JP3687859B2

JP3687859B2 - Microbial transport medium

Info

Publication number: JP3687859B2
Application number: JP26652994A
Authority: JP
Inventors: ▲いん▼▲てつ▼ 小林; 弘規河原
Original assignee: ▲いん▼▲てつ▼ 小林; 弘規河原
Priority date: 1994-10-31
Filing date: 1994-10-31
Publication date: 2005-08-24
Anticipated expiration: 2020-08-24
Also published as: JPH08126495A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、微生物を含有するサンプルを輸送するための微生物輸送用培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】
［微生物輸送用培地］
病原細菌をはじめとする微生物の分析を行うためには、固有の設備が必要である。ところが現状では、このような設備を備えていないために、サンプル採取と同時に分析を行えないことも多い。このため、微生物を含むであろうサンプルは、固有の設備を備えた検査施設に輸送する必要がある。微生物輸送用培地（以下、単に「輸送培地」という）は、この微生物の輸送を行うための培地である。サンプルとして採取されるものの中には、咽頭粘液、髄液、喀痰、胆汁、関節液、胃液、帯下、尿、糞便、気管支洗浄液、耳漏、あるいは患者組織等の生体材料が含まれるが、これらは採取後ただちに輸送培地に移され、その状態で固有施設に輸送される。
【０００３】
サンプル中の特定の微生物群が輸送中に増殖すると他の微生物群の分離を妨げる可能性があるため、輸送培地には一般に、サンプル中に存在する微生物の状態（フローラ）をそのまま維持することが要求される。現在一般に利用されている輸送培地には、ハンクス液やキャリー・ブレア培地等がある。キャリー・ブレア培地は、チオグリコール酸ナトリウム、リン酸１水素ナトリウム、および塩化ナトリウム等を含む培地で、栄養源は持たず緩衝液に近い組成となっている。キャリー・ブレア培地は、各種微生物サンプルの輸送に汎用されている。
【０００４】
ここで、輸送培地本来の目的からすれば、採取時の状態をそのまま維持するのが好ましいようにも見える。どのような微生物を分析するのかが予測できないのであれば、特定の微生物の増殖も減少も生じないようにしておくことが大切である。これは、分析対象となる微生物が輸送中に減少すれば検出率低下を招くのはもちろん、混在する他の微生物群が増殖してフローラが崩れても検出率の低下につながるためである。なお、ここでいう「検出率」とは、採取時のサンプル中に存在している「分析対象となる微生物」を検出することができる可能性を意味する。しかし、分析対象となる微生物が予めはっきりしている場合には、当該分析対象となる微生物の生存のみを心掛けた方が良い結果を期待できる。
【０００５】
例えば、以下に示すHelicobacter pylori （ヘリコバクター・ピロリ；以下、単に「ＨＰ」とする）は、分析対象となる微生物の中でも輸送の困難な細菌として知られている。実際に、従来の輸送培地を使用した場合には、輸送中に死滅あるいは著しい減少などが起こる場合があった。ところが、ＨＰについても、その生存のみを目的とする専用の輸送培地を用意すれば、確実な輸送を期待できる可能性がある。
【０００６】
［Helicobacter pylori （ヘリコバクター・ピロリ）］
輸送困難な細菌であるとされている上述のＨＰ（Helicobacter pylori ；ヘリコバクター・ピロリ）は、次のような特徴を持つ細菌である。
【０００７】
・胃粘膜組織から分離された微好気性細菌(Lancet i:1273-1275;1983)
・分類学上は、グラム陰性らせん状桿菌
・Campylobacter 属に分類されていた時期もあったが、現在はHelicobacterとされている(Int.J.Syst.Bacteriol.39:397-405,1989)
・胃潰瘍や胃炎等の胃疾患との関連が強く示唆されている (Microbiol.Immunol.31:603-614,1987)
ＨＰの検出は、胃をはじめとするこれらの上部消化器系疾患の診断や治療経過の観察にあたって重要な情報を与えるものと考えられている。そしてこれら上部消化器系疾患との関連について更に多くの情報を蓄積することを目的として、多くのサンプルが検査施設へ輸送されている。微好気性細菌であるＨＰは、微好気的培養のための設備を要求する上、比較的長時間にわたって培養しなければならないためにベッドサイドでの分析が困難で、検査施設へ輸送して分析するのが一般的である。ところが、ＨＰは輸送が困難な細菌であるため、サンプルを検査施設へ確実に輸送するための技術は検出率に大きな影響を与える。
【０００８】
［ＨＰの輸送］
従来の一般的な輸送培地であるキャリー・ブレア培地では、通常の細菌の場合には数日間にわたって細菌フローラを維持するものの、ＨＰに用いた場合は十分な検出率を得ることはできなかった。実際、輸送時間に反比例して、検出率の低下が観察される。
【０００９】
他方、ハンクス液を用いたＨＰ含有サンプルの輸送も行われている。ハンクス液は緩衝剤を中心とする組成を有し、４〜５時間にわたる生存を可能にする。しかし、これによれば、単にブイヨン中に保存した場合（この場合には２時間程度の輸送しかできない）と比較すれば輸送時間が延長されたことにはなるものの、この４〜５時間という時間は依然として十分な輸送時間とはいい難い。この他にも、生理食塩水やグルコース水溶液(J.Clin.Pathol.38,1127-1131;1985) を用いた例もあるが、ＨＰの輸送培地としては十分な性能を示さない。
【００１０】
キャリー・ブレア培地やハンクス液のような栄養素を含まない輸送用培地に対して、窒素源や炭素源を含んだ培地によるＨＰの輸送も試みられている。ＨＰの分析を目的としてチオグリコレート培地（液体または半流動）に胃粘膜組織を保存し、輸送を試みた報告(Annals of Tropical Medicine and Parasitology Vol.87.No.5,483-486;1993) がそれである。チオグリコレート培地は栄養素に富む培地で、嫌気性細菌から好気性細菌を含むいずれの増殖にも適する培地とされているが、本発明者らの追試によれば、ＨＰに用いた場合には必ずしも十分な検出率を得られず、保存時間に比例した検出率の低下が観察されている。
【００１１】
ＨＰの輸送が困難なのは、胃粘膜には腸内細菌をはじめとする多くの微生物が存在しており、単なる栄養培地では特定の微生物の増殖を招くため、結果としてフローラが破壊され、ＨＰの検出率低下につながるからであると推測される。また、チオグリコレート培地では、ＨＰの生存に必要な生存維持成分が不足している可能性もある。
【００１２】
ＨＰを選択的に増殖することを目的として、シクロデキストリンやメチルセルロース等と共に各種の抗菌剤を組み合わせた培地の利用(J.Clin.Microbiol.31:160-162,1993 、あるいは特開平5-260955号) も知られている。この培地の抗菌剤には、バンコマイシン、トリメトプリム、ポリミキシンＢが使われている。しかしながら、この培地はあくまでＨＰの選択的な増殖が目的であって、輸送を目的とするものではない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
以上の説明から明らかなように、従来の輸送培地では、輸送が困難な微生物に対しては十分に機能しなかったという問題があった。例えば、分析対象となる微生物の中でも輸送の困難な細菌として知られている上述のＨＰ（Helicobacter pylori ）などに従来の輸送培地を使用した場合には、輸送中に死滅あるいは著しい減少などが生じてしまっていた。
【００１４】
本発明は以上のような課題に鑑みなされたものであり、その目的は、従来の輸送培地では輸送が困難であった微生物に対しても確実な輸送を行うことができる新規な輸送用培地を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段及び作用】
以上のような課題を解決すべく本発明者らが鋭意研究を行った結果、ある微生物に対しての選択培地を構成する抗菌剤を使用して輸送培地を作製することが適切であることを突き止め、本発明を完成するに至った。
【００１６】
［輸送用培地］
まず、本発明は、従来輸送が困難であった微生物にも確実な輸送が行える輸送用培地を提供する。
【００１７】
即ち、本発明は、輸送しようとする微生物が耐性を有する抗菌剤と、支持剤としてヘミンおよびメナジオンとを含む微生物輸送用培地であり（請求項１）、請求項１記載の微生物輸送用培地において半流動性であることを特徴とする微生物輸送用培地である（請求項２）。
【００１８】
請求項４に係る輸送用培地は、抗菌剤としてバンコマイシン(vancomycin)、トリメトプリム(trimethoprim)、ポリミキシンＢ(polymixin B) 、ナリジクス酸(nalidixic acid)の少なくとも１種類を添加するが、ＨＰの検出率の向上のためには全ての抗菌剤の併用が好ましい。各抗菌剤の使用量は後に実施例として例示するが、これらの抗菌剤は、培地を滅菌後、無菌的に添加する。
【００１９】
本発明に係る抗菌剤を加えた培地は、液体、半流動、固形のいずれの形態であってもよく、輸送・分析の目的となる微生物の生存や分離操作に適した任意の形態を採用することができる。例えば液体であれば、輸送中に固形サンプルから微生物を洗い出しておけるので、分離用培地への接種が容易となる。反面、液体中でサンプルが自由に移動するので、空気との接触状態を一定に保つことが困難で、微好気的（或いは嫌気的）輸送が求められるときには不向きである。固形培地では、サンプルを固定することができるが、たとえ培地中にサンプルを埋めこんだとしても亀裂を生じるので、空気の進入を許し、微好気的（或いは嫌気的）輸送を行うのは困難である。
【００２０】
これに対して半流動培地では、培地中にサンプルを埋めこんだ後に自然に包み込まれることとなるため、培地中にサンプルを固定することができると同時に、空気との接触状態も容易に制御することができる。しかも、培地表面からの距離によって好気的環境、微好気的環境、そして嫌気的環境を自由に選択することができる。従って、例えば微好気性菌であるＨＰを輸送するのなら、微好気的環境を与える位置（微好気性環境部位）にサンプルを埋めこめばよい。
【００２１】
なお、各環境の酸素濃度と半流動培地（ゲル化剤として０．３〜０．５%w/vの寒天を使用）における位置は、それぞれ一般に、好気的環境は酸素濃度20% （培地表面付近、大気と同じ）、微好気的環境は酸素濃度3-10% （培地表面から2cm 付近）、そして嫌気的環境は酸素不在（培地表面から2cm 以上）とされている。もちろん、培地中において各環境を与える位置は培地組成にも左右される。即ち、ゲル化剤の物理的性状や化学的な組成等により好気的な環境になり易い培地では、より深い位置でなければ微好気的環境を得ることができない。ＨＰについて培養環境を更に詳細に例示すれば、ＣＯ₂；7-12% 、Ｎ₂またはＨ₂；0-85% 、Ｏ₂；5-6%というような環境が知られており（Manual of Clinical Microbiology 5th edition p407,1991;American Society for Microbiology ）、既に例示したような組成の半流動培地では、培地表面から1cm 付近が輸送に好適な環境（即ち、ＨＰ輸送に好適な微好気性環境部位）となる。
【００２２】
｛半流動培地｝
半流動培地とは、固形培地に比べて寒天などの固形成分の含有量が低く、ある程度の流動性を保持している培地の名称である。半流動培地とするには、寒天やゼラチン等のゲル化剤を利用するのが一般的で、これらは輸送温度において必要なゲル強度を維持する条件で用いられる。なお、寒天の場合、固形培地では１〜２%w/vで用いるが、半流動培地では０．３〜０．５%w/vが一般的である。この濃度で寒天を加えれば、室温のもとで容器の転倒などでは培地の形状が崩れず、かつ必要な流動性を維持した状態とすることが可能である。
【００２３】
本発明に係る輸送用培地は、検出対象である微生物の確実な輸送を目的とするものであるため、最終的に微生物の分離を行うための分離用培地にサンプルを接種するまで目的の微生物の死滅を防ぎ、生存を長期にわたって維持する性能が期待される。従って、必ずしも微生物の生育は要求されず、またコロニーの形成も必要条件ではない。コロニーの形成を必要としないので、培地の性状も、固形培地の他に、微好気性菌や嫌気性菌の生存に有利な半流動培地を採用することができる。
【００２４】
｛支持剤｝
より高い検出率の実現を目的として、前記抗菌剤に加えて、目的の菌の成育をサポートする支持剤を添加する。ＨＰの場合には、前記抗菌剤に加え、支持剤としてヘミンおよびメナジオンを添加する。
【００２５】
ここで、ヘミン(hemin) はヘモグロビンを構成する鉄キレートであり、一方、メナジオン(menadione) はビタミンＫ３の別名である。これらはいずれも、従来から培地の栄養補助に用いられている（しかしながら、いずれも微生物の生育支持を目的とするもので、輸送を目的とするものではない）。これらを添加するときにも、やはり滅菌後に濾過滅菌等の操作により無菌的に添加する。この場合に、抗菌剤、ヘミン、そしてメナジオンを必要な最終濃度を得られるように濃縮液としておき、同時に濾過滅菌によって添加すると、培地の調製が容易になる。
【００２６】
本発明の輸送用培地は、特にＨＰを含むサンプルの輸送に有用である。ＨＰを含むサンプルの代表的なものは、胃の生検試料（胃粘膜を切り取ったサンプル）である。胃粘膜を本発明に係る培地に入れれば、特に温度管理などに注意しなくても、室温で４８時間以上にわたって高い検出率を維持できる。このとき、生検試料を、半流動培地の微好気的環境を与える表面から1cm 付近（微好気的環境部位）に埋め込めば、容易に微好気的環境で輸送することができる。なお、輸送中の温度を低温（例えば、４℃以下）に維持すれば、更に長時間にわたって高い検出率を示す。
【００２７】
｛他の添加物｝
抗菌剤、そしてヘミンおよびメナジオン以外には、目的とする微生物に合わせて必要な成分を添加することができる。たとえばＨＰに対して有効な成分としては、ヒツジ、ヤギ、ウシ、あるいはウマのような動物の血液、または血清等を挙げることができる。血液や血清を加えるときには、５〜２０%v/vの範囲で加えるとよい。
【００２８】
｛基礎になる培地成分｝
これらの補助成分を加える基礎になる培地成分としては、一般の増菌を目的とした培地の組成を利用するとよい。具体的には、例えばＨＰの輸送を目的とするときには、基礎成分としてチオグリコレート培地、ブレイン・ハートインフュージョン・ブイヨン培地、ハート・ブイヨン培地、トリプトソイ・ブイヨン培地、ブドウ糖・ブイヨン培地、チオグリコール酸培地ＩＩ、ＡＢＣＭブイヨン、およびブルセラ・ブイヨン培地等の増菌を目的とした培地が挙げられる。これらの基礎培地成分には、動物血液、動物血清等を加えることもできる。動物の血液成分は特にＨＰの輸送にあたって良い成績につながる。動物としては、ウシ、ウマ、ヒツジ、あるいはヤギ等が有用である。ブイヨン培地は、０．２〜０．５％の寒天を加えることで半流動培地とすることができる。これらの培地のうち、特に好ましいものについて具体的な組成を以下に示す。
【００２９】
【表１】
『チオグリコレート培地（ＢＢＬ社製）』
［組成（１Ｌ中）］
トリプチケースペプトン１７．００g
フェイトンペプトン３．００g
ブドウ糖６．００g
塩化ナトリウム２．５０g
チオグリコール酸ナトリウム０．５０g
寒天０．７０g
Ｌ−シスチン０．２５g
亜硫酸ナトリウム０．１０g
（ｐＨ７．０）
【表２】
『チオグリコレート培地“栄研”（栄研化学製、商品名）』
［組成（１Ｌ中）］
酵母エキス５g
トリプトン１５g
ブドウ糖５g
Ｌ−シスチン０．５g
チオグリコール酸ナトリウム０．５g
塩化ナトリウム２．５０g
レサズリン０．００１g
寒天０．８g
（ｐＨ７．１±）
【表３】
『チオグリコール酸培地ＩＩ“栄研”（栄研化学製、商品名）』
［組成（１Ｌ中）］
酵母エキス５g
トリプトン１５g
ブドウ糖５g
Ｌ−シスチン０．５g
チオグリコール酸ナトリウム０．５g
塩化ナトリウム２．５０g
（ｐＨ７．１±）
【表４】
『ブレインハートインフュージョン培地“栄研”（栄研化学製、商品名）』
［組成（１Ｌ中）］
コウシ脳浸出液２００ｇ
ウシ心臓浸出液２５０ｇ
ペプトン１０ｇ
ブドウ糖２ｇ
塩化ナトリウム５ｇ
リン酸一水素ナトリウム２．５ｇ
（ｐＨ７．４±）
［微生物の輸送］
本発明は、前記輸送用培地を用いた微生物の輸送方法をも提供する（請求項５〜７）。本発明に係る微生物輸送用培地は、輸送しようとする微生物が耐性を有する抗菌剤を含むため、輸送しようとする微生物以外の微生物の増殖が抑制され、目的となる微生物だけが培地中で安定して生存、あるいは増殖する。抗菌剤としてバンコマイシン、トリメトプリム、ポリミキシンＢ、ナリジクス酸のいずれか一つ、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む場合には、ＨＰ以外の微生物の増殖が抑制され、ＨＰだけが培地中で増殖する。
【００３０】
このように本発明では、培地に含まれている所定の抗菌剤により、検出対象となる微生物以外の微生物の増殖による検出率の低下が防止される。目的微生物以外の微生物の極端な増殖は、目的微生物の検出率の低下につながるので、輸送用培地におけるこのような抗菌剤の作用が重要である。輸送培地はフローラの維持を目的とするものが多く、抗菌剤を含有させた例は無い。
【００３１】
支持剤は、検出対象となる微生物の生存率を向上させる作用を持つ。所定の抗菌剤によって目的以外の微生物が増殖しないようにしてもなお生存率の低下が観察される株であっても、支持剤の添加によって高い生存率を維持できる。検出対象となる微生物がＨＰであった場合には、ＨＰの生存率を向上させる作用を有するヘミンとメナジオンが支持剤として使用される。前記の抗菌剤（バンコマイシン、トリメトプリム、ポリミキシンＢ、ナリジクス酸）によってＨＰ以外の微生物の増殖を抑えてもなお生存率の低下が観察される株であっても、ヘミンやメナジオンを添加することにより高い生存率を維持できる。一般にヘミンやメナジオンは嫌気性細菌の生育を支持するといわれているが、輸送中のＨＰの生存率の向上に寄与することは新しい知見である。
【００３２】
本発明の輸送培地、あるいは輸送方法は、抗菌剤を含まない分離用培地との組み合わせによって、従来に無い高い検出率を実現する。このように従来の輸送〜分離作業とは全く逆の順序で抗菌剤を利用したことにより、本発明では非常に高い検出率を実現している。
【００３３】
［微生物の分離方法］
本発明は、前記輸送用培地を用いたＨＰ等の微生物分離方法をも提供する（請求項１２〜１４）。
【００３４】
｛選択と分離｝
従来は、抗菌剤の存在しない環境で輸送した後に、選択剤を加えた培地に接種して分離培養を行って検出するという操作が一般的であった。
【００３５】
ところが、本発明ではあえてこの操作を逆転し、抗菌剤存在下で輸送を行い、これを抗菌剤を含まない培地に接種することで高い検出率を実現している。このため、本発明に係る輸送用培地によってサンプルを輸送した場合には、選択剤を含まない培地に接種することができ（即ち、本発明に係る輸送用培地を使用した場合には、選択培地の使用が不要となる）、同時に、これにより高い検出率でＨＰを検出することができる。本発明の微生物分離方法における選択剤を含まない培地としては、検出対象となる微生物に対して十分な発育支持能を備えた培地を用意する。ＨＰを検出対象とするのであれば、チョコレート寒天培地、血液寒天培地、およびスキロー培地等を例示することができる。分離培養を行うには、ブイヨンよりも寒天培地上でコロニーを形成させる方が有利である。
【００３６】
また、微生物の分析にあたっては、１つの細胞に由来する一群の微生物細胞（単離株）を得なければならない。このような目的で用いるのが分離用培地である。また、分離用培地には、分離しようとする微生物の十分な生育を支持することが第一に求められ、単に死滅しない培地であるというだけでは十分ではない。また、一般にはコロニーを形成させる必要のあることから固形培地が用いられる。そして更に、効率を高めるために、通常は選択培地と分離用培地が兼用されていた。ところが、輸送培地として本発明によるものを用いると、選択培地の使用が排除できることから、本発明における分離用培地とは、純粋に、最終的に微生物を単離することを目的として用いられる培地ということになる。
【００３７】
｛サンプルの輸送｝
輸送されたサンプルが、たとえば胃生検材料のような固形試料であればホモジナイズした後に寒天培地に接種する。なお、ＨＰのような微好気性細菌を分離を目的とするときには、ホモジナイズも窒素雰囲気下で行う等の配慮が必要である。更に、分離用培地による培養も微好気的状態で行わなければならない。
【００３８】
本発明は、前記抗菌剤を添加した輸送用培地で微生物含有サンプルを輸送するときに、ヘミンおよびメナジオンを添加することにより輸送中の微生物の生存率を向上させる方法を提供する。この生存率向上方法はＨＰを輸送するときには、特に大きな効果を示す。例えば、従来のキャンピロバクター選択培地によく用いられていた各種抗菌剤入りの培地をそのままＨＰの輸送に使うと、株によっては短時間で生存率が低下することがあるが、このような株についてもヘミンおよびメナジオンを加えておけば生存率が向上し、高い検出率につなげることが可能である。
【００３９】
【実施例】
以下、本発明の好適な実施例について説明する。
【００４０】
［材料と方法］
｛ＨＰ培地｝
H.pylori輸送用培地（ＨＰ培地：本発明に係る輸送用培地）はチオグリコレート培地をベースに馬血清、ヘミン、メナジオン及び選択剤を加えた半流動の高層培地である。
【００４１】
以下に、ＨＰ培地の組成を示す。
【００４２】
【表５】

｛測定｝
輸送培地として、ＨＰ培地の他に、ボルタジャームピロリ（bioMerieux社；商品名）、ＴＣＳポーター（クリニカルサプライ；商品名）、キャリーブレア培地（日水製薬）を用いてそれぞれの比較を行った。
【００４３】
胃潰瘍患者の胃粘膜から初代分離したH.pyloriを３mm平方の濾紙に１０⁶ＣＦＵしみ込ませ、上記４種の各輸送培地にそれぞれ接種した。ＨＰ培地は培地上部より１ｃｍの位置（即ち、微好気的環境部位）に接種した。各培地とも室温（約２０℃）及び４℃で９６時間保存し、経時的に採取し、培養した。また実際の患者より内視鏡で隣接した部位から２検体を採取し、一方は速やかに培養を行い、もう一方はＨＰ培地に接種後、４℃で輸送し、培養を行った。輸送に要した時間は約３６〜４８時間である。分離培地はコロンビア羊血液寒天培地（ＢＢＬ）及び変法スキロー培地（自家製）を用い、微好気条件下で３５℃、４〜７日間培養を行った。
【００４４】
［結果］
図１及び図２には、各培地を用いて４℃及び室温条件（２０℃）における試験菌の保持能力を比較した結果が示されている。保持能力は、経時的に採取された濾紙の生菌数の変化として検討している。
【００４５】
図１より、キャリー・ブレア培地と比較すると、低温条件では各培地の保持能力は優れているということが分かる。しかしながら、図１及び図２から明らかなように、両条件において、いずれもＨＰ培地のH.pyloriの保持能力が最も高かった。例えば、ＨＰ培地は、４℃では３６時間まで、２０℃では１２時間まで生菌数の減少は全くみられなかった。また、両条件共に、ＨＰ培地、ボルタジャームピロリ、ＴＣＳポーターの順となり、キャリーブレア培地がH.pyloriの輸送培地としては不十分なことが示された。特に、ＨＰ培地は４℃では７２時間もの間、生菌数が安定しており、低温輸送を行えば、確実なH.pyloriの輸送を行えるということが分かる。
【００４６】
表６には、実際に潰瘍部より採取した臨床材料をＨＰ培地で輸送後及び臨床材料の採取直後に培養した際のH.pyloriの培養成績を比較した結果が示されている。
【００４７】
【表６】

１８検体の内、採取直後及び輸送後にいずれも１１検体からH.pyloriを検出した。採取直後（−）輸送後（＋）その逆も各一例ずつ認められたが、その他は全て培養結果が一致した。輸送培地ではしばしば基礎実験で得られた保持能力が、実際の患者試料の輸送条件では反映されないことがある。その理由としては、調製した菌液にはない生体の防御因子が関与することが考えられる。
【００４８】
しかしながら、今回得られたＨＰ培地を用いた輸送後の成績は、ベッドサイドで実施した成績とほとんど一致している。特に、室温より４℃における保持能力が優れている点は既報の他菌種の報告と同様である。通常栄養要求性の厳しい微好気性菌のHaemophilus influenzae、Neisseria gonorrhoeae 等は輸送培地中で速やかに減少するといわれている（草野朱美、手塚孝一、森節子、松島康道、大窪度、小林いんてつ、池田文昭、西田実、五島瑳智子：各種の病原細菌の輸送条件に関する検討−市販の輸送培地中の生菌数の消長について−．臨床と微生物，１２：４５９−４６３，１９８５Ａｐｐｅｌｂａｕｍ，Ｐ．Ｃ．，Ｓｐａｎｇｌｅｒ，Ｓ．Ｋ．，Ｃｒｉｓｔ，Ｒ．，＆Ｃｒｉｓｔ，Ａ．Ｅ．Ｊｒ．：ＳｕｒｖｉｒａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉａｉｎＤｉｆｃｏＣｕｌｔｕｒｅＳｗａｂａｎｄＭａｒｉｏｎＣｕｌｔｕｒｅｔｔｅ II ＴｒａｎｓｐｏｒｔＳｙｓｔｅｍｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２６：１３６−１３８，１９８８．）。しかし、ＨＰ培地は４℃で７２時間まで安定に維持するため、H.pyloriの輸送には非常に適した培地であると考えられる。
【００４９】
次に、表６と同じ実験を行って結果を定量的に求めた。即ち、実際に東京都内の病院で潰瘍部から採取した臨床材料（表６とは別の材料）を２分し、一方は直ちにホモジネイト処理してコロンビア羊血液寒天培地に接種し定量した。他方はＨＰ培地中で４℃で２４時間、または４８時間保存後に、同じ処理によりＨＰを定量した。定量は、組織1.0mg あたりのH.pylori生菌数を測定することにより行った。
【００５０】
表６に示した定性的な結果と同じように、ＨＰ培地の輸送性能は定量的に見ても優れていることが表７から明らかである。すなわち表７では、ベッドサイドで速やかに検査した結果とＨＰ培地中で２４時間（または４８時間）輸送後の結果を比較しても菌量の減少がほとんど無く、安定に維持されていることがわかる。従って、本発明によりＨＰ培地は、定量的に菌量を追跡するという厳密な条件の下で評価した場合であっても、優れた輸送能力を示すということができる。
【００５１】
【表７】

［ヘミン・メナジオンの添加］
次に、ＨＰ培地の組成の検討を行い、ヘミン・メナジオンの添加によるH.pyloriの発育・支持力の変化を調べた。具体的には、ヘミン・メナジオンを含む培地と含まない培地とを作製し、菌の成育状況を検討した。以下の表に、検討に使用した培地の組成を示す。
【００５２】
【表８】

上記の２種類の検討培地に使用した菌株は、次の通りである。
【００５３】
標準株として、H.pylori ATCC 43504 、H.pylori ATCC 43579 、及びH.pylori ATCC 43629 の３株。臨床分離株であるH.pylori CI No.1、H.pylori CI No.2、及びH.pylori CI No.3の３株。なお、この他にも、S.aureus ATCC 25923 、E.coli. ATCC 25922 、及びP.aeruginosa ATCC 27853 を検討培地に接種した。
【００５４】
菌接種は、次のように行った。▲１▼コロンビア羊血液寒天培地に純培養した菌苔を、滅菌生食にかきとり、約１０⁶ＣＦＵ／ｍｌに調製した。▲２▼０．５ｍｌを培地１及び２に接種し、３５℃でH.pyloriは微好気的に、その他の菌種は好気的に培養した。▲３▼H.pyloriの発育の程度を肉眼的観察を行い、−，+ ，++，+++ の４段階で判定した。
【００５５】
組成検討の結果を下表に示す。
【００５６】
【表９】

以上のように、ヘミン・メナジオン含有培地での発育は、不含培地に比較して同等か、やや優れていることが分かる。
【００５７】
［他の微生物と培地の組合せ］
本発明に係る輸送用培地は、ＨＰ輸送用に限られるものではない。例えば、上記したＨＰ培地により、キャンピロバクター属細菌（Campylobacter ）を輸送することもできる。また、微生物とその微生物が耐性を有する抗菌剤の組合せとしては、他にも、例えばヘモフィルス・インフルエンザ（Hemophilus influenzae ）とバシトラシン（bacitracin）の組合せなどが考えられる。なお、この組合せの場合には、次のような基礎培地にバシトラシン（16500U/L）を加え、咽頭粘液サンプルをこの中に保存・輸送する。
【００５８】
【表１０】
トリプトン１０ｇ
ソイペプトン５ｇ
アザミノ酸５ｇ
ブドウ糖１０ｇ
塩化ナトリウム５ｇ
以上説明したように、従来の輸送用培地では高い検出率を期待できなかったＨＰでも、本発明の輸送用培地によれば極めて高い検出率を実現できる。特にヘミンおよびメナジオンを組み合わせたときには、長時間にわたって高い検出率が維持される。しかも、この高い検出率は、室温での輸送においても十分に確認できている。従って、本発明によれば、温度管理が困難な輸送中の生存率低下を効果的に抑制し、ハードな環境でも目的とする微生物を確実に輸送することができることがわかる。また、もし低温環境を維持した輸送が可能ならば、従来の輸送技術をはるかに越えるきわめて優秀な輸送性能が得られるということもわかる。
【００５９】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明に係る輸送用培地によれば、目的とする微生物を、通常の輸送に必要な時間以上に生存させておくことができる。従って、本発明に係る輸送用培地を用いて輸送を行った場合には、目的とする微生物を確実に輸送することができる。
【００６０】
また、本発明によれば、特にH.pyloriを高い検出率で検出することができる輸送用培地を提供でき、更に、H.pyloriを高い検出率で検出することができる分離方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＰ培地、ボルタジャームピロリ（bioMerieux社）、ＴＣＳポーター（クリニカルサプライ）、キャリーブレア培地（日水製薬）の各培地を用いて４℃における試験菌の保持能力を比較した結果を示す図である。
【図２】ＨＰ培地、ボルタジャームピロリ（bioMerieux社）、ＴＣＳポーター（クリニカルサプライ）、キャリーブレア培地（日水製薬）の各培地を用いて室温条件（２０℃）における試験菌の保持能力を比較した結果を示す図である。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a culture medium for transporting microorganisms for transporting a sample containing microorganisms.
[0002]
[Prior art]
[Microbial transport medium]
In order to analyze microorganisms including pathogenic bacteria, unique facilities are required. However, at present, since such equipment is not provided, it is often impossible to perform analysis simultaneously with sampling. For this reason, samples that will contain microorganisms need to be transported to a laboratory equipped with unique equipment. A microorganism transport medium (hereinafter simply referred to as “transport medium”) is a medium for transporting the microorganism. Samples to be collected include biomaterials such as pharyngeal mucus, cerebrospinal fluid, sputum, bile, joint fluid, gastric fluid, substomach, urine, feces, bronchial lavage fluid, ear leakage, or patient tissue. Immediately after collection, it is transferred to the transport medium and transported to its own facility in that state.
[0003]
In general, the transport medium can maintain the state of the microorganisms (flora) present in the sample, as certain microbial groups in the sample can interfere with the separation of other microbial groups if they grow during transport. Required. Currently used transport media include Hank's solution and Carrie-Blair media. The Carrie Blair medium is a medium containing sodium thioglycolate, sodium monohydrogen phosphate, sodium chloride, and the like, and has a composition close to a buffer without having a nutrient source. Carry Blair medium is widely used for transportation of various microorganism samples.
[0004]
Here, from the original purpose of the transport medium, it seems to be preferable to maintain the state at the time of collection as it is. If it is not possible to predict what kind of microorganism will be analyzed, it is important to prevent the growth or reduction of a specific microorganism. This is because if the microorganisms to be analyzed are reduced during transportation, the detection rate will be lowered, and the detection rate will be lowered even if other mixed microorganism groups grow and the flora collapses. The “detection rate” here means the possibility that “microorganisms to be analyzed” present in the sample at the time of collection can be detected. However, if the microorganism to be analyzed is clear in advance, better results can be expected if only the survival of the microorganism to be analyzed is attempted.
[0005]
For example, the following Helicobacter pylori (Helicobacter pylori; hereinafter simply referred to as “HP”) is known as a difficult-to-transport bacterium among the microorganisms to be analyzed. Actually, when a conventional transport medium is used, it may be killed or significantly reduced during transport. However, with regard to HP as well, if a dedicated transport medium only for the survival of the HP is prepared, reliable transport may be expected.
[0006]
[Helicobacter pylori]
The aforementioned HP (Helicobacter pylori), which is considered to be a difficult-to-transport bacterium, is a bacterium having the following characteristics.
[0007]
・ Microaerobic bacteria isolated from gastric mucosa tissue (Lancet i: 1273-1275; 1983)
-Taxonomically, Gram-negative spiral bacilli
-Although there was a period when it was classified as Campylobacter genus, it is now Helicobacter (Int.J.Syst.Bacteriol.39: 397-405,1989)
・ Relationship with gastric diseases such as gastric ulcer and gastritis has been strongly suggested (Microbiol.Immunol.31: 603-614,1987)
The detection of HP is considered to give important information in diagnosing these upper digestive system diseases including the stomach and observing the course of treatment. Many samples are transported to a laboratory for the purpose of accumulating more information about the relationship with these upper digestive system diseases. HP, a microaerobic bacterium, requires equipment for microaerobic culture and must be cultured for a relatively long period of time, making analysis difficult at the bedside and transporting it to a laboratory. It is common to analyze. However, since HP is a bacterium that is difficult to transport, techniques for reliably transporting a sample to a laboratory greatly affect the detection rate.
[0008]
[Transportation of HP]
The carry-blair medium, which is a conventional general transport medium, maintains the bacterial flora for several days in the case of normal bacteria, but has not been able to obtain a sufficient detection rate when used in HP. In fact, a decrease in detection rate is observed inversely proportional to the transport time.
[0009]
On the other hand, transportation of HP-containing samples using Hanks' liquid is also performed. Hank's solution has a buffer-centered composition and allows survival for 4-5 hours. However, according to this, although the transportation time is extended as compared with the case where it is simply stored in the bouillon (in this case, it can only be transported for about 2 hours), this time of 4 to 5 hours is achieved. Is still not good enough transport time. In addition, there is an example using a physiological saline solution or an aqueous glucose solution (J. Clin. Pathol. 38, 1127-1131; 1985), but it does not show sufficient performance as a transport medium for HP.
[0010]
Transport of HP using a medium containing a nitrogen source or a carbon source has also been attempted with respect to a transport medium that does not contain nutrients such as a carry-blair medium and Hanks' liquid. A report (Annals of Tropical Medicine and Parasitology Vol.87.No.5,483-486; 1993) that preserved gastric mucosa tissue in thioglycolate medium (liquid or semi-fluid) for the purpose of HP analysis is there. The thioglycolate medium is a nutrient-rich medium that is suitable for any growth including anaerobic to aerobic bacteria, but according to the inventors' follow-up, when used for HP A sufficient detection rate cannot always be obtained, and a decrease in the detection rate proportional to the storage time has been observed.
[0011]
HP is difficult to transport because many microorganisms such as intestinal bacteria exist in the gastric mucosa, and a simple nutrient medium causes the growth of specific microorganisms. As a result, the flora is destroyed and HP is detected. It is presumed that this will lead to a decrease in rate. In addition, in the thioglycolate medium, there is a possibility that the survival maintaining component necessary for the survival of HP is insufficient.
[0012]
Utilization of a medium in which various antibacterial agents are combined with cyclodextrin, methylcellulose and the like for the purpose of selectively proliferating HP (J. Clin. Microbiol. 31: 160-162, 1993 or JP-A-5-260955) ) Is also known. Vancomycin, trimethoprim, and polymyxin B are used as antibacterial agents for this medium. However, this medium is only for selective growth of HP and is not intended for transport.
[0013]
[Problems to be solved by the invention]
As apparent from the above description, the conventional transport medium has a problem that it does not function sufficiently against microorganisms that are difficult to transport. For example, when a conventional transport medium is used for the above-mentioned HP (Helicobacter pylori), which is known as a difficult-to-transport bacterium among the microorganisms to be analyzed, it may be killed or significantly reduced during transport. I was sorry.
[0014]
The present invention has been made in view of the problems as described above, and its purpose is to provide a novel transport medium that can reliably transport microorganisms that have been difficult to transport using conventional transport media. It is to provide.
[0015]
[Means and Actions for Solving the Problems]
As a result of intensive studies by the present inventors to solve the above problems, it is appropriate to prepare a transport medium using an antibacterial agent that constitutes a selective medium for a certain microorganism. As a result, the present invention has been completed.
[0016]
[Transport medium]
First, the present invention provides a transport medium that can reliably transport microorganisms that have conventionally been difficult to transport.
[0017]
  That is, the present invention provides an antibacterial agent to which a microorganism to be transported is resistant.And hemin and menadione as support agents(Claim 1), which is semi-fluid in the microorganism transport medium according to Claim 1 (Claim 2).
[0018]
  In the transport medium according to claim 4, at least one of vancomycin, trimethoprim, polymixin B, and nalidixic acid is added as an antibacterial agent. In order to improve, the combined use of all antibacterial agents is preferable. Although the usage-amount of each antibacterial agent is illustrated later as an Example, these antibacterial agents are added aseptically after sterilizing a culture medium.
[0019]
The medium to which the antibacterial agent according to the present invention is added may be in a liquid, semi-fluid or solid form, and any form suitable for the survival or separation operation of microorganisms for the purpose of transportation / analysis is adopted. be able to. For example, in the case of a liquid, since microorganisms can be washed out from a solid sample during transportation, inoculation to a separation medium is facilitated. On the other hand, since the sample moves freely in the liquid, it is difficult to keep the contact state with air constant, and it is not suitable when microaerobic (or anaerobic) transportation is required. In solid media, the sample can be fixed, but even if the sample is embedded in the media, it will crack, so it is difficult to allow air to enter and transport microaerobically (or anaerobically) It is.
[0020]
In contrast, in a semi-fluid medium, since the sample is naturally wrapped after the sample is embedded in the medium, the sample can be fixed in the medium, and at the same time, the contact state with air is easily controlled. be able to. In addition, an aerobic environment, a microaerobic environment, and an anaerobic environment can be freely selected according to the distance from the surface of the medium. Therefore, for example, if HP, which is a microaerobic bacterium, is transported, the sample may be embedded at a position that gives a microaerobic environment (microaerobic environment site).
[0021]
In addition, the oxygen concentration of each environment and the position in a semi-fluid medium (using 0.3 to 0.5% w / v agar as a gelling agent) are generally located in an aerobic environment with an oxygen concentration of 20% (medium Near the surface, the same as the atmosphere), the microaerobic environment is 3-10% oxygen concentration (around 2 cm from the surface of the medium), and the anaerobic environment is oxygen-free (more than 2 cm from the surface of the medium). Of course, the position where each environment is provided in the medium also depends on the medium composition. That is, in a medium that tends to be in an aerobic environment due to the physical properties and chemical composition of the gelling agent, a microaerobic environment cannot be obtained unless the position is deeper. If the culture environment for HP is illustrated in more detail, CO₂; 7-12%, N₂Or H₂; 0-85%, O₂; 5-6% of the environment is known (Manual of Clinical Microbiology 5th edition p407,1991; American Society for Microbiology) (Ie, a microaerobic environment site suitable for HP transport).
[0022]
{Semi-fluid medium}
The semi-fluid medium is a name of a medium that has a low content of solid components such as agar and retains a certain degree of fluidity compared to a solid medium. In order to obtain a semi-fluid medium, a gelling agent such as agar or gelatin is generally used, and these are used under conditions that maintain the required gel strength at the transport temperature. In the case of agar, the solid medium is used at 1 to 2% w / v, but the semi-fluid medium is generally 0.3 to 0.5% w / v. If agar is added at this concentration, the shape of the medium does not collapse when the container falls over at room temperature, and the necessary fluidity can be maintained.
[0023]
Since the transport medium according to the present invention is intended for reliable transport of the microorganisms to be detected, the target microorganisms are finally inoculated until the sample is inoculated into the separation medium for separating the microorganisms. Expected to prevent death and maintain survival over a long period of time. Therefore, the growth of microorganisms is not necessarily required, and the formation of colonies is not a necessary condition. Since the formation of colonies is not required, the culture medium can employ a semi-fluid medium that is advantageous for the survival of microaerobic bacteria and anaerobic bacteria in addition to the solid medium.
[0024]
  {Supporting agent}
  For the purpose of realizing a higher detection rate, in addition to the antibacterial agent, a support agent that supports the growth of the target fungus is added. In the case of HP, in addition to the antibacterial agent, hemin as a support agentandAdd menadione.
[0025]
Here, hemin is an iron chelate that constitutes hemoglobin, while menadione is another name for vitamin K3. All of these have been conventionally used for supplementing the culture medium (however, they are all intended to support the growth of microorganisms and are not intended to be transported). Also when these are added, they are added aseptically by an operation such as filtration sterilization after sterilization. In this case, if the antibacterial agent, hemin, and menadione are kept in a concentrated solution so that the required final concentration can be obtained and simultaneously added by filter sterilization, the medium can be easily prepared.
[0026]
The transport medium of the present invention is particularly useful for transporting samples containing HP. A typical sample containing HP is a gastric biopsy sample (a sample obtained by cutting the gastric mucosa). If the gastric mucosa is placed in the culture medium according to the present invention, a high detection rate can be maintained for 48 hours or more at room temperature without particular attention to temperature control. At this time, the biopsy sample can be easily transported in a microaerobic environment if it is embedded in the vicinity of 1 cm 2 (microaerobic environment site) from the surface of the semi-fluid medium giving the microaerobic environment. Note that if the temperature during transportation is maintained at a low temperature (for example, 4 ° C. or lower), a higher detection rate is exhibited for a longer time.
[0027]
  {Other additives}
  Antibacterial and heminandIn addition to menadione, necessary components can be added according to the target microorganism. For example, components effective for HP include blood, serum, etc. of animals such as sheep, goats, cows, or horses. When adding blood or serum, it may be added in the range of 5 to 20% v / v.
[0028]
{Basic medium components}
As a medium component that serves as a basis for adding these auxiliary components, the composition of a medium intended for general enrichment may be used. Specifically, for the purpose of transporting HP, for example, thioglycolate medium, brain / heart infusion / broth medium, heart / broth medium, tryptosoy / broth medium, glucose / broth medium, thioglycolic acid as basic components Examples of the culture medium include medium II, ABCM bouillon, and Brucella bouillon medium for the purpose of enrichment. Animal blood, animal serum and the like can be added to these basal medium components. Animal blood components lead to good results, especially when transporting HP. As animals, cows, horses, sheep, goats and the like are useful. The bouillon medium can be made a semi-fluid medium by adding 0.2 to 0.5% agar. Among these media, specific compositions of particularly preferable ones are shown below.
[0029]
[Table 1]
"Thioglycolate medium (BBL)"
  [Composition (in 1L)]
  Tripty case peptone 17.00 g
  Feyton Peptone 3.00g
  Glucose 6.00g
  Sodium chloride 2.50g
  Sodium thioglycolate 0.50g
  Agar 0.70g
  L-cystine 0.25g
  Sodium sulfite 0.10g
(PH 7.0)
[Table 2]
“Thioglycolate medium“ Eiken ”(trade name, manufactured by Eiken Chemical)
  [Composition (in 1L)]
  Yeast extract 5g
  Tryptone 15g
  Glucose 5g
  L-cystine 0.5g
  Sodium thioglycolate 0.5g
  Sodium chloride 2.50g
  Resazurin 0.001g
  Agar 0.8g
(PH 7.1 ±)
[Table 3]
"Thioglycolic acid medium II" Eiken "(trade name, manufactured by Eiken Chemical)
  [Composition (in 1L)]
  Yeast extract 5g
  Tryptone 15g
  Glucose 5g
  L-cystine 0.5g
  Sodium thioglycolate 0.5g
  Sodium chloride 2.50g
(PH 7.1 ±)
[Table 4]
“Brain Heart Infusion Medium“ Eiken ”(trade name, manufactured by Eiken Chemical)
  [Composition (in 1L)]
  200g calf brain exudate
  250g bovine heart exudate
  Peptone 10g
  Glucose 2g
  Sodium chloride 5g
  Sodium monohydrogen phosphate 2.5g
    (PH 7.4 ±)
  [Transportation of microorganisms]
  The present invention also provides a method for transporting microorganisms using the transport medium (claim).5~7). The microorganism transport medium according to the present invention contains an antibacterial agent to which the microorganisms to be transported are resistant, so that the growth of microorganisms other than the microorganisms to be transported is suppressed, and only the target microorganism is stable in the medium. Survive or proliferate. When any one of vancomycin, trimethoprim, polymyxin B, nalidixic acid, or any combination thereof is included as an antibacterial agent, the growth of microorganisms other than HP is suppressed, and only HP grows in the medium.
[0030]
As described above, in the present invention, the predetermined antibacterial agent contained in the culture medium prevents a decrease in detection rate due to growth of microorganisms other than the microorganisms to be detected. Since the extreme growth of microorganisms other than the target microorganism leads to a decrease in the detection rate of the target microorganism, the action of such an antibacterial agent in the transport medium is important. Many transport media are intended to maintain flora, and no antibacterial agent is contained.
[0031]
The support agent has an action of improving the survival rate of the microorganism to be detected. Even in a strain in which a decrease in the survival rate is observed even if microorganisms other than the target are not grown by a predetermined antibacterial agent, a high survival rate can be maintained by adding a support agent. When the microorganism to be detected is HP, hemin and menadione, which have the effect of improving the survival rate of HP, are used as the support. Even if it is a strain in which the decrease in the survival rate is observed even if the growth of microorganisms other than HP is suppressed by the antibacterial agents (vancomycin, trimethoprim, polymyxin B, nalidixic acid), it is high by adding hemin or menadione. Survival rate can be maintained. Although hemin and menadione are generally said to support the growth of anaerobic bacteria, it is a new finding that contributes to the improvement of the survival rate of HP during transportation.
[0032]
The transport medium or the transport method of the present invention achieves a high detection rate that has not been achieved in the past by combining with a separation medium that does not contain an antibacterial agent. As described above, the antibacterial agent is used in the order completely opposite to that of the conventional transportation to separation work, so that a very high detection rate is realized in the present invention.
[0033]
[Method for separating microorganisms]
The present invention also provides a method for separating microorganisms such as HP using the transport medium (claims 12 to 14).
[0034]
{Selection and separation}
Conventionally, after transporting in an environment where no antibacterial agent is present, an operation of inoculating a medium added with a selective agent and performing separation culture to detect is common.
[0035]
However, in the present invention, this operation is intentionally reversed, transport is carried out in the presence of an antibacterial agent, and a high detection rate is realized by inoculating this in a medium not containing the antibacterial agent. For this reason, when the sample is transported by the transport medium according to the present invention, it can be inoculated into the medium not containing the selective agent (that is, when the transport medium according to the present invention is used, the selective medium is used). At the same time, this makes it possible to detect HP with a high detection rate. As a medium that does not contain a selection agent in the method for separating microorganisms of the present invention, a medium having sufficient growth support ability for a microorganism to be detected is prepared. If HP is to be detected, chocolate agar medium, blood agar medium, skilow medium, and the like can be exemplified. In order to carry out separation culture, it is more advantageous to form colonies on an agar medium than to bouillon.
[0036]
In addition, when analyzing microorganisms, a group of microbial cells (isolated strains) derived from one cell must be obtained. A separation medium is used for such a purpose. In addition, the separation medium is primarily required to support the sufficient growth of the microorganism to be separated, and it is not sufficient that the medium is not simply killed. In general, a solid medium is used because colonies need to be formed. Further, in order to increase the efficiency, a selection medium and a separation medium are usually used in combination. However, when the transport medium according to the present invention is used, the use of a selective medium can be eliminated. Therefore, the separation medium in the present invention is a medium that is purely used for the purpose of finally isolating microorganisms. It will be.
[0037]
{Transport of sample}
If the transported sample is a solid sample such as a stomach biopsy, it is homogenized and then inoculated on an agar medium. Note that when the purpose is to separate microaerobic bacteria such as HP, it is necessary to consider that homogenization is also performed in a nitrogen atmosphere. Furthermore, the culture with the separation medium must be performed in a microaerobic state.
[0038]
  When transporting a microorganism-containing sample in a transport medium to which the antibacterial agent is added,andMethod to improve the survival rate of microorganisms during transportation by adding menadioneTheprovide. This survival rate improving method is particularly effective when transporting HP. For example, if a medium containing various antibacterial agents, which is often used for conventional Campylobacter selective media, is used as it is for transporting HP, the survival rate may decrease in a short time depending on the strain. About heminandIf menadione is added, the survival rate is improved, and it can be connected to a high detection rate.
[0039]
【Example】
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described.
[0040]
[Materials and methods]
{HP medium}
H.pyloriThe transport medium (HP medium: transport medium according to the present invention) is a semi-fluid high-layer medium in which horse serum, hemin, menadione and a selective agent are added to a thioglycolate medium.
[0041]
The composition of the HP medium is shown below.
[0042]
[Table 5]

{Measurement}
In addition to HP medium, Voltajam pylori (bioMerieux; trade name), TCS porter (clinical supply; trade name), and Carre Blair medium (Nissui Pharmaceutical) were used as the transport medium.
[0043]
Primary separation from gastric mucosa of gastric ulcer patientH.pylori10 on 3 mm square filter paper⁶CFU was impregnated and inoculated into each of the above four types of transport media. The HP medium was inoculated at a position 1 cm from the top of the medium (that is, a microaerobic environment site). Each medium was stored at room temperature (about 20 ° C.) and 4 ° C. for 96 hours, collected over time, and cultured. In addition, two specimens were collected from adjacent sites with an endoscope from an actual patient, one was rapidly cultured, and the other was inoculated into HP medium and transported at 4 ° C. for culture. The time required for transportation is about 36 to 48 hours. The separation medium was a Colombian sheep blood agar medium (BBL) and a modified skilow medium (homemade) and cultured at 35 ° C. for 4 to 7 days under microaerobic conditions.
[0044]
[result]
FIG. 1 and FIG. 2 show the results of comparing the holding ability of the test bacteria at 4 ° C. and room temperature (20 ° C.) using each medium. The retention ability is examined as a change in the viable cell count of the filter paper collected over time.
[0045]
From FIG. 1, it can be seen that the retention ability of each medium is excellent under low temperature conditions as compared with the carry-braire medium. However, as is clear from FIG. 1 and FIG. 2, in both conditions, both of HP mediaH.pyloriThe holding ability was the highest. For example, the HP medium did not show any decrease in the number of viable bacteria up to 36 hours at 4 ° C. and 12 hours at 20 ° C. In both conditions, HP medium, Volta germ pylori, and TCS porter are in this order.H.pyloriIt was shown to be insufficient as a transport medium. In particular, the HP medium has a stable viable count for 72 hours at 4 ° C.H.pyloriIt can be seen that can be transported.
[0046]
Table 6 shows the results when the clinical material actually collected from the ulcer portion was cultured after being transported in the HP medium and immediately after the clinical material was collected.H.pyloriThe results of comparing the culture results are shown.
[0047]
[Table 6]

Of the 18 samples, 11 samples are collected immediately after collection and after transportation.H.pyloriWas detected. Immediately after collection (-), after transport (+), and vice versa, one case was observed in each case, but in all other cases, the culture results were consistent. In transport media, the retention capacity obtained in basic experiments is often not reflected in actual patient sample transport conditions. The reason may be that a biological defense factor not present in the prepared bacterial solution is involved.
[0048]
However, the results after transport using the HP medium obtained this time are almost consistent with the results performed at the bedside. In particular, the point that the holding ability at 4 ° C. is superior to that at room temperature is the same as the report of other bacterial species already reported. Of micro-aerobic bacteria, which are usually highly auxotrophicHaemophilus influenzae,Neisseria gonorrhoeaeAre said to decrease rapidly in the transport medium. Examination of conditions-Changes in the number of viable bacteria in commercial transport media-Clinical and microorganisms,12: 459-463, 1985 Appelbaum, P .; C. Spangle, S. K. , Crist, R .; , & Crist, A.C. E. Jr. Survival of Bacteria in Difco Culture Swab and Marion Culture II Transport Systems. J. et al. Clin. Microbiol. ,26: 136-138, 1988. ). However, because HP medium remains stable at 72C for up to 72 hours,H.pyloriIt is thought that this is a very suitable medium for transporting the cells.
[0049]
Next, the same experiment as in Table 6 was performed to obtain the result quantitatively. That is, clinical materials (materials different from Table 6) actually collected from ulcers at hospitals in Tokyo were divided into two, and one was immediately homogenized and inoculated into a Columbia sheep blood agar medium for quantification. On the other hand, HP was quantified by the same treatment after storage in HP medium at 4 ° C. for 24 hours or 48 hours. Quantification is per 1.0 mg of tissue.H.pyloriThis was done by measuring the number of viable bacteria.
[0050]
As with the qualitative results shown in Table 6, it is clear from Table 7 that the transport performance of the HP medium is excellent even when viewed quantitatively. That is, in Table 7, there is almost no decrease in the amount of bacteria even if the results of the rapid examination at the bedside are compared with the results after transporting in HP medium for 24 hours (or 48 hours). Understand. Therefore, it can be said that the HP medium according to the present invention exhibits excellent transport ability even when evaluated under the strict condition of following the amount of bacteria quantitatively.
[0051]
[Table 7]

[Addition of hemin menadione]
Next, we examined the composition of the HP medium and added hemin / menadione.H.pyloriWe investigated the changes in the growth and supportive ability of the animals. Specifically, a medium containing hemin / menadione and a medium containing no hemin / menadion were prepared, and the growth of the fungus was examined. The following table shows the composition of the medium used for the study.
[0052]
[Table 8]

The strains used in the above two types of examination media are as follows.
[0053]
Three strains, H.pylori ATCC 43504, H.pylori ATCC 43579, and H.pylori ATCC 43629, are used as standard strains. Three clinical isolates, H.pylori CI No.1, H.pylori CI No.2, and H.pylori CI No.3. In addition, S. aureus ATCC 25923, E. coli. ATCC 25922, and P. aeruginosa ATCC 27853 were inoculated into the examination medium.
[0054]
Bacterial inoculation was performed as follows. (1) Bacteria moss purely cultivated on Columbia sheep blood agar medium is scraped into a sterilized raw food, about 10⁶Prepared to CFU / ml. (2) Inoculate 0.5 ml of

medium

1 and 2 at 35 ° CH.pyloriWas cultured aerobically and other species were aerobically cultured. ▲ 3 ▼H.pyloriThe degree of development of each was visually observed, and was judged in four stages:-, +, ++, and +++.
[0055]
The results of the composition study are shown in the table below.
[0056]
[Table 9]

As described above, it can be seen that the growth in the hemin / menadione-containing medium is equivalent to or slightly superior to the medium containing no hemin.
[0057]
[Combination of other microorganisms and medium]
The transport medium according to the present invention is not limited to HP transport. For example, Campylobacter can be transported by the above-described HP medium. In addition, other combinations of microorganisms and antibacterial agents to which the microorganisms are resistant include, for example, combinations of Hemophilus influenzae and bacitracin. In the case of this combination, bacitracin (16500 U / L) is added to the following basal medium, and the pharyngeal mucus sample is stored and transported therein.
[0058]
[Table 10]
Tryptone 10g
Soy peptone 5g
Azamino acid 5g
Glucose 10g
Sodium chloride 5g
As described above, even a HP that cannot be expected to have a high detection rate with a conventional transport medium, can achieve an extremely high detection rate with the transport medium of the present invention. Particularly when hemin and menadione are combined, a high detection rate is maintained for a long time. Moreover, this high detection rate has been sufficiently confirmed even in transportation at room temperature. Therefore, according to the present invention, it can be understood that the decrease in the survival rate during transportation, which is difficult to control the temperature, can be effectively suppressed, and the target microorganism can be reliably transported even in a hard environment. It can also be seen that if transport is possible while maintaining a low-temperature environment, extremely superior transport performance can be obtained that far exceeds conventional transport technology.
[0059]
【The invention's effect】
As described above, according to the transport medium according to the present invention, the target microorganism can survive for more than the time required for normal transport. Therefore, when the transport medium according to the present invention is used for transport, the target microorganism can be transported reliably.
[0060]
Also, according to the present invention, in particularH.pyloriCan be provided at a high detection rate, and a transport medium can be provided.H.pyloriCan be provided with a high detection rate.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of comparing the retention of test bacteria at 4 ° C. using HP medium, Voltajam pylori (bioMerieux), TCS porter (clinical supply), and carry Blair medium (Nissui Pharmaceutical). FIG.
[Fig. 2] Comparison of retention of test bacteria under room temperature conditions (20 ° C) using HP medium, Voltajam pylori (bioMerieux), TCS porter (clinical supply), and carry Blair medium (Nissui Pharmaceutical). It is a figure which shows the result.

Claims

Helicobacter pylori and an antibacterial agent having a resistant, Helicobacter pylori transport medium containing hemin and menadione as a supporting agent.

The medium for transporting Helicobacter pylori according to claim 1, which is a semi-fluid medium.

The medium for transporting Helicobacter pylori according to claim 1 or 2, wherein the antibacterial agent is at least one selected from the group consisting of vancomycin, trimethoprim, polymyxin B, and nalidixic acid.

A semi-fluid Helicobacter pylori transport medium comprising vancomycin, trimethoprim, polymyxin B and nalidixic acid, hemin and menadione.

The transport method of Helicobacter pylori which transports the Helicobacter pylori containing sample by the culture medium for transport in any one of Claims 1-4.

The transport method according to claim 5 , wherein transport is performed under microaerobic conditions.

The transport method according to claim 6 , wherein the Helicobacter pylori analysis sample is transported by being embedded in a microaerobic environment site in a semi-fluid medium.

Transport Helicobacter pylori-containing sample by transport medium according to any one of claims 1 to 4, then Helicobacter pylori method of separating inoculating Helicobacter pylori derived from the Helicobacter pylori-containing sample into a microorganism separation medium.

A method for separating Helicobacter pylori, wherein a Helicobacter pylori-containing sample is transported by the transport medium according to claim 4, and then Helicobacter pylori derived from the Helicobacter pylori-containing sample is inoculated into a microorganism separation medium.