JP3686657B2

JP3686657B2 - Method for measuring steroidal in vivo trace substances

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Publication number: JP3686657B2
Application number: JP2003050927A
Authority: JP
Inventors: 達也東; 和武島田
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-02-27
Filing date: 2003-02-27
Publication date: 2005-08-24
Anticipated expiration: 2023-02-27
Also published as: JP2004257949A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中のステロイド性生体内微量物質に電子親和性原子団を有する化合物を導入し、負イオンＡＰＣＩ−ＭＳ法（負イオン大気圧化学イオン化質量分析法）により生体内微量物質を測定する方法、その測定に供される反応成績体及びその測定のための試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビタミンＤ₃代謝物（９，１０−セコステロイド）を含むステロイドホルモンは、生体内において、極微量にて強力な生理作用を表す。これらのステロイドホルモンの生体内レベルを把握することは、臨床診断及び病態解析上極めて重要であるが、これらの生体内濃度は著しく低い上に、構造類似化合物が共存するため、その分析には極めて高い感度及び特異性が要求される。
【０００３】
従来、これら生体内ステロイドホルモンの測定は、主としてＬＣ（Liquid Chromatography：液体クロマトグラフィ）を用いて行われてきたが、実用的に十分な程度の感度が得られない場合が多かった。
【０００４】
近年、ＬＣとＡＰＣＩ−ＭＳ（Atmospheric Pressure Chemical Ionization-based Mass Spectrometry）を組合せた方法、すなわち、ＬＣ／ＡＰＣＩ−ＭＳが特異性や多用性の面で有用であることが提案された（非特許文献１参照）。
しかし、ＬＣ／ＡＰＣＩ−ＭＳを用いた方法においても、ステロイドホルモン化合物自体のイオン化効率が低いために、十分な感度を得ることはできなかった。
【０００５】
さらに、ＬＣとＥＳＩ（Electro Spray Ionization：エレクトロスプレーイオン化）−ＭＳを組合せる方法も行われているが、本法は極性化合物に有効であるが、多くのステロイドホルモンは極性基を数個しか有していないことから、この方法もあまり実用的ではなかった。
【０００６】
最近になって、正イオン検出ＡＰＣＩ−ＭＳを用いた測定において、ステロイド化合物に電子親和性原子団を導入した誘導体が高感度で検出できることが示された（非特許文献２−４参照）。一方、負イオンモードのＡＰＣＩ−ＭＳは、バックグラウンドノイズが低いことが一般的に知られており、負イオンモードＡＰＣＩ−ＭＳを用いた測定において、ステロイド化合物に電子親和性原子団を導入すれば、更なる高感度化が期待できると考えられる。
しかしながら、これまで、負イオン検出ＡＰＣＩ−ＭＳのための電子親和性原子団の導入については、ペンタフルオロベンジル化の例（非特許文献５参照）が知られているのみで、他の誘導体化についての検討はなされていない。
【０００７】
【非特許文献１】
K. Shimada, et al.：J. Chromatogr. A., 2001(935), 141
【非特許文献２】
T. Higashi et al.; Biomed. Chromatogr., 2001(15), 133.
【非特許文献３】
T. Higashi et al.; J. Chromatogr. B, 2002(772), 229.
【非特許文献４】
K. Shimada et al.; J. Chromatogr. B, 1998(714), 153.
【非特許文献５】
G. Singh, et al.; Anal. Chem., 2000(72), 3007
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、負イオンＡＰＣＩ−ＭＳを用いたステロイド性生体内微量物質の測定において、ステロイド性生体内微量物質に電子親和性原子団を有する化合物を導入することにより、ステロイド性生体内微量物質を高感度に測定する方法を提供することである。また、本発明の目的は、負イオンＡＰＣＩ−ＭＳを用いたステロイド性生体内微量物質の測定における測定感度を高めるための化合物を含むイオン化試薬、及び当該化合物をステロイド性生体内微量物質に導入した化合物を提供することである。さらに、本発明の目的は、負イオンＡＰＣＩ−ＭＳを用いたステロイド性生体内微量物質の測定のための試薬を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、負イオン検出ＡＰＣＩ−ＭＳを用いたステロイド性生体内微量物質の測定において、その測定感度を上昇させるべく鋭意検討したところ、驚くべきことに、特定の電子親和性原子団をステロイド性生体内微量物質に導入すると、その測定感度が数倍〜２００倍以上も上昇することを見出した。また、この測定感度はこれまでに知られている電子親和性原子団、すなわち、ペンタフルオロベンジル基を導入した場合に比較しても最大で７倍以上高いものであった。本発明者らは、これらの知見をもとにさらに検討を行い、本発明を完成させた。
【００１０】
しかして、本発明によれば、ステロイド性生体内微量物質のＬＣ／ＭＳ測定において、次の工程、すなわち、
i) 血清試料に下記式（Ｉ）：
【００１１】
【化７】

【００１２】
〔式中、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³はそれぞれＨ、ＣＦ₃又はＮＯ₂を表す〕
の化合物又は下記式（II）：
【００１３】
【化８】

【００１４】
〔式中、Ａｒは下記式：
【００１５】
【化９】

【００１６】
（式中、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は前記の意味を有する、）
の基、３，５−ジニトロ−２−ピリジル基又は７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル基を表す〕
の化合物を反応させて、下記式（III）
【００１７】
【化１０】

【００１８】
〔式中、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は前記の意味を有し、Ｓｔはオキソ基を有するステロイド化合物からオキソ基を除いた部分を表す〕
で示される反応成績体又は下記式（IV）：
【００１９】
【化１１】

【００２０】
〔式中、Ａｒは前記の意味を有し、
【００２１】
【化１２】

【００２２】
はビシナルジオール部分構造を有するビタミンＤ₃代謝物からビシナルジオール部分を除いた部分又はカテコール部分構造を有するステロイド化合物からカテコール部分を除いた部分を表す〕
で示される反応成績体とする工程、及び
ii) 前記反応成績体をＬＣ／負イオンＡＰＣＩ−ＭＳを用いて測定する工程、
を含むことを特徴とする、ステロイド性生体内微量物質の測定方法が提供される。
【００２３】
また、本発明によれば、前記式（III）で示される化合物及び前記式（IV）で示される化合物が提供される。
【００２４】
さらに、本発明によれば、質量分析（ＭＳ）、さらに好ましくはＬＣ／ＭＳ分析のための、式（Ｉ）で表される化合物又は式（II）で表される化合物を含む、高感度検出用イオン化試薬が提供される。
【００２５】
加えて、本発明によれば、分析対象が、ステロイド性生体内微量物質である、上記イオン化試薬、並びに、ＬＣ／ＭＳ分析が、負イオンＡＰＣＩ−ＭＳである、上記イオン化試薬が提供される。
【００２６】
なお、本発明のイオン化試薬は、ＡＰＣＩ法のみならず、ＥＳＩ法及びＣＦ−ＦＡＢ（連続フロー高速原子衝撃）法等、他のイオン化方法を用いる質量分析にも用いることができる。
【００２７】
本明細書において用いる語「ステロイド性生体内微量物質」とは、ステロイド化合物及びビタミンＤ₃類縁体を意味する。したがって、ステロイド性生体内微量物質としては、例えば、テストステロン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、プレグネノロン、エストロン、２−ヒドロキシエストラジオール、４−ヒドロキシエストラジオール、２−ヒドロキシエストロン、４−ヒドロキシエストロン等のステロイド化合物及び２４，２５−（ジヒドロキシ）ビタミンＤ₃、１，２４，２５−（トリヒドロキシ）ビタミンＤ₃等のビタミンＤ₃類縁体を挙げることができる。
【００２８】
本発明において使用される血清試料の調製方法については後記実験例において詳述するが、一般的な調製方法により精製した血清であれば、その血清試料は本発明に用いることができる。
【００２９】
本明細書において、Ｒ¹，Ｒ²，Ｒ³はそれぞれＨ、ＣＦ₃又はＮＯ₂を表す。
【００３０】
本発明に使用することのできる前記式（Ｉ）の化合物としては、例えば、次のものを挙げることができる。
２−ニトロフェニルヒドラジン
２，４−ジニトロフェニルヒドラジン
２，４，６−トリニトロフェニルヒドラジン
２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニルヒドラジン
２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニルヒドラジン
４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニルヒドラジン
２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニルヒドラジン
なお、本明細書において、化合物名は原則として一般名を部分的に用いて記載するが、一般名を用いて表すことができない化合物については化学名にて表記する。
【００３１】
前記式（Ｉ）の化合物のうち、好ましい化合物としては次のものを挙げることができる。
２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニルヒドラジン
２，４−ジニトロフェニルヒドラジン
２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニルヒドラジン
【００３２】
また、本発明に使用することのできる前記式（II）の化合物としては、例えば、次のものを挙げることができる。
〔３−（４−ニトロフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
〔３−（２，４，６−トリニトロフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
４−〔Ｎ−（３−ジヒドロキシボリル）フェニル〕アミノ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール
〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
〔３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
〔３−（２，４−ジニトロピリジル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
〔３−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
【００３３】
前記式（II）の化合物のうち、好ましいのは次に挙げる化合物である。
〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
【００３４】
さらに、前記式（III）においてＳｔで表される部分は、テストステロン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン及びプレグネノロンからそれぞれオキソ基を除いた部分であり、好ましくは、テストステロン及びジヒドロテストステロンからそれぞれオキソ基を除いた部分である。
【００３５】
また、前記式（IV）において
【００３６】
【化１３】

【００３７】
で表される部分は、２４，２５−（ジヒドロキシ）ビタミンＤ₃及び１，２４，２５−（トリヒドロキシ）ビタミンＤ₃からそれぞれビシナルジオール部分を除いた部分並びに２−ヒドロキシエストラジオール、４−ヒドロキシエストラジオール、２−ヒドロキシエストロン及び４−ヒドロキシエストロンからカテコール部分を除いた部分であり、好ましくは、２４，２５−（ジヒドロキシ）ビタミンＤ₃からビシナルジオール部分を除いた部分並びに２−ヒドロキシエストラジオール及び４−ヒドロキシエストラジオールからカテコール部分を除いた部分である。
【００３８】
本発明により提供される前記式（III）の化合物としては、例えば、次のものを挙げることができる。
３−（２−ニトロフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２，４−ジニトロフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２，４，６−トリニトロフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２−ニトロフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
３−（２，４−ジニトロフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
３−（２，４，６−トリニトロフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
３−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
２０−（２−ニトロフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
２０−（２，４−ジニトロフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
２０−（２，４，６−トリニトロフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
２０−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
２０−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
２０−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
２０−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
１７−（２−ニトロフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
１７−（２，４−ジニトロフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
１７−（２，４，６−トリニトロフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
１７−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
１７−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
１７−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
１７−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
【００３９】
また、前記式（III）の化合物のうち、好ましい化合物としては次のものを挙げることができる。
３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２，４−ジニトロフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
３−（２，４−ジニトロフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
２０−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
２０−（２，４−ジニトロフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
２０−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
１７−（２，４−ジニトロフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
１７−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
１７−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
【００４０】
また、前記式（III）の化合物のうち、さらに好ましい化合物としては次のものを挙げることができる。
３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
２０−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
１７−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
【００４１】
本発明により提供される前記式（IV）の化合物としては、例えば、次のものを挙げることができる。
２４，２５−〔３−（４−ニトロフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
２４，２５−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
２４，２５−〔３−（２，４，６−トリニトロフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
２４，２５−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
２４，２５−〔３−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
２４，２５−〔３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
２４，２５−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
２４，２５−〔３−（３，５−ジニトロピリジン−２−イル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
２４，２５−〔３−（７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（４−ニトロフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２，４，６−トリニトロフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（３，５−ジニトロピリジン−２−イル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
２，３−〔３−（４−ニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４，６−トリニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（３，５−ジニトロピリジン−２−イル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（４−ニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４，６−トリニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（３，５−ジニトロピリジン−２−イル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（４−ニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４，６−トリニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（３，５−ジニトロピリジン−２−イル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（４−ニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４，６−トリニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（３，５−ジニトロピリジン−２−イル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
【００４２】
また、前記式（IV）の化合物のうち、好ましいのは次に挙げる化合物である。２４，２５−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
２４，２５−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
２４，２５−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
２，３−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
【００４３】
また、前記式（IV）の化合物のうち、さらに好ましいのは次に挙げる化合物である。
２４，２５−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ₃
２，３−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
【００４４】
本発明の測定方法における測定には、一般的なＬＣ及びＭＳを用いることができる。
次に、本発明の化合物の製造方法及び本発明の方法を用いたステロイド性生体内微量物質の測定について記載する。
【００４５】
【発明の実施の形態】
オキソ基を有するステロイド化合物の測定
本発明における前記式（Ｉ）の化合物は、商業的に入手可能な原料より、ヒドラジンによる置換反応によって容易に合成することができる。また、本発明における血清試料は、常法により容易に調製することができる。
すなわち、本発明における血清試料は、採血した全血より血清を分取した後、市販のカートリッジ（例えば、OASIS HLB（登録商標） cartridgeやBond ELUT Si（登録商標） cartridge等）を用いた精製により調製できる。
【００４６】
本発明における血清試料をエタノール等のアルコール類に懸濁し、これに、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸等の酸性触媒の存在下にて、前記式（Ｉ）のヒドラジン化合物を反応させることにより、前記式（III）の化合物へと誘導することができる。
【００４７】
前記式（III）の化合物への合成反応、すなわち、ヒドラジン誘導体化反応における反応温度は、室温乃至８０℃の範囲内の温度で行うことができ、好ましくは５０℃乃至７０℃の範囲内の温度が適している。また、前記式（Ｉ）のヒドラジン化合物は、直接又は不活性有機溶媒、例えば、アセトニトリル、エタノール、酢酸エチル等の溶液の状態にて加えることもできる。
【００４８】
また、上記ヒドラジン誘導体化反応において、血清試料に対するヒドラジン化合物の使用割合は、血清試料２００μlに対してヒドラジン化合物２μg乃至２０μgとすることができ、好ましくは４μg乃至１０μgが適している。
【００４９】
前記式（III）のヒドラジン誘導体のＬＣ／負イオンＡＰＣＩ−ＭＳ測定は、一般的なＬＣ、例えば、Hewlett Packerd社製 HP1100又はWaters社製 2795など、並びに一般的なＭＳ、例えば、Micromass社製 QUATTRO II又はMicromass社製 QUATTRO MICROなどを用いて行うことができる。
【００５０】
ビシナルジオール部分構造を有するビタミンＤ ₃ 誘導体の測定
本発明における前記式（II）の化合物についても、商業的に入手可能な原料より、アミノフェニルジヒドロキシボランによる置換反応によって容易に合成することができる。
【００５１】
本発明における血清試料と前記式（II）のジヒドロキシボラン化合物とを不活性有機溶媒、例えば、アセトニトリル、エタノール、ピリジン等の溶媒中にて反応させ、前記式（IV）の化合物へと誘導することができる。
【００５２】
前記式（IV）の化合物への合成反応、すなわち、ボロン酸誘導体化反応における反応温度は、室温乃至７０℃の範囲内の温度で行うことができ、好ましくは４０℃乃至６０℃の範囲内の温度が適している。
【００５３】
また、ボロン酸誘導体化反応において、血清試料に対するボロン酸化合物の使用割合は血清試料５０μlに対してボロン酸化合物２μg乃至２０μgとすることができ、好ましくは４μg乃至１０μgが適している。
【００５４】
前記式（III）のヒドラジン誘導体のＬＣ／負イオンＡＰＣＩ−ＭＳ測定は、一般的なＬＣ及びＭＳを用いて行うことができる。
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するものであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５５】
【実施例】
実施例１２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニルヒドラジン（２ＮＦＰＨ）の合成
４−フルオロ−３−ニトロベンゾトリフルオライド１００μlをアセトニトリル１mlに溶解し、８０％ヒドラジン水和物１１０μlを加え室温にて１５分間攪拌する。反応混合物を減圧下にて濃縮した後、これに酢酸エチルを加え、水洗し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下にて溶媒を留去し、得られた粗結晶をＭｅＯＨより２回再結晶して、橙色針状晶の２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニルヒドラジンを得た（定量的）。
融点：１１６−１１６．５℃
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ２２０．０〔Ｍ−Ｈ〕^-
製造例１と同様にして、以下の実施例２の化合物を合成した。
【００５６】
実施例２２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニルヒドラジン（ＤＮＦＰＨ）の合成
黄色針状晶
収率：定量的
融点：１４０．５−１４１．５℃
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ２６５．０〔Ｍ−Ｈ〕^-
【００５７】
実施例３〔３−（４−ニトロフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン（ＮＰ−ＡＰＢ）の合成
４−フルオロニトロベンゼン０．３ml及びアミノフェニルジヒドロキシボラン５０mgを、ジメシルスルホキシド：１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液＝１：１の混合液２mlに加え、７０℃にて６時間攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出した後、水洗し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下にて溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝２０：１）にて精製し、標題化合物の黄色固形物を得た（定量的）。
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ２５７．３〔Ｍ−Ｈ〕^-
実施例３と同様にして、以下の実施例４―１１の化合物を合成した。
【００５８】
実施例４〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン（ＤＮＰ−ＡＰＢ）
橙色固形物
出発原料：２，４−ジニトロフルオロベンゼン
収率：定量的
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３０２．２〔Ｍ−Ｈ〕^-
【００５９】
実施例５〔３−（２，４，６−トリニトロフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン（ＴＮＰ−ＡＰＢ）
茶色固形物
出発原料：２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム二水和物
収率：定量的
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３４７．２〔Ｍ−Ｈ〕^-
【００６０】
実施例６４−〔Ｎ−（３−ジヒドロキシボリル）フェニル〕アミノ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＤＮＢ−ＡＰＢ）
茶色固形物
出発原料：４−クロロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール
収率：定量的
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ２９９．２〔Ｍ−Ｈ〕^-
【００６１】
実施例７〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン（２ＮＦＰ−ＡＰＢ）
黄色固形物
出発原料：４−フルオロ−３−ニトロベンゾトリフルオライド
収率：定量的
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３２５．２〔Ｍ−Ｈ〕^-
【００６２】
実施例８〔３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン（４ＮＦＰ−ＡＰＢ）
黄色固形物
出発原料：２−フルオロ−５−ニトロベンゾトリフルオライド
収率：定量的
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３２５．２〔Ｍ−Ｈ〕^-
【００６３】
実施例９〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン（ＤＮＦＰ−ＡＰＢ）
橙色固形物
出発原料：２−クロロ−３，５−ジニトロベンゾトリフルオライド
収率：定量的
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３７０．２〔Ｍ−Ｈ〕^-
【００６４】
実施例１０〔３−（２，４−ジニトロピリジル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン（ＤＮＰｙ−ＡＰＢ）
橙色固形物
出発原料：２−クロロ−３，５−ジニトロピリジン
収率：定量的
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３０３．２〔Ｍ−Ｈ〕^-
【００６５】
実施例１１〔３−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン（ＰＦＢ−ＡＰＢ）
無色固形物
出発原料：２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジルブロマイド
収率：定量的
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３１６．２〔Ｍ−Ｈ〕^-（３０％），３４８．１〔Ｍ−Ｈ＋Ｏ₂〕^-（１００％）
【００６６】
実施例１２ヒト血清試料中の生体内微量物質の測定
１２−１ヒト血清試料の調製
ヒト全血より得た血清試料２００μlにアセトニトリル２００μlを加え、３０秒間混和し、１，５００ｘｇ、４℃にて１０分間遠心分離した。上清を分取し、水２mlで希釈した後、ＯＡＳＩＳＨＬＢカートリッジ（Waters製。使用前に酢酸エチル２ml、メタノール２ml及び水２mlを通して洗浄しておく。）に通した。カートリッジを水２ml及びメタノール：水＝７：３の混合液２mlにて洗浄した後、酢酸エチル１mlを用いて被検成分を溶出した。
【００６７】
得られた溶出液を減圧下にて留去した後、残渣にヘキサン：酢酸エチル＝３：１の混合液０．２mlを加え、この懸濁液をBond Elut Siカートリッジ（Varian製。使用前に酢酸エチル４ml及びヘキサン４mlを通して洗浄しておく。）に充填した。さらに、同液０．２mlにより同じ操作を繰り返して同カートリッジに充填した。このカートリッジをヘキサン３ml及びヘキサン：酢酸エチル＝３：１の混合液３mlにて洗浄した後、ヘキサン：酢酸エチル＝１：３の混合液３mlを用いて、カートリッジから被検成分を溶出した。この溶出液を減圧下にて留去し、ヒト血清試料とした。
【００６８】
１２−２−１オキソステロイド化合物に対するヒドラジン誘導体化
実験例１に示す操作により得たヒト血清試料をエタノール（２０μl）に懸濁し、これに、トリクロロ酢酸０．５mgの存在下にて、ヒドラジン化合物５μg（製造例１〜２において合成した化合物）のアセトニトリル５０μl溶液を加え、６０℃にて１時間攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧下にて留去し、得られた残渣をエタノール４０μlに溶解して、そのうちの１０μlをＬＣ／ＭＳ測定のために用いた。
【００６９】
１２−２−２ビシナルジオールを部分構造を有するビタミンＤ₃代謝物に対するボロン酸誘導体化
ボロン酸化合物（実施例３〜１１において合成した化合物）５μgをピリジン５０μlに溶解し、これに実験例１に示す操作により得たヒト血清試料を加え５０℃にて１時間攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧下にて留去し、得られた残渣をアセトニトリル４０μlに溶解して、そのうちの１０μlをＬＣ／ＭＳ測定のために用いた。
【００７０】
１２−２−３カテコール部分構造を有するステロイド化合物に対するボロン酸誘導体化
上記実施例２と同様の操作により、カテコール部分構造を有するステロイド化合物のボロン酸誘導体化反応及び後処理を行い、カテコール部分構造を有するステロイド化合物のボロン酸誘導体が含まれる残渣を得た。これをアセトニトリル４０μlに溶解して、そのうちの１０μlをＬＣ／ＭＳ測定のために用いた。
【００７１】
１２−３被検物質の測定
ＬＣ／ＭＳ（ＭＳ）は、jasco pu-980クロマトグラフに接続したliquid chromatograph-ion trap-mass spectrometer ThermoQuest LCQを用い、ＡＰＣＩ条件にて測定した。カラムはJ'sphere ODS H-80(YMC製。４μm，１５０×４．６mm i.d.。）を用い、Flow Rateは１ml/min.、温度は４０℃とした。ＭＳ／ＭＳ分析においては、ヘリウムをCollision Gasとして用いた。Capillary Voltage及びTube Lens Offset Voltageは、ヒドラジン誘導体についてはそれぞれ−１０Ｖ及び−１５Ｖとし、ボロン酸誘導体についてはそれぞれ−３Ｖ及び−１５Ｖとした。また、両誘導体とも負イオン且つZoomScanモードにて測定した。その他のＭＳ測定条件及び各被検物質の移動相については、表１〜表３に記載した。
【００７２】
各被検物質の測定結果を下記表１〜表３に示す。
【００７３】
【表１】

【００７４】
【表２】

【００７５】
【表３】

【００７６】
また、図１にテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン及びプレグネノロンについてのクロマトグラム及びマススペクトルを示し、図２に２４，２５−（ジヒドロキシ）ビタミンＤ₃についてのクロマトグラム及びマススペクトルを示す。
【００７７】
本発明により、負イオン検出ＡＰＣＩ−ＭＳを用いたステロイド性生体内微量物質の測定感度が従来の方法に比較して５〜２２５倍上昇し、ステロイド性生体内微量物質の測定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン及びプレグネノロンをそれぞれ２−ニトロ−４−トリフルオロメチルヒドラジニル化し、ＬＣ／負イオン検出ＡＰＣＩ−ＭＳにより測定した時のクロマトグラム及びマススペクトルである。
【図２】図２は、２４，２５−（ジヒドロキシ）ビタミンＤ₃を〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニル化し、ＬＣ／負イオン検出ＡＰＣＩ−ＭＳにより測定した時のクロマトグラム及びマススペクトルである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention introduces a compound having an electron affinity atomic group into a steroidal in vivo trace substance in a sample, and measures the in vivo trace substance by a negative ion APCI-MS method (negative ion atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry). The present invention relates to a reaction method, a reaction product used for the measurement, and a reagent for the measurement.
[0002]
[Prior art]
Vitamin D_ThreeSteroid hormones including metabolites (9,10-secosteroids) exhibit a strong physiological action in a very small amount in vivo. Understanding the in vivo levels of these steroid hormones is extremely important for clinical diagnosis and pathological analysis. However, these in vivo concentrations are extremely low, and structurally similar compounds coexist. High sensitivity and specificity are required.
[0003]
Conventionally, measurement of these in vivo steroid hormones has been carried out mainly using LC (Liquid Chromatography: liquid chromatography), but there are many cases where practically sufficient sensitivity cannot be obtained.
[0004]
In recent years, it has been proposed that a method combining LC and APCI-MS (Atmospheric Pressure Chemical Ionization-based Mass Spectrometry), that is, LC / APCI-MS is useful in terms of specificity and versatility (non-patent literature). 1).
However, even in the method using LC / APCI-MS, sufficient sensitivity could not be obtained due to the low ionization efficiency of the steroid hormone compound itself.
[0005]
Furthermore, a method combining LC and ESI (Electro Spray Ionization) -MS has been carried out, but this method is effective for polar compounds, but many steroid hormones have only a few polar groups. This method was not very practical because it was not done.
[0006]
Recently, it has been shown in a measurement using positive ion detection APCI-MS that a derivative obtained by introducing an electron affinity atomic group into a steroid compound can be detected with high sensitivity (see Non-Patent Documents 2-4). On the other hand, it is generally known that the negative ion mode APCI-MS has low background noise. In the measurement using the negative ion mode APCI-MS, if an electron affinity atomic group is introduced into the steroid compound, It is considered that further enhancement of sensitivity can be expected.
However, until now, only an example of pentafluorobenzylation (see Non-Patent Document 5) is known for introduction of an electron affinity group for negative ion detection APCI-MS. No consideration has been made.
[0007]
[Non-Patent Document 1]
K. Shimada, et al .: J. Chromatogr. A., 2001 (935), 141
[Non-Patent Document 2]
T. Higashi et al .; Biomed. Chromatogr., 2001 (15), 133.
[Non-Patent Document 3]
T. Higashi et al .; J. Chromatogr. B, 2002 (772), 229.
[Non-Patent Document 4]
K. Shimada et al .; J. Chromatogr. B, 1998 (714), 153.
[Non-Patent Document 5]
G. Singh, et al .; Anal. Chem., 2000 (72), 3007
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to introduce a compound having an electron affinity atomic group into a steroidal in vivo trace substance in measurement of the steroidal in vivo trace substance using negative ion APCI-MS. It is to provide a method for measuring a substance with high sensitivity. Another object of the present invention is to introduce an ionization reagent containing a compound for enhancing measurement sensitivity in measurement of a steroidal in vivo trace substance using negative ion APCI-MS, and the compound into the steroidal in vivo trace substance. It is to provide a compound. Furthermore, the objective of this invention is providing the reagent for the measurement of the steroidal in-vivo trace substance using negative ion APCI-MS.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have intensively studied to increase the measurement sensitivity in the measurement of steroidal in vivo trace substances using negative ion detection APCI-MS. Surprisingly, a specific electron affinity atomic group was found. When it introduce | transduced into the steroidal in-vivo trace substance, it discovered that the measurement sensitivity rose several to 200 times or more. In addition, this measurement sensitivity was 7 times higher at the maximum even when compared with the case where a known electron affinity atomic group, that is, a pentafluorobenzyl group was introduced. The present inventors have further studied based on these findings and completed the present invention.
[0010]
Thus, according to the present invention, in the LC / MS measurement of steroidal in vivo trace substances, the following steps are performed:
i) Serum samples with the following formula (I):
[0011]
[Chemical 7]

[0012]
[In the formula, R¹, R²And R^ThreeAre H and CF respectively_ThreeOr NO₂Represents)
Or a compound of the following formula (II):
[0013]
[Chemical 8]

[0014]
[In the formula, Ar represents the following formula:
[0015]
[Chemical 9]

[0016]
(Wherein R¹, R²And R^ThreeHas the aforementioned meanings)
Represents a 3,5-dinitro-2-pyridyl group or a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl group]
The compound of the following formula (III)
[0017]
[Chemical Formula 10]

[0018]
[In the formula, R¹, R²And R^ThreeHas the above-mentioned meaning, and St represents a moiety obtained by removing an oxo group from a steroid compound having an oxo group.
Or a reaction product represented by the following formula (IV):
[0019]
Embedded image

[0020]
[Wherein Ar has the above-mentioned meaning,
[0021]
Embedded image

[0022]
Vitamin D with vicinal diol partial structure_Three(Represents a part obtained by removing the vicinal diol part from a metabolite or a part obtained by removing the catechol part from a steroid compound having a catechol part structure)
A step of producing a reaction result body represented by
ii) measuring the reaction product using LC / negative ion APCI-MS;
A method for measuring a steroidal in vivo trace substance is provided.
[0023]
The present invention also provides a compound represented by the formula (III) and a compound represented by the formula (IV).
[0024]
Furthermore, according to the present invention, a sensitive detection comprising a compound of formula (I) or a compound of formula (II) for mass spectrometry (MS), more preferably LC / MS analysis. An ionization reagent is provided.
[0025]
In addition, according to the present invention, there are provided the ionization reagent in which the analysis target is a steroidal in vivo trace substance, and the ionization reagent in which the LC / MS analysis is negative ion APCI-MS.
[0026]
The ionization reagent of the present invention can be used not only for the APCI method but also for mass spectrometry using other ionization methods such as the ESI method and the CF-FAB (continuous flow fast atom bombardment) method.
[0027]
As used herein, the term “steroidal in vivo trace substance” means a steroid compound and vitamin D._ThreeIt means an analog. Therefore, steroidal in vivo trace substances include, for example, steroid compounds such as testosterone, dihydrotestosterone, dehydroepiandrosterone, pregnenolone, estrone, 2-hydroxyestradiol, 4-hydroxyestradiol, 2-hydroxyestrone, 4-hydroxyestrone. And 24,25- (dihydroxy) vitamin D_Three1,24,25- (Trihydroxy) vitamin D_ThreeVitamin D such as_ThreeAnalogs can be mentioned.
[0028]
The method for preparing a serum sample used in the present invention will be described in detail in the following experimental examples, but any serum sample purified by a general preparation method can be used in the present invention.
[0029]
In this specification, R¹, R², R^ThreeAre H and CF respectively_ThreeOr NO₂Represents.
[0030]
Examples of the compound of the formula (I) that can be used in the present invention include the following.
2-Nitrophenylhydrazine
2,4-dinitrophenylhydrazine
2,4,6-trinitrophenylhydrazine
2-Nitro-6-trifluoromethylphenylhydrazine
2-nitro-4-trifluoromethylphenylhydrazine
4-nitro-2-trifluoromethylphenylhydrazine
2,4-dinitro-6-trifluoromethylphenylhydrazine
In addition, in this specification, although a compound name is described using a general name partially as a general rule, about a compound which cannot be expressed using a general name, it describes with a chemical name.
[0031]
Among the compounds of the formula (I), preferred compounds include the following.
2-nitro-4-trifluoromethylphenylhydrazine
2,4-dinitrophenylhydrazine
2,4-dinitro-6-trifluoromethylphenylhydrazine
[0032]
Moreover, as a compound of the said formula (II) which can be used for this invention, the following can be mentioned, for example.
[3- (4-Nitrophenyl) aminophenyl] dihydroxyborane
[3- (2,4-Dinitrophenyl) aminophenyl] dihydroxyborane
[3- (2,4,6-trinitrophenyl) aminophenyl] dihydroxyborane
4- [N- (3-dihydroxyboryl) phenyl] amino-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole
[3- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] dihydroxyborane
[3- (4-Nitro-2-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] dihydroxyborane
[3- (2,4-Dinitro-6-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] dihydroxyborane
[3- (2,4-Dinitropyridyl) aminophenyl] dihydroxyborane
[3- (2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl) aminophenyl] dihydroxyborane
[0033]
Of the compounds of the formula (II), preferred are the following compounds.
[3- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] dihydroxyborane
[3- (2,4-Dinitro-6-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] dihydroxyborane
[3- (2,4-Dinitrophenyl) aminophenyl] dihydroxyborane
[0034]
Furthermore, the moiety represented by St in the formula (III) is a part obtained by removing the oxo group from each of testosterone, dihydrotestosterone, dehydroepiandrosterone and pregnenolone, and preferably, the oxo group is respectively removed from testosterone and dihydrotestosterone. Excluded part.
[0035]
In the formula (IV),
[0036]
Embedded image

[0037]
Is represented by 24,25- (dihydroxy) vitamin D_ThreeAnd 1,24,25- (trihydroxy) vitamin D_ThreeAnd a portion obtained by removing the catechol moiety from 2-hydroxyestradiol, 4-hydroxyestradiol, 2-hydroxyestrone and 4-hydroxyestrone, preferably 24,25- (dihydroxy) Vitamin D_ThreeAnd a portion obtained by removing the catechol moiety from 2-hydroxyestradiol and 4-hydroxyestradiol.
[0038]
Examples of the compound of the formula (III) provided by the present invention include the following.
3- (2-Nitrophenyl) hydrazinyl testosterone
3- (2,4-Dinitrophenyl) hydrazinyl testosterone
3- (2,4,6-trinitrophenyl) hydrazinyl testosterone
3- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) hydrazinyl testosterone
3- (2-Nitro-6-trifluoromethylphenyl) hydrazinyl testosterone
3- (4-Nitro-2-trifluoromethylphenyl) hydrazinyl testosterone
3- (2,4-Dinitro-6-trifluoromethylphenyl) hydrazinyl testosterone
3- (2-Nitrophenyl) hydrazinyl dihydrotestosterone
3- (2,4-Dinitrophenyl) hydrazinyl dihydrotestosterone
3- (2,4,6-trinitrophenyl) hydrazinyl dihydrotestosterone
3- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) hydrazinyl dihydrotestosterone
3- (2-Nitro-6-trifluoromethylphenyl) hydrazinyl dihydrotestosterone
3- (4-Nitro-2-trifluoromethylphenyl) hydrazinyl dihydrotestosterone
3- (2,4-Dinitro-6-trifluoromethylphenyl) hydrazinyl dihydrotestosterone
20- (2-Nitrophenyl) hydrazinylpregnenolone
20- (2,4-dinitrophenyl) hydrazinylpregnenolone
20- (2,4,6-trinitrophenyl) hydrazinylpregnenolone
20- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) hydrazinylpregnenolone
20- (2-Nitro-6-trifluoromethylphenyl) hydrazinylpregnenolone
20- (4-Nitro-2-trifluoromethylphenyl) hydrazinylpregnenolone
20- (2,4-Dinitro-6-trifluoromethylphenyl) hydrazinylpregnenolone
17- (2-Nitrophenyl) hydrazinyl dehydroepiandrosterone
17- (2,4-dinitrophenyl) hydrazinyl dehydroepiandrosterone
17- (2,4,6-trinitrophenyl) hydrazinyl dehydroepiandrosterone
17- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) hydrazinyl dehydroepiandrosterone
17- (2-Nitro-6-trifluoromethylphenyl) hydrazinyl dehydroepiandrosterone
17- (4-Nitro-2-trifluoromethylphenyl) hydrazinyl dehydroepiandrosterone
17- (2,4-dinitro-6-trifluoromethylphenyl) hydrazinyl dehydroepiandrosterone
[0039]
Of the compounds of the formula (III), preferred compounds include the following.
3- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) hydrazinyl testosterone
3- (2,4-Dinitrophenyl) hydrazinyl testosterone
3- (2,4-Dinitro-6-trifluoromethylphenyl) hydrazinyl testosterone
3- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) hydrazinyl dihydrotestosterone
3- (2,4-Dinitrophenyl) hydrazinyl dihydrotestosterone
3- (2,4-Dinitro-6-trifluoromethylphenyl) hydrazinyl dihydrotestosterone
20- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) hydrazinylpregnenolone
20- (2,4-dinitrophenyl) hydrazinylpregnenolone
20- (2,4-Dinitro-6-trifluoromethylphenyl) hydrazinylpregnenolone
17- (2,4-dinitrophenyl) hydrazinyl dehydroepiandrosterone
17- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) hydrazinyl dehydroepiandrosterone
17- (2,4-dinitro-6-trifluoromethylphenyl) hydrazinyl dehydroepiandrosterone
[0040]
Of the compounds of the formula (III), more preferred compounds include the following.
3- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) hydrazinyl testosterone
3- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) hydrazinyl dihydrotestosterone
20- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) hydrazinylpregnenolone
17- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) hydrazinyl dehydroepiandrosterone
[0041]
Examples of the compound of the formula (IV) provided by the present invention include the following.
24,25- [3- (4-Nitrophenyl) aminophenyl] boranyldioxyvitamin D_Three
24,25- [3- (2,4-dinitrophenyl) aminophenyl] boranyldioxyvitamin D_Three
24,25- [3- (2,4,6-trinitrophenyl) aminophenyl] boranyldioxyvitamin D_Three
24,25- [3- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boranyldioxyvitamin D_Three
24,25- [3- (2-Nitro-6-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boranyldioxyvitamin D_Three
24,25- [3- (4-Nitro-2-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boranyl dioxyvitamin D_Three
24,25- [3- (2,4-Dinitro-6-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boranyldioxyvitamin D_Three
24,25- [3- (3,5-Dinitropyridin-2-yl) aminophenyl] boranyl dioxyvitamin D_Three
24,25- [3- (7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) aminophenyl] boranyl dioxyvitamin D_Three
1-hydroxy-24,25- [3- (4-nitrophenyl) aminophenyl] boranyl dioxyvitamin D_Three
1-hydroxy-24,25- [3- (2,4-dinitrophenyl) aminophenyl] boranyl dioxyvitamin D_Three
1-hydroxy-24,25- [3- (2,4,6-trinitrophenyl) aminophenyl] boranyl dioxyvitamin D_Three
1-hydroxy-24,25- [3- (2-nitro-4-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boranyl dioxyvitamin D_Three
1-hydroxy-24,25- [3- (2-nitro-6-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boranyldioxyvitamin D_Three
1-hydroxy-24,25- [3- (4-nitro-2-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boranyl dioxyvitamin D_Three
1-hydroxy-24,25- [3- (2,4-dinitro-6-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boranyl dioxyvitamin D_Three
1-hydroxy-24,25- [3- (3,5-dinitropyridin-2-yl) aminophenyl] boranyldioxyvitamin D_Three
1-hydroxy-24,25- [3- (7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) aminophenyl] boranyl dioxyvitamin D_Three
2,3- [3- (4-Nitrophenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
2,3- [3- (2,4-Dinitrophenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
2,3- [3- (2,4,6-trinitrophenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
2,3- [3- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
2,3- [3- (2-Nitro-6-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
2,3- [3- (4-Nitro-2-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
2,3- [3- (2,4-Dinitro-6-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
2,3- [3- (3,5-Dinitropyridin-2-yl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
2,3- [3- (7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (4-Nitrophenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (2,4-dinitrophenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (2,4,6-trinitrophenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (2-Nitro-6-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (4-Nitro-2-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (2,4-dinitro-6-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (3,5-Dinitropyridin-2-yl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
2,3- [3- (4-Nitrophenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
2,3- [3- (2,4-Dinitrophenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
2,3- [3- (2,4,6-trinitrophenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
2,3- [3- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
2,3- [3- (2-Nitro-6-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
2,3- [3- (4-Nitro-2-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
2,3- [3- (2,4-Dinitro-6-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
2,3- [3- (3,5-Dinitropyridin-2-yl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
2,3- [3- (7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (4-Nitrophenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (2,4-dinitrophenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (2,4,6-trinitrophenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (2-Nitro-6-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (4-Nitro-2-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (2,4-dinitro-6-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (3,5-Dinitropyridin-2-yl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
[0042]
Of the compounds of the formula (IV), the following compounds are preferred. 24,25- [3- (2,4-dinitrophenyl) aminophenyl] boranyldioxyvitamin D_Three
24,25- [3- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boranyldioxyvitamin D_Three
24,25- [3- (2,4-Dinitro-6-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boranyldioxyvitamin D_Three
1-hydroxy-24,25- [3- (2,4-dinitrophenyl) aminophenyl] boranyl dioxyvitamin D_Three
1-hydroxy-24,25- [3- (2-nitro-4-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boranyl dioxyvitamin D_Three
1-hydroxy-24,25- [3- (2,4-dinitro-6-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boranyl dioxyvitamin D_Three
2,3- [3- (2,4-Dinitrophenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
2,3- [3- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
2,3- [3- (2,4-Dinitro-6-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (2,4-dinitrophenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (2,4-dinitro-6-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
2,3- [3- (2,4-Dinitrophenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
2,3- [3- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
2,3- [3- (2,4-Dinitro-6-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (2,4-dinitrophenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (2,4-dinitro-6-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
[0043]
Of the compounds of formula (IV), the following compounds are more preferred.
24,25- [3- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boranyldioxyvitamin D_Three
1-hydroxy-24,25- [3- (2-nitro-4-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boranyl dioxyvitamin D_Three
2,3- [3- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-hydroxy-1,3,5 (10) -estraditriene
2,3- [3- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
3,4- [3- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boronyldioxy-17-oxo-1,3,5 (10) -estraditriene
[0044]
General LC and MS can be used for the measurement in the measurement method of the present invention.
Next, the method for producing the compound of the present invention and the measurement of steroidal in vivo trace substances using the method of the present invention are described.
[0045]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Measurement of steroidal compounds with oxo groups
The compound of the formula (I) in the present invention can be easily synthesized from a commercially available raw material by a substitution reaction with hydrazine. Moreover, the serum sample in the present invention can be easily prepared by a conventional method.
That is, the serum sample in the present invention is obtained by separating serum from the collected whole blood and then purifying it using a commercially available cartridge (for example, OASIS HLB (registered trademark) cartridge or Bond ELUT Si (registered trademark) cartridge). Can be prepared.
[0046]
The serum sample in the present invention is suspended in an alcohol such as ethanol, and this is reacted with the hydrazine compound of the above formula (I) in the presence of an acidic catalyst such as trifluoroacetic acid or trichloroacetic acid. It can be derived into the compound of (III).
[0047]
The reaction temperature in the synthesis reaction to the compound of formula (III), that is, the hydrazine derivatization reaction, can be carried out at a temperature in the range of room temperature to 80 ° C., preferably in the range of 50 ° C. to 70 ° C. Is suitable. The hydrazine compound of the formula (I) can also be added directly or in the form of a solution of an inert organic solvent such as acetonitrile, ethanol, ethyl acetate or the like.
[0048]
In the hydrazine derivatization reaction, the hydrazine compound used in the serum sample can be used in an amount of 2 μg to 20 μg, preferably 4 μg to 10 μg, based on 200 μl of the serum sample.
[0049]
LC / negative ion APCI-MS measurement of the hydrazine derivative of the above formula (III) is carried out using general LC such as HP1100 manufactured by Hewlett Packerd or 2795 manufactured by Waters, and general MS such as QUATTRO manufactured by Micromass. II or QUATTRO MICRO manufactured by Micromass can be used.
[0050]
Vitamin D with vicinal diol partial structure _Three Derivative measurement
The compound of formula (II) in the present invention can also be easily synthesized from a commercially available raw material by a substitution reaction with aminophenyldihydroxyborane.
[0051]
Reacting the serum sample of the present invention with the dihydroxyborane compound of the formula (II) in an inert organic solvent such as acetonitrile, ethanol, pyridine and the like to induce the compound of the formula (IV). Can do.
[0052]
The reaction temperature in the synthesis reaction to the compound of formula (IV), that is, the boronic acid derivatization reaction, can be performed at a temperature in the range of room temperature to 70 ° C., preferably in the range of 40 ° C. to 60 ° C. The temperature is suitable.
[0053]
In the boronic acid derivatization reaction, the ratio of the boronic acid compound to the serum sample can be 2 μg to 20 μg, preferably 4 μg to 10 μg, with respect to 50 μl of the serum sample.
[0054]
LC / negative ion APCI-MS measurement of the hydrazine derivative of the formula (III) can be performed using general LC and MS.
The following examples illustrate the invention in more detail, but the invention is not limited thereto.
[0055]
【Example】
Example 1 Synthesis of 2-nitro-4-trifluoromethylphenylhydrazine (2NFPH)
100 μl of 4-fluoro-3-nitrobenzotrifluoride is dissolved in 1 ml of acetonitrile, 110 μl of 80% hydrazine hydrate is added and stirred at room temperature for 15 minutes. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, ethyl acetate was added thereto, washed with water, and dried over anhydrous sodium sulfate. The solvent was distilled off under reduced pressure, and the resulting crude crystals were recrystallized twice from MeOH to obtain 2-nitro-4-trifluoromethylphenylhydrazine as orange needles (quantitative).
Melting point: 116-116.5 ° C
ESI-MS: m / z 220.0 [MH]^-
In the same manner as in Production Example 1, the following compound of Example 2 was synthesized.
[0056]
Example 2 Synthesis of 2,4-dinitro-6-trifluoromethylphenylhydrazine (DNFPH)
Yellow needles
Yield: quantitative
Melting point: 140.5-141.5 ° C
ESI-MS: m / z 265.0 [M-H]^-
[0057]
Example 3 Synthesis of [3- (4-nitrophenyl) aminophenyl] dihydroxyborane (NP-APB)
0.3 ml of 4-fluoronitrobenzene and 50 mg of aminophenyldihydroxyborane were added to 2 ml of a mixed solution of dimesyl sulfoxide: 1M aqueous sodium carbonate = 1: 1 and stirred at 70 ° C. for 6 hours. The reaction mixture was extracted with ethyl acetate, washed with water, and dried over anhydrous sodium sulfate. The solvent was distilled off under reduced pressure, and the resulting residue was purified by silica gel column chromatography (chloroform: methanol = 20: 1) to obtain a yellow solid of the title compound (quantitative).
ESI-MS: m / z 257.3 [M-H]^-
In the same manner as in Example 3, the following compounds of Examples 4-11 were synthesized.
[0058]
Example 4 [3- (2,4-Dinitrophenyl) aminophenyl] dihydroxyborane (DNP-APB)
Orange solid
Starting material: 2,4-dinitrofluorobenzene
Yield: quantitative
ESI-MS: m / z 302.2 [MH]^-
[0059]
Example 5 [3- (2,4,6-Trinitrophenyl) aminophenyl] dihydroxyborane (TNP-APB)
Brown solid
Starting material:

sodium

2,4,6-trinitrobenzenesulfonate dihydrate
Yield: quantitative
ESI-MS: m / z 347.2 [M-H]^-
[0060]
Example 6 4- [N- (3-Dihydroxyboryl) phenyl] amino-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (DNB-APB)
Brown solid
Starting material: 4-chloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole
Yield: quantitative
ESI-MS: m / z 299.2 [M−H]^-
[0061]
Example 7 [3- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] dihydroxyborane (2NFP-APB)
Yellow solid
Starting material: 4-fluoro-3-nitrobenzotrifluoride
Yield: quantitative
ESI-MS: m / z 325.2 [M−H]^-
[0062]
Example 8 [3- (4-Nitro-2-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] dihydroxyborane (4NFP-APB)
Yellow solid
Starting material: 2-fluoro-5-nitrobenzotrifluoride
Yield: quantitative
ESI-MS: m / z 325.2 [M−H]^-
[0063]
Example 9 [3- (2,4-Dinitro-6-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] dihydroxyborane (DNFP-APB)
Orange solid
Starting material: 2-chloro-3,5-dinitrobenzotrifluoride
Yield: quantitative
ESI-MS: m / z 370.2 [M-H]^-
[0064]
Example 10 [3- (2,4-Dinitropyridyl) aminophenyl] dihydroxyborane (DNPy-APB)
Orange solid
Starting material: 2-chloro-3,5-dinitropyridine
Yield: quantitative
ESI-MS: m / z 303.2 [MH]^-
[0065]
Example 11 [3- (2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl) aminophenyl] dihydroxyborane (PFB-APB)
Colorless solid
Starting material: 2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl bromide
Yield: quantitative
ESI-MS: m / z 316.2 [M-H]^-(30%), 348.1 [M−H + O₂]^-(100%)
[0066]
Example 12 Measurement of trace substances in vivo in human serum samples
12-1 Preparation of human serum sample
200 μl of acetonitrile was added to 200 μl of a serum sample obtained from human whole blood, mixed for 30 seconds, and centrifuged at 1,500 × g and 4 ° C. for 10 minutes. The supernatant was separated and diluted with 2 ml of water, and then passed through an OASIS HLB cartridge (manufactured by Waters, washed through 2 ml of ethyl acetate, 2 ml of methanol and 2 ml of water before use). The cartridge was washed with 2 ml of water and 2 ml of a mixture of methanol: water = 7: 3, and then the test component was eluted with 1 ml of ethyl acetate.
[0067]
The obtained eluate was distilled off under reduced pressure, 0.2 ml of a hexane: ethyl acetate = 3: 1 mixture was added to the residue, and this suspension was bonded to a Bond Elut Si cartridge (manufactured by Varian. Before use). Washed through 4 ml of ethyl acetate and 4 ml of hexane). Further, the same operation was repeated with 0.2 ml of the same solution to fill the same cartridge. This cartridge was washed with 3 ml of hexane and 3 ml of a mixture of hexane: ethyl acetate = 3: 1, and then the test component was eluted from the cartridge with 3 ml of a mixture of hexane: ethyl acetate = 1: 3. This eluate was distilled off under reduced pressure to obtain a human serum sample.
[0068]
12-2-1 Hydrazine derivatization to oxosteroid compounds
A human serum sample obtained by the procedure shown in Experimental Example 1 was suspended in ethanol (20 μl), and in the presence of 0.5 mg of trichloroacetic acid, 5 μg of the hydrazine compound (the compound synthesized in Production Examples 1 and 2) was suspended. Acetonitrile 50 μl solution was added and stirred at 60 ° C. for 1 hour. After completion of the reaction, the solvent was distilled off under reduced pressure, and the resulting residue was dissolved in 40 μl of ethanol, 10 μl of which was used for LC / MS measurement.
[0069]
12-2-2 Vitamin D having a partial structure of vicinal diol_ThreeBoronic acid derivatization to metabolites
5 μg of a boronic acid compound (compound synthesized in Examples 3 to 11) was dissolved in 50 μl of pyridine, and a human serum sample obtained by the procedure shown in Experimental Example 1 was added thereto and stirred at 50 ° C. for 1 hour. After completion of the reaction, the solvent was distilled off under reduced pressure, and the resulting residue was dissolved in 40 μl of acetonitrile, and 10 μl of this was used for LC / MS measurement.
[0070]
12-2-3 Boronic acid derivatization of steroid compounds with catechol partial structure
By the same operation as in Example 2 above, a boronic acid derivatization reaction and post-treatment of a steroid compound having a catechol partial structure were performed to obtain a residue containing a boronic acid derivative of a steroid compound having a catechol partial structure. This was dissolved in 40 μl of acetonitrile, 10 μl of which was used for LC / MS measurement.
[0071]
12-3 Measurement of test substance
LC / MS (MS) was measured under APCI conditions using a liquid chromatograph-ion trap-mass spectrometer ThermoQuest LCQ connected to a jasco pu-980 chromatograph. The column used was J'sphere ODS H-80 (manufactured by YMC. 4 μm, 150 × 4.6 mm i.d.), the flow rate was 1 ml / min., And the temperature was 40 ° C. In MS / MS analysis, helium was used as Collision Gas. The Capillary Voltage and Tube Lens Offset Voltage were -10V and -15V for the hydrazine derivative, and -3V and -15V for the boronic acid derivative, respectively. Both derivatives were measured in negative ion and ZoomScan mode. Other MS measurement conditions and the mobile phase of each test substance are shown in Tables 1 to 3.
[0072]
The measurement results of each test substance are shown in Tables 1 to 3 below.
[0073]
[Table 1]

[0074]
[Table 2]

[0075]
[Table 3]

[0076]
FIG. 1 shows chromatograms and mass spectra for testosterone, dehydroepiandrosterone and pregnenolone, and FIG. 2 shows 24,25- (dihydroxy) vitamin D._ThreeThe chromatogram and mass spectrum for are shown.
[0077]
According to the present invention, the measurement sensitivity of a steroidal in vivo trace substance using negative ion detection APCI-MS is increased by 5 to 225 times compared to the conventional method, and the steroidal in vivo trace substance can be measured.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows chromatograms and mass spectra when testosterone, dehydroepiandrosterone and pregnenolone are each 2-nitro-4-trifluoromethylhydrazinylated and measured by LC / negative ion detection APCI-MS. It is.
FIG. 2 shows 24,25- (dihydroxy) vitamin D_Three[3- (2-Nitro-4-trifluoromethylphenyl) aminophenyl] boranylation of the product and LC / negative ion detection APCI-MS measured chromatogram and mass spectrum.

Claims

In LC / MS measurement of steroidal in vivo trace substances, the following steps are performed:
i) Serum sample

[Wherein R ¹ , R ² and R ³ each independently represent H, CF ₃ or NO ₂ ]
Or the following formula

[In the formula, Ar represents the following formula:

(Wherein R ¹ , R ² and R ³ have the above-mentioned meanings)
Represents a 3,5-dinitro-2-pyridyl group or a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl group]
The compound of

[Wherein R ¹ , R ² and R ³ have the above-mentioned meanings, and St represents a moiety obtained by removing an oxo group from a steroid compound having an oxo group]
The reaction results indicated by or the following formula

[Wherein Ar has the above-mentioned meaning,

Represents a portion obtained by removing the diol portion from a vitamin D ₃ metabolite having a vicinal diol partial structure or a portion obtained by removing the catechol portion from a steroid compound having a catechol partial structure.
A step of producing a reaction result body represented by
ii) A method for measuring a steroidal in vivo trace substance, comprising the step of measuring the reaction product using LC / negative ion APCI-MS.

A compound represented by the formula (III) of claim 1.

A compound represented by formula (IV) according to claim 1.

An ionization reagent for high-sensitivity detection, comprising a compound represented by formula (I) of claim 1 or a compound represented by formula (II) of claim 1 for mass spectrometry.

The ionization reagent of Claim 4 whose analysis object is a steroidal in-vivo trace substance.

The ionization reagent of Claim 4 or 5 whose mass spectrometry is negative ion APCI-MS.