JP3682974B2 - Compounds, compositions, and methods for binding bioactive substances to bioparticle surface membranes - Google Patents

Description

ここでＢは治療上有効な物質で構成されるバイオ作用性成分を表し、ＲおよびＲ₁は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、あるいはアルアルキル基から独立に選択した置換基を表し、その炭化水素鎖は直線状または分岐状であり、一つまたはそれ以上の非極性官能基によって脱置換あるいは置換され、ＲおよびＲ₁の少なくとも一方は炭化水素置換基で構成され、その鎖の長さは、膜結合能力を化合物に提供するのに有効なだけの長さを備え、Ｒ₂はスペーサ成分を表し、ｎは０または１であり、Ｌは、ｎ＝０のときに非芳香族結合成分であるという条件下で、ｎ＝０のときにＢとＲおよびＲ₁の少なくとも一方との間、またｎ＝１のときにＲ₂とＲおよびＲ₁の少なくとも一方との間に安定した結合を提供する結合成分を表す。
ここで使用する”非極性官能基”という表現は、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ハロゲン、Ｎ（アルキル）₂、Ｓｅ−アルキル、ＮＯ₂、ＣＮ、ＣＯ−アルキル、Ｓｉ（アルキル）₃、Ｏ−Ｓｉ（アルキル）₃、および同様のものを指す。
結合成分（Ｌ）は、飽和あるいは非飽和脂肪族リンカーまたは脂環、芳香族を含む環構造であり、それは単環式、多環式、単素環式、複素環式、溶解あるいは非溶解でありうる。
好ましくは、結合成分は発色団である。本発明の化合物への発色団の結合は、ｉｎ ｖｉｖｏでの化合物の追跡を促進する。この目的に有効な発色団には、シアニン、アクリジン、ピリジン、キノリン、キサンテン、フェノキサジン、フェノチアジン、およびジフェニルヘキサトリエン色素とその誘導体が含まれる。
本発明の範囲内の好ましい化合物の種類は、以下の式で与えられる：

ここでＢはバイオ作用性物質を表し、ＲおよびＲ₁は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、あるいはアルアルキル基から独立に選択した置換基を表し、その炭化水素鎖は１個から３０個の炭素原子を備え、直線状または分岐状であり、前記置換基は一つまたはそれ以上の非極性官能基によって非置換あるいは置換され、Ｒ₂は次の式のスペーサ成分を表す：

ここでＲ₃は脂肪族炭化水素を表し、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆およびＲ₇は脂肪族、脂環式または芳香族炭化水素、複素環式またはＣＨ₂Ｃ（ＣＯ₂Ｈ）＝ＣＨで構成される基の中から独立に選択し、

はアミド、チオ尿素、ヒドラゾン、アシルヒドラゾン、ケタール、アセタール、オルトエステル、エステル、無水物、ジスルフィド、尿素、カルバミン酸塩、イミン、アミン、エーテル、炭酸塩、チオエーテル、スルホンアミド、カルボニル、アミジンおよびトリアジン結合で構成される官能結合基から独立に選択したものである；

は、さらに独立に原子価結合を表すことができ、脂肪族または脂環式炭化水素は１個から１２個の直線状炭素原子を備え、芳香族炭化水素は６個から１２個の炭素原子を備える；ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓおよびｔはそれぞれ０または１である。
ＸおよびＸ₁は同一または異なる値をとることができ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（ＣＨ₃）₂またはＳｅを表す；
Ｙは、＝ＣＲ₈、＝ＣＲ₈−ＣＲ₈＝ＣＲ₈−、＝ＣＲ₈−ＣＲ₈＝ＣＲ₈−ＣＲ₈＝ＣＲ₈−、あるいは＝ＣＲ₈−ＣＲ₈＝ＣＲ₈−ＣＲ₈＝ＣＲ₈−ＣＲ₈＝ＣＲ₈−から選択した結合基を表し、ここでＲ₈はＨ、ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＨ₃、ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃、あるいはＣＨ（ＣＨ₃）₂から選択する；
Ｚは、Ｈ、アルキル、ＯＨ、−Ｏ−アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ₂、ＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂ＮＨ₂、ＣＯＮＨ−アルキル、ＣＯＮ−（アルキル）₂、ＮＨ−アシル、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）₂、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＮＯ₂、ハロゲン、Ｓｉ（アルキル）₃、あるいはＯ−Ｓｉ（アルキル）₃、Ｓｎ（アルキル）₃、またはＨｇ−ハロゲン基から選択した置換基を表し、前記Ｚ置換基で構成されるアルキル基は１個から４個の炭素原子を備える；さらに、Ａは生物学的に適合しうる陰イオンを表す。高度に安定な生体膜結合を必要とする適用のためには、式（ＩＩ）のＲおよびＲ₁の一方が少なくとも１２個の炭素原子を備え、ＲおよびＲ₁の直線状炭素原子の合計が少なくとも２３個になるようにしなければならない。
様々なスペーサ成分（Ｒ₂）は、既知の合成方法に従って、シアニン頭部基とバイオ作用性成分の間で、頭部基とバイオ作用性成分のどちらか一方あるいは両方に存在する適切な官能基を介して容易に結合することができる。このような目的のために、種類の異なる多数の生体機能（ホモ生体機能とヘテロ生体機能）スペーサ試薬が技術文献に報告されてきた。Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．、９１：５８０〜６０９（１９８３）を参照。これらのスペーサ成分は反応基の種類、疎水性、親水性、長さ、および反応基を結合している構造が切断可能か、切断不可能かによって異なっている。
上述のように、スペーサ基の官能結合は、アミド（−ＮＨＣＯ−）、チオ尿素（−ＮＨＣＳＮＨ−）、ヒドラゾン（＝ＮＨＮ−）、アシルヒドラゾン（＝ＮＨＮＣＯ−）、ケタール（−Ｏ−Ｃ（アルキル）₂−Ｏ−）、アセタール（−Ｏ−ＣＨ（アルキル）−Ｏ−）、オルトエステル（−Ｃ（Ｏ−アルキル）₂−Ｏ−）、エステル（−ＣＯＯ−）、無水物（−ＣＯＯＣＯ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、尿素（−ＮＨＣＯＮＨ−）、カルバミン酸塩（−ＮＨＣＯ₂−）、イミン（＝Ｎ−）、アミン（−ＮＨ−）、エーテル（−Ｏ−）、炭酸塩（−Ｏ−ＣＯ₂−）、チオエーテル（−Ｓ−）、スルホンアミド（−ＳＯ₂−ＮＨ−）、カルボニル（−ＣＯ−）、およびアミジン（−ＮＨＣ＝（ＮＨ_▲＋▼−））にすることができる。
放射線治療のための好ましい実施例では、Ｂは特にレニウムまたはイットリウムのような放射性金属との錯体をなすキレート薬を表す。化学療法のための好ましい実施例では、Ｂはヘパリン、ヒルジン、コルヒチン、ビンブラスチンあるいはその類似体を表し、それらのすべては抗増殖薬である。化学療法のための他の好ましい実施例では、Ｂはペプチドを表す。上記の式ＩＩに含まれる、物質Ｐとして知られるペプチドの誘導体が赤血球に安定して結合し、自由、すなわち非抱合体のペプチドに比べて循環における治療効果の引き延ばしを提供することが見出された。非抱合体の形では循環において比較的短寿命であるような他の治療上有効な物質に対し、同様に生物学的利用能の増大を実現できることが期待されている。
例えば組み合わせ治療および組み合わせ診断のような、本発明の化合物の特定の適用では、式ＩのＢをビオチンにすることが有効である。
ＩＩＩ．本発明の化合物の調整
１．脂肪親和性に機能化したシアニン
上記の式（ＩＩ）の化合物は、以下の一般式に従う脂肪親和性シアニン前駆体から簡単に調整される：

ここでＲ、Ｒ₁、Ｘ、Ｘ₁、Ｙ、Ｚは、式ＩＩの化合物に関して上記で定義したものであり；さらに
Ｒ₂は次の式のスペーサ成分を表す：

ここでＲ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇、

ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔは、式ＩＩの化合物に関して上記で定義したものである；また
Ｗは、アミノ（−ＮＨ₂）、α−ハロアセトアミド（−ＮＨ ＣＯＣＨ₂−ｈａｌ）（ｈａｌ＝ハロゲン）、イソチオシアン酸塩（−ＮＣＳ）、ハロゲン、イソシアン酸塩（−ＮＣＯ）、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）、ヒドラジノ（−ＮＨＮＨ₂）、アシルヒドラジド（−ＣＯＮＨ−ＮＨ₂）、例えばベンゾフェノンなどのケトン（−ＲＣＯ）、ジチオピリジル（−ＳＳ−Ｃ₅Ｈ₅Ｎ）、水硫（−ＳＨ）、アルデヒド（−ＨＣＯ）、無水物（−ＣＯＯＣＯ−アルキル）、スクシンイミドエステル（−ＣＯＯＣ₄Ｈ₄ＮＯ₂）、水酸（−ＯＨ）、スルホニルハロゲン化物（−ＳＯ₂−ｈａｌ）、イミドエステル（−Ｃ（＝ＮＨ）ＯＣＨ₃）、エポキシド（−Ｃ₂Ｈ₃Ｏ）マレイミジル（−ＮＣＯＣＨ＝ＣＨＣＯ）およびアジド（−Ｎ₃）基から選択した反応性官能基を表す。
本発明の化合物の調整に適した前駆体は上記の式の置換基Ｗとして反応性アミン（ＮＨ₂）基を備え、様々な合成法に従って調整することができるが、その一つの方法を反応機構１で説明し、下記の例で詳細に考察する。
機構１に従い、ＧａｌｅとＷｉｌｓｈｉｒｅの方法（Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．、３０：６９３（１９７７））に従って２、３、３−（３Ｈ）−トリメチルインドレニン（市販品）をＮ−ヒドロキシメチルフタルアミド（市販品）と反応させ、化合物（１）を生成させ、これをさらに対応するアルコールと４−スルホン酸クロルベンゼン塩化物からＳｏｎｄｅｒｍａｎｎの方法（Ｌｉｅｂｉｇｓ Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．、７４９：１８３〜１９７（１９７１））によって調整したアルキル ４−スルホン酸クロルベンゼンと反応させ、中間物（２）を生成させる。基本的な手順に従って濃縮した塩酸中で加熱することによって（２）のフタルイミド保護基を除去して化合物（３）を生成し、続いてそれをギ酸メチルで処理して（４）を生成させる。２−メチル−ベンゾオキサゾール（市販品）あるいは２、３、３−（３Ｈ）トリメチルインドレニンとアルキル４−スルホン酸クロルベンゼンのどちらかによるアルキル化によって化合物（５）を調整する。その後化合物（５）を、米国特許番号２、６４７、０５４に記述されている方法と類似の方法を用いてＮ、Ｎ−ジフェニルホルムアミジン（市販品）と反応させることによって（６）を生成させる。次に、塩基（酢酸ナトリウムまたはトリエチルアミン）の存在下でアルコール中で撹拌することによって中間物（４）と（６）を混合し、（７）を生成させる。Ｄｈａｗａｎらの方法（Ｏｒｇｎ．Ｐｒｅｐ．ａｎｄ Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．、７（２）８５〜８８（１９７５））による（７）の脱保護化によって、アミノ誘導シアニン（８）を生成させる。
アミノシアニン（８）は、部位特異的薬物の供給に役立つ抱合体を生成するために、適切な官能基（例えばＣＯ、ＣＯＯＨ）を含む治療薬に直接結合させることができる。さらに、アミノシアニン（８）は、他のバイオ作用性成分と抱合体を作ることができる他の広範囲なシアニン誘導体の調整のために、非常に用途の広い中間物である。また、化合物（８）は多数のホモ−およびヘテロ−二官能スペーサ成分と反応して、脂肪親和性シアニン成分とそれに結合したバイオ作用性物質との間に分離を提供する用途には理想的な分子である。
結果として生じたシアニン誘導体上のアミン置換基は、周知の反応法を用いて他の官能基へ直接的に変換することができる。例えば、イソチオシアン酸官能基への変換は、Ｃｏｓｔａらの方法（Ｊ．ｏｆ Ｌａｂ．Ｃｏｍｐｄｓ．ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．、２７（９）：１０１５（１９８９））によって、チオホスゲンによる処理によって実現することができる。
アミン基と１、４−テレフタル酸ジ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応によって、ＯＯＣ−アリール−ＣＯＮＨ−アルキルスペーサ成分によるシアニン頭部基へのスクシンイミジル官能基の結合が提供される。結果として生じた化合物は、安定な結晶固体として分離および精製することができる。
ジメチルホルムアミド中における置換アミノ基のｐ−ニトロフェニルヨード酢酸塩（市販品）による単純なアシル化によって、アルキル−ＣＯＮＨ−アルキルスペーサ成分によってシアニン頭部基に結合した反応性ヨード置換基が提供される。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−３（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（市販品）によるアミン基の処理によって、ピリジルジチオ官能基とアルキル−ＣＯＮＨ−アルキルスペーサ成分を備えた化合物が提供される。
γ−チオブチロラクトンによるアミン基の処理によって、水硫官能基とアルキル−ＯＣＮＨ−アルキルスペーサ成分を備えた化合物が提供される。同様に、γ−ブチロラクトンによるアミン基の処理によって、水酸基とアルキル−ＣＯＮＨ−アルキルスペーサ成分を備えた化合物が提供される。
２．蛋白質／ペプチド脂肪親和性シアニン抱合体
上記に一般的に記述したように調整した脂肪親和性シアニン前駆体を、異なる数多くの合成法を用いて蛋白質またはペプチドに結合させ、式ＩＩの化合物を提供することができる。
上述したような脂肪親和性リンカー誘導体に対する蛋白質またはペプチドの結合は、蛋白質またはペプチド上に存在するアミン基（すなわち、末端α−アミノ基またはリシンのεアミノ基）を介して行うことができる。別の方法としては、蛋白質またはペプチドを適切なシアニン前駆体に結合するために、カルボキシル基またはチオール基（システイン残留物が存在する部分）を使用することができる。このような結合反応を実施するのに適した条件は、技術に精通した者にとって周知である。
ポリペプチドのα−アミノ基と脂肪親和性シアニン前駆体の抱合体のための一つの方法は、Ｗｅｔｚｅｌらの方法（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１、１１４（１９９０）による修正を用いるものである。これは、ｐＨ６におけるヨード酢酸無水物（市販品）を用いたポリペプチドのアシル化によってヨード酢酸アミド誘導体を形成し、次にそれを上述のように調整した水硫基−誘導脂肪親和性シアニン化合物と反応させ、優れた安定性を備えるチオエーテル結合形成を介して抱合体を形成することを含む。
リシンのε−脂肪族アミノ基を介した抱合体は、平衡によってアミンの限られた分画のみが脱プロトン化されて反応性となるような、ｐＨ８．５を超える点で最良の状態で達成される。このアミノ基は、上述したいくつかのアミノ反応性脂肪親和性リンカー化合物との高い反応性を備えなければならない。例えば、イソチオシアン酸誘導リンカー化合物は、水性条件下で高い安定性を示し、リシンの側鎖と反応してチオ尿素結合を介して結合した抱合体を形成することができる。
上述のＮ−ヒドロキシ−スクシンイミジルエステル誘導リンカー化合物は、このように形成されたアミド抱合体が非常に安定しているため、リシンとの反応にとって特に優れた試薬である。この反応は、この特殊な誘導体の水性条件下での加水分解は競合する副反応であるため、ジメチルホルムアミドのような有機溶媒中での無水条件下で実施することが好ましい。上記の式ＩＩＩのＮ−ヒドロキシ−スクシンイミジルエステル誘導リンカーをリシン残留物のアミノ基とｕｎｄｅｃａペプチド、物質Ｐの位置３で抱合させる反応については、以下に詳細に記述する。
ペプチドまたは蛋白質のＣ末端アミノ酸残留物上と同様、グルタミン酸とアスパラギン酸残留物の側鎖に存在するカルボキシル酸基は、上述のアミン誘導脂肪親和性シアニン化合物を用いた選択的抱合が可能な部位である。この反応は、ＨｏａｒｅとＫｏｓｈｌａｎｄの方法を修正したもの（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４２：２４４７〜２４５３（１９６７）に従って１−エチル−３−ジメチルアミノ−プロピルカルボジイミド（市販品）のような水溶性カルボジイミドを用いて実施することができ、あるいは、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４９：５４５２（１９７４）に記述された方法の修正に従って、Ｗｏｏｄ ｗａｒｄの試薬Ｋ、２−エチル−５−フェニル−イソオキサゾリウム−３−スルホン酸塩（市販品）を用いることによって実施することができる。その結果生じた抱合体を、安定なアミノ結合を介して結合する。
不活性な抱合体がつねに生じるため、官能基化した誘導体の、生物学的活動に必須のペプチドまたは蛋白質の反応基への結合は避けなければならない。しかし、脂肪親和性シアニン誘導体からペプチドまたは蛋白質を切断可能なスペーサ成分によって解放することができれば、この問題を解決することができる。
上述の化合物の脂肪親和性により、それらの一部は代表的な水性の緩衝系に十分溶解しない。薬物の可溶性あるいは活性のある立体配座を維持するために水性条件を必要とする抱合反応は、通常は有機溶媒で改良した水性溶媒中で実施する必要がある。ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、およびアルコールのような溶媒は水と混合することができ、脂肪親和性シアニン誘導体を可溶性にして目的の抱合体を生じさせるうえで有効である。
本発明の化合物は、形成した特定の化合物の大きさ、電荷、あるいは脂肪親和性を利用する各種の標準精製法によって精製することができる。ペプチドで構成される治療薬に特に有効な精製法は、Ｂｏｈｌｅｎらの方法である（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１６：３０６〜１０（１９８０）。
３．ビオチン化した脂肪親和性シアニン
本発明のビオチン化した脂肪親和性シアニン化合物は、好ましくは次の式で与えられる：

ここでＲ、Ｒ₁、Ｒ₈はすでに定義した通りであり、ｍは０から６の値をとる。このようなビオチン化した誘導体は、ビオチン反応、あるいは上記の式ＩＩＩの官能基化脂肪親和性シアニン化合物を用いたビオチン誘導体によって調整することができる。この反応に使用するビオチン誘導体は好ましくは次の式で与えられる：

ここでＥは、前記反応性官能基によって置換することができるレービル基を備える化合物の残留物を表し、Ｗおよびｍは、０、１、または２である。
例えば、反応機構１に従って調整した型のアミノ官能基化シアニン誘導体（８）を、Ｈｏｆｍａｎｎ、Ｆｉｎｎ、Ｋｉｓｏの方法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１００：３５８５（１９８７））に従って、市販のアミン反応性ビオチン誘導体、（＋）−ビオチン ４−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル ６−（ビオチンアミド）カプロン酸塩および６（（６（（ビオチノイル）−アミノ）ヘキサノイル）アミノ）カプロン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンンイミジルエステルと反応させ、上記の式ＩＶのビオチン−脂肪親和性シアニン抱合体を形成させることができるが、ここでそれぞれｍ＝０、１、２である。これらの抱合体は、ビオチン成分と抱合体の脂肪結合成分の間のスペーサ腕の長さが異なっている。このようなスペーサ腕の作用は、ビオチン化化合物の意図する適用によって重要となることがある。長いスペーサ腕は、アビジン中の”深い”ビオチン結合部位とビオチン抱合体を結合する能力にとって、有利な作用を備えることが示されている。
ｍａｌｅｉｍｉｄｏ、α−ヨードアセトアミド、ヒドラジノおよびアミノなどの反応性官能基との他の種類のビオチン誘導体は市販されており（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅａｇｅｎｔｓ、１９８９〜９１）、上述の様々な官能基化脂肪親和性リンカー化合物との結合に用いることができる。適切な反応機構は、技術に精通した者によって明らかである。
さらに、種類の異なる多数のスペーサ成分を、両者の前駆体上の適切な官能基によって、シアニンとビオチン成分の間に結合することができる。このようなスペーサの結合のための反応機構は、技術に精通した者には周知である。
４．放射性同位元素によって置換した脂肪親和性シアニン
放射性ハロゲン化シアニンの調整に役立ち、本発明の方法で有利に使用することができる脂肪親和性トリブチルチンの合成を反応機構２に示し、さらに下記の例で詳細に記述する。
反応機構２に従って、Ｂｌａｉｋｉｅら（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、３１３（１９２４））とＭｏｒｅａｕら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｃｈｉｍ．Ｔｈｅｒ．、９、（３）：２７４〜２８０（１９７４））によって記述された方法を用いてヨードアニリン（市販品）から調整した５−ヨード−２、３、３−トリメチル−（３Ｈ）−インドレニン（９）を、アルキル−４−クロルベンゼンスルホン酸塩（すでに記述したように調整）によってアルキル化して（１０）を生成させる。無水酢酸中で（１０）をＮ、Ｎ−ジフェニルホルムアミジンで処理し、次にビニル中間物（１１）を与える。次に、酢酸ナトリウムの存在下でエタノール中で撹拌して中間物（１１）と（５）（後者はすでに記述したように調整）を結合させる。この反応混合物を酢酸銀を用いて焼入れし、塩化ナトリウムを加えてインドシアニンを与える（１２）。次に、触媒、テトラキス−（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）の存在下でｂｉｓ−（トリ−ｎ−ブチルチン）を用いて（１２）を加熱することを含むＡｚｉｚｉａｎらの方法（Ｊ．Ｏｒｇａｎｏｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．、２１５：４９〜５８（１９８１））によって、（１２）から化合物（１３）を調整することができる。これに続いて、トリブチルスタニル誘導体（１３）を緩やかな条件下で、例えばＷｉｌｂｕｒらの方法を修正した方法（Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．、３０：２１６〜２２６（１９８９）によって、容易に放射性ハロゲン化することができる。さらに、Ｗｅｉｓｓらの方法（Ｊ．Ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｃｍｐｄｓ．＆Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＸＸＶＩ：１０９〜１０（１９８９）を変形した方法を使用して、（１２）への放射性ハロゲンの導入を達成することができる。
放射性ハロゲンの導入に使用することができる別の脂肪親和性シアニン誘導体は、Ｓｎ（Ｂｕ）₃基を−ＨｇＸ、で置換した（１３）の類似体であり、ここでＸはハロゲンを表す。化合物（１２）のハロゲン置換基の環の位置は、当然ながら適切に選択した開始物質に変更することができる。例えば、Ｂａｓｓｉｇｎａｎａらの方法（Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａ Ａｃｔａ．、１９（１１）、１８８５（１９６３））に従って調整した６−ヨード−メチルベンゾチアゾールを、対応する６−ヨード誘導体を提供するために使用することができる。
５．切断可能なコルヒチン−脂肪親和性シアニン抱合体
酸によって切断可能な結合を備えたコルヒチン−シアニン抱合体を、適切に官能基化した活性コルヒチン誘導体を選択することによって調整することができ（Ｂｒｏｓｓｉ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３３：２３１１、２３１９（１９９０）によって記述されたように行う）、シス−アコニチル、アセタール、オルトエステル、エステル、ケタール、無水物、あるいはヒドラゾンなどの結合を介して、適切に官能基化した脂肪親和性シアニン誘導体にそれを結合させることができる。
シス−アコニチル結合を介した結合は、Ｓｈｅｎらによって記述された方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１０２、３：１０４８〜１０５４（１９８１）を用いて実現することができる。この方法は、薬物（例えばデスアセチルコルヒチン）の遊離アミノ誘導体および脂肪親和性シアニンのアミノ型と、無水シス−アコニチル（市販品）との結合を含む。
アセタール、オルトエステル、またはケタール結合を介した結合は、Ｓｒｉｎｖａｓａｃｈａｒらによって記述された方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８、２５０１〜２５０９（１９８９））を修正して用いることによって、適切に官能基化したコルヒチンとシアニン誘導体によって達成することができる。
ヒドラゾン結合を介した結合は、Ｌａｇｕｚｚａらによって記述された方法（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３２：５４８〜５５５（１９８９））を修正して用いることによって実施することができる。この方法は、薬物のアルデヒド型と脂肪親和性シアニンのヒドラジド型との結合を含む。
本発明による切断可能なコルヒチン−シアニン抱合体の合成を反応機構３に示し、さらに下記の例で詳細に記述する。
機構３に従って、アミノ官能基化したシアニン（８）をグルタル酸（市販品）のモノメチルエステルと結合させ、メチルエステル誘導体（１４）を生成し、メタノール中でヒドラジンによって処理することによって、ヒドラジノ誘導体（１５）を提供する。
コルヒチン成分をデアセチルコルヒチン（市販品）で反応させて調整し、酸中間物を生成し、次にカルボニルイジイミダゾールの付加によってそれをｉｎ ｓｉｔｕで活性化し、アシルイミダゾールを形成させ、それをテトラブチル水素化ホウ素アンモニウムによって還元することによってアルコール（１７）を提供する。塩化クロム酸ピリジニウムによる（１７）の酸化によって７−Ｎ−（５−オキソペンタノイル）デアセチルコルヒチン（１８）を生成し、次にそれをヒドラジノ誘導体（１５）と結合させて、コルヒチンとシアニン成分が酸で切断可能なアシルヒドラゾン結合を介して結合した抱合体（１９）を与える。機構３で中間物として生成した７−Ｎ−（５−オキソペンタノイル）デアセチルコルヒチンは、本発明の一部を構成する新しい化合物である。必要な場合には、メチルチオ、または他のカルコゲンを含む基を、コルヒチンの核の位置１０の部分でメトキシ基に置換することができる。
さらに、デアセチルチオコルヒチン（Ｓｈｉａｎら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．、６４、６４６〜６４８（１９７５）によって記述されたように調整）から、機構３に示したアルデヒド（１８）の調整と同一の反応経過を用いて、より効果の大きな７−Ｎ−（５−オキソペンタノイル）デアセチルチオコルヒチン類似体を作ることができる。さらに、このチオコルヒチンの誘導体は、同一の結合条件を用いてヒドラジノ誘導体（１５）に対して結合させ、酸によって切断可能な抱合体を提供することもできる。
コルヒチン類似体を抱合体から放出させる動力学を、コルヒチンとシアニン成分の間のヒドラゾン結合の種類を変えることによって変更することができる。例えば、スルホニルフェニルヒドラゾンとフェニルヒドラゾン結合を介して抗体−薬物抱合体の結合が、対応するアシルヒドラゾン誘導体よりもゆっくりとした放出動力学を提供したことをＭｕｅｌｌｅｒら報告した（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１：３２５〜３３０（１９９０））。
６．ヘパリン−脂肪親和性シアニン抱合体
安定なカルバミン酸塩結合によって結合し、本発明に有効なヘパリン−シアニン抱合体の合成法を反応機構４に示し、以下の例で詳細に記述する。
機構４に従って、アミノ官能基化したシアニン（８）を、Ｅｃｋｅｒｔらの方法（Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｑｌ．、２６（９）：８９４〜９５（１９８７））に従い、トリホスゲンを用いた処理によって高度な反応性をもつイソシアン酸塩誘導体（２０）に変換する。イソシアン酸塩誘導体（２０）は、さらに分離あるいは精製することなく、Ｄｏｎｇの方法（”親水性スペーサ基を備えたヘパリン化し断片化したポリウレタン尿素表面”、Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ、Ｕｔａｈ大学、１９９０）を修正して用いてジメチルホルムアミド／ホルムアミドの混合溶媒の中でヘパリンナトリウムと直ちに反応させ、ヘパリンのヒドロキシル基がカルバミン酸塩結合形成（あるいは尿素結合形成を介したアミノ基によって）を介してシアニンに共有結合で結合したヘパリン−脂肪親和性シアニン抱合体（２１）を提供する。さらに炭素スペーサ腕を、市販の試薬Ｎ−Ｂｏｃ−６アミノカプロン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて、技術に精通した者に周知の反応によってヘパリンとシアニン成分の間で結合させることもできる。
ヘパリンは多数の遊離ヒドロキシル基を備えているため、反応における試薬の化学量論を制御することによって、ヘパリン分子ごとの多数のシアニン基を当然ながら変更することができる。必要な場合には、疎水的相互作用クロマトグラフィによってヘパリン−脂肪親和性シアニン抱合体を遊離ヘパリンから精製することができる。
別の方法として、Ｋｉｎらの記述した方法（Ｎｏｎｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｉｃ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｎａｌｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｐ．１１６〜１３０）を修正して用いることによって、ヘパリン−シアニン抱合体を調整することができる。この方法は、カルボジイミド試薬を用いてヘパリンのカルボン酸基をアミノ官能基化シアニンに結合させることを含む。ヘパリンのカルボン酸基の２０％に及ぶ割合が、バイオ活性を失うことなく誘導されたことを、Ｅｂｅｒｔらが測定した（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ：Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ａｄｖ．Ｃｈｅｍ．Ｓｅｒ．９９、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．（１９８２）。
７．放射性金属錯体−脂肪親和性シアニン抱合体
放射性金属錯体−脂肪親和性シアニン抱合体を合成する方法を、反応機構５に示し、ここで金属にはレニウム、インジウム、銅、あるいはパラジウムで構成される群から一つを選択する。機構５に従って、ＢａｉｄｏｏとＬｅｖｅｒ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、３１、４０、５７０１〜５７０４（１９９０））によって記述されたように調整した二官能キレート薬（２２）をアミノ官能基化シアニン（８）と反応させ、誘導体（２３）を生成する。次に化合物（２３）を適切な酸化状態で金属溶液と反応させ、金属錯体（２４）を生成する。機構５は、使用金属がレニウムである場合に得られる中性金属錯体の構造を描いている。正確な構造と、経過の錯体の電荷は使用する金属と選択した二官能キレートの正確な構造に依存する。
金属を希土類金属から選択した場合の放射性金属錯体脂肪親和性シアニン抱合体を調整する方法を機構６に示す。
（２５）の構造をもつ二官能基化ポリアミノカルボン酸塩キレートを、欧州特許出願番号０３５３４５０ Ａ１に記述された方法に従って調整することができる。機構６に従って、キレート（２５）をｐＨ９〜９．５でアミノ官能基化シアニン（８）と反応させ、キレートとシアニン成分が安定なチオ尿素結合を介して結合している化合物（２６）を生成する。次に、同様に上述の欧州特許出願に記述されている方法に従って、化合物（２６）を適切な緩衝系中で放射性金属塩溶液と反応させ、最終の放射性金属錯体−シアニン抱合体（２７）を生成する。
機構６の図に使用したＭ（ＰＡ−ＤＯＴＡ）は、ポリアミノ−カルボン酸塩キレートと、機構６に示した中間物（２６）のスペーサ成分（−（ＣＨ₂）₂−Ｃ₆Ｈ₄−ＮＨ−）の部分で構成される放射性金属錯体を指す。化合物２７の放射性金属錯体成分の３次元構造は、Ｓｐｉｎｌｅｔら（Ｉｎｏｒｇｅｎ．Ｃｈｅｍ．、２３：４２７８〜４２８３（１９８４）によって記述されたものと同様であると予想される。
他の種類の二官能ポリアミノカルボン酸塩キレートが知られており、技術に精通する者に周知の他の反応によって、官能基化したシアニンに結合させることができる。例えば、Ｓｕｎｄｂｅｒｇｅら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈａｍ．、１７：１３０４（１９７４）を参照。
窒素を含む他の四歯状キレートと、硫黄を含む四歯状キレートが知られており、技術に精通するものに周知の反応によって、適切に官能基化したシアニンに結合させることができる。例えば、Ｒａｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１２：５７９８〜５８０４（１９８０）を参照。
ＩＶ．生体適合粒子へ結合する本発明の結合化合物
本発明の化合物上で置換された炭化水素尾部の多数の直線状炭素は、化合物とバイオ粒子の表面膜の間に目的の程度の安定した結合を達成するうえで重要な要因である。単一の炭化水素尾部を備える化合物、例えばアクリジン誘導体の安定した結合を達成するためには、直線状炭素の数を２３またはそれ以上にする必要がある。本発明に従って調整されたシアニン誘導体における経験は、二つまたはそれ以上の炭化水素尾部を備える化合物では、尾部の一つが少なくとも１２炭素の長さの直線部分を備え、炭化水素尾部の直線状炭素原子の数の合計を少なくとも２３個にする必要があることを示している。化合物の構造に依存して、一つの細胞から他の細胞への漏出または転換は通常は起こらない。一般に、炭化水素尾部が長いほど、脂肪親和性が高い。しかし、３０個を超える直線状炭素原子を備える炭化水素尾部は、バイオ作用性成分と、炭化水素尾部を提供するために使用した作用物質が同一の溶媒に溶けないことがあり、炭化水素尾部をバイオ作用性成分に結合するための化学が非常に困難になるため、問題となることがある。したがって、尾部が結合する結合成分の化学的性質によって、炭化水素尾部の長さには実質的な制約があることがある。
”尾部”が結合する結合成分の構造的な違いもまた、膜結合の安定性に大きな影響を与える。正に帯電した結合成分、例えばシアニン、スチリルピリジン、キサンテン、フェノキサジン、フェノチアジン、あるいはジフェニルヘキサトリエン色素とその誘導体は、負に帯電した膜への化合物の結合と保持に貢献することがある。中性あるいは負に帯電した結合成分もまた、バイオ膜からの制御された放出を実現するのに役立つことがある。
結合成分、炭化水素尾部、およびスペーサ成分またはバイオ作用性成分の間の安定した結合は、場合によっては、本発明が提供する治療上の利益を実現化するために、治療上有効な物質を必要な時間および必要な分量で部位選択的に保持するうえで、本質的となりうるものである。
結合成分（Ｌ）は、本発明の化合物に必要な安定度を与えて、選択した供給部位に目的の治療上の利益を実現するために十分なだけの時間および分量で化合物が存在するように選択しなければならない。この目的のために、上記の式Ｉの化合物の結合成分は、ｎ＝０のときにバイオ作用性成分（Ｂ）とＲおよびＲ₁の少なくとも一方の間に安定した結合を提供し、さらにｎ＝１のときには、スペーサ成分（Ｒ₂）とＲおよびＲ₁の少なくとも一方との間に安定した結合を提供しなければならない。結合基によって与えられた必要な結合安定性を備える化合物は、治療上有効な脂肪親和性抱合体の直接投与の場合には、保持時間に基づいて決定することができ、あるいは、疾患部位へ抱合体を担体を介して供給する場合には、循環の時間に基づいて決定することができる。すなわち、治療上有効な本発明の脂肪親和性抱合体の保持時間、あるいは循環時間は、治療上有効な成分の非抱合体形での保持時間あるいは循環時間よりも大きくなければならない。
本発明が提供する治療上の利益を実現するうえで、保持時間あるいは循環時間の増大は重要な因子であるが、求める治療上の利益を提供するのに十分な分量の化合物が疾患部位に存在あるいは蓄積することも同様に重要な因子であり、これも本発明の化合物の結合の安定性に依存する。
保持時間あるいは循環時間の決定は、特に以下の例９、１０、および１２に例示するように、技術に精通する者に周知の様々な方法で実施することができる。求める効果を生じるために必要な本発明の治療上有効な脂肪親和性抱合体の分量の決定は、しばしば治療薬にあてはまるように、特別な方法によらない。本発明の実施時に用いられる治療上有効な物質の多様性、それによって治療することが可能な数多くの疾患の状態、そして治療を受ける患者の状態の変動のため、必然的にこうならざるをえない。したがって、本発明による治療を受けている患者の反応を周期的に監視し、疾患部位における治療上有効な物質の存在量あるいは蓄積量が、求める治療効果を生じるのに十分であるかどうかを決定する必要がある。
本発明の化合物は、生存可能な細胞あるいは他の生体適合粒子の外側の膜に、生存可能性に対して初期の有害な作用を及ぼすことなく結合させるように作成することができ、または、即時あるいは遅延させた細胞増殖抑制性または細胞毒作用を及ぼすように作成することができる。細胞毒バイオ作用性成分による細胞毒性の範囲を決定するためには、例えば、細胞を本発明の化合物に対して、細胞毒と抱合体をなしていない化合物や濃度ゼロを含む様々な濃度でさらす。その後、細胞をトリパンブルー、またはヨウ化プロピジウムにさらす（Ｆ．Ｃｅｌａｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、５７：６３０（１９６７））。これらの色素は、生存する細胞から正常に除去され、死んだ細胞の膜だけを透過する。適切な培養時間ののち、顕微鏡あるいはフロー細胞計によって細胞を検査し、染色された細胞の割合（死亡率）を測定する。
本発明の化合物の担体細胞への結合も、担体として標的への供給を実施する能力にとって重要な細胞の機能に対し、感知できるような有害な作用を及ぼさない。例えば、一定の適用の実施にとって、担体細胞が適切に分割することが重要であることがある。一方、分割能力あるいは、期待する適用に対して細胞に必要な他の能力に何の作用も及ぼさないようないくつかの機能を、使用する化合物が変化させることがある。したがって、このような化合物は、本発明における使用目的のための細胞の機能に対して、感知しうる有害な作用を及ぼさないとみなすことができる。本発明の化合物によって生じる、本発明の実施に対して重要性をもちうる細胞機能への作用を測定する方法については、米国特許番号４、８５９、５８４、ＳｌｅｚａｋとＨｏｒａｎ、Ｂｌｏｏｄ、７４：２１７２〜７７（１９８９）とＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１１７：２０５−１４（１９８９）に記述されている。本発明の化合物を再現可能な形で、求める細胞機能に有害な作用を生じることなく標的または担体細胞の形質膜に結合するために細胞結合手段を選択する場合は、二つの基準を満たす必要がある。細胞結合手段は、（ｉ）化合物を結合する生体適合粒子に対して等張であり、収縮または腫脹を起こさず、細胞に損傷を与えることがないように等浸透圧性濃度（哺乳類細胞の場合およそ２６０〜３４０ｍＯｓモル）である必要があり、さらに（ｉｉ）本発明の化合物が、細胞の形質膜内に一定の濃度で結合できるように溶解可能であることが必要である。可溶解性時間経過実験（米国特許番号４、７８３、４０１、Ｍ．Ｍｅｌｎｉｃｏｆｆら、Ｊ．Ｌｅｕｋ．Ｂｉｏｋ．、４３：３８７〜３９７（１９８８））は、部分的にのみ水溶性、形質膜に安定に結合するように作用する化合物は、イオン溶液（例えばリン酸塩緩衝食塩水、培地など）に溶解させたときに沈澱しうるようなミセルあるいは凝集物のどちらか一方を形成する傾向をもち、形質膜内への化合物の結合の減少、あるいは望ましくない不規則な結合を生じることを示した。
放射性同位元素化合物についての同様な実験方法を適用することが可能であり、化合物の安定性は、ベータあるいはガンマ計数器を用いて測定することができる。あらゆる場合に、各時点における前記等浸透圧溶液の上澄み液中の本発明の化合物の分量を、エタノールを溶媒として用いたこのような化合物の試料と比較することで、標識細胞には適切ではないが、化合物の最大溶解度に対しては役に立つ（全体として）。
細胞の形質膜に結合する本発明の化合物の適切な濃度の決定には、化合物によって生じる目的の作用、化合物を結合させる細胞の種類を含む、いくつかの因子を考慮しなければならない。一般に、最初の目的は、できるだけ多くの治療薬を細胞膜内に結合させることである。これは、治療化合物を疾患部位に直接供給すること、あるいは治療化合物をｅｘ ｖｉｖｏで細胞に結合させ、修正した細胞をｉｎ ｖｉｖｏで再導入することによって実現することができる。細胞の形質膜内への治療薬の結合を最大化することによって、相対的に少ない投与量を投与すること、あるいは目的の位置に到達して目的の作用を与えるために必要な担体細胞の数を少なくすることが可能になる。細胞を介した治療薬の供給の場合、細胞内に結合した化合物の分量は、細胞の生存能力あるいは細胞が目的の位置に移動する能力に関して、担体細胞に負の変化がまったく見られないような程度にまでのみ増大させる必要がある。
本発明の化合物は、血清および他の脂肪を含む物質の非存在下で担体細胞あるいは他の生体適合粒子に適用する。細胞を身体から分離、あるいは培養から取り出し、血清を含まないように洗浄する。等浸透圧調整薬を含む組成を形成させるために、それらを通常はイオン溶液以外に、本発明の化合物の適切な濃度（１０^-5から１０^-7Ｍ）で懸濁する。化合物の細胞への結合は、通常は１０分以内に完了し、自系または異種の血清を付加することによって結合反応が停止する。次に、血清を含む媒質中（５〜１０％ ｖ／ｖ）で細胞を洗浄し、適用に応じて培養に配置するか、あるいは受容者に注入する。
ここで記述した種類の化合物の細胞への結合法は、米国特許番号４、７８３、４０１に詳細に記述されており、その開示の全体は、ここで完全に記述しているが、引例によって本明細書に統合されている。
他の細胞結合法には、本発明の化合物を食塩水に懸濁してミセルを形成させることが含まれる。次に、その懸濁液に細胞を入れると、食作用細胞（例えば、単球、マクロファージ、好中球）だけが優先的に標識される。この方法で、本発明の化合物を食作用細胞に選択的に向かわせることができる。Ｍ．Ｍｅｌｎｉｃｏｆｆら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．、４３：３８７〜９７（１９８８）。
本発明の化合物、組成、方法の代表的な適用について、特定の薬物療法に関して以下に記述する。
Ｖ．本発明の化合物の使用法
Ａ．一般治療法
１．同位体治療への適用
脂肪を含む生体適合粒子の脂肪成分の中と、放射性で高い線エネルギー付与（ＬＥＴ）を放出するキレートイオンに対して結合する能力をもっていることから、疾患部位に放射線治療を提供するために本発明の化合物を使用することができる。キレート化した本発明の化合物と適切な放射性イオン（例えば、⁶⁷Ｃｕ、⁹⁰Ｙ、¹⁸⁶Ｒｅ、α線放出体）の安定した錯体を最初に形成し、錯体を分離し、上述した通常の細胞結合法を実施することによって、細胞を本発明の化合物で標識する。
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を原発病巣から分離し、ＩＬ−２中で拡大し、上述したように放射線治療物質に結合させ、静脈内に注入する。標識した細胞は転移性疾患の部位を追跡し、転移性腫瘍細胞を殺す放射線を放出し、それによってＴＩＬの治療効果を増大させ、さらに、おそらく疾患の軽減の達成に必要な細胞数を低減する。同様に、転移性部位に移動する他の種類の細胞を、局所的な放射線治療の供給に利用することができる。
２．細胞膜に特異的蛋白質を結合することによる細胞の標的化
他の実施例では、本発明の化合物は、その内部に蛋白質、糖蛋白、リポ蛋白、あるいはペプチドを含む蛋白様物質を、バイオ作用性成分として結合させる。これらの化合物を上記に記述したように細胞に結合させ、それに加えて、前記化合物の炭化水素鎖を形質膜内に包埋し、それによって特異的な細胞型の表面に蛋白質を配置する。
上述の方法を、ヒトのフィブリンに対する単クローン抗体を例えば赤血球などの担体細胞表面に結合させ、フィブリン凝塊部位へ供給するために使用することができる。
同様な方法を、ヒトの細胞表面の腫瘍抗原の単クローン抗体を例えば単球またはリンパ球などの担体細胞を介して腫瘍部位に供給するために使用することができる。担体細胞（例えば赤血球）表面へ適用することによって、組織のプラスミノゲンアクチベータを同様に供給することができる。
必要な場合は、上述の治療を組み合わせて使用することができる。したがって、ヒトのフィブリンに結合する単クローン抗体を細胞（例えば赤血球）の表面に結合し、次にそれをさらにフィブリン溶解化合物（例えばｔＰＡ、スト プトキナーゼ、ウロキナーゼ）に結合させることができる。単クローン抗体は、担体細胞のフィブリンへの結合と、結合後に多数の治療用フィブリン溶解化合物を供給することを可能にする。
これらの治療上有効な蛋白質を、上述の一般的な調整法に従って、脂肪親和性発色団に抱合体させることができる。
上述の技法は、様々な他の治療上有効な蛋白質あるいはペプチドを、細胞、ウイルス、リポソームまたはＬＤＬなどの適切な生体適合粒子に結合させ、それによって循環内における蛋白様物質の生物学的利用能を大きく引き伸ばすために使用することができる。
蛋白質結合生体適合粒子は、放射性画像化化合物、あるいは磁気共鳴画像化化合物を用いて上述のように同位元素によって標識することができる。その結果として生じたバイオ粒子を患者に注入し、それによって細胞を疾患部位に移動させ、標準的なガンマシンチグラフィまたは核画像化を用いて画像化し、治療薬の効果を評価することができる。
３．ワクチンのための細胞への蛋白質の結合
本発明の他の適用では、それに対して保護的な抗体生成が望まれるような、蛋白質、糖蛋白、リポ蛋白あるいはペプチドでありうる抗原を、任意に結合基を含み、細胞（例えば赤血球、単球）の表面に結合させるためバイオ作用性成分として利用する。このように修正した細胞を、抗原性補強剤の存在下および非存在下で注入する。注入の時間間隔は抗原の性質に依存するが、一般的には、２週間を下回らない各時間間隔ごとに１０⁶の細胞を注入することができる。
抗原に対する抗体濃度を、標準的なＥｌｉｓａ法によって監視する。細胞免疫濃度は、免疫化細胞への増殖あるいは細胞毒反応を求めることによって測定することができる。
４．細胞表面の修正による移動形態の変更
この手法の他の適用では、本発明の化合物を用いて、シアリン酸またはグリコサミノグリカンを細胞の形質膜に結合することができる。特異的な化合物を上述のように等浸透圧媒質に入れる。例えば赤血球を溶液の中に入れると、形質膜への化合物の結合が生じる。血清の付加によって反応を停止させ、その後媒質を含む食塩水で細胞を洗浄し、注入の準備が完了する。
赤血球は循環の中を移動し、未成熟細胞の間は、その表面に多量のシアリン酸を備えている。赤血球が成長するに従って、細胞当たりのシアリン酸の分量が減少して、脾臓および肝臓のマクロファージが赤血球の膜の抗原を認識できるようになり、それによってそれらを循環から取り除く。赤血球の膜内に結合するシアリン酸の分量を適切に増大させることにより、循環の中での赤血球の寿命を延ばすことができる。赤血球の寿命を延ばす能力は、移植患者あるいは貧血患者にとって有益となりうる。骨髄移植患者が移植を受けたときには、彼ら自身の赤血球を製造できるようになるまでに数週間を要する。彼ら自身の赤血球の寿命を延ばすためにこの手法を用いることによって、必要な場合には、貧血を起こすことなく患者は複数回の骨髄移植を受けることができる。
貧血のある個体の場合、貧血は赤血球の寿命の低下、または赤血球の生産率の低下によって貧血が起こることがある。どちらの場合でも、赤血球の寿命を延ばすことによって貧血が減少する。
５．治療作用のための光力学化合物の供給
癌を治癒させるための光力学治療は、熱心な研究が行われている領域である（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＳＰＩＥ−Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；Ｖｏｌｕｍｅ ８４７、”Ｎｅｗ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ”Ｄｏｕｇｌａｓ Ｃ．Ｎｅｃｋｅｒｓ、Ｅｄｉｔｏｒ；（Ｏｃｔｏｂｅｒ １９８７））。これらの化合物の多くは、フタロシアニン類またはヘマトポルフィリン類である。すべて６００〜８００ｎｍの領域の光を吸収し、その過程で励起状態の酸素を生成する。
本発明の方法論を用いて、化合物の脂肪親和性誘導体を作成し、次に等浸透圧溶液中に溶解させる。腫瘍選択的細胞（例えばＴＩＬ）をこれらの化合物で標識し、細胞を患者に注入する。その後腫瘍選択的細胞は微小転移巣部位へ移動する。４８時間以内に、光力学分子が吸収する領域の強い光線に患者をさらし、生成した励起状態の酸素が腫瘍細胞を殺す。さらに、担体細胞も殺されて炎症を生じ、それによって死んだ細胞を除去するためにさらに多くの免疫細胞が集まり、腫瘍に対する毒性が高まる。光力学作用を供給するこの方法では、担体細胞は、腫瘍部位へ治療薬を選択的により多く蓄積する必要がある。一部の例では、体腔内（例えば胸膜腔）における腫瘍沈着への本発明の化合物の直接的な適用は部位への保持を補助し、手術時にさらに有効な体腔内照射治療を可能にする。
Ｂ．治療上有効な物質の直接供給による特異的疾患あるいは病的状態の治療
１．血管形成術後の再閉塞および再狭窄
連続的な血流の存在下であっても、人工的表面だけでなく、局所的血管部位に本発明の化合物を保持できることが実験的に示された（以下の例８および１２を参照）。さらに、治療上有効な物質で構成される本発明の化合物中で生物学的作用を保持できることが、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで示された（以下の例４、１３および１５を参照）。
動物モデル系の研究によって、血管形成術後の再狭窄を引き起こす一次的細胞増殖と移動は、血管形成術後およそ７〜２１日以内に起こることが明らかになった。したがって、この発生を防ぐためには、血管形成術後７〜１０日目まで修復した動脈の平滑筋細胞に抗増殖薬を保持する必要がある。適切な抗増殖薬で構成された本発明の化合物を血管形成術後に損傷した血管壁に供給し、化合物に抱合させた非増殖薬を損傷した細胞に保持させることができる。このように、大きな投与量の抗増殖薬を損傷した細胞に直接提供することができ、本発明の化合物を用いることによって、全身性の薬物供給の場合よりも長い時間にわたって損傷した部位に保持することができる。例えば、血管形成術において、薬物供給カテーテルによる抗増殖薬の直接の沈着は、血管形成術の部位の細胞膜に薬物を結合させることを可能にするのに対し、結合していない薬物はすべて、手術中に動脈から流れてしまう。カテーテルを取り除いても、休止細胞に結合した薬物は外側膜にとどまるか、あるいは間隙空間を移動して深い細胞層に到達する。これらの細胞が活動あるいは成長状態になった場合は、膜成分が内部に動くに従って本発明の化合物は細胞内に移動する。一度細胞内に入ると、その抗増殖作用を発揮することが可能になる。したがって、適切な抗増殖薬で構成される本発明の化合物を主として疾患部位に供給し、肝臓あるいは腎臓で一度に処理される薬物の分量を最小にして、重大な副作用の発生を抑えることができる。
好ましい実施例においては、血管形成術後の再狭窄の治療に有効な本発明の化合物は、ヘパリン、ヒルジン、コルヒチン、ビンカアルカロイド、タキソールおよびその誘導体などの抗増殖薬で構成される。培養中の平滑筋細胞へのヘパリンの適用、あるいは動脈損傷後の動物への投与は、成長の低下と、筋内膜の肥厚化および細胞増殖の低減を引き起こす。ヘパリンで構成される本発明の化合物は、一つあるいはそれ以上の細胞壁成分との間の疎水性相互作用によって、これらの細胞内部に取り込まれるよりも、内側動脈壁の外側細胞膜上にとどまるように構成される。これとは対照的に、チューブリン過程を妨げるコルヒチンのような抗増殖薬は、その抗増殖作用を及ぼすためには、細胞内に取り込まれる必要がある。この例においては、内側壁の動脈細胞内に急速に内在化できるように本発明の化合物を合成することが好ましい。好ましい実施例では、酸で切断可能な抱合体として本発明の化合物のバイオ作用性成分でコルヒチンが構成される。コルヒチンは、その抱合体の形では不活性である。しかし、細胞内酸小胞内への化合物の取り込みは、化合物からの薬物の放出を引き起こし、それによって活性化する。したがって、活性コルヒチンは、その作用部位の細胞内に供給され、その部位のチューブリン過程を阻止し、それによって細胞分割を阻止する。
本発明での使用に特に好ましいものは、次の式で与えられるような、コルヒチンを含む酸で切断可能な化合物である：

他の有効なコルヒチンを含む化合物は、次の式で与えられる：

本発明の実施での使用を考慮した他の抗増殖薬には以下の薬物が含まれる：アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）抑制因子、アンギオペプチン、シクロスポリンＡ、カルシウムチャンネル遮断薬、ヤギ−抗ウサギ血小板由来成長因子抗体、Ｔｅｒｂｉｎａｆｉｎｅ、Ｔｒａｐｉｄｉｌ、インターフェロンγ、および陽イオン成長因子の結合のための重陰イオン。
２．慢性関節リウマチ
本発明の化合物は、慢性関節リウマチの治療に特に適している。それらは、リンパ節、脾臓あるいは肝臓に対して顕著な全身性の放出を行うことなく、関節への大量の治療薬の保持を可能にするための、化学あるいは放射線滑膜切除を実施する手段を提供する。あらゆる現存の供給システムに対する大きな利点は、本発明の化合物を治療を必要とする組織自体に均一に供給し、これらの細胞に保持することである。本発明の放射線治療用化合物の場合、化合物から放出された放射能が、滑膜の細胞に治療効果を引き起こす。下記の例に詳細を記述するように、基本的に身体中のすべての化合物が治療を行った関節に見出され、注入した化合物の約７０％が６日目にそこにとどまっていた。この局所的で長期の保持は、それぞれの放射線滑膜切除術に必要な放射性同位元素量を低減し、従来の治療で、関節から放出された放射性同位元素に全身的にさらされることによって起こる副作用を低下させる。
放射線滑膜切除に特に好ましい本発明の放射線治療化合物は、以下に例示するように、適切な放射性同位元素に結合させて合成することができる。例えば、（１）窒素と硫黄を含むキレート、あるいは（２）窒素と酸素を含むキレートのどちらか一方と放射性金属で錯体を構成する。放射性同位元素は、放射性のハロゲン、銅、イットリウム、ロジウム、パラジウム、インジウム、ヨウ素、サマリウム、ガドリニウム、ホルミウム、エルビウム、イッテルビウム、ルテチウム、レニウム、金、あるいはそれらの組み合わせで構成される群から選択することができる。
本発明に使用する好ましい化合物は次の式で与えられる：

ここでＬ、Ｒ、Ｒ₁、およびＲ₂は上記の式Ｉで定義したものである；
ＺはＨまたは金属配位位置を表す；

ここでそれぞれのＲ'は、独立に水素原子、あるいはアルキル基、好ましくは低いアルキル基、あるいは置換された低いアルキルで、ここで置換基はあらゆるエステルにすることができ、Ｒ"および

は独立に水素原子あるいはアルキル基で、ｍおよびｎはそれぞれ０または１にすることができる；さらに、Ｍは、レニウム、インジウム、銅、およびパラジウムで構成される群から選択する放射性金属を表す。
好ましい実施例では、上記の式ＶＩＩＩの化合物は次の式で与えられる：

ここでＲおよびＲ₁は、１個から約３０個の炭素原子を備える炭化水素置換基である；ＸおよびＸ₁は同一または異なる値にすることができ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（ＣＨ₃）₂あるいはＳｅを表す；
Ａは薬学上許容することができる陰イオンを表す；
ＺはＨあるいは金属配位位置を表す；

ここでそれぞれのＲ'は独立に水素原子あるいはアルキル基、好ましくは低いアルキル基を表し、あるいは置換された低いアルキル基で、置換基はあらゆるエステルにすることができ、Ｒ"および

は独立に水素原子またはアルキル基であり、ｍとｎはそれぞれ０または１にすることができる；Ｍはレニウム、インジウム、銅およびパラジウムで構成される群から選択する放射性金属を表す。
本発明で使用する他の特に好ましい化合物は、次の式で与えられる化合物である：

ここでＭは、レニウム、インジウム、銅またはパラジウムなどの放射線治療物質を表す。
他の有効な化合物は次式で与えられる：

ここでＲおよびＲ₁は、１個から約３０個の炭素原子を備える炭化水素置換基である；ＸおよびＸ₁は同一または異なる値にすることができ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（ＣＨ₃）₂またはＳｅを表す；
Ａは薬学上許容することができる陰イオンを表す；
Ｍは、銅、テクネチウム、ロジウム、パラジウム、インジウム、サマリウム、ガドリニウム、ホルミウム、エルビウム、イッテルビウム、ルテチウム、レニウム、イットリウム、金、エルビウム、ホルミウムあるいはそれらの組み合わせで構成される群から選択した放射線治療物質を表す；ｎは２、３あるいは４である；ｍは１あるいは２である；ｐは１から６である。
３．卵巣癌
化学治療薬または放射線治療薬で構成される本発明の化合物は、これらの薬物を卵巣腫瘍細胞増殖部位に高濃度で直接供給することを可能にする。さらに、治療薬を腹膜腔内に長時間にわたって保持し、それによって腫瘍細胞の散在を阻止する。また、これらの薬物の全身的供給システムによる高濃度での投与に伴う顕著な副作用を起こすことなく、これを実現することができる。
本発明の化合物は、手術後の治療としてＴｅｎｃｋｈｏｆｆカテーテルを用いて腹膜腔内に供給することができ、あるいは再側腹開腹術、および手術時の補助治療として供給することができる。
酸切断可能なコルヒチンを含む本発明の化合物は、すでに記述したように、卵巣腫瘍細胞の抗増殖治療にも有効である。上述したように、これらの分子は細胞の外側の膜に非毒性の形でとどまることが期待される。しかし、化合物の残りの部分から化学治療薬が切り離されている細胞内に化合物が取り込まれた場合には、化学治療物質がその抗増殖作用を及ぼすことができる。
４．乾癬
コルチコステロイドで構成される本発明の化合物を、乾癬の治療に有効に用いることができる。それらは乾癬病変の部位に大量の薬物の保持を提供し、それによって、ケラチノサイトと免疫細胞の増殖を減少する薬物の有効性を高める。さらに、病変部位への本発明の化合物の保持は、毒性をもつ可能性のある化合物を循環系の中に透過させることを防ぐ。これによって、２週間に及ぶ一連の適用後に、抗増殖薬の高い血清濃度のために治療を停止する必要がなくなるという臨床的な利益を生じる。
本発明の他の適用に従って、アテローム硬化症の初期の検出のために、血小板あるいは低密度のリポ蛋白（ＬＤＬ）で、アテローム硬化性斑沈着部位を突き止めることができる。標準的な勾配法を用いて個体の血液から血小板を分離し、次に、任意の診断成分としてインジウムあるいはテクネチウムで標識し、静脈内に再注入する。ここで記述した種類の化合物を血小板に結合する適切な方法は、米国特許番号４、７６２、７０１に記述されている。次の４８時間以内に、動脈壁の斑形成部位に放射標識血小板が蓄積し、ガンマカメラを用いてその部位のガンマ放出を検出することができる。
同様に、標準的な超遠心分離法によってＬＤＬを精製し、顕著な脂肪含有量と、生体適合粒子の脂肪領域に対する本発明の化合物の結合親和性を利用して、本発明の化合物で標識する。これらの放射標識ＬＤＬは、再注入後にアテローム硬化斑集中部位に蓄積し、核画像化による検出を可能にする。単球がアテローム硬化斑に蓄積することも知られており、そのため、その形成の検出に利用することができる；その唯一の限界は、放射標識に適した数の単球を精製する可能性である。
さらに、血小板が血栓症部位（例えば冠状動脈血栓症、深部静脈血栓症、血管内移植片）と、器官の移植後の急性拒絶反応部位に蓄積することが知られている。したがって、標準的方法によって分離され、本発明の化合物と方法を用いて放射標識された自系血小板もまた、薬物療法と組み合わせて、このような疾患過程の非侵襲的診断を可能にする。
さらに、放射性金像イオンに結合させるためにキレートを用いることができるが、上記の式Ｉの化合物で、放射性同位元素を例えば放射性のヨウ素、炭素、窒素、硫黄、リンまたはセレン原子を分子の構成成分とする蛍光および非蛍光化合物を生成することも可能である。放射標識された本発明の化合物を用いた十分なエネルギーのγ線を放出する化合物は、ガンマシンチグラフィを用いて検出することができる。同位元素が低エネルギー非透過ベータ放出元素の場合、標準的なベータ計数法を用いて化合物を研究用に使用することができる。
ビオチン化した本発明の脂肪親和性化合物を、多目的試薬として作用させることができる。例えば、通常は非付着性の細胞を、選択した表面に急速に付着させるためにこれらの化合物を使用することができる。これは、固定化した細胞を必要とするような分析、すなわち単一の細胞を時間的に監視する分析にとって重要である。本発明のビオチン化した化合物で細胞母集団を標識すれば、ストレプタビジンに結合する表面に、その結果生じた標識細胞を接触させ、細胞を急速にその表面に付着させる。細胞の分析を直ちに開始することができる。ビオチン化した化合物と結合させた蛍光によって、実験中に細胞を視覚的に監視する便利な手段を提供する。
さらに、蛍光細胞で標識した化合物を、成長する細胞の監視と、蛍光の希薄化による成長速度の測定に利用することができる。（米国特許番号４、８５９、５８４）。この方法では、標識化合物の蛍光が自己蛍光にまで減少すると、５〜８倍加時間（細胞の種類による）で感度が低下する。蛍光色素を抱合させたストレプタビジンを、例えばビオチン化したシアニンにここに記述したように結合させることにより、蛍光の増幅を実現することができる。この方法によって、色素の蛍光が自己蛍光にまで低下したのちでも、標識細胞を確認することができる。さらに高い感度が必要な場合には、ビオチン化した本発明の化合物に対して放射標識ストレプタビジンを結合させることができ、標識細胞を確認するためにオートラジオグラフィを実施することができる。ビオチン化した本発明の化合物の別の適用は、蛋白質結合である。いくつかの大きな蛋白質の場合、上記の式ＩＩＩに示すように、本発明の脂肪親和性化合物に蛋白質を共有結合で結合することによって、蛋白質を細胞に結合させることは不可能である。このような場合には、別の結合機構として、アビジン−ビオチン結合対がある。この目的のために、ビオチン化した本発明の化合物を用いて標的細胞を標識し、大きな蛋白質をアビジン、あるいは適切なアビジンの誘導体、例えばストレプタビジンに抱合させる。次に、ビオチン化した細胞をアビジン−蛋白質抱合体にさらすことによって、蛋白質が細胞に安定に結合する。
Ｃ．製薬製剤
本発明の化合物で構成される製薬製剤は、食塩を含まない等浸透圧溶液、あるいは薬学的に許容可能な液体賦形剤のような適合性生物学的媒質と組み合わせた投与に好都合なように作成することができる。後者には、各種の不活性油、例えばオリーブ油やピーナッツ油などの植物油、あるいは高度に生成した鉱物油が含まれる。選択した媒質の活性成分の濃度は、化合物の性質、および治療する疾患または病的状態に応じて異なる。
製薬製剤を投薬単位形態で構成することが、投与の簡便性、投薬の均一性にとって特に有利である。ここで使用する投薬単位形態とは、治療を受ける患者に適合した物理的に分離した製薬製剤単位を指す。各投薬単位は、選択した薬剤の担体と結合して、目的の治療効果を生じるように計算した有効成分量を含むようにしなければならない。細胞増殖を阻止するため、あるいはある一定の分類の患者の他の病的状態を治療するための適切な投薬単位を決定する方法は、技術に精通した者には周知である。例えば、放射線滑膜切除の場合、様々なコロイド状の形で投与した約５ｍＣＩの⁹⁰Ｙ（半減期２．７日、ベータエネルギー２．２ＭｅＶ）、あるいは３００ｍＣｉの¹⁶⁵Ｄｙ（半減期２．３時間、ベータエネルギー１．３ＭｅＶ）の投与量が臨床的な有効性を示した。Ｐ．Ｌｅｅ、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、９：１６５〜１６７（１９８２）；Ｃ．Ｓｌｅｄｇｅら、Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．、１８２：３７〜４０（１９８４）。標準的な線量計測法を用いて、２００ｍＣｉ／μモルの特異的活性で調整した約０．０５μモルの適切な化合物（例えば反応機構５の化合物２３）の注入によって提供される約１０ｍＣｉの投与量の¹⁸⁶Ｒｅ（半減期３．７日、ベータエネルギー０．９８ＭｅＶ）によって、同様な治療効果が得られることが見積もられた。他の放射線治療同位元素も技術上知られている。Ｗ．Ｖｏｌｋｅｒｔら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、３２：１７４〜１８５（１９９１）。さらに、本発明の他の化合物も、これらの薬物の効果的な投与量での供給に有効であるとみなされる。
腫瘍の放射線治療においては、単クローン抗体を用いて供給した場合、固化した腫瘍の放射線治療の滅菌投与量として、８０Ｇｙの投与量が示された。Ｊ．Ｈｕｍｍ、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ、２７：１４９０〜１４９７（１９８６）。細胞表面膜に対する結合と内在化は、これらの治療の有効性を高めることが期待されている。Ｊ．Ｈｕｍｍ、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ、３１：７５〜８３（１９９０）。８０Ｇｙの投与量は、２００ｍＣｉ／μモルの特異的活性で調整された約０．８ｎモルの化合物２３の注入によって提供される。さらに、この化合物や他の本発明の化合物は、技術上知られている他の放射線治療同位元素の供給に利用できることが期待されている。Ｗ．Ｖｏｌｋｅｒｔら、ｓｕｐｒａ．。他の種類の抗癌放射線治療薬と同様に、本発明の化合物を腫瘍組織内、散在した腫瘍を含む体腔内、あるいは腫瘍を供給している血管内などに直接供給することができる。Ｃ．Ｈｏｅｆｎａｇｅｌ、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ、２：１０７〜１３２（１９９１）。
血管形成術後の再狭窄の治療において、十分な分量の本発明の化合物を病態生理学的部位に供給できることを示すために、Ｇｒｉｎｅｓら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８４：ＩＩ−３６５（１９９１）によって、１ｍｇ／日のヒト治療投与量のコルヒチンが投与されたが、再狭窄を防ぐことはできず、２ｎｇ／ｍｌあるいは５ｎＭ（ｍ．ｗ．コルヒチン＝３９９．４）の最大血漿濃度を生じたことに言及しておくことができる。Ｂｏｃｈｎｅｒら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｌｉｔｔｌｅ、Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｂｏｓｔｏｎ（１９８３）、ｐｐ．１５１〜１５２。（ｉ）ウサギによる同様なコルヒチンの吸収および分布；（ｉｉ）平均的な３ｋｇの体重のウサギ、および（ｉｉｉ）体重７０ｋｇの平均的なヒトの場合を仮定し、０．２ｍｇ／ｋｇ／日の投与量がＣｕｒｒｉｅｒら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８０：ＩＩ−６６（１９８９）によって用いられ、ウサギにおいて２８ｎｇ／ｍｌまたは７０ｎＭの血漿濃度で再狭窄を防ぐことに成功した。したがって、再狭窄を防ぐための濃度は、臨床試験で達成した濃度の１４倍であることを、ウサギにおけるコルヒチン濃度が示した。本発明の化合物は、上述の適合する結合媒質中に１００μＭ、すなわち、動物研究で有効であることが示された濃度の１４００倍にまで調整することができ、血管形成術時にカテーテルを用いて動脈壁に直接供給することができる。
本発明の製薬製剤は、好ましくは注射、腹膜腔内輸液、あるいはカテーテル法によって投与する。さらに、一部の症例では経口投与、あるいはエーロゾル投与などの他の投与法も有効であることがある。
製薬製剤を適切な間隔で投与することができる。本発明の化合物の性質により、反復投与は不要であると考えられる。製薬製剤の投与頻度の決定は、関連する医療技術に精通した者には周知である。あらゆる場合に、いずれの個別の症例の適切な間隔は、通常は患者の状態、および治療する病的状態の種類によって決まる。
以下の例は、本発明をさらに詳細に記述するために提供されるものである。これらの例は、本発明の特定の側面を説明することを意図しているものであり、本発明の制限をとみなすことはできない。
例１
膜保持係数の決定
膜保持係数（ＭＲＣ）は、与えられた化合物が細胞の形質膜にいかに十分に保持されているかという点に関する情報を提供するものであり、以下に記載したように決定する。
モデル膜として使用する赤血球ゴーストの生成は、全血液を３００×ｇで１５分間遠心分離し、血漿を除去し、０．８３％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウムで細胞ペレットの再懸濁を行うことによって行う。１０、０００×ｇの１０分間の遠心分離によって塩化アンモニウムからゴーストをペレット化する。細胞からのヘモグロビンの完全な放出を実現するために、この塩化アンモニウム洗浄処理を少なくとも５回反復する。装置による分析あるいは蛍光顕微鏡法による標識されたゴーストの検出を可能にするような濃度、さらに上述した個々の適用のために細胞を標識する際に用いたのと同じ濃度で、問題の化合物でゴーストを標識する。以下の測定のために、問題の化合物の保存溶液を２×１０³のモル濃度のエタノールで調整し、化合物の作業用希釈液を、等浸透圧性スクロース（５２ｇ／５００ｍｌ蒸留水）で調整した。約１×１０⁹ゴースト／ｍｌの濃度の化合物の作業用希釈液で１０分間ゴーストの培基をしたのち、ゴーストをペレット化するために試料を１０、０００×ｇで遠心分離し、試料から染色溶液を吸引した。１０％のウシ血清（ＰＢＳ−ＦＢＳ）を含む１ｍｌのリン酸塩緩衝食塩水に標識したゴーストを再懸濁した。三重化した２０ｕｌアリクォットを、存在する全化合物量を測定するために各試料から取り出した。試料を上述のように遠心分離し、存在する全非結合化合物量の定量的測定のための上澄み液から三重化２０ｕｌアリクォットを取り出した。
サンプリングののち、上澄み液を吸引し、赤血球ゴーストのペレットを１．０ｍｌのＰＢＳ−ＦＢＳに再懸濁し、上述のように再度サンプリングした。この方法を少なくとも６回反復し、急速に放出された化合物を検出できるようにし、さらにゆっくりと放出される化合物の検出もできるように２４時間またはそれ以上の時間ののちに監視を行った。各試料中に存在する化合物量の測定のため、２０ｕｌアリクォットを攪拌によって３．０ｍｌのｎ−ブタノールに抽出した。膜の残骸を除去するために試料を３０００×ｇで遠心分離し、ブタノール分画の化合物濃度を分析した。各試料の蛍光単位を測定するために、分析する特定の化合物の最大励起と放出波長を用いて、この方法で蛍光化合物を分析した。放射標識化合物はブタノール抽出が不要であり、ベータまたはガンマ計数装置を用いて直接分析することができる。
上述のように各試料中に存在する化合物量を測定することにより、洗浄または固定した各時点のＭＲＣの計算が可能になる。値は次の式で与えられる：
((C_T - C_S)/C_T *100
ここでＣ_Tは全試料中に存在する化合物量（化合物の分析に使用する方法によって決まる単位）を表し、Ｃ_Sは、特定の時点で上澄み液中に存在する化合物量を表す。ＭＲＣ値の比較によって、本発明の化合物を同定する基準が定義されるが、これらの基準は：１）各洗浄段階で測定したＭＲＣ値が少なくとも約９０の値であること、および２）少なくとも２４時間の間のＭＲＣ値の割合の差が約１０％未満であることである。

下記の表Ｉに示したデータは一つの実験結果であり、ＭＲＣ測定例を示す。表Ｉでは、Ａ〜Ｃで表す化合物は上記の式ＸＩＩの化合物であり、ここで各化合物中のＸおよびＸ₁はＣ（ＣＨ₃）₂を表し、ＺおよびＺ₁はＨを表し、さらにＲ／Ｒ₁はＣ−５／Ｃ−５（化合物Ａ）、Ｃ−１０／Ｃ−１０（化合物Ｂ）、Ｃ−１４／Ｃ−１４（化合物Ｃ）を表す；Ｄ〜Ｋで表す化合物は同様に式ＸＩＩＩの化合物であり、ここでＺおよびＺ₁はＨを表し、Ｒ／Ｒ₁はＣ−１４／Ｃ−３（化合物Ｄ）、Ｃ−１８／Ｃ−３（化合物Ｅ）、Ｃ−２０（３、７、１１、１５−テトラメチルヘキサデシル）／Ｃ−３（化合物Ｆ）、Ｃ−２２／Ｃ−３（化合物Ｇ）、Ｃ−２０／Ｃ−３（化合物Ｈ）、Ｃ−１８／Ｃ−８（化合物Ｉ）、Ｃ−１８／Ｃ−５（化合物Ｊ）、Ｃ−２２／Ｃ−３（化合物Ｋ）を表す；また、Ｌ〜Ｎで表す化合物は上記の式ＸＩＶの化合物であり、ここでＺおよびＺ₁はそれぞれ、（３および６の環の位置での）Ｎ（ＣＨ₃）₂を表し、Ｚ₂はＨを表し、Ｒは、Ｃ−２２（化合物Ｌ）、Ｃ−１８（化合物Ｍ）、Ｃ−２６（化合物Ｎ）を表す。化合物Ｋでは、陰イオンは塩化物であり、その他残りのすべての化合物では、陰イオンはヨウ化物である。

上記の表Ｉに記載したＭＲＣ値は、上述の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８９／０００８７中ですでに記述したように、細胞内化合物変換分析から得た結果との優れた相関を示している。
例２
膜結合安定性の決定
水相（例えば、細胞外媒質）から液体炭化水素相（例えば、生体膜の炭化水素内部）への炭化水素鎖変換の自由エネルギーは、分岐の程度、非飽和の程度、および炭化水素鎖中のメチレン基の数に依存することが知られている。メチレン−炭化水素相互作用の自由エネルギーは、水性媒介に最も近いメチレン基では最小で、それに続くメチレン基では増大し、炭化水素基が４個またはそれ以上の炭素を膜の脂質内部にもつ非極性炭化水素を含む溶媒中の炭化水素に見出されるものとほぼ等しくなる。したがって、本発明の化合物のような、極性をもつ頭部基と直線状の４個あるいはそれ以上の炭素で構成される炭化水素尾部（単数あるいは複数、対称あるいは非対称）を含むあらゆる構造について、炭化水素溶媒中に完全に浸した時に、ほぼ等しい結合エネルギーを与えるような炭素等価物の数を、以下のように計算することができる：
炭化等価物＝０＋．２５＋．５＋．７５＋ｎ−４（＋）０＋．２５＋．５＋．７５＋ｍ−４（＋）・・・ここでｎは、最初の尾の直線状炭化水素の数と等しく、ｍは、第２の尾の直線状炭化水素の数と等しい。
本発明の化合物の炭素等価物と、その膜保持係数（ＭＲＣ）との間に相関が存在することは、上記の例１に記述したように、実験的に決定した。例えば、１８−１９個を超える炭素等価物を備える本発明の化合物は、９０またはそれ以上のＭＲＣを備え、細胞内化合物変換分析において、標識細胞と非標識細胞の間の最小の変換を示す（上記を参照）。したがって、これらの化合物もｉｎ ｖｉｖｏで標識された細胞との結合の優れた安定性を示すことが期待される。しかし、驚くべきことにこれはあてはまらない。実際に、異なるＭＲＣを示している本発明の化合物のいくつかは、僅かに１０％だけ異なる本発明の複数の化合物が、ｉｎ ｖｉｖｏで１０倍異なる低下率を示す。
本発明の化合物と方法の様々な実際の適用において、ｉｎ ｖｉｖｏでの化合物と生物膜との間の結合の安定性をいくつかの予測基準を用いて評価できることが重要である。例えば、腫瘍部位への治療放射性核種の供給などの適用では、化合物の損失が、放射性核種による非腫瘍部位への毒性作用の生成を引き起こしうるので、膜への非常に安定した結合が必要となる。一方、治療薬供給率の制御を必要とする適用にとっては、生体膜からの化合物のより急速な損失が望ましいことがある。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏで見出される条件を近似する条件下でＭＢＳを測定する分析について、以下に記述する。
この分析を実施するうえで、生理的濃度を近似する血清アルブミン（５％）を使用する。さらに、本発明の多くの化合物は、５％のアルブミンを含む食塩水中への溶解度が低いため、限定した体積の“生理的”液体を含む閉じた系で、２４時間以内に膜内での溶解度と周囲の媒質内での溶解度の間の平衡を達成させる。標識細胞をｉｎ ｖｉｖｏでさらす体積の大きな液体の作用を十分に近似するために、アルブミンを含む体積を固定した食塩水に、数を低減した標識膜ゴーストを懸濁することによってＭＢＳの分析を実施する。２４時間の時点で、十分に混合した懸濁液をサンプリングすることによって存在する標識の総量を測定する；次に、膜ゴーストを遠心分離によりペレット化し、上澄み液に放出された標識の分量を測定し、全標識の割合として表す。懸濁液１ｍｌ当たりのゴースト数に対して保持率をプロットし、５×１０⁷ゴースト／ｍｌと、４×１０⁸ゴースト／ｍｌ間の曲線の下の部分でＭＢＳを測定する。この分析では、無限の膜結合安定性を示す化合物は３．５×１０¹⁰のＭＢＳとなり、この最大ＭＢＳに対する比率として結果を表す。
次表は、上記の例１で記述したＭＲＣ測定と、本例のＭＢＳ測定から得たデータを、本発明の化合物の代表的な試料についてそれぞれ記載したものである。Ｏ〜Ｔで表す化合物は上記の式ＸＩＩの化合物であり、ここでＸおよびＸ₁はＣ（ＣＨ₃）₂を表し、ＺおよびＺ₁はＨを表し、Ｒ／Ｒ₁は、Ｃ−１２／Ｃ−１０（化合物Ｏ）、Ｃ−２２／Ｃ−１２（化合物Ｐ）、Ｃ−１４／Ｃ−３（化合物Ｑ）、Ｃ−１４／Ｃ−１４（化合物Ｒ）、Ｃ−１６／Ｃ−１６（化合物Ｓ）、Ｃ−２２／Ｃ−１４（化合物Ｔ）を表す。

前記の表から、ＭＢＳ分析によって、ＭＲＣがほぼ同一だがｉｎ ｖｉｖｏで異なる生体膜との結合安定性を示す化合物を識別できることがわかる。
本発明の様々な適用において、適切な結合の特徴で化合物を選ぶためにＭＢＳ分析を用いることの付加的な利点は、膜結合安定性に対する頭基構造の変化の作用を確認できることであるのに対し、ＭＲＣ分析では、これは不十分にしか実施できない。下記の表ＩＩＩに見られるように、炭化水素尾部の長さ（対称構造および非対称構造の比較ができるように炭素等価物として表した）と頭部基構造とは、ともに膜結合安定性に対して顕著な作用を備えることができるが、低い炭素等価物数から中程度の炭素等価物数の場合は頭基の作用の方がより顕著である。したがって、本発明の適用（例えば、放射性金属キレート、蛋白質、ペプチド、放射性核種、およびその類似物）に役立つ様々な官能基を備える他の種類の頭部基に対しても同様の作用を求めることができ、頭部基の作用と、望ましい膜結合安定性に達するために必要な炭素等価物との間の平衡を見積もることができる。少なくとも約３０％またはそれ以上のＭＢＳを備える化合物は、ここに記述した種類の本発明の適用上有益であることが期待される。さらに、炭素等価物の数が一定に維持された場合でも、頭部基上の置換基が膜結合安定性に対して顕著な作用を備えうることも観察することができる。下記の表ＩＩＩに見られるように、ＡＣ化合物とＡＤ化合物は頭部基置換基が異なるだけであるが、各ＭＢＳは非常に異なっている。
表ＩＩＩでは、Ｕ，Ｗ，Ｙで表す化合物は上記の式ＸＩＩＩの化合物であり、ここで各化合物のＸおよびＸ₁はＯを表し、ＺおよびＺ₁はＨを表し、Ｒ／Ｒ₁は、Ｃ−２２／Ｃ−３０（化合物Ｕ）、Ｃ−１４／Ｃ−１４（化合物Ｗ）、Ｃ−１８／Ｃ−１８（化合物Ｙ）を表す；さらに、Ｖ、Ｘ、ＡＡで表す化合物も式ＸＩＩの化合物であり、ここでＸおよびＸ₁はＳを表し、ＺとＺ₁はＨを表し、Ｒ／Ｒ₁はＣ−２２／Ｃ−３（化合物Ｖ）、Ｃ−１４／Ｃ−１４（化合物Ｘ）、Ｃ−１８／Ｃ−１８（化合物ＡＡ）を表す。
ＡＢ、ＡＣ、ＡＤで表す化合物は上記の式ＸＩＩの化合物であり、ここでＸおよびＸ₁は（ＣＨ₃）₂を表し、Ｚ₁はＨを、さらにＲ／Ｒ₁は、Ｃ−１４／Ｃ−２２（化合物ＡＢ）、Ｃ−１４／Ｃ−３（化合物ＡＣ、ＡＤ）を表す。化合物ＡＢでは、Ｚは−ＣＨ₂−ＮＨＯＣＨを表す。化合物ＡＣでは、ＺはＨを表す。化合物ＡＤでは、Ｚは以下に示すような非切断可能コルヒチン誘導体を表す。

表ＩＩＩに示した多くの対称性色素は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲから製品として入手することができる。

例３
化合物の調整
ａ．５−アミノメチル−１’−ドコサニル−１−テトラデシル−３、３、３’、３’−テトラメチルインド−カルボシアニンヨウ化物
表題の化合物を反応機構１に従って上述のように調整した。以下の記述では、括弧中に示す数字は反応機構１に示した対応する数字の試薬を示している。得られた生成物は化合物８の式で与えられ、ＸおよびＸ₁がＣ（ＣＨ₃）₂を、Ｒ／Ｒ₁がＣ₁₄Ｈ₂₉／Ｃ₂₂Ｈ₄₅を表し、ＡはＩを表す。
５−（Ｎ−フタルイミドアミノメチル）−２、３、３−（３Ｈ）−トリメチルインドレニン（１）を、Ｇａｌｅら、Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．、３０：６９３（１９７７）の方法を修正して調整した。２、３、３−（３Ｈ）−トリメチルインドレニン（２３．８５ｇ、０．１５モル、Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１５０ｍｌの濃硫酸に溶解させた。次に、氷浴槽内にフラスコを置き、Ｎ−ヒドロキシメチルフタルイミド（２６．５５ｇ、０．１５モル、Ｆｌｕｋａ）を３０分以上にわたって一部ずつ加えた。氷浴槽を取り外し、溶液を室温で５日間攪拌した。次に反応混合物を２００ｇの粉砕氷上に注ぎ、必要に応じて氷を付加することによって温度を３５℃以下に保ちながら、５０％のＮａＯＨ溶液でｐＨを９．０に調整した。その結果得られた沈澱物を濾過によって集め、蒸留水で洗浄し、高圧化で一晩乾燥させた。未加工の生成物を塩化メチレン／ヘキサンから再結晶化し、５−（Ｎ−フタルイミドアミノメチル−２、３、３−（３Ｈ）−トリメチルインドレニンを生成させる（１）（３０ｇ、６３％）。
ＰＣＴ／ＵＳ８９／０００８７に記述された方法を用いて、ドコサニル４−クロルベンゼンスルホン酸塩を調整した。
テトラジシル４−クロルベンゼンスルホン酸塩を、同様の方法で調整した。５−（Ｎ−フタルイミド−アミノメチル）−２、３、３−（３Ｈ）−トリメチルインドレニン（６．３６ｇ，２ｍｍｏｌ）と、テトラデシル−４−クロルベンゼンスルホン酸塩（７．６２ｇ、２ｍｍｏｌ）を結合し、両者を１３０℃で２時間加熱した。次に反応混合物を室温まで冷却し、未加工生成物を純粋な５−（Ｎ−フタルイミドアミノメチル）−１−テトラデシル−２、３、３−（３Ｈ）−トリメチルインドレニウム４−クロルベンゼンスルホン酸塩（２）（１０．２３ｇ、７２％）、ｍ．ｐ．＝１４１℃を生成するために、酢酸エチルから再結晶化した。
２、３、３−トリメチル−（３Ｈ）−インドレニン（６．２６ｇ、０．０４モル Ａｌｄｒｉｃｈ）と、ｎ−ドコサニル−４−クロルベンゼンスルホン酸塩（２０．０２ｇ、０．０４モル）をもとに攪拌しながら３時間１４０℃で加熱した。その後反応混合物をワックス状固体になるように室温まで冷却した。次にその固体をエタノール（２５０ｍｌ）に溶解させ、２００ｍｌの飽和ＫＩ溶液を付加し、その溶液を３０分間攪拌した。１リットルの冷水を加え、さらに１５分間攪拌を継続した。その結果得られた沈澱物を集め、蒸留水で２度洗浄し、高圧下で一晩乾燥させた。未加工物質を塩化メチレン／ヘキサンから再結晶化し、純粋な１−ドコサニル−２、３、３−（３Ｈ）トリメチル−インドレニウムヨウ化物（５）（１４．５ｇ、６１％）、ｍ．ｐ．＝１０７〜１１０℃を生成した。
１−ドコサニル−２、３、３−（３Ｈ）−トリメチルインドレニウムヨウ化物（８．９４ｇ、０．０１５モル）、Ｎ、Ｎ−ジフェニルホルムアミジン（２．９４ｇ、０．０１５モル、Ａｌｄｒｉｃｈ）と無水酢酸（６０ｍｌ）を冷却器を取り付けた丸底フラスコに入れ、アルゴンでフラスコを浄化し、その後、冷却器を乾燥管に接続した。そのフラスコをあらかじめ加熱した（１６０℃）油浴槽に入れ、６０分間還流した。次にフラスコを油浴槽から取り出しし、室温まで冷却した。その後、１リットルの三角フラスコに移し、エタノール（６０ｍｌ）と、続いて６０ｍｌの飽和ＫＩ溶液で希釈し、その混合物を３０分間攪拌した。冷水（８００ｍｌ）を加え、さらに１５分間攪拌を続けた。沈澱した生成物を濾過によってて集めて蒸留水で洗浄し、高圧化で一晩乾燥させて、２−（β−アセトニルイドビニル）−１−ドコサニル−３、３−（３Ｈ）ジメチルインドレニウムヨウ化物（６）（１０．５２ｇ、９５％）、ｍ．ｐ．＝９８〜１００℃を生成した。さらに生成を行うことなく未加工生成物を使用した。
５−（Ｎ−フタルイミドアミノメチル）−１−テトラデシル−２、３、３−（３Ｈ）−トリメチルインドレニウム４−クロロベンゼン−スルホン酸塩（２）（１４．１ｇ、２０ｍｍｏｌ）を３００ｍｌの濃縮したＨＣｌ中に溶解させた。その溶解をゆっくりと１１５℃まで加熱し（泡立ちに注意）、２２時間還流させた。その後この混合物を室温まで冷却し、氷浴槽内に入れた。温度を１５℃から２０℃の間に保ちながら、水酸化アンモニウム（３０％）を用いてｐＨ９．０に調整した。その後、その溶液を蒸留水で２倍の容積に希釈し、塩化メチレン（３×２００ｍｌ）で抽出した。塩化メチレン抽出物を結合し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮して黄色の油（３）（６．９ｇ、９０％）として５−アミノメチル−３、３−ジメチル−２−メチレン−１−テトラデシル−インドリンを生成した。
５−アミノメチル−３、３−ジメチル−２−メチレン−１−テトラデシル−インドリン（３）（１４．８８ｇ、３８．７５ｍｍｏｌ）を、メチルホルマート（７５ｍｌ）中に溶解し、アルゴン下で還流（５５℃）するために２４時間加熱した。次に溶液を室温まで冷却し、メチルホルマートを蒸発させた。残留物をヘキサンから再結晶化し、５−（Ｎ−ホルミルアミノメチル）−３、３ジメチル−２−メチレン−１−テトラデシル−インドリン（４）（１０．８５ｇ、６８％）を生成した。
２−（β−アセトンイリドビニル）−１−ドコサニル−３、３−（３Ｈ）−ジメチルインドレニウムヨウ化物（６）（７４０ｍｇｓ、１ｍｍｏｌ）と、５−（Ｎ−ホルミルアミノメチル）−３、３−ジメチル−２−メチレン−１−テトラデシル−インドリン（４）(３３０mg、０．８ｍｍｏｌ）と、無水酢酸ナトリウム（１５０mg、１．８ｍｍｏｌ）をイソプロパノール中で溶解させ、室温で２４時間攪拌した。その後その溶液を２５０ｍｌの三角フラスコに移し、エタノール（２０ｍｌ）と飽和ＫＩ溶液（２０ｍｌ）で希釈し、その混合物を３０分間攪拌した。１００ｍｌの冷水を付加することによって生成物を沈澱させ、その結果得た溶液を１５分間攪拌した。濾過によって沈殿物を集め、蒸留水で洗浄し、高圧下で一晩乾燥させた。未加工生成物（８７０mg）を二つの群に分け、それぞれをｆｌａｓｈカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、メチレン塩化物中に１０％のイソプロパノール）によって精製し、純粋な１'−ドコサニル−５（Ｎ−ホルミルアミノメチル）−１−テトラデシル−３、３、３'、３'テトラメチルインドカルボシアニンヨウ化物（７）（４１４mg、５２％）を生成した。
１００ｍｌｓの濃縮ＨＣｌ：メタノール溶液（１１ｍｌの濃縮ＨＣｌと１２０ｍｌｓのメタノールを混合して調整）を、１’−ドコサニル−５−（Ｎ−ホルミルアミノメチル）−１−テトラデシル−３、３、３'、３'−テトラメチルインドカルボシアニンヨウ化物（７）（２５０ｍｇｓ）に付加し、溶液を室温で１６〜２４時間攪拌した。その後その溶液を氷水（１００ｍｌ）で希釈し、氷浴槽内で冷却し、飽和重炭酸ナトリウム溶液をゆっくり加えて、ｐＨを７．５〜８．０に調整した。その後水相を塩化メチレン（２×１００ｍｌ）で抽出し、その結合有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過、濃縮し（Ｂｕｃｈｉ浴槽 温度＜３０℃）、その後高圧下で乾燥させて生成物を得た（８）（２４０ｍｇｓ、９８％）。
ｂ．２−［３−（２、３−ジヒドロ−３、３−ジメチル−５−アミノメチル−１−テトラデシル−（２Ｈ）−インドール−２−イリデン）−１−プロペニル］−１−ドコサニル−ベンゾキサゾリウムヨウ化物
さらに表題の化合物を反応機構１に従って調整した。以下の記述中においても、括弧中に示した数字は反応機構１に示した対応する数字の試薬を示している。得られた生成物は化合物（８）の式を備え、ＸがＣ（ＣＨ₃）₂、Ｘ₁が酸素、Ｒ／Ｒ₁がＣ₁₄Ｈ₂₉／Ｃ₂₂Ｈ₄₅、Ａがヨウ化物を表している。
上述のように調整した２−メチルベンゾキサゾール（２．６５ｇ、１９．９ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）とドコサニル−４−クロルベンゼンスルホン酸塩（１０．０ｇ、１９．９ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液を１６０〜１７０℃（油浴槽温度）で６時間加熱した。その後反応混合物を室温まで冷却し、その結果として得られた固体塊を塩化メチレンから再結晶化し、純粋１−ドコサニル−２−メチルベンゾキサゾリウム−４−クロルベンゼンスルホン酸塩（５）（７．３ｇ、５８％）、ｍ．ｐ．＝１２４〜１２５℃を生成した。
１−ドコサニル−２−メチル−ベンゾキサゾリウム−４−クロルベンゼンスルホン酸塩（５）（１．５ｇ、２．３６ｍｍｏｌ）、Ｎ、Ｎ'−ジフェニル−ホルムアミジン（０．４６２ｇ、２．３６ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）と無水酢酸（７ｍｌ）の攪拌した溶液を、油浴槽内（あらかじめ１６０℃まで加熱）で３０分間還流した。室温まで冷却し、その混合物を無水エタノール（１５ｍｌ）で希釈し、次に飽和カリウムヨウ化物溶液（１０ｍｌ）で希釈して３０分間攪拌した。その後水（１５０ｍｌ）を加え、沈澱した生成物を濾過して集め、水で洗浄し、高圧下で一晩乾燥させた。乾燥した未加工生成物を、酢酸エチルから再結晶化し、純粋２−（β−アセトンイリドビニル）−１−ドコサニル−ベンゾキサゾリウムヨウ化物（６）（１．５１ｇ、９０％）、ｍ．ｐ．＝６７−６８℃を生成した。
上記の３ａのように調整した２−（β−アセトンイリドビニル）−１−ドコサニル−ベンゾキサゾリウムヨウ化物（６）（１．１０ｇ、１．５３ｍｍｏｌ）、５−（Ｎ−ホルミルアミノメチル）−１−テトラデシル−３、３−ジメチル−２−メチレンヨウ化物（４）（６３ｍｇｓ、１．５３ｍｍｏｌ）と、トリエチルアミン（０．５ｍｌ）およびエタノール（２５ｍｌ）を、１時間加熱した還流した。その後溶液を室温まで冷却し、三角フラスコに移してエタノール（４０ｍｌ）と飽和ＫＩ溶液で希釈した。その後この混合物を３０分間攪拌し、２００ｍｌの冷水を加え、この溶液を塩化メチレンで抽出した。塩化メチレン抽出物を混合し、硫酸マクネシウムで乾燥させ、濾過し、未加工生成物を得るために濃縮した。この生成物を、ｆｌａｓｈカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、塩化メチレン中に５％のメタノール）で精製し、２−［３−（２、３−ジヒドロ−３、３−ジメチル−５−（Ｎ−ホルミルアミノメチル）−１−テトラデシル−（２Ｈ）−インドール−２−イリデン）−１−プロペニル］−１−ドコサニル−ベンゾキサゾリウムヨウ化物（７）（３０５ｍｇｓ、２０％）を生成した。
上記のａのように調整した２５ｍｌｓの濃縮ＨＣＬ：メタノール溶液を、２−［３−（２、３−ジヒドロ−３、３−ジメチル−５−（Ｎ−ホルミルアミノメチル）−１−テトラデシル−（２Ｈ）−インドール−２−イリデン）−１−プロペニル］−１−ドコサニル−ベンゾキサゾリウムヨウ化物（７）（５０ｍｇｓ）に加え、その溶液を室温で１６〜２４時間攪拌した。その後その溶液を氷水（３０ｍｌ）で希釈し、氷浴槽内で冷却し、飽和重炭酸ナトリウム溶液をゆっくり加えることによってｐＨを７．５〜８．０に調整した。その後塩化メチレン（２×５０ｍｌ）で水相を抽出し、硫酸ナトリウムで結合有機相を乾燥させ、濾過して濃縮し（Ｂｕｃｈ浴槽 温度０〜５℃）、その後高圧下で乾燥させ、生成物を作成した（８）（４８ｍｇｓ、９９％）。
Ｃ．５−アミノメチル−１'−ドコサニル−１−テトラデシル−３、３、３'、３'−テトラメチルインドカルボシアニンヨウ化物のテレフタロイルＮ−ヒドロキシルスクシンイミドエステル誘導体
室温、アルゴン大気下でカニューレ管を用いて、乾燥テトラヒドロフラン（３０ｍｌ）内でテレフタル酸のジ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの攪拌した溶液（１００ｍｇｓ、０．２７８ｍｍｏｌ）（塩化テレフタロイルをＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させることによって調整）に、上記の例３ａのようにテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）中で調整した５−アミノメチル−１'−ドコサニル−１−テトラデシル−３、３、３'、３'−テトラメチルインドカルボシアニンヨウ化物の溶液を加えた。その結果得た溶液を２時間攪拌し、その後Ｂｕｃｈｉ上で濃縮した。その結果得た未加工生成物をｆｌａｓｈカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、塩化メチレン中に５％のメタノール）で精製し、表題の化合物（１０１ｍｇｓ、３４％）を提供した。
ｄ．物質Ｐ−５−脂肪親和性シアニン抱合体
物質Ｐ（２１ｍｇｓ、０．０１３ｍｍｏｌ）と、上記の例３ｃの生成物（３０ｍｇｓ、０．０２４ｍｍｏｌ）の攪拌した溶液に、乾燥ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）内で、０〜２℃のアルゴン大気内でトリエチルアミン（６０ｕｌ）を加え、その結果得られた溶液を０〜２℃で４時間攪拌した。その後、トリフルオロ酢酸（１００ｕｌ）を付加することによって反応生成物を急冷し、その溶液を２５０ｍｌのフラスコに移し、水（８０ｍｌ）で希釈して一晩凍結乾燥させた。その結果得られた試料をオクタデシルシリカゲルのカラムを通すことで精製し、最初は８０：２０：１（メタノール：水：トリフルオロ酢酸）で非抱合ペプチドを溶離し、次に１００：２：１（メタノール：水：トリフルオロ酢酸）で目的の生成物を溶離した。ペプチド−脂肪親和性シアニン抱合体を含む分画を混合し、Ｂｕｃｈｉ上で濃縮し、その残留物を水（５０ｍｌ）から凍結乾燥させて紫色の粉状の純粋抱合体を生成した（１４ｍｇｓ、４０％）。ｈｐｌｃによる純度は９０％以上であり、遊離した物質Ｐより０．０２％小さかった。このようにして得られた抱合体は、以下の構造式で与えられる（物質Ｐのアミノ酸配列を示すために従来の３文字記号を使用）：

ペプチドとシアニンリポーターの両者がスペーサ成分にアミノ結合を介して結合しているため、結果として生じた抱合体は、各々ｉｎ ｖｉｖｏでは比較的安定なはずである。
ｅ．２−［３−（２、３−ジヒドロ−３、３−ジメチル−５−（＋）−ビオチンアミドメチル−１−テトラデシル−（２Ｈ）−インドール−２−イリデン）−１−プロペニル］−１−ドコサニル−ベンゾキサゾリウムヨウ化物
上記の例３ｄに記述したように調整した２−［３−（２、３−ジヒドロ−３、３−ジメチル−５−アミノメチル−１−テトラデシル−（２Ｈ）−インドール−２−イリジン）−１−プロペニル］−１−ドコサニル−ベンゾキサゾリウムヨウ化物（５３ｍｇｓ、０．０５５ｍｍｏｌ）の溶液を、ジメチルホルムアミド内、アルゴン気体下で氷浴槽内で冷却した。この溶液に、（＋）−ビオチン４−ニトロフェニルエステル（２３ｍｇｓ、０．６３ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を付加し、その後イミダゾール（１６ｍｇｓ、０．２３ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）と溶液を氷浴槽内で１時間攪拌し、室温で一晩おいた。その後、反応混合物をＢｕｃｈｉ内で高圧化で濃縮し、残留物にｆｌａｓｈクロマトグラフィを実施（シリカゲル、塩化メチレン中７．５％メタノール、その後塩化メチレン中１０％メタノール）、表題の化合物を生成した（２２ｍｇｓ、３６％）。
ｆ．５−｛６−（６−（＋）−ビオチノイルアミドヘキサンアミド）−ヘキサンアミドメチル｝−１'−ドコサニル−１−テトラデシル−３、３、３'、３'−テトラメチルインドカルボシアニンヨウ化物
上記例３ｅに記述したものと同様の方法を、以下の分量の試薬に対して再度使用した：上記のように調整した５−アミノメチル−１'−ドコサニル−１−テトラデシル−３、３、３'、３'−テトラメチルインドカルボシアニンヨウ化物（９０ｍｇｓ、０．０９ｍｍｏｌ）と、６［（６−（ビオチノイル）アミノ）ヘキサノイルアミノ］カプロン酸Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジルエステル（５５ｍｇｓ、０．０９７ｍｍｏｌ、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と、ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）とイミダゾール（２０ｍｇｓ、０．２４ｍｍｏｌ）。Ｆｌａｓｈクロマトグラフィ（シリカゲル、塩化メチレン中１０％メタノール）によって、表題の化合物（２７．５ｍｇｓ、２１％）を生成した。
化合物２−［３−（２、３−ジヒドロ−３、３−ジメチル−５−（６−｛（＋）−ビオチンアミド｝−ヘキサミドメチル）−１−テトラデシル−（２Ｈ）−インドール−２−イリデン）−１−プロペニル］−１−ドコサニル−ベンゾキサゾリウムと、２−［３−（２、３−ジヒドロ−３、３−ジメチル−５−（６−（６（＋）−ビオチノイルアミドヘキサミド）−ヘキサミドメチル）−１−テトラデシル−（２Ｈ）−インドール−２−イリデン）−１−プロペニル］−１−ドコサニル−ベンゾキサゾリウム塩は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジイル６−（ビオチンアミド）カプロン酸塩と、６［６−（（ビオチノイル）アミノ）ヘキサノイルアミノ］カプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルとから、それぞれ同様に調整した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから入手）。
ｇ．Ｎ−ｎ−ドコサニル−Ｎ'−ｎ−テトラデシル−５−トリブチルスタニル−３、３、３'、３'−テトラメチルインド−カルボシアニン塩化物
反応機構２に従って表題の化合物を合成した。得られた生成物は、化合物（１３）の式で与えられ、ＸおよびＸ₁はＣ（ＣＨ₃）₂を表し、Ｒ／Ｒ₁はＣ₂₂Ｈ₄₅／Ｃ₁₄Ｈ₂₉を表し、ＡはＣｌを表している。４−インドフェニルヒドラジンを、Ｂｌａｉｋｉｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、３１３：２９６（１９２４）の方法を用いて調整した。水（１００ｍｌ）に溶解させた硝酸ナトリウム（１６．５６ｇ、０．２４モル、Ａｌｄｒｉｃｈ）を、氷水（６００ｍｌ）中の４−イオドアニリン（４３．９ｇ、０．２０モル、Ａｌｄｒｉｃｈ）と０〜２℃まで冷却した濃塩酸（２００ｍｌ）との溶液に、４５分間以内に一滴ずつ加えた。その反応混合物を、０〜２℃でさらに３０分間攪拌し、その後反応混合物の温度を０〜２℃の間に維持しながら、ｃ．ＨＣｌ（１５０ｍｌ）中の塩化スズ（ＩＩ）（１５１．６８ｇ、０．８モル、Ａｌｄｒｉｃｈ）を９０分間以上にわたって一滴ずつ加えた。この付加ののち、結果として得た溶液を室温まで温めて、３時間攪拌した。その後、溶液から分離した黄色い固体を濾過によって集め、氷水（８００ｍｌ）中に入れ、２５％の水性水酸化カリウムでｐＨを１０に調整した。その結果得た固体を濾過によって集め、少量の水で洗浄し、真空下で乾燥させた。その後、その生成物をトルエン（４００ｍｌ）中に入れ、不溶性不純物を除去するために濾過した。ヘキサン（１２００ｍｌ）を加え、冷蔵庫で冷却しながら、分離した黄色の針状物を濾過によって集め、ヘキサン（１００ｍｌ）で洗浄し、高真空下で乾燥させ、純粋４−イオドドフェニルヒドラジン（２３．３６ｇ、５０％）、ｍ．ｐ．＝９４℃を生成した。
Ｍｏｒｅａｕら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｃｈｉｍ．Ｔｈｅｒ．、９（３）：２７４−２８０（１９７４）の方法を修正して、５−イオド−２、３、３−トリメチル−（３Ｈ）−インドレニン（９）を調整した。４−インドフェニル−ヒドラジン（２３．３６ｇ、０．０９９８モル）と、エタノール（１００ｍｌ）中の２−メチルブタノン（８．５９ｇ、０．０９９８モル）を、３時間還流した。その後、エタノール（１００ｍｌ）中に溶解させた濃縮硫酸（９．９２ｇ、０．０９９８モル）を、一時間以上にわたって一滴ずつ加え、その結果得られた溶液をさらに３時間還流した。室温まで冷却したのち、沈澱した固体を濾過によって除去し、濾液を８０ｍｌまで濃縮し、その後氷水中に注いだ。その後水性溶液を塩化メチレンで抽出し、混合有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過、濃縮して、未加工生成物を生成した（２６．９ｇ、９５％）。純粋な生成物５−イオド−２、３、３−トリメチル−（３Ｈ）−インドレニン（９）（１６．７ｇ、５９．０％）は、ｂ．ｐ．８１〜８８℃で０．０３ｍｍＨｇの真空蒸留後に得た。
５−イオド−２、３、３−トリメチル−（３Ｈ）−インドレニン（２．８５ｇ、０．０１モル）とｎ−ドコサニル−４−クロルベンゼンスルホン酸（５．５５ｇ、０．０１モル）を連続的に４時間攪拌しながら１３０℃（油浴槽温度）まで加熱した。その後冷却した反応混合物を、酢酸エチルから再結晶化し、Ｎ−ｎ−ドコサニル−５−イオド−２、３、３−トリメチルインドリニウム４−クロルベンゼンスルホン酸塩（１０）（４．６２ｇ、５９％）ｍ．ｐ．＝１１８℃のタンニン結晶を提供した。
２、３、３−トリメチル−（３Ｈ）−インドレニン（６．３６ｇ、０．０４モル、Ａｌｄｒｉｃｈ）とｎ−テトラデシル−４−クロルベンゼン−スルホン酸塩（１５．５２ｇ、０．０４モル）の両者を１３０〜１３５℃（油浴槽温度）で３時間連続的に攪拌しながら加熱熱した。その後未加工試料をエタノール（２００ｍｌ）中に溶解させ、次に飽和ヨウ化カリウム溶液（５０ｍｌ）とともに３０分間攪拌した。冷水（５００ｍｌ）を加え、沈澱物を濾過によって集め、冷水で十分に洗浄した。乾燥した未加工物を酢酸エチルから結晶化し、集めた結晶をエーテルで十分に洗浄し、乾燥させて、Ｎ−テトラデシル−２、３、３−トリメチルインドリニウムヨウ化物（５）（１２．８ｇ、６６．８％）ｍ．ｐ．９７℃を生成した。
Ｎ−ドコサニル−５−イオド−２、３、３−トリメチルインドリニウム４−クロルベンゼンスルホン酸塩（２．３６ｇ、３．０ｍｍｏｌ）、Ｎ、Ｎ'−ジフェニルホルムアミジン（０．５９ｇ、３．０ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）と、無水酢酸（２０ｍｌ）を５０ｍｌの丸底フラスコに入れ、それをアルゴン大気下で還流冷却器と攪拌棒に設置した。その後、このフラスコをあらかじめ１７０℃の一定な温度に加熱した油浴槽内に入れ、混合物を６０分間還流した。次に、その反応フラスコを室温まで冷却し、５００ｍｌの三角フラスコに移した。その後、そのフラスコを氷浴槽内に入れ、飽和ヨウ化カリウム溶液を加えた。１５分間攪拌したのち、冷水（２５０ｍｌ）を加え、混合物をさらに１５分間攪拌した。沈澱した生成物、Ｎ−ｎ−ドコサニル−５−イオド−２−（β−アセトニリドビニル）−３、３−ジメチルインドリニウムヨウ化物（１１）（２．３７ｇ、９１％）ｍ．ｐ．＝１７０℃（ｄｅｃｏｍｐ）を濾過によって集め、乾燥させた。
Ｎ−ドコサニル−５−イオド−２−（β−アセトニリドビニル）−３、３−ジメチルインドリニウムヨウ化物（５１１ｍｇｓ、０．５９ｍｍｏｌ）と、Ｎ−テトラデシル−２、３、３−トリメチルインドリニウムヨウ化物（２３３ｍｇｓ、０．４７ｍｍｏｌ）と、無水エタノール（１５ｍｌ）中の無水酢酸ナトリウム（４８ｍｇｓ、０．５９ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を室温で２４時間攪拌した。その後深紅色の混合物を三角フラスコに移し、エタノール（２５ｍｌ）で希釈した。その後水（２５ｍｌ）に溶解させた酢酸銀（４９２ｍｇｓ、２．９５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を付加し、その溶液を１５分間攪拌した。次にエタノール（２５ｍｌ）と飽和塩化ナトリウム溶液を加え、連続的に１５分間攪拌した。その後その溶液を分離漏斗に移し、水（２００ｍｌ）で希釈し、塩化メチレン（２×１００ｍｌ）で抽出した。その有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過、蒸発させ、未加工生成物を提供した。未加工生成物をｆｌａｓｈクロマトグラフィ（シリカゲル、最初に塩化メチレン中５％のメタノール、続いて塩化メチレン中に８％のメタノール）で精製し、Ｎ−ドコサニル−Ｎ'−テトラデシル−５−イオド−３、３、３'、３'−テトラメチルインドカルボシアニン塩化物（１２）（２７２ｍｇ、５８％）を生成した。
Ｎ−ドコサニル−Ｎ'−テトラデシル−５−イオド−３、３、３'、３'−テトラメチルインドカルボシアニン塩化物（１２）（２００ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、乾燥トルエン（１５ｍｌ、水酸化カルシウムから新たに蒸留）中に溶解させ、得られた溶液をアルゴン大気を通して発泡させることによって、ガス抜きを行った。次にＢｉｓ−（ｎ−トリブチルチン）（０．２３７ｍｌ、０．４７ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を注射器で加え、テトラキス−（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（２．３４ｍｇｓ、２．０ｕｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を付加した。得られた溶液をアルゴン下で４８時間還流した。その後トルエンを真空下で除去し、その残留物にｆｌａｓｈクロマトグラフィ（シリカゲル、塩化メチレン中５％メタノール）を実施し、表題の化合物を得た（１３）（７１mg、３１％）。Ｆｏｕｎｄ Ｍ＋、１１２２Ｃ₇₁Ｈ₁₂₃Ｎ₂Ｓｎ ｒｅｑｕｉｒｅｓ １１２２。
化合物（１３）は、Ｗｉｌｂｕｒら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、３０：２１６〜２２６（１９８９）によって記述された方法を用いた放射性ハロゲン原子との結合のための用途の広い中間体である。
ｈ．¹⁸⁶Ｒｅ−キレート脂肪親和性シアニン抱合体
上記に示した反応機構５に従って、表題の化合物を調整した。この反応に示す参照番号は反応機構５の数字に対応している。得られた化合物は化合物２４の式で与えられ、ＸおよびＸ₁はＣ（ＣＨ₃）₂を表し、Ｒ／Ｒ₁はＣ₁₄Ｈ₂₉／Ｃ₂₂Ｈ₄₅を表し、ＡはＩを表している。
二官能キレート剤である、４００μＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解した化合物２２（８４．５ｍｇ、０．２９１ｍｍｏｌ）を（８）（６６．８ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）を含む梨型フラスコに連続的に加えた。この溶液を室温で攪拌した。薄層クロマトグラフィ（ＴＣＬ；シリカ、９０：１０ ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ）によって反応経過を継続した。４時間後、ヘキサンによって反応混合物を希釈し、７５：２５のＴＨＦ：ヘキサン溶液を作成し、短経路シリカゲル（２０ｇ）カラムに入れた。溶離液がブロモクレゾールグリーンの陰性反応を示すまで、余剰化合物２２を５０：５０のヘキサン：ＥｔＯＡｃで溶離した。溶剤の組成を９０：１０のＣＨ₂Ｃ₁₂：ＭｅＯＨに変更し、化合物２２を溶離した。その溶剤を減圧下で蒸発させ、６５．０ｍｇの化合物２３を生成した。
高磁場の¹Ｈ ｎｍｒ（３００ＭＨｚ）は、以前にホルミルで保護された化合物８で見られたように、３．９ｐｐｍから４．５ｐｐｍまでのベンジルメチレン陽子の低磁場シフトを示した。４．５ｐｐｍと８．４ｐｐｍでの信号の相対積分（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）は１：１の結合比を示した。
生成物の化合物２３は、ＨＣｌガス／エタノール溶液の付加によってＨＣｌ塩に変換した。シュウ酸のエタノール溶液を酸化防止剤として加え、溶液を蒸発させ、蒸留した固体を窒素下で貯蔵した。
０．１ＮのＮａＯＨ（０．１８１ｍＣｉ／ｎｍｏｌ）１０７μｌ中の６０ｎｍｏｌのＮａ¹⁸⁶ＲｅＯ⁴を、１５０μｌの変換キレート溶液（２００ｍｇのクエン酸、４０ｍｇのＳｎＣｌ₂２Ｈ₂Ｏおよび２０ｍｇのゲンチジン酸を２ｍＬのＨ₂Ｏ中に溶解）に加え、続いて０．１ＭのＮａＯＨ４３μＬを加えた。その溶液を１分間、渦状に攪拌し、５５℃で１０分間加熱した。エタノール（０．６ｇｍＬ）を反応混合物に加え、続いて化合物２３（０．８ｍｇ、０．６９μｍｏｌ）のエタノール溶液３００μＬを加えた。溶液を１５秒間渦状に攪拌し、加熱を１時間継続した。
反応混合物をｓｅｍｉｐｒｅｐＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｎｏｖａｐａｋ、７．５×３００ｍｍ）に入れ、Ａ：Ｂを５０：５０の勾配からＢ１００％まで、流速４．０ｍＬ／分で３０分以上にわたって溶離した。（溶媒Ａは、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と０．０５％ゲンチジン酸を含む７５：２５のＨ₂Ｏ：ＣＨ₃ＣＮ。溶媒Ｂは、０．１％のＴＦＡと０．０５％のゲンチジン酸を含む２０：８０のＣＨ₃ＣＮ：ＴＨＦ）。約２０分間溶離した分画を、表題化合物を含む分画として確認した。
上記の分画を、溶媒１（Ｈ₂Ｏ中に０．０５％のゲンチジン酸）１で１：１に希釈し、最初に１０ｍＬの溶媒２（ＥｔＯＨ中に０．０５％のゲンチジン酸）、続いて１０ｍＬの溶媒１で洗浄したＳｅｐ−Ｐａｋカラム（Ｃ−１８、Ｗａｔｅｒｓ ３６８０５）に入れた。カラムを１０ｍＬの溶媒１、１５０μＬの溶媒２と、および３００μＬの溶媒２で溶離した。Ｎ₂気流によって１０μＬの体積までその溶媒を蒸発させ、その後ＥｔＯＨで４０μＬまで希釈した。
た。特異的活性は、１８１ｍＣｉ／μｍｏｌの理論値に対して、１８６±２１ｍＣｉ／μｍｏｌであった。生成物の回復は、全Ｒｅ−１８６の９％未満であった。１日後にＨＰＬＣによって放射性純度を測定し９４％未満であることを見出した。不純物（〜５％）の大部分空洞体積（ｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅ）で見出し、遊離過レニウム酸塩と考えられた。
ｉ．７−Ｎ（５−オキソペンタノイル）デアセチルコルチシン脂肪親和性シアニンヒドラゾン抱合体と、酸切断性の測定
（ａ）調整
上記の反応機構３に記載した一般的方法に従って表題の化合物を調整した。ここにおける引例番号は、反応機構３に示した数字と対応している。得られた生成物は化合物１９の式で与えられ、ＸおよびＸ₁＝Ｃ（ＣＨ₃）₂、Ｒ／Ｒ₁＝Ｃ₁₄Ｈ₂₉／Ｃ₂₂Ｈ₄₅、ＡはＣｌを表す。
５−アミノメチル−１'−ドコサニル−１−テトラデシル−３、３、３'、３'−テトラメチルインドカルボシアニンヨウ化物（化合物８）を、ＲがＣ₁₄Ｈ₂₉；Ｒ₁がＣ₂₂Ｈ₄₅；ＸおよびＸ₁＝Ｃ（ＣＨ₃）₂である反応機構１の一般的方法を用いて調整した。
ジメチルホルムアミド（１５ｍｌ、リチウム水酸化アルミニウムから蒸留）中で、モノメチルグルタル酸塩の攪拌溶液（０．１４ｍｌ、１．１ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１２６．５ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を室温で加えた。この混合物を氷浴槽内で冷却し、ジシクロヘキシルカルボジイミド（２２６．６ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）を加えた。その反応混合物を徐々に室温まで温め、さらに３時間攪拌した。次に、その反応混合物を新たに調整した化合物８（７００ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）の含むフラスコに移し、この反応混合物を室温で３０時間攪拌し続けた。その後ジメチルホルムアミドを高圧下で除去し、結果として得られた未加工生成物を無水エタノール（２５０ｍｌ）と水（２５０ｍｌ）で希釈した。その後、酢酸銀（４３４ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）を加えて３０分間攪拌したのち、飽和塩化ナトリウム溶液（１００ｍｌ）を加え、その混合物をさらに３０分間攪拌した。水層を塩化メチレン（４×１００ｍｌ）で抽出し、混合有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して濃縮した。残留物に対してｆｌａｓｈクロマトグラフィ（シリカゲル、塩化メチレン中で２．５％、続いて１０％のメタノールで溶離）を実施し、５−［Ｎ−（モノメチルグルタリル）−アミノメチル］−１'−ドコサニル−１−テトラデシル−３、３、３'、３'−テトラメチルインドカルボシアニン塩化物（１４）（５２０ｍｇ、６３％）を生成した。
得られた５−［Ｎ−（モノメチルグルタリル）−アミノメチル］−１'−ドコサニル−１−テトラデシル−３、３、３'、３'−テトラメチル−インドカルボシアニン塩化物（５２０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）の無水エタノール中の攪拌した溶液に、無水ヒドラジン（５ｍｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）をゆっくりと室温で加えた。その反応混合物を２時間連続的に攪拌し、その後、回転蒸発させて濃縮し、その残留物に対してｆｌａｓｈクロマトグラフィ（シリカゲル、塩化メチレン中１０％、続いて３０％のメタノールで溶離）を実施し、５−［Ｎ−（モノヒドラジノ）グルタリル−アミノメチル］−１'−ドコサニル−１−テトラデシル−３、３、３'、３'−テトラメチル−インドカルボシアニン塩化物（１５）（１１０ｍｇ、２７％）を生成した。
無水グルタル酸（１１１．２ｍｇ、０．９７５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を室温で塩化メチレン（５ｍｌ）中の攪拌したデアセチルコルヒチン（１６）（０．２９０２ｇ、０．８１ｍｍｏｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）に加え、その反応混合物を室温で２時間連続的に攪拌した。その後、塩化メチレンを回転蒸発で除去し、未加工生成物を高真空下で乾燥させ、７−（Ｎ−グルタリル）デアセチルコルヒチン（０．３９７ｇ、１００％）を固体として生成した。
次に、カルボニルジイミダゾール（０．１９７ｇ、１．２２ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を、ジメチルホルムアミド（５ｍＬ、水素化リチウムアルミニウムから新たに蒸留）中で７−（Ｎ−グルタリル）デアセチルコルヒチン（０．３９７ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）の溶液を攪拌したものに室温で加え、その反応混合物を室温で２時間攪拌し続けた。この時間内に溶液中に沈澱物が形成された。ジメチルホルムアミドを真空蒸留によって除去し、残留物を塩化メチレン（５ｍＬ）中に溶解させた。この溶液にテトラブチルアンモニウム水素化ホウ素（２５０ｍｇ、０．９７２ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、その反応混合物を３時間攪拌した。次にこれを水（５０ｍＬ）の中に注ぎ、有機層を分離し、水層を塩化メチレン（２×２５ｍＬ）で再抽出した。混合有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して濃縮した。その未加工生成物に対してｆｌａｓｈクロマトグラフィ（シリカゲル、塩化メチレン中１０％メタノール）を実施し、７−Ｎ−（５−ヒドロキシルペンタノイル）デアセチルコルヒチン（１７）（７２ｍｇ、２５％）を生成した。
塩化メチレン（５ｍＬ）中の７−Ｎ−（５−ヒドロキシルペンタノイル）デアセチルコルヒチン（７２ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）溶液に、室温でピリジニウムクロルクロム酸塩（４１．３ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、その混合物を２時間攪拌した。その後、それを水（５０ｍＬ）中に注ぎ、有機層を分離し、水層を塩化メチレン（２×２５ｍＬ）で再抽出した。結合有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して濃縮した。得られた残留物に対してｆｌａｓｈクロマトグラフィ（シリカゲル、塩化メチレン中１０％メタノール）を実施し、７−Ｎ−（５−オキソペンタノイル）デアセチルコルヒチン（１８）（３５ｍｇ、４９％）を油として生成した。
無水エタノール（２０ｍｌ）中の５−［Ｎ−グルタリル（モノヒドラジノ）−アミノメチル］−１'−ドコサニル−１−テトラデシル−３、３、３'、３'−テトラメチルインドカルボシアニン塩化物溶液（１１０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を、７−Ｎ−（５−オキソペンタノイル）デアセチルコルヒチン（４０ｍｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）を含むフラスコに加え、その反応混合物を２０時間攪拌した。その後エタノールを回転蒸発によって除去し、その残留物に対してｆｌａｓｈクロマトグラフィ（シリカゲル、塩化メチレン中１０％のメタノール）を実施し、表題の化合物を提供した。（１９）（２６．５ｍｇ、２７％）。この化合物の２００ＭＨｚプロトンＮＭＲの積算は１：１の結合比を示し、高速原子衝突質量分光法（グリセロール／チオグリセロール複合体）では、生成イオンＣ₉₀Ｈ₁₃₅Ｎ₆Ｏ₈の期待されるＭ⁺に対応し、Ｍ⁺＝１４２９を示した。さらにこの生成物は、以下に記述する条件に従って、逆相高圧流体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって特徴付けられ、５５分間の保持時間を備えていた。３５０ｎｍにおけるＵＶ検出を用いて、９８％の純度であることが見出された。０．３０％未満の遊離７−Ｎ−（５−オキソペンタノイル）デアセチルコルヒチン（保持時間＝１２分）がこの生成物中に検出された。
使用したＨＰＬＣシステムは、Ｗ６００Ｅ勾配コントローラとＵ６Ｋ注入装置およびＭｏｄｅｌ ９９０フォトダイオード配列検出装置を備えたＷａｔｅｒｓ Ｍｏｄｅｌ ６００Ｅ溶媒供給装置で構成されている。クロマトグラフィの条件は、以下の通りである：カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｎｏｖａ−Ｐａｋ（フェニル、４μｍ、３．９ｍｍ×１５ｃｍ）；Ｍｏｂｉｌｅ相：溶媒Ａ＝水：メタノール：アセトニトリル：ＰＩＣ Ａ試薬（水）（３９５：２５：８０：４）、溶媒Ｂ＝水：メタノール：アセトニトリル：ＰＩＣ Ａ試薬（水）（２２５：２５：２５０：４）、溶媒Ｃ＝メタノール：水：ＰＩＣ Ａ試薬（水）（４９０：１５：４）。勾配条件：２０分以上で１００％（Ａ）から６０％：４０％（Ａ：Ｂ）、その後１０分以上で１００％（Ｃ）まで、さらに４０分で１００％（Ｃ）。流速：２ｍＬ／分。検出：２４０〜５７５ｎｍのフォトダイオード配列。
（ｂ）酸切断性の測定
７−Ｎ−（５−オキソペンタノイル）デアセチルコルヒチンを生成するヒドラゾン抱合体（１９）の酸加水分解率を、異なる３種類のｐＨにおけるＨＰＬＣによって調査した。
緩衝液をＧｏｍｏｒｉの、“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”、１６：１３８（１９５５）の記述した方法に従って調整した。ＨＰＬＣ条件と保持時間は、上述のものと同一であった。７−Ｎ−（５−オキソペンタノイル）デアセチルコルヒチンの検出限界は、３５０ｎｍにおいて約１００ｎｇとした。
５０μｌのヒドラゾン抱合体溶液（１ｍｇ／ｍｌメタノール）を、目的のｐＨのクエン酸塩リン酸塩緩衝液（２００μｌ）を含むねじ蓋付きガラスびんに加えて、調査する化合物溶液を調整した。ガラスびんを閉じ、ＨＰＬＣ（３５０ｎｍにおける検出）によって溶液を分析し、残っている抱合体（１９）、さらに２４時間後と４８時間後に生成した７−Ｎ−（５−オキソペンタノイル）デアセチルコルヒチンを調べた。各ｈｐｌｃ注入は２００μｌであった。
ｐＨ４．２１、５．７４、７．３５における加水分解の結果を以下に要約した。
ｐＨ４．２１：２４時間後において、（１９）の７８％が切断されて（１８）を生成し、４８時間後に１００％が切断された。
ｐＨ５．７４：２４時間後において、（１９）の４５％が切断されて（１８）を生成し、４８時間後に１００％が切断された。
ｐＨ７．３５：２４時間後において、（１９）の３６％が切断されて（１８）を生成し、４８時間後に７７％が切断された。
ＨＰＬＣによって検出されたヒドラゾン抱合体の遊離コルヒチンヒドロリシス生成物だけが化合物（１８）のアルデヒドであると考えられた。
（ｊ）ヘパリン脂肪親和性シアニン抱合体
表題の化合物を、上記の反応機構４に記載した一般的方法に従って調整した。この引例番号は、反応機構４の数字に対応している。得られた生成物は化合物２１によって表される種類の式を備え、ＸおよびＸ₁＝Ｃ（ＣＨ₃）₂、Ｒ／Ｒ₁＝Ｃ₁₄Ｈ₂₉／Ｃ₂₂Ｈ₄₅、Ａ＝Ｃｌである。
上述したように化合物８を調整した。
新たに調整した化合物８（１８．０ｍｇ、１８．０μｍｏｌ）を、ＮＭＲ管中で、重水素化クロロホルム（０．５ｍｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）中に溶解させた。その後トリエチルアミン（５μｌ、０．０３６ｍｍｏｌ）、続いてトリホスゲン（１．９５ｍｇ、６．７μｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、この混合物を２分間振った。その後、プロトンＮＭＲを実施し、化合物（８）で見られたようにベンジル陽子中の３．９５から４．９５へのシフトを示し、生成物５−イソシアン酸メチレン−１'−ドコサニル−１−テトラデシル−３、３、３'、３'−テトラメチルインドカルボシアニン塩化物（２０）の形成を示した。
イソシアン酸塩の重水素化したクロロホルム溶液（２０）を回転蒸留によって濃縮し、その残留物をジメチルホルムアミド（４ｍｌ、乾燥させて蒸留）の中に溶解させ、急速に攪拌した。このように急速に攪拌した溶液に、ヘパリンのホルムアミド溶液（９．４ｍｇ／ｍｌ、２ｍｌ、０．００１６ｍｍｏｌ）を加え、さらにフラスコに蓋をし、室温で２０時間攪拌した。次に濾過によって不溶性物質を除去し、濾過液を５０℃で高真空下で回転蒸留によって濃縮した。残留物を水（２０ｍｌ）と塩化メチレンの混合物に加えた。水層を分離し、塩化メチレンで再度洗浄した。次に、水性溶液を透析バッグ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ膜 ＭＷＣＯ：１０００）に入れ、水を透析し、その後凍結乾燥させて、ピンク色の固体を生成した（２４．３ｍｇ）。この物質をさらに精製することなく、化合物２１と未反応ヘパリンの混合物であるとみなした。それを、生物学的評価のために使用した（例１４を参照）。
例４
治療上有効な蛋白質を脂肪親和性分子に抱合させることの生物学的作用
上記の例３ｄで生成した化合物のｉｎ ｖｉｖｏのレセプタ薬理学を、Ｕ．Ｆｏｒｓｔｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、２３４：１０５５〜６１（１９８７）が記述した方法と同様にして、血液を潅流させたウサギの後肢標本で調査した。ペントバルビタールで麻酔し、人工的に換気させたウサギのカニューレを挿入した頚動脈から血液を取り出し、定速ローラーポンプを用いて医療等級のｓｉｌａｓｔｉｃ管内を通過させ、カニューレを挿入した大腿動脈に導いた。大腿動脈床における末端潅流圧（ｍｍＨｇ）を、微小圧変換器（Ｍｉｌｌａｒ）が大腿カテーテル先端の僅か先に位置するように潅流管を通るようにして測定した。最初に、末端潅流圧が全身平均動脈圧に近付くようにポンプ速度を調整し、その後残りの各実験の間は血流を一定に維持した。その後、抵抗の変動は、オームの法則が記述するのと同様に末端潅流圧に従って次のように変化する：
血管抵抗＝潅流圧／血流
したがって、各実験時に血流を一定に維持することによって、圧力の低下が血管拡張を意味し、圧力の上昇が血管収縮を意味するように、末梢潅流圧の変化が直接血管抵抗に反映される。したがって、血管の生物学と、ｉｎ ｖｉｖｏで血管平滑筋の緊張に作用を及ぼすと考えられる物質の薬理学を分析するために、潅流系への直接的な注入を利用することができる。
図１は、物質Ｐと例３ｄの抱合体のｉｎ ｖｉｖｏでの反応の定性的な同一性を示す。物質Ｐと抱合体の両者が、潅流したウサギの後肢標本に局所的に注入したときに、短時間の投与量に関連した後肢潅流圧の低下を生じている。これらの拡張薬の反応は、物質Ｐの既知の血管薬理学と完全に一致している。例えば、Ｊ．Ｂｅｎｙら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、３９８：２７７から８９（１９８８）を参照。
図２に見られるように、物質Ｐと抱合体の反応の間には定量的な差が存在する。物質Ｐの平均投与量閾値はおよそ０．００３ｐｍｏｌｅｓの潅流圧の低下が起こることを必要としているのに対し、圧力の最大の低下は３〜１０ｐｍｏｌｅｓの投与量範囲で達成されている。潅流圧の低下を引き起こすのに必要な抱合体の最小投与量は物質Ｐの場合よりも大きく、１〜１０ｐｍｏｌｅｓであり、最大の低下は１０００ｐｍｏｌｅｓのときに達成している。論理関数によって物質Ｐと抱合体について計算したＥＤ₅₀値は、それぞれ０．１３と３４ｐｍｏｌｅｓであり、物質Ｐの効力が２５０倍大きいことを示している。しかし、どちらの物質も通常のレセプタの相互作用に一致する平行な投与量−反応曲線の勾配を示した。さらに図２は、既知の物質Ｐの拮抗薬である［Ｄ−ＰＲＯ²、Ｄ−Ｔｒｐ^7,9］−物質Ｐの注入時の物質Ｐと抱合体の投与量−反応関係も示している。このＤアミノ酸との位置３における合成ペプチドは、内因性物質Ｐと外因性に投与した物質Ｐのニューロン、行動および血管作用に拮抗することが報告されてきた。物質Ｐと抱合体の両者に対する潅流圧の低下は、拮抗薬が存在するときの両化合物の投与量−反応曲線の右側への平行な移動によって分析されるように、［Ｄ−ＰＲＯ²、Ｄ−Ｔｒｐ^7,9］−物質Ｐによって抑制される。拮抗薬存在下での投与量−反応曲線の右向きの移動の大きさは、物質Ｐと抱合体に関して同様であり、これらの二つの物質が共通のレセプタ部位に作用することをさらに示唆している。図２に記載したデータは、３頭のウサギを含む試験に基づいたものであり、最大反応から拮抗薬非存在下での物質Ｐまでの潅流圧の平均（±ＳＥＭ）変化率として表している。
上記に加えて、対応する非抱合脂肪親和性シアニンの１および１０ｎｍｏｌｅｓの濃度における投与が、血管弛緩作用をまったく示さなかったことが実験的に確認された。さらに、βアドレナリン受容体作用薬であるイソプロテレノールの１、１０、１００ｐｍｏｌｅｓの濃度における投与もまた、潅流圧の投与量に関連した低下を生じたが、それはＳＰ拮抗薬［Ｄ−ＰＲＯ²、Ｄ−Ｔｒｐ^7,9］−ＳＰによって拮抗されることはなく、ＳＰレセプタに対する［Ｄ−ＰＲＯ²、Ｄ−Ｔｒｐ^7,9］−ＳＰの特異性を示した。
１ｍＭのＥＤＴＡと０．５％のウサギ血清アルブミンを加えたリン酸塩緩衝食塩水に懸濁した、洗浄したウサギの赤血球に例３ｄの抱合体（１００ｕＭ）を容易に結合させ、両者をともにｅｘ ｖｉｖｏで培養した。抱合体の蛍光成分によって、フロー血球計算法を用いたＲＢＣでの素早い検出が可能になる。抱合体で標識したウサギのＲＢＣをウサギの後肢内に注入すると、潅流圧の低下が生じ、その大きさは注入した細胞の数に関係する。別の実験は、１０⁶〜１０⁹個のＲＢＣの注入によってウサギの後肢標本の潅流圧が大きく低下したことを示した。抱合体で標識したＲＢＣの標本を上澄み液分画と細胞分画に分離し、それを上記のＲＢＣ緩衝液に再懸濁して再注入すると、上澄み液分画が本来の細胞懸濁液の生物学的活性の大部分を含み、抱合体がＲＢＣを拡散させる能力を備えていることを示す。ＲＢＣの洗浄を繰り返すことによって血管拡張作用を備える上澄み液分画が生じ、ＲＢＣからの、抱合体の放出能力の延長を示唆する。
前述の実験から、上記の例３ｄの物質Ｐ脂肪親和性シアニン抱合体は自然の物質Ｐの作用と定性的に同様な血管拡張作用を備え、このような作用は物質Ｐレセプタの既知の拮抗薬によって拮抗されうるものであることが理解される。これらの実験結果は、脂肪親和性リポーター分子との化学的抱合に関わらず、物質Ｐとそのレセプタの相互作用が維持されることを示す傾向がある。
例５
脂肪親和性シアニンで誘導させた物質Ｐの構造と生物学的相互作用への細胞結合の効果の測定
例３ｄの抱合体の物質Ｐ成分が構造的に受けておらず、末梢赤血球（ＲＢＣ）の表面に認識可能であることを測定するために、２ｍｌのヒトＲＢＣ（１０⁶細胞／ｍｌ）を抱合体（１０μＭ；赤の蛍光性）を用いて標識し、その後フロー血球計算法を使用して調査した。この調査の結果を図３Ａ〜Ｃに示す。特別に、未処理のＲＢＣと抱合体で標識したＲＢＣを分析して以下のことを測定した：
１．抱合体が細胞表面上に結合していること（図３Ａの比較）。
２．イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）を抱合したヤギ抗ウサギ抗体が抱合体標識ＲＢＣあるいは非標識細胞に非特異的に結合すること（図３Ｂの比較）、あるいは
３．ウサギ抗物質Ｐ抗体＋ＦＩＴＣ抗ウサギ抗体が抱合体標識ＲＢＣに特異的に結合すること（図３Ｃの比較）。
図３Ａでは、未染色ＲＢＣの検査では、バックグラウンドの自己蛍光（緑（ＬＦＬ１）と赤（ＬＦＬ２）の軸の起点の近くに位置する細胞母集団）のみを示したが、抱合体標識細胞は、非標識細胞に比べて赤の蛍光信号の増大を示した。
図３Ｂでは、図３Ａの結果に比べ、緑の蛍光信号（ＬＦＬ１）の小さな増大によって証拠付けられるように、フルオレセインで染色したヤギ抗ウサギ抗体による抱合体標識細胞の処理が、この抗体がＲＢＣに対して最小の非特異的結合のみを行ったことを示した。
図３Ｃは、ウサギ抗物質Ｐ抗体を用いて一次試薬として間接的に蛍光標識し、その後二次試薬としてヤギ抗ウサギ抗体でフルオレセイン染色した非標識ＲＢＣあるいは抱合体標識ＲＢＣの蛍光ヒストグラムを示す。抱合体標識細胞では、細胞上に顕著な量の緑および赤の蛍光が検出可能であり（ＬＦＬ１信号が図３Ｂよりも増大）、細胞結合抱合体に対する特異的結合を示している。この蛍光の増大は、抱合体で標識しなかったＲＢＣでは認められなかった。したがってこの方法は、物質Ｐが抗物質Ｐ抗体によって抗原性にＲＢＣの表面上に”認識”されたことを示し、赤血球上における物質Ｐの構造の存在と維持を確認する。
例６
赤血球細胞上における物質Ｐ−脂肪親和性シアニン抱合体のＩｎ Ｖｉｖｏでの安定性の測定
上記の例３ｄの抱合体で標識した赤血球細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの特徴を調査するために、２頭のウサギのそれぞれから得た０．５ｍｌの新鮮な抗凝固化血液を抱合体（最終濃度１０μＭ）で標識し、血液を採取した同一のウサギに再注入した。抱合体による標識後、注入に先立って標識細胞のアリクウォットをフロー血球計算法を用いて検査し、標識が適切に行われたことを確認した。標識細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの投与に続いて、３０分、１、２、３、４、および７日目の時点で血液標本を取り出し、フロー血球計算法を用いて細胞の蛍光性を検査した。
本調査の結果を図４のグラフに示したが、そのグラフから、標識細胞からの抱合体のｉｎ ｖｉｖｏでの分離が比較的ゆっくりとした速度で起こることを理解することができる。標識細胞に関する蛍光（対数蛍光強度）は５〜６日間の半減期で低下したが、自然の物質Ｐの循環における寿命は分単位であった。
したがって、上記の実験結果から、治療薬を備える脂肪親和性分子によるバイオ粒子の標識は、治療薬の非経口投与において革新的な供給賦形剤を提供することが明らかになる。
例７
色素結合、細胞の生存可能性および膜結合安定性に対するヨウ化の作用
本化合物の化合物へのヨウ素原子の付加が、その細胞標識特性に対して実質的に影響を及ぼさないことを実証するために、化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏでの取り込み、標識後の細胞の生存可能性、および膜保持の測定を以下の化合物について実施した：

前述の反応機構１に記載し、上記の例３に記述した一般的な方法に従って、化合物Ｔ、ＡＡ、ＡＢを調整することができる。
ＳｌｅｚａｋとＨｏｒａｎ、Ｂｌｏｏｄ、７４：２１７２〜２１７７（１９８９）が記述したように、５、１０、２０μＭの標識濃度と、化合物ＡＡとＡＢについては５または１０μＭの標識濃度で回復と生存可能性を計算した。しかし、化合物ＡＡとＡＢでは２０μＭの標識濃度において生存可能性と回復が７０〜８０％に低下した。
１個の細胞当たりに結合した化合物分子の数を、１０μＭの化合物で標識した細胞について測定した。最終再懸濁と計数後に洗浄した細胞から１０⁶個の細胞のアリクウォット（１０ｕｌ）を取り出し、２５０μｌの１００％エタノールとの混合物によって細胞膜から化合物を抽出し、蛍光ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩとフィルターの組み合わせを用いて抽出物２００μｌの蛍光強度を測定した。１００％エタノール中で作成し、ＦｌｕｏｒｏｓｋａｎＩＩで測定した既知の化合物濃度のキャリブレーション曲線から各抽出物の化合物濃度を測定した。次に、既知の抽出物濃度、抽出物の全容積、および既知の抽出した細胞数から細胞１個当たりの化合物の分子数を計算した。計算値は、化合物Ｔが（４．０±０．４）×１０⁶、化合物ＡＡが（１．３±０．２）かける１０⁶、化合物ＡＢが（２．５±０．７）×１０⁶であった。
ＮＨ₄Ｃｌ溶解によって調整した赤血球膜ゴーストを用いて相対的な膜保持を測定した（ＳｌｅｚａｋとＨｏｒａｎ、Ｂｌｏｏｄ、ｓｕｐｒａ）。ゴーストを１０μＭの化合物を用い、４×１０⁸／ｍｌ、室温で前述の方法を使用して５分間標識した。しかし、ＰＢＳを含む１ｍＭのＥＤＴＡと５％のＢＳＡを使用して標識後の洗浄を実施した。最終洗浄ののち、４×１０⁸／ｍｌでＰＢＳ＋ＥＤＴＡ＋５％ＢＳＡにゴーストを再懸濁し、３７℃で２４時間培養した。２４時間の時点で二倍にした５０μｌのアリクウォットを、ａ）ゴーストの十分に混合した懸濁液（存在する全化合物の測定用）、およびｂ）ゴーストを１２、５００×ｇで１５分間ペレット化した残りの上澄み液（存在する未結合化合物の測定用）から取り出した。２００μｌの１００％エタノールの混合物によってアリクウォットを抽出し、各抽出物の蛍光強度を蛍光ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩを使用して測定した。保持された化合物の割合を次の式によって計算した：
全化合物−非結合化合物×１００
全化合物
計算値は、化合物Ｔが（９１．９±２．９）％、化合物ＡＡが（９７．７±０．２）％、化合物ＡＢが（９６．８±１．３）％であることを見出した。
前述の実験に基づいて、本発明のヨウ化化合物が、非ヨウ化化合物と同等またはより優れた膜保持特性を示すという結論を得た。赤血球膜内への結合は、等価な濃度の非ヨウ化化合物に比べてある程度低かったが、その分子サイズと分子量が大きいことから予想されるように、この差が、上述の種類の細胞標識適用における有効性を変化させるほど大きいとは思われない。
例８
人工的表面への保持
本発明の化合物が人工的表面に保持される能力を分析するために、１００％エタノール中の放射性ヨウ素（¹²⁵Ｉ）と結合した脂肪親和性シアニン（上記の化合物１２、反応機構２、例３ｇ）を、医療用ｓｉｌａｓｔｉｃ（ＳＩＬ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、およびポリエチレン（ＰＥ）を含む複数の種類の異なるプラスチック管の短い断片の管腔面に接触するように配置した。１０分間にわたって化合物が管に接触してとどまることができるようにし、その後取り出して管をＰＢＳで静かに流した。標識した管の基線放射能測定を行ったのち、約３０ｍｌの抗凝固処理を施していない新鮮なヒトの血液を含む閉じた管の回路に断片を接続した。管の回路をローラーポンプに通過させ、血液を６時間循環させた。６時間後に管の断片を取り外し、ＰＢＳを静かに流して付着した血液をすべて取り除き、放射能を計測した。この実験の結果を図５に図式的に示す。管腔面の放射性ヨウ素を結合させた化合物／ｍｍ²（棒グラフのｘ軸）をピコグラムで表すことができるように、管断片の長さ、直径、および放射性ヨウ素を結合させた本発明の化合物の特異的活性を記録した。図５は、開始時に最大量の放射性ヨウ素が結合した化合物がＰＶＣ管に結合し、ＰＥに結合した化合物が最小であったことを示している。６時間後に血液と接触した管への最大の保持を示したのはＰＶＣ（最初に保持された放射能の９７．６±２．１％）であり、ＰＣへの保持は最小であった（最初に保持された放射能の５６．０±１０．４％）。しかし、すべてに管について平均の保持は５０％を超えており、ＰＶＣでは１００％近くまで達し、本発明の化合物が、生物学的液体との接触していても長期間人工的表面にとどまる能力を備えていることを示した。したがって、本発明の化合物は、生物作用性物質の人工的表面への保持に有効となりうる。
例９
腫瘍内注入後の¹⁸⁶Ｒｅ−キレート脂肪親和性シアニン抱合体とＮａ¹⁸⁶ＲｅＯ₄のＩｎ Ｖｉｖｏでの保持
過剰なゲンチジン酸を除去し、ｉｎ ｖｉｖｏの投与前のｐＨ調整の必要を回避するためにエタノールによる生成物の溶離に先立ってＳｅｐＰａｋを約１０ｍＬの蒸留水で洗浄した点を除き、基本的に例３ｈに記述した方法に従って¹⁸⁶Ｒｅキレート脂肪親和性シアニン抱合体を調整した（反応機構５の化合物２４）。真空蒸発後、濃縮した貯蔵溶液をエチルアルコール中で約２５μＬの最終容積にした（約５００μＭの濃度の化合物２４；約１２３ｍＣｉ／μモルの特異的活性）。ｉｎ ｖｉｖｏ注入のための、約５〜６μＣｉの¹⁸⁶Ｒｅを含む化合物２４とＮａ¹⁸⁶ＲｅＯ₄の調整を以下のように行った。Ｎａ¹⁸⁶ＲｅＯ₄（ＮＥＺ３０１、０．１ＮのＮａＯＨ中）を３００ｍＯｓＭの滅菌したダルベッコのリン酸塩緩衝食塩水で希釈し、ｐＨ紙を用いてｐＨが７．０であることを確認し、次にその調整剤を０．２２μｍのフィルターを通して再滅菌した。化合物２４を滅菌３００ｍＯｓＭグルコースで希釈した。滅菌した５０μＬのハミルトン注射器に５．０μＬのＮａ¹⁸⁶ＲｅＯ₄または化合物２４の調整剤を滅菌法を用いて入れた。各調整の計数基準を提供し、全身画像の崩壊補正と生物分布測定のための基準として用いるために、別々のアリクウォットを取り出した。
腫瘍内注入後の上述の調整剤の保持を以下のように評価した。腫瘍内注入前の５〜６日間に、メスのＣ５７Ｂｌ／６マウスの右後肢への、滅菌ハンクス緩衝食塩水に懸濁した約１×１０⁶生存腫瘍細胞の接種物を用いた皮内注入によって、成長したＭＣ３８腺癌小結節を導入した。０日目に動物に再麻酔を行い、アルコール綿棒を用いて右後肢を滅菌し、化合物２４の５．０μＬのアリクウォットまたはＮａ¹⁸⁶ＲｅＯ₄を腫瘍小結節内に直径約５ｍｍで直接注入した。約１０秒間にわたって注入を実施し、さらに注入完了後５〜１０秒間その位置に針を保持して、背圧をすべて消散させ、注入部位における漏出を最小にした。注入の直後（１０〜１５分以内）と４日間にわたって毎日、１４０±２０ｋｅＶのエネルギーウインドウを使用し、ＧＥのＳｔａｒｃａｍ３００システムを用いて動物と計測基準を画像化した。２日目と４日目に画像化を終えたのち、動物群を犠牲にして各種の器官を集めて計量し、¹⁸⁶Ｒｅの生物分布を評価するためにｃｐｍ／ｇｍを測定した。
選択した器官の４日目の¹⁸⁶Ｒｅの生物分布を表ＩＶのＡに示す。結果は、注入した総数に対する、特定の器官からの回収の崩壊補正後の比率で表している。器官と腫瘍はその大きさが著しく異なっているので、各器官に見出した¹⁸⁶Ｒｅの相対濃度を表ＩＶＢで比較している。結果は、１ｇの組織塊に見出される注入数の比率を崩壊補正を行って表している。腫瘍あるいは全身に対応する関心領域（ＲＯＩ）を確認することによって、全身のシンチグラフィ画像を分析した；次に、各関心領域の数量を注入後の時間の関数として求めた。腫瘍内の標識の局在化を、腫瘍ＲＯＩの数量と全身ＲＯＩの数量の比として計算した（表Ｖの２列目および３列目）。身体内の標識の保持率を、全身ＲＯＩの数量と基準ＲＯＩの数量の比として計算した（表２、４列目と５列目）。
表ＩＶと表Ｖのデータは、腫瘍内部位からの¹⁸⁶Ｒｅの漏出の大きさが、化合物２４の形での放射性核種の投与によって大きく減少していることを示している。さらにこれらのデータは、腫瘍内保持を測定するために用いた二つの異なる方法（全身ガンマシンチグラフィと直接励起）の間における優れた一致を示している。

例１０
¹⁸⁶Ｒｅ−キレート脂肪親和性シアニン抱合体とＮａ¹⁸⁶ＲｅＯ₄の関節内注入後のＩｎ Ｖｉｖｏ保持
本発明の化合物の二つの特性は、治療上の有効性とともに、部位選択的な投与と保持を実現するうえで重要である：
ａ）非結合治療薬に比べた場合の、適用部位への保持の強さと、
ｂ）部位への注入後のその分布形態（不均質と均質）。
蛍光あるいは放射標識化合物を用いて、レニウムを含む化合物の関節腔内の滑膜内層への供給に基づいて、これらの特性を分析した。
¹⁸⁶Ｒｅ−キレート脂肪親和性シアニン抱合体（反応機構５の化合物２４）を例３ｈに記述したように調整し、濃縮貯蔵溶液をエチルアルコール中で約４０μＬの最終容積にした。ｉｎ ｖｉｖｏ注入のために、以下のようにして化合物２４の調整剤とＮａ¹⁸⁶ＲｅＯ₄を作成した。Ｎａ¹⁸⁶ＲｅＯ₄（ＮＥＺ３０１、０．１ＮのＮａＯＨ中）を３００ｍＯｓＭの滅菌したダルベッコのリン酸塩緩衝食塩水で希釈し、ｐＨ紙を用いてｐＨが７．０であることを確認し、次にその調整剤を０．２２μｍのフィルターを通して再滅菌した。滅菌した３００ｍＯｓＭグルコースで化合物２４を希釈し、滅菌した０．１ＮのＮａＯＨの付加によってｐＨを７．０に調整した（グルコース希釈液に緩衝液が存在しないことと、ゲンチジン酸が最終調整剤に存在し、未調整のｐＨ１〜２を生じているという事実を必要とする）。滅菌した２５Ｇ×５／８インチの針を備えた１．０ｍＬのツベルクリン注射器を計量し、約０．１ｍＬのＮａ¹⁸⁶ＲｅＯ₄、あるいは化合物２４の調整剤を滅菌法を用いて入れ、注入前の重量を求めるために再計量を行った。さらに、各調整剤のｃｐｍ／μＬを求めるために、アリクウォットを取り出した。
関節内注入後の上述の調整剤の保持を、以下のようにして評価した。体重３〜４ｋｇのメスのニュージーランドホワイトウサギを、ケタミンとキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）を用いて麻酔し、膝の部位を慎重に剃り、ヨウ素の溶液で消毒した。滅菌法を使用して膝を約１２０°に屈曲させて膝蓋骨を一時的に側方へ移動させ、関節空間内へ皮膚を通って針を中央に挿入し、約０．１ｍＬの化合物２４（３頭の動物）あるいはＮａ¹⁸⁶ＲｅＯ₄調整剤（２頭の動物）を注入し、針を取り出して膝蓋骨を正常な位置に戻した。注射器を再計量し、注入前後の重量の間の差を計算し（注入物の密度を１．０ｇ／ｍＬと仮定）、各調整剤の既知の体積のアリクウォットの計数によって得たｃｐｍ／μＬ値に測定した体積を掛けて、注入した化合物２４またはＮａ¹⁸⁶ＲｅＯ₄の正確な体積と作用を求めた。関節内注入の５〜１０分後以内に、既知の体積の血液（約１ｍＬ）を耳中心動脈から取り出した。尿と便を独立に採取できるケージに動物を入れ、６日間にわたって観察した。それぞれの日に血液を取り出し、それまでの２４時間に排出されたすべての尿を集め、Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏｂｒａ Ｍｏｄｅｌ ５００３ガンマ計測器を使用して既知の体積の血液と尿のアリクウォットのｃｐｍ／ｍＬを求めた。総血液生産量を、全体重の５．５％と血液のｃｐｍ／ｍＬに基づいて見積もった；総尿量を、２４時間の尿体積と尿とｃｐｍ／ｍＬに基づいて計算した。便については有意な分量を検出しなかった。０、１、４、および６日目にＧＥのＳｔａｒｃａｍ ３００システムを約１２０〜１５０ｋＥＶのエネルギーウインドウで使用してガンマシンチグラフィを実施した。６日目に、血液および尿標本の採取後に動物を犠牲にし、各種の器官を集めて計測し、¹⁸⁶Ｒｅの生物分布の評価のためにｃｐｍ／ｍＬを測定した。
化合物２４およびＮａ¹⁸⁶ＲｅＯ₄の血液中における循環濃度と、注入後６日間にわたる期間に尿中に排出された分量を表ＶＩに示す。選択した器官の６日目における¹⁸⁶Ｒｅの分布を表ＶＩＩに示す。表ＶＩおよび表ＶＩＩのすべての結果は、崩壊の補正後の注入量に対する比率で表している。表ＶＩおよび表ＶＩＩのデータは、血液濃度、尿排出量、および他の器官への蓄積によって測定した関節内空間からの¹⁸⁶Ｒｅの漏出の大きさが、化合物２４の形での放射性核種の投与によって大きく減少したことを示している。さらに、ガンマシンチグラフィ画像からの特定の関心領域（膝および／または全身）の分量の測定によって、膝への保持の評価を行い、表ＶＩＩＩに示した。これらの結果も、化合物２４の形で放射性核種を投与したときの保持の大きな改善を示している。

例１１
関節内注入後の脂肪親和性シアニン抱合体の滑膜における分布
関節内注入後の滑膜細胞による結合の均質性あるいは不均一性を評価するために、３００ｍＯｓＭでｐＨ７．０のグルコース内の化合物Ｔ（上記の例２を参照）のヨウ化塩１０μＭ溶液約０．１ｍＬを例１０に記述したように膝の中に注入した。１時間後に動物を犠牲にし、注入を行った膝関節と行っていない膝関節の両方を切開した。薄い切片を切開するためには鉱物質除去が必要であり、鉱物質除去を行う媒質は本発明の化合物を組織から除去してしまうため、全関節の横断切片は実現不可能であった。したがって、膝蓋骨の下に入れて滑膜腔との境界を形成する膝蓋下脂肪パッドを慎重に除去し、ドライアイス上で急速に凍結させ、凍結切片が調整されるまで−８０°で貯蔵した。厚い（１０μ）低温槽切片を切断し、スライドガラスに付着させ、光学顕微鏡と蛍光顕微鏡によって分析した。
脂肪パッド切片（注入を行った膝と行わなかった膝）の光学顕微鏡写真は、滑膜細胞が、脂肪パッドの関節空間に面する表面に薄く暗い線状に切片の内側の縁に沿って層をなしていることが、１００倍の拡大率で調べたときに観察された。（滑膜層は、正常な関節では僅かに１から２つの細胞の厚さであるが、関節炎の関節では過剰増殖によって厚みを増している）。残りの組織は、主に大きな脂肪細胞によって構成されていた。注入を行った膝から青の励起光を当てたときの切片の照明は、明るく比較的均一な標識の存在が基本的に滑膜細胞層に限定されていることを示し、一方、脂肪細胞領域あるいは注入を行わなかった膝は、非常に暗い緑の自己蛍光のみを示した。
例１２
血管内部位への脂肪親和性シアニン抱合体の保持
本発明の化合物が一度適用された血管内部位にとどまるかどうかを調べるために実験を実施し、その実験では、例２に記述したように調整した¹²⁵Ｉで置換した脂肪親和性シアニン（化合物１２、反応機構２）を麻酔したウサギの大腿動脈の管腔表面に適用した。大腿動脈を外科的に分離し、小さな近心の側枝に短長のＰＥ１０管でカニューレを挿入した。側枝の周囲の１ｃｍの動脈部分を閉塞させ、¹²⁵Ｉで置換した化合物１２を含む溶液２０〜５０μｌをカニューレを通して閉塞部分に投与し、５〜１０分間とどまるようにした。その後¹²⁵Ｉで置換した化合物をカニューレに沿って取り出して側枝を恒久的に接合し、血流を回復させるために大腿動脈の閉塞を取り除き、大腿の切開を閉じた。次に、Ｌｕｄｉｕｍ Ｍｏｄｅｌ ２２００ Ｓｃａｌｅｒ ＲａｔｅｍｅｔｅｒとＭｏｄｅｌ ４４−１７ ２インチｃｒｙｓｔａｌを用いて、¹²⁵Ｉの検出用に最適化したウインドウで¹²⁵Ｉの放射能をその後３週間にわたって選択した時間で観察した。
結果として得られたデータの図による分析は、２相の放出過程において、適用物質（放射能）の３４．０±１０．９％（平均±ｓｅｍ、ｎ＝４）が最初の２４時間後に動脈にとどまり、最初の放出半減期が０．７７±０．２９日であることを示した。しかし、最初の２４時間後ののちには、残りの物質は非常にゆっくりと放出され、放出の半減期は１５．２４±２．８９日であった。したがって、血管内適用部位からの放出が遅いことから、顕著な量の¹²⁵Ｉ置換化合物を適用後少なくとも３週間に検出することができた。
例１３
Ａ１０細胞に対するＩｎ Ｖｉｔｒｏでのコルヒチン脂肪親和性シアニン抱合体の抗増殖作用
本発明の化合物の抗増殖作用を調べるために、筋原細胞として増殖し、表現型的に平滑筋細胞に類似した細胞に成長する、Ａ１０細胞と胚のラットの胸大動脈に由来するクローン細胞系を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏの研究を実施した（Ｂ．ＫｉｍｅｓとＢ．Ｂｒａｎｄｔ、Ｅｘｐｔｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．９８：３４９（１９７６）。通常は、１２槽の平板で２５００〜１０、０００のＡ１０細胞／ｃｍ²を１０％子ウシ血清（ＦＣＳ）を加えたダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）に接種し、３７℃で２４時間かけて付着させ、安定化させた。次に、試験物質を必要な濃度で適切な細胞結合媒質に調整し、平板培養の培地を吸引したのち、個々の槽に３７℃で僅かに１０分間だけ入れた。次に処理物を吸引し、媒質を含む非処理の培地で槽を４回洗浄し、研究の期間中は非処理の１０％のＦＣＳを加えたＤＭＥＭを含む培地に入れた。処理適用後の異なる時間に、３つの槽を吸引し、吸引物を保存して、０．２５ｍｌの０．２５％トリプシンで槽を処理して付着した細胞を除去した。トリプシンの細胞に対する酵素作用を、余分な蛋白質（１．７５ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％のＦＣＳ）の付加によって停止させ、吸引物を槽に戻し、結果として得た細胞懸濁液のアリクウォットをＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｍｏｄｅｌ ＺＭとＳａｍｐｌｉｎｇ Ｓｔａｎｄ ＩＩ）で計測した。細胞数は、成長領域（槽底の表面領域）のｃｍ²当たりの細胞数に規格化した。
下記の表ＩＸに示すように、本発明の化合物（化合物１９、反応機構３、例３ｉ、ここでは”コルヒチン抱合体”と呼ぶ）で処理した細胞培養における７日後の増殖は、賦形剤で処理した最大の成長の僅かに５．２％であった。顕著な細胞結合の蛍光が見られ（フロー血球計算法によって測定）、コルヒチン抱合体のＡ１０細胞への結合の存在を示した。反対に、同一の初期濃度の非抱合コルヒチンで処理した細胞の存在は、賦形剤処理細胞の細胞密度の半分でしかなく、本発明の化合物で得たものの約１０倍の細胞数の上昇を示した。したがって、本発明の化合物は、僅かに１０分間の暴露にも関わらず母体化合物の抗増殖作用のＡ１０細胞内への顕著な保持を可能にし、同じ方法で適用した非抱合コルヒチンよりもはるかに大きな抗増殖作用を示した。
例１４
抗凝固薬脂肪親和性シアニン抱合体の生体膜への結合
本発明の抗凝固薬化合物を生体膜へ安定して結合することができるかどうかを評価するために、上記の例１に記述したようにウサギの赤血球ゴーストでｉｎ ｖｉｔｒｏの研究を実施した。２×１０⁸ゴースト／ｍｌを、（１）抗凝固薬を含まない誘導脂肪親和性シアニン（反応機構１、例３ａの化合物７）、（２）抗凝固薬脂肪親和性シアニン抱合体（反応機構４、例３ｊの化合物２１）、または（３）蛍光イソチオシアン酸塩標識ヘパリン（ＦＩＴＣヘパリン）で、１０μＭ、２０μＭ、および２０μＭの濃度でそれぞれ標識した。次にゴーストをさらに洗浄し、１ｍＭのＥＤＴＡと５％のＢＳＡを含むリン酸塩緩衝食塩水中に３７℃で２４時間入れた。試料を撹拌し、各試料から５０μｌのアリクウォットを取り出し、マイクロタイター平板培養槽の２００μｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００▲Ｒ▼の中に入れた（全懸濁液蛍光を意味する）。元の試料を１０分間遠心分離し、５０μｌのゴースト上澄み液の試料を取り出し、２００μｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００▲Ｒ▼の中に入れた（液相中のみでの遊離蛍光を意味する）。全試料の蛍光を、蛍光光度マイクロタイター平板培養リーダーで測定した。結合した蛍光を、未染色ゴーストからのバックグラウンドの補正後に、全体から遊離蛍光を減算することによって求めた；結合および遊離蛍光を全蛍光で割り、１００を掛けることによって、遊離および結合蛍光の比率をそれぞれ求めた。
以下の表Ｘに示した結果は、本発明の抗凝固薬抱合体は、抗凝固薬を含まない本発明の化合物の９４．６９％の保持と比べて、２４時間後にゴーストの膜に９０．９４％結合しており、優れた膜保持を示したことを表している。ＦＩＴＣヘパリンは、２４時間後にとどまっていた蛍光が僅かに３７．６３％であり、不十分な保持しか得られなかった。この数値は、ゴースト上のＦＩＴＣヘパリンの蛍光信号がバックグラウンド蛍光強度を僅かに上回る程度であったことから、ＦＩＴＣヘパリンの実際の保持率の過大評価であると考えられ、これらの数値から計算した結合および遊離率は、その精度に疑問が残る。しかし、以下のデータは、本発明の化合物は、蛍光ヘパリンとは異なり、生体膜上に十分保持されていることを明らかに示している。

例１５
生体膜表面に結合したときの抗凝固薬−脂肪親和性シアニン抱合体の抗凝固薬保持特性
本発明の化合物の抗凝固特性が、生体膜表面上に被膜したときに保持されるかどうかを調べるためにｉｎ ｖｉｔｒｏ研究を実施し、本発明の化合物の凝固酵素トロンビンを阻止する能力を分析した。ウサギの赤血球ゴーストを１０μＭの抗凝固剤−脂肪親和性シアニン抱合体（反応機構４、例３ｊの化合物２１）で最初に標識し、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳで４回洗浄し、次に様々な数量のゴースト／ｍｌに希釈した。既知の分量のゴーストをマイクロタイター平板培養槽中に入れ、化合物の既知の標準濃度によって生じる蛍光と、観察された蛍光を比較することによって、ゴースト上の化合物２１の濃度を分析した。次に、ＫｒｔｅｎａｎｓｋｙとＭａｏ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔ．２１１：１０（１９８７）によって報告されたものと同様の方法によって活性分析を実施し、その分析では、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）の緩衝液中の１：１０に希釈したヒト血漿１００μｌ、様々な濃度の標識したゴーストあるいはトロンビン阻止剤を含む５０μｌのＰＢＳ、そして一定量（０．５ｎＭ）のトロンビンを含む５０μｌのＰＢＳを、マイクロタイター平板培養槽に加え、分光光度平板培養リーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ）で４０５ｎｍにおける吸光度の変化を６０分にわたって記録した。阻止剤で処理した槽から得たデータを、阻止剤の非存在下で得た吸光度領域の阻止率として表した。代表的な実験から得られたデータを図６に示す。ヘパリン（●）および本発明の抗凝固薬抱合体（○）のそれぞれの３変数非線形論理回帰によって得たＥＣ₅₀値である１．０３ｎＭおよび２１．２３ｎＭ（＠１．４３×１０⁷ゴースト／２００ｕｌ）は、生体膜に適用したときに、本発明の化合物は親化合物に比べて、トロンビン阻止薬としての効果が２０培よりある程度少ない大きさだけ小さいことを示している。しかし、同時に分析した順次希釈したゴーストを含まない上澄み液（◇）がトロンビン阻止作用をまったくもっていないことから、この阻止作用はすべての膜に結合している。したがって、本発明の化合物は、生体膜に結合したときにおいても、依然として強力な抗トロンビン作用を提供する。
本発明の様々な側面を、特定の好ましい実施例、すなわち化学療法および放射線療法の抗増殖化合物の合成と使用に関して上記に記述し、例示してきた。しかし、他の数多くの実施例が、技術に精通した者には明らかである。例えば、様々な疾患状態あるいは病的状態の治療または分析のために、他の化学療法および放射線療法の抱合体を合成し、使用することができる。さらに、本発明の化合物と方法を、抗菌薬、抗真菌薬、あるいは抗炎症薬などの他の種類の薬物の部位選択的供給と保持の開発のために使用することができる。したがって、本発明は、具体的に記述し、例示した実施例に限定されるものではなく、以下の請求範囲の範囲から離脱しない範囲で変形と修正を行うことができる。

This application is a continuation of US patent application Ser. No. 189,192, filed May 2, 1988, entitled “Compounds, Compositions, and Methods for Binding Bioactive Substances to Bioparticle Surface Membranes”. It is an application.
FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to compounds, compositions, and methods for binding therapeutic agents, and optionally bioactive agents such as diagnostic agents, to biocompatible particles including viable cells and viruses, non-viable carrier particles. It is about. The invention also relates to starting materials and intermediates used in the preparation of such compounds. The invention further relates to the use of the compounds for site-selective delivery of therapeutic agents, and optionally diagnostic agents, in vivo.
BACKGROUND OF THE INVENTION
The supply of therapeutic agents for the treatment of diseases and other pathological conditions can be achieved by various methods. They include oral, intravenous, subcutaneous, transdermal, intramuscular administration, or topical application. For some therapeutics, current delivery methods provide sufficient dose to the disease site without causing systemic side effects, or treatment at the disease site for sufficient time to produce the intended therapeutic effect It is impossible to keep the substance well.
Drugs that prevent or reduce the growth of pathological cell types are indispensable for the treatment and control of various diseases involving harmful or uncontrollable cell growth. However, by definition, anti-proliferative substances must be toxic to certain cells. Systemic administration of these drugs is often not feasible because the amount required to control disease cell types can be toxic or fatal to the patient's normal cells. This difficulty can be avoided by administering an antiproliferative substance directly to the site of growth of harmful cells. Also, a mechanism for retaining antiproliferative drugs at the disease site is needed to effectively control the growth of harmful cells while limiting the migration and damage of normal cell types.
Specific diseases and conditions for which site-specific delivery and retention of antiproliferative substances are particularly effective are described briefly below. Each of these conditions involves the proliferation of particularly detrimental cell types where drug therapy with systemic administration for treatment does not produce optimal results.
1. Reocclusion and restenosis after angioplasty
Atherosclerotic lesions that restrict or occlude coronary blood flow are the leading cause of death associated with coronary heart disease. Direct surgery by percutaneous transluminal coronary angioplasty (PTCA) or coronary artery bypass grafting has been used.
The main difficulty with PTCA is the problem of vascular closure after angioplasty, which occurs both immediately after PTCA (acute reocclusion) and within a long period of time (restenosis).
Restenosis after angioplasty is a response to damage to the inner wall of the artery caused by an angioplasty procedure. The exact mechanism is still under investigation, but generally involves the proliferation of smooth muscle cells in the arterial middle layer and the migration of these cells towards the inner (intimal) layer where the cells continue to grow. Growth normally stops in the intima within 7 to 14 days after injury.
Patients with symptomatic re-occlusion require re-PTCA or coronary artery bypass grafting. The high percentage (30-50%) of patients who have undergone PTCA experience restenosis, which clearly limits the success of PTCA as a treatment for coronary artery disease.
Attempts to prevent restenosis by pharmacological techniques usually require systemic administration of various drugs and are generally unsuccessful.
Several antiproliferative drugs that are being actively studied to prevent restenosis are described in detail below.
a. Heparin and heparin fragments
Heparin is a highly anionic heterogeneous glycosaminoglycan composed of repeating disaccharide units of α-D-glucuronic acid and N-acetyl-D-glucosamine which are extensively sulfated. The main therapeutic use of heparin is an anticoagulant. However, heparin is also known to inhibit the growth of several different cell types, including vascular smooth muscle cells (SMC). Heparin fragments as small as tetrasaccharides have been found to have weak or no anticoagulant activity but have antiproliferative activity in vitro and in vivo. Castellott et al. Cell Biol. , 102 : 1979-1984 (1986).
Heparin binds to the cell surface of SMC via a high affinity binding site and is taken up into the cell. Furthermore, heparin can also bind to various artificial surfaces such as silicon, Mylar®, Dacron®, polycarbonate, polyethylene, polypropylene, etc. through ionic bonds with the tridodecylmethylammonium chloride coating. . Grode et al., Trans. Am. Soc. Artif. Int. Organs, 15 1 (1969).
There is no data on whether the antiproliferative effects of heparin are retained when bound to these substances.
b. Colchicine
Colchicine is an alkaloid found in nature and is used for the therapeutic management of acute ventilated arthritis. Colchicine prevents plant and animal cell division in vitro and in vivo by preventing mitotic spindle fiber formation and arresting cell division at metaphase. The action of colchicine is the same as that of vinca alkaloids, vincristine, and vinblastine. It has recently been reported that daily administration of colchicine to rabbits with atherosclerotic iliac arteries reduced the degree of restenosis observed on angiography 4 weeks after balloon injury. Currier et al., Circulation, 80 11-66 (1989).
However, in a recent clinical study, 1 mg / day of colchicine failed to reduce the incidence of restenosis in patients undergoing balloon angioplasty. C. Grines et al., Circulation, 84 : II-365 (1991). Due to toxicity limitations, patients cannot tolerate doses above 1 mg / day, but the human blood colchicine concentration produced by this dose is 10 to 20 times lower than in the rabbit study Is estimated.
c. Other chemicals
Other drugs that have been used in animal models and reduced intimal thickening are as follows: (1) Angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor (J. Powell et al., Science, 245 186-188 (1989); (2) Angiopeptin (C. Lundergan et al., Am. J. Cardiol., 17 (Suppl. B): 132B-136B (1991)); Cyclosporin A (L. Jonasson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85 : 2303-06 (1988)); (4) goat anti-rabbit platelet-derived growth factor antibody (G. Ferns et al., Science, 253 : 1129 to 1132 (1991)); (5) Terbinafine (G. Nemecek, J. Pharmacol. Exp. Thera., 248 : 1671-1174 (1989)); (6) Trapidil (M. Liu et al., Circulation, 81 : 1089-1093 (1990); and (7) Interferon-gamma (G. Hansson et al. Circulation, 84 : 1266-72 (1991)).
The use of systemic drug delivery, such as oral administration to treat restenosis after angioplasty, requires periodic administration at regular intervals, resulting in periodic fluctuations in the therapeutic agent concentration at the disease site. Arise. Furthermore, after a period of 20-30 days when the patient must receive systemic administration of the drug, usually 99% or more of the ingested drug is processed in the liver or kidney by the drug. This represents a potential for serious side effects.
2. Rheumatoid arthritis
Rheumatoid arthritis is a chronic disease characterized by chronic synovitis of the joints. There is currently no cure for rheumatoid arthritis, but one accepted treatment is synovectomy with removal of inflamed parenchyma in the affected joint. N. Gschwend, Textbook of Rheumatology (Eds.WN Kelly et al.), W.M. B. Saunders, pp. 1934-1961 (1989). Synovectomy can be accomplished surgically, chemically, or radiopharmaceutically. Surgical synovectomy has been shown to have a long-lasting effect on pain. In most cases, however, synovitis has recurred within a few years after surgery. Furthermore, surgical synovectomy can be performed only once for each joint and is difficult to perform with relatively small joints. Chemical synovectomy has been shown to be an effective alternative to surgical synovectomy, but its use is limited by the toxicity of drugs currently available for cartilage and bone.
Radioisotope synovectomy as an alternative to chemical synovectomy appears to inhibit synovial proliferation. However, as far as is known, currently used delivery systems require prolonged immobilization of the affected joints and systemic irradiation of radioisotopes to the lymph nodes, spleen and liver. The use of synovectomy with radioisotopes is limited because it is necessary to use isotopes that are short-lived and difficult to market in order to reduce tolerances. Radioisotope leakage from the synovectomy site is a primary consideration in the development of this method for the initial treatment of rheumatoid arthritis.
3. Ovarian cancer
Ovarian cancer is the fourth leading cause of female cancer deaths. Epithelial cancer accounts for approximately 80% to 90% of ovarian malignancies. Epithelial cancers initially spread through the surface or spread lymphically throughout the body. The most common type that spreads outside the ovary is transperitoneal spread of cells that spread from the surface of the primary tumor.
The primary treatment for ovarian cancer is rarely complete because cancer cells usually enter the peritoneal cavity early in the disease and cannot be removed surgically. External beam radiation therapy is also often used before and after surgery, but the single dose is limited to the radiation tolerance limits for the abdominal organs (liver, kidney, stomach, intestine). Intraperitoneal instillation of radioactive colloidal gold or phosphorus that irradiates the peritoneal cavity has been used in the past. However, its use has decreased due to uneven distribution of radiation and complications in the small intestine. Monoclonal antibodies have recently been tested as excipients for radioisotopes delivered intraperitoneally. To date, no monoclonal antibody conjugate has been approved for the treatment of ovarian cancer.
Chemotherapy is the most common form of treatment for patients with advanced ovarian cancer. Drugs currently used for ovarian cancer can extend life expectancy by several years. However, they show significant side effects at the recommended systemic dose.
4). psoriasis
Psoriasis is a common chronic skin disease that develops into uncontrolled growth of cutaneous keratinocytes and forms inflammation and ulcers. To date there is no comprehensive treatment for psoriasis.
Current treatments for psoriasis include both systemic and local. Both types of treatment are effective, but they can cause serious side effects. Systemic treatment of psoriasis mainly involves the administration of cytotoxic compounds such as corticosteroids and methotrexate. Topical treatments include antibacterial or antifungal preparations, wood tars, exposure to sunlight or phototherapy using UV light, or topical steroids. Topical corticosteroids are more commonly used for psoriasis than any other physical treatment. However, conventional topical treatments have the disadvantage of being easily rubbed or washed away, impairing long-term effectiveness. Furthermore, local use of corticosteroids tends to cause harmful systemic accumulation due to penetration into the peripheral blood vessels and penetration into the systemic circulation therefrom, and its use is limited.
It is clear that drug therapy administration methods that allow the drug to be maintained at a higher concentration for a longer period of time without causing serious side effects are effective in treating the above conditions. I will.
Recent research efforts have focused on the use of specific biological interactions such as receptor ligands or antigen-antibody interactions in the development of target specific therapeutics or diagnostics. Other promising areas of research include target-specific cells, or vesicles (eg, liposomes) containing appropriate diagnostic and therapeutic agents. In particular, monoclonal antibodies have been used to provide target specificity to these cells or vesicles. Since this is a relatively new technology, such targeted drug therapy is not truly effective and reliable.
In International Application No. PCT / US89 / 00087, various compounds, compositions, methods for their preparation, and bioparticles such as cells or viruses that do not produce appreciable damaging effects on cell morphology or physiological function. The use of binding bioactive substances to the surface membrane is described. The compound has the general formula R—B—R ₁ And B represents a bioactive substance such as a therapeutic agent or a diagnostic agent, and R and R ₁ At least one of the is a hydrocarbon substituent selected to provide a degree of lipophilicity to the compound to allow stable binding to the bioparticle surface membrane. The composition comprising the compound described herein is constituted by a suitable binding means for stable binding between the compound and the outer surface membrane of the bioparticle. These compositions are intended to exert a pre-determined site-specific action in vivo by stably binding a compound to a selected bioparticle having an original or acquired affinity for a pre-determined site. By introducing the bioparticle in vivo, the bioparticle is used to transport the bioactive substance to a predetermined site so as to produce its intended action.
SUMMARY OF THE INVENTION
In accordance with one aspect of the present invention, compounds are provided that have the ability to bind therapeutically effective substances to bioparticles containing lipids such as cells or viruses. The compounds of the present invention have been selected to stably bind either in vivo or in vitro to the lipid component of biocompatible particles containing lipids by making the compound sufficiently non-polar. A bioactive component composed of a therapeutically effective substance that is stably bound to a hydrocarbon substituent by a binding component. The compound optionally includes a spacer component that mediates a therapeutic effect, separating the therapeutic agent and the binding component.
In addition, the compounds of the invention are characterized by having stability of binding with the lipid component of the biomembrane, which varies but is predictable. The compound is sufficiently nonpolar to have a surface film retention coefficient (MRC) of at least 90% and a membrane binding stability of at least 30%. Furthermore, the compounds of the present invention are sufficient to be used so that once a therapeutic agent is delivered to a site selected by direct administration or by a carrier, it remains there for the time being and remains in an amount sufficient to produce its intended effect. Need to be stable. Methods for determining membrane retention coefficient and membrane binding stability are described below.
The compounds described above according to the present invention are used for the selective delivery of therapeutic agents and their retention at selected sites. According to a preferred aspect of the present invention, the therapeutic agent has an anti-proliferative effect that is effective in the treatment of diseases or other pathological conditions involving cell proliferation. The antiproliferative drug can be constituted by a radiotherapy substance or a chemotherapeutic substance. According to a preferred embodiment, the present invention provides a compound wherein the radiotherapeutic agent is comprised of a chelator and a radiometal. In other preferred embodiments, the compounds of the invention are comprised of chemotherapeutic agents such as heparin, hirudin and derivatives thereof, in addition to substances capable of interfering with selected intracellular functions.
According to another aspect of the invention, chemotherapeutic agents can be releasably conjugated to the compounds of the invention. These chemotherapeutic substances can be selected, for example, from the group consisting of colchicine, vinca alkaloids, taxol and derivatives thereof that exhibit their bioactivity only when released from the compound. These compounds interfere with tubulin synthesis polymerization, depolymerization, or degradation and / or function, hereinafter referred to as the “tubulin” process. For example, acid cleaved colchicine derivatives are provided that are conjugated with colchicine analogs that are essentially inactive while conjugated to the binding component. This compound is supplied to a selected site and finally taken up into cells. Incorporation of the compound is achieved by reducing the pH that cleaves the colchicine component from the binding component. Free colchicine derivatives can have the intended biological effect of interfering with the tubulin process.
According to yet another aspect of the present invention there is provided a pharmaceutical formulation comprised of a compound of the present invention that is compatible with a biological medium.
Another aspect of the present invention provides methods of using the various compounds of the present invention comprised of therapeutically effective substances for use in the treatment of diseases or other pathological conditions, and optionally including diagnostic agents. .
The compounds of the present invention are preferably administered directly in an in vivo supply to retain at the site of disease. In another method, the compound can be bound to carrier particles that supply the compound to the disease site. Direct in vivo delivery is particularly preferred for the treatment of conditions such as restenosis after angioplasty, rheumatoid arthritis, ovarian cancer, psoriasis and is described in further detail below.
The present invention provides a number of distinct advantages over currently available compounds and methods for delivering therapeutic agents to disease sites. In particular, the compounds of the present invention can be supplied and retained at a selected site of the body by stably binding to the cell structure of that site. Existing delivery methods are either long enough to supply a sufficient dose to the disease site without systemic side effects or to hold the therapeutic substance at the disease site for the time being to produce the desired therapeutic effect. It is impossible to hold. The compounds of the present invention can achieve therapeutically effective dosages at the disease site. For example, in radiotherapy where the systemic distribution of radioisotopes is very detrimental, the compounds of the present invention allow stable binding and retention of the radiotherapeutic substance to the required site, allowing joint fixation and extremes Suppresses systemic distribution of isotopes without the need for short-lived isotopes.
Another significant advantage of the present invention is that the compound can be tailored so that it initially binds stably to the outer cell membrane and then is taken up into the cell via a normal membrane passage process. This feature allows the compounds of the invention to be tailored to be composed of releasably conjugated therapeutic substances, as well as enabling the delivery of potentially toxic substances into selected cells where they are activated and activated. It is possible to have a therapeutic effect only on those cells and not on other cells in the body. This method can also include the provision of antisense RNA or DNA.
Yet another advantage of the present invention is that binding of the compounds described herein to cells and other biocompatible particles occurs essentially by lipophilicity. This is particularly important for cells, since the cell membrane is present in individual protein parts and not in larger lipid parts, reducing the chance of lipid binding interfering with important functional regions of the cell membrane. It is. Traditional methods that rely on binding to membrane proteins and cell receptors to deliver bioactive substances to cells often have reduced functional capacity.
There are attendant and obvious advantages realized by binding to the lipid region of the cell. Since the lipid region is constituted by the majority of the cell surface region, it is possible to place a large number of lipid binding compounds, so that a high concentration of therapeutic agent can be placed in the plasma membrane. In addition, the compounds of the present invention bind stably within membrane lipids due to their lipophilic character and are therefore relatively insoluble in standard physiological salts. Thus, once these compounds are bound to the membrane, they are effectively trapped there and cannot be easily separated. As a result, leakage from the cells is minimized, thereby minimizing harmful systemic effects.
[Brief description of the drawings]
Reference is now made to the following drawings.
FIG. 1 is a diagram showing test results comparing the vascular reaction of substance P injected locally with the substance P-lipophilic cyanine conjugate of the present invention. The upper graph relates to the substance P, and the lower graph relates to the conjugate.
FIG. 2 is a diagram showing the dose-response relationship between substance P and substance P-lipophilic cyanine conjugate of the present invention, wherein each substance P antagonist [D-Pro ² , D-Trp ^7,9 ] Indicates the absence and presence of -SP.
FIG. 3 shows a series of fluorescence / frequency histograms where points represent individual cells; increasing the distance of the point from the x-axis origin represents increasing red fluorescence intensity (LFL2 signal) and y-axis An increase in the distance of the point from the origin represents an increase in the green fluorescence intensity (LFL1 signal).
FIG. 4 is a graph showing the in vivo binding stability of the substance P lipophilic cyanine dye conjugate of the present invention, as a function of time, to erythrocytes.
FIG. 5 shows radioactive iodine ( ¹²⁵ A bar graph showing the degree of retention of lipophilic cyanine bound to I) on four different artificial surfaces: silastic rubber (SIL), polycarbonate (PC), polyvinyl chloride (PVC), polyethylene (PE) is there. The rods drawn with dots are the radioactive iodine ( ¹²⁵ I represents the amount of lipophilic cyanine bound to I); the black bar represents the amount that remained after 6 hours of continuous blood perfusion. The number associated with the paired bars is the retention of the first quantity of bound compound.
FIG. 6 shows data from experiments in which the ability of carrier cells labeled with anticoagulant lipophilic cyanine conjugates to suppress the in vitro generation of fibrin produced by a reference concentration of thrombin is shown. The concentration response of unconjugated anticoagulant is provided for comparison. The inhibition rate of the thrombin reaction (y-axis) was recorded as a function of the molar concentration of the compound tested (lower x-axis; log scale) and the number of carrier cells per test specimen (upper x-axis; log scale).
[Description of Preferred Embodiment]
I. Definition
The following terms and expressions are defined as follows as an illustration of the description of the present invention:
1. Bioactive ingredients—The terms bioactive ingredients and bioactive substances are used herein to refer to a wide variety of substances that are useful for the treatment, diagnosis, prevention, or other treatment of humans or animals. These terms include any substance that can exert a biological effect.
2. Biocompatible particles—The term “biocompatible particles” as used herein is in addition to viable entities such as cells in vivo and in vitro as long as they do not cause significant side effects upon in vivo administration. And both non-viable entities such as liposomes and lipoproteins.
The expression “viable biocompatible particles with physiological function” refers here to a virus comprising any viable cell or membrane. Further, as used herein, the term “cell” includes eukaryotic cells such as leukocytes, various tumor cells, prokaryotic cells such as bacteria, and cultured mammalian cells such as Chinese hamster ovary cells and yeast. And non-nuclear cells such as red blood cells, red blood cell ghosts and platelets. The following detailed description of the invention will be described with particular reference to living cells. However, it should be understood that what is described for cells generally applies to viruses that include membranes as well. Furthermore, in performing site-selective delivery of a therapeutic agent according to the present invention, a non-viable entity can be appropriately selected as a viable entity if it has a natural or acquired affinity for the intended delivery site. It is necessary to understand that it can be replaced. For example, liposomes can be used as a carrier for therapeutically active substances for delivery to the liver or spleen.
3. Diagnostic agent—refers to a compound or substance that has the ability to facilitate the detection, measurement, or analysis of a physiological condition or condition by in vivo or in vitro testing. The compounds of the present invention can serve a dual function as reporter molecules that can be detected from outside the body or detected in body fluids or biopsies obtained for in vitro analysis.
4). Chromophore—refers to a substance that can be detected visually or by using an instrument by absorption of at least one selected wavelength of light.
5. Therapeutically effective substance—refers to a substance that has the ability to prevent, reduce, treat or cure an abnormal or pathological condition in the body. These include substances that protect the organism by inhibiting, killing, improving or retaining the organism's microorganisms or antigens, as well as those with the ability to maintain, increase, reduce, limit, or destroy physiological body functions. included. A therapeutically effective substance includes a drug or drug with a therapeutic utility.
6). Chemotherapeutic substance—refers to a therapeutically effective substance whose therapeutic effect is attributable to the chemical characteristics of the substance. Chemotherapeutic agents can include, for example, non-radioactive agents. They can include small molecules and more complex molecules such as lipids, carbohydrates, proteins or nucleic acids such as DNA or RNA.
7. Radiotherapeutic substance—refers to a therapeutically effective substance whose therapeutic effect is attributable to radioactivity. Suitable radiotherapeutic substances can be composed of radioisotopes. Preferably, the bioactive ingredient is ¹⁸⁶ Re, ⁹⁰ Y, ⁶⁷ Cu, ¹⁷⁷ Lu or ¹⁵³ With various radiotherapy nuclides such as Sm Complex Consists of chelating agents that make
8). Anti-proliferative agent—refers to a therapeutically effective substance with the ability to inhibit, reduce or prevent the proliferation of cells.
II. Compound description
The compounds of the present invention are effective in various pharmacological therapies that require site-selective delivery of therapeutically effective substances. According to a preferred embodiment of the present invention, the therapeutically effective substance is a radiation therapeutic substance or a chemotherapeutic antiproliferative drug. In another example, the compounds of the invention can be comprised of diagnostic agents such as chromophores or radionuclides that allow for in vitro or in vivo tracking and / or detection of the compounds of the invention. . Thus, the compounds of the present invention can be comprised of, for example, a therapeutically effective substance as a bioactive component and a detectable chromophore as a binding component.
The diagnostic agents that make up the compounds of the present invention can be selected from among different types that can be detected by various analytical methods well known to those skilled in the art. The detectable fluorescent compound is preferably a cyanocarbocyanine, an indocarbocyanine, a thiocarbocyanine, or a cyanine dye and its derivatives including an acridine dye and its derivatives. Other effective fluorescent compounds include, for example, styrylpyridine, xanthene, phenoxazine, phenothiazine, or diphenylhexatriene dyes and derivatives thereof.
Effective diagnostic agents further include ligands that facilitate detection, such as biotin or specific antibodies. Other effective diagnostic agents are chelating agents that complex with metals, which can be detected directly or indirectly. Suitable chelate-metal complexes can be composed of isotopes selected from the transition metal series having atomic numbers 21 to 49, such as indium 111 or technetium 99m. Such complexes can be made radioactive to bind to the cytoplasmic membrane of carrier cells and allow imaging using a gamma camera after delivery into the body. The chelating agent can further form a complex with a metal ion that can be detected indirectly, for example by producing a specific action at the site of interest. For example, paramagnetic element complexes can affect the relaxation time of nearby nuclei and can be detected by magnetic resonance imaging (MRI). Chelate-metal complexes are suitable for these applications, metal ions selected from the transition metal series of atomic numbers 21 to 29 or the lanthanide series of atomic numbers 59 to 66.
If desired, compounds containing radioisotopes can be used in various uses of the invention. ¹²⁵ I, ¹³¹ I, ¹⁴ C, ^Three H, ³⁵ S or ⁷⁵ Radioisotopes such as Se can be replaced with abundant and naturally found non-radioactive forms of atoms present in the bioactive component, chromophore or hydrocarbon tail of the compound. Non-zero spin state (eg ¹⁹ An isotope with F) can be introduced into a compound of the invention so that its presence can be detected by MRI techniques.
For therapeutic application, ¹⁸⁶ Re, ⁹⁰ Y or ⁶⁷ Bioactive ingredients can be composed of chelating agents of the type described above that form complexes with various therapeutic radionuclides such as Cu.
For application to therapy according to the present invention, protein-like substances including proteins, glycoproteins, lipoproteins, or peptides can be bound to an appropriate length hydrocarbon tail via an appropriate binding component. . Exemplary bioactive proteinaceous materials are immunogens, toxins, hormones, enzymes, antigens, antibodies, and antibody fragments. Such therapeutically effective proteins are advantageously conjugated to the types of lipophilic chromophores described above, due to the variable and predictable binding stability with various bioparticles including lipids exemplified below, The resulting conjugate becomes prominent.
In other therapeutic applications, bioactive ingredients are composed of carbohydrates that allow movement and circulation morphology changes within the cells of the cells to which they are attached. One class of carbohydrates that can be applied in this way includes sialic acid; another class includes glycosaminoglycans. For example, a configuration containing sialic acid can be applied to the plasma membrane of erythrocytes to increase the amount of sialic acid on the membrane. Increasing the number of charged groups increases the lifetime of circulating red blood cells before they are removed by the liver.
The bioactive component can also be in the form of a tissue specific receptor or a ligand capable of binding to a receptor on a cell in the target organ. Compounds containing such ligands facilitate migration to specific organ sites, for example when bound to carrier cells.
The compounds of the present invention can be delivered directly to selected sites in the body by a variety of methods including injection, infusion, catheterization and topical application, among others. For example, the compounds of the present invention can be bound to carrier biocompatible particles such as autologous, allogeneic or zenogenic cells to facilitate targeted delivery of bioactive substances. Unless specifically limited, the discussion described below means binding of a compound of the present invention to viable cells, either by direct delivery to the disease site or by adjustment of carrier excipients. One object of the present invention is to provide compounds that can bind therapeutic agents or radioisotopes and can be dissolved in the fat bilayer that constitutes the outer membrane of cells. The supply of therapeutic substances via the compounds of the present invention, when delivered directly to the disease site, keeps these substances at high concentrations in the diseased area cells for long periods that cannot be achieved by other methods. Enable. Furthermore, the use of the compounds of the present invention allows the use of therapeutic agents that can be toxic when administered systemically.
Methods of action of the compounds of the present invention on cells vary and depend on: (1) the type of cells to be bound; (2) the nature, length and quantity of the lipophilic tail; (3 The body part to be treated; (4) the nature of the bioactive ingredient; and (5) the mechanism by which the bioactive ingredient attached to the compound produces its action on the cell. The compounds of the invention deposit on the cells and initially attach to the lipid bilayer outside the plasma membrane. Since the membrane component naturally leads to the inside, these compounds are also taken up inside the cell. The rate at which this occurs depends on the type of individual cell, its growth state and its activity or degree of stimulation.
Some types of antiproliferative drugs, such as radiotherapeutics conjugated to the compounds of the present invention, will work whether they are located on the outer membrane or in the cell. These drugs emit radiation that damages the nucleus and, if the radiation is sufficiently transmitted, also inhibits the growth of surrounding cells. Drugs that must physically interact with intracellular components to inhibit growth become effective only after the compound of the invention is taken up into the cell. For extremely toxic drugs such as colchicine, other methods of action that can be conjugated to lipophilic components, bound to the outer membrane in an inactive form, and not toxic to cells Has been devised. Subsequently, as the conjugate moves inward, a specially prepared bond (described in detail in the examples below) allows the drug to be released from the conjugate and exert its antiproliferative effect. To.
III. General formula
Compounds within the scope of the present invention are given by the following formula:

Where B represents a bioactive component composed of a therapeutically effective substance, R and R ₁ Represents a substituent independently selected from hydrogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, alkaryl, or an aralkyl group, the hydrocarbon chain of which is linear or branched, desorbed by one or more non-polar functional groups. Substituted or substituted, R and R ₁ At least one of which is composed of a hydrocarbon substituent, the chain length of which is effective to provide membrane binding capability to the compound, and R ₂ Represents a spacer component, n is 0 or 1, and L is a non-aromatic linking component when n = 0, and B and R and R when n = 0. ₁ Or at least one of R ₂ And R and R ₁ Represents a binding component that provides a stable bond with at least one of
As used herein, the expression “non-polar functional group” is O-alkyl, S-alkyl, halogen, N (alkyl) ₂ , Se-alkyl, NO ₂ , CN, CO-alkyl, Si (alkyl) _Three , O-Si (alkyl) _Three , And the like.
The linking component (L) is a saturated or unsaturated aliphatic linker or ring structure containing an alicyclic ring or aromatic ring, which is monocyclic, polycyclic, monocyclic, heterocyclic, dissolved or undissolved. It is possible.
Preferably, the binding component is a chromophore. The attachment of the chromophore to the compound of the present invention facilitates the tracking of the compound in vivo. Effective chromophores for this purpose include cyanine, acridine, pyridine, quinoline, xanthene, phenoxazine, phenothiazine, and diphenylhexatriene dyes and their derivatives.
A preferred class of compounds within the scope of the present invention is given by the following formula:

Where B represents a bioactive substance and R and R ₁ Represents a substituent independently selected from hydrogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, alkaryl, or an aralkyl group, the hydrocarbon chain of which has 1 to 30 carbon atoms and is linear or branched, Substituents are unsubstituted or substituted by one or more nonpolar functional groups, and R ₂ Represents a spacer component of the following formula:

Where R _Three Represents an aliphatic hydrocarbon and R _Four , R _Five , R ₆ And R ₇ Is aliphatic, alicyclic or aromatic hydrocarbon, heterocyclic or CH ₂ C (CO ₂ H) independently selected from the group consisting of = CH;

Is an amide, thiourea, hydrazone, acyl hydrazone, ketal, acetal, orthoester, ester, anhydride, disulfide, urea, carbamate, imine, amine, ether, carbonate, thioether, sulfonamide, carbonyl, amidine and triazine Independently selected from functional linking groups comprised of bonds;

Can independently represent a valence bond, an aliphatic or alicyclic hydrocarbon having 1 to 12 linear carbon atoms, and an aromatic hydrocarbon having 6 to 12 carbon atoms. N; p, q, r, s and t are each 0 or 1;
X and X ₁ Can have the same or different values, O, S, C (CH _Three ) ₂ Or represents Se;
Y is = CR ₈ , = CR ₈ -CR ₈ = CR ₈ -, = CR ₈ -CR ₈ = CR ₈ -CR ₈ = CR ₈ -Or = CR ₈ -CR ₈ = CR ₈ -CR ₈ = CR ₈ -CR ₈ = CR ₈ Represents a linking group selected from: wherein R ₈ Is H, CH _Three , CH ₂ CH _Three , CH ₂ CH ₂ CH _Three Or CH (CH _Three ) ₂ Choose from;
Z is H, alkyl, OH, -O-alkyl, COOH, CONH ₂ , SO _Three H, SO ₂ NH ₂ , CONH-alkyl, CON- (alkyl) ₂ , NH-acyl, NH-alkyl, N (alkyl) ₂ , SH, S-alkyl, NO ₂ , Halogen, Si (alkyl) _Three Or O-Si (alkyl) _Three , Sn (alkyl) _Three Or represents a substituent selected from Hg-halogen groups, wherein the alkyl group composed of the Z substituent comprises 1 to 4 carbon atoms; Represent. For applications that require highly stable biomembrane binding, R and R of formula (II) ₁ One of which comprises at least 12 carbon atoms, R and R ₁ The total number of linear carbon atoms must be at least 23.
Various spacer components (R ₂ ) Is easily coupled between the cyanine head group and the bioactive component via an appropriate functional group present on either or both of the head group and the bioactive component according to known synthetic methods be able to. For this purpose, a large number of different types of biological function (homo biological function and hetero biological function) spacer reagents have been reported in the technical literature. Meth. Enz. , 91 : 580-609 (1983). These spacer components differ depending on the type of reactive group, hydrophobicity, hydrophilicity, length, and whether the structure to which the reactive group is bonded is cleavable or not cleavable.
As described above, the functional bond of the spacer group includes amide (—NHCO—), thiourea (—NHCSNH—), hydrazone (═NHN—), acyl hydrazone (═NHNCO—), ketal (—O—C (alkyl). ) ₂ -O-), acetal (-O-CH (alkyl) -O-), orthoester (-C (O-alkyl) ₂ -O-), ester (-COO-), anhydride (-COOCO-), disulfide (-SS-), urea (-NHCONH-), carbamate (-NHCO ₂ -), Imine (= N-), amine (-NH-), ether (-O-), carbonate (-O-CO) ₂ -), Thioether (-S-), sulfonamide (-SO ₂ -NH-), carbonyl (-CO-), and amidine (-NHC = (NH _{▲ + ▼} -)).
In a preferred embodiment for radiotherapy, B represents a chelating agent which is in particular a complex with a radiometal such as rhenium or yttrium. In a preferred embodiment for chemotherapy, B represents heparin, hirudin, colchicine, vinblastine or analogs thereof, all of which are antiproliferative drugs. In another preferred embodiment for chemotherapy, B represents a peptide. It has been found that a derivative of the peptide known as substance P, contained in Formula II above, binds stably to erythrocytes and provides an extended therapeutic effect in the circulation compared to free, ie non-conjugated peptides. It was. It is expected that increased bioavailability can be achieved for other therapeutically effective substances that are relatively short-lived in circulation in the non-conjugated form as well.
For certain applications of the compounds of the invention, such as, for example, combination therapy and combination diagnosis, it is useful to replace B of formula I with biotin.
III. Preparation of the compounds of the invention
1. Cyanine functionalized for lipophilicity
The compound of formula (II) above is easily prepared from a lipophilic cyanine precursor according to the following general formula:

Where R, R ₁ , X, X ₁ , Y, Z are as defined above for compounds of formula II;
R ₂ Represents a spacer component of the following formula:

Where R _Three , R _Four , R _Five , R ₆ , R ₇ ,

p, q, r, s, t are as defined above for compounds of formula II;
W is amino (—NH ₂ ), Α-haloacetamide (—NH 2 COCH ₂ -Hal) (hal = halogen), isothiocyanate (-NCS), halogen, isocyanate (-NCO), carboxyl (-COOH), hydrazino (-NHNH ₂ ), Acyl hydrazide (-CONH-NH ₂ ), For example, ketones such as benzophenone (—RCO), dithiopyridyl (—SS—C) _Five H _Five N), hydrous (-SH), aldehyde (-HCO), anhydride (-COOCO-alkyl), succinimide ester (-COOC) _Four H _Four NO ₂ ), Hydroxy acid (—OH), sulfonyl halide (—SO) ₂ -Hal), imide ester (-C (= NH) OCH _Three ), Epoxide (-C ₂ H _Three O) maleimidyl (-NCOCH = CHCO) and azide (-N _Three ) Represents a reactive functional group selected from the group.
Precursors suitable for the preparation of the compounds of the invention are reactive amines (NH) as substituents W in the above formula. ₂ ) Groups and can be prepared according to various synthetic methods, one of which is illustrated in Reaction Mechanism 1 and discussed in detail in the examples below.
According to Mechanism 1, Gale and Wilshire's method ( Aust. J. et al. Chem. , 30 : 693 (1977)), 2,3,3- (3H) -trimethylindolenine (commercial product) is reacted with N-hydroxymethylphthalamide (commercial product) to produce compound (1), The corresponding alcohol and 4-sulfonic acid chlorobenzene chloride were reacted with an alkyl 4-sulfonic acid chlorobenzene prepared by the method of Sondermann (Liebigs Ann. Chem., 749: 183-197 (1971)) to give an intermediate (2 ) Is generated. Removal of the phthalimide protecting group of (2) by heating in concentrated hydrochloric acid according to the general procedure yields compound (3), which is subsequently treated with methyl formate to yield (4). Compound (5) is prepared by alkylation with either 2-methyl-benzoxazole (commercially available) or 2,3,3- (3H) trimethylindolenine and alkyl 4-sulfonic acid chlorobenzene. Compound (5) is then reacted with N, N-diphenylformamidine (commercially available) using a method similar to that described in US Pat. No. 2,647,054 to produce (6). . The intermediates (4) and (6) are then mixed by stirring in alcohol in the presence of a base (sodium acetate or triethylamine) to produce (7). Dhawan et al. ( Orgn. Prep. and Proc. Int. , 7 (2) Deprotection of (7) by 85-88 (1975)) produces the amino-derived cyanine (8).
Aminocyanine (8) can be conjugated directly to a therapeutic agent containing an appropriate functional group (eg, CO, COOH) to produce a conjugate that is useful for delivery of site-specific drugs. In addition, aminocyanine (8) is a very versatile intermediate for the preparation of a wide range of other cyanine derivatives that can be conjugated with other bioactive ingredients. Compound (8) is also ideal for applications that react with a number of homo- and hetero-bifunctional spacer components to provide separation between the lipophilic cyanine component and the bioactive agent bound thereto. Is a molecule.
The resulting amine substituent on the cyanine derivative can be converted directly to other functional groups using well-known reaction methods. For example, the conversion to the isothiocyanic acid functional group is carried out by the method of Costa et al. J. et al. of Lab. Compds. and Radiopharm. , 27 (9): 1015 (1989)) can be realized by treatment with thiophosgene.
Reaction of the amine group with 1,4-terephthalic acid di-N-hydroxysuccinimide ester provides attachment of the succinimidyl functional group to the cyanine head group by an OOC-aryl-CONH-alkyl spacer component. The resulting compound can be separated and purified as a stable crystalline solid.
Simple acylation of a substituted amino group with p-nitrophenyl iodoacetate (commercially available) in dimethylformamide provides a reactive iodo substituent attached to the cyanine head group by an alkyl-CONH-alkyl spacer moiety. .
Treatment of the amine group with N-hydroxysuccinimidyl-3 (2-pyridyldithio) propionic acid (commercially available) provides a compound with a pyridyldithio functional group and an alkyl-CONH-alkyl spacer component.
Treatment of the amine group with γ-thiobutyrolactone provides a compound with a hydrol functionality and an alkyl-OCNH-alkyl spacer component. Similarly, treatment of amine groups with γ-butyrolactone provides compounds with hydroxyl groups and alkyl-CONH-alkyl spacer components.
2. Protein / peptide lipophilic cyanine conjugate
Lipophilic cyanine precursors prepared as generally described above can be coupled to proteins or peptides using a number of different synthetic methods to provide compounds of formula II.
Binding of the protein or peptide to the lipophilic linker derivative as described above can be performed through an amine group (that is, a terminal α-amino group or an ε-amino group of lysine) present on the protein or peptide. Alternatively, carboxyl groups or thiol groups (where cysteine residues are present) can be used to attach the protein or peptide to the appropriate cyanine precursor. Suitable conditions for carrying out such binding reactions are well known to those skilled in the art.
One method for conjugating an α-amino group of a polypeptide to a lipophilic cyanine precursor is the method of Wetzel et al. Bioconjugate Chem. 1, 114 (1990). This is the formation of an iodoacetamide derivative by acylation of a polypeptide with iodoacetic anhydride (commercially available) at pH 6, which is then adjusted as described above to a hydrocarbyl group-derived lipophilic cyanine compound. And forming a conjugate via thioether bond formation with excellent stability.
Conjugation via the ε-aliphatic amino group of lysine is best achieved at a pH above 8.5 so that only a limited fraction of the amine is deprotonated and becomes reactive by equilibrium. Is done. This amino group must be highly reactive with some of the amino reactive lipophilic linker compounds described above. For example, isothiocyanic acid-derived linker compounds exhibit high stability under aqueous conditions and can react with the side chain of lysine to form a conjugate bound via a thiourea bond.
The N-hydroxy-succinimidyl ester-derived linker compound described above is a particularly good reagent for reaction with lysine because the amide conjugate thus formed is very stable. This reaction is preferably carried out under anhydrous conditions in an organic solvent such as dimethylformamide since hydrolysis of this particular derivative under aqueous conditions is a competing side reaction. The reaction of conjugating the N-hydroxy-succinimidyl ester-derived linker of formula III above to the amino group of the lysine residue at position 3 of the undeca peptide, substance P is described in detail below.
As on the C-terminal amino acid residue of the peptide or protein, the carboxylic acid group present in the side chain of the glutamic acid and aspartic acid residue is a site where selective conjugation using the amine-derived lipophilic cyanine compound described above is possible. is there. This reaction is a modification of Hoare and Koshland's method ( J. et al. Biol. Chem. , 242 2447-2453 (1967) can be carried out with a water-soluble carbodiimide such as 1-ethyl-3-dimethylamino-propylcarbodiimide (commercially available), or J. et al. Biol. Chem. , 249 No. 5452 (1974) according to a modification of the method described by using Woodward's reagent K, 2-ethyl-5-phenyl-isoxazolium-3-sulfonate (commercially available) it can. The resulting conjugate is attached via a stable amino bond.
Since inactive conjugates always occur, binding of functionalized derivatives to reactive groups of peptides or proteins essential for biological activity must be avoided. However, this problem can be solved if the peptide or protein can be released from the lipophilic cyanine derivative by a cleavable spacer component.
Due to the lipophilicity of the above-mentioned compounds, some of them do not dissolve well in typical aqueous buffer systems. Conjugation reactions that require aqueous conditions to maintain the drug's soluble or active conformation usually need to be performed in an aqueous solvent modified with an organic solvent. Solvents such as dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, acetonitrile, and alcohol can be mixed with water and are effective in solubilizing the lipophilic cyanine derivative to yield the desired conjugate.
The compounds of the present invention can be purified by various standard purification methods that utilize the size, charge, or lipophilicity of the particular compound formed. A particularly effective purification method for therapeutic agents composed of peptides is the method of Bohlen et al. ( Int. J. et al. Rept. Prot. Research , 16 : 306-10 (1980).
3. Biotinylated lipophilic cyanine
The biotinylated lipophilic cyanine compound of the present invention is preferably given by the following formula:

Where R, R ₁ , R ₈ Is as already defined, and m takes a value from 0 to 6. Such biotinylated derivatives can be prepared by biotin reactions or biotin derivatives using functionalized lipophilic cyanine compounds of formula III above. The biotin derivative used in this reaction is preferably given by the following formula:

Here, E represents a residue of a compound having a labile group that can be substituted by the reactive functional group, and W and m are 0, 1, or 2.
For example, an amino-functionalized cyanine derivative (8) of the type prepared according to reaction mechanism 1 can be prepared by the method of Hofmann, Finn, Kiso ( J. et al. Am. Chem. Soc. , 100 : 3585 (1987)), commercially available amine-reactive biotin derivatives, (+)-biotin 4-nitrophenyl ester, N-hydroxysuccinimidyl 6- (biotinamide) caprate and 6 ((6 (( Biotinyl) -amino) hexanoyl) amino) caproic acid can be reacted with N-hydroxysuccinimidyl ester to form a biotin-lipophilic cyanine conjugate of formula IV above, where m = 0, 1 and 2. These conjugates differ in the length of the spacer arm between the biotin component and the fat binding component of the conjugate. The action of such spacer arms can be important depending on the intended application of the biotinylated compound. Long spacer arms have been shown to have an advantageous effect on the ability to bind biotin conjugates to “deep” biotin binding sites in avidin.
Other types of biotin derivatives with reactive functional groups such as maleimido, α-iodoacetamide, hydrazino and amino are commercially available (Molecular Probes, Eugene, OR, Handbook of Fluorescent Probes and Research Reagents, 1989-91). It can be used for conjugation with the various functionalized lipophilic linker compounds described above. Appropriate reaction mechanisms will be apparent to those skilled in the art.
In addition, a number of different types of spacer components can be attached between the cyanine and biotin components by appropriate functional groups on both precursors. Reaction mechanisms for such spacer binding are well known to those skilled in the art.
4). Lipophilic cyanine substituted by radioisotopes.
The synthesis of lipophilic tributyltin, which aids in the preparation of radiohalogenated cyanines and can be used advantageously in the method of the present invention, is shown in Reaction Scheme 2 and further described in detail in the examples below.
According to Reaction Mechanism 2, Blakeie et al. (J. Chem. Soc., 313 (1924)) and Moreau et al. (Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther., 9, (3): 274-280 (1974)) 5-iodo-2,3,3-trimethyl- (3H) -indolenine (9) prepared from iodoaniline (commercially available) using the method described by Alkylation by adjustment as described above yields (10). Treat (10) with N, N-diphenylformamidine in acetic anhydride to give the vinyl intermediate (11). The intermediates (11) and (5) (the latter being adjusted as already described) are then combined by stirring in ethanol in the presence of sodium acetate. The reaction mixture is quenched with silver acetate and sodium chloride is added to give indocyanine (12). Next, the method of Azizian et al. Comprising heating (12) with bis- (tri-n-butyltin) in the presence of a catalyst, tetrakis- (triphenylphosphine) palladium (0) ( J. et al. Organomet. Chem. , 215 : 49-58 (1981)), the compound (13) can be prepared from (12). Following this, the tributylstannyl derivative (13) can be readily synthesized under mild conditions, for example by the method modified by Wilbur et al. (J. Nuc. Med., 30: 216-226 (1989)). Furthermore, using a modified version of the method of Weiss et al. (J. Labeled Cmpds. & Radiopharmaceuticals, XXVI: 109-10 (1989), achieving the introduction of radioactive halogen into (12). Can do.
Another lipophilic cyanine derivative that can be used for the introduction of radiohalogens is Sn (Bu). _Three An analogue of (13) wherein the group is substituted with -HgX, wherein X represents a halogen. The position of the halogen substituent ring of compound (12) can of course be changed to the appropriately selected starting material. For example, the method of Bassignana et al. Spectrochemica Acta. , 19 (11), 1885 (1963)), 6-iodo-methylbenzothiazole can be used to provide the corresponding 6-iodo derivatives.
5. Cleaveable colchicine-lipophilic cyanine conjugate
Colchicine-cyanine conjugates with acid-cleavable linkages can be prepared by selecting appropriately functionalized active colchicine derivatives (Brossi, J. Med. Chem., 33: 2311, 2319). (As described by (1990)) to a suitably functionalized lipophilic cyanine derivative via a bond such as cis-aconityl, acetal, orthoester, ester, ketal, anhydride, or hydrazone. Can be combined.
Coupling via the cis-aconityl linkage is the method described by Shen et al. Biochem, Biophys. Res. Commun. , 102 3: 1048-1054 (1981). This method involves the conjugation of a free amino derivative of a drug (eg desacetyl colchicine) and the amino form of lipophilic cyanine with anhydrous cis-aconityl (commercial product).
Coupling via an acetal, orthoester, or ketal linkage is the method described by Srinvasachar et al. ( Biochemistry , 28 , 2501-2509 (1989)), can be used with appropriately functionalized colchicine and cyanine derivatives.
Coupling via the hydrazone bond is the method described by Laguzza et al. ( J. et al. Med. Chem. , 32 : 548 to 555 (1989)). This method involves the coupling of the aldehyde form of the drug with the hydrazide form of lipophilic cyanine.
The synthesis of a cleavable colchicine-cyanine conjugate according to the present invention is shown in Reaction Mechanism 3 and further described in detail in the examples below.
According to mechanism 3, the amino-functionalized cyanine (8) is coupled with monomethyl ester of glutaric acid (commercially available) to produce the methyl ester derivative (14), which is treated with hydrazine in methanol to give the hydrazino derivative ( 15).
The colchicine component is prepared by reacting with deacetyl colchicine (commercially available) to produce an acid intermediate, which is then activated in situ by addition of carbonylididiimidazole to form acylimidazole, which is converted to tetrabutylhydrogen Reduction with ammonium borohydride provides alcohol (17). Oxidation of (17) with pyridinium chlorochromate yields 7-N- (5-oxopentanoyl) deacetylcolchicine (18), which is then coupled with hydrazino derivative (15) to provide colchicine and cyanine components. Gives a conjugate (19) linked via an acid cleavable acylhydrazone bond. 7-N- (5-oxopentanoyl) deacetylcolchicine produced as an intermediate in mechanism 3 is a new compound that forms part of the present invention. If necessary, a group containing methylthio or other chalcogen can be substituted with a methoxy group at position 10 of the colchicine nucleus.
In addition, deacetylthiocolchicine (Sian et al., J. Pharma. Sci., 64 646-648 (1975)) using the same reaction course as that of aldehyde (18) shown in mechanism 3, using the more effective 7-N- (5-oxopenta Noyl) deacetylthiocolchicine analogs can be made. Further, this thiocolchicine derivative can be bound to the hydrazino derivative (15) using the same binding conditions to provide a conjugate that can be cleaved by an acid.
The kinetics of releasing the colchicine analog from the conjugate can be altered by changing the type of hydrazone binding between the colchicine and cyanine components. For example, Mueller et al. Reported that antibody-drug conjugate binding via sulfonylphenylhydrazone and phenylhydrazone linkages provided slower release kinetics than the corresponding acylhydrazone derivatives ( Bioconjugate Chem. , 1 : 325-330 (1990)).
6). Heparin-lipophilic cyanine conjugate
A synthesis method of a heparin-cyanine conjugate bound by a stable carbamate bond and effective in the present invention is shown in Reaction Mechanism 4 and described in detail in the following examples.
According to mechanism 4, the amino-functionalized cyanine (8) was treated with triphosgene according to the method of Eckert et al. (Angew Chem. Int. Ed. Enql., 26 (9): 894-95 (1987)). Convert to highly reactive isocyanate derivative (20). Isocyanate derivatives (20) were modified from Dong's method ("heparinized and fragmented polyurethaneurea surface with hydrophilic spacer groups", Dissertation, Utah University, 1990) without further separation or purification. Used to react immediately with sodium heparin in a mixed solvent of dimethylformamide / formamide, and the hydroxyl group of heparin is covalently bound to cyanine via carbamate bond formation (or by amino group via urea bond formation) Heparin-lipophilic cyanine conjugate (21) is provided. In addition, the carbon spacer arm can be coupled between the heparin and cyanine components by a reaction well known to those skilled in the art using the commercially available reagent N-Boc-6 aminocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester.
Since heparin has a large number of free hydroxyl groups, a number of cyanine groups per heparin molecule can of course be altered by controlling the stoichiometry of the reagents in the reaction. If necessary, heparin-lipophilic cyanine conjugates can be purified from free heparin by hydrophobic interaction chromatography.
Alternatively, the method described by Kin et al. Nonthrombogenic Bioactive Surface Anals New York Academy of Sciences, p. 116-130) can be used by modifying the heparin-cyanine conjugate. This method involves coupling the carboxylic acid group of heparin to an amino-functionalized cyanine using a carbodiimide reagent. Ebert et al. Determined that up to 20% of the heparin carboxylic acid groups were induced without loss of bioactivity (Biomaterials: Interfacial Phenomenon and Application, Adv. Chem. Ser. 99, American Chem. Soc). , Washington, DC (1982).
7. Radioactive metal complex-lipophilic cyanine conjugate
A method for synthesizing the radiometal complex-lipophilic cyanine conjugate is shown in Reaction Mechanism 5, wherein one metal is selected from the group consisting of rhenium, indium, copper, or palladium. According to mechanism 5, Baidu and Lever ( Tetrahedron Lett. , 31 40, 5701-5704 (1990)) is reacted with an amino-functionalized cyanine (8) to produce derivative (23). Next, the compound (23) is reacted with a metal solution in an appropriate oxidation state to produce a metal complex (24). Mechanism 5 depicts the structure of the neutral metal complex obtained when the metal used is rhenium. The exact structure and charge of the complex in the course depend on the metal used and the exact structure of the selected bifunctional chelate.
Mechanism 6 shows how to prepare the radiometal complex lipophilic cyanine conjugate when the metal is selected from rare earth metals.
A difunctionalized polyaminocarboxylate chelate having the structure of (25) can be prepared according to the method described in European Patent Application No. 0353450 A1. According to mechanism 6, chelate (25) is reacted with amino-functionalized cyanine (8) at pH 9-9.5 to produce compound (26) in which the chelate and cyanine component are bound via a stable thiourea bond. To do. The compound (26) is then reacted with a radioactive metal salt solution in a suitable buffer system according to the method described in the above-mentioned European patent application, and the final radioactive metal complex-cyanine conjugate (27) is obtained. Generate.
M (PA-DOTA) used in the mechanism 6 diagram is the polyamino-carboxylate chelate and the spacer component (-(CH ₂ ) ₂ -C ₆ H _Four It refers to a radioactive metal complex composed of a -NH-) moiety. The three-dimensional structure of the radioactive metal complex component of Compound 27 is Spinlet et al. ( Inorgen. Chem. , 23 : 4278-4283 (1984).
Other types of bifunctional polyaminocarboxylate chelates are known and can be coupled to functionalized cyanines by other reactions well known to those skilled in the art. For example, Sundberge et al. J. et al. Med. Cham. , 17 : 1304 (1974).
Other tetradentate chelates containing nitrogen and tetradentate chelates containing sulfur are known and can be coupled to appropriately functionalized cyanines by reactions well known to those skilled in the art. For example, Ras et al. J. et al. Am. Chem. Soc. , 112 : 5798-5804 (1980).
IV. Binding compounds of the invention that bind to biocompatible particles
The large number of linear carbons of the hydrocarbon tail substituted on the compounds of the present invention is an important factor in achieving the desired degree of stable bonding between the compound and the bioparticle surface film. In order to achieve stable binding of a compound with a single hydrocarbon tail, such as an acridine derivative, the number of linear carbons needs to be 23 or more. Experience with cyanine derivatives prepared in accordance with the present invention has shown that for compounds with two or more hydrocarbon tails, one of the tails has a straight portion at least 12 carbons long, and the hydrocarbon tail linear carbon atom This indicates that the sum of the numbers needs to be at least 23. Depending on the structure of the compound, leakage or conversion from one cell to another usually does not occur. In general, the longer the hydrocarbon tail, the higher the lipophilicity. However, hydrocarbon tails with more than 30 linear carbon atoms can cause the bioactive component and the agent used to provide the hydrocarbon tail to be insoluble in the same solvent. This can be problematic because the chemistry for binding to bioactive ingredients becomes very difficult. Thus, depending on the chemical nature of the binding component to which the tail binds, the length of the hydrocarbon tail may be substantially limited.
Structural differences in the binding components to which the “tail” binds also have a significant impact on the stability of membrane binding. Positively charged binding components such as cyanine, styrylpyridine, xanthene, phenoxazine, phenothiazine, or diphenylhexatriene dyes and their derivatives may contribute to binding and retention of the compound to the negatively charged membrane. Neutral or negatively charged binding components may also help to achieve controlled release from biomembranes.
A stable bond between the binding component, hydrocarbon tail, and spacer or bioactive component may in some cases require a therapeutically effective substance to realize the therapeutic benefit provided by the present invention. It can be essential for site-selective retention at the required time and in the required amount.
The binding component (L) provides the necessary stability to the compound of the present invention so that the compound is present in a time and amount sufficient to achieve the desired therapeutic benefit at the selected delivery site. Must be selected. For this purpose, the binding component of the compound of formula I above is the bioactive component (B) when R = 0 and R and R ₁ Provides a stable bond between at least one of the spacer components and when n = 1, the spacer component (R ₂ ) And R and R ₁ Must provide a stable bond with at least one of the two. Compounds with the required binding stability conferred by the linking group can be determined based on retention time in the case of direct administration of a therapeutically effective lipophilic conjugate, or can be conjugated to the disease site. When the coalescence is supplied via a carrier, it can be determined based on the circulation time. That is, the retention time or circulation time of the therapeutically effective lipophilic conjugate of the present invention must be greater than the retention time or circulation time of the therapeutically effective component in an unconjugated form.
Increased retention time or circulation time is an important factor in realizing the therapeutic benefit provided by the present invention, but there is a sufficient amount of compound at the disease site to provide the desired therapeutic benefit. Alternatively, accumulation is an equally important factor, which also depends on the stability of the binding of the compounds of the invention.
The determination of retention time or circulation time can be performed in a variety of ways well known to those skilled in the art, particularly as illustrated in Examples 9, 10, and 12 below. The determination of the amount of the therapeutically effective lipophilic conjugate of the present invention necessary to produce the desired effect is not a special method, as is often the case for therapeutic agents. This is inevitably due to the variety of therapeutically effective substances used in the practice of the present invention, the number of disease states that can be treated thereby, and the variations in the condition of patients undergoing treatment. Absent. Therefore, the response of patients undergoing treatment according to the present invention is periodically monitored to determine whether the amount or amount of therapeutically effective substance present at the disease site is sufficient to produce the desired therapeutic effect. There is a need to.
The compounds of the present invention can be made to bind to the outer membrane of viable cells or other biocompatible particles without causing an initial detrimental effect on viability, or immediately. Alternatively, it can be made to exert a delayed cytostatic or cytotoxic effect. To determine the extent of cytotoxicity due to a cytotoxin bioactive component, for example, cells are exposed to the compounds of the present invention at various concentrations, including compounds that are not conjugated to a cytotoxic agent or zero concentration. . The cells are then exposed to trypan blue or propidium iodide (F. Celada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , 57 : 630 (1967)). These dyes are normally removed from living cells and only penetrate the membranes of dead cells. After an appropriate incubation time, the cells are examined with a microscope or a flow cytometer and the percentage of stained cells (mortality) is determined.
Binding of the compounds of the present invention to carrier cells also has no appreciable detrimental effect on cellular functions critical to the ability to effect delivery to the target as a carrier. For example, for the implementation of certain applications it may be important that the carrier cells divide appropriately. On the other hand, the compounds used may alter some of the functions that do not have any effect on the splitting capacity or other capabilities required of the cell for the expected application. Accordingly, such compounds can be considered as having no appreciable deleterious effect on the function of the cells for purposes of use in the present invention. For methods for measuring the effects of compounds of the invention on cellular function that may be important for the practice of the invention, see US Pat. No. 4,859,584, Slezak and Horan, Blood , 74 : 2172-77 (1989) J. et al. Immunol. Meth. , 117 : 205-14 (1989). When selecting a cell binding means to bind to the plasma membrane of a target or carrier cell in a reproducible manner without causing a detrimental effect on the desired cellular function, two criteria must be met. is there. The cell binding means is (i) isotonic with respect to the biocompatible particles that bind the compound, does not cause contraction or swelling, and isotonic concentration (approximately in the case of mammalian cells) so as not to damage the cells. 260-340 mOsmol) and (ii) the compound of the present invention must be soluble so that it can bind at a constant concentration within the plasma membrane of the cell. A soluble time course experiment (US Pat. No. 4,783,401, M. Melnicoff et al., J. Leuk. Biok., 43: 387-397 (1988)) is only partially water soluble and stable to the plasma membrane. Compounds that act to bind to tend to form either micelles or aggregates that can precipitate when dissolved in an ionic solution (eg, phosphate buffered saline, medium, etc.) It has been shown to result in decreased binding of compounds into the plasma membrane or undesirable irregular binding.
Similar experimental methods for radioisotope compounds can be applied and compound stability can be measured using a beta or gamma counter. In all cases, comparing the amount of the compound of the invention in the supernatant of the isotonic solution at each time point with a sample of such a compound using ethanol as a solvent is not appropriate for labeled cells. However, it is useful (as a whole) for the maximum solubility of the compound.
Determining the appropriate concentration of a compound of the invention that binds to the plasma membrane of a cell must take into account several factors, including the desired effect produced by the compound and the type of cell to which the compound binds. In general, the first objective is to bind as many therapeutic agents as possible into the cell membrane. This can be accomplished by supplying the therapeutic compound directly to the disease site or by binding the therapeutic compound to the cell ex vivo and reintroducing the modified cell in vivo. The number of carrier cells required to administer a relatively small dose by maximizing the binding of the therapeutic agent into the plasma membrane of the cell, or to reach the desired location and give the desired effect Can be reduced. In the case of cell-mediated therapeutic delivery, the amount of compound bound within the cell is such that there is no negative change in the carrier cell with respect to cell viability or the ability of the cell to move to the target location. It needs to be increased only to the extent.
The compounds of the present invention are applied to carrier cells or other biocompatible particles in the absence of serum and other fat containing substances. Cells are separated from the body or removed from culture and washed free from serum. In order to form compositions containing isotonicity adjusting agents, they are usually combined with an appropriate concentration of the compounds of the invention (10 ^-Five To 10 ^-7 Suspend in M). Binding of the compound to the cells is usually complete within 10 minutes and the binding reaction is stopped by adding autologous or heterologous serum. The cells are then washed in serum-containing medium (5-10% v / v) and placed in culture or injected into the recipient, depending on the application.
Methods for binding compounds of the type described herein to cells are described in detail in U.S. Pat. No. 4,783,401, the entire disclosure of which is hereby fully described, but is hereby incorporated by reference. Integrated into the statement.
Other cell binding methods include suspending a compound of the invention in saline to form micelles. Next, when cells are put into the suspension, only phagocytic cells (eg monocytes, macrophages, neutrophils) are preferentially labeled. In this way, the compounds of the invention can be selectively directed to phagocytic cells. M.M. Melnicoff et al., J. et al. Leukocyte Biol. , 43 : 387-97 (1988).
Representative applications of the compounds, compositions, and methods of the present invention are described below for specific drug therapies.
V. Use of the compounds of the invention
A. General therapy
1. Application to isotope therapy
The present invention has the ability to bind to chelate ions that release radioactive and high linear energy imparting (LET) in the fat component of biocompatible particles, including fat, so that the present invention provides radiation therapy to disease sites. These compounds can be used. Chelated compounds of the invention and a suitable radioactive ion (eg ⁶⁷ Cu, ⁹⁰ Y, ¹⁸⁶ Re, α-emitters) are first formed, the complexes are separated, and the cells are labeled with the compounds of the invention by carrying out the usual cell binding methods described above.
Tumor infiltrating lymphocytes (TIL) are isolated from the primary lesion, expanded in IL-2, bound to radiotherapeutic material as described above, and injected intravenously. Labeled cells track the site of metastatic disease and emit radiation that kills metastatic tumor cells, thereby increasing the therapeutic effect of TIL and possibly reducing the number of cells needed to achieve disease mitigation . Similarly, other types of cells that migrate to metastatic sites can be used to deliver local radiation therapy.
2. Targeting cells by binding specific proteins to the cell membrane
In another embodiment, the compound of the present invention binds a protein-like substance containing a protein, glycoprotein, lipoprotein, or peptide as a bioactive component. These compounds are bound to cells as described above, and in addition, the hydrocarbon chains of the compounds are embedded in the plasma membrane, thereby placing the protein on the surface of a specific cell type.
The methods described above can be used to bind monoclonal antibodies against human fibrin to the surface of carrier cells such as erythrocytes and supply them to the fibrin clot site.
Similar methods can be used to supply monoclonal antibodies to human cell surface tumor antigens to tumor sites via carrier cells such as monocytes or lymphocytes. By applying to the surface of carrier cells (eg erythrocytes), tissue plasminogen activator can be similarly supplied.
If necessary, a combination of the above treatments can be used. Thus, monoclonal antibodies that bind to human fibrin can be bound to the surface of cells (eg, erythrocytes), which can then be further conjugated to fibrinolytic compounds (eg, tPA, stop kinase, urokinase). Monoclonal antibodies make it possible to bind carrier cells to fibrin and to supply a number of therapeutic fibrinolytic compounds after binding.
These therapeutically effective proteins can be conjugated to lipophilic chromophores according to the general preparation methods described above.
The technique described above binds various other therapeutically effective proteins or peptides to appropriate biocompatible particles such as cells, viruses, liposomes or LDL, thereby bioavailability of the proteinaceous material in the circulation. Can be used to stretch greatly.
Protein-bound biocompatible particles can be labeled with isotopes as described above using radioactive imaging compounds or magnetic resonance imaging compounds. The resulting bioparticles can be injected into the patient, thereby moving the cells to the disease site and imaging using standard gunmachigraphy or nuclear imaging to assess the effectiveness of the therapeutic agent.
3. Protein binding to cells for vaccines
In other applications of the present invention, an antigen, which may be a protein, glycoprotein, lipoprotein or peptide, for which production of a protective antibody is desired, optionally contains a linking group and contains cells (eg, erythrocytes, single cells). It is used as a bioactive ingredient to bind to the surface of the sphere. Cells so modified are injected in the presence and absence of antigenic reinforcing agent. The time interval between injections depends on the nature of the antigen, but generally 10 for each time interval not less than 2 weeks. ⁶ Cells can be injected.
Antibody concentration against the antigen is monitored by the standard Elisa method. Cellular immunity concentration can be measured by determining proliferation to immunized cells or cytotoxic response.
4). Change of movement by modifying cell surface
In other applications of this approach, compounds of the invention can be used to bind sialic acid or glycosaminoglycans to the plasma membrane of cells. The specific compound is placed in an isotonic medium as described above. For example, when red blood cells are placed in solution, binding of the compound to the plasma membrane occurs. The reaction is stopped by the addition of serum, after which the cells are washed with saline containing medium and ready for injection.
Red blood cells move in the circulation, and between immature cells, a large amount of sialic acid is provided on the surface. As erythrocytes grow, the amount of sialic acid per cell decreases, allowing spleen and liver macrophages to recognize erythrocyte membrane antigens, thereby removing them from the circulation. By appropriately increasing the amount of sialic acid bound into the red blood cell membrane, the life of the red blood cell in the circulation can be extended. The ability to extend the life of red blood cells can be beneficial to transplant patients or anemic patients. When bone marrow transplant patients receive a transplant, it takes several weeks before they can produce their own red blood cells. By using this technique to extend the life of their own red blood cells, patients can receive multiple bone marrow transplants without anemia if necessary.
In an individual with anemia, anemia can be caused by a decrease in the lifespan of red blood cells or a decrease in the production rate of red blood cells. In either case, anemia is reduced by extending the life of the red blood cells.
5. Supply of photodynamic compounds for therapeutic action
Photodynamic therapy to cure cancer is an area where intense research is underway (Proceedings of SPIE-The International Society for Optical Engineering; Volume 847, “New Directions in Phottod. (October 1987)). Many of these compounds are phthalocyanines or hematoporphyrins. All absorb light in the region of 600 to 800 nm and generate excited oxygen in the process.
Using the methodology of the present invention, lipophilic derivatives of the compounds are made and then dissolved in an isotonic solution. Tumor selective cells (eg TIL) are labeled with these compounds and the cells are injected into the patient. Tumor-selective cells then migrate to the micrometastatic site. Within 48 hours, the patient is exposed to intense light in the region where the photodynamic molecules absorb, and the excited oxygen that is generated kills the tumor cells. In addition, carrier cells are also killed, causing inflammation, thereby gathering more immune cells to remove dead cells and increasing tumor toxicity. In this method of providing photodynamic action, carrier cells need to selectively accumulate more therapeutic agent at the tumor site. In some instances, direct application of the compounds of the present invention to tumor deposition within a body cavity (eg, pleural cavity) assists in site retention and allows more effective intracavitary radiation therapy during surgery.
B. Treatment of specific diseases or conditions by direct supply of therapeutically effective substances
1. Reocclusion and restenosis after angioplasty
It has been experimentally shown that even in the presence of continuous blood flow, the compounds of the invention can be retained not only at artificial surfaces but also at local vascular sites (see Examples 8 and 12 below). Furthermore, it has been shown in vitro and in vivo that biological activity can be retained in the compounds of the invention composed of therapeutically effective substances (see Examples 4, 13 and 15 below).
Animal model system studies have revealed that primary cell proliferation and migration that cause restenosis after angioplasty occurs within approximately 7-21 days after angioplasty. Therefore, to prevent this occurrence, it is necessary to retain antiproliferative drugs in arterial smooth muscle cells that have been repaired until 7-10 days after angioplasty. A compound of the present invention composed of a suitable antiproliferative drug can be supplied to the damaged vessel wall after angioplasty and the non-proliferative drug conjugated to the compound can be retained in the damaged cells. In this way, large doses of antiproliferative drugs can be provided directly to the damaged cells, and by using the compounds of the present invention, they are retained at the damaged site for a longer time than in the case of systemic drug delivery. be able to. For example, in angioplasty, direct deposition of an antiproliferative drug through a drug delivery catheter allows the drug to be bound to the cell membrane at the site of the angioplasty, whereas all unbound drugs are surgically It flows from the artery inside. Even when the catheter is removed, drug bound to resting cells stays in the outer membrane or travels through the interstitial space to reach deep cell layers. When these cells become active or grow, the compound of the present invention moves into the cells as the membrane components move inward. Once inside the cell, it is possible to exert its antiproliferative effect. Therefore, the compound of the present invention composed of an appropriate antiproliferative drug can be supplied mainly to the disease site, the amount of the drug processed at once in the liver or kidney can be minimized, and the occurrence of serious side effects can be suppressed. .
In a preferred embodiment, the compounds of the present invention effective for the treatment of restenosis after angioplasty comprise antiproliferative drugs such as heparin, hirudin, colchicine, vinca alkaloids, taxol and derivatives thereof. Application of heparin to smooth muscle cells in culture, or administration to animals following arterial injury, results in decreased growth and thickening of the intima and decreased cell proliferation. The compounds of the present invention composed of heparin will remain on the outer cell membrane of the inner arterial wall rather than being taken up inside these cells by hydrophobic interactions with one or more cell wall components. Composed. In contrast, antiproliferative drugs such as colchicine that interfere with the tubulin process need to be taken up into cells in order to exert their antiproliferative effects. In this example, it is preferred to synthesize the compounds of the invention so that they can be rapidly internalized into the arterial cells of the inner wall. In a preferred embodiment, colchicine is comprised of a bioactive component of a compound of the invention as an acid cleavable conjugate. Colchicine is inactive in its conjugate form. However, the incorporation of a compound into intracellular acid vesicles causes the release of the drug from the compound and is thereby activated. Thus, active colchicine is supplied into the cell at its site of action, blocking the tubulin process at that site, thereby preventing cell division.
Particularly preferred for use in the present invention are acid cleavable compounds including colchicine, as given by the following formula:

Other effective colchicine-containing compounds are given by the following formula:

Other anti-proliferative drugs contemplated for use in the practice of the present invention include the following drugs: angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor, angiopeptin, cyclosporin A, calcium channel blockers, goat-anti-rabbit platelets Derived growth factor antibody, Terbinafine, Trapidil, interferon gamma, and heavy anion for binding of cationic growth factor.
2. Rheumatoid arthritis
The compounds of the invention are particularly suitable for the treatment of rheumatoid arthritis. They provide a means to perform chemical or radiation synovectomy to allow retention of large amounts of therapeutic agents in the joint without significant systemic release to the lymph nodes, spleen or liver. provide. A major advantage over any existing delivery system is that the compound of the invention is delivered uniformly to the tissue itself in need of treatment and retained in these cells. In the case of the radiotherapeutic compound of the present invention, the radioactivity released from the compound causes a therapeutic effect on synovial cells. As detailed in the examples below, essentially all of the compounds in the body were found in the treated joints, and about 70% of the injected compounds remained there on day 6. This local and long-term retention reduces the amount of radioisotope required for each radiation synovectomy and is a side effect caused by systemic exposure to radioisotopes released from the joints in conventional therapy. Reduce.
The radiotherapy compound of the present invention particularly preferred for radiation synovectomy can be synthesized by binding to an appropriate radioisotope as exemplified below. For example, a complex is composed of a radioactive metal and either (1) a chelate containing nitrogen and sulfur or (2) a chelate containing nitrogen and oxygen. The radioisotope is selected from the group consisting of radioactive halogen, copper, yttrium, rhodium, palladium, indium, iodine, samarium, gadolinium, holmium, erbium, ytterbium, lutetium, rhenium, gold, or combinations thereof. Can do.
Preferred compounds for use in the present invention are given by the following formula:

Where L, R, R ₁ And R ₂ Is as defined in Formula I above;
Z represents H or a metal coordination position;

Where each R ′ is independently a hydrogen atom, or an alkyl group, preferably a lower alkyl group, or a substituted lower alkyl, where the substituent can be any ester, R ″ and

Is independently a hydrogen atom or an alkyl group, and m and n can each be 0 or 1; and M represents a radioactive metal selected from the group consisting of rhenium, indium, copper, and palladium.
In a preferred embodiment, the compound of formula VIII above is given by:

Where R and R ₁ Is a hydrocarbon substituent with 1 to about 30 carbon atoms; X and X ₁ Can be the same or different values, O, S, C (CH _Three ) ₂ Or represents Se;
A represents a pharmaceutically acceptable anion;
Z represents H or a metal coordination position;

Wherein each R ′ independently represents a hydrogen atom or an alkyl group, preferably a low alkyl group, or a substituted low alkyl group, the substituent can be any ester, R ″ and

Is independently a hydrogen atom or an alkyl group, and m and n can each be 0 or 1; M represents a radioactive metal selected from the group consisting of rhenium, indium, copper and palladium.
Other particularly preferred compounds for use in the present invention are those given by the following formula:

Here, M represents a radiotherapy substance such as rhenium, indium, copper or palladium.
Other effective compounds are given by:

Where R and R ₁ Is a hydrocarbon substituent with 1 to about 30 carbon atoms; X and X ₁ Can be the same or different values, O, S, C (CH _Three ) ₂ Or represents Se;
A represents a pharmaceutically acceptable anion;
M is a radiotherapy substance selected from the group consisting of copper, technetium, rhodium, palladium, indium, samarium, gadolinium, holmium, erbium, ytterbium, lutetium, rhenium, yttrium, gold, erbium, holmium or combinations thereof. N is 2, 3 or 4; m is 1 or 2; p is 1 to 6.
3. Ovarian cancer
The compounds of the present invention comprised of chemotherapeutic or radiotherapeutic agents allow these drugs to be delivered directly at high concentrations to ovarian tumor cell growth sites. In addition, the therapeutic agent is retained in the peritoneal cavity for an extended period of time, thereby preventing the spread of tumor cells. This can also be achieved without causing significant side effects associated with the administration of these drugs at high concentrations by the systemic delivery system.
The compounds of the present invention can be delivered into the peritoneal cavity using a Tenchoff catheter as a post-surgical treatment, or can be delivered as a reperitoneal laparotomy and an adjunct treatment at the time of surgery.
The compounds of the present invention, including acid-cleavable colchicine, are also effective for anti-proliferative treatment of ovarian tumor cells, as already described. As mentioned above, these molecules are expected to remain in a non-toxic form on the outer membrane of the cell. However, if the compound is taken up into cells where the chemotherapeutic agent is separated from the rest of the compound, the chemotherapeutic agent can exert its antiproliferative effect.
4). psoriasis
The compounds of the present invention comprised of corticosteroids can be used effectively for the treatment of psoriasis. They provide retention of large amounts of drug at the site of psoriatic lesions, thereby increasing the effectiveness of drugs that reduce keratinocyte and immune cell proliferation. In addition, retention of the compounds of the present invention at the lesion site prevents permeation of potentially toxic compounds into the circulatory system. This has the clinical benefit of eliminating the need to stop treatment due to high serum concentrations of antiproliferative drugs after a series of applications over two weeks.
According to another application of the present invention, atherosclerotic plaque deposition sites can be located with platelets or low density lipoprotein (LDL) for early detection of atherosclerosis. Platelets are separated from the individual's blood using standard gradient methods, then labeled with indium or technetium as an optional diagnostic component and reinjected intravenously. Suitable methods for binding compounds of the type described herein to platelets are described in US Pat. No. 4,762,701. Within the next 48 hours, radiolabeled platelets accumulate at the site of plaque formation on the arterial wall, and gamma release at that site can be detected using a gamma camera.
Similarly, LDL is purified by standard ultracentrifugation and labeled with a compound of the invention, taking advantage of the significant fat content and the binding affinity of the compound of the invention for the fat region of biocompatible particles. . These radiolabeled LDL accumulate at the site of atherosclerotic plaque after reinjection and allow detection by nuclear imaging. It is also known that monocytes accumulate in atherosclerotic plaques and can therefore be used to detect their formation; the only limitation is the possibility of purifying a suitable number of monocytes for radiolabeling. is there.
Furthermore, it is known that platelets accumulate at sites of thrombosis (eg, coronary artery thrombosis, deep vein thrombosis, intravascular graft) and at sites of acute rejection after organ transplantation. Thus, autologous platelets separated by standard methods and radiolabeled using the compounds and methods of the present invention, also in combination with drug therapy, allow non-invasive diagnosis of such disease processes.
In addition, chelates can be used to bind to the radioactive gold image ions, but in the compounds of formula I above, the radioisotope is composed of, for example, radioactive iodine, carbon, nitrogen, sulfur, phosphorus or selenium atoms. It is also possible to produce fluorescent and non-fluorescent compounds as components. A compound that emits gamma rays of sufficient energy using a radiolabeled compound of the present invention can be detected using gunmachigraphy. If the isotope is a low energy non-permeable beta emitting element, the compound can be used for research using standard beta counting methods.
Biotinylated lipophilic compound of the present invention can act as a multipurpose reagent. For example, these compounds can be used to rapidly attach normally non-adherent cells to selected surfaces. This is important for analyzes that require fixed cells, ie, analyzes that monitor a single cell in time. When a cell population is labeled with the biotinylated compound of the present invention, the resulting labeled cells are brought into contact with the surface that binds to streptavidin and the cells are rapidly attached to the surface. Cell analysis can be started immediately. Fluorescence coupled with biotinylated compounds provides a convenient means of visually monitoring cells during the experiment.
Furthermore, a compound labeled with a fluorescent cell can be used for monitoring a growing cell and measuring a growth rate by diluting fluorescence. (US Pat. No. 4,859,584). In this method, when the fluorescence of the labeling compound decreases to autofluorescence, the sensitivity decreases in 5 to 8 times the addition time (depending on the cell type). Fluorescence amplification can be achieved by binding streptavidin conjugated with a fluorescent dye to, for example, biotinylated cyanine as described herein. By this method, labeled cells can be confirmed even after the fluorescence of the dye has decreased to autofluorescence. When higher sensitivity is required, radiolabeled streptavidin can be bound to the biotinylated compound of the present invention, and autoradiography can be performed to confirm the labeled cells. Another application of the biotinylated compounds of the present invention is protein binding. In the case of some large proteins, it is impossible to bind the protein to the cell by covalently binding the protein to the lipophilic compound of the present invention, as shown in Formula III above. In such a case, another binding mechanism is an avidin-biotin binding pair. For this purpose, the target cells are labeled with a biotinylated compound of the invention and a large protein is conjugated to avidin or an appropriate avidin derivative such as streptavidin. Next, the protein is stably bound to the cells by exposing the biotinylated cells to the avidin-protein conjugate.
C. Pharmaceutical formulation
A pharmaceutical formulation comprised of a compound of the present invention may be conveniently administered in combination with a compatible biological medium such as an isotonic solution without salt or a pharmaceutically acceptable liquid excipient. Can be created. The latter includes various inert oils, such as vegetable oils such as olive oil and peanut oil, or highly produced mineral oils. The concentration of the active ingredient in the chosen medium will depend on the nature of the compound and the disease or condition being treated.
It is particularly advantageous for the convenience of administration and the uniformity of dosage to make the pharmaceutical preparation in dosage unit form. As used herein, dosage unit form refers to a physically separate pharmaceutical formulation unit adapted to the patient to be treated. Each dosage unit must contain an amount of active ingredient calculated to produce the desired therapeutic effect in association with the carrier of the selected drug. Methods to determine the appropriate dosage unit to prevent cell proliferation or to treat other pathological conditions in certain classes of patients are well known to those skilled in the art. For example, in the case of radiation synovectomy, about 5 mCI administered in various colloidal forms ⁹⁰ Y (half-life 2.7 days, beta energy 2.2 MeV), or 300 mCi ¹⁶⁵ A dose of Dy (half-life 2.3 hours, beta energy 1.3 MeV) showed clinical efficacy. P. Lee, J.M. Rheumatol. , 9 : 165-167 (1982); Sledge et al., Clin. Orthop. , 182 : 37-40 (1984). A dose of about 10 mCi provided by injection of about 0.05 μmol of the appropriate compound (eg, Compound 23 of Reaction Scheme 5) adjusted with a specific activity of 200 mCi / μmol using standard dosimetry. of ¹⁸⁶ It was estimated that similar therapeutic effects could be obtained with Re (half-life 3.7 days, beta energy 0.98 MeV). Other radiotherapy isotopes are also known in the art. W. Volkert et al. Nucl. Med. , 32 174-185 (1991). In addition, other compounds of the present invention are also considered effective in providing effective dosages of these drugs.
In tumor radiotherapy, a dose of 80 Gy was shown as a sterilized dose for solid tumor radiotherapy when supplied with a monoclonal antibody. J. et al. Humm, J. et al. Nucl. Med , 27 : 1490-1497 (1986). Binding and internalization to the cell surface membrane is expected to increase the effectiveness of these treatments. J. et al. Humm, J. et al. Nucl. Med , 31 : 75-83 (1990). The 80 Gy dose is provided by an injection of about 0.8 nmol of compound 23 adjusted with a specific activity of 200 mCi / μmol. Furthermore, this compound and other compounds of the present invention are expected to be available for the supply of other radiotherapy isotopes known in the art. W. Volkert et al. supra. . Similar to other types of anti-cancer radiotherapeutic agents, the compounds of the present invention can be delivered directly into tumor tissue, into body cavities containing scattered tumors, or into blood vessels supplying tumors. C. Hoefnagel, Anti-Cancer Drugs , 2 : 107-132 (1991).
To demonstrate that in the treatment of restenosis after angioplasty, a sufficient amount of a compound of the invention can be delivered to the pathophysiological site, Grines et al. Circulation , 84 : II-365 (1991) administered 1 mg / day human therapeutic dose of colchicine, but could not prevent restenosis, 2 ng / ml or 5 nM (mw colchicine = 399.4) It can be mentioned that the maximum plasma concentration of. Bochner et al. Handbook of Clinical Pharmacology Little, Brown and Co. Boston (1983), pp. 151-152. Assuming (i) similar colchicine absorption and distribution by rabbits; (ii) rabbits with an average weight of 3 kg and (iii) an average human with a weight of 70 kg, 0.2 mg / kg / day The dose was used by Currier et al., Circulation, 80: II-66 (1989) and was successful in preventing restenosis in rabbits at plasma concentrations of 28 ng / ml or 70 nM. Thus, colchicine concentrations in rabbits indicated that the concentration to prevent restenosis was 14 times that achieved in clinical trials. The compounds of the present invention can be adjusted to 100 μM in the above-described compatible binding media, ie, 1400 times the concentration shown to be effective in animal studies, using a catheter during angioplasty with arteries. Can be supplied directly to the wall.
The pharmaceutical preparation of the present invention is preferably administered by injection, intraperitoneal infusion, or catheterization. In addition, in some cases, other administration methods such as oral administration or aerosol administration may also be effective.
The pharmaceutical formulation can be administered at appropriate intervals. Due to the nature of the compounds of the invention, repeated administration may not be necessary. Determination of the frequency of administration of pharmaceutical preparations is well known to those familiar with the relevant medical technology. In all cases, the appropriate interval between any individual cases will usually depend on the patient's condition and the type of morbidity being treated.
The following examples are provided to describe the invention in further detail. These examples are intended to illustrate certain aspects of the invention and should not be considered a limitation of the invention.
Example 1
Determination of membrane retention coefficient
The membrane retention factor (MRC) provides information regarding how well a given compound is retained in the plasma membrane of the cell and is determined as described below.
Red blood cell ghosts used as model membranes are produced by centrifuging whole blood at 300 xg for 15 minutes, removing plasma and resuspending the cell pellet with 0.83% (w / v) ammonium chloride. Do by. Pellet the ghost from ammonium chloride by centrifugation at 10,000 xg for 10 minutes. This ammonium chloride wash treatment is repeated at least 5 times to achieve complete release of hemoglobin from the cells. Ghost with the compound of interest at a concentration that allows for detection of labeled ghosts by instrumental analysis or fluorescence microscopy, and at the same concentration used to label cells for the individual applications described above. Be labeled. For the following measurements, 2 × 10 ^Three The working dilution of the compound was adjusted with isotonic sucrose (52 g / 500 ml distilled water). About 1 × 10 ⁹ After ghost culture with a working dilution of compound at a ghost / ml concentration for 10 minutes, the sample was centrifuged at 10,000 × g to pellet the ghost and the staining solution was aspirated from the sample. The labeled ghost was resuspended in 1 ml phosphate buffered saline containing 10% bovine serum (PBS-FBS). Triplicated 20 ul aliquots were removed from each sample to determine the total amount of compound present. Samples were centrifuged as described above and triplicated 20 ul aliquots were removed from the supernatant for quantitative determination of the total amount of unbound compound present.
After sampling, the supernatant was aspirated and the erythrocyte ghost pellet was resuspended in 1.0 ml PBS-FBS and resampled as described above. This method was repeated at least 6 times to allow monitoring of rapidly released compounds and monitoring after 24 hours or more to allow detection of more slowly released compounds. For the determination of the amount of compound present in each sample, 20 ul aliquots were extracted with stirring into 3.0 ml n-butanol. Samples were centrifuged at 3000 × g to remove membrane debris and the butanol fraction compound concentration was analyzed. In order to measure the fluorescence units of each sample, the fluorescent compounds were analyzed in this manner using the maximum excitation and emission wavelengths of the particular compound being analyzed. Radiolabeled compounds do not require butanol extraction and can be analyzed directly using a beta or gamma counter.
By measuring the amount of compound present in each sample as described above, it is possible to calculate the MRC at each time point when washed or fixed. The value is given by:
((C _T -C _S ) / C _T * 100
Where C _T Represents the amount of compound present in the total sample (unit determined by the method used to analyze the compound), C _S Represents the amount of compound present in the supernatant at a particular time. The comparison of MRC values defines the criteria for identifying the compounds of the present invention, which are: 1) the MRC value measured at each wash step is at least about 90, and 2) at least 24 The difference in the proportion of MRC values during time is less than about 10%.

The data shown in Table I below is an experimental result and shows an example of MRC measurement. In Table I, the compounds represented by AC are the compounds of formula XII above, where X and X in each compound ₁ Is C (CH _Three ) ₂ Z and Z ₁ Represents H, and further R / R ₁ Represents C-5 / C-5 (compound A), C-10 / C-10 (compound B), C-14 / C-14 (compound C); the compounds represented by D to K are similarly represented by the formula XIII Where Z and Z ₁ Represents H and R / R ₁ Are C-14 / C-3 (compound D), C-18 / C-3 (compound E), C-20 (3, 7, 11, 15-tetramethylhexadecyl) / C-3 (compound F). C-22 / C-3 (Compound G), C-20 / C-3 (Compound H), C-18 / C-8 (Compound I), C-18 / C-5 (Compound J), C -22 / C-3 (compound K); and the compounds represented by L to N are compounds of formula XIV above, where Z and Z ₁ Respectively N (CH at the ring positions 3 and 6) _Three ) ₂ Represents Z ₂ Represents H, and R represents C-22 (Compound L), C-18 (Compound M), and C-26 (Compound N). In compound K, the anion is chloride, and in all other remaining compounds, the anion is iodide.

The MRC values listed in Table I above show an excellent correlation with the results obtained from the intracellular compound conversion analysis, as already described in the aforementioned international application PCT / US89 / 00087.
Example 2
Determination of membrane binding stability
The free energy of hydrocarbon chain conversion from an aqueous phase (eg, extracellular medium) to a liquid hydrocarbon phase (eg, inside a hydrocarbon in a biological membrane) is the degree of branching, degree of unsaturation, and in the hydrocarbon chain It is known to depend on the number of methylene groups. The free energy of the methylene-hydrocarbon interaction is minimal for the methylene group closest to aqueous mediation, increases in the subsequent methylene group, and is nonpolar with the hydrocarbon group having 4 or more carbons inside the membrane lipid It is approximately equal to that found in hydrocarbons in solvents containing hydrocarbons. Thus, any structure containing a hydrocarbon head (single or plural, symmetric or asymmetric) composed of a polar head group and four or more linear carbons, such as the compounds of the present invention, is carbonized. The number of carbon equivalents that, when fully immersed in a hydrogen solvent, gives approximately equal binding energies can be calculated as follows:
Carbonized equivalent = 0+. 25+. 5+. 75 + n-4 (+) 0+. 25+. 5+. 75 + m-4 (+)... Where n is equal to the number of first tail linear hydrocarbons and m is equal to the number of second tail linear hydrocarbons.
The existence of a correlation between the carbon equivalent of the compound of the present invention and its membrane retention coefficient (MRC) was determined experimentally as described in Example 1 above. For example, compounds of the invention with more than 18-19 carbon equivalents have 90 or more MRCs and show minimal conversion between labeled and unlabeled cells in an intracellular compound conversion assay ( See above). Therefore, these compounds are also expected to show excellent stability of binding with cells labeled in vivo. But surprisingly this is not the case. In fact, some of the compounds of the present invention exhibiting different MRCs show a 10-fold different reduction rate in vivo, with multiple compounds of the present invention differing by only 10%.
In various practical applications of the compounds and methods of the present invention, it is important that the stability of the binding between the compound and the biofilm in vivo can be assessed using several predictive criteria. For example, in applications such as the supply of therapeutic radionuclides to tumor sites, very stable binding to the membrane is required because loss of compounds can cause the production of toxic effects to non-tumor sites by radionuclides. . On the other hand, for applications that require control of the therapeutic agent supply rate, more rapid loss of the compound from the biological membrane may be desirable. Thus, an analysis that measures MBS under conditions approximating those found in vivo is described below.
In performing this analysis, serum albumin (5%) approximating physiological concentrations is used. In addition, many compounds of the present invention have low solubility in saline containing 5% albumin, so in a closed system containing a limited volume of “physiological” liquid, the solubility within the membrane within 24 hours. And achieve a balance between the solubility in the surrounding medium. MBS analysis was performed by suspending a reduced number of labeled membrane ghosts in a fixed volume of albumin-containing saline to closely approximate the effect of a large volume of liquid exposing the labeled cells in vivo. To do. At 24 hours, measure the total amount of label present by sampling a well mixed suspension; then, membrane ghosts are pelleted by centrifugation and the amount of label released into the supernatant is measured And expressed as a percentage of the total label. The retention was plotted against the number of ghosts per ml of suspension, 5 × 10 ⁷ Ghost / ml, 4x10 ⁸ Measure MBS in the lower part of the curve between ghosts / ml. In this analysis, compounds showing infinite membrane binding stability are 3.5 × 10 ^Ten The result is expressed as a ratio to the maximum MBS.
The following table describes the MRC measurement described in Example 1 above and the data obtained from the MBS measurement of this example for each representative sample of the compound of the present invention. The compounds represented by O to T are compounds of formula XII above, where X and X ₁ Is C (CH _Three ) ₂ Z and Z ₁ Represents H and R / R ₁ Are C-12 / C-10 (Compound O), C-22 / C-12 (Compound P), C-14 / C-3 (Compound Q), C-14 / C-14 (Compound R), C-16 / C-16 (Compound S) and C-22 / C-14 (Compound T) are represented.

From the above table, it can be seen that MBS analysis can identify compounds that have substantially the same MRC but exhibit different binding stability to biological membranes in vivo.
In various applications of the present invention, an additional advantage of using MBS analysis to select compounds with appropriate binding characteristics is that the effect of head group structure changes on membrane binding stability can be confirmed. In contrast, in MRC analysis this can only be done poorly. As can be seen in Table III below, the length of the hydrocarbon tail (represented as a carbon equivalent so that a symmetric and asymmetric structure can be compared) and the head group structure are both related to membrane-bound stability. The effect of the head group is more pronounced when the number of carbon equivalents is low to moderate. Therefore, the same action should be sought for other types of head groups with various functional groups that are useful for the application of the present invention (eg, radiometal chelates, proteins, peptides, radionuclides, and the like). And the equilibrium between the action of the head group and the carbon equivalent required to reach the desired membrane binding stability can be estimated. Compounds with at least about 30% or more MBS are expected to be beneficial for application of the present invention of the type described herein. It can also be observed that the substituents on the head group can have a significant effect on membrane binding stability even when the number of carbon equivalents is kept constant. As seen in Table III below, AC and AD compounds differ only in head group substituents, but each MBS is very different.
In Table III, the compounds represented by U, W, Y are compounds of formula XIII above, where X and X for each compound ₁ Represents O, Z and Z ₁ Represents H and R / R ₁ Represents C-22 / C-30 (compound U), C-14 / C-14 (compound W), C-18 / C-18 (compound Y); and compounds represented by V, X and AA Is a compound of formula XII where X and X ₁ Represents S, Z and Z ₁ Represents H and R / R ₁ Represents C-22 / C-3 (Compound V), C-14 / C-14 (Compound X) and C-18 / C-18 (Compound AA).
Compounds represented by AB, AC, AD are compounds of formula XII above, where X and X ₁ Is (CH _Three ) ₂ Represents Z ₁ Is H, then R / R ₁ Represents C-14 / C-22 (compound AB), C-14 / C-3 (compounds AC, AD). In Compound AB, Z is —CH ₂ -NHOCH is represented. In the compound AC, Z represents H. In compound AD, Z represents a non-cleavable colchicine derivative as shown below.

Many of the symmetric dyes shown in Table III are available from Molecular Probes, Inc. , Eugene, OR available as a product.

Example 3
Compound preparation
a. 5-Aminomethyl-1′-docosanyl-1-tetradecyl-3, 3, 3 ′, 3′-tetramethylindo-carbocyanine iodide
The title compound was prepared as described above according to Reaction Scheme 1. In the following description, the numbers shown in parentheses indicate the corresponding numerical reagents shown in Reaction Mechanism 1. The resulting product is given by the formula of compound 8, where X and X ₁ Is C (CH _Three ) ₂ R / R ₁ Is C ₁₄ H ₂₉ / C _{twenty two} H ₄₅ And A represents I.
5- (N-phthalimidoaminomethyl) -2,3,3- (3H) -trimethylindolenine (1), Gale et al., Aust. J. et al. Chem. , 30 : The method of 693 (1977) was corrected and adjusted. 2,3,3- (3H) -trimethylindolenine (23.85 g, 0.15 mol, Aldrich) was dissolved in 150 ml concentrated sulfuric acid. The flask was then placed in an ice bath and N-hydroxymethylphthalimide (26.55 g, 0.15 mol, Fluka) was added in portions over 30 minutes. The ice bath was removed and the solution was stirred at room temperature for 5 days. The reaction mixture was then poured onto 200 g of crushed ice and the pH was adjusted to 9.0 with 50% NaOH solution while keeping the temperature below 35 ° C. by adding ice as needed. The resulting precipitate was collected by filtration, washed with distilled water and dried overnight at elevated pressure. The raw product is recrystallized from methylene chloride / hexane to produce 5- (N-phthalimidoaminomethyl-2,3,3- (3H) -trimethylindolenine (1) (30 g, 63%).
The docosanyl 4-chlorobenzene sulfonate was prepared using the method described in PCT / US89 / 00087.
Tetradisil 4-chlorobenzenesulfonate was prepared in the same manner. 5- (N-phthalimido-aminomethyl) -2,3,3- (3H) -trimethylindolenine (6.36 g, 2 mmol) and tetradecyl-4-chlorobenzenesulfonate (7.62 g, 2 mmol). Combined, both were heated at 130 ° C. for 2 hours. The reaction mixture is then cooled to room temperature and the raw product is purified with pure 5- (N-phthalimidoaminomethyl) -1-tetradecyl-2,3,3- (3H) -trimethylindolenium 4-chlorobenzenesulfonic acid. Salt (2) (10.23 g, 72%), m.p. p. Recrystallized from ethyl acetate to produce = 141 ° C.
2,3,3-trimethyl- (3H) -indolenine (6.26 g, 0.04 mol Aldrich) and n-docosanyl-4-chlorobenzenesulfonate (20.02 g, 0.04 mol) The mixture was heated at 140 ° C. for 3 hours with stirring. The reaction mixture was then cooled to room temperature to become a waxy solid. The solid was then dissolved in ethanol (250 ml), 200 ml of saturated KI solution was added and the solution was stirred for 30 minutes. 1 liter of cold water was added and stirring was continued for another 15 minutes. The resulting precipitate was collected, washed twice with distilled water, and dried overnight under high pressure. The raw material was recrystallized from methylene chloride / hexane to give pure 1-docosanyl-2,3,3- (3H) trimethyl-indolenium iodide (5) (14.5 g, 61%), m.p. p. = 107-110 ° C.
1-docosanyl-2,3,3- (3H) -trimethylindolenium iodide (8.94 g, 0.015 mol), N, N-diphenylformamidine (2.94 g, 0.015 mol, Aldrich) and Acetic anhydride (60 ml) was placed in a round bottom flask fitted with a condenser, the flask was purged with argon, and then the condenser was connected to a drying tube. The flask was placed in a preheated (160 ° C.) oil bath and refluxed for 60 minutes. The flask was then removed from the oil bath and cooled to room temperature. It was then transferred to a 1 liter Erlenmeyer flask and diluted with ethanol (60 ml) followed by 60 ml of saturated KI solution and the mixture was stirred for 30 minutes. Cold water (800 ml) was added and stirring was continued for an additional 15 minutes. The precipitated product was collected by filtration, washed with distilled water, dried at elevated pressure overnight, and 2- (β-acetonidoid vinyl) -1-docosanyl-3,3- (3H) dimethylindolenium. Iodide (6) (10.52 g, 95%), m. p. = 98-100 ° C. The raw product was used without further production.
5- (N-phthalimidoaminomethyl) -1-tetradecyl-2,3,3- (3H) -trimethylindolenium 4-chlorobenzene-sulfonate (2) (14.1 g, 20 mmol) in 300 ml concentrated HCl Dissolved in. The dissolution was slowly heated to 115 ° C. (care for foaming) and refluxed for 22 hours. The mixture was then cooled to room temperature and placed in an ice bath. While maintaining the temperature between 15 ° C. and 20 ° C., the pH was adjusted to 9.0 using ammonium hydroxide (30%). The solution was then diluted to 2 volumes with distilled water and extracted with methylene chloride (3 × 200 ml). Combine the methylene chloride extracts, dry over magnesium sulfate and concentrate to 5-aminomethyl-3,3-dimethyl-2-methylene-1-tetradecyl as a yellow oil (3) (6.9 g, 90%). -Indoline was produced.
5-Aminomethyl-3,3-dimethyl-2-methylene-1-tetradecyl-indoline (3) (14.88 g, 38.75 mmol) was dissolved in methyl formate (75 ml) and refluxed under argon ( (55 ° C.) for 24 hours. The solution was then cooled to room temperature and the methyl formate was evaporated. The residue was recrystallized from hexane to yield 5- (N-formylaminomethyl) -3,3dimethyl-2-methylene-1-tetradecyl-indoline (4) (10.85 g, 68%).
2- (β-acetoneylidovinyl) -1-docosanyl-3, 3- (3H) -dimethylindolenium iodide (6) (740 mgs, 1 mmol) and 5- (N-formylaminomethyl) -3,3 -Dimethyl-2-methylene-1-tetradecyl-indoline (4) (330 mg, 0.8 mmol) and anhydrous sodium acetate (150 mg, 1.8 mmol) were dissolved in isopropanol and stirred at room temperature for 24 hours. The solution was then transferred to a 250 ml Erlenmeyer flask, diluted with ethanol (20 ml) and saturated KI solution (20 ml), and the mixture was stirred for 30 minutes. The product was precipitated by adding 100 ml of cold water and the resulting solution was stirred for 15 minutes. The precipitate was collected by filtration, washed with distilled water and dried overnight under high pressure. The raw product (870 mg) was divided into two groups, each purified by flash column chromatography (silica gel, 10% isopropanol in methylene chloride) to give pure 1′-docosanyl-5 (N-formylaminomethyl). ) -1-tetradecyl-3, 3, 3 ', 3' tetramethylindocarbocyanine iodide (7) (414 mg, 52%).
100 ml concentrated HCl: methanol solution (adjusted by mixing 11 ml concentrated HCl and 120 mls methanol) 1′-docosanyl-5- (N-formylaminomethyl) -1-tetradecyl-3, 3, 3 ′, 3'-Tetramethylindocarbocyanine iodide (7) (250 mgs) was added and the solution was stirred at room temperature for 16-24 hours. The solution was then diluted with ice water (100 ml), cooled in an ice bath, and saturated sodium bicarbonate solution was added slowly to adjust the pH to 7.5-8.0. The aqueous phase is then extracted with methylene chloride (2 × 100 ml) and the combined organic phase is dried over sodium sulfate, filtered and concentrated (Buchi bath temperature <30 ° C.) and then dried under high pressure to give the product. (8) (240 mgs, 98%).
b. 2- [3- (2,3-Dihydro-3,3-dimethyl-5-aminomethyl-1-tetradecyl- (2H) -indole-2-ylidene) -1-propenyl] -1-docosanyl-benzoxazo Lithium iodide
The title compound was further prepared according to Reaction Mechanism 1. In the following description, the numbers shown in parentheses indicate the corresponding numbers of reagents shown in Reaction Mechanism 1. The resulting product has the formula of compound (8), where X is C (CH _Three ) ₂ , X ₁ Is oxygen, R / R ₁ Is C ₁₄ H ₂₉ / C _{twenty two} H ₄₅ , A represents iodide.
A stirred solution of 2-methylbenzoxazole (2.65 g, 19.9 mmol, Aldrich) and docosanyl-4-chlorobenzenesulfonate (10.0 g, 19.9 mmol), prepared as described above, was 160-170. Heated at 0 ° C. (oil bath temperature) for 6 hours. The reaction mixture was then cooled to room temperature and the resulting solid mass was recrystallized from methylene chloride to give pure 1-docosanyl-2-methylbenzoxazolium-4-chlorobenzenesulfonate (5) (7 .3g, 58%), m. p. = 124-125 ° C.
1-docosanyl-2-methyl-benzoxazolium-4-chlorobenzenesulfonate (5) (1.5 g, 2.36 mmol), N, N′-diphenyl-formamidine (0.462 g, 2.36 mmol) , Aldrich) and acetic anhydride (7 ml) were refluxed in an oil bath (previously heated to 160 ° C.) for 30 minutes. Upon cooling to room temperature, the mixture was diluted with absolute ethanol (15 ml), then diluted with saturated potassium iodide solution (10 ml) and stirred for 30 minutes. Water (150 ml) was then added and the precipitated product was collected by filtration, washed with water and dried overnight under high pressure. The dried raw product was recrystallized from ethyl acetate and purified with pure 2- (β-acetoneylidovinyl) -1-docosanyl-benzoxazolium iodide (6) (1.51 g, 90%), m.p. p. = 67-68 ° C.
2- (β-Acetoneylidovinyl) -1-docosanyl-benzoxazolium iodide (6) (1.10 g, 1.53 mmol), 5- (N-formylaminomethyl) prepared as in 3a above -1-Tetradecyl-3,3-dimethyl-2-methylene iodide (4) (63 mgs, 1.53 mmol), triethylamine (0.5 ml) and ethanol (25 ml) were heated to reflux for 1 hour. The solution was then cooled to room temperature, transferred to an Erlenmeyer flask and diluted with ethanol (40 ml) and saturated KI solution. The mixture was then stirred for 30 minutes, 200 ml of cold water was added and the solution was extracted with methylene chloride. The methylene chloride extracts were combined, dried over magnesium sulfate, filtered and concentrated to give the raw product. The product was purified by flash column chromatography (silica gel, 5% methanol in methylene chloride) to give 2- [3- (2,3-dihydro-3,3-dimethyl-5- (N-formylaminomethyl). ) -1-tetradecyl- (2H) -indole-2-ylidene) -1-propenyl] -1-docosanyl-benzoxazolium iodide (7) (305 mgs, 20%).
25 mls of concentrated HCl: methanol solution prepared as in a above was added 2- [3- (2,3-dihydro-3,3-dimethyl-5- (N-formylaminomethyl) -1-tetradecyl- ( 2H) -Indol-2-ylidene) -1-propenyl] -1-docosanyl-benzoxazolium iodide (7) (50 mgs) was added and the solution was stirred at room temperature for 16-24 hours. The solution was then diluted with ice water (30 ml), cooled in an ice bath, and the pH was adjusted to 7.5-8.0 by slowly adding saturated sodium bicarbonate solution. The aqueous phase is then extracted with methylene chloride (2 × 50 ml), the combined organic phase is dried over sodium sulfate, filtered and concentrated (Buch bath temperature 0-5 ° C.) and then dried under high pressure to give the product Prepared (8) (48 mgs, 99%).
C. Terephthaloyl N-hydroxysuccinimide ester derivative of 5-aminomethyl-1′-docosanyl-1-tetradecyl-3, 3, 3 ′, 3′-tetramethylindocarbocyanine iodide
Stirred solution of di-N-hydroxysuccinimide ester of terephthalic acid (100 mgs, 0.278 mmol) (reacted terephthaloyl chloride with N-hydroxysuccinimide in dry tetrahydrofuran (30 ml) using a cannula tube at room temperature under argon atmosphere To 5-aminomethyl-1′-docosanyl-1-tetradecyl-3,3,3 ′, 3′-tetramethylindocarbox prepared in tetrahydrofuran (10 ml) as in Example 3a above. A solution of cyanine iodide was added. The resulting solution was stirred for 2 hours and then concentrated on Buchi. The resulting raw product was purified by flash column chromatography (silica gel, 5% methanol in methylene chloride) to provide the title compound (101 mgs, 34%).
d. Substance P-5-lipophilic cyanine conjugate
To a stirred solution of substance P (21 mgs, 0.013 mmol) and the product of Example 3c above (30 mgs, 0.024 mmol) was added triethylamine in dry dimethylformamide (10 ml) in an argon atmosphere at 0-2 ° C. (60 ul) was added and the resulting solution was stirred at 0-2 ° C. for 4 hours. The reaction product was then quenched by adding trifluoroacetic acid (100 ul) and the solution was transferred to a 250 ml flask, diluted with water (80 ml) and lyophilized overnight. The resulting sample was purified by passing through a column of octadecyl silica gel, first eluting unconjugated peptide with 80: 20: 1 (methanol: water: trifluoroacetic acid) and then 100: 2: 1 ( The desired product was eluted with methanol: water: trifluoroacetic acid. Fractions containing the peptide-lipophilic cyanine conjugate were mixed and concentrated on Buchi, and the residue was lyophilized from water (50 ml) to produce a purple powdery pure conjugate (14 mgs, 40 %). The purity by hplc was 90% or more and 0.02% smaller than the released substance P. The conjugate thus obtained is given by the following structural formula (using the conventional three letter symbols to indicate the amino acid sequence of substance P):

Since both the peptide and the cyanine reporter are linked to the spacer component via an amino bond, the resulting conjugates should each be relatively stable in vivo.
e. 2- [3- (2,3-dihydro-3,3-dimethyl-5-(+)-biotinamidomethyl-1-tetradecyl- (2H) -indole-2-ylidene) -1-propenyl] -1- Docosanyl-benzoxazolium iodide
2- [3- (2,3-dihydro-3,3-dimethyl-5-aminomethyl-1-tetradecyl- (2H) -indole-2-ylidine) -1 prepared as described in Example 3d above A solution of -propenyl] -1-docosanyl-benzoxazolium iodide (53 mgs, 0.055 mmol) was cooled in an ice bath under argon gas in dimethylformamide. To this solution was added (+)-biotin 4-nitrophenyl ester (23 mgs, 0.63 mmol, Aldrich), then the imidazole (16 mgs, 0.23 mmol, Aldrich) and the solution were stirred in an ice bath for 1 hour, Stayed overnight at room temperature. The reaction mixture was then concentrated at high pressure in Buchi and the residue was subjected to flash chromatography (silica gel, 7.5% methanol in methylene chloride, then 10% methanol in methylene chloride) to yield the title compound (22 mgs 36%).
f. 5- {6- (6-(+)-Biotinoylamidohexanamide) -hexamidomethyl} -1′-docosanyl-1-tetradecyl-3, 3, 3 ′, 3′-tetramethylindocarbocyanine monster
A method similar to that described in Example 3e above was used again for the following amounts of reagents: 5-aminomethyl-1′-docosanyl-1-tetradecyl-3, 3, 3 prepared as described above. ', 3'-tetramethylindocarbocyanine iodide (90 mgs, 0.09 mmol) and 6 [(6- (biotinoyl) amino) hexanoylamino] caproic acid N-hydroxy-succinimidyl ester (55 mgs, .0. 097 mmol, (Molecular Probes), dimethylformamide (20 ml) and imidazole (20 mgs, 0.24 mmol) Flash chromatography (silica gel, 10% methanol in methylene chloride) yields the title compound (27.5 mgs, 21%) did.
Compound 2- [3- (2,3-dihydro-3,3-dimethyl-5- (6-{(+)-biotinamide} -hexamidomethyl) -1-tetradecyl- (2H) -indole-2- Ylidene) -1-propenyl] -1-docosanyl-benzoxazolium and 2- [3- (2,3-dihydro-3,3-dimethyl-5- (6- (6 (+)-biotinoyl) Amidohexamido) -hexamidomethyl) -1-tetradecyl- (2H) -indole-2-ylidene) -1-propenyl] -1-docosanyl-benzoxazolium salt is N-hydroxysuccinimidyl 6- (Biotinamide) caproate and 6 [6-((biotinoyl) amino) hexanoylamino] caproic acid N-hydroxysuccinimidyl ester were similarly prepared (M Available from lecular Probes).
g. Nn-docosanyl-N′-n-tetradecyl-5-tributylstannyl-3,3,3 ′, 3′-tetramethylindo-carbocyanine chloride
The title compound was synthesized according to Reaction Mechanism 2. The product obtained is given by the formula of compound (13), where X and X ₁ Is C (CH _Three ) ₂ R / R ₁ Is C _{twenty two} H ₄₅ / C ₁₄ H ₂₉ And A represents Cl. 4-Indophenylhydrazine was obtained from Blakeie et al. J. et al. Chem. Soc. , 313 : 296 (1924). Sodium nitrate (16.56 g, 0.24 mol, Aldrich) dissolved in water (100 ml) was combined with 4-iodoaniline (43.9 g, 0.20 mol, Aldrich) in ice water (600 ml) at 0-2 ° C. To a solution of concentrated hydrochloric acid (200 ml) cooled to 0 ° C. was added dropwise within 45 minutes. The reaction mixture is stirred for an additional 30 minutes at 0-2 ° C, after which the temperature of the reaction mixture is maintained between 0-2 ° C, c. Tin (II) chloride (151.68 g, 0.8 mol, Aldrich) in HCl (150 ml) was added dropwise over 90 minutes. After this addition, the resulting solution was warmed to room temperature and stirred for 3 hours. The yellow solid that separated from the solution was then collected by filtration, placed in ice water (800 ml) and the pH adjusted to 10 with 25% aqueous potassium hydroxide. The resulting solid was collected by filtration, washed with a small amount of water and dried under vacuum. The product was then taken up in toluene (400 ml) and filtered to remove insoluble impurities. Hexane (1200 ml) is added and the isolated yellow needles are collected by filtration while cooling in the refrigerator, washed with hexane (100 ml), dried under high vacuum, and pure 4-iodophenylhydrazine (23. 36 g, 50%), m. p. = 94 ° C was produced.
Moreau et al., Eur. J. et al. Med. Chem. Chim. Ther. , 9 (3): The method of 274-280 (1974) was modified to prepare 5-iodo-2,3,3-trimethyl- (3H) -indolenine (9). 4-Indophenyl-hydrazine (23.36 g, 0.0998 mol) and 2-methylbutanone (8.59 g, 0.0998 mol) in ethanol (100 ml) were refluxed for 3 hours. Then concentrated sulfuric acid (9.92 g, 0.0998 mol) dissolved in ethanol (100 ml) was added dropwise over 1 hour and the resulting solution was refluxed for an additional 3 hours. After cooling to room temperature, the precipitated solid was removed by filtration and the filtrate was concentrated to 80 ml and then poured into ice water. The aqueous solution was then extracted with methylene chloride and the combined organic phase was dried over magnesium sulfate, filtered and concentrated to produce the raw product (26.9 g, 95%). The pure product 5-iodo-2,3,3-trimethyl- (3H) -indolenine (9) (16.7 g, 59.0%) was obtained after b. p. Obtained after vacuum distillation at 81-88 ° C. and 0.03 mmHg.
5-iodo-2,3,3-trimethyl- (3H) -indolenine (2.85 g, 0.01 mol) and n-docosanyl-4-chlorobenzenesulfonic acid (5.55 g, 0.01 mol). The mixture was heated to 130 ° C. (oil bath temperature) with continuous stirring for 4 hours. The cooled reaction mixture was then recrystallized from ethyl acetate and Nn-docosanyl-5-iodo-2,3,3-trimethylindolinium 4-chlorobenzenesulfonate (10) (4.62 g, 59% ) M. p. = 118 ° C tannin crystals were provided.
2,3,3-Trimethyl- (3H) -indolenine (6.36 g, 0.04 mol, Aldrich) and n-tetradecyl-4-chlorobenzene-sulfonate (15.52 g, 0.04 mol) Both were heated at 130-135 ° C. (oil bath temperature) with continuous stirring for 3 hours. The raw sample was then dissolved in ethanol (200 ml) and then stirred with saturated potassium iodide solution (50 ml) for 30 minutes. Cold water (500 ml) was added and the precipitate was collected by filtration and washed thoroughly with cold water. The dried raw material was crystallized from ethyl acetate and the collected crystals were washed thoroughly with ether and dried to give N-tetradecyl-2,3,3-trimethylindolinium iodide (5) (12.8 g, 66.8%) m. p. 97 ° C. was produced.
N-docosanyl-5-iodo-2,3,3-trimethylindolinium 4-chlorobenzenesulfonate (2.36 g, 3.0 mmol), N, N′-diphenylformamidine (0.59 g, 3.0 mmol) Aldrich) and acetic anhydride (20 ml) were placed in a 50 ml round bottom flask which was placed on a reflux condenser and stir bar under argon atmosphere. Thereafter, the flask was placed in an oil bath heated to a constant temperature of 170 ° C., and the mixture was refluxed for 60 minutes. The reaction flask was then cooled to room temperature and transferred to a 500 ml Erlenmeyer flask. The flask was then placed in an ice bath and saturated potassium iodide solution was added. After stirring for 15 minutes, cold water (250 ml) was added and the mixture was stirred for an additional 15 minutes. The precipitated product, Nn-docosanyl-5-iodo-2- (β-acetonidovinyl) -3,3-dimethylindolinium iodide (11) (2.37 g, 91%) m. p. = 170 ° C (decomp) was collected by filtration and dried.
N-docosanyl-5-iodo-2- (β-acetonylidovinyl) -3,3-dimethylindolinium iodide (511 mgs, 0.59 mmol) and N-tetradecyl-2,3,3-trimethylindolinium Iodide (233 mgs, 0.47 mmol) and anhydrous sodium acetate (48 mgs, 0.59 mmol, Aldrich) in absolute ethanol (15 ml) were stirred at room temperature for 24 hours. The crimson mixture was then transferred to an Erlenmeyer flask and diluted with ethanol (25 ml). Then silver acetate (492 mgs, 2.95 mmol, Aldrich) dissolved in water (25 ml) was added and the solution was stirred for 15 minutes. Ethanol (25 ml) and saturated sodium chloride solution were then added and stirred continuously for 15 minutes. The solution was then transferred to a separatory funnel, diluted with water (200 ml) and extracted with methylene chloride (2 × 100 ml). The organic phase was dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and evaporated to provide the raw product. The raw product was purified by flash chromatography (silica gel, first 5% methanol in methylene chloride followed by 8% methanol in methylene chloride) to give N-docosanyl-N′-tetradecyl-5-iodo-3, 3,3 ′, 3′-tetramethylindocarbocyanine chloride (12) (272 mg, 58%) was produced.
N-docosanyl-N′-tetradecyl-5-iodo-3, 3, 3 ′, 3′-tetramethylindocarbocyanine chloride (12) (200 mg, 0.2 mmol) was added to dry toluene (15 ml, calcium hydroxide). The product was degassed by dissolving it in a fresh distillation and bubbling the resulting solution through an argon atmosphere. Then Bis- (n-tributyltin) (0.237 ml, 0.47 mmol, Aldrich) was added with a syringe and tetrakis- (triphenylphosphine) palladium (0) (2.34 mgs, 2.0 umol, Aldrich) was added. did. The resulting solution was refluxed for 48 hours under argon. The toluene was then removed in vacuo and the residue was subjected to flash chromatography (silica gel, 5% methanol in methylene chloride) to give the title compound (13) (71 mg, 31%). Found M +, 1122C ₇₁ H _{one two Three} N ₂ Sn requests 1122.
Compound (13) is described in Wilbur et al. Nucl. Med. 30: 216-226 (1989), a versatile intermediate for conjugation with radioactive halogen atoms using the method described.
h. ¹⁸⁶ Re-chelate lipophilic cyanine conjugate
The title compound was prepared according to Reaction Scheme 5 shown above. The reference numbers shown in this reaction correspond to the numbers in reaction mechanism 5. The resulting compound is given by the formula of compound 24, and X and X ₁ Is C (CH _Three ) ₂ R / R ₁ Is C ₁₄ H ₂₉ / C _{twenty two} H ₄₅ And A represents I.
Compound 22 (84.5 mg, 0.291 mmol) dissolved in 400 μL of tetrahydrofuran (THF), which is a bifunctional chelator, is continuously added to a pear-shaped flask containing (8) (66.8 mg, 0.066 mmol). added. The solution was stirred at room temperature. The course of the reaction was continued by thin layer chromatography (TCL; silica, 90:10 CH2Cl2: MeOH). After 4 hours, the reaction mixture was diluted with hexanes to make a 75:25 THF: hexane solution and loaded onto a short path silica gel (20 g) column. Excess compound 22 was eluted with 50:50 hexane: EtOAc until the eluent showed a negative reaction of bromocresol green. Solvent composition is 90:10 CH ₂ C ₁₂ : Changed to MeOH and eluted compound 22. The solvent was evaporated under reduced pressure to yield 65.0 mg of compound 23.
High magnetic field ¹ H nmr (300 MHz) showed a low field shift of benzylmethylene protons from 3.9 ppm to 4.5 ppm, as seen previously with Compound 8 protected with formyl. The relative integration of the signals at 4.5 ppm and 8.4 ppm showed a binding ratio of 1: 1.
The product compound 23 was converted to the HCl salt by addition of HCl gas / ethanol solution. An ethanol solution of oxalic acid was added as an antioxidant, the solution was evaporated, and the distilled solid was stored under nitrogen.
60 nmol Na in 107 μl 0.1 N NaOH (0.181 mCi / nmol) ¹⁸⁶ ReO ^Four 150 μl of conversion chelate solution (200 mg citric acid, 40 mg SnCl ₂ 2H ₂ O and 20 mg gentisic acid in 2 mL H ₂ Dissolved in O) followed by 43 μL of 0.1 M NaOH. The solution was vortexed for 1 minute and heated at 55 ° C. for 10 minutes. Ethanol (0.6 gmL) was added to the reaction mixture, followed by 300 μL of an ethanol solution of compound 23 (0.8 mg, 0.69 μmol). The solution was vortexed for 15 seconds and heating was continued for 1 hour.
The reaction mixture was loaded onto a semiprep HPLC column (Waters Novapak, 7.5 × 300 mm) and A: B was eluted from a 50:50 gradient to B 100% over 30 minutes at a flow rate of 4.0 mL / min. (Solvent A is 75:25 H containing 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) and 0.05% gentisic acid. ₂ O: CH _Three CN. Solvent B is 20:80 CH containing 0.1% TFA and 0.05% gentisic acid. _Three CN: THF). The fraction eluting for about 20 minutes was confirmed as the fraction containing the title compound.
The above fraction was dissolved in solvent 1 (H ₂ Sep-diluted 1: 1 with 0.05% gentisic acid in O), first washed with 10 mL of solvent 2 (0.05% gentisic acid in EtOH) followed by 10 mL of solvent 1 Placed in a Pak column (C-18, Waters 36805). The column was eluted with 10 mL of solvent 1, 150 μL of solvent 2, and 300 μL of solvent 2. N ₂ The solvent was evaporated to a volume of 10 μL by air flow and then diluted to 40 μL with EtOH.
It was. The specific activity was 186 ± 21 mCi / μmol against the theoretical value of 181 mCi / μmol. Product recovery was less than 9% of total Re-186. One day later, the radioactive purity was measured by HPLC and found to be less than 94%. Found mostly in void volume of impurities (~ 5%) and considered free perrhenate.
i. 7-N (5-oxopentanoyl) deacetylcortisine lipophilic cyanine hydrazone conjugate and measurement of acid cleavability
(A) Adjustment
The title compound was prepared according to the general method described in Reaction Scheme 3 above. The reference numbers here correspond to the numbers shown in the reaction mechanism 3. The product obtained is given by the formula of compound 19, X and X ₁ = C (CH _Three ) ₂ , R / R ₁ = C ₁₄ H ₂₉ / C _{twenty two} H ₄₅ , A represents Cl.
5-aminomethyl-1′-docosanyl-1-tetradecyl-3, 3, 3 ′, 3′-tetramethylindocarbocyanine iodide (compound 8), where R is C ₁₄ H ₂₉ R ₁ Is C _{twenty two} H ₄₅ X and X ₁ = C (CH _Three ) ₂ Was adjusted using the general method of Reaction Mechanism 1.
To a stirred solution of monomethyl glutarate (0.14 ml, 1.1 mmol, Aldrich) in dimethylformamide (15 ml, distilled from lithium aluminum hydroxide), N-hydroxysuccinimide (126.5 mg, 1.1 mmol, Aldrich) Was added at room temperature. The mixture was cooled in an ice bath and dicyclohexylcarbodiimide (226.6 mg, 1.1 mmol) was added. The reaction mixture was gradually warmed to room temperature and stirred for an additional 3 hours. The reaction mixture was then transferred to a flask containing freshly prepared compound 8 (700 mg, 0.7 mmol) and the reaction mixture was kept stirring at room temperature for 30 hours. The dimethylformamide was then removed under high pressure and the resulting raw product was diluted with absolute ethanol (250 ml) and water (250 ml). Then, after adding silver acetate (434 mg, 2.6 mmol) and stirring for 30 minutes, saturated sodium chloride solution (100 ml) was added, and the mixture was further stirred for 30 minutes. The aqueous layer was extracted with methylene chloride (4 × 100 ml) and the combined organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated. The residue was subjected to flash chromatography (silica gel, eluted with 2.5% in methylene chloride followed by 10% methanol) to give 5- [N- (monomethylglutaryl) -aminomethyl] -1′- Docosanyl-1-tetradecyl-3, 3, 3 ′, 3′-tetramethylindocarbocyanine chloride (14) (520 mg, 63%) was produced.
The resulting 5- [N- (monomethylglutaryl) -aminomethyl] -1′-docosanyl-1-tetradecyl-3,3,3 ′, 3′-tetramethyl-indocarbocyanine chloride (520 mg, 0. To a stirred solution of 44 mmol) in absolute ethanol was added anhydrous hydrazine (5 ml, Aldrich) slowly at room temperature. The reaction mixture was stirred continuously for 2 hours, then concentrated by rotary evaporation, and the residue was subjected to flash chromatography (silica gel, eluting with 10% in methylene chloride followed by 30% methanol). , 5- [N- (monohydrazino) glutaryl-aminomethyl] -1'-docosanyl-1-tetradecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethyl-indocarbocyanine chloride (15) (110 mg, 27% ) Was generated.
Glutaric anhydride (111.2 mg, 0.975 mmol, Aldrich) was added to stirred deacetylcolchicine (16) (0.2902 g, 0.81 mmol, Molecular Probes) in methylene chloride (5 ml) at room temperature and the reaction mixture Was continuously stirred at room temperature for 2 hours. The methylene chloride was then removed by rotary evaporation and the raw product was dried under high vacuum to produce 7- (N-glutaryl) deacetylcolchicine (0.397 g, 100%) as a solid.
Next, carbonyldiimidazole (0.197 g, 1.22 mmol, Aldrich) was added to 7- (N-glutaryl) deacetylcolchicine (0.397 g, Aldirich) in dimethylformamide (5 mL, freshly distilled from lithium aluminum hydride). 0.83 mmol) was added to the stirred solution at room temperature and the reaction mixture was kept stirring at room temperature for 2 hours. Within this time a precipitate formed in the solution. Dimethylformamide was removed by vacuum distillation and the residue was dissolved in methylene chloride (5 mL). To this solution was added tetrabutylammonium borohydride (250 mg, 0.972 mmol, Aldrich) and the reaction mixture was stirred for 3 hours. This was then poured into water (50 mL), the organic layer was separated and the aqueous layer was re-extracted with methylene chloride (2 × 25 mL). The combined organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated. The raw product was subjected to flash chromatography (silica gel, 10% methanol in methylene chloride) to produce 7-N- (5-hydroxylpentanoyl) deacetylcolchicine (17) (72 mg, 25%). .
To a solution of 7-N- (5-hydroxylpentanoyl) deacetylcolchicine (72 mg, 0.16 mmol) in methylene chloride (5 mL) was added pyridinium chlorochromate (41.3 mg, 0.19 mmol, Aldrich) at room temperature. In addition, the mixture was stirred for 2 hours. It was then poured into water (50 mL), the organic layer was separated and the aqueous layer was re-extracted with methylene chloride (2 × 25 mL). The combined organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated. The resulting residue was subjected to flash chromatography (silica gel, 10% methanol in methylene chloride) using 7-N- (5-oxopentanoyl) deacetylcolchicine (18) (35 mg, 49%) as an oil. Generated.
5- [N-glutaryl (monohydrazino) -aminomethyl] -1′-docosanyl-1-tetradecyl-3,3,3 ′, 3′-tetramethylindocarbocyanine chloride solution (110 mg) in absolute ethanol (20 ml) 0.12 mmol) was added to a flask containing 7-N- (5-oxopentanoyl) deacetylcolchicine (40 mg, 0.088 mmol) and the reaction mixture was stirred for 20 hours. The ethanol was then removed by rotary evaporation and flash chromatography (silica gel, 10% methanol in methylene chloride) was performed on the residue to provide the title compound. (19) (26.5 mg, 27%). The integration of 200 MHz proton NMR of this compound shows a bond ratio of 1: 1, and in fast atom collision mass spectroscopy (glycerol / thioglycerol complex), the product ion C ₉₀ H ₁₃₅ N ₆ O ₈ Expected M ⁺ Corresponding to M ⁺ = 1429. The product was further characterized by reverse phase high pressure fluid chromatography (HPLC) according to the conditions described below and had a retention time of 55 minutes. It was found to be 98% pure using UV detection at 350 nm. Less than 0.30% free 7-N- (5-oxopentanoyl) deacetylcolchicine (retention time = 12 minutes) was detected in this product.
The HPLC system used consisted of a Waters Model 600E solvent supply with a W600E gradient controller and a U6K injector and a Model 990 photodiode array detector. The chromatographic conditions are as follows: Column: Waters Nova-Pak (phenyl, 4 μm, 3.9 mm × 15 cm); Mobile phase: solvent A = water: methanol: acetonitrile: PIC A reagent (water) (395: 25: 80: 4), solvent B = water: methanol: acetonitrile: PIC A reagent (water) (225: 25: 250: 4), solvent C = methanol: water: PIC A reagent (water) (490: 15: 4). Gradient conditions: 100% (A) to 60%: 40% (A: B) over 20 minutes, then 100% (C) over 10 minutes, then 100% (C) over 40 minutes. Flow rate: 2 mL / min. Detection: 240-575 nm photodiode array.
(B) Measurement of acid cleavability
The acid hydrolysis rate of the hydrazone conjugate (19) producing 7-N- (5-oxopentanoyl) deacetylcolchicine was investigated by HPLC at three different pHs.
The buffer is Gomori's "Methods in Enzymology" 16 138 (1955). HPLC conditions and retention times were the same as described above. The detection limit for 7-N- (5-oxopentanoyl) deacetylcolchicine was about 100 ng at 350 nm.
50 μl of hydrazone conjugate solution (1 mg / ml methanol) was added to a screw cap glass bottle containing the desired pH citrate phosphate buffer (200 μl) to prepare the compound solution to be investigated. The glass bottle was closed and the solution was analyzed by HPLC (detection at 350 nm) and the remaining conjugate (19), 7-N- (5-oxopentanoyl) deacetylcolchicine formed after 24 and 48 hours. I investigated. Each hplc injection was 200 μl.
The results of the hydrolysis at pH 4.21, 5.74, 7.35 are summarized below.
pH 4.21: After 24 hours, 78% of (19) was cleaved to yield (18) and after 48 hours 100% was cleaved.
pH 5.74: After 24 hours, 45% of (19) was cleaved to produce (18) and after 48 hours 100% was cleaved.
pH 7.35: After 24 hours, 36% of (19) was cleaved to yield (18) and after 48 hours 77% was cleaved.
Only the free colchicine hydrolysis product of the hydrazone conjugate detected by HPLC was considered to be the aldehyde of compound (18).
(J) Heparin lipophilic cyanine conjugate
The title compound was prepared according to the general method described in Reaction Scheme 4 above. This reference number corresponds to the number of the reaction mechanism 4. The resulting product has the type of formula represented by compound 21, X and X ₁ = C (CH _Three ) ₂ , R / R ₁ = C ₁₄ H ₂₉ / C _{twenty two} H ₄₅ , A = Cl.
Compound 8 was prepared as described above.
Freshly prepared compound 8 (18.0 mg, 18.0 μmol) was dissolved in deuterated chloroform (0.5 ml, Aldrich) in an NMR tube. Triethylamine (5 μl, 0.036 mmol) was then added followed by triphosgene (1.95 mg, 6.7 μmol, Aldrich) and the mixture was shaken for 2 minutes. Proton NMR was then performed and showed a shift from 3.95 to 4.95 in the benzyl proton as seen in compound (8), indicating the product 5-methylene isocyanate 1′-docosanyl-1- The formation of tetradecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine chloride (20) was shown.
The deuterated chloroform solution of isocyanate (20) was concentrated by rotary distillation and the residue was dissolved in dimethylformamide (4 ml, dried and distilled) and stirred rapidly. A solution of heparin in formamide (9.4 mg / ml, 2 ml, 0.0016 mmol) was added to the rapidly stirred solution, and the flask was further capped and stirred at room temperature for 20 hours. The insoluble material was then removed by filtration and the filtrate was concentrated by rotary distillation at 50 ° C. under high vacuum. The residue was added to a mixture of water (20 ml) and methylene chloride. The aqueous layer was separated and washed again with methylene chloride. The aqueous solution was then placed in a dialysis bag (Spectra / Por membrane MWCO: 1000) and the water was dialyzed and then lyophilized to produce a pink solid (24.3 mg). This material was considered to be a mixture of compound 21 and unreacted heparin without further purification. It was used for biological evaluation (see Example 14).
Example 4
Biological effects of conjugating therapeutically effective proteins to lipophilic molecules
The in vivo receptor pharmacology of the compound produced in Example 3d above is described in US Pat. Forstermann et al. Pharmacol. Exp. Ther. 234: 1055-61 (1987) was examined on hind limb specimens of rabbits perfused with blood. Blood was withdrawn from the carotid artery inserted with an artificially ventilated rabbit cannula anesthetized with pentobarbital, passed through a medical grade silastic tube using a constant speed roller pump, and led to the cannulated femoral artery. Terminal perfusion pressure (mmHg) in the femoral artery bed was measured through the perfusion tube so that the micro-pressure transducer (Millar) was located just beyond the tip of the femoral catheter. Initially, the pump speed was adjusted so that the terminal perfusion pressure approached the systemic mean arterial pressure, and then the blood flow was kept constant during each remaining experiment. The resistance variation then changes according to the end perfusion pressure as described by Ohm's Law:
Vascular resistance = perfusion pressure / blood flow
Therefore, by maintaining a constant blood flow during each experiment, changes in peripheral perfusion pressure are directly reflected in vascular resistance, such that a decrease in pressure means vasodilation and an increase in pressure means vasoconstriction. . Therefore, direct injection into the perfusion system can be used to analyze vascular biology and the pharmacology of substances that are thought to affect vascular smooth muscle tone in vivo.
FIG. 1 shows the qualitative identity of the reaction in vivo between substance P and the conjugate of Example 3d. When both substance P and the conjugate are locally injected into the hind limb specimens of perfused rabbits, there is a decrease in hind limb perfusion pressure associated with short doses. The response of these dilators is in complete agreement with the known vascular pharmacology of substance P. For example, J. et al. Beny et al. J. et al. Physiol. , 398 : 277-89 (1988).
As can be seen in FIG. 2, there is a quantitative difference between the reaction of substance P and the conjugate. The average dose threshold for substance P requires that a perfusion pressure drop of approximately 0.003 pmoles occurs, while the maximum pressure drop is achieved in the 3-10 pmole dose range. The minimum conjugate dose required to cause a reduction in perfusion pressure is greater than that of substance P, 1-10 pmoles, with the greatest reduction achieved at 1000 pmoles. ED calculated for substance P and conjugate by logical function ₅₀ The values are 0.13 and 34 pmole, respectively, indicating that the potency of substance P is 250 times greater. However, both substances showed parallel dose-response curve slopes consistent with normal receptor interaction. Further, FIG. 2 shows a known substance P antagonist [D-PRO ² , D-Trp ^7,9 The dose-response relationship between substance P and conjugate upon injection of substance P is also shown. This synthetic peptide at position 3 with the D amino acid has been reported to antagonize the neuronal, behavioral and vascular effects of endogenous substance P and exogenously administered substance P. [D-PRO] The decrease in perfusion pressure for both substance P and conjugate is analyzed by a parallel shift to the right of the dose-response curve of both compounds in the presence of antagonist. ² , D-Trp ^7,9 ] -Suppressed by substance P The magnitude of the rightward shift of the dose-response curve in the presence of the antagonist is similar for substance P and the conjugate, further suggesting that these two substances act on a common receptor site. . The data described in FIG. 2 is based on a study involving 3 rabbits and is expressed as the mean (± SEM) change in perfusion pressure from maximum response to substance P in the absence of antagonist. .
In addition to the above, it was experimentally confirmed that administration of the corresponding unconjugated lipophilic cyanine at concentrations of 1 and 10 nmoles did not show any vasorelaxant effects. Furthermore, administration of isoproterenol, a β-adrenergic receptor agonist, at concentrations of 1, 10, 100 pmoles also resulted in a dose-related decrease in perfusion pressure, which was a SP antagonist [D-PRO. ² , D-Trp ^7,9 It is not antagonized by -SP, and [D-PRO against SP receptor ² , D-Trp ^7,9 ] -SP specificity was shown.
The conjugate of Example 3d (100 uM) was readily bound to washed rabbit erythrocytes suspended in phosphate buffered saline supplemented with 1 mM EDTA and 0.5% rabbit serum albumin, and both were ex Cultured in vivo. The fluorescent component of the conjugate allows for rapid detection with RBC using flow cytometry. Infusion of conjugate labeled rabbit RBCs into the hind limbs of rabbits results in a decrease in perfusion pressure, the magnitude of which is related to the number of cells injected. Another experiment is 10 ⁶ -10 ⁹ It was shown that infusion of one RBC greatly reduced the perfusion pressure of rabbit hind limb specimens. The RBC sample labeled with the conjugate is separated into a supernatant fraction and a cell fraction, which is resuspended in the above RBC buffer and re-injected, and the supernatant fraction becomes the original cell suspension organism. It shows that the conjugate has the ability to diffuse RBCs, including most of the pharmacological activity. Repeated washing of the RBC results in a supernatant fraction with vasodilatory action, suggesting an extended ability to release the conjugate from the RBC.
From the above experiments, the substance P lipophilic cyanine conjugate of Example 3d above has a vasodilatory action that is qualitatively similar to that of natural substance P, and such action is a known antagonist of substance P receptor. It is understood that it can be antagonized by. These experimental results tend to show that the interaction between substance P and its receptor is maintained regardless of chemical conjugation with the lipophilic reporter molecule.
Example 5
Measurement of the effect of cell binding on the structure and biological interactions of substance P induced by lipophilic cyanine
To determine that the substance P component of the conjugate of Example 3d is structurally unaffected and can be recognized on the surface of peripheral red blood cells (RBC), 2 ml of human RBC (10 ⁶ Cells / ml) were labeled with the conjugate (10 μM; red fluorescence) and then examined using flow cytometry. The results of this investigation are shown in FIGS. Specifically, untreated RBCs and conjugate labeled RBCs were analyzed to determine the following:
1. The conjugate is bound on the cell surface (compare FIG. 3A).
2. The goat anti-rabbit antibody conjugated with fluorescein isothiocyanate (FITC) binds non-specifically to conjugate-labeled RBC or unlabeled cells (comparison of FIG. 3B), or
3. Rabbit anti-substance P antibody + FITC anti-rabbit antibody specifically binds to conjugate-labeled RBC (compare FIG. 3C).
In FIG. 3A, examination of unstained RBC showed only background autofluorescence (cell population located near the origin of the green (LFL1) and red (LFL2) axes), but conjugate labeled cells were It showed an increase in red fluorescence signal compared to unlabeled cells.
In FIG. 3B, treatment of the conjugate labeled cells with goat anti-rabbit antibody stained with fluorescein, as evidenced by a small increase in the green fluorescence signal (LFL1) compared to the results in FIG. Only minimal non-specific binding was shown.
FIG. 3C shows a fluorescence histogram of unlabeled RBC or conjugate-labeled RBC that is indirectly fluorescently labeled as a primary reagent using a rabbit anti-substance P antibody and then fluorescein stained with a goat anti-rabbit antibody as a secondary reagent. In conjugate-labeled cells, significant amounts of green and red fluorescence can be detected on the cells (LFL1 signal increased over FIG. 3B), indicating specific binding to the cell-bound conjugate. This increase in fluorescence was not observed with RBCs that were not labeled with the conjugate. This method therefore demonstrates that substance P has been "recognized" on the surface of RBC by antigen P by an anti-substance P antibody, confirming the presence and maintenance of substance P structure on erythrocytes.
Example 6
In vivo stability measurement of substance P-lipophilic cyanine conjugate on red blood cells
To investigate the in vivo characteristics of red blood cells labeled with the conjugate of Example 3d above, 0.5 ml of fresh anticoagulated blood from each of two rabbits was conjugated (final concentration 10 μM). ) And reinjected into the same rabbit from which the blood was collected. Following labeling with the conjugate, an aliquot of labeled cells was examined using flow cytometry prior to injection to confirm that labeling was performed properly. Following in vivo administration of labeled cells, blood samples were taken at 30 minutes, 1, 2, 3, 4, and 7 time points and examined for cell fluorescence using flow cytometry.
The results of this study are shown in the graph of FIG. 4, from which it can be seen that the in vivo separation of the conjugate from the labeled cells occurs at a relatively slow rate. The fluorescence (logarithmic fluorescence intensity) for the labeled cells decreased with a half-life of 5-6 days, but the lifetime of natural substance P in the circulation was in minutes.
Thus, the above experimental results reveal that the labeling of bioparticles with lipophilic molecules comprising a therapeutic agent provides an innovative delivery vehicle for parenteral administration of the therapeutic agent.
Example 7
Effect of iodination on dye binding, cell viability and membrane binding stability
To demonstrate that the addition of an iodine atom to the compound does not substantially affect its cell labeling properties, in vitro incorporation of the compound, cell viability after labeling, And membrane retention measurements were performed on the following compounds:

Compounds T, AA, AB can be prepared according to the general method described in Reaction Mechanism 1 above and described in Example 3 above.
Slezak and Horan, Blood , 74 : 2172-2177 (1989), recovery and viability were calculated at 5, 10, 20 μM labeling concentrations and for compounds AA and AB at 5 or 10 μM labeling concentrations. However, compounds AA and AB reduced viability and recovery to 70-80% at a label concentration of 20 μM.
The number of compound molecules bound per cell was determined for cells labeled with 10 μM compound. 10 from the washed cells after final resuspension and counting ⁶ An aliquot (10 ul) of individual cells was removed, the compound was extracted from the cell membrane by a mixture with 250 μl of 100% ethanol, and the fluorescence intensity of 200 μl of extract was measured using a combination of fluorescent microplate readerFluoroskan II and filter. The compound concentration of each extract was determined from a calibration curve of known compound concentrations made in 100% ethanol and measured with Fluoroskan II. The number of compound molecules per cell was then calculated from the known extract concentration, the total volume of the extract, and the known number of extracted cells. The calculated value is (4.0 ± 0.4) × 10 for compound T. ⁶ Compound AA is (1.3 ± 0.2) times 10 ⁶ Compound AB is (2.5 ± 0.7) × 10 ⁶ Met.
NH _Four Relative membrane retention was measured using erythrocyte membrane ghosts conditioned by Cl lysis (Slezak and Horan, Blood , supra ). Using 10 μM of ghost, 4 × 10 ⁸ Labeled for 5 minutes using the method described above at room temperature / ml. However, post-label washing was performed using 1 mM EDTA with PBS and 5% BSA. 4x10 after final wash ⁸ Ghosts were resuspended in PBS + EDTA + 5% BSA at / ml and cultured at 37 ° C. for 24 hours. 50 μl aliquot doubled at 24 hours, a) well mixed suspension of ghosts (for determination of all compounds present), and b) ghosts pelleted at 12,500 × g for 15 minutes The remaining supernatant (for determination of unbound compound present) was removed. Aliquots were extracted with a mixture of 200 μl of 100% ethanol, and the fluorescence intensity of each extract was measured using a fluorescence microplate readerFluoroskan II. The percentage of retained compound was calculated by the following formula:
Total compound-unbound compound x 100
All compounds
The calculated values are found to be (91.9 ± 2.9)% for compound T, (97.7 ± 0.2)% for compound AA and (96.8 ± 1.3)% for compound AB. It was.
Based on the above experiments, it was concluded that the iodide compound of the present invention exhibits film retention properties that are equivalent to or better than the non-iodide compound. Binding to the erythrocyte membrane was somewhat lower than the equivalent concentration of non-iodinated compounds, but this difference is expected to apply to the above-mentioned types of cell labeling, as expected due to its large molecular size and molecular weight. It doesn't seem to be big enough to change the effectiveness of.
Example 8
Holding on an artificial surface
In order to analyze the ability of the compounds of the invention to be retained on an artificial surface, radioactive iodine in 100% ethanol ( ¹²⁵ I) Lipophilic cyanine (compound 12, above, reaction mechanism 2, example 3g) combined with medical silastic (SIL), polycarbonate (PC), polyvinyl chloride (PVC), and polyethylene (PE) They were placed in contact with the luminal surface of short pieces of different types of plastic tubes. Allow the compound to remain in contact with the tube for 10 minutes, then remove and gently flush the tube with PBS. After performing baseline radioactivity measurements on the labeled tubes, the fragments were connected to a closed tube circuit containing about 30 ml of fresh human blood without anticoagulation. The tube circuit was passed through a roller pump and blood was circulated for 6 hours. After 6 hours, the piece of the tube was removed, PBS was gently flushed to remove all attached blood, and the radioactivity was measured. The results of this experiment are shown schematically in FIG. Compound combined with radioactive iodine on the luminal surface / mm ² The tube segment length, diameter, and specific activity of the compounds of the invention to which radioactive iodine was bound were recorded so that (the x-axis of the bar graph) can be represented in picograms. FIG. 5 shows that the compound with the highest amount of radioactive iodine bound at the beginning bound to the PVC tube and the compound bound to PE was minimal. It was PVC (97.6 ± 2.1% of the initially retained radioactivity) that showed the greatest retention in tubes in contact with blood after 6 hours, with minimal retention on PC ( (56.0 ± 10.4% of initially retained radioactivity). However, the average retention for all tubes is over 50%, reaching nearly 100% for PVC, and the ability of the compounds of the invention to remain on an artificial surface for extended periods of time even in contact with biological fluids Showed that it is equipped. Accordingly, the compounds of the present invention can be effective in retaining biologically active substances on artificial surfaces.
Example 9
After intratumoral injection ¹⁸⁶ Re-chelate lipophilic cyanine conjugate and Na ¹⁸⁶ ReO _Four Retention in vivo
Basically except that SepPak was washed with about 10 mL of distilled water prior to elution of the product with ethanol to remove excess gentisic acid and avoid the need for pH adjustment prior to in vivo administration. According to the method described in 3h ¹⁸⁶ A Re chelate lipophilic cyanine conjugate was prepared (compound 24 of Reaction Mechanism 5). After vacuum evaporation, the concentrated stock solution was brought to a final volume of about 25 μL in ethyl alcohol (compound 24 at a concentration of about 500 μM; specific activity of about 123 mCi / μmol). About 5-6 μCi for in vivo infusion ¹⁸⁶ Compound 24 containing Re and Na ¹⁸⁶ ReO _Four Was adjusted as follows. Na ¹⁸⁶ ReO _Four (NEZ301, in 0.1N NaOH) is diluted with 300 mOsM of sterilized Dulbecco's phosphate buffered saline, pH is confirmed to be 7.0 using pH paper, and then the modifier is added. Re-sterilized through a 0.22 μm filter. Compound 24 was diluted with sterile 300 mOsM glucose. In a sterile 50 μL Hamilton syringe, 5.0 μL Na ¹⁸⁶ ReO _Four Alternatively, a compound 24 modifier was added using a sterilization method. A separate aliquot was taken to provide a counting basis for each adjustment and to be used as a basis for whole body image decay correction and biodistribution measurements.
Retention of the above-described regulator after intratumoral injection was evaluated as follows. Approximately 1 × 10 6 suspended in sterile Hanks buffered saline to the right hind limb of female C57B1 / 6 mice 5-6 days prior to intratumoral injection ⁶ Growing MC38 adenocarcinoma nodules were introduced by intradermal injection with an inoculum of viable tumor cells. On day 0, the animals are re-anesthetized and the right hind limb is sterilized using an alcohol swab to give a 5.0 μL aliquot of Compound 24 or Na ¹⁸⁶ ReO _Four Was injected directly into the tumor nodule, approximately 5 mm in diameter. The infusion was performed for about 10 seconds, and the needle was held in place for 5-10 seconds after the infusion was completed to dissipate any back pressure and minimize leakage at the infusion site. Immediately after infusion (within 10-15 minutes) and daily for 4 days, animals and metrics were imaged using the GE Starcam 300 system using an energy window of 140 ± 20 keV. After imaging on the 2nd and 4th day, collect and weigh various organs at the expense of the group of animals, ¹⁸⁶ Cpm / gm was measured to assess the biodistribution of Re.
Day 4 of the selected organ ¹⁸⁶ The biological distribution of Re is shown in A of Table IV. The results are expressed as a ratio after correction for collapse of recovery from specific organs to the total number injected. Organs and tumors are significantly different in size and found in each organ ¹⁸⁶ The relative concentration of Re is compared in Table IVB. The results represent the ratio of the number of injections found in a 1 g tissue mass with collapse correction. Whole body scintigraphic images were analyzed by identifying regions of interest (ROI) corresponding to the tumor or whole body; the quantity of each region of interest was then determined as a function of time after injection. The localization of the label within the tumor was calculated as the ratio of the tumor ROI quantity to the whole body ROI quantity (columns 2 and 3 in Table V). The retention of label within the body was calculated as the ratio of the quantity of whole body ROI to the quantity of reference ROI (Table 2, 4th and 5th rows).
The data in Table IV and Table V are from sites within the tumor ¹⁸⁶ It shows that the magnitude of Re leakage is greatly reduced by administration of the radionuclide in the form of Compound 24. Furthermore, these data show excellent agreement between the two different methods used to measure intratumoral retention (whole body gunmachigraphy and direct excitation).

Example 10
¹⁸⁶ Re-chelate lipophilic cyanine conjugate and Na ¹⁸⁶ ReO _Four In vivo maintenance after intraarticular injection
Two properties of the compounds of the present invention are important in achieving site-selective administration and retention as well as therapeutic efficacy:
a) the strength of retention at the application site compared to unbound therapeutics;
b) Its distribution form (inhomogeneous and homogeneous) after injection into the site.
Using fluorescent or radiolabeled compounds, these properties were analyzed based on the supply of rhenium containing compounds to the synovial lining in the joint space.
¹⁸⁶ The Re-chelate lipophilic cyanine conjugate (Compound 24 of Reaction Scheme 5) was prepared as described in Example 3h and the concentrated stock solution was brought to a final volume of about 40 μL in ethyl alcohol. For in vivo infusion, compound 24 modifier and Na as follows: ¹⁸⁶ ReO _Four It was created. Na ¹⁸⁶ ReO _Four (NEZ301, in 0.1N NaOH) is diluted with 300 mOsM of sterilized Dulbecco's phosphate buffered saline, pH is confirmed to be 7.0 using pH paper, and then the modifier is added. Re-sterilized through a 0.22 μm filter. Compound 24 was diluted with sterilized 300 mOsM glucose and the pH was adjusted to 7.0 by addition of sterilized 0.1 N NaOH (the absence of buffer in the glucose dilution and the presence of gentisic acid in the final preparation. And requires the fact that an unadjusted pH of 1-2 is produced). Weigh a 1.0 mL tuberculin syringe equipped with a sterile 25G x 5/8 inch needle and add approximately 0.1 mL Na ¹⁸⁶ ReO _Four Alternatively, a compound 24 modifier was added using a sterilization method and reweighed to determine the weight prior to injection. Furthermore, aliquots were taken out in order to determine cpm / μL of each regulator.
Retention of the above-described conditioning agent after intra-articular injection was evaluated as follows. Female New Zealand white rabbits weighing 3-4 kg were anesthetized with ketamine and xylazine, the knee site was carefully shaved and disinfected with an iodine solution. Using a sterilization method, the knee is bent to approximately 120 ° to temporarily move the patella laterally, a needle is inserted through the skin into the joint space, and approximately 0.1 mL of compound 24 (3 Head animal) or Na ¹⁸⁶ ReO _Four Conditioner (2 animals) was injected and the needle was removed to return the patella to the normal position. Re-weigh the syringe, calculate the difference between the weight before and after injection (assuming the density of the injection is 1.0 g / mL), and obtain the cpm / μL value obtained by counting aliquots of known volume of each modifier Multiplied by the measured volume and injected compound 24 or Na ¹⁸⁶ ReO _Four The exact volume and action were determined. Within 5-10 minutes after intra-articular injection, a known volume of blood (approximately 1 mL) was removed from the central ear artery. Animals were placed in cages where urine and stool could be collected independently and observed for 6 days. Blood was removed on each day and all urine excreted in the previous 24 hours was collected and cpm / mL of aliquots of known volume of blood and urine was determined using a Packard Cobra Model 5003 gamma meter. . Total blood production was estimated based on 5.5% of total body weight and cpm / mL of blood; total urine volume was calculated based on urine volume for 24 hours and urine and cpm / mL. No significant amount was detected for stool. On days 0, 1, 4, and 6, gunmachigraphy was performed using a GE Starcam 300 system with an energy window of approximately 120-150 kEV. On the sixth day, sacrifice the animal after collecting blood and urine specimens, collect and measure various organs, ¹⁸⁶ Cpm / mL was measured for assessment of Re biodistribution.
Compound 24 and Na ¹⁸⁶ ReO _Four Table VI shows the circulating concentrations of urine and the amount excreted in the urine over a period of 6 days after infusion. On day 6 of the selected organ ¹⁸⁶ The Re distribution is shown in Table VII. All results in Table VI and Table VII are expressed as a percentage of the injected dose after correction for decay. The data in Table VI and Table VII are derived from intraarticular space measured by blood concentration, urine output, and accumulation in other organs. ¹⁸⁶ It shows that the magnitude of Re leakage was greatly reduced by administration of radionuclide in the form of Compound 24. In addition, retention on the knee was evaluated by measuring the amount of a particular region of interest (knee and / or whole body) from a gunmachigraphy image and is shown in Table VIII. These results also show a significant improvement in retention when the radionuclide is administered in the form of compound 24.

Example 11
Distribution of lipophilic cyanine conjugate in synovium after intra-articular injection
To assess the homogeneity or heterogeneity of binding by synoviocytes after intra-articular injection, a solution of about 10 μM iodide salt of Compound T (see Example 2 above) in glucose at pH 7.0 at 300 mOsM. .1 mL was injected into the knee as described in Example 10. One hour later, the animals were sacrificed and both the injected knee joint and the non-injected knee joint were incised. Mineral removal is required to incise thin sections, and the media for mineral removal removes the compounds of the present invention from the tissue, making cross sections across all joints impossible. Therefore, the subpatellar fat pad that was placed under the patella and bounded the synovial cavity was carefully removed, frozen rapidly on dry ice, and stored at −80 ° until the frozen section was adjusted. Thick (10μ) cryostat sections were cut, attached to a glass slide and analyzed by optical and fluorescence microscopy.
Light micrographs of fat pad sections (injected and non-injected knees) show that synovial cells are layered along the inner edge of the section in a thin, dark line on the surface facing the joint space of the fat pad Was observed when examined at 100x magnification. (The synovial layer is only 1 to 2 cells thick in normal joints, but thickens by hyperproliferation in arthritic joints). The remaining tissue was composed mainly of large adipocytes. Illumination of the section when blue excitation light is applied from the injected knee shows that the presence of bright and relatively uniform label is essentially limited to the synovial cell layer, while the adipocyte region Alternatively, the knee without injection showed only very dark green autofluorescence.
Example 12
Retention of lipophilic cyanine conjugates at intravascular sites
Experiments were performed to see if the compounds of the invention remained in the intravascular site once applied, which was adjusted as described in Example 2. ¹²⁵ Lipophilic cyanine (compound 12, reaction mechanism 2) substituted with I was applied to the luminal surface of the femoral artery of an anesthetized rabbit. The femoral artery was surgically isolated and a small, mesial side branch was cannulated with a short PE10 tube. Occlude the 1 cm artery part around the side branch, ¹²⁵ 20-50 μl of a solution containing Compound 12 substituted with I was administered through the cannula to the occluded part and allowed to remain for 5-10 minutes. after that ¹²⁵ The I-substituted compound was removed along the cannula to permanently join the side branches, remove the femoral artery occlusion to restore blood flow, and close the femoral incision. Next, using a Ludium Model 2200 Scaler Ratemeter and a Model 44-17 2 inch crystal, ¹²⁵ With a window optimized for I detection ¹²⁵ I radioactivity was then observed at selected times over 3 weeks.
Graphical analysis of the resulting data shows that in the two-phase release process, 34.0 ± 10.9% (mean ± sem, n = 4) of the applied substance (radioactivity) is 24 hours after the first 24 hours. The initial release half-life was 0.77 ± 0.29 days. However, after the first 24 hours, the remaining material was released very slowly with a release half-life of 15.24 ± 2.89 days. Therefore, since the release from the intravascular application site is slow, a significant amount of ¹²⁵ I-substituted compounds could be detected at least 3 weeks after application.
Example 13
Anti-proliferative effect of colchicine lipophilic cyanine conjugate in vitro on A10 cells
In order to investigate the antiproliferative activity of the compounds of the present invention, clonal cell lines derived from A10 cells and embryonic rat thoracic aorta that proliferate as myogenic cells and grow phenotypically into cells similar to smooth muscle cells. In vitro studies were performed using B. Kimes and B. Brandt, Exptl. Cell Res. 98 : 349 (1976). Usually 2500 A to 10,000 A10 cells / cm in 12 tanks ² Was inoculated into Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% calf serum (FCS) and allowed to attach and stabilize at 37 ° C. for 24 hours. The test substance was then adjusted to the appropriate cell binding medium at the required concentration and the plate culture medium was aspirated and then placed in individual baths at 37 ° C. for only 10 minutes. The treatment was then aspirated and the tank was washed 4 times with untreated medium containing medium and placed in medium containing DMEM supplemented with untreated 10% FCS for the duration of the study. At different times after treatment application, the three tanks were aspirated and the aspirate was stored and the tanks were treated with 0.25 ml of 0.25% trypsin to remove attached cells. The enzymatic action of trypsin on the cells was stopped by the addition of extra protein (1.75 ml DMEM + 10% FCS), the aspirate was returned to the bath and the resulting cell suspension aliquot was filtered to a Coulter Counter (Model ZM). And Sampling Stand II). The number of cells is cm in the growth area (surface area of the tank bottom). ² Normalized to the number of cells per cell.
As shown in Table IX below, growth after 7 days in cell cultures treated with a compound of the invention (compound 19, reaction mechanism 3, example 3i, referred to herein as “colchicine conjugate”) Only 5.2% of the maximum growth treated. Significant cell-bound fluorescence was seen (measured by flow cytometry), indicating the presence of colchicine conjugate binding to A10 cells. In contrast, the presence of cells treated with the same initial concentration of unconjugated colchicine is only half the cell density of vehicle-treated cells, resulting in an approximately 10-fold increase in cell number as obtained with the compounds of the present invention. Indicated. Thus, the compounds of the present invention allow a significant retention of the anti-proliferative effects of the parent compound in A10 cells despite exposure for only 10 minutes, much greater than unconjugated colchicine applied in the same way. It showed antiproliferative action.
Example 14
Binding of anticoagulant lipophilic cyanine conjugates to biological membranes.
In order to evaluate whether the anticoagulant compounds of the present invention can be stably bound to biological membranes, an in vitro study was performed on rabbit erythrocyte ghosts as described in Example 1 above. 2 × 10 ⁸ Ghost / ml was (1) an induced lipophilic cyanine free of anticoagulant (reaction mechanism 1, compound 7 of example 3a), (2) anticoagulant lipophilic cyanine conjugate (reaction mechanism 4, example 3j). Compound 21) or (3) fluorescent isothiocyanate labeled heparin (FITC heparin) at concentrations of 10 μM, 20 μM and 20 μM, respectively. The ghosts were then further washed and placed in phosphate buffered saline containing 1 mM EDTA and 5% BSA at 37 ° C. for 24 hours. Samples were agitated and 50 μl aliquots were removed from each sample and placed in 200 μl Triton X-100®R in a microtiter plate culture tank (meaning total suspension fluorescence). The original sample was centrifuged for 10 minutes and a 50 μl ghost supernatant sample was removed and placed in 200 μl Triton X-100® (meaning free fluorescence only in the liquid phase). The fluorescence of all samples was measured with a fluorimetric microtiter plate reader. Bound fluorescence was determined by subtracting free fluorescence from the total after correction of background from unstained ghosts; the ratio of free and bound fluorescence by dividing bound and free fluorescence by total fluorescence and multiplying by 100 I asked for each.
The results shown in Table X below show that the anticoagulant conjugates of the present invention show 90.90% of the ghost membrane after 24 hours compared to 94.69% retention of the compounds of the present invention without the anticoagulant. 94% bonded, indicating excellent membrane retention. FITC heparin only had an inadequate retention with only 37.63% fluorescence remaining after 24 hours. This value is considered to be an overestimation of the actual retention rate of FITC heparin because the fluorescence signal of FITC heparin on the ghost was slightly above the background fluorescence intensity, and was calculated from these values. Binding and release rates remain questionable in their accuracy. However, the following data clearly shows that the compounds of the present invention are well retained on biological membranes, unlike fluorescent heparin.

Example 15
Anticoagulant retention properties of anticoagulant-lipophilic cyanine conjugates when bound to biological membrane surfaces
In vitro studies were conducted to determine whether the anticoagulant properties of the compounds of the present invention were retained when coated on a biological membrane surface, and the ability of the compounds of the present invention to block the clotting enzyme thrombin was analyzed. . Rabbit erythrocyte ghosts were first labeled with 10 μM anticoagulant-lipophilic cyanine conjugate (reaction mechanism 4, compound 21 of Example 3j), washed 4 times with PBS containing 0.1% BSA, and then Diluted to various quantities of ghost / ml. A known amount of ghost was placed in a microtiter plate and the concentration of compound 21 on the ghost was analyzed by comparing the observed fluorescence with the fluorescence produced by a known standard concentration of compound. Next, Krtenansky and Mao, FEBS Let. 211: 10 (1987), activity analysis was performed by a method similar to that reported by: 100 μl of human plasma diluted 1:10 in phosphate buffered saline (PBS) buffer, 50 μl of PBS containing various concentrations of labeled ghost or thrombin inhibitor and 50 μl of PBS containing a constant amount (0.5 nM) of thrombin are added to the microtiter plate culture bath and a spectrophotometric plate reader (Bio- The change in absorbance at 405 nm was recorded over 60 minutes. The data obtained from the bath treated with the blocking agent was expressed as the blocking rate in the absorbance region obtained in the absence of blocking agent. The data obtained from a representative experiment is shown in FIG. EC obtained by three-variable nonlinear logic regression of heparin (●) and anticoagulant conjugate of the present invention (◯), respectively ₅₀ The values 1.03 nM and 21.23 nM (@ 1.43 × 10 ⁷ (Ghost / 200 ul) shows that when applied to biological membranes, the compounds of the present invention are less effective than the parent compound as a thrombin inhibitor by a magnitude somewhat less than 20 cultures. However, since the serially diluted ghost-free supernatant (◇) analyzed at the same time has no thrombin blocking action, this blocking action is bound to all membranes. Thus, the compounds of the present invention still provide a potent antithrombin action when bound to biological membranes.
Various aspects of the invention have been described and illustrated above with respect to the synthesis and use of certain preferred embodiments, ie, chemotherapy and radiotherapy antiproliferative compounds. However, many other embodiments will be apparent to those skilled in the art. For example, other chemotherapy and radiation therapy conjugates can be synthesized and used for the treatment or analysis of various disease states or pathological conditions. In addition, the compounds and methods of the present invention can be used for the development of site-selective delivery and retention of other types of drugs such as antibacterial, antifungal or anti-inflammatory drugs. Accordingly, the present invention is not limited to the specifically described and illustrated embodiments, and variations and modifications can be made without departing from the scope of the following claims.

Claims (10)

formula:

[Where:
B is heparin; Hirudin; colchicine; vinca alkaloid; taxol; substance P; Interferon gamma; and formula:

Wherein Z ′ represents H or a metal coordination position;
R ′ is R ″ or the formula:

Wherein each R ′ is independently a hydrogen atom or an alkyl group, R ″ and R ′ ″ are independently a hydrogen atom or an alkyl group, and m and n are each 0. Or 1)
Or the formula:

(Wherein n is 2, 3 or 4, m is 1 or 2, and p is 1-6)
A complex of a chelating reagent represented by and a radioactive metal;
It is selected from the group consisting of,
R and R ₁ are hydrocarbon substituents having 1 to 30 carbon atoms , wherein _one of R and R ₁ has at least 12 carbon atoms, and the straight chain of R and R ₁ The total number of carbon atoms is at least 23;
R ₂ represents a spacer component of the following formula:
− (Q′−R ₄ ) _q −Q− (R ₃ ) _p −
Here, R ₃ represents an aliphatic hydrocarbon, R ₄ is independently selected from the group consisting of aliphatic, alicyclic or aromatic hydrocarbon, heterocyclic or CH ₂ C (CO ₂ H) ═CH. Q and Q ′ are amide (—NHCO—), thiourea (—NHCSNH—), Acyl hydrazone (—CH═NHNCO—), Ester (—COO—), Urea (-NHCONH-), carbamate (-NHCO ₂ -) Q and Q ′ may further independently represent a valence bond; the aliphatic hydrocarbon may be from 1 to 12 linear carbons; The aromatic hydrocarbon comprises 6 to 12 carbon atoms; n is 1; p is 0 or 1; q is 0 to 4, and when q is 2 or more, Each Q ′ may be the same or different ; provided that at least one of Q and Q ′ is amide (—NHCO—), thiourea (—NHCSNH—), Acyl hydrazone (—CH═NHNCO—), urea (—NHCONH—), carbamate (—NHCO ₂ —) Q is not a valence bond when selected from a functional linking group composed of a bond and q = 0,
X and X ₁ can have the same or different values and represent O, S, C (CH ₃ ) ₂ or Se ,
Y _{is, = CR 8 -, = CR} 8 -CR 8 = CR 8 -, = CR 8 -CR 8 = CR 8 -CR 8 = CR 8 -, or _{= CR 8 -CR 8 = CR 8} -CR 8 = CR ₈ —CR ₈ represents a linking group selected from CR ₈ —, wherein R ₈ is selected from H, CH ₃ , CH ₂ CH ₃ , CH ₂ CH ₂ CH ₃ , or CH (CH ₃ ) ₂ ;
Z is, H, alkyl, OH, -O- _{alkyl, COOH, CONH 2, SO 3} H, SO 2 NH 2, SH, S- alkyl, CONH- alkyl, CON- (alkyl) _2, NH- acyl, NH -Alkyl, N (alkyl) ₂ , NO ₂ or halogen Represents a substituent selected from the group, alkyl group composed of said Z substituent comprises from 1 to 4 carbon atoms, further,
A represents a pharmaceutically acceptable anion ]
A compound represented by The compound according to claim 1, characterized in that B is selected from the group consisting of colchicine, vinca alkaloids and taxol. 2. A compound according to claim 1 wherein B is vinblastine. B is heparin The compound of claim 1, wherein The compound according to claim 1, wherein B is hirudin.

2. A compound according to claim 1, characterized in that it is given by the above formula.

2. A compound according to claim 1, characterized in that it is given by the above formula.

2. A compound according to claim 1, characterized in that it is given by the above formula. A compound given by the following formula:

Wherein R and R ₁ is a hydrocarbon substituent with one to 30 carbon atoms, wherein, having one of at least 12 carbon atoms of R and R _1, straight of R and R ₁ The total of chain carbon atoms is at least 23;
X and X ₁ can be the same or different values and represent O, S, C (CH ₃ ) ₂ or Se;
A represents a pharmaceutically acceptable anion;
M represents a radioactive metal selected from the group consisting of copper, technetium, rhodium, palladium, indium, samarium, gadolinium, holmium, erbium, ytterbium, lutetium, rhenium, yttrium, gold, erbium, holmium or combinations thereof. N is 2, 3 or 4; m is 1 or 2; p is 1 to 6; 2. A compound according to claim 1 wherein B is a complex in the form of a chelating reagent and a radioactive metal .

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