封入陽性電荷リポソーム
脂質の構成成分が異なるだけで、調製方法は上記中性電荷リポソームの場合と同様である。
ホスフアチジルコリン類、スフインゴミエリン等のリン脂質、コレステロール、およびステアリルアミン等の陽性電荷の高級脂肪族アミンをモル比で７：２：１又は４：１：１で混合して、脂質成分とし、同様の方法でＦＴＳを封入した。
【００４１】
▲３▼ ＦＴＳ封入陰性電荷リポソーム
ホスフアチジルコリン類、スフインゴミエリン等のリン脂質、コレステロールおよびジセチルホスフエート、スルフアチド等の陰性電荷の高級脂肪族エステル等をモル比で７：２：１又は４：１：１で混合して、脂質成分とし、同様の方法でＦＴＳを封入した。
【００４２】
実施例５軟膏剤
ＦＴＳ・ＣＨ_３ＣＯＯＨ・２Ｈ_２Ｏ（三井製薬工業社製）２ｍｇを精製水に溶解した。次に白色ワセリン２５ｇ、ステアリルアルコール２０ｇ、ＨＣＯ−６０４ｇおよびモノステアリン酸グリセリン１ｇをとり、混和して予め調製したプロピレングリコール１２ｇ、パラオキシ安息香酸メチル０．１ｇ、パラオキシ安息香酸プロピル０．１ｇの水溶液（ＦＴＳ含有）を加えて充分に混和し、乳液とした後、冷却して固化するまで混和操作を続けて調製した。
【００４３】
実施例６坐剤
ＦＴＳ・ＣＨ_３ＣＯＯＨ・２Ｈ_２Ｏ（三井製薬工業社製）１０ｍｇを予め加温したハードファットに分散し、全量を２ｇとした。
【００４４】
実施例７経鼻用カプセル剤
ＦＴＳ０．０５ｍｇを無菌条件下で２９．９５ｍｇのミグリオル８１２中性油（ダイナマイトノーベル社製）に溶解した。この溶液を常用の単位投与用投与器に充填し、これを使用前に駆動カプセルに装着した。
【００４５】
実施例８点鼻剤
蒸留水に以下の量のリン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウム及びＥＤＴＡ−ジナトリウム塩を室温にて溶解した。この溶液にＦＴＳを溶解し、メンブランフィルターにより濾過した。
ＦＴＳ・ＣＨ_３ＣＯＯＨ・２Ｈ_２Ｏ０．１０ｍｇ
リン酸一水素ナトリウム・２Ｈ_２Ｏ０．３０ｍｇ
リン酸二水素ナトリウム・１２Ｈ_２Ｏ１０．１０ｍｇ
塩化ベンザルコニウム０．１０ｍｇ
エチレンジアミン四酢酸−ジナトリウム塩（ＥＤＴＡ）０．５０ｍｇ
塩化ナトリウム４．５０ｍｇ
蒸留水９８７．６０ｍｇ
ｐＨ値５．０±０．３
【００４６】
実施例９経鼻用スプレー製剤
ＦＴＳ・ＣＨ_３ＣＯＯＨ・２Ｈ_２Ｏ（三井製薬工業社製）２ｍｇをヒドロキシプロピルセルロース又はヒドロキシプロピルメチルセルロースに懸濁し、噴霧製剤機にてスプレー用剤とした。
以下に、本発明の薬剤に関する薬理実験、毒性実験の例を掲げる。
【００４７】
【実験例】
実験例１
Ｉａ抗原の異なるＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスとＢ６．Ｃ−Ｂ−２^ｂｍ１２（ｂｍ１２）マウスとを用意した。Ｂ６マウスの脾細胞からナイロンウールカラム法によって非付着性のＴ細胞を得た。その１〜２×１０^７個を（ｂｍ１２×Ｂ６）Ｆ_１マウスに１週間隔で２回移入し、ＧＶＨＲを惹起させた。ＧＶＨＲが起こっていることは脾指数（脾重量（ｍｇ）÷マウス体重（ｇ））の増加によって知ることができる。
【００４８】
これらマウスを２群に分け、第１群にはＦＴＳ物質生食溶液を、細胞移入２日前から連日１４日間（屠殺の２日前まで）５００μｇ／ｋｇ体重、０．１ｍｌ／１０ｇ体重になるようにｉ．ｐ．投与した。第２群には同様にして、生食のみを投与し、マウスはそれぞれ最初の細胞移入から１４日目に屠殺した。
【００４９】
ついで肝の一部をホルマリン固定し、常法によってヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色を施した。これを光学顕微鏡下で病理学的検索を行い、病変の程度をスコア化した。第２群のマウスでは、脾腫をきたし、肝小葉間胆管や中心静脈門脈域に細胞浸潤と肉芽腫がみられ、また慢性非化膿性破壊性胆管炎（Ｃｈｏｒｏｎｉｃｎｏｎ−ｓｕｐｐｒａｔｉｖｅｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ，ＣＮＳＤＣ）が認められた。スコアは４００倍で検鏡した時、細胞浸潤の程度が１００個以下の細胞浸潤を１とし、１００−４００個を２とし、４００個以上を３とした。ＣＮＳＤＣと肉芽腫に関しては、スコア化が困難なために、ある（＋）か、なし（−）かで表した。ＦＴＳ物質を投与することにより、細胞浸潤の程度は明らかに弱くなっており、また肉芽腫の形成も弱い個体が多かった（４／６）。このようにＦＴＳ物質はＧＶＨＲを抑制し、またＧＶＨＲが引き金となる自己免疫疾患様病態を抑えることが明らかにされた。
【００５０】
実験例２
６週令Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスにＢａｌｂＣマウスの骨髄細胞１０^７個および５×１０^６個の脾臓細胞を静脈内投与してＧＶＨＤを惹起させ、経時的に治療群にはＦＴＳ物質０．１〜３０μｇの各用量を、また対照群には生食を皮下投与していった。対照群が次第に体重減少し、毛羽立ってゆき、１０日目でほぼ全例死亡したのに対し、ＦＴＳ物質投与群は、１０日目までの体重減少が抑制され、次第に体重増加に転じ、３０日後まで延命した。
【００５１】
実験例３
（Ｃ５７Ｂ１／６×ＤＢＡ／２）Ｆ_１マウスに１×１０^６の脾臓細胞を静脈内投与して急性ＧＶＨＤモデルを作成した。６日目から９日目にかけて宿主のγδ型腸管上皮間リンパ球が増加し、１２日目になると減少した。ドナーの腸管上皮間リンパ球は９日目から出現した。このドナーＴリンパ球の腸管上皮間への浸潤によるＧＶＨＤの消化器病変等により、宿主マウスは１４〜１６日目にほぼ死亡した。この経過をたどる宿主マウスにＦＴＳ物質を０．１〜５０μｇの各用量を投与していったところ、腸管上皮障害が軽減、あるいは遅延して発生し、またマウスの死亡も遅延し、死亡率が低下した。
【００５２】
実験例４
４週令（ＤＡ×Ｌｅｗｉｓ）Ｆ_１ラット足蹠にＤＡ系ラットリンパ球１×１０^５個を皮下注射し、４、５および７日後に膝窩リンパ節の重量を測定してＧＶＨＲを測定した。ＦＴＳ物質を種々の投与スケジュールで０．１〜５０μｇの各用量を投与していったところ、４、５日後の対照群の各個体の膝窩リンパ節の重量が、３ｍｇから４５ｍｇの範囲に分布し、７日後の重量が８ｍｇから８５ｍｇまでの間に分布したのに対して、ＦＴＳ物質投与群の重量が抑制されていることがわかった。
【００５３】
実験例５
コロニーフォーミングユニットアッセイ／脾臓（ｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ−ｓｐｌｅｅｎａｓｓａｙ）により、ＦＴＳ物質の骨髄細胞のコロニー形成能に対する促進効果を、Ｇ−ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ）のそれと比較して検討した。９週令雌性Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスを１群４匹ずつ、３群に分けた。第１群（ＦＴＳ＋ＣＹ群）のマウスには、実験第０日から８日まで５０μｇのＦＴＳ物質を１日１回皮下投与し、第３日にシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ，ＣＹ）を２００ｍｇ／ｋｇ皮下投与した。
【００５４】
第２群（Ｇ−ＣＳＦ＋ＣＹ群）のマウスには、０日から８日まで２μｇのＧ−ＣＳＦを１日１回皮下投与し、第３日にＣＹを２００ｍｇ／ｋｇ皮下投与した。第３群（ＣＹ群）のマウスには、第１群、第２群同様に、第３日にＣＹを２００ｍｇ／ｋｇ皮下投与した。第８日に、各群の４匹のマウスの骨髄細胞を採取し、群ごとにプールした。他方、骨髄細胞の移植を受けるレシピエントマウスを用意した。７週令雌性Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス１５匹に９．５ＧｙのＸ線の全身照射を行い、３群に分けた。
【００５５】
２４時間後に１群５匹の３群の各レシピエントマウスそれぞれに対応して、上記のように集めた３群の骨髄細胞を１×１０^５ずつ移入した。骨髄移植の７日後に、各マウスを屠殺し、脾臓を採取した。脾臓の固定後、各マウスのＣＦＵ−ｓ数を測定したところ、ＦＴＳ＋ＣＹ群は８５±１９、Ｇ−ＣＳＦ＋ＣＹ群は１０２±３４、ＣＹ群は１７±１２であり、ＣＹ群と他の２群との間にはｐ＜０．００５で有意差があったが、ＦＴＳ＋ＣＹ群とＧ−ＣＳＦ＋ＣＹ群との間には統計学的有意差は見られなかった。この実験結果はＦＴＳ物質の骨髄細胞のコロニー形成能に対する効果が、Ｇ−ＣＳＦのそれと比べて遜色ないものであることを示すものである。
【００５６】
実験例６
９週令雄性Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスを２群に分け、第１群にはＦＴＳ物質１０μｇを１日１回、計７日間皮下注射した。第２群には生理食塩水を同様に投与した。そしてそれぞれの群のマウスから骨髄細胞を採取し、それぞれプールした。別に用意した同系マウスに８００Ｒ放射線を照射し、２４時間後に、上記のように採取した、ＦＴＳ物質投与群あるいは生食投与群の骨髄細胞を１０匹１群のマウスのそれぞれの群に、１匹あたり１．２５×１０^３、２．５×１０^３、５×１０^３、１×１０^４および１×１０^５個、尾静脈より移入した。
【００５７】
１０日後のマウスの生存率を調べると、１．２５×１０^３、２．５×１０^３、５×１０^３、１×１０^４、１×１０^５個の移入量に対して、生食投与群骨髄細胞の移入群では、それぞれ０％、１０％、２０％、３０％、１００％であったのに対して、ＦＴＳ物質投与群骨髄細胞の移入群では、それぞれ４０％、６０％、７０％、１００％、１００％であった。５０％生存を与える、生食投与群骨髄細胞移入群の細胞数が、１．９５×１０^４個であるのに対して、ＦＴＳ物質投与群骨髄細胞移入群の細胞数は１．７５×１０^３と算定され、ＦＴＳ物質前投与マウスの骨髄細胞は、生食前投与マウスの１１倍の骨髄生着・生存維持活性があることがわかり、このことにより、ＦＴＳ物質を前投与しておくと骨髄細胞の移植のための採取量は１１分の１ですむということが認識される。
【００５８】
これ故、骨髄移植、末梢血幹細胞移植など造血幹細胞移植療法において、造血幹細胞を提供するドナーに予めＦＴＳ物質を投与しておくことは、造血幹細胞の数や機能を増強するのに有効であることが予想される。ドナーからの１回の造血幹細胞数の採取量も減らすことが可能となる。
【００５９】
実験例７毒性試験
ｄｄｙ系５週令雄性マウス１群５匹に、ＦＴＳ物質５０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇをそれぞれ連日１４日間、皮下投与したが、何ら毒性は見られなかった。
【００６０】
実験例８毒性試験
５週令のウイスターラット１群１０匹に、ＦＴＳ物質３０ｍｇ／ｋｇを連日２１日間、皮下投与したが、何ら毒性は見られなかった。
以上述べたように、骨髄移植、造血幹細胞移植、輪血などの医療が頻繁に行われている今日、造血系・血液成分の生体への投与の際に併用し、それらの宿主への生着を確実にし、移植・輸血の治療効果を高め、かつそれに伴う副作用を減らし、死亡例を減らすことを目的とする予防・治療剤の提供が待望されているが、そのような薬剤は殆どないと言われている。
【００６１】
しかるに本発明に係わる薬剤は、直接的に、あるいは間接的に種々の作用を通して生体防御系を活性化して、上記の目的を達成する優れた予防・治療効果をもたらす点で画期的なものである。また、本発明において使用するノナペプチド（ＦＴＳ）は動物由来のペプチドであり天然物質であるので、類似のアミノ酸配列を持つＦＴＳ類縁体（アナローグ）と異なり、生体においても全く無害であり、抗原性、アナフラキシーショックなどの問題も存在しない。従って、本発明に係わる薬剤は、安全かつ有用な人間用、動物用の医薬として使用することができる。[0001]
【Technical field】
The present invention relates to a novel pharmaceutical for humans or animals, and more specifically, hematopoietic cells, that is, bone marrow, thymus, lymphoid tissue cells, peripheral blood stem cells, umbilical cord blood stem cells and blood, or their The present invention relates to a drug for transplanting or transfusion of individual components into the body, for enhancing the intended therapeutic effect in medical / therapeutic treatment, and for suppressing / preventing side reactions and side effects associated therewith.
[0002]
[Background]
Patients with abnormal or incomplete hematopoietic system are transplanted with bone marrow, thymus, lymphoid tissue cells, peripheral blood stem cells, umbilical cord blood stem cells, or individual components thereof. On the other hand, large doses of chemotherapeutic agents or large doses of radiation are used to treat cancer, tumors, leukemias, lymphomas and the like. After thorough removal of these tumor cells, reconstruction of bone marrow etc. is essential. The cancer patient's own bone marrow and peripheral blood stem cells are taken out of the body in advance, cryopreserved, and after bone marrow destructive cancer treatment, the bone marrow and peripheral blood stem cells are returned to the patient. Stem cell transplant.
[0003]
On the other hand, after eradicating and eradicating tumor cells by chemotherapy, radiation therapy, etc., transplanting the bone marrows of parents, siblings, siblings, and other people who are donors is an allogeneic (rarely syngeneic) bone marrow transplantation. The transplanted bone marrow reconstructs the host hematopoietic system and immune system.
[0004]
In this transplantation medicine, it is important to secure a sufficient number of transplanted cells for bone marrow, peripheral blood stem cells, and cord blood stem cells. In addition, the transplanted bone marrow, thymus, and lymphoid tissue cells are surely engrafted in the host, that is, the host-to-graft reaction [HVGR] and other rejection reactions are suppressed, and the graft-to-host disease (reaction) [GVHD] It is important not to cause (R)] remarkably, and to take measures to restore the necessary immune system at an early stage so that the transplanted patient does not die early due to infection or the like.
[0005]
However, there are many patients who die early or late after acute bone marrow transplantation due to acute GVHD or chronic GVHD. Appropriate and effective medical measures can be taken for such situations. It has been demanded. In bone marrow transplantation, it is an urgent issue to secure a large amount of bone marrow to be provided, but measures such as the establishment of a bone marrow bank are being taken. The current situation.
[0006]
On the other hand, it is known that GVHD after bone marrow transplantation to leukemia patients is relatively effectively prevented by, for example, combined use of cyclosporin A and methotrexate, but at the same time, recurrence of leukemia due to GVHR It also leads to the suppression effect (GVL) being suppressed. Therefore, a prophylactic / therapeutic agent that can be used in a supportive manner in bone marrow transplantation therapy that suppresses GVHD and maintains or maintains GVL or effectively suppresses GVHD to such an extent that GVL is not suppressed is developed. To do is meaningful.
[0007]
On the other hand, in transfusion medicine, GVHD occurs not a little after transfusion, and there are not a few patients who die after transfusion, and this is also a problem that needs to be solved.
[0008]
DISCLOSURE OF THE INVENTION
The present inventor has developed a method for increasing the amount of bone marrow cells collected and provided from a bone marrow donor at a time, and a method capable of achieving and maintaining the same degree of transplantation effect even if the number of bone marrow cells collected is reduced. In order to find a drug that can be used for this purpose in a substance that is naturally present in the living body and has a defense function, bone marrow transplantation and blood transfusion for various naturally occurring peptides with high safety In the field of medical care, a prophylactic / therapeutic agent that can increase the medical effect and reduce side effects such as GVHD, and a prophylactic / therapeutic agent that can prevent early death due to infectious diseases through reconstruction of the immune system, etc. I searched hard.
[0009]
As a result, by administering a nonapeptide known as serum thymic factor (FTS) and its derivatives or their salts, or a combination of each of these compounds and a metal to mice, rats, guinea pigs, etc., during bone marrow transplantation It was found that even if the number of bone marrow cells collected from donors required for transplantation was greatly reduced, the same transplantation results could be achieved. Furthermore, administration of FTS nonapeptide suppresses GVHD induced and generated in mice, rats, etc. transplanted with bone marrow, and mice, rats, etc., transfused / transfected with spleen cells, blood or its leukocyte components (lymphocytes, etc.). I found.
[0010]
Moreover, it discovered that the onset of leukemia of a mouse | mouth was suppressed by administration of FTS. The present invention has been made on the basis of such findings, and in medical treatment for transplantation or transfusion of individual components such as bone marrow and blood or hematopoietic stem cells or lymphocytes into a living body, the engraftment to those hosts is ensured. In order to prevent the early death due to infectious diseases through the restructuring of the immune system and the prevention / treatment agent for enhancing the targeted therapeutic effect, reducing or suppressing unwanted side reactions and side effects such as GVHD Prophylactic / therapeutic agents are provided.
[0011]
First of all, various diseases accompanied by immunodeficiency such as multiple sclerosis, Guillain-Barre syndrome, inflammatory neuritis, multiple neuritis and other immune demyelinating diseases that contain nonapeptide known as FTS as an active ingredient Although therapeutic agents and drugs for preventing aging, cell activation, and geriatric disease prevention / treatment are known (JP-A-58-52225, JP-A-1-316328), FTS nonapeptide is a hematopoietic system / blood component. The fact and knowledge that it can be used in combination with a living body to ensure engraftment in the host, increase the therapeutic effect of transplantation and blood transfusion, and reduce the side effects associated therewith is completely unexpected from the prior art. This is not possible and has been found for the first time by the present inventors.
[0012]
Thus, the present invention provides the following amino acid sequence:
a nonapeptide having pGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn or an ester or amide in the carboxyl group of the asparagine at its C-terminal, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or each of those compounds It is combined with the administration of hematopoietic system and blood components to the living body, characterized by containing a conjugate with metal as an active ingredient, ensuring their engraftment in the host, and the therapeutic effect of transplantation and blood transfusion It is intended to provide a prophylactic / therapeutic agent that aims to increase the risk and reduce the side effects associated therewith.
[0013]
The nonapeptide used in the present invention is a known substance, and a peptide synthesis method in a liquid phase or a solid phase commonly used in peptide synthesis, for example, JP-A-54-16425, USP 4,301,065 is described. By this method, it can be manufactured without difficulty. Alternatively, this nonapeptide can also be prepared by a genetic engineering method or a cell engineering method.
[0014]
The ester in the carboxyl group of asparagine at the C-terminal of the nonapeptide used in the present invention is a pharmaceutically acceptable ester of a carboxylic acid,
[0015]
Examples thereof include methyl ester, ethyl ester, propyl ester, isopropyl ester, n-butyl ester, isobutyl ester, tert-butyl ester, n-pentyl ester, isopentyl ester, neopentyl ester, tert-pentyl ester, n- Hexyl ester, sec-hexyl ester, heptyl ester, octyl ester, sec-octyl ester, tert-octyl ester, nonyl ester, decyl ester, undecyl ester, dodecyl ester, tridecyl ester, tetradecyl ester, hexadecyl ester, octadecyl ester Ester, nonadecyl ester, eicosyl ester,
[0016]
Cyclopentyl ester, cyclohexyl ester, cycloheptyl ester, cyclooctyl ester, allyl ester, isopropenyl ester, benzyl ester, o-, m-, or p-chlorobenzyl ester, o-, m-, or p-fluorbensyl ester O-, m-, or p-bromobenzyl ester, o-, m-, or p-iodobenzyl ester, o-, m-, or p-methylbenzyl ester, o-, m-, or p-ethyl Benzyl ester, o-, m-, or p-isopropylbenzyl ester, cinnamyl ester, aminoethyl ester,
[0017]
o-, m-, or p-aminobenzyl ester, o-, m-, or p-nitrobenzyl ester, o-, m-, or p-methoxybenzyl ester, o-, m-, or p-ethoxybenzyl Ester, o-, m-, or p-aminophenethyl ester, α-furfuryl ester, α-thienylmethyl ester, α-pyridylmethyl ester, α-pyridylethyl ester, piperidinomethyl ester, α-biperi Examples thereof include silyl methyl ester, morpholino ethyl ester, and α-morpholinyl methyl ester.
[0018]
The amide in the carboxyl group of the asparagine at the C-terminal of the nonapeptide used in the present invention is a pharmaceutically acceptable amide of carboxylic acid,
[0019]
Examples include amide, methylamide, ethylamide, propylamide, isopropylamide, n-butyramide, isobutylamide, tert-butylamide, n-pentylamide, isopentylamide, neopentylamide, tert-pentylamide, n-hexylamide. , Sec-hexylamide, heptylamide, octylamide, sec-octylamide, tert-octylamide, nonylamide, decylamide, undecylamide, dodecylamide, tridecylamide, tetradecylamide, hexadecylamide, octadecylamide, nonadecylamide, Eicosylamide,
[0020]
Cyclopentylamide, cyclohexylamide, cycloheptylamide, cyclooctylamide, allylamide, isopropenylamide, benzylamide, o-, m-, or p-chlorobenzylamide, o-, m-, or p-fluorobenzylamide, o-, m-, or p-bromobenzylamide, o-, m-, or p-iodobenzylamide, o-, m-, or p-methylbenzylamide, o-, m-, or p-ethylbenzyl Amide, o-, m-, or p-isopropylbenzylamide, cinnamylamide, aminoethylamide, o-, m-, or p-aminobenzylamide, o-, m-, or p-nitrobenzylamide, o -, M-, or p-methoxybenzylamide, o-, m-, or p-ethoxybenzylamide,
[0021]
o-, m-, or p-aminophenethylamide, α-furfurylamide, α-thienylmethylamide, α-pyridylmethylamide, α-pyridylethylamide, piperidinomethylamide, α-piperidylmethylamide Morpholinoethylamide, α-morpholinylmethylamide, methoxycarbonyl- (α-mercaptomethyl) methylamide, ethoxycarbonyl- (α-mercaptomethyl) methylamide and the like.
[0022]
Examples of the pharmaceutically acceptable salt include acid addition salts at the amino group and base salts at the carboxyl group of the nonapeptide. Examples of acid addition salts include salts with organic acids or inorganic acids, and examples thereof include formic acid, acetic acid, propionic acid, trifluoroacetic acid, tartaric acid, fumaric acid, malic acid, maleic acid, oxalic acid. A salt with a carboxylic acid such as an acid or naphthoic acid, a salt with a sulfonic acid such as methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid or naphthalenesulfonic acid, or a salt with an inorganic acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid or phosphoric acid. can give.
[0023]
Examples of the base salt include salts with inorganic bases, that is, alkali metal salts, alkaline earth metal salts, ammonium salts, or salts with organic bases, that is, salts with amines. Salt, sodium salt, potassium salt, calcium salt, ammonium salt, triethylamine salt, ethanolamine salt, tris salt, dicyclohexylamine salt and the like.
[0024]
Examples of the metal in the combination of each compound and metal include monovalent and divalent metals such as zinc, iron, magnesium, cobalt, nickel, chromium, gold, germanium, gallium, potassium, calcium, aluminum, copper, manganese, and selenium. Trivalent or tetravalent metals are exemplified.
[0025]
A prophylactic / therapeutic agent that is used in combination with the administration of the hematopoietic system / blood component according to the present invention to a living body to increase its therapeutic effect and reduce side effects is usually used according to its dosage form. Prepared using formulation means. That is, an active ingredient substance selected from the above nonapeptide, its ester or amide derivative or salt thereof, or a combination of each compound and metal is appropriately pharmaceutically acceptable carrier, excipient, diluent. Etc. to prepare a suitable dosage form. The dosage form can be various dosage forms suitable for administration routes such as external use, oral administration and parenteral administration.
[0026]
The effects of prophylactic / therapeutic agents intended to increase the therapeutic effect and reduce side effects are confirmed by the following tests when used together with the administration of the hematopoietic system and blood components according to the present invention to the living body. Yes.
[0027]
That is, using mammals such as mice, rats, hamsters, gerbils, guinea pigs, etc., these animals are irradiated with a lethal dose of radiation, or each dose, a lethal dose of an anticancer agent, etc. Impaired function, then pre-administered a predetermined amount of the above-mentioned nonapeptide to animals of the same species by various administration routes such as intraperitoneal injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intravenous injection, oral, etc. for a certain period every day or every other day, As a control, the same diet was administered to allogeneic animals in the same way, and then each collected bone marrow cell was transferred to the above-mentioned bone marrow-impaired animal, and the effects on the hematopoietic system such as the number of bone marrow and spleen colony formation and life-prolonging effects were compared. investigated.
[0028]
In addition, bone marrow can be transplanted together and spleen cells can be transferred, or bone marrow only, spleen cells only, and lymphocytes only can be transferred to induce GVHD. Administered by various administration routes such as intraperitoneal injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intravenous injection, oral administration, etc. for a predetermined period of time in advance or immediately after onset, every day or every other day, between the control group and the nonapeptide administration group The blood, urinalysis values, weight measurements of each organ, weight measurements of each lymph node, body weight measurements, survival rate, pathological findings of injury of each organ were compared and observed.
[0029]
In order to examine the toxicity of the active ingredient substance in the drug according to the present invention, 100 mg / kg of the active ingredient substance nonapeptide was subcutaneously administered to mice for 14 days every day, but no abnormality was observed in appearance. Further, the active ingredient substance 30 mg / kg was subcutaneously administered to rats for 21 days every day, but no abnormality was seen in appearance, serum biochemistry, or pathological dissection. Thus, the drug according to the present invention is a safe drug with very little toxicity and can be administered for a long period of time.
[0030]
Examples of target animals to which the drug according to the present invention can be administered include humans and domestic animals such as cattle, horses, pigs, sheep, goats, rabbits, dogs, cats, lions, elephants, giraffes, bears, gorillas, monkeys, Examples include mammals bred in zoos such as chimpanzees, mice, rats, hamsters, gerbils, guinea pigs, various laboratory animals, poultry such as chickens and turkeys, birds for pets, reptiles, amphibians, and fish .
[0031]
The dosage is usually 0.1 μg / 500 mg / day per kg of the body weight of these animals, and these may be divided into 1 to 6 times a day. The dosage can be increased or decreased as appropriate. Although the administration route is not particularly limited, it can be administered intravenously, intramuscularly, intradermally or subcutaneously. In addition, by preparing an ointment, it can be applied to the eye, oral cavity, nasal cavity, skin, etc., suppositories, jelly preparations, eye drops, nasal drops, nasal oral absorbents, aerosols, sprays, It can also be administered as a topical indwelling pellet or oral preparation. In order to prevent rapid degradation or inactivation of the active ingredient substance in vivo, the active ingredient substance is treated with an appropriate pharmaceutical ingredient, for example, an alcoholic, lecithin or other oily or fatty physiologically harmless solid or A preparation using liquid materials or suspension liposomes thereof or the like can also be prepared for a long-lasting activity.
[0032]
The drugs according to the present invention include other drugs such as biologic response modifiers such as immunosuppressants, immunomodulators and immunostimulants, various G-CSF, GM-CSF, erythropoietin, IL-3, IL-6, It can be administered together with hematopoietic factors such as IL-11 and LIF, muroctasin, chemotherapeutic agents and the like, and these can be added to the preparation and administered as a combination to enhance clinical effects.
[0033]
EXAMPLES Examples and experimental examples will be described below to describe the present invention in more detail, but the present invention is not limited to these examples. In the description in the examples, the nonapeptide is abbreviated as FTS for convenience.
[0034]
【Example】
Example 1 Vial formulation for injection
FTS ・ CH ₃ COOH 2H ₂ 1 mg of O (Mitsui Pharmaceutical Co., Ltd.) was dissolved in distilled water, sterilized and filtered, filled into a vial, and lyophilized.
[0035]
Example 2 Ampoule Formulation for Injection
FTS ・ CH ₃ COOH 2H ₂ 5 mg of O (Mitsui Pharmaceutical Co., Ltd.) was dissolved in physiological saline, sterilized and filtered, and filled into an ampoule.
[0036]
Example 3 Injection for subcutaneous injection
FTS ・ CH ₃ COOH 2H ₂ O (Mitsui Pharmaceutical Co., Ltd.) 2 mg per unit dose was suspended in 2% carboxymethylcellulose PBS (phosphate buffered saline) solution, Lipomal (manufactured by HutamakiOy / Leiras Pharmaceuticals) or intravenous water consisting of soybean phosphide It was mixed with Intralipid (manufactured by Cutter Laboratories), which is a medium oil type emulsion. When using Lipomal, FTS-dissolved PBS and Lipomal were mixed in equal amounts. When Intralipid was used, 2.5 ml of FTS-dissolved PBS solution, 0.1 ml of Tween 80 (manufactured by Sigma Chemicals) and 4.6 ml of Intralipid were mixed.
[0037]
Example 4 Liposome formulation
There are three types of liposome preparations with different charges, and these are further classified into four types in terms of structure.
Charges are neutral, positive, and negative, and are structurally multilamellar liposomes (MLV), small unilamellar liposomes (SUV), and small unilamellar vesicles (LUV). There are known four types: large unilamellar vesicles, and several film (REV, reverse-phase evolution vesicles) having a structure close to LUV.
[0038]
(1) Neutral charge liposome encapsulated in FTS
Phospholipids such as phosphatidylcholines, sphingomyelin, and a chloroform solution of cholesterol are mixed at a molar ratio of 2: 1, 4: 1, or 1: 1, and the solvent is once distilled off under reduced pressure. MLV was obtained by adding 1/100 to 1/1000 equivalent of FTS in PBS (phosphate buffered saline) and mixing well with a vortex mixer.
Furthermore, SUV was obtained by ultrasonic treatment at a phase transition temperature (Tc) or higher of the phospholipid.
[0039]
After adding calcium chloride aqueous solution to the obtained SUV and incubating at 37 ° C. for 1 hour to fuse, add EDTA and incubating at 37 ° C. for 30 minutes to obtain Ca. ⁺⁺ LUV was obtained except for.
REV is prepared as follows. That is, after the solvent was distilled off from the lipid chloroform solution under reduced pressure, an adequate amount of diethyl ether was added and sufficiently dissolved, and then the FTS in PBS was added and sonicated to obtain a uniform single-phase solution. After the obtained solution was concentrated under reduced pressure at room temperature, a PBS solution was added and mixed well with a Vortex mixer to obtain REV.
[0040]
(2) FTS encapsulated positively charged liposomes
The preparation method is the same as that of the neutrally charged liposome, except that the constituent components of the lipid are different.
Lipid components such as phosphatidylcholines, phospholipids such as sphingomyelin, cholesterol, and higher-charged aliphatic amines such as stearylamine are mixed at a molar ratio of 7: 2: 1 or 4: 1: 1. And FTS was encapsulated in the same manner.
[0041]
(3) FTS-encapsulated negatively charged liposomes
Phospholipids such as phosphatidylcholines, sphingomyelin, cholesterol and dicetyl phosphates, higher-charged aliphatic esters such as sulfatides, etc. are mixed at a molar ratio of 7: 2: 1 or 4: 1: 1. Thus, FTS was encapsulated in the same manner as a lipid component.
[0042]
Example 5 Ointment
FTS ・ CH ₃ COOH 2H ₂ 2 mg of O (Mitsui Pharmaceutical Co., Ltd.) was dissolved in purified water. Next, 25 g of white petrolatum, 20 g of stearyl alcohol, 604 g of HCO-604, and 1 g of glyceryl monostearate were mixed and mixed in advance to prepare an aqueous solution of 12 g of propylene glycol, 0.1 g of methyl paraoxybenzoate, and 0.1 g of propyl paraoxybenzoate ( FTS containing) was added and mixed well to obtain an emulsion, and then the mixing operation was continued until cooled and solidified.
[0043]
Example 6 Suppository
FTS ・ CH ₃ COOH 2H ₂ 10 mg of O (manufactured by Mitsui Pharmaceutical Co., Ltd.) was dispersed in a preheated hard fat to make the total amount 2 g.
[0044]
Example 7 Nasal Capsule
0.05 mg of FTS was dissolved in 29.95 mg of Miglyol 812 neutral oil (manufactured by Dynamite Nobel) under aseptic conditions. This solution was filled into a conventional unit dose dispenser, which was attached to the drive capsule before use.
[0045]
Example 8 Nasal Drop
The following amounts of sodium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, sodium chloride and EDTA-disodium salt were dissolved in distilled water at room temperature. FTS was dissolved in this solution and filtered through a membrane filter.
FTS ・ CH ₃ COOH 2H ₂ O 0.10mg
Sodium monohydrogen phosphate 2H ₂ O 0.30mg
Sodium dihydrogen phosphate 12H ₂ O 10.10mg
Benzalkonium chloride 0.10mg
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) 0.50mg
Sodium chloride 4.50mg
Distilled water 987.60mg
pH value 5.0 ± 0.3
[0046]
Example 9 Nasal Spray Formulation
FTS ・ CH ₃ COOH 2H ₂ 2 mg of O (manufactured by Mitsui Pharmaceutical Co., Ltd.) was suspended in hydroxypropylcellulose or hydroxypropylmethylcellulose, and used as a spray formulation with a spray formulation machine.
Examples of pharmacological experiments and toxicity experiments relating to the drug of the present invention are listed below.
[0047]
[Experimental example]
Experimental example 1
C57BL / 6 (B6) mice with different Ia antigens and B6. CB-2 ^bm12 (Bm12) A mouse was prepared. Non-adherent T cells were obtained from the spleen cells of B6 mice by the nylon wool column method. Its 1-2x10 ⁷ (Bm12 × B6) F ₁ Mice were transferred twice at weekly intervals to induce GVHR. The occurrence of GVHR can be known by an increase in spleen index (spleen weight (mg) ÷ mouse body weight (g)).
[0048]
These mice were divided into 2 groups, and the FTS substance saline solution was applied to the first group at 500 μg / kg body weight and 0.1 ml / 10 g body weight from 2 days before cell transfer to 14 consecutive days (until 2 days before sacrifice). . p. Administered. Similarly, Group 2 was given only a raw diet and each mouse was sacrificed 14 days after the initial cell transfer.
[0049]
Subsequently, a part of the liver was fixed with formalin, and hematoxylin-eosin (HE) staining was performed by a conventional method. This was subjected to pathological search under an optical microscope, and the degree of lesion was scored. In the second group of mice, splenomegaly occurs, cell infiltration and granulomas are observed in the interlobular bile duct and central venous portal vein, and chronic non-suppurative destructive cholangitis (CNSDC) Was recognized. When the score was examined at a magnification of 400 times, the cell infiltration with a degree of cell infiltration of 100 or less was taken as 1, the 100-400 was taken as 2, and the 400 or more was taken as 3. Regarding CNSDC and granuloma, since they are difficult to score, they are expressed as (+) or not (-). By administering the FTS substance, the degree of cell infiltration was clearly weakened, and there were many individuals with weak granulomas formation (4/6). Thus, it has been clarified that an FTS substance suppresses GVHR and suppresses an autoimmune disease-like pathology triggered by GVHR.
[0050]
Experimental example 2
6 week old C3H / HeN mice and BalbC mouse bone marrow cells 10 ⁷ Pieces and 5 × 10 ⁶ Individual spleen cells were intravenously administered to induce GVHD. Over time, each dose of 0.1-30 μg of FTS substance was administered to the treatment group, and saline was subcutaneously administered to the control group. In the control group, the body weight gradually decreased and became fluffy, and almost all cases died on the 10th day, whereas in the FTS substance-administered group, the body weight loss until the 10th day was suppressed, and gradually began to gain weight, 30 days later Prolonged life.
[0051]
Experimental example 3
(C57B1 / 6 × DBA / 2) F ₁ 1 × 10 to mouse ⁶ A spleen cell was administered intravenously to create an acute GVHD model. From day 6 to day 9, host γδ intestinal interepithelial lymphocytes increased, and on day 12, they decreased. Donor intestinal interepithelial lymphocytes appeared from day 9. Due to GVHD gastrointestinal lesions due to infiltration of the donor T lymphocytes between the intestinal epithelium, the host mice almost died on the 14th to 16th days. When each dose of 0.1 to 50 μg of FTS substance was administered to a host mouse that followed this course, intestinal epithelial damage was reduced or delayed, and death of the mouse was also delayed, resulting in a mortality rate. Declined.
[0052]
Experimental Example 4
4 weeks old (DA x Lewis) F ₁ DA rat lymphocytes 1 × 10 on rat footpad ⁵ GVHR was measured by subcutaneous injection and weight of popliteal lymph nodes was measured after 4, 5 and 7 days. When 0.1 to 50 μg of each dose of FTS substance was administered on various administration schedules, the weight of popliteal lymph nodes of each individual in the control group after 4 and 5 days was distributed in the range of 3 mg to 45 mg However, while the weight after 7 days was distributed between 8 mg and 85 mg, it was found that the weight of the FTS substance administration group was suppressed.
[0053]
Experimental Example 5
The colony forming unit assay / spleen (colony forming unit-splen assay) was used to examine the effect of FTS substances on the ability of bone marrow cells to form colonies compared to that of G-CSF (granulocyte- colony stimulating factor). Nine-week-old female C3H / HeN mice were divided into 3 groups, 4 mice per group. The mice in group 1 (FTS + CY group) were given 50 μg of FTS substance subcutaneously once daily from day 0 to day 8 of the experiment, and on day 3 cyclophosphamide (CYclophosphamide, CY) was 200 mg / kg. It was administered subcutaneously.
[0054]
From the 0th day to the 8th day, 2 μg of G-CSF was subcutaneously administered to the mice in the second group (G-CSF + CY group) once a day, and CY was subcutaneously administered at a dose of 200 mg / kg on the third day. The mice in the third group (CY group) were subcutaneously administered with 200 mg / kg of CY on the third day as in the first and second groups. On day 8, bone marrow cells from 4 mice in each group were collected and pooled by group. On the other hand, a recipient mouse receiving bone marrow cell transplantation was prepared. Fifteen 7-week-old female C3H / HeN mice were subjected to whole body irradiation with X-rays of 9.5 Gy and divided into three groups.
[0055]
After 24 hours, 3 groups of bone marrow cells collected as described above were treated with 1 × 10 5 corresponding to each of 3 groups of 5 recipient mice. ⁵ It was imported one by one. Seven days after bone marrow transplantation, each mouse was sacrificed and the spleen was collected. After fixing the spleen, the number of CFU-s of each mouse was measured. As a result, the FTS + CY group was 85 ± 19, the G-CSF + CY group was 102 ± 34, the CY group was 17 ± 12, and the CY group and the other two groups There was a significant difference at p <0.005, but no statistically significant difference was found between the FTS + CY group and the G-CSF + CY group. This experimental result shows that the effect of the FTS substance on the bone marrow cell colony forming ability is comparable to that of G-CSF.
[0056]
Experimental Example 6
Nine-week-old male C3H / HeN mice were divided into two groups, and the first group was subcutaneously injected with 10 μg of FTS substance once a day for a total of 7 days. The second group was similarly administered with physiological saline. Bone marrow cells were collected from each group of mice and pooled. Separately prepared syngeneic mice were irradiated with 800R radiation, and after 24 hours, 10 bone marrow cells collected from the FTS substance administration group or saline administration group were collected as described above per mouse group. 1.25 × 10 ³ 2.5 × 10 ³ 5 × 10 ³ 1 × 10 ⁴ And 1 × 10 ⁵ Individuals were transferred from the tail vein.
[0057]
When the survival rate of the mice after 10 days was examined, 1.25 × 10 ³ 2.5 × 10 ³ 5 × 10 ³ 1 × 10 ⁴ 1 × 10 ⁵ In the bone marrow cell transfer group, the bone marrow cell transfer group was 0%, 10%, 20%, 30%, and 100%, respectively, whereas the bone marrow cell transfer group was the bone marrow cell transfer group. Then, they were 40%, 60%, 70%, 100% and 100%, respectively. The number of cells in the bone marrow cell transfer group that gives 50% survival is 1.95 × 10 ⁴ In contrast, the number of cells in the bone marrow cell transfer group of the FTS substance administration group is 1.75 × 10 ³ The bone marrow cells of mice pre-administered with FTS substance were found to have a bone marrow engraftment / survival maintenance activity 11 times that of mice pre-administered with raw diet. It is recognized that the harvesting volume for transplantation is less than 1/11.
[0058]
Therefore, in hematopoietic stem cell transplantation therapy such as bone marrow transplantation and peripheral blood stem cell transplantation, it is effective to enhance the number and function of hematopoietic stem cells by administering an FTS substance to a donor who provides hematopoietic stem cells in advance. Is expected. It is also possible to reduce the amount of collected hematopoietic stem cells from a donor.
[0059]
Experimental Example 7 Toxicity test
FTS substance 50 mg / kg and 100 mg / kg were administered subcutaneously for 14 days each day to 5 groups of ddy 5-week-old male mice, but no toxicity was observed.
[0060]
Experimental Example 8 Toxicity test
Although 10 mg of 5-week-old Wistar rats were subcutaneously administered with FTS substance 30 mg / kg for 21 days every day, no toxicity was observed.
As described above, medical treatments such as bone marrow transplantation, hematopoietic stem cell transplantation, and ring blood are frequently performed today, and they are used together when administering hematopoietic systems and blood components to living bodies, and engrafting them in the host. There is a long-awaited provision of prophylactic / therapeutic agents aimed at ensuring the effectiveness of transplantation and blood transfusion, reducing the side effects associated therewith, and reducing the number of deaths. It is said.
[0061]
However, the drug according to the present invention is epoch-making in that it provides an excellent preventive / therapeutic effect for activating the biological defense system directly or indirectly through various actions and achieving the above-mentioned purpose. is there. Further, since the nonapeptide (FTS) used in the present invention is a peptide derived from an animal and a natural substance, it is completely harmless in the living body, unlike an FTS analog (analog) having a similar amino acid sequence, There are no problems such as anaphylactic shock. Therefore, the medicine according to the present invention can be used as a safe and useful medicine for humans and animals.

Claims

Hematopoietic system / blood characterized by containing a nonapeptide having the following amino acid sequence: pGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient A prophylactic / therapeutic agent that is used in combination with the administration of components to the body to ensure their engraftment in the host, increase the therapeutic effect of transplantation / transfusion, and reduce the side effects associated therewith.