JP3682974B2 - Compound to bind bio active substance to the bio-particle surface layer, composition, and methods - Google Patents

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Description

本出願は、1988年5月2日に出願された、“バイオ作用性物質をバイオ粒子表面膜へ結合するための化合物、組成、および方法”と題する米国特許出願番号189,192の一部継続出願である。 This application was filed on May 2, 1988, "compound for binding bio-active substance to the bio-particle surface layer, composition, and methods" entitled U.S. continuation-in-part of patent application No. 189,192 it is an application.
【発明の分野】 FIELD OF THE INVENTION
本発明は、治療薬、および任意には診断薬などのバイオ作用性物質を、生存可能な細胞とウイルス、生存不可能な担体粒子を含む生体適合粒子へ結合するための化合物、組成、および方法に関するものである。 The present invention, therapeutic agents, and bio-active substance, such as diagnostics optionally, viable cells and viruses, compounds for binding to a biocompatible particles containing non-viable carrier particles, compositions, and methods it relates. 本発明はまた、このような化合物の調整に使用する開始物質と中間物に関するものである。 The present invention also relates to starting materials and intermediates for use in the adjustment of such compounds. さらに本発明は、治療薬、および任意に診断薬をin vivoで部位選択的に供給するための化合物の使用に関するものである。 The invention further therapeutic agent, and optionally a diagnostic agent relates to the use of a compound for site-selectively supplied with in vivo.
【発明の背景】 BACKGROUND OF THE INVENTION
疾患と他の病的状態の治療のための治療薬の供給は、様々な方法によって達成することができる。 Therapeutic agent supply for the treatment of diseases and other pathological conditions may be accomplished by a variety of methods. それらには、経口、静脈内、皮下、経皮、筋肉内投与、あるいは局所的適用が含まれる。 They include oral, intravenous, subcutaneous, transdermal, intramuscular administration or topical application. 一部の治療薬の場合、現行の供給方法では、全身性の副作用を及ぼすことなく疾患部位へ十分な量を供給すること、または、意図する治療効果を生むための十分な間、疾患部位に治療物質を十分に保持しておくことが不可能である。 Treatment For some therapeutic agents, the current supply method, supplying a sufficient amount to disease site without adversely systemic side effects, or, on long enough, the disease site to produce the intended therapeutic effect materials it is impossible to keep safely hold.
病的細胞種の増殖を防止あるいは低減する薬物は、有害あるいは制御不可能な細胞増殖を伴う様々な疾患の治療と制御に不可欠なものである。 Pathological cell type drugs that prevent or reduce proliferation of, is essential in the treatment and control of various diseases involving harmful or uncontrollable cell growth. しかし、抗増殖物質はその定義上、ある種の細胞にとって毒物とならざるをえない。 However, anti-proliferative substance on its definition, forced to not help become a poison for some of the cells. 疾患細胞種を制御するために必要な分量が、患者の正常な細胞にとって有毒あるいは致命的になることがあるため、これらの薬物の全身的投与はしばしば実現不可能である。 Amount needed to control the diseased cell species, because it can be toxic or fatal to normal cells of the patient, the systemic administration of these drugs is often not feasible. この困難は、有害細胞の増殖部位に抗増殖物質を直接投与することによって避けることができる。 This difficulty can be avoided by administering an anti-proliferative agent to the growth site of harmful cells directly. また、正常な細胞種の移動および損傷を制限しながら有害な細胞の増殖を効果的に制御するために、疾患部位に抗増殖薬を保持するための機構が必要である。 Further, in order to effectively control the growth of harmful cells while limiting the movement and damage of normal cell types, it is necessary mechanism for holding the anti-proliferative agent to the disease site.
抗増殖物質の部位特異的な供給と保持が特に効果的な特定の疾患と状態について、以下に簡潔に記述する。 Site-specific supply and retention especially effective specific disease and condition of the anti-proliferative agent, briefly described below. これらの各状態は、特に有害な細胞種の増殖を含み、治療のための全身投与による薬物療法が最適な結果を生んでいないものである。 Each of these conditions, in particular including the growth of harmful cell types, drug therapy by systemic administration for the treatment is one that is not given rise to optimal results.
1. 1. 血管形成術後の再閉塞および再狭窄冠状血流を制限または閉塞するアテローム硬化性病変は、冠状動脈心疾患に関連する死亡の主要な原因である。 Atherosclerotic lesions, which limit or obstruct reocclusion and restenosis coronary blood flow after angioplasty is a major cause of death associated with coronary heart disease. 経皮経管冠動脈形成(PTCA)、あるいは冠状動脈バイパス移植術による直接的手術が用いられてきた。 Percutaneous transluminal coronary angioplasty (PTCA), or directly surgery coronary artery bypass grafting has been used.
PTCAの主な難点は、血管形成術後の血管閉鎖の問題であり、それにはPTCAの直後に起こるもの(急性再閉塞)と、長い期間内で起こるもの(再狭窄)の両方がある。 The main difficulty with PTCA is the following angioplasty vascular closure problem, and it shall take place immediately after PTCA is (acute reocclusion), there are both those that take place within a longer period (restenosis).
血管形成術後の再狭窄は、血管形成術の処置によって起こる動脈内壁の損傷に対する反応である。 Restenosis after angioplasty is a response to injury of the artery inner wall caused by the treatment of angioplasty. その正確な機構は依然として調査中であるが、一般的には、動脈中間層の平滑筋細胞の増殖と、細胞が増殖を続ける内側(内膜)層に向かう、これらの細胞の移動を含む。 Its Although the exact mechanism is still under investigation, generally comprises a proliferation of smooth muscle cells of the artery intermediate layer, cells inward (intimal) layer to continue the growth, the migration of these cells. 増殖は、通常は損傷後7〜14日以内に内膜内で停止する。 Proliferation, usually stops at the intima within 7 to 14 days after injury.
症候性再閉塞の患者は、再度のPTCAまたは冠動脈バイパス移植を必要とする。 Patients with symptomatic reocclusion require PTCA or coronary artery bypass graft again. PTCAを受けた患者の高比率(30〜50%)の患者が再狭窄を経験するため、冠動脈疾患の治療法としてのPTCAの成功が明確に制限される。 Since patients with high proportion (30-50%) of patients undergoing PTCA will experience restenosis, the success of PTCA as a therapeutic method for coronary artery disease is clearly limited.
薬理学的手法によって再狭窄を防ぐ試みは、通常は様々な薬剤の全身的投与を必要とし、一般的には成功しない。 Attempts to prevent restenosis by pharmacologic approach usually requires systemic administration of various agents, it is not generally successful.
再狭窄の防止のために活発に研究されているいくつかの抗増殖薬について、以下に詳細に記述する。 For some antiproliferative agents being actively studied for prevention of restenosis is described in detail below.
a. a. ヘパリンとヘパリン断片ヘパリンは、広範囲に硫酸化されたα−D−グルクロン酸とN−アセチル−D−グルコサミンの反復二糖類ユニットで構成される高度に陰イオン性の異質性グリコサミノグリカンである。 Heparin and heparin fragments heparin, highly are anionic heterogeneity glycosaminoglycan composed of repeating disaccharide units of extensively with alpha-D-glucuronic acid sulfated N- acetyl -D- glucosamine . ヘパリンの治療上の主要な用途は抗凝固薬である。 Major therapeutic use of heparin is an anticoagulant. しかし、ヘパリンはまた、血管の平滑筋細胞(SMC)を含むいくつかの異なる細胞種の成長を抑制することが知られている。 However, heparin also possible to suppress the number of different cell types of growth, including smooth muscle cells (SMC) of the vessel is known. 四糖類と同程度に小さいヘパリン断片は、抗凝固作用が弱いか、あるいは抗凝固作用を持たないが、in vitroおよびin vivoで抗増殖作用を備えていることが見出されている。 Small heparin fragments to the same extent as tetrasaccharide, or anticoagulant activity is weak, or has no anticoagulant activity, have been found to be equipped with anti-proliferative effect in vitro and in vivo. Castellotら、J. Castellot, et al., J. Cell Biol. Cell Biol. 102 :1979〜1984(1986)。 , 102: 1979-1984 (1986).
ヘパリンは、高親和性結合部位を介してSMCの細胞表面に結合し、細胞内に取り込まれる。 Heparin binds to the cell surface of the SMC via high affinity binding sites are incorporated into the cell. さらにヘパリンは、トリドデシルメチルアンモニウム塩化物被膜とのイオン性結合を介して、シリコン、Mylar▲R▼、Dacron▲R▼、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレンなどの様々な人工表面にも結合することができる。 Further heparin through ionic bond with tridodecylmethylammonium chloride film, silicon, Mylar ▲ R ▼, Dacron ▲ R ▼, polycarbonates, can also be coupled to various artificial surfaces, such as polyethylene, polypropylene . Grodeら、Trans. Grode, et al., Trans. Am. Am. Soc. Soc. Artif. Artif. Int. Int. Organs、 15 :1(1969)を参照。 Organs, 15: reference 1 (1969).
ヘパリンの抗増殖性作用が、これらの物質に対して結合した場合にも保持されるかどうかについてのデータは存在しない。 Antiproliferative effect of heparin, the data does not exist as to whether also held when bound to these substances.
b. b. コルヒチンコルヒチンは、自然に見出されるアルカロイドで、急性通風性関節炎の治療的管理に使用する。 Colchicine Colchicine is a alkaloid found naturally use in therapeutic management of acute gouty arthritis. コルヒチンは、有糸分裂紡錘体線維形成を妨げ、分裂中期で細胞分裂を抑止することによって、in vitroおよびin vivoで植物および動物の細胞分割を阻止する。 Colchicine may prevent mitotic spindle fiber formation, by arresting cell division in metaphase, inhibit cell division in plants and animals in vitro and in vivo. このコルヒチンの作用は、ビンカアルカロイド、ビンクリスチン、ビンブラスチンの作用と同様のものである。 Action of the colchicine are those vinca alkaloids, vincristine, similar to the action of vinblastine. アテローム硬化性腸骨動脈を持つウサギに毎日コルヒチンを投与したところ、バルーン損傷後4週に血管造影に観察された再狭窄の程度が減少したことが最近報告された。 It was administered colchicine daily in rabbits with atherosclerotic iliac arteries, that the degree of restenosis was observed in angiography to 4 weeks after balloon injury has been reduced has recently been reported. Currierら、Circulation、 80 、11〜66(1989)。 Currier et al., Circulation, 80, 11~66 (1989 ).
しかし、最近の臨床研究では、1mg/日のコルヒチンでは、バルーン血管形成術を受けた患者の再狭窄の発生を減少させることはできなかった。 However, recent clinical studies, the colchicine 1mg / day, it was not possible to reduce the incidence of restenosis in patients undergoing balloon angioplasty. C. C. Grinesら、Circulation、 84 :II−365(1991)。 Grines et al., Circulation, 84: II-365 (1991). 毒性による制限のために、患者は1mg/日を超える投与量を許容することができないが、この投与量によって生じるヒトの血中コルヒチン濃度はウサギにおける研究の場合よりも10倍から20倍低いことが見積もられている。 For limited by toxicity, the patient is unable to tolerate doses of greater than 1mg / day, it 20 times lower to 10 times than blood colchicine concentration of human caused by this dose of study in rabbits it is estimated.
c. c. 他の薬品動物モデルで用いられ、筋肉内膜の肥厚化を減少させた他の薬品は、以下の通りである:(1)アンギオテンシン変換酵素(ACE)抑制因子(J.Powellら、Science、 245 :186〜188(1989);(2)Angiopeptin(C.Lunderganら、Am.J.Cardiol.、 17 (Suppl.B):132B〜136B(1991));Cyclosporin A(L.Jonassonら、Proc.Natl.Acad.Sci.、 85 :2303〜06(1988));(4)ヤギ抗ウサギ血小板由来成長因子抗体(G.Fernsら、Science、 253 :1129から1132(1991));(5)Terbinafine(G.Nemecek、J.Phar Used in other chemicals animal models, other chemicals with reduced thickening intramuscular film are as follows: (1) an angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor (J.Powell et al, Science, 245 : 186~188 (1989); (2 ) Angiopeptin (. C.Lundergan al, Am.J.Cardiol, 17 (Suppl.B): 132B~136B (1991)); Cyclosporin A (L.Jonasson et, Proc. Natl.Acad.Sci, 85:. 2303~06 (1988 )); (4) goat anti-rabbit platelet-derived growth factor antibody (G.Ferns et al, Science, 253: 1129 from 1132 (1991)); (5 ) terbinafine (G.Nemecek, J.Phar acol.Exp.Thera.、 248 :1167〜1174(1989));(6)Trapidil(M.Liuら、Circulation、 81 :1089〜1093(1990);および、(7)インターフェロン−ガンマ(G.Hanssonら、Circulation、 84 :1266〜72(1991))。 . acol.Exp.Thera, 248: 1167~1174 (1989 )); (6) Trapidil (M.Liu et al, Circulation, 81: 1089~1093 (1990 ); and, (7) interferon - gamma (G.Hansson et al., Circulation, 84: 1266~72 (1991 )).
血管形成術後の再狭窄を治療するための経口投与など全身への薬品供給の使用は、一定間隔での周期的投与を必要とし、その結果、疾患部位における治療薬濃度の周期的な変動が生じる。 Use of the drug supply to the systemic such as oral administration for the treatment of restenosis after angioplasty requires periodic administration at fixed intervals, so that the periodic fluctuations of the therapeutic agent concentration at the disease site occur. さらに、患者が薬物の全身的投与を受けなければならない20〜30日の期間を過ぎると、通常は摂取された薬物の99%以上が、薬物によって肝臓または腎臓で処理される。 Further, after the period of 20 to 30 days the patient must receive systemic administration of the drug, usually more than 99% of the ingested drug is processed in the liver or kidney by the drug. これは、重大な副作用の可能性を表している。 This represents the possibility of serious side effects.
2. 2. 慢性関節リウマチ慢性関節リウマチは、関節の慢性的滑膜炎によって特徴付けられる慢性病である。 Rheumatoid arthritis Rheumatoid arthritis is a chronic disease characterized by chronic synovitis of the joints. 慢性関節リウマチ炎を治癒する方法は現在は存在しないが、治療として認められているものの一つは、冒された関節内の、炎症を起こした柔組織の除去を伴う滑膜切除である。 How to cure rheumatoid arthritis inflammation is not currently exist, one of which is recognized as treatment in affected joints are synovial resection with removal of soft tissue inflamed. N. N. Gschwend、 Textbook of Rheumatology 、(eds.W.N.Kellyら)、W. Gschwend, Textbook of Rheumatology, (eds.W.N.Kelly et al.), W. B. B. Saunders、pp. Saunders, pp. 1934〜1961(1989)。 1934-1961 (1989). 滑膜切除は、外科的、化学的、放射線薬学的に達成することができる。 Synovectomy is surgical, chemical, radiation pharmaceutically can Accomplish. 外科的滑膜切除は、痛みに対する待期的効果を備えることが示された。 Surgical synovectomy has been shown to comprise a palliative effect on pain. しかし、ほとんどの症例で、手術後数年以内に滑膜炎の再発が起きている。 However, in most cases, recurrence of synovitis is happening within a few years after surgery. さらに、外科的滑膜切除は、各関節について一回しか実施することができず、比較的小さい関節では実施が困難である。 Moreover, surgical synovectomy can not be performed only once for each joint, it is difficult to implement a relatively small joints. 化学的滑膜切除は、外科的滑膜切除に代わる効果的方法であることが示されてきたが、軟骨と骨に現在使用できる薬品の毒性によってその使用が限定されている。 Chemical synovectomy is to be effective alternative to surgical synovectomy has been shown, its use by the toxicity of the chemicals currently available in the cartilage and bone are limited.
化学的滑膜切除に代わる方法としての放射性同位元素による滑膜切除は、滑膜の増殖を抑制するようにみえる。 Synovectomy with radioactive isotopes as an alternative to chemical synovectomy, appears to inhibit the proliferation of synovial. しかし、知られている限りでは、現在用いられている供給システムが、冒された関節の固定化の延長を必要とすることと、リンパ節、脾臓、肝臓への放射性同位元素の全身的照射の許容値を低減するために、短寿命で市販が困難な同位元素の使用が必要であるため、放射性同位元素による滑膜切除の使用は限定されている。 However, as far as is known, supply system currently used, and the need for prolonged immobilization of the affected joint, lymph nodes, spleen, systemic irradiation of radioactive isotopes to the liver to reduce the tolerance, since commercially available in a short lifetime requires the use of hard isotopes, use of synovectomy radioisotope is limited. 滑膜切除部位からの放射性同位元素の漏出は、慢性関節リウマチの初期治療のためのこの方法の開発上、第一に考慮すべき点である。 Leakage of radioactive isotopes from synovectomy site, on the development of this method for the early treatment of rheumatoid arthritis, a point to consider first.
3. 3. 卵巣癌卵巣癌は、女性の癌による死亡の主因の第4位である。 Ovarian cancer Ovarian cancer is the fourth largest of the leading cause of cancer deaths in women. 上皮癌は、卵巣の悪性疾患のおよそ80%から90%を占める。 Epithelial cancer, accounting for 90% from approximately 80% of malignant disease of the ovary. 上皮癌は最初は表面を伝わって、あるいはリンパ性に広がって身体全体に広がる。 Epithelial cancer is initially spread throughout the body and spread to be transmitted to the surface, or lymphatic. 卵巣外に広がった最も一般的な型は、原発腫瘍の表面から広がった細胞の経腹膜性散在である。 The most common type of spread outside the ovaries are through the peritoneum of scattered cells spread from the surface of the primary tumor.
卵巣癌の主要な治療としては、通常は疾患初期に癌細胞が腹膜腔に入り、外科的に除去することができないため、完治はまれである。 The main treatment of ovarian cancer, usually because the disease early cancer cells to enter the peritoneal cavity, can not be surgically removed, complete recovery is rare. 外部ビーム放射線治療も、手術の前後にしばしば用いられるが、一回の照射値は腹部器官(肝臓、腎臓、胃、腸)の照射許容限界値に制限される。 External beam radiation therapy may, but are often used before and after the surgery, irradiation value of one is limited abdominal organs (liver, kidney, stomach, intestine) to irradiation tolerance limit. 腹膜腔に照射する放射性のコロイド状金またはリンの腹腔内点滴注入が、過去には使用されていた。 Intraperitoneal instillation of radioactive colloidal gold or phosphorus to irradiate the peritoneal cavity has been used in the past. しかし、放射線の配分が不均一で小腸での合併症が起こるため、その使用は減少している。 However, since the distribution of radiation complications in the small intestine occurs in heterogeneous, their use has declined. 単クローン抗体が、腹腔内に供給された放射性同位元素のための賦形剤として、最近試験が行われている。 Monoclonal antibodies, as excipients for the radioisotope supplied into the abdominal cavity, recently tested is performed. 現在までに卵巣癌の治療に認可された単クローン抗体共役は存在しない。 Monoclonal antibody conjugate that has been approved for the treatment of ovarian cancer does not exist to date.
化学療法は、進行した卵巣癌患者の最も一般的な治療形式である。 Chemotherapy is the most common treatment forms of ovarian cancer patients with advanced. 現在卵巣癌に対して使用されている薬物は、余命を数年延ばすことがある。 Drugs that are currently used for ovarian cancer, it is possible to extend the number of years the life expectancy. しかし、それらは推奨全身投与量では、顕著な副作用を示す。 However, they are in the recommended systemic dose, show significant side effects.
4. 4. 乾癬乾癬は、皮膚クラチノサイトの制御不能な成長に発展し、炎症と潰瘍を形成する一般的な慢性皮膚疾患である。 Psoriasis Psoriasis is developed into uncontrolled growth of skin class Chino site, a common chronic skin disease that forms the inflammation and ulceration. 乾癬の包括的な治療法は現在まで存在しない。 Comprehensive treatment of psoriasis does not exist up to now.
現在の乾癬の治療には、全身的なものと局所的なものの両方がある。 The current treatment of psoriasis include both systemic ones and local ones. 両方の型の治療ともに効果的であるが、それらは重大な副作用を起こすことがある。 Is effective in treating both of both types, they may cause serious side effects. 乾癬の全身的治療には、主に、コルチコステロイドとメトトレキセートのような細胞毒化合物の投与が含まれる。 Systemic treatment of psoriasis, mainly include administration of cytotoxic compounds such as corticosteroids and methotrexate. 局所的治療には、抗菌性あるいは抗真菌性整剤、木タール、太陽光への暴露あるいは紫外線を用いた光線療法、あるいは、局所的ステロイドの適用が含まれる。 The topical treatment, antimicrobial or Koshinkinsei Seizai, phototherapy using wood tar, exposure or ultraviolet to sunlight, or includes the application of topical steroids. 局所的コルチコステロイドは、他のどのような理学的治療法よりも乾癬に多く用いられている。 Topical corticosteroids are used in many psoriasis than any other kind of physical therapy. しかし、通常の局所的治療は、簡単に擦りとられたり、洗い流されてしまう欠点があり、長期の有効性が損なわれる。 However, usually topical treatment of, or be rubbed off in simple, resulting in washed out drawbacks, long efficacy of impaired. さらに、コルチコステロイドの局所的使用は末梢血管への浸透と、そこからの全身循環への浸透によって、有害な全身性蓄積の原因となる傾向があり、その使用が限定される。 Furthermore, topical use of corticosteroids and penetration into a peripheral blood vessel, by penetration into the systemic circulation from there, tend to cause adverse systemic accumulation, its use is limited.
深刻な副作用を示すことなく、疾患部位へ治療薬をより高い濃度で長く保持することを可能にするような薬物療法の投与法は、上記の状態の治療に有効であることが明らかになるであろう。 Without showing severe side effects, administration of medication, such as that can be retained longer at higher concentrations of therapeutic agents to the disease site, by reveals effective in the treatment of the above conditions It will allo.
最近の研究努力は、標的特異的治療薬または診断薬の開発において、例えばレセプターリガンド、あるいは抗原抗体相互作用などの特異的生物学的相互作用の利用に集中してきた。 Recent research efforts in the development of target-specific therapeutic or diagnostic agents has focused example receptor ligand, or the use of specific biological interactions such as antigen-antibody interaction. 他の有望な研究分野には、標的特異的細胞、あるいは適切な診断薬、治療薬を含む小胞(例えばリポソーム)が含まれる。 Other promising research areas, target specific cells or appropriate diagnostic agents, vesicles such as liposomes containing the therapeutic agent include. 特に単クローン抗体は、これらの細胞または小胞に標的特異性を提供するために用いられてきた。 Especially monoclonal antibodies have been used to provide target specificity to these cells or vesicles. これは比較的新しい技術であるため、このように標的を定めた薬物治療が、真に効果的で信頼できるというわけではない。 Since this is a relatively new technology, thus drug therapy targeted, does not mean that truly effective and reliable.
国際出願番号PCT/US89/00087では、各種の化合物、組成、その調整方法、および細胞形態あるいは生理的機能に対して感知しうる損傷作用を生み出すことのない、細胞あるいはウイルスのようなバイオ粒子の表面膜へのバイオ作用性物質の結合の使用が記述されている。 In International Application No. PCT / US89 / 00087, various compounds, compositions, the adjustment method, and not to produce a damaging effect appreciable relative cell morphology or physiological function, bio particles such as cells or viruses use of binding bio active substance to the surface film are described. 化合物は、一般式R−B−R 1をもち、Bは例えば治療薬あるいは診断薬などのバイオ作用性物質を表し、RおよびR 1の少なくとも一方は、化合物にある程度の脂肪親和性を提供してバイオ粒子の表面膜との安定した結合を可能にするように選択された炭化水素置換基である。 Compound has a general formula R-B-R 1, B represents a bio-active substance such as, for example, therapeutic or diagnostic agent, at least one of R and R 1, to provide a degree of lipophilic compound it is selected hydrocarbon substituents to allow stable binding to the surface membrane of bio-particles Te. ここで述べた化合物を含む組成は、化合物とバイオ粒子の外側表面膜との間の安定した結合のための適切な結合手段によって構成される。 Composition comprising a compound described herein is constituted by a suitable coupling means for the stable connection between the outer surface layer of the compound and bio particles. これらの組成は、あらかじめ決定した部位に対する、本来のあるいは獲得した親和性を備える選択したバイオ粒子に化合物を安定に結合させることによって、あらかじめ決定された部位特異的作用をin vivoで発揮するためと、in vivoでバイオ粒子を導入することによって、あらかじめ決定した部位にバイオ粒子がバイオ作用性物質を運搬してその目的の作用を生むようにするために利用する。 These compositions, for sites previously determined, by stably binding the compound to the selected bioparticle having a natural or acquired affinity, and to exert a site-specific action that was previously determined in vivo, , by introducing bio particles in vivo, Bio particles at a site previously determined to use in order to be transported bio active substance produces the effect that purpose.
【発明の要約】 SUMMARY OF THE INVENTION
本発明の一つの側面に従って、例えば細胞あるいはウイルスなど脂質を含むバイオ粒子に、治療上有効な物質を結合させる能力を備える化合物が提供される。 According to one aspect of the present invention, for example, bio-particles comprising a lipid, such as cells or viruses, compounds having the ability to bind a therapeutically effective substance. 本発明の化合物は、化合物を十分に非極性にすることによって、脂質を含む生体適合粒子の脂質成分にin vivoあるいはin vitroのどちらか一方で安定して結合するように選ばれた、少なくとも1個の炭化水素置換基に、結合成分によって安定に結合している治療上有効な物質で構成されるバイオ作用性成分を含む。 The compounds of the present invention, by sufficiently non-polar compounds, was chosen to bind stably in either the in vivo or in vitro the lipid component of biocompatible particles comprising a lipid, at least one the number of hydrocarbon substituents, including bio-acting component comprised of a therapeutically effective substance bound stably by the binding component. 本化合物は、治療薬と結合成分の間を分離する、治療作用を媒介するスペーサ成分を任意に含む。 The compounds, separating between the coupling component with a therapeutic agent, optionally containing a spacer component that mediates a therapeutic effect.
さらに本発明の化合物は、変化するが予測可能であるような、バイオ膜の脂質成分との結合の安定性を備えることによって特徴付けられる。 Furthermore, the compounds of the present invention, varying but as predictable, characterized by providing a stable bond with the lipid component of bio-membranes. 本化合物は少なくとも90%の表面膜保持係数(MRC)と、少なくとも30%の膜結合安定性を備えるのに十分なだけ非極性である。 The compounds are at least 90% of the surface membrane retention coefficient (MRC), a non-polar enough to comprise at least 30% of the membrane binding stability. さらに本発明の化合物は、直接投与あるいは担体によって選択した部位に治療薬を一度供給すれば、当分の間そこにとどまり、その意図した効果を生み出すのに十分な分量がとどまるように用いるうえで十分に安定である必要がある。 Furthermore, the compounds of the present invention, Once supply a therapeutic agent to the site selected by direct administration or carrier, remains there for the time being, sufficient in terms of use to remain sufficient quantity to produce its intended effect there is a need to be stable. 膜保持係数および膜結合安定性を決定する方法については以下に記述する。 Described below for a method of determining the membrane retention coefficient and membrane binding stability.
本発明に従って上述の化合物は、治療薬の選択的な供給と、選択した部位へのその保持のために使用する。 The above-mentioned compounds in accordance with the present invention, the selective supply of the therapeutic agent, used for its retention at the site selected. 本発明の好ましい側面に従って、治療薬は、細胞増殖を伴う疾患あるいは他の病的状態の治療に有効な抗増殖作用を備える。 According to a preferred aspect of the present invention, the therapeutic agent comprises an effective anti-proliferative effect in the treatment of diseases or other pathological conditions involving cell proliferation. 抗増殖薬は、放射線治療物質あるいは化学治療物質によって構成することができる。 Antiproliferative agents may be constituted by a radiation therapy agent or chemotherapeutic agent. 好ましい実施例によれば、本発明は、放射線治療物質がキレート薬および放射性金属で構成されるような化合物を提供する。 According to a preferred embodiment, the present invention is a radiation therapy agent to provide a compound such as composed of chelating agent and a radioactive metal. 他の好ましい実施例では、本発明の化合物は、選択した細胞内機能を妨げることが可能な物質に加えて、ヘパリン、ヒルジンおよびその誘導体のような化学治療物質で構成される。 In another preferred embodiment, the compounds of the present invention, in addition to the substance capable of interfering with selected intracellular functions, heparin, composed of hirudin and chemotherapeutic agents such as derivatives thereof.
本発明の別の側面によって、化学治療物質を本発明の化合物に対して放出可能に抱合させることができる。 By another aspect of the present invention, the chemotherapeutic agent can be releasably conjugated to the compound of the present invention. これらの化学治療物質は、例えば、化合物から放出された場合のみにそのバイオ作用を示すコルヒチン、ビンカアルカロイド、タキソールおよびその誘導体で構成される群から選択することができる。 These chemotherapeutic agents, for example, can be selected colchicine indicating the bio action only when it is released from the compound, vinca alkaloids, taxol and derivatives thereof from the group consisting of. これらの化合物は、以下”チューブリン”過程と呼ぶチューブリン合成重合、脱重合、あるいは、分解および/または機能を妨げる。 These compounds are hereinafter tubulin synthetic polymers referred to as "tubulin" process, depolymerization, or prevents degradation and / or function. 例えば、結合成分に抱合している間は本質的に不活性であるようなコルヒチン類似体が結合した、酸切断コルヒチン誘導体が提供される。 For example, while conjugated to the binding component colchicine analogues such as are essentially inactive bound, acid cleavage colchicine derivative. 本化合物は、選択された部位に供給され、最終的に細胞内に取り込まれる。 This compound is supplied to a selected site and eventually taken into the cell. 化合物の取り込みは、結合成分からコルヒチン成分を切断するpHの低減によって達成する。 Uptake of compounds is accomplished by reducing the pH to cut the colchicine components from the binding component. 遊離したコルヒチン誘導体は、チューブリン過程を妨げるという、意図した生物学的作用を及ぼすことが可能である。 Liberated colchicine derivatives, that interfere with tubulin processes, it is possible to exert the intended biological effect.
本発明のさらに別の側面によって、生物学的媒質と適合しうる本発明の化合物で構成される薬学的製剤が提供される。 According to yet another aspect of the present invention, a pharmaceutical formulation consisting of compounds of the present invention there is provided that can be compatible with the biological medium.
本発明のもう一つの側面によって、疾患あるいは他の病的状態の治療に用いる治療上有効な物質で構成され、さらに任意に診断薬を含む本発明の様々な化合物を使用する方法が提供される。 By another aspect of the present invention, consists of a therapeutically active substances for use in the treatment of diseases or other pathological conditions, methods of use are provided with various compounds of the present invention further optionally contain diagnostic .
本発明の化合物は、好ましくは疾患の部位に保持するためにin vivo供給で直接投与する。 The compounds of the present invention is preferably administered directly in vivo, provided to hold the site of disease. 別の方法では、化合物を疾患部位に供給する担体粒子に本化合物を結合することができる。 Alternatively, it is possible to combine the compounds of the compound to the carrier particles supplied to the disease site. 直接in vivo供給は、血管形成術後の再狭窄、慢性関接リウマチ、卵巣癌、乾癬のような状態の治療に特に好ましく、以下にさらに詳細に記述する。 Direct in vivo supply, particularly preferably restenosis after angioplasty, chronic function against arthritis, ovarian cancer, for the treatment of conditions such as psoriasis, described in further detail below.
本発明は、疾患部位へ治療薬を供給するために現在利用できる化合物および方法に比べて、数多くの明白な利点を備えている。 The present invention, as compared with the current compounds and methods which can be utilized to provide a therapeutic agent to a disease site, and a number of obvious advantages. 特に本発明の化合物は、身体の選択した部位に対し、その部位の細胞構造と安定して結合することによって供給と保持を行うことができる。 In particular, the compounds of the present invention, for the selected site of the body, can be held and supplied by binding stably and cell structures at that site. 現存する供給法は、全身性の副作用なしに疾患部位に十分な投与量を供給すること、あるいは治療物質を疾患部位に当分の間保持して目的の治療効果を生じるのに十分な長さの保持を行うことが不可能である。 Existing feeding method which is possible to supply a sufficient dose without systemic side effects disease site, or treatment material was held for the time being the disease site purpose therapeutic effect sufficient length of to yield it is impossible to perform the holding. 本発明の化合物は、疾患部位において治療上有効な投与量を達成することができる。 The compounds of the invention can achieve therapeutically effective dose in the disease site. 例えば、放射性同位元素の全身的な分布が非常に有害となる放射線治療の場合、本発明の化合物は、必要な部位への放射線治療物質の安定した結合と保持を可能にし、関節の固定や極度に短寿命の同位元素を必要とすることなく、同位元素の全身的な分布を抑制する。 For example, for systemic distribution radiotherapy to be very harmful radioactive isotopes, compounds of the present invention allows the retention and stable coupling of radiation therapeutic agent to the required site, the joints of the fixed and extreme without requiring isotopes of a short life, it suppresses systemic distribution of isotopes.
本発明の他の顕著な利点は、最初は外部の細胞膜と安定に結合し、その後は通常の膜通過過程を経て細胞内に取り込まれるように化合物を調整できることである。 Another significant advantage of the present invention are initially stably associated with the outside of the cell membrane, and after that they can be adjusted compounds as incorporated into cells via conventional transmembrane processes. この特徴は、放出可能に抱合した治療物質で構成されるように本発明の化合物を調整できることとともに、選択した細胞内への潜在的に毒性のある物質の供給を可能にし、そこで活性化してその治療効果をそれらの細胞だけに及ぼし、身体内の他の細胞には及ぼさないようにすることが可能である。 This feature, together with the ability to adjust the compounds of the present invention to consist of releasably conjugated therapeutic agents, allows for potentially supply toxic substances to within the selected cells where activated its the therapeutic effect had only those cells, the other cells in the body it is possible to prevent adversely. この方法には、アンチセンスRNAあるいはDNAの供給をも含めることができる。 The method can also include the supply of antisense RNA or DNA.
本発明のさらに別の利点は、ここに記述した化合物の、細胞および他の生体適合粒子への結合が、本質的に脂質親和力によって生じることである。 Yet another advantage of the present invention, the compounds described herein, binding to cells and other biocompatible particles is that caused by the essentially lipid affinity. このことは、細胞膜が個々の蛋白質部分に存在し、さらに大きな脂質部分には存在しないため、脂質との結合が細胞膜の重要な機能領域に干渉する機会を減らすことから、特に細胞の場合に重要である。 This membrane is present in the individual protein portion, to further not present in large lipid moiety, since the binding of the lipid reduces the interfere opportunity important functional areas of the cell membrane, particularly important in the case of the cell it is. 細胞にバイオ作用性物質を供給するために、膜蛋白質と細胞レセプタへの結合に頼る従来の方法では、しばしば機能的な能力が減少してしまう。 In order to supply the biological active substance to cells, in the conventional methods that rely on binding to membrane proteins and cell receptors often functional capacity is reduced.
細胞の脂質領域との結合によって実現する、付随的な明白な利点が存在する。 Realized by binding to cellular lipid regions, ancillary obvious advantage exists. 脂質領域は細胞表面領域の大部分によって構成されるため、数多くの脂質結合化合物を配置することが可能であり、その結果、高い濃度の治療薬を形質膜内に入れることができる。 Since lipid region is constituted by a majority of cell surface area, it is possible to arrange a number of lipid binding compounds, as a result, it is possible to put a high concentration of the therapeutic agent into the plasma membrane. それに加えて、本発明の化合物はその脂肪親和性の特徴によって膜脂質内に安定して結合するので、標準的な生理的塩に対して比較的溶解しにくい。 In addition, the compounds of the present invention because it binds stably to the membrane lipids by their lipophilic characteristics, relatively difficult to dissolve in standard physiological salt. したがって、これらの化合物が一度膜に結合すると、それらはそこに効果的に閉じ込められ、容易に分離することができなくなる。 Accordingly, when these compounds bind once film, they there effectively trapped, can not be easily separated. その結果、細胞からの漏れが最小限になり、それによって有害な全身性の作用を最小にする。 As a result, leakage from the cells is minimized, thereby minimizing the effects of adverse systemic.
【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
ここに以下の図面を参照する。 With reference to the following drawings here.
図1は、局所的に注入した物質Pの血管反応と、本発明の物質P−脂肪親和性シアニン抱合体とを比較した試験結果を示す図である。 Figure 1 is a diagram illustrating a vascular reaction of locally injected substance P, and the test results obtained by comparing the substance P- lipophilic cyanine conjugate of the invention. 上方のグラフは物質Pに関するものであり、下方のグラフは抱合体に関するものである。 Upper graph relates substance P, downward graph relates conjugate.
図2は、物質Pと本発明の物質P−脂肪親和性シアニン抱合体のそれぞれの投与量−反応関係を示す図であり、それぞれ物質P拮抗薬[D−Pro 2 、D−Trp 7,9 ]−SPの非存在下および存在下を示す。 2, each dose of substance P- lipophilic cyanine conjugates of substance P and the present invention - a diagram showing the response relationship, each substance P antagonist [D-Pro 2, D- Trp 7,9 ] shows the absence and presence of -SP.
図3は、蛍光/周波数ヒストグラムの系列を示す図で、点は個々の細胞を表す;x軸の原点からの点の距離の増大は赤の蛍光強度(LFL2信号)の増大を表し、y軸の原点からの点の距離の増大は緑の蛍光強度(LFL1信号)の増大を表す。 Figure 3 is a diagram showing a sequence of fluorescence / frequency histograms, dot represents an individual cell; increasing distance of the points from the origin of the x-axis represents the increase in red fluorescence intensity (LFL2 signal), y-axis increasing distance of the points from the origin of represents an increase in the green fluorescence intensity (LFL1 signal).
図4は、本発明の物質P脂肪親和性シアニン色素抱合体の、時間の関数として求めたin vivoでの赤血球への結合の安定性を表すグラフである。 Figure 4 is a substance P lipophilic cyanine dye conjugate of the invention, is a graph representing the stability of binding to red blood cells in vivo, which was determined as a function of time.
図5は、放射性ヨウ素( 125 I)と結合した脂肪親和性シアニンの、異なる4種類の人口表面、すなわちsilasticゴム(SIL)、ポリカーボネート(PC)、ポリ塩化ビニル(PVC)、ポリエチレン(PE)への保持の程度を表す棒グラフである。 Figure 5 is a lipophilic cyanine bound to radioactive iodine (125 I), four different populations surface, i.e. silastic rubber (SIL), polycarbonate (PC), polyvinyl chloride (PVC), the polyethylene (PE) is a bar graph representing the degree of retention. 点で描いた棒は、最初に各表面に結合した放射性ヨウ素( 125 I)と結合した脂肪親和性シアニンの分量を表す;黒い棒は6時間の連続的血液潅流後にとどまった分量を表す。 Rod drawn at point initially represents the amount of lipophilic cyanine bound to radioactive iodine bonded to each surface (125 I); the black bars represent the amount that remained after continuous blood perfusion 6 hours. 対をなす棒に付随する数字は、結合した化合物の最初の分量の保持率である。 The numbers associated with the rod of the pair is the retention of the initial amount of bound compound.
図6は、抗凝固性脂肪親和性シアニン抱合体で標識した担体細胞の、基準濃度のトロンビンによって生成したフィブリンのin vitroでの発生を抑制する能力を試験した実験のデータを示す図である。 Figure 6 is a diagram illustrating an anti-solidification resistance lipophilic cyanine conjugate of labeled carrier cells, the data of experiments tested the ability to inhibit the generation of an in vitro fibrin produced by thrombin reference density. 非抱合の抗凝固剤の濃度反応を比較のために提供する。 Providing density response of unconjugated anti-coagulant for comparison. トロンビン反応の抑制率(y軸)を、試験した化合物のモル濃度(下方のx軸;対数目盛)、試験標本当たりの担体細胞の数(上方のx軸;対数目盛)の関数として記録した。 Was recorded as a function of the percent inhibition of thrombin reaction (y-axis), the molar concentration of the compounds tested (x-axis of the lower; log scale), the number of carrier cells per test sample (logarithmic scale above the x-axis).
【好ましい実施例の説明】 [Description of the preferred embodiment]
I. I. 定義以下に示す用語および表現を、本発明の記述の引例として、以下のように定義する: Defines the terms and expressions below, by reference to the description of the present invention, is defined as follows:
1. 1. バイオ作用性成分−バイオ作用性成分とバイオ作用性物質という用語は、ここではヒトまたは動物の治療、診断、予防、あるいは他の治療に有効な広範囲の様々な物質を指すために用いる。 Bio-acting component - the term bio-acting component and bio-acting agent, wherein the treatment of the human or animal, diagnostic, prophylactic, or used to point to a valid wide variety of materials to other treatments. これらの用語には、生物学的作用を及ぼすことができるあらゆる物質が含まれる。 These terms include any substance capable of exerting a biological effect.
2. 2. 生体適合粒子−ここで使用する”生体適合粒子”という用語は、in vivoでの投与で重大な副作用を起こさないものである限り、例えばin vivoおよびin vitroでの細胞など生存可能な実体に加えて、リポソーム、リポ蛋白などの生存不可能な実体の両方を含む。 Biocompatible particles - the term as used herein "biocompatible particles" is as long as it does not cause serious side effects in administration in in vivo, in addition to the example in vivo and viable entities such as cells in vitro Te, including liposomes, both of non-viable entities such as lipoproteins.
”生理的機能を備える生存可能な生体適合粒子”という表現は、ここではあらゆる生存可能な細胞または膜を含むウイルスを指す。 The expression "viable biocompatible particles having physiological function" is used herein refers to a virus containing any viable cell or membrane. さらに、ここで使用するように、”細胞”という用語には、白血球、各種の腫瘍細胞などの真核細胞と、細菌などの原核細胞、さらに、例えば中国ハムスター卵巣細胞、イーストなどの培養哺乳類細胞、および赤血球、赤血球ゴーストや血小板などの非核細胞が含まれる。 Further, As used herein, the term "cell", leukocytes, and eukaryotic cells such as various tumor cells, prokaryotic cells such as bacteria, further, for example Chinese hamster ovary cells, cultured mammalian cells, such as yeast , and red blood cells, include non-nuclear cells, such as erythrocyte ghosts and platelets. 以下の本発明の詳細な説明は、生体の細胞を特に参照して記載する。 Following detailed description of the present invention will be described with reference to biological cells in particular. しかし、細胞に関して記述する内容は、一般的に膜を含むウイルスに対しても同様に適用されることを理解する必要がある。 However, the contents described with respect to cells is generally necessary to understand that it is equally applicable to viruses containing film. さらに、本発明に従う治療薬の部位選択的供給を実施するうえで、目的の供給部位に対する自然な、あるいは獲得した親和性を備えていれば、生存不可能な実体を生存可能な実体に適切に置き換えることができることを理解する必要がある。 Furthermore, in carrying out the site-selective delivery of therapeutic agents according to the invention, natural, or if it has to acquire affinity, suitably a non-viable entities viable entities for supplying the target site there is a need to understand that you can be replaced. 例えば、リポソームは、肝臓または脾臓に供給するための治療有効物質の担体として使用することができる。 For example, liposomes can be used as carriers for therapeutically active substances to be supplied to the liver or spleen.
3. 3. 診断薬−in vivoまたはin vitroの試験による生理的条件あるいは状態の検出、測定、または分析を促進する能力を備える化合物あるいは物質を指す。 Detection of physiological conditions or conditions by test diagnostics -in vivo or in vitro, refers to the measurement, or a compound or substance comprising the capacity to facilitate analysis. 本発明の化合物は、身体の外側から検出可能な、あるいはin vitroでの分析のために入手した体液または生検内で検出可能なリポーター分子として、二重の機能を果たすことができる。 The compounds of the present invention, a detectable reporter molecule in a body fluid or biopsy obtained for analysis of a detectable, or in vitro from outside the body, can serve a dual function.
4. 4. 発色団−少なくとも一つの選択した光の波長の吸収によって、視覚的、または装置を用いることによって検出することが可能な物質を指す。 Chromophore - it refers at least by one of the absorption wavelength of the selected light, a material that can be detected by using visual, or device.
5. 5. 治療上有効な物質−生体の異常あるいは病的な条件の予防、軽減、治療または治癒の能力を備える物質を指す。 Therapeutically active substances - refers prevention of abnormal or pathological conditions of the living body, reduces, the material comprising the ability of treatment or cure. これらには、生理的身体機能を維持、増大、低減、制限、または破壊する能力を備える物質と同様に、生体の微生物または抗原を抑制、殺傷、改良あるいは保持することによって生体を保護する物質が含まれる。 These include maintaining the physiological body functions, increase, decrease, limit, or similar to the material comprising the ability to disrupt, inhibit microbial or antigen vivo killing substances to protect the biological by improving or retaining included. 治療上有効な物質には、治療上の効用を備える薬剤あるいは薬物を含む。 The therapeutically active substances, including drugs or drug having utility in the treatment.
6. 6. 化学治療物質−その治療効果が物質の化学的特徴に起因するような治療上有効な物質を指す。 Chemotherapeutic agents - their therapeutic effect refers to therapeutically active substances, such as due to chemical characteristics of the material. 化学治療物質には、例えば、非放射性薬剤を含むことができる。 The chemotherapeutic agent, for example, may include non-radioactive agent. それらには小さな分子と、脂質、炭水化物、蛋白質あるいはDNAまたはRNAなどの核酸のようなさらに複雑な分子を含めることができる。 The they may include a small molecule, a lipid, a carbohydrate, more complex molecules such as nucleic acids, such as protein or DNA or RNA.
7. 7. 放射線治療物質−その治療効果が放射性に起因するような治療上有効な物質を指す。 Radiotherapeutic agents - their therapeutic effect refers to therapeutically active substances such as those caused by radioactive. 適切な放射線治療物質は、放射性同位元素で構成することができる。 Suitable radiotherapeutic substances may be configured with a radioactive isotope. 好ましくは、バイオ作用性成分は、 186 Re、 90 Y、 67 Cu、 177 Lu、あるいは153 Smなどの各種の放射性治療核種との錯体をなすキレート薬で構成する。 Preferably, the bio-acting component comprises at 186 Re, 90 Y, 67 Cu , 177 Lu, or chelating agents that form various complexes with radiotherapy nuclides such as 153 Sm.
8. 8. 抗増殖薬−細胞の増殖を阻止、減少、または防止する能力を備える治療上有効な物質を指す。 Antiproliferative agents - inhibiting the growth of cells refers to therapeutically active substances with the ability to reduce, or prevent.
II. II. 化合物の説明本発明の化合物は、治療上有効な物質を部位選択的に供給することが求められる様々な薬理療法に有効である。 Compounds of The present invention compounds are effective in various pharmacological therapy it is desired to provide a therapeutically effective substance regioselectively. 本発明の好ましい実施例によれば、治療上有効な物質は放射線治療物質、あるいは化学治療物質の抗増殖薬である。 According to a preferred embodiment of the present invention, the therapeutically effective substance is an antiproliferative agent radiotherapy agent or chemotherapeutic agent. 別の実施例では、本発明の化合物は、本発明の化合物のin vitroまたはin vivoでの追跡、および/または検出を可能にする発色団または放射性核種のような診断薬で構成することができる。 In another embodiment, the compounds of the present invention may be composed of a diagnostic agent, such as a chromophore or radionuclide to permit tracking, and / or detected in vitro or in vivo of the compounds of the present invention . したがって、本発明の化合物は、例えばバイオ作用性成分として治療上有効な物質、および結合成分としての検出可能な発色団で構成することができる。 Accordingly, the compounds of the present invention may be composed of, for example, detectable chromophore as therapeutically active substances and binding component, as bio-acting components.
本発明の化合物を構成する診断薬は、技術に精通した者に周知である様々な分析法によって検出することが可能な異なる種類の中から選択することができる。 Diagnostic agents constituting the compounds of the present invention may be selected from among different types that can be detected by various analytical techniques well known to those skilled in the art. 検出可能な蛍光化合物は、好ましくは、例えばオキシカルボシアニン、インドカルボシアニン、チオカルボシアニン、あるいはアクリジン色素とその誘導体を含むシアニン色素およびその誘導体である。 Detectable fluorescent compounds are preferably, for example, cyanine dyes and derivatives thereof including oxy carbocyanine, indocarbocyanine, thio carbocyanine, or acridine dyes and derivatives thereof. 他の有効な蛍光化合物には、例えばスチリルピリジン、キサンテン、フェノキサジン、フェノチアジン、あるいはジフェニルヘキサトリエン色素およびその誘導体が含まれる。 Other useful fluorescent compounds include, for example, styrylpyridine, xanthene, phenoxazine, phenothiazine or the diphenylhexatriene dyes and derivatives thereof.
有効な診断薬には、ビオチンまたは特異的抗体のような検出を促進するリガンドがさらに含まれる。 The effective diagnostic agents, the ligand to facilitate detection, such as biotin or specific antibodies are further included. 他の有効な診断薬は、金属と錯体をなすキレート化物質であり、これらは直接的あるいは間接的に検出することができる。 Other useful diagnostic agents are chelating substances forming a complex with a metal, it can be directly or indirectly detected. 適切なキレート−金属錯体は、原子番号が21から49の遷移金属系列から選択した同位元素、例えばインジウム111あるいはテクネチウム99mで構成することができる。 Suitable chelating - metal complexes isotope atomic number selected from the transition metal series of 21 to 49, may be formed, for example, indium-111 or technetium-99m. このような錯体は、担体細胞の細胞質膜に対して結合し、身体内への供給後にガンマカメラを用いた画像化を可能にするように放射性にすることができる。 Such complexes may be radioactive, as bound to the cell membrane of carrier cells, to enable imaging using a gamma camera after supply into the body. キレート化物質はさらに、例えば関心部位にある特定の作用を生じることによって間接的に検出可能な金属イオンと錯体を構成することが可能である。 Chelating agent is further capable of configuring the indirectly detectable metal ions and complexes by producing specific effects that, for example, in the site of interest. 例えば常磁性元素の錯体は、近傍の核の緩和時間に影響を与えることができるので、磁気共鳴画像化(MRI)によって検出することができる。 For example complexes of paramagnetic elements, it is possible to affect the relaxation times of neighboring nuclei can be detected by magnetic resonance imaging (MRI). キレート−金属錯体は、原子番号21から29の遷移金属系列、あるいは原子番号59から66のランタニド系列から選択した金属イオンがこうした用途に適している。 Chelate - metal complex is a transition metal series from atomic number 21 29, or by a metal ion selected from lanthanide series from atomic number 59 66 is suitable for such applications.
望ましい場合には、放射性同位元素を含む化合物を本発明の各種の使用例に用いることができる。 If desired, it is possible to use a compound containing a radioactive isotope to various examples of using the present invention. 125 I、 131 I、 14 C、 3 H、 35 S、あるいは75 Seのような放射性同位元素を、バイオ作用性成分、発色団あるいは化合物の炭化水素尾部に存在する、豊富に存在し自然に見出される非放射性形の原子に置き換えることができる。 125 I, 131 I, 14 C , 3 H, 35 S, or radioactive isotopes, such as 75 Se, bio-acting component, present in the hydrocarbon tails of the chromophore or compounds, abundant and found in nature it can be replaced with non-radioactive form atoms. 非ゼロスピン状態(例えば19 F)をもつ同位体を本発明の化合物に導入し、MRI技法によってその存在を検出できるようにすることができる。 Isotope with non-zero spin states (e.g., 19 F) is introduced into the compounds of the present invention, it is possible to be able to detect its presence by MRI techniques.
治療への適用のためには、 186 Re、 90 Y、あるいは67 Cuなどの様々な治療放射性核種と錯体を構成する、上述の種類のキレート薬によってバイオ作用性成分を構成することができる。 For therapeutic applications are, 186 Re, constituting the 90 Y or various therapeutic radionuclide complexes such as 67 Cu,, it is possible to construct a bio-acting components by chelating agents the type described above.
本発明による治療への適用のために、さらに蛋白質、糖蛋白、リポ蛋白、あるいはペプチドを含む蛋白様物質を適切な結合成分を介して、適切な長さの炭化水素尾部に結合することができる。 For therapeutic applications in accordance with the present invention, it is possible to further protein, glycoprotein, a proteinaceous material containing lipoproteins or peptides, through a suitable coupling component, it binds to hydrocarbon tails of appropriate length . 代表的なバイオ作用性蛋白様物質は、イムノゲン、トキシン、ホルモン、酵素、抗原、抗体、および抗体断片である。 Representative bio-acting proteinaceous substances, immunogens, toxins, hormones, enzymes, antigens, antibodies, and antibody fragments. このような治療上有効な蛋白質は、上述した種類の脂肪親和性発色団に有利に抱合体となり、以下に例証する脂質を含む様々なバイオ粒子との変動し予測可能な結合の安定性によって、結果として生じる抱合体が顕著になる。 Such therapeutically effective proteins, advantageously be conjugate to the lipophilic chromophore of the type described above, by the stability of the change and predictable binding with various bio particles containing lipids exemplified below, results conjugate becomes remarkable caused as.
治療への他の適用では、結合する細胞の細胞体内において移動および循環形態の変動を可能にする炭水化物で、バイオ作用性成分が構成される。 In other therapeutic applications, carbohydrate permitting variation of the movement and circulation form in cell bodies of cell binding, constitute bio-acting components. この方法で適用可能な種類の炭水化物の一つにはシアリン酸が含まれる;他の種類としては、グリコサミノグリカンが含まれる。 It contains sialic acid is one of the applicable types of carbohydrates by this method; Other types include glycosaminoglycans. 例えば、シアリン酸を含む構成を赤血球の形質膜に適用し、膜上のシアリン酸の数量を増大させることができる。 For example, a configuration including a sialic acid is applied to the plasma membrane of red blood cells, it is possible to increase the number of sialic acids on the membrane. 荷電した基の数の増大は、肝臓で除去される前の循環する赤血球の寿命を増大させる。 Increase in the number of charged groups increases the lifespan of circulating red blood cells before they are removed by the liver.
バイオ作用性成分は、組織特異的レセプタ、あるいは標的器官内の細胞上のレセプタと結合することが可能なリガンドの形にすることもできる。 Bio-acting ingredient may also be in the form of tissue-specific receptors or capable of binding to cells on receptors in target organs ligand. このようなリガンドを含む化合物は、例えば担体細胞に結合した場合に、特異的な器官の部位への移動を促進する。 Compounds containing such ligands, for example, when bound to the carrier cells, to promote the movement to the site of specific organs.
本発明の化合物は、特に注射、輸液、カテーテル法および局所的適用を含む様々な方法によって、身体内の選択した部位に直接供給することができる。 The compounds of the present invention, particularly for injectable, infusion, by a variety of methods including catheterization and topical application, may be fed directly to the selected site within the body. 例えば自系、同種異系、あるいはzenogeric細胞などの担体生体適合粒子に本発明の化合物を結合させ、バイオ作用性物質の標的を定めた供給を促進させることもできる。 For example autologous, allogeneic, or a compound of the present invention is bound to a carrier biocompatible particles, such as zenogeric cells, it is also possible to promote the supply of targeted bio active substance. 特に限定しない限り、以下に記載する考察は、疾患部位への直接的な供給あるいは担体賦形剤の調整のどちらかによる、生存可能な細胞への本発明の化合物の結合を意味する。 Unless specifically limited, the discussion set forth below, by either adjusting the direct feed or carrier excipient to the disease site, refers to a binding of a compound of the invention to viable cells. 本発明の一つの目的は、治療薬または放射性同位元素を結合することができ、細胞の外側の膜を構成する脂肪二重層の中に溶解することができる化合物を提供することである。 One object of the present invention is capable of binding a therapeutic agent or a radioactive isotope, it is to provide a compound which can be dissolved in fat bilayer that constitutes the outer membrane of a cell. 本発明の化合物を介した治療物質の供給は、疾患部位に直接供給した場合に、これらの物質を疾患の領域の細胞に高い濃度で、他の方法では達成できないような長期間にわたって保持することを可能にする。 Supplying therapeutic substances via the compounds of the present invention, when fed directly to the disease site, these substances in the cell to a high concentration in the region of the disease, can be held for a long period of time which can not be achieved in other ways to enable the. さらに、本発明の化合物を使用することによって、全身的に投与すると毒性をもちうるような治療薬の使用を可能にする。 Furthermore, by using a compound of the present invention, it allows the use of therapeutic agents that may have toxic when administered systemically.
本発明の化合物の細胞上への作用の方法は多様であり、以下の項目に依存する:(1)結合させる細胞の種類;(2)脂肪親和性尾部の性質、長さおよび数量;(3)治療する身体部位;(4)バイオ作用性成分の性質;そして(5)化合物に結合させたバイオ作用性成分がその作用を細胞上に生じる機構。 The method of action of the on cells of the compounds of the present invention are diverse, depending on the following items: (1) type of cell to be bonded; (2) the nature of the lipophilic tail, length and quantity; (3 ) treated body part to; (4) the nature of bio-acting component; and (5) Bio-acting component bound to a compound mechanism produces its effect on the cells. 本発明の化合物は細胞上に沈着し、最初は形質膜の外側の脂質二重層に付着する。 The compounds of the present invention is deposited on the cell initially adhere to the outer lipid bilayer of the plasma membrane. 膜成分は内側に自然に通じているので、これらの化合物も細胞の内側に取り込まれる。 Because membrane components leads naturally to the inside, also these compounds are incorporated into the inside of the cell. これが起こる速度は個々の細胞の種類、その成長状態とその活動あるいは刺激の程度に応じて変化する。 This rate is the type of individual cells that occurs, varies depending on the degree of its growth state and its activity or stimulation.
本発明の化合物に対して抱合している放射線治療物質のような抗増殖薬の一部の種類は、それらが外側の膜あるいは細胞内のどちらに位置していても作用する。 Some types of antiproliferative agents, such as radiation therapy substances conjugated to the compound of the present invention, they act be located either outside of the membrane or the cell. これらの薬剤は核を損傷する放射線を放出し、放射線が十分に透過した場合は、周囲の細胞の成長も同様に抑制する。 These agents emit radiation which damages the nucleus, radiation if it is sufficiently permeable, similarly suppresses growth of surrounding cells. 成長を抑制するために細胞内成分と物理的に相互作用しなければならない薬物は、本発明の化合物が細胞内に取り込まれたのちにはじめて有効となる。 Intracellular components physically must interact drugs to inhibit the growth, the compounds of the present invention is effective only after being incorporated into the cells. コルヒチンのような極度に毒性の強い薬物の場合は、脂肪親和性成分に抱合体にすることができ、不活性形態で外側の膜に結合させ、細胞には毒性をもたない他の作用方法が考案されている。 For super strong toxic drugs such as colchicine, it can be conjugate to the lipophilic component, is coupled to the outer membrane in an inactive form, other action method having no toxicity to cells There has been devised. その後、抱合体が内側に移動するに従って、特別に用意された結合(以下の例で詳細に記述する)が、抱合体からの薬物の放出を可能にし、その抗増殖性作用を及ぼすことを可能にする。 Thereafter, allowing the following conjugate is moved inwardly, is specially prepared linkage (described in greater detail in the following examples), to allow release of the drug from the conjugate, exerts its antiproliferative activity to.
III. III. 一般式本発明の範囲内の化合物は以下の式で与えられる: Compounds of general formula within the scope of the present invention is given by the following equation:
ここでBは治療上有効な物質で構成されるバイオ作用性成分を表し、RおよびR 1は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、あるいはアルアルキル基から独立に選択した置換基を表し、その炭化水素鎖は直線状または分岐状であり、一つまたはそれ以上の非極性官能基によって脱置換あるいは置換され、RおよびR 1の少なくとも一方は炭化水素置換基で構成され、その鎖の長さは、膜結合能力を化合物に提供するのに有効なだけの長さを備え、R 2はスペーサ成分を表し、nは0または1であり、Lは、n=0のときに非芳香族結合成分であるという条件下で、n=0のときにBとRおよびR 1の少なくとも一方との間、またn=1のときにR 2とRおよびR 1の少なくとも一方との間に安定した結合を提供する結合成分を表 Wherein B represents a bio-acting component comprised of a therapeutically effective substance, R and R 1 represents hydrogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, alkaryl, or the selected substituents from aralkyl group independently, the hydrocarbon chain is linear or branched, it is de-substituted or substituted by one or more non-polar functional groups, at least one of R and R 1 consists of a hydrocarbon substituent, the length of the chain has a length of only effective to provide a membrane binding capability to the compound, R 2 represents a spacer component, n is 0 or 1, L is a non-aromatic bond when n = 0 under the condition that a component, stable during at least one of R 2 and R and R 1 and when between at least one of B and R and R 1 when n = 0, also of n = 1 Table binding moieties to provide a bond .
ここで使用する”非極性官能基”という表現は、O−アルキル、S−アルキル、ハロゲン、N(アルキル) 2 、Se−アルキル、NO 2 、CN、CO−アルキル、Si(アルキル) 3 、O−Si(アルキル) 3 、および同様のものを指す。 The expression as used herein "non-polar functional group", O- alkyl, S- alkyl, halogen, N (alkyl) 2, Se- alkyl, NO 2, CN, CO- alkyl, Si (alkyl) 3, O -Si (alkyl) 3, and refer to the like.
結合成分(L)は、飽和あるいは非飽和脂肪族リンカーまたは脂環、芳香族を含む環構造であり、それは単環式、多環式、単素環式、複素環式、溶解あるいは非溶解でありうる。 Binding component (L) is a saturated or non-saturated aliphatic linker or alicyclic, a cyclic structure including aromatic, which monocyclic, polycyclic, homocyclic, heterocyclic, dissolved or in undissolved There can.
好ましくは、結合成分は発色団である。 Preferably, the binding component is a chromophore. 本発明の化合物への発色団の結合は、in vivoでの化合物の追跡を促進する。 Binding chromophore to the compounds of the present invention facilitates tracking of the compounds in the in vivo. この目的に有効な発色団には、シアニン、アクリジン、ピリジン、キノリン、キサンテン、フェノキサジン、フェノチアジン、およびジフェニルヘキサトリエン色素とその誘導体が含まれる。 Valid chromophore for this purpose include cyanine, acridine, pyridine, quinoline, xanthene, phenoxazine, phenothiazine, and diphenylhexatriene dyes and derivatives thereof.
本発明の範囲内の好ましい化合物の種類は、以下の式で与えられる: Class of preferred compounds within the scope of the present invention is given by the following formula:
ここでBはバイオ作用性物質を表し、RおよびR 1は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、あるいはアルアルキル基から独立に選択した置換基を表し、その炭化水素鎖は1個から30個の炭素原子を備え、直線状または分岐状であり、前記置換基は一つまたはそれ以上の非極性官能基によって非置換あるいは置換され、R 2は次の式のスペーサ成分を表す: Wherein B represents a bio-active substance, R and R 1 is hydrogen, alkyl, 30 alkenyl, alkynyl, alkaryl or represents a substituent selected from aralkyl group independently, the hydrocarbon chain from one, comprising a carbon atom, a linear or branched, said substituents being unsubstituted or substituted by one or more non-polar functional group, R 2 represents a spacer component of the following formula:
ここでR 3は脂肪族炭化水素を表し、R 4 、R 5 、R 6およびR 7は脂肪族、脂環式または芳香族炭化水素、複素環式またはCH 2 C(CO 2 H)=CHで構成される基の中から独立に選択し、 Wherein R 3 represents an aliphatic hydrocarbon, R 4, R 5, R 6 and R 7 are aliphatic, cycloaliphatic or aromatic hydrocarbons, heterocyclic or CH 2 C (CO 2 H) = CH independently selected from the group consisting in,
はアミド、チオ尿素、ヒドラゾン、アシルヒドラゾン、ケタール、アセタール、オルトエステル、エステル、無水物、ジスルフィド、尿素、カルバミン酸塩、イミン、アミン、エーテル、炭酸塩、チオエーテル、スルホンアミド、カルボニル、アミジンおよびトリアジン結合で構成される官能結合基から独立に選択したものである; Amide, thiourea, hydrazone, acyl hydrazone, ketal, acetal, orthoester, ester, anhydride, disulfide, urea, carbamate, imine, amine, ether, carbonate, thioether, sulfonamide, carbonyl, amidine and triazine those independently selected from the consisting functional binding group a bond;
は、さらに独立に原子価結合を表すことができ、脂肪族または脂環式炭化水素は1個から12個の直線状炭素原子を備え、芳香族炭化水素は6個から12個の炭素原子を備える;n、p、q、r、sおよびtはそれぞれ0または1である。 It may further independently represent a valence bond, an aliphatic or alicyclic hydrocarbon comprises one to twelve linear carbon atoms, an aromatic hydrocarbon 12 carbon atoms from 6 comprising; n, p, q, r, s and t are each 0 or 1.
XおよびX 1は同一または異なる値をとることができ、O、S、C(CH 32またはSeを表す; X and X 1 may take the same or different values, represent O, S, and C (CH 3) 2 or Se;
Yは、=CR 8 、=CR 8 −CR 8 =CR 8 −、=CR 8 −CR 8 =CR 8 −CR 8 =CR 8 −、あるいは=CR 8 −CR 8 =CR 8 −CR 8 =CR 8 −CR 8 =CR 8 −から選択した結合基を表し、ここでR 8はH、CH 3 、CH 2 CH 3 、CH 2 CH 2 CH 3 、あるいはCH(CH 32から選択する; Y is, = CR 8, = CR 8 -CR 8 = CR 8 -, = CR 8 -CR 8 = CR 8 -CR 8 = CR 8 -, or = CR 8 -CR 8 = CR 8 -CR 8 = CR 8 -CR 8 = CR 8 - represents the selected linking groups from where R 8 is H, CH 3, CH 2 CH 3, CH 2 CH 2 CH 3 or CH (CH 3), is selected from 2;
Zは、H、アルキル、OH、−O−アルキル、COOH、CONH 2 、SO 3 H、SO 2 NH 2 、CONH−アルキル、CON−(アルキル) 2 、NH−アシル、NH−アルキル、N(アルキル) 2 、SH、S−アルキル、NO 2 、ハロゲン、Si(アルキル) 3 、あるいはO−Si(アルキル) 3 、Sn(アルキル) 3 、またはHg−ハロゲン基から選択した置換基を表し、前記Z置換基で構成されるアルキル基は1個から4個の炭素原子を備える;さらに、Aは生物学的に適合しうる陰イオンを表す。 Z is, H, alkyl, OH, -O- alkyl, COOH, CONH 2, SO 3 H, SO 2 NH 2, CONH- alkyl, CON- (alkyl) 2, NH- acyl, NH- alkyl, N (alkyl ) 2, SH, S- alkyl, NO 2, represents halogen, Si (alkyl) 3 or O-Si (alkyl) 3, Sn (alkyl) 3 or Hg- substituents selected from a halogen group, wherein Z alkyl group consisting of substituents comprising from 1 to 4 carbon atoms; and, a represents an anion capable of biologically compatible. 高度に安定な生体膜結合を必要とする適用のためには、式(II)のRおよびR 1の一方が少なくとも12個の炭素原子を備え、RおよびR 1の直線状炭素原子の合計が少なくとも23個になるようにしなければならない。 For highly stable biomembrane applications requiring coupling includes one of at least 12 carbon atoms of R and R 1 of Formula (II), the sum of linear carbon atoms in R and R 1 It must be to at least be 23.
様々なスペーサ成分(R 2 )は、既知の合成方法に従って、シアニン頭部基とバイオ作用性成分の間で、頭部基とバイオ作用性成分のどちらか一方あるいは両方に存在する適切な官能基を介して容易に結合することができる。 Various spacer component (R 2), according to known synthetic methods, among cyanine head group and bio-acting components, appropriate functionalities present on either or both of the head groups and bio-acting component it can be easily coupled through the. このような目的のために、種類の異なる多数の生体機能(ホモ生体機能とヘテロ生体機能)スペーサ試薬が技術文献に報告されてきた。 For this purpose, different number of biological functions (homo biological function and hetero biological function) spacer reagents have been reported in the technical literature. Meth. Meth. Enz. Enz. 91 :580〜609(1983)を参照。 , 91: 580-609 see the (1983). これらのスペーサ成分は反応基の種類、疎水性、親水性、長さ、および反応基を結合している構造が切断可能か、切断不可能かによって異なっている。 These spacers components type of reactive groups, hydrophobicity, hydrophilicity, length and whether the reactive group bonded to that structure cleavable differ depending noncleavable.
上述のように、スペーサ基の官能結合は、アミド(−NHCO−)、チオ尿素(−NHCSNH−)、ヒドラゾン(=NHN−)、アシルヒドラゾン(=NHNCO−)、ケタール(−O−C(アルキル) 2 −O−)、アセタール(−O−CH(アルキル)−O−)、オルトエステル(−C(O−アルキル) 2 −O−)、エステル(−COO−)、無水物(−COOCO−)、ジスルフィド(−S−S−)、尿素(−NHCONH−)、カルバミン酸塩(−NHCO 2 −)、イミン(=N−)、アミン(−NH−)、エーテル(−O−)、炭酸塩(−O−CO 2 −)、チオエーテル(−S−)、スルホンアミド(−SO 2 −NH−)、カルボニル(−CO−)、およびアミジン(−NHC=(NH ▲+▼ −))にすることができる。 As described above, the functional coupling of the spacer group is an amide (-NHCO-), thiourea (-NHCSNH-), hydrazone (= NHN-), acyl hydrazone (= NHNCO-), ketal (-O-C (alkyl ) 2 -O-), acetal (-O-CH (alkyl) -O-), an orthoester (-C (o-alkyl) 2 -O-), ester (-COO-), anhydride (-COOCO- ), disulfide (-S-S-), urea (-NHCONH-), carbamate (-NHCO 2 -), imine (= N-), amine (-NH-), ether (-O-), carbonate salt (-O-CO 2 -) - in () -NHC = (NH ▲ + ▼), thioether (-S-), sulfonamide (-SO 2 -NH-), carbonyl (-CO-), and amidine can do.
放射線治療のための好ましい実施例では、Bは特にレニウムまたはイットリウムのような放射性金属との錯体をなすキレート薬を表す。 In a preferred embodiment for radiotherapy, B represents in particular a chelating agent which forms a complex with the radioactive metal such as rhenium or yttrium. 化学療法のための好ましい実施例では、Bはヘパリン、ヒルジン、コルヒチン、ビンブラスチンあるいはその類似体を表し、それらのすべては抗増殖薬である。 In a preferred embodiment for chemotherapy, B represents heparin, hirudin, colchicine, vinblastine or an analog, all of which are antiproliferative agents. 化学療法のための他の好ましい実施例では、Bはペプチドを表す。 In another preferred embodiment for chemotherapy, B represents a peptide. 上記の式IIに含まれる、物質Pとして知られるペプチドの誘導体が赤血球に安定して結合し、自由、すなわち非抱合体のペプチドに比べて循環における治療効果の引き延ばしを提供することが見出された。 Within Formula II above, been found that derivatives of peptides, known as substance P is stably bound to erythrocytes, free, i.e. to provide a stretching of the therapeutic effect in the circulation compared to the peptide of the unconjugated It was. 非抱合体の形では循環において比較的短寿命であるような他の治療上有効な物質に対し、同様に生物学的利用能の増大を実現できることが期待されている。 To other therapeutically active substances such that relatively short life in the circulation in the form of unconjugated likewise be able to achieve an increase in bioavailability is expected.
例えば組み合わせ治療および組み合わせ診断のような、本発明の化合物の特定の適用では、式IのBをビオチンにすることが有効である。 For example, such as combination therapies and combination diagnostics, in application specific compounds of the present invention, it is effective to the B of formula I to biotin.
III. III. 本発明の化合物の調整1. Adjustment 1 of the compounds of the present invention. 脂肪親和性に機能化したシアニン上記の式(II)の化合物は、以下の一般式に従う脂肪親和性シアニン前駆体から簡単に調整される: Compounds of lipophilic to functionalized cyanine above formula (II) are easily prepared from lipophilic cyanine precursor according to the following general formula:
ここでR、R 1 、X、X 1 、Y、Zは、式IIの化合物に関して上記で定義したものであり;さらにR 2は次の式のスペーサ成分を表す: Wherein R, R 1, X, X 1, Y, Z is as defined above for compounds of formula II; further R 2 is a spacer component of the following formula:
ここでR 3 、R 4 、R 5 、R 6 、R 7 Wherein R 3, R 4, R 5 , R 6, R 7,
p、q、r、s、tは、式IIの化合物に関して上記で定義したものである;またWは、アミノ(−NH 2 )、α−ハロアセトアミド(−NH COCH 2 −hal)(hal=ハロゲン)、イソチオシアン酸塩(−NCS)、ハロゲン、イソシアン酸塩(−NCO)、カルボキシル(−COOH)、ヒドラジノ(−NHNH 2 )、アシルヒドラジド(−CONH−NH 2 )、例えばベンゾフェノンなどのケトン(−RCO)、ジチオピリジル(−SS−C 55 N)、水硫(−SH)、アルデヒド(−HCO)、無水物(−COOCO−アルキル)、スクシンイミドエステル(−COOC 44 NO 2 )、水酸(−OH)、スルホニルハロゲン化物(−SO 2 −hal)、イミドエステル(−C(=NH)OCH 3 )、エポキシド(−C 2 p, q, r, s, t are as defined above for compounds of formula II; also W is an amino (-NH 2), alpha-haloacetamide (-NH COCH 2 -hal) (hal = halogen), isothiocyanate (-NCS), halogen, isocyanate (-NCO), carboxyl (-COOH), hydrazino (-NHNH 2), acyl hydrazides (-CONH-NH 2), for example, ketones such as benzophenone ( -RCO), dithiopyridyl (-SS-C 5 H 5 N ), Mizu硫(-SH), aldehyde (-HCO), anhydride (-COOCO- alkyl) succinimide ester (-COOC 4 H 4 NO 2) , hydroxyl (-OH), sulfonyl halide (-SO 2 -hal), imidoesters (-C (= NH) OCH 3 ), the epoxide (-C 2 H 3 O)マレイミジル(−NCOCH=CHCO)およびアジド(−N 3 )基から選択した反応性官能基を表す。 It represents a 3 O) maleimidyl (-NCOCH = CHCO) and azido (-N 3) reactive functional groups selected from group.
本発明の化合物の調整に適した前駆体は上記の式の置換基Wとして反応性アミン(NH 2 )基を備え、様々な合成法に従って調整することができるが、その一つの方法を反応機構1で説明し、下記の例で詳細に考察する。 Precursors suitable for adjustment of the compounds of the present invention comprises a reactive amine (NH 2) group as substituent W in the above formula, can be adjusted according to various synthetic methods, reaction mechanisms that one way described in 1, discussed in detail in the examples below.
機構1に従い、GaleとWilshireの方法( Aust.J.Chem.30 :693(1977))に従って2、3、3−(3H)−トリメチルインドレニン(市販品)をN−ヒドロキシメチルフタルアミド(市販品)と反応させ、化合物(1)を生成させ、これをさらに対応するアルコールと4−スルホン酸クロルベンゼン塩化物からSondermannの方法(Liebigs Ann.Chem.、749:183〜197(1971))によって調整したアルキル 4−スルホン酸クロルベンゼンと反応させ、中間物(2)を生成させる。 According mechanism 1, the method of Gale and Wilshire (Aust.J.Chem, 30:. 693 (1977)) 2,3,3- (3H) according - trimethyl indolenine (commercially available) N- hydroxymethylphthalamide ( commercially available) is reacted, the compound (to produce a 1), further corresponding alcohol and Sondermann manner from 4-sulfonic acid chlorobenzene chloride this (Liebigs Ann.Chem, 749:. 183~197 (1971)) It reacted with adjusted alkyl 4-sulfonic acid chlorobenzene by, to produce an intermediate product (2). 基本的な手順に従って濃縮した塩酸中で加熱することによって(2)のフタルイミド保護基を除去して化合物(3)を生成し、続いてそれをギ酸メチルで処理して(4)を生成させる。 By heating in hydrochloric acid and concentrated according to the general procedure to produce the phthalimido protecting group is removed the compounds of (2) (3), followed by it to produce treated with methyl formate (4). 2−メチル−ベンゾオキサゾール(市販品)あるいは2、3、3−(3H)トリメチルインドレニンとアルキル4−スルホン酸クロルベンゼンのどちらかによるアルキル化によって化合物(5)を調整する。 2-methyl - adjusting benzoxazole (commercially available) or 2,3,3-(3H) Compound by alkylation with either trimethyl indolenine and alkyl 4-sulfonic acid chlorobenzene (5). その後化合物(5)を、米国特許番号2、647、054に記述されている方法と類似の方法を用いてN、N−ジフェニルホルムアミジン(市販品)と反応させることによって(6)を生成させる。 Then the compound (5), N using an analogous procedure to that described in U.S. Patent No. 2,647,054, to produce (6) by reaction with N- diphenylformamidine (commercially available) . 次に、塩基(酢酸ナトリウムまたはトリエチルアミン)の存在下でアルコール中で撹拌することによって中間物(4)と(6)を混合し、(7)を生成させる。 Next, the base intermediate by stirring in alcohol in the presence of (sodium acetate or triethylamine) (4) (6) were mixed, to produce (7). Dhawanらの方法( Orgn.Prep.and Proc.Int. (2)85〜88(1975))による(7)の脱保護化によって、アミノ誘導シアニン(8)を生成させる。 Dhawan et al. Method (Orgn.Prep.and Proc.Int., 7 (2 ) 85~88 (1975)) by deprotection by (7), to produce amino-induced cyanine (8).
アミノシアニン(8)は、部位特異的薬物の供給に役立つ抱合体を生成するために、適切な官能基(例えばCO、COOH)を含む治療薬に直接結合させることができる。 Amino cyanines (8), to produce a conjugate useful for delivery of site-specific drug can be bound directly to a therapeutic agent containing the appropriate functional groups (e.g. CO, COOH). さらに、アミノシアニン(8)は、他のバイオ作用性成分と抱合体を作ることができる他の広範囲なシアニン誘導体の調整のために、非常に用途の広い中間物である。 Furthermore, amino hemocyanin (8), for the adjustment of other extensive cyanine derivatives which can make a conjugate other bio-acting components, a wide intermediary very purpose. また、化合物(8)は多数のホモ−およびヘテロ−二官能スペーサ成分と反応して、脂肪親和性シアニン成分とそれに結合したバイオ作用性物質との間に分離を提供する用途には理想的な分子である。 Further, the compound (8) a number of homo - and hetero - reacts with bifunctional spacer component, ideal for applications that provide separation between the bio-active substance bound thereto and lipophilic cyanine component it is a molecule.
結果として生じたシアニン誘導体上のアミン置換基は、周知の反応法を用いて他の官能基へ直接的に変換することができる。 As a result amine substituent on cyanine derivatives produced can be directly converted to other functional groups using known reaction method. 例えば、イソチオシアン酸官能基への変換は、Costaらの方法( J.of Lab.Compds.and Radiopharm.27 (9):1015(1989))によって、チオホスゲンによる処理によって実現することができる。 For example, conversion to isothiocyanate functional groups, Costa et al. Method (J.of Lab.Compds.and Radiopharm, 27 (9 ):. 1015 (1989)) , it is possible to realize by treatment with thiophosgene.
アミン基と1、4−テレフタル酸ジ−N−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応によって、OOC−アリール−CONH−アルキルスペーサ成分によるシアニン頭部基へのスクシンイミジル官能基の結合が提供される。 By reaction with an amine group and 1,4-terephthalic acid di -N- hydroxysuccinimide ester, OOC- binding of succinimidyl functional group by an aryl -CONH- alkyl spacer component to the cyanine head group is provided. 結果として生じた化合物は、安定な結晶固体として分離および精製することができる。 The resulting compounds can be separated and purified as a stable crystalline solid.
ジメチルホルムアミド中における置換アミノ基のp−ニトロフェニルヨード酢酸塩(市販品)による単純なアシル化によって、アルキル−CONH−アルキルスペーサ成分によってシアニン頭部基に結合した反応性ヨード置換基が提供される。 By simple acylation with p- nitrophenyl iodoacetate salts of substituted amino groups (commercially available) in dimethylformamide, reactive iodo substituent attached to the cyanine head group is provided by an alkyl -CONH- alkyl spacer component .
N−ヒドロキシスクシンイミジル−3(2−ピリジルジチオ)プロピオン酸(市販品)によるアミン基の処理によって、ピリジルジチオ官能基とアルキル−CONH−アルキルスペーサ成分を備えた化合物が提供される。 By treatment of the amine group by N- hydroxysuccinimidyl-3 (2-pyridyldithio) propionic acid (commercially available), compounds with pyridyldithio functional group and an alkyl -CONH- alkyl spacer ingredient.
γ−チオブチロラクトンによるアミン基の処理によって、水硫官能基とアルキル−OCNH−アルキルスペーサ成分を備えた化合物が提供される。 By treatment of the amine group by γ- thiobutyrolactone, compounds with water 硫官 functional group and the alkyl -OCNH- alkyl spacer ingredient. 同様に、γ−ブチロラクトンによるアミン基の処理によって、水酸基とアルキル−CONH−アルキルスペーサ成分を備えた化合物が提供される。 Similarly, by treatment of the amine group by γ- butyrolactone, compounds with a hydroxyl group and alkyl -CONH- alkyl spacer ingredient.
2. 2. 蛋白質/ペプチド脂肪親和性シアニン抱合体上記に一般的に記述したように調整した脂肪親和性シアニン前駆体を、異なる数多くの合成法を用いて蛋白質またはペプチドに結合させ、式IIの化合物を提供することができる。 The protein / peptide lipophilic cyanine conjugate lipophilic cyanine precursor adjusted as above described generally, bound to proteins or peptides with different number of synthetic methods, provides compounds of formula II be able to.
上述したような脂肪親和性リンカー誘導体に対する蛋白質またはペプチドの結合は、蛋白質またはペプチド上に存在するアミン基(すなわち、末端α−アミノ基またはリシンのεアミノ基)を介して行うことができる。 Binding proteins or peptides to lipophilic linker derivatives, such as those described above, it can be carried out via the amine groups present on the protein or peptide (i.e., terminal α- amino group or ε-amino group of lysine). 別の方法としては、蛋白質またはペプチドを適切なシアニン前駆体に結合するために、カルボキシル基またはチオール基(システイン残留物が存在する部分)を使用することができる。 Alternatively, it can be used to couple proteins or peptides to appropriate cyanine precursors, a carboxyl group or a thiol group (a portion cysteine ​​residues are present). このような結合反応を実施するのに適した条件は、技術に精通した者にとって周知である。 Conditions suitable for performing such coupling reactions are well known to those skilled in the art.
ポリペプチドのα−アミノ基と脂肪親和性シアニン前駆体の抱合体のための一つの方法は、Wetzelらの方法( Bioconjugate Chem. 、1、114(1990)による修正を用いるものである。これは、pH6におけるヨード酢酸無水物(市販品)を用いたポリペプチドのアシル化によってヨード酢酸アミド誘導体を形成し、次にそれを上述のように調整した水硫基−誘導脂肪親和性シアニン化合物と反応させ、優れた安定性を備えるチオエーテル結合形成を介して抱合体を形成することを含む。 One method for the conjugate of α- amino group and lipophilic cyanine precursor polypeptide, Wetzel et al. Method (Bioconjugate Chem., Is to use a correction by 1,114 (1990). This , iodoacetic anhydride in pH6 form a iodoacetamide derivative by acylation of the polypeptide with (commercially available), then adjust water 硫基 it as described above - induced lipophilic cyanine compound and reaction is includes forming a conjugate via thioether bond formation with excellent stability.
リシンのε−脂肪族アミノ基を介した抱合体は、平衡によってアミンの限られた分画のみが脱プロトン化されて反応性となるような、pH8.5を超える点で最良の状態で達成される。 Conjugates via ε- aliphatic amino group of lysine, such as only fraction with a limited amine by the equilibrium is reactive deprotonated, achieved in the best condition in that more than pH8.5 It is. このアミノ基は、上述したいくつかのアミノ反応性脂肪親和性リンカー化合物との高い反応性を備えなければならない。 This amino group must comprise a high reactivity with a number of amino-reactive lipophilic linker compounds described above. 例えば、イソチオシアン酸誘導リンカー化合物は、水性条件下で高い安定性を示し、リシンの側鎖と反応してチオ尿素結合を介して結合した抱合体を形成することができる。 For example, isothiocyanate derived linker compounds exhibit high stability in aqueous conditions, it is possible to form a conjugate attached through an thiourea bond by reacting with the side chains of lysine.
上述のN−ヒドロキシ−スクシンイミジルエステル誘導リンカー化合物は、このように形成されたアミド抱合体が非常に安定しているため、リシンとの反応にとって特に優れた試薬である。 Above N- hydroxy - succinimidyl ester derived linker compound, since thus formed amide conjugate is very stable, which is particularly good reagent for reaction with lysine. この反応は、この特殊な誘導体の水性条件下での加水分解は競合する副反応であるため、ジメチルホルムアミドのような有機溶媒中での無水条件下で実施することが好ましい。 This reaction, since this hydrolysis under aqueous conditions of special derivatives are side reaction competing, it is preferably carried out under anhydrous conditions in an organic solvent such as dimethylformamide. 上記の式IIIのN−ヒドロキシ−スクシンイミジルエステル誘導リンカーをリシン残留物のアミノ基とundecaペプチド、物質Pの位置3で抱合させる反応については、以下に詳細に記述する。 The above formula III N-hydroxy - amino group and undeca peptide succinimidyl esters derived linker lysine residue, the reaction of conjugated at positions 3 substance P is described in detail below.
ペプチドまたは蛋白質のC末端アミノ酸残留物上と同様、グルタミン酸とアスパラギン酸残留物の側鎖に存在するカルボキシル酸基は、上述のアミン誘導脂肪親和性シアニン化合物を用いた選択的抱合が可能な部位である。 As with C-terminal amino acid residue Butsujo peptide or protein, the carboxyl groups present on the side chains of glutamic acid and aspartic acid residues at the site that can selectively conjugated with amine inductive lipophilic cyanine compound of the above is there. この反応は、HoareとKoshlandの方法を修正したもの( J.Biol.Chem.242 :2447〜2453(1967)に従って1−エチル−3−ジメチルアミノ−プロピルカルボジイミド(市販品)のような水溶性カルボジイミドを用いて実施することができ、あるいは、 J.Biol.Chem.249 :5452(1974)に記述された方法の修正に従って、Wood wardの試薬K、2−エチル−5−フェニル−イソオキサゾリウム−3−スルホン酸塩(市販品)を用いることによって実施することができる。その結果生じた抱合体を、安定なアミノ結合を介して結合する。 This reaction, a modification of the method of Hoare and Koshland (J.Biol.Chem, 242:. 2447~2453 (1- ethyl-3-dimethylamino according 1967) - water-soluble, such as carbodiimide (commercially available) can be performed using carbodiimide or, J.Biol.Chem, 249:. 5452 according modification of the method described in (1974), reagent Wood ward K, 2-ethyl-5-phenyl - Isookisa can be carried out by using a Zoriumu 3- sulfonate (commercially available). the resulting conjugate is linked via a stable amide bond.
不活性な抱合体がつねに生じるため、官能基化した誘導体の、生物学的活動に必須のペプチドまたは蛋白質の反応基への結合は避けなければならない。 Since inactive conjugates always occurs, the functionalized derivatives, must be avoided bond to reactive groups of the required peptide or protein biological activity. しかし、脂肪親和性シアニン誘導体からペプチドまたは蛋白質を切断可能なスペーサ成分によって解放することができれば、この問題を解決することができる。 However, if it is possible to release the spacer component cleavable peptide or protein from the lipophilic cyanine derivative, we can solve this problem.
上述の化合物の脂肪親和性により、それらの一部は代表的な水性の緩衝系に十分溶解しない。 The lipophilic compounds described above, some of them do not fully soluble in buffer systems of typical aqueous. 薬物の可溶性あるいは活性のある立体配座を維持するために水性条件を必要とする抱合反応は、通常は有機溶媒で改良した水性溶媒中で実施する必要がある。 Conjugation reactions requiring aqueous conditions to maintain the conformation which is soluble or activity of the drug, usually must be carried out in an aqueous solvent which is an improvement in an organic solvent. ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、およびアルコールのような溶媒は水と混合することができ、脂肪親和性シアニン誘導体を可溶性にして目的の抱合体を生じさせるうえで有効である。 Dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, acetonitrile and solvents such as alcohols, can be mixed with water, it is effective to produce a conjugate of interest and the lipophilic cyanine derivative soluble.
本発明の化合物は、形成した特定の化合物の大きさ、電荷、あるいは脂肪親和性を利用する各種の標準精製法によって精製することができる。 The compounds of the present invention, the size of the specific compound formed may be purified by various standard purification methods utilizing charges, or lipophilic. ペプチドで構成される治療薬に特に有効な精製法は、Bohlenらの方法である( Int.J.Rept.Prot.Research16 :306〜10(1980)。 Particularly effective purification method therapeutic agent composed of peptides are Bohlen et al. Method (Int.J.Rept.Prot.Research, 16: 306~10 (1980 ).
3. 3. ビオチン化した脂肪親和性シアニン本発明のビオチン化した脂肪親和性シアニン化合物は、好ましくは次の式で与えられる: Lipophilic cyanine compound biotinylated lipophilic cyanine present invention were biotinylated, preferably given by the following equation:
ここでR、R 1 、R 8はすでに定義した通りであり、mは0から6の値をとる。 Wherein R, R 1, R 8 is as previously defined, m has a value of 0 to 6. このようなビオチン化した誘導体は、ビオチン反応、あるいは上記の式IIIの官能基化脂肪親和性シアニン化合物を用いたビオチン誘導体によって調整することができる。 Such derivatives biotinylated can be adjusted by a biotin derivative with biotin reaction, or functionalized lipophilic cyanine compound of the above formula III. この反応に使用するビオチン誘導体は好ましくは次の式で与えられる: Biotin derivative used in this reaction is preferably given by the following equation:
ここでEは、前記反応性官能基によって置換することができるレービル基を備える化合物の残留物を表し、Wおよびmは、0、1、または2である。 Where E represents the residue of a compound comprising a Rebiru group which may be substituted by the reactive functional groups, W and m is 0, 1 or 2.
例えば、反応機構1に従って調整した型のアミノ官能基化シアニン誘導体(8)を、Hofmann、Finn、Kisoの方法( J.Am.Chem.Soc.100 :3585(1987))に従って、市販のアミン反応性ビオチン誘導体、(+)−ビオチン 4−ニトロフェニルエステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル 6−(ビオチンアミド)カプロン酸塩および6((6((ビオチノイル)−アミノ)ヘキサノイル)アミノ)カプロン酸 N−ヒドロキシスクシンンイミジルエステルと反応させ、上記の式IVのビオチン−脂肪親和性シアニン抱合体を形成させることができるが、ここでそれぞれm=0、1、2である。 For example, the amino functionalized cyanine derivatives of the type adjusted according to the reaction mechanism 1 (8), Hofmann, Finn , Kiso method (J.Am.Chem.Soc, 100:. 3585 ( 1987)) in accordance with a commercial amine reactive biotin derivatives, (+) - biotin 4-nitrophenyl ester, N- hydroxysuccinimidyl 6- (biotinamido) caproic acid and 6 ((6 ((biotinoyl) - amino) hexanoyl) amino) caproic acid It reacted with N- hydroxysuccinimidyl down succinimidyl ester, biotin of formula IV above - can be formed lipophilic cyanine conjugate, where a m = 0, 1, 2, respectively. これらの抱合体は、ビオチン成分と抱合体の脂肪結合成分の間のスペーサ腕の長さが異なっている。 These conjugates, the length of the spacer arm between the fat binding component biotin moiety and the conjugate are different. このようなスペーサ腕の作用は、ビオチン化化合物の意図する適用によって重要となることがある。 Action of such spacer arm may be important by the intended application of the biotinylated compound. 長いスペーサ腕は、アビジン中の”深い”ビオチン結合部位とビオチン抱合体を結合する能力にとって、有利な作用を備えることが示されている。 Long spacer arm, for the ability to bind the "deep" biotin-binding site and the biotin conjugate in avidin, have been shown to comprise a beneficial effect.
maleimido、α−ヨードアセトアミド、ヒドラジノおよびアミノなどの反応性官能基との他の種類のビオチン誘導体は市販されており(Molecular Probes、Eugene、OR、Handbook of Fluorescent Probes and Research Reagents、1989〜91)、上述の様々な官能基化脂肪親和性リンカー化合物との結合に用いることができる。 maleimido, alpha-iodoacetamide, other types of biotin derivatives with reactive functional groups such as hydrazino and amino are commercially available (Molecular Probes, Eugene, OR, Handbook of Fluorescent Probes and Research Reagents, 1989~91), it can be used for coupling with various functionalized lipophilic linker compounds described above. 適切な反応機構は、技術に精通した者によって明らかである。 Suitable reaction mechanisms will be apparent by those skilled in the art.
さらに、種類の異なる多数のスペーサ成分を、両者の前駆体上の適切な官能基によって、シアニンとビオチン成分の間に結合することができる。 Furthermore, different multiple spacer components, by suitable functional groups on both precursors can be coupled between the cyanine and biotin component. このようなスペーサの結合のための反応機構は、技術に精通した者には周知である。 The reaction mechanism for coupling such spacers are well known to those skilled in the art.
4. 4. 放射性同位元素によって置換した脂肪親和性シアニン放射性ハロゲン化シアニンの調整に役立ち、本発明の方法で有利に使用することができる脂肪親和性トリブチルチンの合成を反応機構2に示し、さらに下記の例で詳細に記述する。 It helps adjust the lipophilic cyanine radiohalogenated cyanine substituted with a radioactive isotope, advantageously synthetic lipophilic tributyltin that can be used in the method of the present invention shown in reaction scheme 2, further in the examples below It described in detail.
反応機構2に従って、Blaikieら(J.Chem.Soc.、313(1924))とMoreauら(Eur.J.Med.Chem.Chim.Ther.、9、(3):274〜280(1974))によって記述された方法を用いてヨードアニリン(市販品)から調整した5−ヨード−2、3、3−トリメチル−(3H)−インドレニン(9)を、アルキル−4−クロルベンゼンスルホン酸塩(すでに記述したように調整)によってアルキル化して(10)を生成させる。 According to reaction mechanism 2, Blaikie et a Moreau et al (J.Chem.Soc, 313 (1924).) (Eur.J.Med.Chem.Chim.Ther, 9, (3):. 274~280 (1974)) 5-iodo-2,3,3-trimethyl adjusted from iodoaniline (commercially available) using the method described by - (3H) - indolenine (9), alkyl-4-chlorobenzene sulfonate ( already to produce alkylated (10) by the adjustment) as described. 無水酢酸中で(10)をN、N−ジフェニルホルムアミジンで処理し、次にビニル中間物(11)を与える。 In acetic anhydride a (10) N, was treated with N- diphenylformamidine gives then vinyl intermediate (11). 次に、酢酸ナトリウムの存在下でエタノール中で撹拌して中間物(11)と(5)(後者はすでに記述したように調整)を結合させる。 Then bound intermediate was stirred in ethanol in the presence of sodium acetate (11) (5) (adjusted to the latter already described). この反応混合物を酢酸銀を用いて焼入れし、塩化ナトリウムを加えてインドシアニンを与える(12)。 The reaction mixture was quenched with silver acetate, giving indocyanine Sodium chloride (12). 次に、触媒、テトラキス−(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)の存在下でbis−(トリ−n−ブチルチン)を用いて(12)を加熱することを含むAzizianらの方法( J.Organomet.Chem.215 :49〜58(1981))によって、(12)から化合物(13)を調整することができる。 The catalyst, tetrakis - (triphenylphosphine) palladium (0) in the presence of bis- Azizian's method comprises heating (tri -n- butyltin) with the (12) (J. Organomet. Chem, 215:. by 49-58 (1981)), it is possible to adjust the compound (13) from (12). これに続いて、トリブチルスタニル誘導体(13)を緩やかな条件下で、例えばWilburらの方法を修正した方法(J.Nuc.Med.、30:216〜226(1989)によって、容易に放射性ハロゲン化することができる。さらに、Weissらの方法(J.Labelled Cmpds.&Radiopharmaceuticals、XXVI:109〜10(1989)を変形した方法を使用して、(12)への放射性ハロゲンの導入を達成することができる。 Following this, tributylstannyl derivative (13) under mild conditions, for example, a method that fixes Wilbur et al. Method (J.Nuc.Med, 30:. By 216-226 (1989), easily radioactive halogen can be of further, Weiss et al. method (J.Labelled Cmpds & Radiopharmaceuticals, XXVI:.. 109~10 (using the method obtained by modifying the 1989), to achieve the introduction of radioactive halogen to (12) can.
放射性ハロゲンの導入に使用することができる別の脂肪親和性シアニン誘導体は、Sn(Bu) 3基を−HgX、で置換した(13)の類似体であり、ここでXはハロゲンを表す。 Another lipophilic cyanine derivative which may be used for the introduction of radiohalogens is an analogue of the Sn (Bu) 3 group -HgX, in the substitutions (13), wherein X represents a halogen. 化合物(12)のハロゲン置換基の環の位置は、当然ながら適切に選択した開始物質に変更することができる。 Position of ring halogen substituents of the compound (12) can be changed appropriately chosen starting material of course. 例えば、Bassignanaらの方法( Spectrochemica Acta.19 (11)、1885(1963))に従って調整した6−ヨード−メチルベンゾチアゾールを、対応する6−ヨード誘導体を提供するために使用することができる。 For example, Bassignana et al. Method (Spectrochemica Acta, 19 (11) , 1885 (1963).) 6- iodo adjusted according - methyl benzothiazole, it may be used to provide the corresponding 6-iodo derivative.
5. 5. 切断可能なコルヒチン−脂肪親和性シアニン抱合体酸によって切断可能な結合を備えたコルヒチン−シアニン抱合体を、適切に官能基化した活性コルヒチン誘導体を選択することによって調整することができ(Brossi、J.Med.Chem.、33:2311、2319(1990)によって記述されたように行う)、シス−アコニチル、アセタール、オルトエステル、エステル、ケタール、無水物、あるいはヒドラゾンなどの結合を介して、適切に官能基化した脂肪親和性シアニン誘導体にそれを結合させることができる。 Cleavable colchicine - colchicine with a cleavable linkage by lipophilic cyanine conjugate acid - cyanine conjugate, it can be adjusted by selecting the appropriate functionalized active colchicine derivative (Brossi, J . .Med.Chem, 33: 2311,2319 performed as described by (1990)), cis - aconityl, acetal, via binding orthoester, ester, ketal, anhydride, or a hydrazone, suitably it can be bound to it in lipophilic cyanine derivative functionalized.
シス−アコニチル結合を介した結合は、Shenらによって記述された方法( Biochem、Biophys.Res.Commun.102 、3:1048〜1054(1981)を用いて実現することができる。この方法は、薬物(例えばデスアセチルコルヒチン)の遊離アミノ誘導体および脂肪親和性シアニンのアミノ型と、無水シス−アコニチル(市販品)との結合を含む。 .. Cis - aconityl through binding binding method described by Shen et al (Biochem, Biophys.Res.Commun, 102, 3 : 1048~1054 (1981) can be achieved using this method, including binding of aconityl (commercially available) - a free amino derivatives and lipophilic cyanine amino type drugs (e.g. desacetyl colchicine), anhydrous cis.
アセタール、オルトエステル、またはケタール結合を介した結合は、Srinvasacharらによって記述された方法( Biochemistry28 、2501〜2509(1989))を修正して用いることによって、適切に官能基化したコルヒチンとシアニン誘導体によって達成することができる。 Acetal, orthoester or coupling via ketal bond, the method described by Srinvasachar et al (Biochemistry, 28, 2501~2509 (1989 )) by using modify the colchicine and cyanine appropriately functionalized, it can be achieved by derivatization.
ヒドラゾン結合を介した結合は、Laguzzaらによって記述された方法( J.Med.Chem.32 :548〜555(1989))を修正して用いることによって実施することができる。 Coupling via hydrazone bond method described by Laguzza et al (J.Med.Chem, 32:. 548~555 ( 1989)) can be carried out by using and modifying the. この方法は、薬物のアルデヒド型と脂肪親和性シアニンのヒドラジド型との結合を含む。 The method comprises the binding of hydrazide type aldehyde type and lipophilic cyanine drugs.
本発明による切断可能なコルヒチン−シアニン抱合体の合成を反応機構3に示し、さらに下記の例で詳細に記述する。 Cleavable colchicine according to the invention - the synthesis of the cyanine conjugates shown in reaction scheme 3 described in further detail in the examples below.
機構3に従って、アミノ官能基化したシアニン(8)をグルタル酸(市販品)のモノメチルエステルと結合させ、メチルエステル誘導体(14)を生成し、メタノール中でヒドラジンによって処理することによって、ヒドラジノ誘導体(15)を提供する。 According mechanism 3, the amino functionalized cyanine (8) is coupled with mono-methyl ester of glutaric acid (commercially available), by generating a methyl ester derivative (14) is treated with hydrazine in methanol, hydrazino derivative ( to provide 15).
コルヒチン成分をデアセチルコルヒチン(市販品)で反応させて調整し、酸中間物を生成し、次にカルボニルイジイミダゾールの付加によってそれをin situで活性化し、アシルイミダゾールを形成させ、それをテトラブチル水素化ホウ素アンモニウムによって還元することによってアルコール(17)を提供する。 Adjust by reacting colchicine components deacetyl colchicine (commercially available), to produce an acid intermediate, then activate it in situ, by the addition of the carbonyl Idi imidazole, to form an acyl imidazole, it tetrabutyl hydrogen providing alcohol (17) by reducing the boron ammonium. 塩化クロム酸ピリジニウムによる(17)の酸化によって7−N−(5−オキソペンタノイル)デアセチルコルヒチン(18)を生成し、次にそれをヒドラジノ誘導体(15)と結合させて、コルヒチンとシアニン成分が酸で切断可能なアシルヒドラゾン結合を介して結合した抱合体(19)を与える。 7-N-(5-oxo-pentanoyl) de generate acetyl colchicine (18), and then allowed to bind it with a hydrazino derivative (15) by the oxidation of by pyridinium chlorochromate (17), colchicine and cyanine component There give conjugates coupled via a cleavable acyl hydrazone bond with acid (19). 機構3で中間物として生成した7−N−(5−オキソペンタノイル)デアセチルコルヒチンは、本発明の一部を構成する新しい化合物である。 7-N- (5- oxo-pentanoyl) deacetyl colchicine produced as an intermediate in mechanism 3 are new compounds forming part of the present invention. 必要な場合には、メチルチオ、または他のカルコゲンを含む基を、コルヒチンの核の位置10の部分でメトキシ基に置換することができる。 If necessary, methylthio or other groups containing a chalcogen, can be replaced with a methoxy group at the portion of the position 10 of the colchicine nucleus.
さらに、デアセチルチオコルヒチン(Shianら、J.Pharma.Sci.、 64 、646〜648(1975)によって記述されたように調整)から、機構3に示したアルデヒド(18)の調整と同一の反応経過を用いて、より効果の大きな7−N−(5−オキソペンタノイル)デアセチルチオコルヒチン類似体を作ることができる。 Moreover, deacetyl thiocolchicine from (Shian et, J.Pharma.Sci., 64, 646~648 (adjusted as described by 1975)), adjusting the same reaction of the aldehyde (18) shown in mechanism 3 using course, it is possible to make more effective the larger 7-N- (5- oxo-pentanoyl) deacetyl thiocolchicine analogue. さらに、このチオコルヒチンの誘導体は、同一の結合条件を用いてヒドラジノ誘導体(15)に対して結合させ、酸によって切断可能な抱合体を提供することもできる。 Furthermore, derivatives of thiocolchicine, using the same coupling condition is coupled to a hydrazino derivative (15) may provide a possible conjugate cleaved by acid.
コルヒチン類似体を抱合体から放出させる動力学を、コルヒチンとシアニン成分の間のヒドラゾン結合の種類を変えることによって変更することができる。 The kinetics of releasing colchicine analogue from the conjugate can be altered by changing the type of hydrazone bond between the colchicine and cyanine component. 例えば、スルホニルフェニルヒドラゾンとフェニルヒドラゾン結合を介して抗体−薬物抱合体の結合が、対応するアシルヒドラゾン誘導体よりもゆっくりとした放出動力学を提供したことをMuellerら報告した( Bioconjugate Chem. :325〜330(1990))。 . For example, an antibody via a sulfonyl phenylhydrazone and phenyl hydrazone bond - is bound drug conjugate, that provides slow release kinetics than the corresponding acyl hydrazone derivatives was reported Mueller et (Bioconjugate Chem, 1: 325-330 (1990)).
6. 6. ヘパリン−脂肪親和性シアニン抱合体安定なカルバミン酸塩結合によって結合し、本発明に有効なヘパリン−シアニン抱合体の合成法を反応機構4に示し、以下の例で詳細に記述する。 Heparin - bound by lipophilic cyanine conjugates stable carbamate bond, effective heparin present invention - illustrates the synthesis of the cyanine conjugates in the reaction mechanism 4, described in detail in the following examples.
機構4に従って、アミノ官能基化したシアニン(8)を、Eckertらの方法(Angew Chem.Int.Ed.Enql.、26(9):894〜95(1987))に従い、トリホスゲンを用いた処理によって高度な反応性をもつイソシアン酸塩誘導体(20)に変換する。 According mechanism 4, the amino functionalized cyanine (8), Eckert et al. Method (Angew Chem.Int.Ed.Enql, 26 (9):. 894~95 (1987)) in accordance with, by treatment with triphosgene converted into isocyanate derivative (20) with a high degree of reactivity. イソシアン酸塩誘導体(20)は、さらに分離あるいは精製することなく、Dongの方法(”親水性スペーサ基を備えたヘパリン化し断片化したポリウレタン尿素表面”、Dissertation、Utah大学、1990)を修正して用いてジメチルホルムアミド/ホルムアミドの混合溶媒の中でヘパリンナトリウムと直ちに反応させ、ヘパリンのヒドロキシル基がカルバミン酸塩結合形成(あるいは尿素結合形成を介したアミノ基によって)を介してシアニンに共有結合で結合したヘパリン−脂肪親和性シアニン抱合体(21)を提供する。 Isocyanate derivative (20) without further separation or purification, the method of Dong ( "hydrophilic spacer group heparinized with a fragmented polyurethaneurea surface", Dissertation, Utah University, 1990) to modify the bond is immediately reacted with heparin sodium, hydroxyl groups of heparin through the salt carbamate bond formation (or by an amino group through urea bond formation) covalently attached to the cyanine in a mixed solvent of dimethylformamide / formamide using heparin - providing lipophilic cyanine conjugates (21). さらに炭素スペーサ腕を、市販の試薬N−Boc−6アミノカプロン酸 N−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて、技術に精通した者に周知の反応によってヘパリンとシアニン成分の間で結合させることもできる。 Further carbon spacer arm, using commercially available reagents N-Boc-6-aminocaproic acid N- hydroxysuccinimide ester, can also be coupled between the heparin and cyanine components by reactions well known to those skilled in the art.
ヘパリンは多数の遊離ヒドロキシル基を備えているため、反応における試薬の化学量論を制御することによって、ヘパリン分子ごとの多数のシアニン基を当然ながら変更することができる。 Heparin because it has a large number of free hydroxyl groups, by controlling the stoichiometry of the reagents in the reaction, can, of course, vary the number of cyanine groups per heparin molecule. 必要な場合には、疎水的相互作用クロマトグラフィによってヘパリン−脂肪親和性シアニン抱合体を遊離ヘパリンから精製することができる。 If necessary, heparin by hydrophobic interaction chromatography - can be purified lipophilic cyanine conjugate from free heparin.
別の方法として、Kinらの記述した方法( Nonthrombogenic Bioactive Surface Annals 、New York Academy of Sciences、p.116〜130)を修正して用いることによって、ヘパリン−シアニン抱合体を調整することができる。 Alternatively, Kin et al process described (Nonthrombogenic Bioactive Surface Annals, New York Academy of Sciences, p.116~130) by using modify the heparin - can be adjusted cyanine conjugate. この方法は、カルボジイミド試薬を用いてヘパリンのカルボン酸基をアミノ官能基化シアニンに結合させることを含む。 The method comprises binding the carboxylic acid groups of heparin to the amino functionalized cyanine using a carbodiimide reagent. ヘパリンのカルボン酸基の20%に及ぶ割合が、バイオ活性を失うことなく誘導されたことを、Ebertらが測定した(Biomaterials:Interfacial Phenomenon and Application、Adv.Chem.Ser.99、American Chem.Soc.、Washington、D.C.(1982)。 Ratio ranging from 20% of the carboxylic acid groups of the heparin, the derived without loss of bioactivity, Ebert et al. Was measured (Biomaterials: Interfacial Phenomenon and Application, Adv.Chem.Ser.99, American Chem.Soc ., Washington, D.C. (1982).
7. 7. 放射性金属錯体−脂肪親和性シアニン抱合体放射性金属錯体−脂肪親和性シアニン抱合体を合成する方法を、反応機構5に示し、ここで金属にはレニウム、インジウム、銅、あるいはパラジウムで構成される群から一つを選択する。 Radiometal complex - Lipophilic Cyanine Conjugates radiometal complexes - a method of synthesizing a lipophilic cyanine conjugate, shown in reaction scheme 5, the group consisting of wherein rhenium to metal, indium, copper or palladium, select one from. 機構5に従って、BaidooとLever( Tetrahedron Lett.31 、40、5701〜5704(1990))によって記述されたように調整した二官能キレート薬(22)をアミノ官能基化シアニン(8)と反応させ、誘導体(23)を生成する。 According mechanism 5, Baidoo and Lever (Tetrahedron Lett., 31, 40,5701~5704 (1990)) is reacted with an amino functionalized cyanine the adjusted bifunctional chelating agent (22) as described by (8) , it generates the derivative (23). 次に化合物(23)を適切な酸化状態で金属溶液と反応させ、金属錯体(24)を生成する。 Then reacted with a metal solution compound (23) in a suitable oxidation state, to produce a metal complex (24). 機構5は、使用金属がレニウムである場合に得られる中性金属錯体の構造を描いている。 Mechanism 5 depicts the structure of the neutral metal complex obtained when the metal used is rhenium. 正確な構造と、経過の錯体の電荷は使用する金属と選択した二官能キレートの正確な構造に依存する。 The exact structure, charge the course of the complex will depend on the exact structure of the bifunctional chelate and the selected metal used.
金属を希土類金属から選択した場合の放射性金属錯体脂肪親和性シアニン抱合体を調整する方法を機構6に示す。 Metals are shown in mechanism 6 how to adjust the radiometal complex lipophilic cyanine conjugates in the case of selecting from the rare earth metals.
(25)の構造をもつ二官能基化ポリアミノカルボン酸塩キレートを、欧州特許出願番号0353450 A1に記述された方法に従って調整することができる。 Can be a two functionalized poly aminocarboxylate chelating having the structure of (25), adjusted according to the method described in European Patent Application No. 0,353,450 A1. 機構6に従って、キレート(25)をpH9〜9.5でアミノ官能基化シアニン(8)と反応させ、キレートとシアニン成分が安定なチオ尿素結合を介して結合している化合物(26)を生成する。 According mechanism 6, generates a chelate (25) is reacted with an amino functionalized cyanine (8) at PH9~9.5, compound chelating cyanine components are linked via a stable thiourea bond (26) to. 次に、同様に上述の欧州特許出願に記述されている方法に従って、化合物(26)を適切な緩衝系中で放射性金属塩溶液と反応させ、最終の放射性金属錯体−シアニン抱合体(27)を生成する。 Then, according to the method described in the same manner described above European patent application, the compound (26) in a suitable buffer system in reacted with a radioactive metal salt solution, the final radiometal complex - cyanine conjugate (27) generated.
機構6の図に使用したM(PA−DOTA)は、ポリアミノ−カルボン酸塩キレートと、機構6に示した中間物(26)のスペーサ成分(−(CH 22 −C 64 −NH−)の部分で構成される放射性金属錯体を指す。 M used in FIG mechanism 6 (PA-DOTA) is polyamino - spacer component of the carboxylate chelate, intermediates shown in mechanism 6 (26) (- (CH 2) 2 -C 6 H 4 -NH - refers to configured radiometal complex part of). 化合物27の放射性金属錯体成分の3次元構造は、Spinletら( Inorgen.Chem.23 :4278〜4283(1984)によって記述されたものと同様であると予想される。 3-dimensional structure of the radiometal complex component of the compound 27, Spinlet et (Inorgen.Chem, 23:. Is expected to be similar to those described by 4278-4283 (1984).
他の種類の二官能ポリアミノカルボン酸塩キレートが知られており、技術に精通する者に周知の他の反応によって、官能基化したシアニンに結合させることができる。 Are known other types of difunctional poly aminocarboxylate chelating, by the well-known addition reactions to those skilled in the art, it can be coupled to cyanine functionalized. 例えば、Sundbergeら、 J. For example, Sundberge et al., J. Med. Med. Cham. Cham. 17 :1304(1974)を参照。 See 1304 (1974): 17.
窒素を含む他の四歯状キレートと、硫黄を含む四歯状キレートが知られており、技術に精通するものに周知の反応によって、適切に官能基化したシアニンに結合させることができる。 The other four dentate chelates containing nitrogen, the four-dentate chelating containing sulfur are known, by the reaction known to those skilled in the art, it can be coupled to a suitably functionalized cyanine. 例えば、Rasら、 J. For example, Ras, et al., J. Am. Am. Chem. Chem. Soc. Soc. 112 :5798〜5804(1980)を参照。 , 112: 5798-5804 see the (1980).
IV. IV. 生体適合粒子へ結合する本発明の結合化合物本発明の化合物上で置換された炭化水素尾部の多数の直線状炭素は、化合物とバイオ粒子の表面膜の間に目的の程度の安定した結合を達成するうえで重要な要因である。 Numerous linear carbons of the hydrocarbon tails substituted on the compounds binding the Invention Compounds of the invention that bind to a biocompatible particles, achieve a stable binding of the degree of interest between the surface membrane of the compound and the bioparticle it is an important factor in that. 単一の炭化水素尾部を備える化合物、例えばアクリジン誘導体の安定した結合を達成するためには、直線状炭素の数を23またはそれ以上にする必要がある。 Compounds with a single hydrocarbon tails, for example, in order to achieve a stable connection of acridine derivatives, it is necessary that the number of linear carbon 23 or more. 本発明に従って調整されたシアニン誘導体における経験は、二つまたはそれ以上の炭化水素尾部を備える化合物では、尾部の一つが少なくとも12炭素の長さの直線部分を備え、炭化水素尾部の直線状炭素原子の数の合計を少なくとも23個にする必要があることを示している。 Experience in cyanine derivatives adjusted in accordance with the present invention, two or more in compounds comprising a hydrocarbon tail comprises one linear portion of the length of at least 12 carbon atoms in the tail, the linear carbon atoms in the hydrocarbon tails It indicates the need to the total number of at least 23. 化合物の構造に依存して、一つの細胞から他の細胞への漏出または転換は通常は起こらない。 Depending on the structure of the compound, leakage or conversion from one cell to another is usually not occur. 一般に、炭化水素尾部が長いほど、脂肪親和性が高い。 In general, the higher the hydrocarbon tails are long, high lipophilic. しかし、30個を超える直線状炭素原子を備える炭化水素尾部は、バイオ作用性成分と、炭化水素尾部を提供するために使用した作用物質が同一の溶媒に溶けないことがあり、炭化水素尾部をバイオ作用性成分に結合するための化学が非常に困難になるため、問題となることがある。 However, the hydrocarbon tails having the linear carbon atoms in excess of 30, and bio-acting component, may agent was used to provide the hydrocarbon tails are not soluble in the same solvent, the hydrocarbon tails since the chemical for binding to the bio-acting components becomes very difficult, it can be problematic. したがって、尾部が結合する結合成分の化学的性質によって、炭化水素尾部の長さには実質的な制約があることがある。 Thus, the chemical nature of the binding component tails are attached, there may be substantial restrictions on the length of the hydrocarbon tails.
”尾部”が結合する結合成分の構造的な違いもまた、膜結合の安定性に大きな影響を与える。 Structural differences of the binding component to bind the "tail" is also greatly affects the stability of the membrane-bound. 正に帯電した結合成分、例えばシアニン、スチリルピリジン、キサンテン、フェノキサジン、フェノチアジン、あるいはジフェニルヘキサトリエン色素とその誘導体は、負に帯電した膜への化合物の結合と保持に貢献することがある。 Positively charged binding component, e.g. a cyanine, styrylpyridine, derivatives thereof xanthene, phenoxazine, phenothiazine, or a diphenylhexatriene dyes may contribute to holding the binding of the compound to negatively charged membrane. 中性あるいは負に帯電した結合成分もまた、バイオ膜からの制御された放出を実現するのに役立つことがある。 Neutral or negatively charged binding component also may help to achieve a controlled release from bio-membranes.
結合成分、炭化水素尾部、およびスペーサ成分またはバイオ作用性成分の間の安定した結合は、場合によっては、本発明が提供する治療上の利益を実現化するために、治療上有効な物質を必要な時間および必要な分量で部位選択的に保持するうえで、本質的となりうるものである。 Binding component, hydrocarbon tails, and a stable bond between the spacer component or bio-acting component, in some cases, in order to realize the therapeutic benefit provided by the present invention, requires a therapeutically active substances in order to regioselectively held at a time and required amount, and can be used as a nature.
結合成分(L)は、本発明の化合物に必要な安定度を与えて、選択した供給部位に目的の治療上の利益を実現するために十分なだけの時間および分量で化合物が存在するように選択しなければならない。 Binding component (L), giving the stability needed for the compounds of the present invention, as the compound is present in the time and quantity of enough to realize the benefits of the purposes of the treatment feed sites selected It must be selected. この目的のために、上記の式Iの化合物の結合成分は、n=0のときにバイオ作用性成分(B)とRおよびR 1の少なくとも一方の間に安定した結合を提供し、さらにn=1のときには、スペーサ成分(R 2 )とRおよびR 1の少なくとも一方との間に安定した結合を提供しなければならない。 For this purpose, the binding component of the compounds of formula I is to provide a stable bond between the at least one bio-acting component (B) of the R and R 1 when n = 0, further n = when 1 must provide a stable bond between the spacer component and (R 2) and at least one of R and R 1. 結合基によって与えられた必要な結合安定性を備える化合物は、治療上有効な脂肪親和性抱合体の直接投与の場合には、保持時間に基づいて決定することができ、あるいは、疾患部位へ抱合体を担体を介して供給する場合には、循環の時間に基づいて決定することができる。 Compounds having the necessary binding stability given by a linking group in the case of direct administration of a therapeutically effective lipophilic conjugates may be based on the retention time, or to the disease site Idaku coalesce when supplying via the carrier may be determined based on the time of circulation. すなわち、治療上有効な本発明の脂肪親和性抱合体の保持時間、あるいは循環時間は、治療上有効な成分の非抱合体形での保持時間あるいは循環時間よりも大きくなければならない。 That is, the holding time of the lipophilic conjugates of therapeutically effective present invention, or circulation time must be greater than the holding time or circulation time in the unconjugated form of the therapeutically active ingredient.
本発明が提供する治療上の利益を実現するうえで、保持時間あるいは循環時間の増大は重要な因子であるが、求める治療上の利益を提供するのに十分な分量の化合物が疾患部位に存在あるいは蓄積することも同様に重要な因子であり、これも本発明の化合物の結合の安定性に依存する。 In order to achieve a therapeutic benefit provided by the present invention, although the increase in retention time or circulation time is an important factor, present in sufficient quantity of the compound is a disease site to provide a therapeutic benefit to seek or is an important factor as well be stored, which also depends on the stability of the binding of the compounds of the present invention.
保持時間あるいは循環時間の決定は、特に以下の例9、10、および12に例示するように、技術に精通する者に周知の様々な方法で実施することができる。 Determination of retention time or circulation time, particularly as exemplified in the following examples 9, 10 and 12, can be implemented in various ways well known to those skilled in the art. 求める効果を生じるために必要な本発明の治療上有効な脂肪親和性抱合体の分量の決定は、しばしば治療薬にあてはまるように、特別な方法によらない。 Determination of amount of therapeutically active lipophilic conjugates of the present invention required to produce the effect of obtaining, often as apply to the therapeutic agent, it does not depend on a special way. 本発明の実施時に用いられる治療上有効な物質の多様性、それによって治療することが可能な数多くの疾患の状態、そして治療を受ける患者の状態の変動のため、必然的にこうならざるをえない。 Diversity implementation therapeutically active substances for use when the present invention, forced not thereby of a number of diseases that can be treated state and for variations in the patient's condition to be treated, inevitably this Absent. したがって、本発明による治療を受けている患者の反応を周期的に監視し、疾患部位における治療上有効な物質の存在量あるいは蓄積量が、求める治療効果を生じるのに十分であるかどうかを決定する必要がある。 Therefore, the response of patients treated with the present invention periodically monitors, determine the abundance or accumulated amount of therapeutically active substances in the disease site, whether it is sufficient to produce a therapeutic effect of obtaining There is a need to.
本発明の化合物は、生存可能な細胞あるいは他の生体適合粒子の外側の膜に、生存可能性に対して初期の有害な作用を及ぼすことなく結合させるように作成することができ、または、即時あるいは遅延させた細胞増殖抑制性または細胞毒作用を及ぼすように作成することができる。 The compounds of the invention, the outer membrane of viable cells or other biocompatible particles, can be created to couple without exerting an initial detrimental effect on viability, or immediate or may be made to exert a cytostatic or cytotoxic effect is delayed. 細胞毒バイオ作用性成分による細胞毒性の範囲を決定するためには、例えば、細胞を本発明の化合物に対して、細胞毒と抱合体をなしていない化合物や濃度ゼロを含む様々な濃度でさらす。 To determine the extent of cytotoxicity by cytotoxic bio acting components are, for example, to the compound of the present invention the cells are exposed at various concentrations, including a compound or zero concentration that does not make the cytotoxic conjugate . その後、細胞をトリパンブルー、またはヨウ化プロピジウムにさらす(F.Celadaら、 Proc.Natl.Acad.Sci.57 :630(1967))。 The cells are then exposed to trypan blue or propidium iodide, (F.Celada et, Proc.Natl.Acad.Sci, 57:. 630 ( 1967)). これらの色素は、生存する細胞から正常に除去され、死んだ細胞の膜だけを透過する。 These dyes are normally removed from the cells that survive, it transmits only membrane of dead cells. 適切な培養時間ののち、顕微鏡あるいはフロー細胞計によって細胞を検査し、染色された細胞の割合(死亡率)を測定する。 After a suitable incubation time, it examines the cells by microscopy or flow cytometer, measuring the percentage of stained cells (mortality).
本発明の化合物の担体細胞への結合も、担体として標的への供給を実施する能力にとって重要な細胞の機能に対し、感知できるような有害な作用を及ぼさない。 Also binding to the carrier cells of the compounds of the present invention, with respect to important cellular functions for ability to implement the supply of the target as a carrier, it does not adversely effect as appreciable. 例えば、一定の適用の実施にとって、担体細胞が適切に分割することが重要であることがある。 For example, for the implementation of certain applications, it may be important that the carrier cells to properly divide. 一方、分割能力あるいは、期待する適用に対して細胞に必要な他の能力に何の作用も及ぼさないようないくつかの機能を、使用する化合物が変化させることがある。 On the other hand, division capability or several functions, such as add no effect on other capabilities necessary for cell for applications that expect sometimes compounds used vary. したがって、このような化合物は、本発明における使用目的のための細胞の機能に対して、感知しうる有害な作用を及ぼさないとみなすことができる。 Thus, such compounds can be regarded as to the function of the cells for the intended use in the present invention, do not adversely effect appreciable. 本発明の化合物によって生じる、本発明の実施に対して重要性をもちうる細胞機能への作用を測定する方法については、米国特許番号4、859、584、SlezakとHoran、 Blood74 :2172〜77(1989)とJ. Caused by the compounds of the present invention, for the method for measuring the effect on rice can cellular function of the importance to the practice of the present invention, U.S. Patent No. 4,859,584, Slezak and Horan, Blood, 74: 2172~ 77 (1989) and J. Immunol. Immunol. Meth. Meth. 117 :205−14(1989)に記述されている。 , 117: are described in 205-14 (1989). 本発明の化合物を再現可能な形で、求める細胞機能に有害な作用を生じることなく標的または担体細胞の形質膜に結合するために細胞結合手段を選択する場合は、二つの基準を満たす必要がある。 Reproducibly form a compound of the present invention, when selecting a cell binding means for binding to the plasma membrane of target or carrier cells without causing adverse effects to determine cell function, it must meet two criteria is there. 細胞結合手段は、(i)化合物を結合する生体適合粒子に対して等張であり、収縮または腫脹を起こさず、細胞に損傷を与えることがないように等浸透圧性濃度(哺乳類細胞の場合およそ260〜340mOsモル)である必要があり、さらに(ii)本発明の化合物が、細胞の形質膜内に一定の濃度で結合できるように溶解可能であることが必要である。 Cell coupling means, (i) a isotonic to biocompatible particles to bind compounds, without causing contraction or swelling, if approximate isotonic concentration (mammalian cells so as not to damage the cells must be 260~340mOs mol), further (ii) a compound of the present invention, it is necessary to be dissolvable so that it can be coupled with a constant concentration to the plasma membrane of a cell. 可溶解性時間経過実験(米国特許番号4、783、401、M.Melnicoffら、J.Leuk.Biok.、43:387〜397(1988))は、部分的にのみ水溶性、形質膜に安定に結合するように作用する化合物は、イオン溶液(例えばリン酸塩緩衝食塩水、培地など)に溶解させたときに沈澱しうるようなミセルあるいは凝集物のどちらか一方を形成する傾向をもち、形質膜内への化合物の結合の減少、あるいは望ましくない不規則な結合を生じることを示した。 Yes Solubility time course experiments (U.S. Patent No. 4,783,401, M.Melnicoff et, J.Leuk.Biok, 43:. 387~397 (1988)) is only partially water soluble, stable in plasma membrane compounds that act to bind to has a tendency to form either an ionic solution (e.g., phosphate buffered saline, culture medium, etc.) micelle or aggregate as may precipitate when dissolved in, decrease in binding of the compound to the plasma membrane, or undesirable showed that results in irregular bond.
放射性同位元素化合物についての同様な実験方法を適用することが可能であり、化合物の安定性は、ベータあるいはガンマ計数器を用いて測定することができる。 It is possible to apply a similar experimental method of radioisotopes compounds, the stability of the compounds can be measured using a beta or gamma counter. あらゆる場合に、各時点における前記等浸透圧溶液の上澄み液中の本発明の化合物の分量を、エタノールを溶媒として用いたこのような化合物の試料と比較することで、標識細胞には適切ではないが、化合物の最大溶解度に対しては役に立つ(全体として)。 In all cases, the amount of compound of the present invention the supernatant liquid of the iso-osmotic solution at each time point, ethanol is compared with a sample of such compound used as a solvent, not suitable for labeling cells but useful for maximum solubility of the compound (as a whole).
細胞の形質膜に結合する本発明の化合物の適切な濃度の決定には、化合物によって生じる目的の作用、化合物を結合させる細胞の種類を含む、いくつかの因子を考慮しなければならない。 To determine the appropriate concentration of the compounds of the invention to bind to the plasma membrane of cells, the action of the object caused by the compound, including the type of cells to bind the compound must be taken into account several factors. 一般に、最初の目的は、できるだけ多くの治療薬を細胞膜内に結合させることである。 In general, the first objective is to make as much of the therapeutic agent bound to the cell membrane. これは、治療化合物を疾患部位に直接供給すること、あるいは治療化合物をex vivoで細胞に結合させ、修正した細胞をin vivoで再導入することによって実現することができる。 This therapeutic compounds can be fed directly to the disease site, or a therapeutic compound bound to cells in ex vivo, and modified cells can be achieved by re-introduced in vivo. 細胞の形質膜内への治療薬の結合を最大化することによって、相対的に少ない投与量を投与すること、あるいは目的の位置に到達して目的の作用を与えるために必要な担体細胞の数を少なくすることが可能になる。 By maximizing the binding of the therapeutic agent to the plasma membrane of a cell, the number of carrier cells required to give effect purpose of reaching the position of administering, or object of relatively small doses it is possible to be reduced. 細胞を介した治療薬の供給の場合、細胞内に結合した化合物の分量は、細胞の生存能力あるいは細胞が目的の位置に移動する能力に関して、担体細胞に負の変化がまったく見られないような程度にまでのみ増大させる必要がある。 For the supply of therapeutic agent through the cells, amount of compound bound to the cells, for their ability viability or the cells in the cell is moved to the desired location, such as a negative change in the carrier cells are not observed at all it is necessary to increase only to the extent.
本発明の化合物は、血清および他の脂肪を含む物質の非存在下で担体細胞あるいは他の生体適合粒子に適用する。 The compounds of the present invention is applied to the support cells or other biocompatible particles in the absence of a substance containing serum and other fats. 細胞を身体から分離、あるいは培養から取り出し、血清を含まないように洗浄する。 Separating the cells from the body, or removed from the culture and washed free of serum. 等浸透圧調整薬を含む組成を形成させるために、それらを通常はイオン溶液以外に、本発明の化合物の適切な濃度(10 -5から10 -7 M)で懸濁する。 To form a composition comprising an isotonic adjusting agents, they usually other than ionic solution, suspended in a suitable concentration of the compounds of the present invention (10 -5 to 10 -7 M). 化合物の細胞への結合は、通常は10分以内に完了し、自系または異種の血清を付加することによって結合反応が停止する。 Binding to cellular compounds, usually completed within 10 minutes, the binding reaction is stopped by the addition of serum autologous or heterologous. 次に、血清を含む媒質中(5〜10% v/v)で細胞を洗浄し、適用に応じて培養に配置するか、あるいは受容者に注入する。 Then, serum cells were washed with medium containing (5~10% v / v), or placed in a culture depending on the application, or injected into the recipient.
ここで記述した種類の化合物の細胞への結合法は、米国特許番号4、783、401に詳細に記述されており、その開示の全体は、ここで完全に記述しているが、引例によって本明細書に統合されている。 Binding method to cells types of the compounds described herein, are described in detail in U.S. Patent No. 4,783,401, the entire disclosure is herein are fully described, the by references It is integrated in the specification.
他の細胞結合法には、本発明の化合物を食塩水に懸濁してミセルを形成させることが含まれる。 Other cell binding method, the compounds of the present invention involves the formation of micelles suspended in saline. 次に、その懸濁液に細胞を入れると、食作用細胞(例えば、単球、マクロファージ、好中球)だけが優先的に標識される。 Next, put a cell suspension, phagocytic cells (e.g., monocytes, macrophages, neutrophils) only is labeled preferentially. この方法で、本発明の化合物を食作用細胞に選択的に向かわせることができる。 In this way, the compounds of the present invention can be selectively directed to the phagocytosis cells. M. M. Melnicoffら、 J. Melnicoff et al., J. Leukocyte Biol. Leukocyte Biol. 43 :387〜97(1988)。 , 43: 387-97 (1988).
本発明の化合物、組成、方法の代表的な適用について、特定の薬物療法に関して以下に記述する。 The compounds of the present invention, the composition, for a representative application of the method, described below with respect to a particular drug therapy.
V. V. 本発明の化合物の使用法A. Use of the compounds of the present invention A. 一般治療法1. General treatment 1. 同位体治療への適用脂肪を含む生体適合粒子の脂肪成分の中と、放射性で高い線エネルギー付与(LET)を放出するキレートイオンに対して結合する能力をもっていることから、疾患部位に放射線治療を提供するために本発明の化合物を使用することができる。 And in the fat component of biocompatible particles including application fat to isotope therapy, since it has the ability to bind to a chelating ion that emits high linear energy transfer with radioactive (LET), radiation therapy to the site of disease It may be used compounds of the present invention to provide. キレート化した本発明の化合物と適切な放射性イオン(例えば、 67 Cu、 90 Y、 186 Re、α線放出体)の安定した錯体を最初に形成し、錯体を分離し、上述した通常の細胞結合法を実施することによって、細胞を本発明の化合物で標識する。 The compounds of the present invention chelated with an appropriate radioactive ion (e.g., 67 Cu, 90 Y, 186 Re, α -emitting body) first forming a stable complex, separating the complex, normal cell binding described above by implementing the method, to label cells with a compound of the present invention.
腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を原発病巣から分離し、IL−2中で拡大し、上述したように放射線治療物質に結合させ、静脈内に注入する。 Tumor infiltrating lymphocytes (TIL) isolated from a primary lesion, expanded in IL-2, is coupled to a radiotherapeutic substance as described above, it is injected intravenously. 標識した細胞は転移性疾患の部位を追跡し、転移性腫瘍細胞を殺す放射線を放出し、それによってTILの治療効果を増大させ、さらに、おそらく疾患の軽減の達成に必要な細胞数を低減する。 Labeled cells tracks the sites of metastatic disease, radiation to kill metastatic tumor cells releases, thereby increasing the therapeutic effect of TIL, further, possibly reducing the number of cells required to achieve relief of disease . 同様に、転移性部位に移動する他の種類の細胞を、局所的な放射線治療の供給に利用することができる。 Similarly, other types of cells that migrate to metastatic sites may be utilized to supply the local radiation therapy.
2. 2. 細胞膜に特異的蛋白質を結合することによる細胞の標的化他の実施例では、本発明の化合物は、その内部に蛋白質、糖蛋白、リポ蛋白、あるいはペプチドを含む蛋白様物質を、バイオ作用性成分として結合させる。 In targeting another embodiment of a cell by combining the specific protein in the cell membrane, the compounds of the invention, internal to the protein that, glycoproteins, lipoproteins, or proteinaceous substance comprising a peptide, Bio-acting component to bind as. これらの化合物を上記に記述したように細胞に結合させ、それに加えて、前記化合物の炭化水素鎖を形質膜内に包埋し、それによって特異的な細胞型の表面に蛋白質を配置する。 These compounds are bound to cells as described above, in addition, embedded a hydrocarbon chain of the compound into the plasma membrane, placing it by specific cell types protein on the surface of the.
上述の方法を、ヒトのフィブリンに対する単クローン抗体を例えば赤血球などの担体細胞表面に結合させ、フィブリン凝塊部位へ供給するために使用することができる。 The above-described method, to bind the monoclonal antibody to fibrin human carrier cell surfaces, such as for example red blood cells, can be used to supply to the fibrin clot site.
同様な方法を、ヒトの細胞表面の腫瘍抗原の単クローン抗体を例えば単球またはリンパ球などの担体細胞を介して腫瘍部位に供給するために使用することができる。 Similar methods can be used to supply to the tumor site via a carrier cell, such as a monoclonal antibody of the tumor antigen of the human cell surface such as monocytes or lymphocytes. 担体細胞(例えば赤血球)表面へ適用することによって、組織のプラスミノゲンアクチベータを同様に供給することができる。 By applying to the support cells (e.g., erythrocytes) surface can be supplied in the same manner the plasminogen activator of the tissue.
必要な場合は、上述の治療を組み合わせて使用することができる。 If necessary, it can be used in combination therapy described above. したがって、ヒトのフィブリンに結合する単クローン抗体を細胞(例えば赤血球)の表面に結合し、次にそれをさらにフィブリン溶解化合物(例えばtPA、スト プトキナーゼ、ウロキナーゼ)に結合させることができる。 Thus, monoclonal antibodies that bind to human fibrin bound to the surface of cells (e.g. red blood cells), then further fibrinolytic compound it (e.g. tPA, strike Putokinaze, urokinase) can be attached to. 単クローン抗体は、担体細胞のフィブリンへの結合と、結合後に多数の治療用フィブリン溶解化合物を供給することを可能にする。 Monoclonal antibodies allows the binding to the carrier cells fibrin, to supply a large number of therapeutic fibrinolytic compound after binding.
これらの治療上有効な蛋白質を、上述の一般的な調整法に従って、脂肪親和性発色団に抱合体させることができる。 These therapeutically effective proteins, according to the general preparation method described above can be conjugated body lipophilic chromophore.
上述の技法は、様々な他の治療上有効な蛋白質あるいはペプチドを、細胞、ウイルス、リポソームまたはLDLなどの適切な生体適合粒子に結合させ、それによって循環内における蛋白様物質の生物学的利用能を大きく引き伸ばすために使用することができる。 Above techniques, a variety of other therapeutically effective proteins or peptides, cells, viruses, bound to a suitable biocompatible particles, such as liposomes or LDL, bioavailability of proteinaceous material in the circulation thereby it can be used to stretch significantly.
蛋白質結合生体適合粒子は、放射性画像化化合物、あるいは磁気共鳴画像化化合物を用いて上述のように同位元素によって標識することができる。 Protein binding biocompatible particles can be labeled by isotopes, as described above with a radioactive imaging compounds or the magnetic resonance imaging compounds. その結果として生じたバイオ粒子を患者に注入し、それによって細胞を疾患部位に移動させ、標準的なガンマシンチグラフィまたは核画像化を用いて画像化し、治療薬の効果を評価することができる。 The resulting bio particles injected into the patient, thereby moving the cells into the disease site, and imaged using standard gamma scintigraphy or nuclear imaging, it is possible to assess the effect of therapeutic agents.
3. 3. ワクチンのための細胞への蛋白質の結合本発明の他の適用では、それに対して保護的な抗体生成が望まれるような、蛋白質、糖蛋白、リポ蛋白あるいはペプチドでありうる抗原を、任意に結合基を含み、細胞(例えば赤血球、単球)の表面に結合させるためバイオ作用性成分として利用する。 In another application of the coupling present invention protein into cells for vaccines, such as protective antibodies produced are desired contrast, protein, glycoprotein, an antigen can be a lipoprotein, or a peptide, attached to any It includes groups, used as bio-acting components for binding to the surface of cells (e.g. erythrocytes, monocytes). このように修正した細胞を、抗原性補強剤の存在下および非存在下で注入する。 Such modified cells to be injected in the presence and absence of antigenic reinforcing agent. 注入の時間間隔は抗原の性質に依存するが、一般的には、2週間を下回らない各時間間隔ごとに10 6の細胞を注入することができる。 Time interval of the injection depends on the nature of the antigen, but generally, it is possible to inject 10 6 cells at each time interval of not less than 2 weeks.
抗原に対する抗体濃度を、標準的なElisa法によって監視する。 Antibody concentrations for the antigen is monitored by standard Elisa technique. 細胞免疫濃度は、免疫化細胞への増殖あるいは細胞毒反応を求めることによって測定することができる。 Cell immunity concentration can be measured by determining the proliferation or cytotoxic responses to immunizing cells.
4. 4. 細胞表面の修正による移動形態の変更この手法の他の適用では、本発明の化合物を用いて、シアリン酸またはグリコサミノグリカンを細胞の形質膜に結合することができる。 In other applications of changing movement form by modification of cell surface this approach, using the compounds of the present invention, sialic acid or glycosaminoglycans can be bound to the plasma membrane of cells. 特異的な化合物を上述のように等浸透圧媒質に入れる。 Specific compounds placed in isotonic medium quality, as described above. 例えば赤血球を溶液の中に入れると、形質膜への化合物の結合が生じる。 For example, placing the red blood cells in a solution, resulting binding of compounds to the plasma membrane. 血清の付加によって反応を停止させ、その後媒質を含む食塩水で細胞を洗浄し、注入の準備が完了する。 The reaction by the addition of serum to stop, then the medium the cells were washed with saline containing preparation for injection is completed.
赤血球は循環の中を移動し、未成熟細胞の間は、その表面に多量のシアリン酸を備えている。 Red blood cells moving through the circulation during the immature cells has a large amount of sialic acid on the surface thereof. 赤血球が成長するに従って、細胞当たりのシアリン酸の分量が減少して、脾臓および肝臓のマクロファージが赤血球の膜の抗原を認識できるようになり、それによってそれらを循環から取り除く。 According erythrocytes grows, it reduces the amount of sialic acid per cell, spleen and liver macrophages able to recognize antigens of the membrane of red blood cells, thereby removing them from circulation. 赤血球の膜内に結合するシアリン酸の分量を適切に増大させることにより、循環の中での赤血球の寿命を延ばすことができる。 By increasing the amount of sialic acid bound to the membrane of red blood cells properly, it is possible to extend the life of red blood cells in the circulation. 赤血球の寿命を延ばす能力は、移植患者あるいは貧血患者にとって有益となりうる。 The ability to extend the life of the red blood cells can be beneficial to transplant patients or anemic patients. 骨髄移植患者が移植を受けたときには、彼ら自身の赤血球を製造できるようになるまでに数週間を要する。 When a bone marrow transplant patients has received a transplant, it takes a few weeks to be able to manufacture their own red blood cells. 彼ら自身の赤血球の寿命を延ばすためにこの手法を用いることによって、必要な場合には、貧血を起こすことなく患者は複数回の骨髄移植を受けることができる。 By using this technique to prolong their own red blood lifetime, if necessary, the patient without causing anemia may receive multiple bone marrow transplantation.
貧血のある個体の場合、貧血は赤血球の寿命の低下、または赤血球の生産率の低下によって貧血が起こることがある。 For a anemia individuals, anemia may anemia caused by reduced reduction, or erythrocytes production rate of the life of the erythrocytes. どちらの場合でも、赤血球の寿命を延ばすことによって貧血が減少する。 In either case, anemia is reduced by extending the life of the red blood cells.
5. 5. 治療作用のための光力学化合物の供給癌を治癒させるための光力学治療は、熱心な研究が行われている領域である(Proceedings of SPIE−The International Society for Optical Engineering;Volume 847、”New Directions in Photodynamic Therapy”Douglas C.Neckers、Editor;(October 1987))。 Photodynamic treatment to cure the supply cancer photodynamic compounds for therapeutic action is an area of ​​intense research has been conducted (Proceedings of SPIE-The International Society for Optical Engineering; Volume 847, "New Directions in Photodynamic Therapy "Douglas C.Neckers, Editor; (October 1987)). これらの化合物の多くは、フタロシアニン類またはヘマトポルフィリン類である。 Many of these compounds are phthalocyanines or hematoporphyrin compound. すべて600〜800nmの領域の光を吸収し、その過程で励起状態の酸素を生成する。 All absorb light in the region of 600 to 800 nm, producing oxygen in an excited state in the process.
本発明の方法論を用いて、化合物の脂肪親和性誘導体を作成し、次に等浸透圧溶液中に溶解させる。 Using the methodology of the present invention, creates a lipophilic derivative of a compound, it is then dissolved in iso-osmotic pressure solution. 腫瘍選択的細胞(例えばTIL)をこれらの化合物で標識し、細胞を患者に注入する。 Tumor selective cells (e.g., TIL) labeled with these compounds, to inject the cells into the patient. その後腫瘍選択的細胞は微小転移巣部位へ移動する。 Thereafter tumor selective cells migrate to micrometastases site. 48時間以内に、光力学分子が吸収する領域の強い光線に患者をさらし、生成した励起状態の酸素が腫瘍細胞を殺す。 Within 48 hours, exposing the patient to the strong light of the region photodynamic molecule absorbs oxygen of the generated excited state kill tumor cells. さらに、担体細胞も殺されて炎症を生じ、それによって死んだ細胞を除去するためにさらに多くの免疫細胞が集まり、腫瘍に対する毒性が高まる。 Furthermore, the carrier cells are also killed cause inflammation, more immune cells gather, toxicity increases to a tumor in order to remove dead cells by it. 光力学作用を供給するこの方法では、担体細胞は、腫瘍部位へ治療薬を選択的により多く蓄積する必要がある。 In this method of supplying photodynamic action, the carrier cells, it is necessary to selectively more accumulate therapeutic agents to the tumor site. 一部の例では、体腔内(例えば胸膜腔)における腫瘍沈着への本発明の化合物の直接的な適用は部位への保持を補助し、手術時にさらに有効な体腔内照射治療を可能にする。 In some cases, direct application of the compounds of the present invention to a tumor deposits within a body cavity (e.g., pleural cavity) may assist in the retention of the site, enabling more effective body cavity irradiated treatment at the time of surgery.
B. B. 治療上有効な物質の直接供給による特異的疾患あるいは病的状態の治療1. Treatment of a specific disease or pathological condition by direct supply of therapeutically active substances 1. 血管形成術後の再閉塞および再狭窄連続的な血流の存在下であっても、人工的表面だけでなく、局所的血管部位に本発明の化合物を保持できることが実験的に示された(以下の例8および12を参照)。 Even in the presence of reocclusion and restenosis continuous blood flow after angioplasty, as well as artificial surfaces, it can hold the compounds of the present invention topically vascular site was shown experimentally ( reference to the following examples 8 and 12). さらに、治療上有効な物質で構成される本発明の化合物中で生物学的作用を保持できることが、in vitroおよびin vivoで示された(以下の例4、13および15を参照)。 Further, (see the following examples 4, 13 and 15) in the compounds of the present invention can hold the biological action, indicated by in vitro and in vivo consists of therapeutically active substances.
動物モデル系の研究によって、血管形成術後の再狭窄を引き起こす一次的細胞増殖と移動は、血管形成術後およそ7〜21日以内に起こることが明らかになった。 The animal model systems studied, move primary cell proliferation causing restenosis after angioplasty has revealed that occur within approximately 7-21 days after angioplasty. したがって、この発生を防ぐためには、血管形成術後7〜10日目まで修復した動脈の平滑筋細胞に抗増殖薬を保持する必要がある。 Therefore, in order to prevent this occurrence, it is necessary to hold the anti-proliferative drug in smooth muscle cells of arteries repaired to 7-10 days after angioplasty. 適切な抗増殖薬で構成された本発明の化合物を血管形成術後に損傷した血管壁に供給し、化合物に抱合させた非増殖薬を損傷した細胞に保持させることができる。 The compounds of the present invention configured with a suitable anti-proliferative agents is supplied to the vessel wall is damaged after angioplasty, it can be held in the damaged cells of non-proliferative agents which is conjugated to the compound. このように、大きな投与量の抗増殖薬を損傷した細胞に直接提供することができ、本発明の化合物を用いることによって、全身性の薬物供給の場合よりも長い時間にわたって損傷した部位に保持することができる。 Thus, it is possible to provide directly to a large dose of damaged cells antiproliferative agents, by using the compounds of the present invention, to hold the site of injured for longer than in the case of systemic drug delivery be able to. 例えば、血管形成術において、薬物供給カテーテルによる抗増殖薬の直接の沈着は、血管形成術の部位の細胞膜に薬物を結合させることを可能にするのに対し、結合していない薬物はすべて、手術中に動脈から流れてしまう。 For example, in angioplasty, the direct deposition of anti-proliferative agent by drug delivery catheter, whereas it possible to bond the drug to the cell membrane of the site of angioplasty, all drug unbound surgery It will flow from the artery in. カテーテルを取り除いても、休止細胞に結合した薬物は外側膜にとどまるか、あるいは間隙空間を移動して深い細胞層に到達する。 Be removed catheters, drug bound to resting cells will reach or remain in outer membrane, or deep cell layer by moving the gap space. これらの細胞が活動あるいは成長状態になった場合は、膜成分が内部に動くに従って本発明の化合物は細胞内に移動する。 If these cells became active or growth state, the compounds of the present invention as the film component moves inside moves into the cell. 一度細胞内に入ると、その抗増殖作用を発揮することが可能になる。 Once inside the cell, it is possible to exert its anti-proliferative effect. したがって、適切な抗増殖薬で構成される本発明の化合物を主として疾患部位に供給し、肝臓あるいは腎臓で一度に処理される薬物の分量を最小にして、重大な副作用の発生を抑えることができる。 Therefore, mainly supplied to the disease site of a compound of the present invention consists of a suitable anti-proliferative agents, the quantity of medicament to be processed at a time in the liver or kidney with minimal, it is possible to suppress the occurrence of serious side effects .
好ましい実施例においては、血管形成術後の再狭窄の治療に有効な本発明の化合物は、ヘパリン、ヒルジン、コルヒチン、ビンカアルカロイド、タキソールおよびその誘導体などの抗増殖薬で構成される。 In a preferred embodiment, the compounds of the invention effective in the treatment of restenosis following angioplasty heparin, hirudin, colchicine, and antiproliferative agents vinca alkaloids, such as taxol and its derivatives. 培養中の平滑筋細胞へのヘパリンの適用、あるいは動脈損傷後の動物への投与は、成長の低下と、筋内膜の肥厚化および細胞増殖の低減を引き起こす。 Application of heparin to smooth muscle cells in culture, or administration to animals after arterial injury causes a decrease in growth, the reduction in thickening and cell proliferation endomysium. ヘパリンで構成される本発明の化合物は、一つあるいはそれ以上の細胞壁成分との間の疎水性相互作用によって、これらの細胞内部に取り込まれるよりも、内側動脈壁の外側細胞膜上にとどまるように構成される。 The compounds of the present invention composed of heparin, by hydrophobic interactions between the one or more cell wall components, than is taken into these cells, to remain on the outer cell membrane of the inner arterial wall constructed. これとは対照的に、チューブリン過程を妨げるコルヒチンのような抗増殖薬は、その抗増殖作用を及ぼすためには、細胞内に取り込まれる必要がある。 In contrast, antiproliferative agents such as colchicine interfering with tubulin processes, in order to exert its antiproliferative action needs to be taken up into cells. この例においては、内側壁の動脈細胞内に急速に内在化できるように本発明の化合物を合成することが好ましい。 In this example, it is preferable to synthesize the compounds of the present invention can be rapidly internalized into the artery cells of the inner wall. 好ましい実施例では、酸で切断可能な抱合体として本発明の化合物のバイオ作用性成分でコルヒチンが構成される。 In a preferred embodiment, colchicine is composed of bio-acting component of the compounds of the present invention as cleavable conjugate acid. コルヒチンは、その抱合体の形では不活性である。 Colchicine, in the form of its conjugate is inactive. しかし、細胞内酸小胞内への化合物の取り込みは、化合物からの薬物の放出を引き起こし、それによって活性化する。 However, incorporation of a compound into cells in acid vesicles causes the release of the drug from the compound, thereby activating. したがって、活性コルヒチンは、その作用部位の細胞内に供給され、その部位のチューブリン過程を阻止し、それによって細胞分割を阻止する。 Thus, the active colchicine is delivered to the cells of the site of action, it prevents tubulin process of the site, thereby preventing cell division.
本発明での使用に特に好ましいものは、次の式で与えられるような、コルヒチンを含む酸で切断可能な化合物である: Particularly preferred for use in the present invention, as given by the following equation, it is a cleavable compounds with an acid containing colchicine:
他の有効なコルヒチンを含む化合物は、次の式で与えられる: Compounds containing other active colchicine is given by the following formula:
本発明の実施での使用を考慮した他の抗増殖薬には以下の薬物が含まれる:アンギオテンシン変換酵素(ACE)抑制因子、アンギオペプチン、シクロスポリンA、カルシウムチャンネル遮断薬、ヤギ−抗ウサギ血小板由来成長因子抗体、Terbinafine、Trapidil、インターフェロンγ、および陽イオン成長因子の結合のための重陰イオン。 Other anti-proliferative agents in consideration of use in the practice of the invention include the following drugs: angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors, angiopeptin, cyclosporin A, calcium channel blockers, goat - anti-rabbit platelet derived growth factor antibody, terbinafine, Trapidil, heavy anion for binding of interferon gamma, and cationic growth factors.
2. 2. 慢性関節リウマチ本発明の化合物は、慢性関節リウマチの治療に特に適している。 Compounds of rheumatoid arthritis present invention is particularly suitable for the treatment of rheumatoid arthritis. それらは、リンパ節、脾臓あるいは肝臓に対して顕著な全身性の放出を行うことなく、関節への大量の治療薬の保持を可能にするための、化学あるいは放射線滑膜切除を実施する手段を提供する。 They lymph nodes, spleen or without significant systemic release on the liver, to enable retention of a large amount of the therapeutic agent into the joint, a means for conducting a chemical or radiation synovectomy provide. あらゆる現存の供給システムに対する大きな利点は、本発明の化合物を治療を必要とする組織自体に均一に供給し、これらの細胞に保持することである。 Great advantage to the feed system of any existing, the compounds of the present invention was uniformly supplied to the tissue itself in need of treatment is to keep these cells. 本発明の放射線治療用化合物の場合、化合物から放出された放射能が、滑膜の細胞に治療効果を引き起こす。 For radiotherapeutic compounds of the present invention, the radioactivity released from the compound, causing a therapeutic effect on synovial cells. 下記の例に詳細を記述するように、基本的に身体中のすべての化合物が治療を行った関節に見出され、注入した化合物の約70%が6日目にそこにとどまっていた。 As described in detail in the following Examples are found in essentially joints all compounds in the body were treated, about 70% of the injected compound had stayed there on day 6. この局所的で長期の保持は、それぞれの放射線滑膜切除術に必要な放射性同位元素量を低減し、従来の治療で、関節から放出された放射性同位元素に全身的にさらされることによって起こる副作用を低下させる。 The local and long-term retention, side effects reduced radioisotope amount required for each of the radiation synovectomy, in conventional treatment, caused by exposure systemically radioisotope released from the joint reduce the.
放射線滑膜切除に特に好ましい本発明の放射線治療化合物は、以下に例示するように、適切な放射性同位元素に結合させて合成することができる。 Radiotherapeutic compounds particularly preferred present invention to radiation synovectomy, as exemplified below, it can be synthesized by binding to a suitable radioisotope. 例えば、(1)窒素と硫黄を含むキレート、あるいは(2)窒素と酸素を含むキレートのどちらか一方と放射性金属で錯体を構成する。 For example, to configure the complex chelates, or (2) in either the chelating radioactive metals containing nitrogen and oxygen containing (1) a nitrogen and sulfur. 放射性同位元素は、放射性のハロゲン、銅、イットリウム、ロジウム、パラジウム、インジウム、ヨウ素、サマリウム、ガドリニウム、ホルミウム、エルビウム、イッテルビウム、ルテチウム、レニウム、金、あるいはそれらの組み合わせで構成される群から選択することができる。 Radioisotope comprises selecting radioactive halogen, copper, yttrium, rhodium, palladium, indium, iodine, samarium, gadolinium, holmium, erbium, ytterbium, lutetium, rhenium, gold or from the group consisting of a combination thereof, can.
本発明に使用する好ましい化合物は次の式で与えられる: Preferred compounds for use in the present invention is given by the following equation:
ここでL、R、R 1 、およびR 2は上記の式Iで定義したものである; Wherein L, R, R 1, and R 2 are as defined above for formula I;
ZはHまたは金属配位位置を表す; Z represents H or a metal coordination sites;
ここでそれぞれのR'は、独立に水素原子、あるいはアルキル基、好ましくは低いアルキル基、あるいは置換された低いアルキルで、ここで置換基はあらゆるエステルにすることができ、R"および Wherein each R 'is independently a hydrogen atom or an alkyl group, preferably a lower alkyl group or with substituted lower alkyl, wherein the substituents can be in any ester, R "and
は独立に水素原子あるいはアルキル基で、mおよびnはそれぞれ0または1にすることができる;さらに、Mは、レニウム、インジウム、銅、およびパラジウムで構成される群から選択する放射性金属を表す。 Is independently a hydrogen atom or an alkyl group, m and n can each be 0 or 1; and, M represents rhenium, indium, copper, and the radioactive metal selected from the group consisting of palladium.
好ましい実施例では、上記の式VIIIの化合物は次の式で与えられる: In a preferred embodiment, the compound of formula VIII above is given by the following equation:
ここでRおよびR 1は、1個から約30個の炭素原子を備える炭化水素置換基である;XおよびX 1は同一または異なる値にすることができ、O、S、C(CH 32あるいはSeを表す; Wherein R and R 1 is a hydrocarbon substituent from 1 comprising from about 30 carbon atoms; X and X 1 may be the same or different values, O, S, C (CH 3) 2 or represents an Se;
Aは薬学上許容することができる陰イオンを表す; A represents an anion capable of acceptable pharmaceutical;
ZはHあるいは金属配位位置を表す; Z represents H or a metal coordination sites;
ここでそれぞれのR'は独立に水素原子あるいはアルキル基、好ましくは低いアルキル基を表し、あるいは置換された低いアルキル基で、置換基はあらゆるエステルにすることができ、R"および Wherein each R 'is independently a hydrogen atom or an alkyl group, preferably represents a lower alkyl group, or in substituted lower alkyl group, the substituent can be any ester, R "and
は独立に水素原子またはアルキル基であり、mとnはそれぞれ0または1にすることができる;Mはレニウム、インジウム、銅およびパラジウムで構成される群から選択する放射性金属を表す。 Is independently a hydrogen atom or an alkyl group, m and n can each be 0 or 1; M represents rhenium, indium, radioactive metal selected from the group consisting of copper and palladium.
本発明で使用する他の特に好ましい化合物は、次の式で与えられる化合物である: Another particularly preferred compound for use in the present invention is a compound given by the following equation:
ここでMは、レニウム、インジウム、銅またはパラジウムなどの放射線治療物質を表す。 Wherein M represents rhenium, indium, radiation therapy agents such as copper or palladium.
他の有効な化合物は次式で与えられる: Other useful compounds is given by:
ここでRおよびR 1は、1個から約30個の炭素原子を備える炭化水素置換基である;XおよびX 1は同一または異なる値にすることができ、O、S、C(CH 32またはSeを表す; Wherein R and R 1 is a hydrocarbon substituent from 1 comprising from about 30 carbon atoms; X and X 1 may be the same or different values, O, S, C (CH 3) It represents 2 or Se;
Aは薬学上許容することができる陰イオンを表す; A represents an anion capable of acceptable pharmaceutical;
Mは、銅、テクネチウム、ロジウム、パラジウム、インジウム、サマリウム、ガドリニウム、ホルミウム、エルビウム、イッテルビウム、ルテチウム、レニウム、イットリウム、金、エルビウム、ホルミウムあるいはそれらの組み合わせで構成される群から選択した放射線治療物質を表す;nは2、3あるいは4である;mは1あるいは2である;pは1から6である。 M is copper, technetium, rhodium, palladium, indium, samarium, gadolinium, holmium, erbium, ytterbium, lutetium, rhenium, yttrium, gold, erbium, holmium or radiotherapeutic substance selected from the group consisting a combination thereof It represents; n is 2, 3 or 4; m is 1 or 2; p is 1 to 6.
3. 3. 卵巣癌化学治療薬または放射線治療薬で構成される本発明の化合物は、これらの薬物を卵巣腫瘍細胞増殖部位に高濃度で直接供給することを可能にする。 The compounds of the present invention consists of ovarian cancer chemotherapeutic drugs or radiation therapy agents, these drugs makes it possible to supply directly in high concentrations in ovarian tumor cell proliferation moiety. さらに、治療薬を腹膜腔内に長時間にわたって保持し、それによって腫瘍細胞の散在を阻止する。 Furthermore, the therapeutic agent is held for a long time into the peritoneal cavity, thereby preventing scattered tumor cells. また、これらの薬物の全身的供給システムによる高濃度での投与に伴う顕著な副作用を起こすことなく、これを実現することができる。 Also, without causing significant side effects that accompany the administration of a high concentration by systemic supply system of these drugs, it is possible to achieve this.
本発明の化合物は、手術後の治療としてTenckhoffカテーテルを用いて腹膜腔内に供給することができ、あるいは再側腹開腹術、および手術時の補助治療として供給することができる。 The compounds of the invention may be fed to the peritoneal cavity with a Tenckhoff catheter as a treatment after surgery, or re-flank laparotomy and can be supplied as an adjunct treatment during surgery.
酸切断可能なコルヒチンを含む本発明の化合物は、すでに記述したように、卵巣腫瘍細胞の抗増殖治療にも有効である。 The compounds of the present invention containing an acid cleavable colchicine, as already described, is also effective in antiproliferative treatment of ovarian tumor cells. 上述したように、これらの分子は細胞の外側の膜に非毒性の形でとどまることが期待される。 As described above, these molecules are expected to remain in the form of non-toxic to the outside of the membrane of a cell. しかし、化合物の残りの部分から化学治療薬が切り離されている細胞内に化合物が取り込まれた場合には、化学治療物質がその抗増殖作用を及ぼすことができる。 However, when the compound from the remainder of the intracellular chemotherapeutic agent is isolated compounds were incorporated as a chemotherapeutic substance it can exert its antiproliferative activity.
4. 4. 乾癬コルチコステロイドで構成される本発明の化合物を、乾癬の治療に有効に用いることができる。 The compounds of the present invention consists of psoriasis corticosteroids, it can be effectively used for the treatment of psoriasis. それらは乾癬病変の部位に大量の薬物の保持を提供し、それによって、ケラチノサイトと免疫細胞の増殖を減少する薬物の有効性を高める。 They provide retention of a large amount of the drug at the site of psoriatic lesions, thereby increasing the effectiveness of a drug to reduce the proliferation of keratinocytes and immune cells. さらに、病変部位への本発明の化合物の保持は、毒性をもつ可能性のある化合物を循環系の中に透過させることを防ぐ。 Furthermore, retention of the compounds of the present invention to a lesion site prevents that transmits compounds which may have toxic in the circulatory system. これによって、2週間に及ぶ一連の適用後に、抗増殖薬の高い血清濃度のために治療を停止する必要がなくなるという臨床的な利益を生じる。 Thus, after a series of applications ranging from 2 weeks, resulting in clinical benefit it is not necessary to stop treatment because of the high anti-proliferative drug serum concentration.
本発明の他の適用に従って、アテローム硬化症の初期の検出のために、血小板あるいは低密度のリポ蛋白(LDL)で、アテローム硬化性斑沈着部位を突き止めることができる。 According to another application of the present invention, for the initial detection of atherosclerosis, with platelet or low density lipoproteins (LDL), it is possible to locate the atherosclerotic plaque deposition site. 標準的な勾配法を用いて個体の血液から血小板を分離し、次に、任意の診断成分としてインジウムあるいはテクネチウムで標識し、静脈内に再注入する。 Separating the platelets from the blood of the individual using standard gradient method, then labeled with indium or technetium as optional diagnostic components, reinjected intravenously. ここで記述した種類の化合物を血小板に結合する適切な方法は、米国特許番号4、762、701に記述されている。 Suitable methods of binding the class of compounds described herein to platelets is described in U.S. Patent No. 4,762,701. 次の48時間以内に、動脈壁の斑形成部位に放射標識血小板が蓄積し、ガンマカメラを用いてその部位のガンマ放出を検出することができる。 Within the next 48 hours, radiolabeled platelets plaque formation site of the arterial wall accumulate, it is possible to detect the gamma emission of the site using a gamma camera.
同様に、標準的な超遠心分離法によってLDLを精製し、顕著な脂肪含有量と、生体適合粒子の脂肪領域に対する本発明の化合物の結合親和性を利用して、本発明の化合物で標識する。 Similarly, purified LDL by standard ultracentrifugation, and significant fat content, by utilizing the binding affinity of the compounds of the present invention to fat area of ​​biocompatible particles, labeled with a compound of the invention . これらの放射標識LDLは、再注入後にアテローム硬化斑集中部位に蓄積し、核画像化による検出を可能にする。 These radiolabeled LDL accumulates after reinfusion into atherosclerotic plaques centralized site, allowing detection by nuclear imaging. 単球がアテローム硬化斑に蓄積することも知られており、そのため、その形成の検出に利用することができる;その唯一の限界は、放射標識に適した数の単球を精製する可能性である。 Monocytes are also known to accumulate in atherosclerotic plaque, therefore, it can be used for detection of formation; its only limit is the possibility of purifying the monocytes number suitable for radiolabeling is there.
さらに、血小板が血栓症部位(例えば冠状動脈血栓症、深部静脈血栓症、血管内移植片)と、器官の移植後の急性拒絶反応部位に蓄積することが知られている。 Furthermore, platelet thrombosis site (e.g. coronary thrombosis, deep vein thrombosis, endovascular grafts), and are known to accumulate in acute rejection sites after implantation of organs. したがって、標準的方法によって分離され、本発明の化合物と方法を用いて放射標識された自系血小板もまた、薬物療法と組み合わせて、このような疾患過程の非侵襲的診断を可能にする。 Thus, separated by standard methods, autologous platelets were radiolabeled using the compounds and methods of the present invention may also be combined with drug therapies, which enable non-invasive diagnosis of such disease processes.
さらに、放射性金像イオンに結合させるためにキレートを用いることができるが、上記の式Iの化合物で、放射性同位元素を例えば放射性のヨウ素、炭素、窒素、硫黄、リンまたはセレン原子を分子の構成成分とする蛍光および非蛍光化合物を生成することも可能である。 Furthermore, it is possible to use a chelate for binding to radioactive gold image ions, a compound of formula I, a radioisotope such as a radioactive iodine, carbon, nitrogen, sulfur, structure of the molecule a phosphorus or selenium atom it is also possible to produce a fluorescent and non-fluorescent compound whose components. 放射標識された本発明の化合物を用いた十分なエネルギーのγ線を放出する化合物は、ガンマシンチグラフィを用いて検出することができる。 Compounds releasing sufficient energy γ rays with a compound of the invention as radiolabels may be detected using gamma scintigraphy. 同位元素が低エネルギー非透過ベータ放出元素の場合、標準的なベータ計数法を用いて化合物を研究用に使用することができる。 If isotopes are low energy non-transmissive beta release element can be used compounds for research using standard beta counting.
ビオチン化した本発明の脂肪親和性化合物を、多目的試薬として作用させることができる。 The lipophilic compounds of the present invention a biotinylated, can act as a multipurpose reagent. 例えば、通常は非付着性の細胞を、選択した表面に急速に付着させるためにこれらの化合物を使用することができる。 For example, typically a nonadherent cells can be used these compounds to rapidly adhere to the selected surface. これは、固定化した細胞を必要とするような分析、すなわち単一の細胞を時間的に監視する分析にとって重要である。 It analyzes that require immobilized cells, which is important for the analysis of time monitoring the single cell. 本発明のビオチン化した化合物で細胞母集団を標識すれば、ストレプタビジンに結合する表面に、その結果生じた標識細胞を接触させ、細胞を急速にその表面に付着させる。 If label cells populations in compound biotinylated present invention, the surface to bind to streptavidin, resulting labeled cells are contacted to deposit rapidly the surface of cells. 細胞の分析を直ちに開始することができる。 It can begin analysis of cells immediately. ビオチン化した化合物と結合させた蛍光によって、実験中に細胞を視覚的に監視する便利な手段を提供する。 By fluorescence conjugated with compound biotinylated provides a convenient means of visually monitoring the cell during the experiment.
さらに、蛍光細胞で標識した化合物を、成長する細胞の監視と、蛍光の希薄化による成長速度の測定に利用することができる。 Further, a compound labeled with a fluorescent cell, a monitoring of the growing cells can be used to measure the growth rate by dilution of fluorescence. (米国特許番号4、859、584)。 (US Pat. No. 4,859,584). この方法では、標識化合物の蛍光が自己蛍光にまで減少すると、5〜8倍加時間(細胞の種類による)で感度が低下する。 In this method, a fluorescent labeling compounds when reduced to autofluorescence, sensitivity is reduced by 5-8 doubling time (depending on the type of cells). 蛍光色素を抱合させたストレプタビジンを、例えばビオチン化したシアニンにここに記述したように結合させることにより、蛍光の増幅を実現することができる。 The streptavidin was conjugated to a fluorescent dye, for example by binding as described herein to biotinylated cyanine, it is possible to realize the amplification of fluorescence. この方法によって、色素の蛍光が自己蛍光にまで低下したのちでも、標識細胞を確認することができる。 This method, even after the fluorescence of the dye is lowered to the autofluorescence, it is possible to confirm the labeled cells. さらに高い感度が必要な場合には、ビオチン化した本発明の化合物に対して放射標識ストレプタビジンを結合させることができ、標識細胞を確認するためにオートラジオグラフィを実施することができる。 When higher sensitivity is required, may be able to bind radiolabeled streptavidin for compounds of the present invention a biotinylated, implementing autoradiography to confirm the labeled cells. ビオチン化した本発明の化合物の別の適用は、蛋白質結合である。 Another application of the compounds of the present invention a biotinylated is a protein binding. いくつかの大きな蛋白質の場合、上記の式IIIに示すように、本発明の脂肪親和性化合物に蛋白質を共有結合で結合することによって、蛋白質を細胞に結合させることは不可能である。 For some large proteins, as shown in Formula III above, by combining the protein covalently to lipophilic compounds of the present invention, it is not possible to the protein bound to the cell. このような場合には、別の結合機構として、アビジン−ビオチン結合対がある。 In such a case, as another binding mechanism, avidin - it is biotin binding pair. この目的のために、ビオチン化した本発明の化合物を用いて標的細胞を標識し、大きな蛋白質をアビジン、あるいは適切なアビジンの誘導体、例えばストレプタビジンに抱合させる。 For this purpose, using the compounds of the present invention that was biotinylated labeling target cells, avidin large protein or appropriate avidin derivatives, for example, it is conjugated to streptavidin. 次に、ビオチン化した細胞をアビジン−蛋白質抱合体にさらすことによって、蛋白質が細胞に安定に結合する。 Then, biotinylated cell avidin - by exposing the protein conjugate, the protein is stably bound to the cells.
C. C. 製薬製剤本発明の化合物で構成される製薬製剤は、食塩を含まない等浸透圧溶液、あるいは薬学的に許容可能な液体賦形剤のような適合性生物学的媒質と組み合わせた投与に好都合なように作成することができる。 Pharmaceutical formulations consisting of compounds of the pharmaceutical preparations present invention is advantageous for administration in combination with compatible biological medium, such as iso-osmotic solution, or pharmaceutically acceptable liquid excipient does not contain sodium chloride it can be created as. 後者には、各種の不活性油、例えばオリーブ油やピーナッツ油などの植物油、あるいは高度に生成した鉱物油が含まれる。 The latter include various inert oils such as vegetable oils, such as olive oil or peanut oil, or highly produced mineral oil is contained. 選択した媒質の活性成分の濃度は、化合物の性質、および治療する疾患または病的状態に応じて異なる。 The concentration of the active ingredient for the selected medium, varies depending on a disease or pathological condition nature of the compound, and treat.
製薬製剤を投薬単位形態で構成することが、投与の簡便性、投薬の均一性にとって特に有利である。 It is ease of administration is particularly advantageous for uniformity of dosage constituting a pharmaceutical formulation in dosage unit form. ここで使用する投薬単位形態とは、治療を受ける患者に適合した物理的に分離した製薬製剤単位を指す。 Dosage unit form as used herein refers to physically discrete pharmaceutical formulations units adapted to the patient to be treated. 各投薬単位は、選択した薬剤の担体と結合して、目的の治療効果を生じるように計算した有効成分量を含むようにしなければならない。 Each dosage unit is combined with a carrier of the selected drug must to include the amount of active ingredient calculated to produce the desired therapeutic effect. 細胞増殖を阻止するため、あるいはある一定の分類の患者の他の病的状態を治療するための適切な投薬単位を決定する方法は、技術に精通した者には周知である。 For inhibiting cell growth, or a method for determining the appropriate dosage unit for the treatment of other pathological conditions of the patient certain classification are well known to those skilled in the art. 例えば、放射線滑膜切除の場合、様々なコロイド状の形で投与した約5mCIの90 Y(半減期2.7日、ベータエネルギー2.2MeV)、あるいは300mCiの165 Dy(半減期2.3時間、ベータエネルギー1.3MeV)の投与量が臨床的な有効性を示した。 For example, for radiation synovectomy, various colloidal about 5mCI administered in the form of 90 Y (half-life 2.7 days, beta energy 2.2 MeV), or 165 Dy (half-life 2.3 hours 300mCi , the dose of beta energy 1.3 MeV) showed clinical efficacy. P. P. Lee、J. Lee, J. Rheumatol. Rheumatol. :165〜167(1982);C. , 9: 165~167 (1982); C. Sledgeら、 Clin. Sledge, et al., Clin. Orthop. Orthop. 182 :37〜40(1984)。 , 182: 37-40 (1984). 標準的な線量計測法を用いて、200mCi/μモルの特異的活性で調整した約0.05μモルの適切な化合物(例えば反応機構5の化合物23)の注入によって提供される約10mCiの投与量の186 Re(半減期3.7日、ベータエネルギー0.98MeV)によって、同様な治療効果が得られることが見積もられた。 Using standard dosimetry methods, a dosage of about 10mCi provided by injection of a suitable compound of about 0.05μ moles conditioned with 200 mCi / mu mol of specific activity (e.g., compound 23 of Reaction Scheme 5) 186 Re of (half-life 3.7 days, beta energy 0.98MeV) by, that the same therapeutic effect is obtained was estimated. 他の放射線治療同位元素も技術上知られている。 Other radiation therapy isotopes are also known in the art. W. W. Volkertら、J. Volkert et al., J. Nucl. Nucl. Med. Med. 32 :174〜185(1991)。 , 32: 174-185 (1991). さらに、本発明の他の化合物も、これらの薬物の効果的な投与量での供給に有効であるとみなされる。 Furthermore, other compounds of the invention are also considered to be effective for the supply of an effective dose of these drugs.
腫瘍の放射線治療においては、単クローン抗体を用いて供給した場合、固化した腫瘍の放射線治療の滅菌投与量として、80Gyの投与量が示された。 In radiation treatment of tumors, when supplied with a monoclonal antibody, as a sterile dose of radiation therapy of the solidified tumor dose of 80Gy was shown. J. J. Humm、 J. Humm, J. Nucl. Nucl. Med27 :1490〜1497(1986)。 Med, 27: 1490~1497 (1986) . 細胞表面膜に対する結合と内在化は、これらの治療の有効性を高めることが期待されている。 Coupled with internalized to the cell surface membrane, it is expected to enhance the effectiveness of these treatments. J. J. Humm、 J. Humm, J. Nucl. Nucl. Med31 :75〜83(1990)。 Med, 31: 75~83 (1990) . 80Gyの投与量は、200mCi/μモルの特異的活性で調整された約0.8nモルの化合物23の注入によって提供される。 The dose of 80Gy is provided by injection of 200 mCi / mu mol to about 0.8n moles adjusted in specific activity of the compound 23. さらに、この化合物や他の本発明の化合物は、技術上知られている他の放射線治療同位元素の供給に利用できることが期待されている。 Furthermore, the compounds of this compound and other of the present invention can be utilized to supply other radiotherapeutic isotopes known in the art is expected. W. W. Volkertら、 supra. Volkert et al., Supra. . 他の種類の抗癌放射線治療薬と同様に、本発明の化合物を腫瘍組織内、散在した腫瘍を含む体腔内、あるいは腫瘍を供給している血管内などに直接供給することができる。 Like other types of anticancer radiation therapy, the compounds of the present invention the tumor tissue, can be fed directly into such a blood vessel that supplies body cavity or a tumor, including interspersed tumors. C. C. Hoefnagel、 Anti−Cancer Drugs :107〜132(1991)。 Hoefnagel, Anti-Cancer Drugs, 2 : 107~132 (1991).
血管形成術後の再狭窄の治療において、十分な分量の本発明の化合物を病態生理学的部位に供給できることを示すために、Grinesら、 Circulation84 :II−365(1991)によって、1mg/日のヒト治療投与量のコルヒチンが投与されたが、再狭窄を防ぐことはできず、2ng/mlあるいは5nM(m.w.コルヒチン=399.4)の最大血漿濃度を生じたことに言及しておくことができる。 In the treatment of post-angioplasty restenosis, a compound of the invention sufficient amount to indicate that can be supplied to the pathophysiological sites, Grines et al, Circulation, 84: the II-365 (1991), 1mg / day Although human therapeutic dose of colchicine is administered, it is impossible to prevent restenosis, and mentioned that produced a maximum plasma concentration of 2 ng / ml or 5nM (m.w. colchicine = 399.4) it can be placed. Bochnerら、 Handbook of Clinical Pharmacology 、Little、Brown and Co. Bochner, et al., Handbook of Clinical Pharmacology, Little, Brown and Co. 、Boston(1983)、pp. , Boston (1983), pp. 151〜152。 151-152. (i)ウサギによる同様なコルヒチンの吸収および分布;(ii)平均的な3kgの体重のウサギ、および(iii)体重70kgの平均的なヒトの場合を仮定し、0.2mg/kg/日の投与量がCurrierら、Circulation、80:II−66(1989)によって用いられ、ウサギにおいて28ng/mlまたは70nMの血漿濃度で再狭窄を防ぐことに成功した。 (I) the absorption and distribution of similar colchicine by rabbit; (ii) rabbits weighing an average 3 kg, and (iii) the assumption that the average human weighing 70 kg, the 0.2 mg / kg / day dose Currier et al, Circulation, 80: used by II-66 (1989), succeeded in preventing restenosis in plasma concentration of 28 ng / ml or 70nM in rabbits. したがって、再狭窄を防ぐための濃度は、臨床試験で達成した濃度の14倍であることを、ウサギにおけるコルヒチン濃度が示した。 Therefore, the concentration to prevent restenosis that is 14 times the concentration achieved in the clinical trials showed that colchicine concentration in rabbits. 本発明の化合物は、上述の適合する結合媒質中に100μM、すなわち、動物研究で有効であることが示された濃度の1400倍にまで調整することができ、血管形成術時にカテーテルを用いて動脈壁に直接供給することができる。 The compounds of the present invention, 100 [mu] M in compatible binding medium described above, i.e., can be adjusted up to 1400 times the concentration shown to be effective in animal studies, using a catheter during angioplasty arteries it can be fed directly to the wall.
本発明の製薬製剤は、好ましくは注射、腹膜腔内輸液、あるいはカテーテル法によって投与する。 Pharmaceutical formulations of the present invention is preferably injection, administered by intraperitoneal infusion or catheterization. さらに、一部の症例では経口投与、あるいはエーロゾル投与などの他の投与法も有効であることがある。 Furthermore, in some cases it may oral administration, or other administration methods such as aerosol administration is also effective.
製薬製剤を適切な間隔で投与することができる。 It can be administered pharmaceutical formulations at appropriate intervals. 本発明の化合物の性質により、反復投与は不要であると考えられる。 The properties of the compounds of the present invention, repeated administration is considered to be unnecessary. 製薬製剤の投与頻度の決定は、関連する医療技術に精通した者には周知である。 Determination of the frequency of administration of the pharmaceutical formulation are well known to those skilled in the relevant medical art. あらゆる場合に、いずれの個別の症例の適切な間隔は、通常は患者の状態、および治療する病的状態の種類によって決まる。 In all cases, the appropriate interval of any individual case, usually determined by the type of pathological condition the patient's condition, and treatment.
以下の例は、本発明をさらに詳細に記述するために提供されるものである。 The following examples are intended to be provided to further detail describe the present invention. これらの例は、本発明の特定の側面を説明することを意図しているものであり、本発明の制限をとみなすことはできない。 These examples, which are intended to illustrate certain aspects of the present invention, can not be regarded as a limitation of the present invention.
例1 Example 1
膜保持係数の決定膜保持係数(MRC)は、与えられた化合物が細胞の形質膜にいかに十分に保持されているかという点に関する情報を提供するものであり、以下に記載したように決定する。 Determining film retention factor of the membrane retention coefficient (MRC) is a given compound is intended to provide information about that are either how well retained in the plasma membrane of the cells is determined as described below.
モデル膜として使用する赤血球ゴーストの生成は、全血液を300×gで15分間遠心分離し、血漿を除去し、0.83%(w/v)塩化アンモニウムで細胞ペレットの再懸濁を行うことによって行う。 Generation of red blood cell ghosts for use as a model membrane, the whole blood was centrifuged for 15 minutes at 300 × g, the plasma was removed, 0.83% (w / v) to perform the re-suspension of the cell pellet with ammonium chloride carried out by. 10、000×gの10分間の遠心分離によって塩化アンモニウムからゴーストをペレット化する。 To pellet ghosts from ammonium chloride by centrifugation for 10 min 10,000 × g. 細胞からのヘモグロビンの完全な放出を実現するために、この塩化アンモニウム洗浄処理を少なくとも5回反復する。 To achieve complete release of hemoglobin from the cells and repeated at least 5 times the ammonium chloride washing process. 装置による分析あるいは蛍光顕微鏡法による標識されたゴーストの検出を可能にするような濃度、さらに上述した個々の適用のために細胞を標識する際に用いたのと同じ濃度で、問題の化合物でゴーストを標識する。 Concentration such as to permit analysis or ghost detection labeled by fluorescence microscopy by the device, at the same concentration as that used in labeling the cells for particular application described above, the ghost in the compound in question the labeling. 以下の測定のために、問題の化合物の保存溶液を2×10 3のモル濃度のエタノールで調整し、化合物の作業用希釈液を、等浸透圧性スクロース(52g/500ml蒸留水)で調整した。 For the following measurements, adjusting the stock solution of the compound in question at 2 × 10 3 molar concentration of ethanol, the working dilutions of the compounds were prepared in isotonic sucrose (52 g / 500 ml distilled water). 約1×10 9ゴースト/mlの濃度の化合物の作業用希釈液で10分間ゴーストの培基をしたのち、ゴーストをペレット化するために試料を10、000×gで遠心分離し、試料から染色溶液を吸引した。 About 1 × 10 9 After the ghost / ml concentration of the working dilutions of the ghost 10 minutes培基compounds, the samples were centrifuged at 10,000 × g for to pellet ghosts, staining the sample the solution was aspirated. 10%のウシ血清(PBS−FBS)を含む1mlのリン酸塩緩衝食塩水に標識したゴーストを再懸濁した。 Were resuspended labeled ghosts phosphate buffered saline 1ml containing 10% bovine serum (PBS-FBS). 三重化した20ulアリクォットを、存在する全化合物量を測定するために各試料から取り出した。 The triplicated was 20ul aliquots were removed from each sample for measuring the total amount of compound present. 試料を上述のように遠心分離し、存在する全非結合化合物量の定量的測定のための上澄み液から三重化20ulアリクォットを取り出した。 Samples were centrifuged as described above, was removed triplication 20ul aliquots from the supernatant for quantitative determination of total unbound amount of compound present.
サンプリングののち、上澄み液を吸引し、赤血球ゴーストのペレットを1.0mlのPBS−FBSに再懸濁し、上述のように再度サンプリングした。 After sampling, the supernatant was aspirated, the pellet resuspended in erythrocyte ghosts PBS-FBS for 1.0 ml, was sampled as described above again. この方法を少なくとも6回反復し、急速に放出された化合物を検出できるようにし、さらにゆっくりと放出される化合物の検出もできるように24時間またはそれ以上の時間ののちに監視を行った。 This method was repeated at least 6 times, to be able to detect rapidly released compounds was further slowly emitted 24 hours to detect also the compound or more monitoring after time. 各試料中に存在する化合物量の測定のため、20ulアリクォットを攪拌によって3.0mlのn−ブタノールに抽出した。 For the determination of the amount of compound present in each sample was extracted in n- butanol 3.0ml by stirring 20ul aliquots. 膜の残骸を除去するために試料を3000×gで遠心分離し、ブタノール分画の化合物濃度を分析した。 Samples to remove debris of the membrane was centrifuged at 3000 × g, and analyzed for compound concentrations of butanol fraction. 各試料の蛍光単位を測定するために、分析する特定の化合物の最大励起と放出波長を用いて、この方法で蛍光化合物を分析した。 To measure the fluorescence units for each sample, using the maximum excitation and emission wavelengths of a particular compound to be analyzed, it was analyzed fluorescent compound by this method. 放射標識化合物はブタノール抽出が不要であり、ベータまたはガンマ計数装置を用いて直接分析することができる。 Radiolabeled compounds are unnecessary butanol extraction, can be analyzed directly using beta or gamma counting device.
上述のように各試料中に存在する化合物量を測定することにより、洗浄または固定した各時点のMRCの計算が可能になる。 By measuring the amount of compound present in each sample as described above, it is possible to calculate the MRC for each time of washing or fixed. 値は次の式で与えられる: The value is given by the following equation:
((C T - C S )/C T *100 ((C T - C S) / C T * 100
ここでC Tは全試料中に存在する化合物量(化合物の分析に使用する方法によって決まる単位)を表し、C Sは、特定の時点で上澄み液中に存在する化合物量を表す。 Here C T represents the (units determined by the method used to analyze compound) the amount of compound present in all samples, C S represents the amount of compound present in the supernatant at a specific time. MRC値の比較によって、本発明の化合物を同定する基準が定義されるが、これらの基準は:1)各洗浄段階で測定したMRC値が少なくとも約90の値であること、および2)少なくとも24時間の間のMRC値の割合の差が約10%未満であることである。 Comparison of MRC values, the reference to identify compounds of the invention are defined, these criteria are: 1) the MRC values ​​determined for each washing step has a value of at least about 90, and 2) at least 24 the percent difference between the MRC values ​​during the time it is less than about 10%.
下記の表Iに示したデータは一つの実験結果であり、MRC測定例を示す。 The data shown in Table I below is one of the experimental results, showing the MRC measurement example. 表Iでは、A〜Cで表す化合物は上記の式XIIの化合物であり、ここで各化合物中のXおよびX 1はC(CH 32を表し、ZおよびZ 1はHを表し、さらにR/R 1はC−5/C−5(化合物A)、C−10/C−10(化合物B)、C−14/C−14(化合物C)を表す;D〜Kで表す化合物は同様に式XIIIの化合物であり、ここでZおよびZ 1はHを表し、R/R 1はC−14/C−3(化合物D)、C−18/C−3(化合物E)、C−20(3、7、11、15−テトラメチルヘキサデシル)/C−3(化合物F)、C−22/C−3(化合物G)、C−20/C−3(化合物H)、C−18/C−8(化合物I)、C−18/C−5(化合物J)、C−22/C−3(化合物K)を表す;また、L〜Nで表す化合物は上記の In Table I, compounds represented by A~C is a compound of formula XII, wherein X and X 1 in each compound represents C (CH 3) 2, Z and Z 1 represents H, further R / R 1 is C-5 / C-5 (compound a), C-10 / C -10 ( compound B), C-14 / C -14 ( compound C) representing the a compound represented by D~K the Similarly a compound of formula XIII, wherein Z and Z 1 represents H, R / R 1 is C-14 / C-3 (compound D), C-18 / C -3 ( compound E), C -20 (3,7,11,15-tetramethyl-hexadecyl) / C-3 (compound F), C-22 / C-3 (compound G), C-20 / C-3 (compound H), C -18 / C-8 (compound I), C-18 / C-5 (compound J), representing the C-22 / C-3 (compound K); the compound represented by L~N the above XIVの化合物であり、ここでZおよびZ 1はそれぞれ、(3および6の環の位置での)N(CH 32を表し、Z 2はHを表し、Rは、C−22(化合物L)、C−18(化合物M)、C−26(化合物N)を表す。 XIV is a compound, wherein each Z and Z 1 represents a (3 and at the position of ring 6) N (CH 3) 2 , Z 2 represents H, R is C-22 (compound L), M C-18 (compound), representing the C-26 (compound N). 化合物Kでは、陰イオンは塩化物であり、その他残りのすべての化合物では、陰イオンはヨウ化物である。 In compound K, the anion is chloride, all remaining other compounds, anions are iodide.
上記の表Iに記載したMRC値は、上述の国際出願PCT/US89/00087中ですでに記述したように、細胞内化合物変換分析から得た結果との優れた相関を示している。 MRC values ​​set forth in Table I above, as already described in International Application PCT / US89 / 00087 mentioned above, show excellent correlation with the results obtained from intracellular compound transform analysis.
例2 Example 2
膜結合安定性の決定水相(例えば、細胞外媒質)から液体炭化水素相(例えば、生体膜の炭化水素内部)への炭化水素鎖変換の自由エネルギーは、分岐の程度、非飽和の程度、および炭化水素鎖中のメチレン基の数に依存することが知られている。 Membrane binding stability of determining the water phase (e.g., the extracellular medium) from a liquid hydrocarbon phase (e.g., a hydrocarbon interior of a biomembrane) free energy of the hydrocarbon chain conversion to the degree of branching, the degree of non-saturation, and depend on the number of methylene groups in the hydrocarbon chain are known. メチレン−炭化水素相互作用の自由エネルギーは、水性媒介に最も近いメチレン基では最小で、それに続くメチレン基では増大し、炭化水素基が4個またはそれ以上の炭素を膜の脂質内部にもつ非極性炭化水素を含む溶媒中の炭化水素に見出されるものとほぼ等しくなる。 Methylene - free energy of hydrocarbon interaction is a minimum at the nearest methylene groups in an aqueous-mediated, increased in subsequent methylene group, a non-polar hydrocarbon groups having 4 or more carbons into the lipid interior of the membrane approximately equal to that found in a hydrocarbon solvent containing a hydrocarbon. したがって、本発明の化合物のような、極性をもつ頭部基と直線状の4個あるいはそれ以上の炭素で構成される炭化水素尾部(単数あるいは複数、対称あるいは非対称)を含むあらゆる構造について、炭化水素溶媒中に完全に浸した時に、ほぼ等しい結合エネルギーを与えるような炭素等価物の数を、以下のように計算することができる: Thus, for any structure, including hydrocarbon tails consisting of four or more carbons of the head group having a polarity linearly (single or multiple, symmetric or asymmetric) as the compounds of the present invention, carbide when fully immersed in hydrocarbon solvent, the carbon equivalent the number that gives approximately equal binding energy can be calculated as follows:
炭化等価物=0+. Carbide equivalents = 0 +. 25+. 25+. 5+. 5+. 75+n−4(+)0+. 75 + n-4 (+) 0+. 25+. 25+. 5+. 5+. 75+m−4(+)・・・ここでnは、最初の尾の直線状炭化水素の数と等しく、mは、第2の尾の直線状炭化水素の数と等しい。 75 + m-4 (+) ··· where n is equal to the number of the first tail linear hydrocarbon, m is equal to the number of second tail linear hydrocarbon.
本発明の化合物の炭素等価物と、その膜保持係数(MRC)との間に相関が存在することは、上記の例1に記述したように、実験的に決定した。 And carbon equivalent of the compounds of the present invention, that there is a correlation between the film retention factor (MRC), as described in Example 1 above was determined experimentally. 例えば、18−19個を超える炭素等価物を備える本発明の化合物は、90またはそれ以上のMRCを備え、細胞内化合物変換分析において、標識細胞と非標識細胞の間の最小の変換を示す(上記を参照)。 For example, the compounds of the present invention comprising a carbon equivalent of more than 18-19 carbon atoms, with a 90 or more MRC, shown in intracellular compounds transform analysis, the minimum conversion between labeled cells and the unlabeled cells ( see above). したがって、これらの化合物もin vivoで標識された細胞との結合の優れた安定性を示すことが期待される。 Therefore, it is expected to exhibit excellent stability of the binding of these compounds were also labeled with in vivo cell. しかし、驚くべきことにこれはあてはまらない。 However, surprisingly this is not the case. 実際に、異なるMRCを示している本発明の化合物のいくつかは、僅かに10%だけ異なる本発明の複数の化合物が、in vivoで10倍異なる低下率を示す。 In fact, some of the compounds of the present invention showing different MRC, a plurality of different compounds of the present invention by 10% slightly indicates a 10-fold different reduction rates in in vivo.
本発明の化合物と方法の様々な実際の適用において、in vivoでの化合物と生物膜との間の結合の安定性をいくつかの予測基準を用いて評価できることが重要である。 In the compounds and various practical applications of the method of the present invention, it is important that the binding of the stability between the compound and the biofilm in the in vivo can be evaluated using several prediction criteria. 例えば、腫瘍部位への治療放射性核種の供給などの適用では、化合物の損失が、放射性核種による非腫瘍部位への毒性作用の生成を引き起こしうるので、膜への非常に安定した結合が必要となる。 For example, in applications such as supply of therapeutic radionuclides to tumor sites, loss of compound, as it can cause the production of toxic effects of the non-tumor sites with radioactive nuclides, it is necessary to very stable binding to membranes . 一方、治療薬供給率の制御を必要とする適用にとっては、生体膜からの化合物のより急速な損失が望ましいことがある。 On the other hand, for applications requiring control of the therapeutic agent feed rate, sometimes more rapid loss of compound from biomembranes may be desirable. したがって、in vivoで見出される条件を近似する条件下でMBSを測定する分析について、以下に記述する。 Thus, the analysis of measuring the MBS under conditions approximating the conditions found in in vivo, described below.
この分析を実施するうえで、生理的濃度を近似する血清アルブミン(5%)を使用する。 In carrying out this analysis, using a serum albumin (5%) to approximate physiological concentration. さらに、本発明の多くの化合物は、5%のアルブミンを含む食塩水中への溶解度が低いため、限定した体積の“生理的”液体を含む閉じた系で、24時間以内に膜内での溶解度と周囲の媒質内での溶解度の間の平衡を達成させる。 Furthermore, many of the compounds of the present invention has a low solubility in saline containing 5% albumin, in a closed system including a "physiological" fluid volume is limited, the solubility in the film within 24 hours and to achieve an equilibrium between solubility in the surrounding medium. 標識細胞をin vivoでさらす体積の大きな液体の作用を十分に近似するために、アルブミンを含む体積を固定した食塩水に、数を低減した標識膜ゴーストを懸濁することによってMBSの分析を実施する。 The labeled cells in order to sufficiently approximate the effects of large fluid volumes exposure in in vivo, in saline with a fixed volume containing the albumin, perform an analysis of MBS by suspending the labeled membrane ghosts with a reduced number to. 24時間の時点で、十分に混合した懸濁液をサンプリングすることによって存在する標識の総量を測定する;次に、膜ゴーストを遠心分離によりペレット化し、上澄み液に放出された標識の分量を測定し、全標識の割合として表す。 At 24 hours, measuring the amount of label present by sampling the well mixed suspension; then pelleted by centrifugation membrane ghosts, measured quantity of label released into the supernatant was expressed as a percentage of the total label. 懸濁液1ml当たりのゴースト数に対して保持率をプロットし、5×10 7ゴースト/mlと、4×10 8ゴースト/ml間の曲線の下の部分でMBSを測定する。 Plotting the retention against ghosts per suspension 1 ml, and 5 × 10 7 ghosts / ml, to measure the MBS at the lower part of the curve between 4 × 10 8 ghosts / ml. この分析では、無限の膜結合安定性を示す化合物は3.5×10 10のMBSとなり、この最大MBSに対する比率として結果を表す。 In this analysis, the compound exhibiting an infinite membrane binding stability represents the results MBS next to 3.5 × 10 10, as a ratio to the maximum MBS.
次表は、上記の例1で記述したMRC測定と、本例のMBS測定から得たデータを、本発明の化合物の代表的な試料についてそれぞれ記載したものである。 The following table, are those described respectively MRC measurement described in the above example 1, the data obtained from the MBS measurement of this example, for a representative sample of compounds of the present invention. O〜Tで表す化合物は上記の式XIIの化合物であり、ここでXおよびX 1はC(CH 32を表し、ZおよびZ 1はHを表し、R/R 1は、C−12/C−10(化合物O)、C−22/C−12(化合物P)、C−14/C−3(化合物Q)、C−14/C−14(化合物R)、C−16/C−16(化合物S)、C−22/C−14(化合物T)を表す。 Compounds represented by O~T is a compound of formula XII, wherein X and X 1 represents a C (CH 3) 2, Z and Z 1 represents H, R / R 1 is, C-12 / C-10 (compound O), C-22 / C-12 (compound P), C-14 / C-3 (compound Q), C-14 / C-14 (compound R), C-16 / C -16 (compound S), representing the C-22 / C-14 (compound T).
前記の表から、MBS分析によって、MRCがほぼ同一だがin vivoで異なる生体膜との結合安定性を示す化合物を識別できることがわかる。 From the table, the MBS analysis, it can be seen that the MRC can identify approximately the same but it compounds that exhibit binding stability of different biological membranes in vivo.
本発明の様々な適用において、適切な結合の特徴で化合物を選ぶためにMBS分析を用いることの付加的な利点は、膜結合安定性に対する頭基構造の変化の作用を確認できることであるのに対し、MRC分析では、これは不十分にしか実施できない。 In various applications of the present invention, additional advantages of using MBS analysis to select a compound wherein suitable binding to is to be confirmed the effect of changes in the head group structure on membrane binding stability contrast, in the MRC analysis, this can not be carried out poorly. 下記の表IIIに見られるように、炭化水素尾部の長さ(対称構造および非対称構造の比較ができるように炭素等価物として表した)と頭部基構造とは、ともに膜結合安定性に対して顕著な作用を備えることができるが、低い炭素等価物数から中程度の炭素等価物数の場合は頭基の作用の方がより顕著である。 As seen in Table III below, the hydrocarbon tails length of (symmetrical structure and comparison of the asymmetric structure is expressed as carbon equivalents to allow) the head group structure, with respect to both membrane binding stability It may be provided with a significant effect Te is more pronounced towards the action of the head group in the case of moderate low carbon equivalent number of carbon atoms equivalents. したがって、本発明の適用(例えば、放射性金属キレート、蛋白質、ペプチド、放射性核種、およびその類似物)に役立つ様々な官能基を備える他の種類の頭部基に対しても同様の作用を求めることができ、頭部基の作用と、望ましい膜結合安定性に達するために必要な炭素等価物との間の平衡を見積もることができる。 Therefore, application of the present invention (e.g., radioactive metal chelates, proteins, peptides, radionuclides, and the like) to obtain the same effect even for other types of head groups comprise various functional groups that will help can be can be estimated and the action of the head group, the equilibrium between carbon equivalents needed to reach the desired membrane binding stability. 少なくとも約30%またはそれ以上のMBSを備える化合物は、ここに記述した種類の本発明の適用上有益であることが期待される。 Compounds comprising at least about 30% or more of the MBS is expected here is beneficial on application type of the present invention described. さらに、炭素等価物の数が一定に維持された場合でも、頭部基上の置換基が膜結合安定性に対して顕著な作用を備えうることも観察することができる。 Furthermore, it can also be observed that even when the carbon equivalent the number is kept constant, the substituents on the head groups may comprise a significant effect on membrane binding stability. 下記の表IIIに見られるように、AC化合物とAD化合物は頭部基置換基が異なるだけであるが、各MBSは非常に異なっている。 As seen in Table III below, AC compound and AD compound is only different headgroup substituent, each MBS is very different.
表IIIでは、U,W,Yで表す化合物は上記の式XIIIの化合物であり、ここで各化合物のXおよびX 1はOを表し、ZおよびZ 1はHを表し、R/R 1は、C−22/C−30(化合物U)、C−14/C−14(化合物W)、C−18/C−18(化合物Y)を表す;さらに、V、X、AAで表す化合物も式XIIの化合物であり、ここでXおよびX 1はSを表し、ZとZ 1はHを表し、R/R 1はC−22/C−3(化合物V)、C−14/C−14(化合物X)、C−18/C−18(化合物AA)を表す。 In Table III, U, W, compounds represented by Y is a compound of formula XIII above, wherein X and X 1 each compound represents O, Z and Z 1 represents H, R / R 1 is , C-22 / C-30 (compound U), C-14 / C-14 (compound W), C-18 / C-18 (compound Y) alkyl; further, V, X, also compounds represented by AA a compound of formula XII, wherein X and X 1 represent S, Z and Z 1 represents H, R / R 1 is C-22 / C-3 (compound V), C-14 / C- 14 (compound X), representative of C-18 / C-18 (compound AA).
AB、AC、ADで表す化合物は上記の式XIIの化合物であり、ここでXおよびX 1は(CH 32を表し、Z 1はHを、さらにR/R 1は、C−14/C−22(化合物AB)、C−14/C−3(化合物AC、AD)を表す。 AB, AC, compounds represented by AD is a compound of formula XII, wherein X and X 1 represents a (CH 3) 2, a Z 1 is H, further R / R 1 is, C-14 / C-22 (compound AB), C-14 / C-3 (compound AC, AD) represents a. 化合物ABでは、Zは−CH 2 −NHOCHを表す。 In compound AB, Z represents -CH 2 -NHOCH. 化合物ACでは、ZはHを表す。 In compound AC, Z represents H. 化合物ADでは、Zは以下に示すような非切断可能コルヒチン誘導体を表す。 In compound AD, Z represents a non-cleavable colchicine derivative as shown below.
表IIIに示した多くの対称性色素は、Molecular Probes、Inc. Many symmetric dyes shown in Table III, Molecular Probes, Inc. 、Eugene、ORから製品として入手することができる。 It can be obtained Eugene, from OR as a product.
例3 Example 3
化合物の調整a. Adjust a compound. 5−アミノメチル−1'−ドコサニル−1−テトラデシル−3、3、3'、3'−テトラメチルインド−カルボシアニンヨウ化物表題の化合物を反応機構1に従って上述のように調整した。 5-aminomethyl-1'-docosanyl-1-tetradecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethyl India - adjusting the carbocyanine iodide The title compound, as described above in accordance with the reaction mechanism 1. 以下の記述では、括弧中に示す数字は反応機構1に示した対応する数字の試薬を示している。 In the following description, the numbers shown in parentheses indicate the reagent corresponding number shown in the reaction mechanism 1. 得られた生成物は化合物8の式で与えられ、XおよびX 1がC(CH 32を、R/R 1がC 1429 /C 2245を表し、AはIを表す。 The resulting product is given by the formula Compound 8, X and X 1 is C (CH 3) 2, R / R 1 represents a C 14 H 29 / C 22 H 45, A represents I.
5−(N−フタルイミドアミノメチル)−2、3、3−(3H)−トリメチルインドレニン(1)を、Galeら、 Aust. 5-(N-phthalimidomethyl aminomethyl) -2,3,3- (3H) - trimethyl indolenine a (1), Gale et al., Aust. J. J. Chem. Chem. 30 :693(1977)の方法を修正して調整した。 , 30: 693 was prepared by modifying the method (1977). 2、3、3−(3H)−トリメチルインドレニン(23.85g、0.15モル、Aldrich)を、150mlの濃硫酸に溶解させた。 2,3,3- (3H) - trimethyl indolenine (23.85g, 0.15 mol, Aldrich) was dissolved in concentrated sulfuric acid 150 ml. 次に、氷浴槽内にフラスコを置き、N−ヒドロキシメチルフタルイミド(26.55g、0.15モル、Fluka)を30分以上にわたって一部ずつ加えた。 Then place the flask in an ice bath, N- hydroxymethyl phthalimide was added portionwise over (26.55g, 0.15 mol, Fluka) for 30 minutes or more. 氷浴槽を取り外し、溶液を室温で5日間攪拌した。 Remove the ice bath, the solution was stirred at room temperature for 5 days. 次に反応混合物を200gの粉砕氷上に注ぎ、必要に応じて氷を付加することによって温度を35℃以下に保ちながら、50%のNaOH溶液でpHを9.0に調整した。 The reaction mixture was then poured onto crushed ice in 200 g, while maintaining the temperature by adding ice as necessary to 35 ° C. or less, and the pH was adjusted to 9.0 with 50% NaOH solution. その結果得られた沈澱物を濾過によって集め、蒸留水で洗浄し、高圧化で一晩乾燥させた。 Its resulting precipitate was collected by filtration, washed with distilled water and dried overnight under high pressure. 未加工の生成物を塩化メチレン/ヘキサンから再結晶化し、5−(N−フタルイミドアミノメチル−2、3、3−(3H)−トリメチルインドレニンを生成させる(1)(30g、63%)。 The raw product was recrystallized from methylene chloride / hexane, 5-(N-phthalimidomethyl-aminomethyl-2,3,3 (3H) - to produce trimethyl indolenine (1) (30g, 63%).
PCT/US89/00087に記述された方法を用いて、ドコサニル4−クロルベンゼンスルホン酸塩を調整した。 Using the methods described PCT / US89 / 00087, to prepare a docosanyl 4-chlorophenyl benzenesulfonate.
テトラジシル4−クロルベンゼンスルホン酸塩を、同様の方法で調整した。 The Tetorajishiru 4-chlorophenyl benzenesulfonate, was prepared in a similar manner. 5−(N−フタルイミド−アミノメチル)−2、3、3−(3H)−トリメチルインドレニン(6.36g,2mmol)と、テトラデシル−4−クロルベンゼンスルホン酸塩(7.62g、2mmol)を結合し、両者を130℃で2時間加熱した。 5-(N-phthalimido - aminomethyl) -2,3,3- (3H) - trimethyl indolenine (6.36g, 2mmol), tetradecyl-4-chlorobenzene sulfonate (7.62 g, 2 mmol) bound and they were heated at 130 ° C.. 次に反応混合物を室温まで冷却し、未加工生成物を純粋な5−(N−フタルイミドアミノメチル)−1−テトラデシル−2、3、3−(3H)−トリメチルインドレニウム4−クロルベンゼンスルホン酸塩(2)(10.23g、72%)、m. The reaction mixture was then cooled to room temperature, the raw product of pure 5-(N-phthalimidomethyl aminomethyl) -1-tetradecyl-2,3,3 (3H) - trimethyl indolenium 4- chlorobenzenesulfonate salt (2) (10.23g, 72%), m. p. p. =141℃を生成するために、酢酸エチルから再結晶化した。 = To generate a 141 ° C., and recrystallized from ethyl acetate.
2、3、3−トリメチル−(3H)−インドレニン(6.26g、0.04モル Aldrich)と、n−ドコサニル−4−クロルベンゼンスルホン酸塩(20.02g、0.04モル)をもとに攪拌しながら3時間140℃で加熱した。 Trimethyl 2,3,3-- (3H) - indolenine (6.26 g, 0.04 mol Aldrich) and, n- docosanyl-4-chlorobenzene sulfonate (20.02 g, 0.04 mol) also bets on heated with stirring for 3 hours 140 ° C.. その後反応混合物をワックス状固体になるように室温まで冷却した。 The reaction mixture was then cooled to room temperature so that the waxy solid. 次にその固体をエタノール(250ml)に溶解させ、200mlの飽和KI溶液を付加し、その溶液を30分間攪拌した。 Then dissolve the solid in ethanol (250 ml), was added saturated KI solution 200 ml, and the solution was stirred for 30 minutes. 1リットルの冷水を加え、さらに15分間攪拌を継続した。 Cold water 1 liter was added and further stirring continued for 15 minutes. その結果得られた沈澱物を集め、蒸留水で2度洗浄し、高圧下で一晩乾燥させた。 The resulting precipitate was collected, washed twice with distilled water and dried overnight under high pressure. 未加工物質を塩化メチレン/ヘキサンから再結晶化し、純粋な1−ドコサニル−2、3、3−(3H)トリメチル−インドレニウムヨウ化物(5)(14.5g、61%)、m. The raw material was recrystallized from methylene chloride / hexane, pure 1-docosanyl-2,3,3 (3H) trimethyl - indolenium iodide (5) (14.5g, 61%), m. p. p. =107〜110℃を生成した。 = 107 to 110 was generated ℃.
1−ドコサニル−2、3、3−(3H)−トリメチルインドレニウムヨウ化物(8.94g、0.015モル)、N、N−ジフェニルホルムアミジン(2.94g、0.015モル、Aldrich)と無水酢酸(60ml)を冷却器を取り付けた丸底フラスコに入れ、アルゴンでフラスコを浄化し、その後、冷却器を乾燥管に接続した。 1- docosanyl-2,3,3 (3H) - trimethyl indolenium iodide (8.94 g, 0.015 mol), N, N-diphenyl formamidine (2.94 g, 0.015 mol, Aldrich) and placed acetic anhydride (60 ml) in a round bottom flask fitted with a condenser, purged flask with argon, then connect the condenser drying tube. そのフラスコをあらかじめ加熱した(160℃)油浴槽に入れ、60分間還流した。 Placed in a preheated (160 ° C.) oil bath and the flask was refluxed for 60 minutes. 次にフラスコを油浴槽から取り出しし、室温まで冷却した。 Then the flask was removed from the oil bath and allowed to cool to room temperature. その後、1リットルの三角フラスコに移し、エタノール(60ml)と、続いて60mlの飽和KI溶液で希釈し、その混合物を30分間攪拌した。 Then transferred to a conical flask 1 liter, and ethanol (60 ml), followed by dilution with saturated KI solution 60 ml, and the mixture was stirred for 30 minutes. 冷水(800ml)を加え、さらに15分間攪拌を続けた。 Cold water (800 ml) was added, stirring was continued for an additional 15 minutes. 沈澱した生成物を濾過によってて集めて蒸留水で洗浄し、高圧化で一晩乾燥させて、2−(β−アセトニルイドビニル)−1−ドコサニル−3、3−(3H)ジメチルインドレニウムヨウ化物(6)(10.52g、95%)、m. The precipitated product was washed with distilled water collected by filtration and dried overnight under high pressure, 2-(beta-acetonyl Id vinyl) -1- docosanyl-3,3-(3H) dimethyl indolenium iodide (6) (10.52g, 95%), m. p. p. =98〜100℃を生成した。 = 98-100 were generated ℃. さらに生成を行うことなく未加工生成物を使用した。 Using raw product without further for generating.
5−(N−フタルイミドアミノメチル)−1−テトラデシル−2、3、3−(3H)−トリメチルインドレニウム4−クロロベンゼン−スルホン酸塩(2)(14.1g、20mmol)を300mlの濃縮したHCl中に溶解させた。 5-(N-phthalimidomethyl aminomethyl) -1-tetradecyl-2,3,3 (3H) - trimethyl indolenium 4-chloro - sulfonate (2) (14.1g, 20mmol) was concentrated in 300 ml HCl It was dissolved in. その溶解をゆっくりと115℃まで加熱し(泡立ちに注意)、22時間還流させた。 Its dissolution was heated slowly to 115 ° C. (note the foaming), it was refluxed for 22 hours. その後この混合物を室温まで冷却し、氷浴槽内に入れた。 Then the mixture was cooled to room temperature, placed in an ice bath. 温度を15℃から20℃の間に保ちながら、水酸化アンモニウム(30%)を用いてpH9.0に調整した。 While maintaining the temperature between 20 ° C. from 15 ° C., and adjusted to pH9.0 with ammonium hydroxide (30%). その後、その溶液を蒸留水で2倍の容積に希釈し、塩化メチレン(3×200ml)で抽出した。 The solution was then diluted to twice the volume with distilled water, extracted with methylene chloride (3 × 200ml). 塩化メチレン抽出物を結合し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮して黄色の油(3)(6.9g、90%)として5−アミノメチル−3、3−ジメチル−2−メチレン−1−テトラデシル−インドリンを生成した。 Combined methylene chloride extracts were dried over magnesium sulfate and concentrated to a yellow oil (3) (6.9g, 90%) 5- Amino-3,3-dimethyl-2-methylene-1-tetradecyl as - generated the indoline.
5−アミノメチル−3、3−ジメチル−2−メチレン−1−テトラデシル−インドリン(3)(14.88g、38.75mmol)を、メチルホルマート(75ml)中に溶解し、アルゴン下で還流(55℃)するために24時間加熱した。 5-aminomethyl-3,3-dimethyl-2-methylene-1-tetradecyl - indoline (3) (14.88g, 38.75mmol) was dissolved in methyl formate (75 ml), refluxed under argon ( It was heated for 24 hours to 55 ° C.) to. 次に溶液を室温まで冷却し、メチルホルマートを蒸発させた。 The solution was then cooled to room temperature, evaporating the methyl formate. 残留物をヘキサンから再結晶化し、5−(N−ホルミルアミノメチル)−3、3ジメチル−2−メチレン−1−テトラデシル−インドリン(4)(10.85g、68%)を生成した。 The residue was recrystallized from hexane, 5-(N-formylaminomethyl) -3,3-dimethyl-2-methylene-1-tetradecyl - to produce indoline (4) (10.85g, 68%).
2−(β−アセトンイリドビニル)−1−ドコサニル−3、3−(3H)−ジメチルインドレニウムヨウ化物(6)(740mgs、1mmol)と、5−(N−ホルミルアミノメチル)−3、3−ジメチル−2−メチレン−1−テトラデシル−インドリン(4)(330mg、0.8mmol)と、無水酢酸ナトリウム(150mg、1.8mmol)をイソプロパノール中で溶解させ、室温で24時間攪拌した。 2-(beta-acetone ylide vinyl) -1- docosanyl-3,3-(3H) - dimethyl indolenium iodide (6) (740mgs, 1mmol) and, 5-(N-formylaminomethyl) -3,3 - dimethyl-2-methylene-1-tetradecyl - indoline (4) (330mg, 0.8mmol) and anhydrous sodium acetate (150 mg, 1.8 mmol) was dissolved in isopropanol and stirred for 24 hours at room temperature. その後その溶液を250mlの三角フラスコに移し、エタノール(20ml)と飽和KI溶液(20ml)で希釈し、その混合物を30分間攪拌した。 Then the solution transferred to a Erlenmeyer flask 250 ml, diluted with ethanol (20ml) and saturated KI solution (20ml), and the mixture was stirred for 30 minutes. 100mlの冷水を付加することによって生成物を沈澱させ、その結果得た溶液を15分間攪拌した。 The product was precipitated by adding cold water 100 ml, it was the resulting solution was stirred for 15 minutes. 濾過によって沈殿物を集め、蒸留水で洗浄し、高圧下で一晩乾燥させた。 The precipitate was collected by filtration, washed with distilled water and dried overnight under high pressure. 未加工生成物(870mg)を二つの群に分け、それぞれをflashカラムクロマトグラフィ(シリカゲル、メチレン塩化物中に10%のイソプロパノール)によって精製し、純粋な1'−ドコサニル−5(N−ホルミルアミノメチル)−1−テトラデシル−3、3、3'、3'テトラメチルインドカルボシアニンヨウ化物(7)(414mg、52%)を生成した。 Divided raw product (870 mg) in two groups, each was purified by flash column chromatography (silica gel, 10% isopropanol in methylene chloride), pure 1'docosanyl -5 (N-formylaminomethyl ) -1-tetradecyl-3,3,3 ', 3' to produce a tetramethyl indocarbocyanine iodide (7) (414mg, 52%).
100mlsの濃縮HCl:メタノール溶液(11mlの濃縮HClと120mlsのメタノールを混合して調整)を、1'−ドコサニル−5−(N−ホルミルアミノメチル)−1−テトラデシル−3、3、3'、3'−テトラメチルインドカルボシアニンヨウ化物(7)(250mgs)に付加し、溶液を室温で16〜24時間攪拌した。 Concentration of 100 mls HCl: methanol solution (prepared by mixing methanol concentration HCl and 120mls of 11 ml), 1'docosanyl-5-(N-formylaminomethyl) -1-tetradecyl-3,3,3 ', It was added to the 3'-tetramethyl indocarbocyanine iodide (7) (250mgs), the solution was stirred for 16-24 hours at room temperature. その後その溶液を氷水(100ml)で希釈し、氷浴槽内で冷却し、飽和重炭酸ナトリウム溶液をゆっくり加えて、pHを7.5〜8.0に調整した。 Then the solution was diluted with ice water (100 ml), cooled in an ice bath, was added slowly saturated sodium bicarbonate solution and the pH was adjusted to 7.5-8.0. その後水相を塩化メチレン(2×100ml)で抽出し、その結合有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過、濃縮し(Buchi浴槽 温度<30℃)、その後高圧下で乾燥させて生成物を得た(8)(240mgs、98%)。 Then the aqueous phase was extracted with methylene chloride (2 × 100 ml), the combined organic phases were dried over sodium sulfate, resulting filtered, concentrated (Buchi bath temperature <30 ° C.), after which the product is dried under high pressure and (8) (240mgs, 98%).
b. b. 2−[3−(2、3−ジヒドロ−3、3−ジメチル−5−アミノメチル−1−テトラデシル−(2H)−インドール−2−イリデン)−1−プロペニル]−1−ドコサニル−ベンゾキサゾリウムヨウ化物さらに表題の化合物を反応機構1に従って調整した。 2- [3- (2,3-dihydro-3,3-dimethyl-5-aminomethyl-1-tetradecyl - (2H) - indol-2-ylidene) -1-propenyl] -1-docosanyl - Benzokisazo Riumuyou product was further adjusted title compound according to the reaction mechanism 1. 以下の記述中においても、括弧中に示した数字は反応機構1に示した対応する数字の試薬を示している。 Even during the following description, the numbers shown in parentheses indicate the reagent corresponding number shown in the reaction mechanism 1. 得られた生成物は化合物(8)の式を備え、XがC(CH 32 、X 1が酸素、R/R 1がC 1429 /C 2245 、Aがヨウ化物を表している。 The resulting product comprises a formula of the compound (8), X is C (CH 3) 2, X 1 is oxygen, R / R 1 is the C 14 H 29 / C 22 H 45, A represents an iodide ing.
上述のように調整した2−メチルベンゾキサゾール(2.65g、19.9mmol、Aldrich)とドコサニル−4−クロルベンゼンスルホン酸塩(10.0g、19.9mmol)の撹拌した溶液を160〜170℃(油浴槽温度)で6時間加熱した。 Adjusted 2-methyl benzoxazole as described above (2.65g, 19.9mmol, Aldrich) and docosanyl-4-chlorobenzene sulfonate (10.0 g, 19.9 mmol) and stirred solution of 160 to 170 and heated for 6 hours at ° C. (oil bath temperature). その後反応混合物を室温まで冷却し、その結果として得られた固体塊を塩化メチレンから再結晶化し、純粋1−ドコサニル−2−メチルベンゾキサゾリウム−4−クロルベンゼンスルホン酸塩(5)(7.3g、58%)、m. The reaction mixture was then cooled to room temperature, the resulting solid mass consequently was recrystallized from methylene chloride, pure 1-docosanyl-2-methyl-benzoxathiol tetrazolium-4-chlorobenzene sulfonate (5) (7 .3g, 58%), m. p. p. =124〜125℃を生成した。 = 124-125 was generated ℃.
1−ドコサニル−2−メチル−ベンゾキサゾリウム−4−クロルベンゼンスルホン酸塩(5)(1.5g、2.36mmol)、N、N'−ジフェニル−ホルムアミジン(0.462g、2.36mmol、Aldrich)と無水酢酸(7ml)の攪拌した溶液を、油浴槽内(あらかじめ160℃まで加熱)で30分間還流した。 1-docosanyl-2-methyl - benzoxathiol tetrazolium-4-chlorobenzene sulfonate (5) (1.5g, 2.36mmol), N, N'- diphenyl - formamidine (0.462 g, 2.36 mmol the stirred solution of Aldrich) and acetic anhydride (7 ml), was refluxed in an oil bath (heated to a pre-160 ° C.) 30 min. 室温まで冷却し、その混合物を無水エタノール(15ml)で希釈し、次に飽和カリウムヨウ化物溶液(10ml)で希釈して30分間攪拌した。 Cooled to room temperature, the mixture was diluted with absolute ethanol (15 ml), then stirred diluted to 30 minutes with a saturated potassium iodide solution (10 ml). その後水(150ml)を加え、沈澱した生成物を濾過して集め、水で洗浄し、高圧下で一晩乾燥させた。 Then water (150ml) was added, the precipitated product was collected by filtration, washed with water, and dried overnight under high pressure. 乾燥した未加工生成物を、酢酸エチルから再結晶化し、純粋2−(β−アセトンイリドビニル)−1−ドコサニル−ベンゾキサゾリウムヨウ化物(6)(1.51g、90%)、m. The dried raw product was recrystallized from ethyl acetate, pure 2-(beta-acetone ylide vinyl) -1-docosanyl - benzoxathiol tetrazolium iodide (6) (1.51g, 90%), m. p. p. =67−68℃を生成した。 = 67-68 were generated ℃.
上記の3aのように調整した2−(β−アセトンイリドビニル)−1−ドコサニル−ベンゾキサゾリウムヨウ化物(6)(1.10g、1.53mmol)、5−(N−ホルミルアミノメチル)−1−テトラデシル−3、3−ジメチル−2−メチレンヨウ化物(4)(63mgs、1.53mmol)と、トリエチルアミン(0.5ml)およびエタノール(25ml)を、1時間加熱した還流した。 The adjusted 2-(beta-acetone ylide vinyl) as the 3a-1-docosanyl - benzoxathiol tetrazolium iodide (6) (1.10g, 1.53mmol), 5- (N- formyl-aminomethyl) 1-tetradecyl-3,3-dimethyl-2- Mechiren'you product (4) (63mgs, 1.53mmol) and triethylamine (0.5 ml) and ethanol (25 ml), was refluxed with heating for 1 hour. その後溶液を室温まで冷却し、三角フラスコに移してエタノール(40ml)と飽和KI溶液で希釈した。 The solution was then cooled to room temperature and diluted with saturated KI solution and ethanol (40 ml) was transferred to an Erlenmeyer flask. その後この混合物を30分間攪拌し、200mlの冷水を加え、この溶液を塩化メチレンで抽出した。 After which the mixture was stirred for 30 minutes, added cold water 200 ml, the solution was extracted with methylene chloride. 塩化メチレン抽出物を混合し、硫酸マクネシウムで乾燥させ、濾過し、未加工生成物を得るために濃縮した。 Mixing the methylene chloride extracts were dried over magnesium sulphate, filtered and concentrated to obtain a raw product. この生成物を、flashカラムクロマトグラフィ(シリカゲル、塩化メチレン中に5%のメタノール)で精製し、2−[3−(2、3−ジヒドロ−3、3−ジメチル−5−(N−ホルミルアミノメチル)−1−テトラデシル−(2H)−インドール−2−イリデン)−1−プロペニル]−1−ドコサニル−ベンゾキサゾリウムヨウ化物(7)(305mgs、20%)を生成した。 The product, flash column chromatography (silica gel, 5% methanol in methylene chloride) to give 2- [3- (2,3-dihydro-3,3-dimethyl-5-(N-formylaminomethyl ) -1-tetradecyl - (2H) - indol-2-ylidene) -1-propenyl] -1-docosanyl - generating the benzoxathiol tetrazolium iodide (7) (305mgs, 20%).
上記のaのように調整した25mlsの濃縮HCL:メタノール溶液を、2−[3−(2、3−ジヒドロ−3、3−ジメチル−5−(N−ホルミルアミノメチル)−1−テトラデシル−(2H)−インドール−2−イリデン)−1−プロペニル]−1−ドコサニル−ベンゾキサゾリウムヨウ化物(7)(50mgs)に加え、その溶液を室温で16〜24時間攪拌した。 Concentration of 25mls which was prepared as described above in a HCL: methanol solution, 2- [3- (2,3-dihydro-3,3-dimethyl-5-(N-formylaminomethyl) -1-tetradecyl - ( 2H) - indol-2-ylidene) -1-propenyl] -1-docosanyl - benzoxathiol tetrazolium iodide (7) was added to (50mgs), and the solution was stirred at room temperature for 16 to 24 hours. その後その溶液を氷水(30ml)で希釈し、氷浴槽内で冷却し、飽和重炭酸ナトリウム溶液をゆっくり加えることによってpHを7.5〜8.0に調整した。 Then the solution was diluted with ice water (30 ml), cooled in an ice bath, the pH was adjusted to 7.5-8.0 by the slow addition of saturated sodium bicarbonate solution. その後塩化メチレン(2×50ml)で水相を抽出し、硫酸ナトリウムで結合有機相を乾燥させ、濾過して濃縮し(Buch浴槽 温度0〜5℃)、その後高圧下で乾燥させ、生成物を作成した(8)(48mgs、99%)。 Then the aqueous phase was extracted with methylene chloride (2 × 50 ml), dried and the combined organic phases over sodium sulfate, filtered and concentrated (Buch bath temperature 0 to 5 ° C.), then dried under high pressure, the product was created (8) (48mgs, 99%).
C. C. 5−アミノメチル−1'−ドコサニル−1−テトラデシル−3、3、3'、3'−テトラメチルインドカルボシアニンヨウ化物のテレフタロイルN−ヒドロキシルスクシンイミドエステル誘導体室温、アルゴン大気下でカニューレ管を用いて、乾燥テトラヒドロフラン(30ml)内でテレフタル酸のジ−N−ヒドロキシスクシンイミドエステルの攪拌した溶液(100mgs、0.278mmol)(塩化テレフタロイルをN−ヒドロキシスクシンイミドと反応させることによって調整)に、上記の例3aのようにテトラヒドロフラン(10ml)中で調整した5−アミノメチル−1'−ドコサニル−1−テトラデシル−3、3、3'、3'−テトラメチルインドカルボシアニンヨウ化物の溶液を加えた。 5-aminomethyl-1'-docosanyl-1-tetradecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethyl Indian carbonitrile cyanine iodide terephthaloyl N- hydroxy succinimide ester derivative room temperature, using a cannula tube under argon atmosphere , in dry tetrahydrofuran (30ml) was stirred di -N- hydroxysuccinimide ester of terephthalic acid in solution (100mgs, 0.278 mmol) (adjusted by reaction with terephthaloyl chloride N- hydroxysuccinimide), the above example 3a tetrahydrofuran (10ml) was adjusted in 5-aminomethyl-1'-docosanyl-1-tetradecyl-3,3,3 'as, was added a solution of 3'-tetramethyl indocarbocyanine iodide. その結果得た溶液を2時間攪拌し、その後Buchi上で濃縮した。 The resulting solution was stirred for 2 hours, then concentrated on a Buchi. その結果得た未加工生成物をflashカラムクロマトグラフィ(シリカゲル、塩化メチレン中に5%のメタノール)で精製し、表題の化合物(101mgs、34%)を提供した。 The results obtained raw product was flash column chromatography (silica gel, in methylene chloride 5% methanol) to give provide the title compound (101mgs, 34%).
d. d. 物質P−5−脂肪親和性シアニン抱合体物質P(21mgs、0.013mmol)と、上記の例3cの生成物(30mgs、0.024mmol)の攪拌した溶液に、乾燥ジメチルホルムアミド(10ml)内で、0〜2℃のアルゴン大気内でトリエチルアミン(60ul)を加え、その結果得られた溶液を0〜2℃で4時間攪拌した。 Substance P-5-lipophilic Cyanine conjugate substance P (21mgs, 0.013mmol) and the product of the previous example 3c (30mgs, 0.024mmol) to a stirred solution of the at dry dimethylformamide (10ml) triethylamine (60 ul) was added in an argon atmosphere 0 to 2 ° C., was the resulting solution was stirred for 4 hours at 0 to 2 ° C.. その後、トリフルオロ酢酸(100ul)を付加することによって反応生成物を急冷し、その溶液を250mlのフラスコに移し、水(80ml)で希釈して一晩凍結乾燥させた。 Thereafter, the reaction was quenched product by adding trifluoroacetic acid (100 ul), the solution was transferred to a flask 250 ml, was diluted with water (80 ml) was lyophilized overnight. その結果得られた試料をオクタデシルシリカゲルのカラムを通すことで精製し、最初は80:20:1(メタノール:水:トリフルオロ酢酸)で非抱合ペプチドを溶離し、次に100:2:1(メタノール:水:トリフルオロ酢酸)で目的の生成物を溶離した。 The resulting sample was purified by a passing through a column of octadecyl silica gel, initially 80: 20: 1 to elute unconjugated peptide (methanol: water trifluoroacetic acid), then 100: 2: 1 ( methanol: water to elute the desired product with trifluoroacetic acid). ペプチド−脂肪親和性シアニン抱合体を含む分画を混合し、Buchi上で濃縮し、その残留物を水(50ml)から凍結乾燥させて紫色の粉状の純粋抱合体を生成した(14mgs、40%)。 Peptide - mixed fractions containing the lipophilic cyanine conjugate, concentrated on Buchi, the residue was lyophilized from water (50ml) to produce a powdered pure conjugate purple (14mgs, 40 %). hplcによる純度は90%以上であり、遊離した物質Pより0.02%小さかった。 Purity by hplc was 90% or more was 0.02% less than the free substance P. このようにして得られた抱合体は、以下の構造式で与えられる(物質Pのアミノ酸配列を示すために従来の3文字記号を使用): Thus obtained conjugate is given by the following structural formula (using conventional three letter symbols for the amino acid sequence of substance P):
ペプチドとシアニンリポーターの両者がスペーサ成分にアミノ結合を介して結合しているため、結果として生じた抱合体は、各々in vivoでは比較的安定なはずである。 Since both the peptide and the cyanine reporter are bonded via an amino bond to the spacer component, resulting conjugate should be relatively stable in each in vivo.
e. e. 2−[3−(2、3−ジヒドロ−3、3−ジメチル−5−(+)−ビオチンアミドメチル−1−テトラデシル−(2H)−インドール−2−イリデン)−1−プロペニル]−1−ドコサニル−ベンゾキサゾリウムヨウ化物上記の例3dに記述したように調整した2−[3−(2、3−ジヒドロ−3、3−ジメチル−5−アミノメチル−1−テトラデシル−(2H)−インドール−2−イリジン)−1−プロペニル]−1−ドコサニル−ベンゾキサゾリウムヨウ化物(53mgs、0.055mmol)の溶液を、ジメチルホルムアミド内、アルゴン気体下で氷浴槽内で冷却した。 2- [3- (2,3-dihydro-3,3-dimethyl-5 - (+) - biotin amide methyl-1-tetradecyl - (2H) - indol-2-ylidene) -1-propenyl] -1 docosanyl - benzoxathiol tetrazolium iodide was adjusted as described in the above example 3d 2- [3- (2,3- dihydro-3,3-dimethyl-5-aminomethyl-1-tetradecyl - (2H) - indol-2-ylidine) -1-propenyl] -1-docosanyl - benzoxathiol tetrazolium iodide (53Mgs, a solution of 0.055 mmol), in dimethylformamide, cooled in an ice bath under argon gas. この溶液に、(+)−ビオチン4−ニトロフェニルエステル(23mgs、0.63mmol、Aldrich)を付加し、その後イミダゾール(16mgs、0.23mmol、Aldrich)と溶液を氷浴槽内で1時間攪拌し、室温で一晩おいた。 To this solution, (+) - adding biotin 4-nitrophenyl ester (23mgs, 0.63mmol, Aldrich), then imidazole (16mgs, 0.23mmol, Aldrich) and the solution was stirred for 1 hour in an ice bath, It placed overnight at room temperature. その後、反応混合物をBuchi内で高圧化で濃縮し、残留物にflashクロマトグラフィを実施(シリカゲル、塩化メチレン中7.5%メタノール、その後塩化メチレン中10%メタノール)、表題の化合物を生成した(22mgs、36%)。 Thereafter, the reaction mixture was concentrated under high pressure in a Buchi, implement flash chromatography on the residue (silica gel, 7.5% methanol in methylene chloride, then 10% methanol in methylene chloride) to yield the title compound (22Mgs , 36%).
f. f. 5−{6−(6−(+)−ビオチノイルアミドヘキサンアミド)−ヘキサンアミドメチル}−1'−ドコサニル−1−テトラデシル−3、3、3'、3'−テトラメチルインドカルボシアニンヨウ化物上記例3eに記述したものと同様の方法を、以下の分量の試薬に対して再度使用した:上記のように調整した5−アミノメチル−1'−ドコサニル−1−テトラデシル−3、3、3'、3'−テトラメチルインドカルボシアニンヨウ化物(90mgs、0.09mmol)と、6[(6−(ビオチノイル)アミノ)ヘキサノイルアミノ]カプロン酸N−ヒドロキシ−スクシンイミジルエステル(55mgs、0.097mmol、(Molecular Probes)と、ジメチルホルムアミド(20ml)とイミダゾール(20mgs、0.24m 5- {6- (6 - (+) - biotinyl noil amide hexanamide) - hexanamide methyl} -r-docosanyl-1-tetradecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethyl indocarbocyanine iodide the product above example 3e same manner as described in, and re-used for the reagent of the following amounts: was prepared as described above 5-aminomethyl-1'-docosanyl-1-tetradecyl-3,3, 3 ', 3'-tetramethyl indocarbocyanine iodide (90Mgs, 0.09 mmol) and, 6 [(6- (biotinoyl) amino) hexanoyl amino] caproic acid N- hydroxy - succinimidyl ester (55Mgs, 0 .097Mmol, and (Molecular Probes), dimethylformamide (20ml) and imidazole (20mgs, 0.24m mol)。Flashクロマトグラフィ(シリカゲル、塩化メチレン中10%メタノール)によって、表題の化合物(27.5mgs、21%)を生成した。 By mol) .flash chromatography (silica gel, 10% methanol in methylene chloride) to yield the title compound (27.5mgs, 21%).
化合物2−[3−(2、3−ジヒドロ−3、3−ジメチル−5−(6−{(+)−ビオチンアミド}−ヘキサミドメチル)−1−テトラデシル−(2H)−インドール−2−イリデン)−1−プロペニル]−1−ドコサニル−ベンゾキサゾリウムと、2−[3−(2、3−ジヒドロ−3、3−ジメチル−5−(6−(6(+)−ビオチノイルアミドヘキサミド)−ヘキサミドメチル)−1−テトラデシル−(2H)−インドール−2−イリデン)−1−プロペニル]−1−ドコサニル−ベンゾキサゾリウム塩は、N−ヒドロキシスクシンイミジイル6−(ビオチンアミド)カプロン酸塩と、6[6−((ビオチノイル)アミノ)ヘキサノイルアミノ]カプロン酸N−ヒドロキシスクシンイミジルエステルとから、それぞれ同様に調整した(M Compound 2- [3- (2,3-dihydro-3,3-dimethyl-5- (6 - {(+) - biotinamido} - hexa bromide methyl) -1-tetradecyl - (2H) - indol-2 ylidene) -1-propenyl] -1-docosanyl - and benzoxathiol tetrazolium, 2- [3- (2,3-dihydro-3,3-dimethyl-5- (6- (6 (+) - biotinoyl amide hexa bromide) - hexa bromide methyl) -1-tetradecyl - (2H) - indol-2-ylidene) -1-propenyl] -1-docosanyl - benzoxathiol tetrazolium salt, N- hydroxysuccinimidyl diyl 6- and (biotinamido) caproate, 6 - and a [6 ((biotinoyl) amino) hexanoyl amino] caproic acid N- hydroxysuccinimidyl ester, was prepared in the same manner, respectively (M lecular Probesから入手)。 Available from lecular Probes).
g. g. N−n−ドコサニル−N'−n−テトラデシル−5−トリブチルスタニル−3、3、3'、3'−テトラメチルインド−カルボシアニン塩化物反応機構2に従って表題の化合物を合成した。 N-n-docosanyl-N'-n-tetradecyl-5-tributylstannyl-3,3,3 ', 3'-tetramethyl India - The title compound was synthesized according carbocyanine chloride reaction mechanism 2. 得られた生成物は、化合物(13)の式で与えられ、XおよびX 1はC(CH 32を表し、R/R 1はC 2245 /C 1429を表し、AはClを表している。 The resulting product is given by the formula Compound (13), X and X 1 represents a C (CH 3) 2, R / R 1 represents a C 22 H 45 / C 14 H 29, A is it represents a Cl. 4−インドフェニルヒドラジンを、Blaikieら、 J. 4 India phenylhydrazine, Blaikie et, J. Chem. Chem. Soc. Soc. 313 :296(1924)の方法を用いて調整した。 , 313: 296 was prepared using the method (1924). 水(100ml)に溶解させた硝酸ナトリウム(16.56g、0.24モル、Aldrich)を、氷水(600ml)中の4−イオドアニリン(43.9g、0.20モル、Aldrich)と0〜2℃まで冷却した濃塩酸(200ml)との溶液に、45分間以内に一滴ずつ加えた。 Sodium nitrate dissolved in water (100ml) (16.56g, 0.24 mol, Aldrich) and ice-water (600 ml) solution of 4- Iodoanirin (43.9 g, 0.20 mol, Aldrich) and 0 to 2 ° C. to a solution of concentrated hydrochloric acid (200ml) was cooled to, it was added dropwise within 45 minutes. その反応混合物を、0〜2℃でさらに30分間攪拌し、その後反応混合物の温度を0〜2℃の間に維持しながら、c. The reaction mixture was stirred for further 30 minutes at 0 to 2 ° C., while maintaining the temperature of the reaction mixture is subsequently between 0 to 2 ° C., c. HCl(150ml)中の塩化スズ(II)(151.68g、0.8モル、Aldrich)を90分間以上にわたって一滴ずつ加えた。 HCl (150 ml) solution of tin (II) chloride was added (151.68g, 0.8 mol, Aldrich) dropwise over 90 minutes. この付加ののち、結果として得た溶液を室温まで温めて、3時間攪拌した。 After this addition, the resulting solution was allowed to warm to room temperature and stirred for 3 hours. その後、溶液から分離した黄色い固体を濾過によって集め、氷水(800ml)中に入れ、25%の水性水酸化カリウムでpHを10に調整した。 Thereafter, a yellow solid separated from the solution was collected by filtration, placed in ice-water (800 ml), the pH was adjusted to 10 with 25% aqueous potassium hydroxide. その結果得た固体を濾過によって集め、少量の水で洗浄し、真空下で乾燥させた。 The resulting solid was collected by filtration, washed with a little water and dried under vacuum. その後、その生成物をトルエン(400ml)中に入れ、不溶性不純物を除去するために濾過した。 Then filtered and the product was placed in toluene (400 ml), to remove insoluble impurities. ヘキサン(1200ml)を加え、冷蔵庫で冷却しながら、分離した黄色の針状物を濾過によって集め、ヘキサン(100ml)で洗浄し、高真空下で乾燥させ、純粋4−イオドドフェニルヒドラジン(23.36g、50%)、m. Hexane (1200 ml) was added, while cooling in a refrigerator, the needles of the separated yellow collected by filtration, washed with hexane (100ml), dried under high vacuum, pure 4-Io Dodo phenylhydrazine (23. 36g, 50%), m. p. p. =94℃を生成した。 = To produce a 94 ℃.
Moreauら、 Eur. Moreau et al., Eur. J. J. Med. Med. Chem. Chem. Chim. Chim. Ther. Ther. (3):274−280(1974)の方法を修正して、5−イオド−2、3、3−トリメチル−(3H)−インドレニン(9)を調整した。 , 9 (3): 274-280 Correct the method (1974), 5-iodo-2,3,3-trimethyl - (3H) - was adjusted indolenine (9). 4−インドフェニル−ヒドラジン(23.36g、0.0998モル)と、エタノール(100ml)中の2−メチルブタノン(8.59g、0.0998モル)を、3時間還流した。 4-indophenyl - hydrazine (23.36g, 0.0998 mol) and ethanol (100ml) solution of 2- Mechirubutanon (8.59 g, 0.0998 mol) was refluxed for 3 hours. その後、エタノール(100ml)中に溶解させた濃縮硫酸(9.92g、0.0998モル)を、一時間以上にわたって一滴ずつ加え、その結果得られた溶液をさらに3時間還流した。 Then, ethanol (100ml) concentrated sulfuric acid (9.92 g, .0998 mol) dissolved in the added dropwise over one hour, and refluxed for further 3 hours the resulting solution. 室温まで冷却したのち、沈澱した固体を濾過によって除去し、濾液を80mlまで濃縮し、その後氷水中に注いだ。 After cooling to room temperature, the precipitated solid was removed by filtration, the filtrate was concentrated to 80 ml, then poured into ice water. その後水性溶液を塩化メチレンで抽出し、混合有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過、濃縮して、未加工生成物を生成した(26.9g、95%)。 Then the aqueous solution was extracted with methylene chloride, the combined organic phases were dried over magnesium sulfate, filtered, and concentrated to produce the raw product (26.9g, 95%). 純粋な生成物5−イオド−2、3、3−トリメチル−(3H)−インドレニン(9)(16.7g、59.0%)は、b. Pure product 5-iodo-2,3,3-trimethyl - (3H) - indolenine (9) (16.7g, 59.0%) is, b. p. p. 81〜88℃で0.03mmHgの真空蒸留後に得た。 It was obtained after vacuum distillation of 0.03mmHg at 81 to 88 ° C..
5−イオド−2、3、3−トリメチル−(3H)−インドレニン(2.85g、0.01モル)とn−ドコサニル−4−クロルベンゼンスルホン酸(5.55g、0.01モル)を連続的に4時間攪拌しながら130℃(油浴槽温度)まで加熱した。 5-iodo-2,3,3-trimethyl - (3H) - indolenine (2.85 g, 0.01 mol) and n- docosanyl-4-chlorobenzene sulfonic acid (5.55 g, 0.01 mol) It was heated continuously for 4 hours while stirring 130 ° C. (oil bath temperature). その後冷却した反応混合物を、酢酸エチルから再結晶化し、N−n−ドコサニル−5−イオド−2、3、3−トリメチルインドリニウム4−クロルベンゼンスルホン酸塩(10)(4.62g、59%)m. The cooled reaction mixture was recrystallized from ethyl acetate, N-n-docosanyl-5-iodo-2,3,3-trimethyl indolinium 4-chlorophenyl benzenesulfonate (10) (4.62g, 59% ) m. p. p. =118℃のタンニン結晶を提供した。 = 118 and provided ℃ of tannin crystal.
2、3、3−トリメチル−(3H)−インドレニン(6.36g、0.04モル、Aldrich)とn−テトラデシル−4−クロルベンゼン−スルホン酸塩(15.52g、0.04モル)の両者を130〜135℃(油浴槽温度)で3時間連続的に攪拌しながら加熱熱した。 2,3,3-trimethyl - sulfonate (15.52 g, 0.04 mol) - (3H) - indolenine (6.36 g, 0.04 mol, Aldrich) and n- tetradecyl-4-chlorobenzene both 3 hours heated continuously heated with stirring at 130 to 135 ° C. (oil bath temperature). その後未加工試料をエタノール(200ml)中に溶解させ、次に飽和ヨウ化カリウム溶液(50ml)とともに30分間攪拌した。 Then dissolve the raw sample in ethanol (200 ml), stirred for 30 minutes with next saturated potassium iodide solution (50ml). 冷水(500ml)を加え、沈澱物を濾過によって集め、冷水で十分に洗浄した。 Cold water (500 ml) was added, the precipitate was collected by filtration, washed thoroughly with cold water. 乾燥した未加工物を酢酸エチルから結晶化し、集めた結晶をエーテルで十分に洗浄し、乾燥させて、N−テトラデシル−2、3、3−トリメチルインドリニウムヨウ化物(5)(12.8g、66.8%)m. The dried raw material was crystallized from ethyl acetate, the collected crystals washed well with ether, and dried, N- tetradecyl-2,3,3-trimethyl indolinium iodide (5) (12.8 g, 66.8%) m. p. p. 97℃を生成した。 To produce a 97 ℃.
N−ドコサニル−5−イオド−2、3、3−トリメチルインドリニウム4−クロルベンゼンスルホン酸塩(2.36g、3.0mmol)、N、N'−ジフェニルホルムアミジン(0.59g、3.0mmol、Aldrich)と、無水酢酸(20ml)を50mlの丸底フラスコに入れ、それをアルゴン大気下で還流冷却器と攪拌棒に設置した。 N- docosanyl-5-iodo-2,3,3-trimethyl indolinium 4-chlorophenyl benzenesulfonate (2.36g, 3.0mmol), N, N'- diphenyl formamidine (0.59 g, 3.0 mmol , and Aldrich), placed acetic anhydride (20ml) in a round bottom flask 50 ml, it was placed in a reflux condenser and stir bar under an argon atmosphere. その後、このフラスコをあらかじめ170℃の一定な温度に加熱した油浴槽内に入れ、混合物を60分間還流した。 Thereafter, The flask was placed in an oil bath heated to a constant temperature of advance 170 ° C., the mixture was refluxed for 60 minutes. 次に、その反応フラスコを室温まで冷却し、500mlの三角フラスコに移した。 Then, the reaction flask was cooled to room temperature and transferred to an Erlenmeyer flask 500 ml. その後、そのフラスコを氷浴槽内に入れ、飽和ヨウ化カリウム溶液を加えた。 Then, place the flask in an ice bath, it was added a saturated potassium iodide solution. 15分間攪拌したのち、冷水(250ml)を加え、混合物をさらに15分間攪拌した。 After stirring for 15 minutes, cold water (250 ml) was added and the mixture was stirred for an additional 15 minutes. 沈澱した生成物、N−n−ドコサニル−5−イオド−2−(β−アセトニリドビニル)−3、3−ジメチルインドリニウムヨウ化物(11)(2.37g、91%)m. The precipitated product, N-n-docosanyl-5-iodo-2-(beta-aceto oxanilide vinyl) -3,3-dimethyl-indolinium iodide (11) (2.37g, 91%) m. p. p. =170℃(decomp)を濾過によって集め、乾燥させた。 = 170 ° C. The (decomp) collected by filtration and dried.
N−ドコサニル−5−イオド−2−(β−アセトニリドビニル)−3、3−ジメチルインドリニウムヨウ化物(511mgs、0.59mmol)と、N−テトラデシル−2、3、3−トリメチルインドリニウムヨウ化物(233mgs、0.47mmol)と、無水エタノール(15ml)中の無水酢酸ナトリウム(48mgs、0.59mmol、Aldrich)を室温で24時間攪拌した。 N- docosanyl-5-iodo-2-(beta-aceto oxanilide vinyl) -3,3-dimethyl-indolinium iodide (511mgs, 0.59mmol) and, N- tetradecyl-2,3,3-trimethyl indolinium iodide (233mgs, 0.47mmol) and anhydrous sodium acetate in absolute ethanol (15ml) (48mgs, 0.59mmol, Aldrich) was stirred at room temperature for 24 hours. その後深紅色の混合物を三角フラスコに移し、エタノール(25ml)で希釈した。 Thereafter the mixtures are transferred to deep red in an Erlenmeyer flask and diluted with ethanol (25 ml). その後水(25ml)に溶解させた酢酸銀(492mgs、2.95mmol、Aldrich)を付加し、その溶液を15分間攪拌した。 Then water (25 ml) in The dissolved silver acetate (492mgs, 2.95mmol, Aldrich) was added and the solution stirred for 15 minutes. 次にエタノール(25ml)と飽和塩化ナトリウム溶液を加え、連続的に15分間攪拌した。 Then ethanol (25 ml) and saturated sodium chloride solution, and the mixture was continuously stirred for 15 minutes. その後その溶液を分離漏斗に移し、水(200ml)で希釈し、塩化メチレン(2×100ml)で抽出した。 Then the solution transferred to a separatory funnel, diluted with water (200 ml), and extracted with methylene chloride (2 × 100ml). その有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過、蒸発させ、未加工生成物を提供した。 The organic phase was dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered, and evaporated to provide a raw product. 未加工生成物をflashクロマトグラフィ(シリカゲル、最初に塩化メチレン中5%のメタノール、続いて塩化メチレン中に8%のメタノール)で精製し、N−ドコサニル−N'−テトラデシル−5−イオド−3、3、3'、3'−テトラメチルインドカルボシアニン塩化物(12)(272mg、58%)を生成した。 The raw product was purified by flash chromatography (silica gel, first 5% methanol in methylene chloride, followed by 8% methanol in methylene chloride), N- docosanyl -N'- tetradecyl-5-iodo -3, 3,3 ', produced 3'-tetramethyl indocarbocyanine chloride (12) (272mg, 58%).
N−ドコサニル−N'−テトラデシル−5−イオド−3、3、3'、3'−テトラメチルインドカルボシアニン塩化物(12)(200mg、0.2mmol)を、乾燥トルエン(15ml、水酸化カルシウムから新たに蒸留)中に溶解させ、得られた溶液をアルゴン大気を通して発泡させることによって、ガス抜きを行った。 N- docosanyl -N'- tetradecyl-5-iodo-3,3,3 ', 3'-tetramethyl indocarbocyanine chloride (12) (200mg, 0.2mmol), dry toluene (15 ml, calcium hydroxide freshly distilled) is dissolved in the resulting solution by bubbling through argon atmosphere, it was degassed. 次にBis−(n−トリブチルチン)(0.237ml、0.47mmol、Aldrich)を注射器で加え、テトラキス−(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(2.34mgs、2.0umol、Aldrich)を付加した。 Then Bis- (n-tributyltin) (0.237ml, 0.47mmol, Aldrich) was added via syringe, tetrakis - (triphenylphosphine) palladium (0) added (2.34mgs, 2.0umol, Aldrich) and did. 得られた溶液をアルゴン下で48時間還流した。 The resulting solution was refluxed for 48 hours under argon. その後トルエンを真空下で除去し、その残留物にflashクロマトグラフィ(シリカゲル、塩化メチレン中5%メタノール)を実施し、表題の化合物を得た(13)(71mg、31%)。 Then the toluene was removed under vacuum, the residue flash chromatographed (silica gel, 5% methanol in methylene chloride) was performed to give the title compound (13) (71 mg, 31%). Found M+、1122C 711232 Sn requires 1122。 Found M +, 1122C 71 H 123 N 2 Sn requires 1122.
化合物(13)は、Wilburら、J. Compound (13), Wilbur et al., J. Nucl. Nucl. Med. Med. 、30:216〜226(1989)によって記述された方法を用いた放射性ハロゲン原子との結合のための用途の広い中間体である。 , 30: 216-226 a versatile intermediate for binding of radioactive halogen atom using the method described by (1989).
h. h. 186 Re−キレート脂肪親和性シアニン抱合体上記に示した反応機構5に従って、表題の化合物を調整した。 According to the reaction mechanism 5 shown in 186 Re- chelating Lipophilic Cyanine Conjugates above, to adjust the title compound. この反応に示す参照番号は反応機構5の数字に対応している。 Reference numbers shown in the reaction corresponds to the number of reaction mechanisms 5. 得られた化合物は化合物24の式で与えられ、XおよびX 1はC(CH 32を表し、R/R 1はC 1429 /C 2245を表し、AはIを表している。 The resulting compound given by the formula Compound 24, X and X 1 represents a C (CH 3) 2, R / R 1 represents a C 14 H 29 / C 22 H 45, A is representative of the I there.
二官能キレート剤である、400μLのテトラヒドロフラン(THF)中に溶解した化合物22(84.5mg、0.291mmol)を(8)(66.8mg、0.066mmol)を含む梨型フラスコに連続的に加えた。 Is a bifunctional chelating agent, compounds were dissolved in 400μL of tetrahydrofuran (THF) 22 a (84.5mg, 0.291mmol) (8) (66.8mg, 0.066mmol) successively pear-shaped flask containing added. この溶液を室温で攪拌した。 The solution was stirred at room temperature. 薄層クロマトグラフィ(TCL;シリカ、90:10 CH2Cl2:MeOH)によって反応経過を継続した。 Thin layer chromatography (TCL; silica, 90: 10 CH2Cl2: MeOH) and the reaction was continued course by. 4時間後、ヘキサンによって反応混合物を希釈し、75:25のTHF:ヘキサン溶液を作成し、短経路シリカゲル(20g)カラムに入れた。 After 4 hours, the reaction mixture was diluted with hexane, 75: 25 THF: hexane solution was prepared and placed in a short path of silica gel (20 g) column. 溶離液がブロモクレゾールグリーンの陰性反応を示すまで、余剰化合物22を50:50のヘキサン:EtOAcで溶離した。 Until eluent shows a negative reaction of bromocresol green, hexane surplus Compound 22 50:50: and eluted with EtOAc. 溶剤の組成を90:10のCH 212 :MeOHに変更し、化合物22を溶離した。 CH 2 C 12 of the composition of the solvent 90:10: Change in MeOH, and elute the compound 22. その溶剤を減圧下で蒸発させ、65.0mgの化合物23を生成した。 The solvent was evaporated under reduced pressure to yield compound 23 in 65.0 mg.
高磁場の1 H nmr(300MHz)は、以前にホルミルで保護された化合物8で見られたように、3.9ppmから4.5ppmまでのベンジルメチレン陽子の低磁場シフトを示した。 Upfield 1 H nmr (300MHz), as seen in compound 8, which is protected by previously formyl showed downfield shifts of the benzylic methylene protons from 3.9ppm to 4.5 ppm. 4.5ppmと8.4ppmでの信号の相対積分(relative integration)は1:1の結合比を示した。 The relative integration of the signals at 4.5ppm and 8.4ppm (relative integration) is 1: shows a coupling ratio.
生成物の化合物23は、HClガス/エタノール溶液の付加によってHCl塩に変換した。 Compound 23 of the product was converted to the HCl salt by addition of HCl gas / ethanol solution. シュウ酸のエタノール溶液を酸化防止剤として加え、溶液を蒸発させ、蒸留した固体を窒素下で貯蔵した。 Was added an ethanol solution of oxalic acid as an antioxidant, the solution was evaporated and distilled solid was stored under nitrogen.
0.1NのNaOH(0.181mCi/nmol)107μl中の60nmolのNa 186 ReO 4を、150μlの変換キレート溶液(200mgのクエン酸、40mgのSnCl 2 2H 2 Oおよび20mgのゲンチジン酸を2mLのH 2 O中に溶解)に加え、続いて0.1MのNaOH43μLを加えた。 The 60 nmol Na 186 ReO 4 in in 0.1N of NaOH (0.181mCi / nmol) 107μl, 150μl of conversion chelate solution (200mg citric acid, 40 mg of SnCl 2 2H 2 O and 20mg of gentisic acid in 2 mL H in addition to dissolving in 2 O), followed by the addition of 0.1M NaOH43μL. その溶液を1分間、渦状に攪拌し、55℃で10分間加熱した。 The solution for 1 minute, then vortexed and heated at 55 ° C. 10 min. エタノール(0.6gmL)を反応混合物に加え、続いて化合物23(0.8mg、0.69μmol)のエタノール溶液300μLを加えた。 Ethanol (0.6gmL) was added to the reaction mixture followed by Compound 23 (0.8mg, 0.69μmol) was added an ethanol solution 300μL of. 溶液を15秒間渦状に攪拌し、加熱を1時間継続した。 Stirred solution for 15 seconds vortex, and heating was continued for 1 hour.
反応混合物をsemiprepHPLCカラム(Waters Novapak、7.5×300mm)に入れ、A:Bを50:50の勾配からB100%まで、流速4.0mL/分で30分以上にわたって溶離した。 The reaction mixture semiprepHPLC column (Waters Novapak, 7.5 × 300mm) placed in a, A: B from the gradient of 50:50 to B100%, was eluted over 30 minutes or more at a flow rate of 4.0 mL / min. (溶媒Aは、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)と0.05%ゲンチジン酸を含む75:25のH 2 O:CH 3 CN。溶媒Bは、0.1%のTFAと0.05%のゲンチジン酸を含む20:80のCH 3 CN:THF)。 (Solvent A, 75:25 containing 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) and 0.05% gentisic acid H 2 O:. CH 3 CN solvent B, 0.1% TFA and 0.05 % CH 3 20:80 containing gentisic acid CN: THF). 約20分間溶離した分画を、表題化合物を含む分画として確認した。 For about 20 minutes eluted fraction was identified as fractions containing the title compound.
上記の分画を、溶媒1(H 2 O中に0.05%のゲンチジン酸)1で1:1に希釈し、最初に10mLの溶媒2(EtOH中に0.05%のゲンチジン酸)、続いて10mLの溶媒1で洗浄したSep−Pakカラム(C−18、Waters 36805)に入れた。 The above fractions, the solvent 1 with 1 (H 2 O 0.05% gentisic acid in) were diluted 1: 1 (0.05% gentisic acid in EtOH) beginning of 10mL solvent 2, Subsequently Sep-Pak column which was washed with solvent 1 10mL was placed in (C-18, Waters 36805). カラムを10mLの溶媒1、150μLの溶媒2と、および300μLの溶媒2で溶離した。 The column and solvent 2 in a solvent 1,150μL of 10 mL, and was eluted with 300μL of solvent 2. 2気流によって10μLの体積までその溶媒を蒸発させ、その後EtOHで40μLまで希釈した。 N 2 stream through the solvent evaporated to a volume of 10 [mu] L, was diluted to 40μL thereafter EtOH.
た。 It was. 特異的活性は、181mCi/μmolの理論値に対して、186±21mCi/μmolであった。 Specific activity, the theoretical value of 181mCi / μmol, was 186 ± 21mCi / μmol. 生成物の回復は、全Re−186の9%未満であった。 Recovery of the product was less than 9% of the total Re-186. 1日後にHPLCによって放射性純度を測定し94%未満であることを見出した。 It was found to be less than 94% measured radioactive pure by HPLC after 1 day. 不純物(〜5%)の大部分空洞体積(void volume)で見出し、遊離過レニウム酸塩と考えられた。 Heading most open volume of impurities (~5%) (void volume), it was considered free perrhenate.
i. i. 7−N(5−オキソペンタノイル)デアセチルコルチシン脂肪親和性シアニンヒドラゾン抱合体と、酸切断性の測定(a)調整上記の反応機構3に記載した一般的方法に従って表題の化合物を調整した。 Adjusting the title compound according to the general method described in 7-N (5-oxopentanoyl) deacetyl Corti Shin fat and affinity cyanine hydrazone conjugates, acid cleavage of the measurement (a) adjusting the above reaction mechanism 3 . ここにおける引例番号は、反応機構3に示した数字と対応している。 References numbers in this case, in response that a number shown in the reaction mechanism 3. 得られた生成物は化合物19の式で与えられ、XおよびX 1 =C(CH 32 、R/R 1 =C 1429 /C 2245 、AはClを表す。 The resulting product is given by the formula Compound 19, X and X 1 = C (CH 3) 2, R / R 1 = C 14 H 29 / C 22 H 45, A represents Cl.
5−アミノメチル−1'−ドコサニル−1−テトラデシル−3、3、3'、3'−テトラメチルインドカルボシアニンヨウ化物(化合物8)を、RがC 1429 ;R 1がC 2245 ;XおよびX 1 =C(CH 32である反応機構1の一般的方法を用いて調整した。 5-aminomethyl-1'-docosanyl-1-tetradecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethyl indocarbocyanine iodide (compound 8), R is C 14 H 29; is R 1 C 22 H 45; X and X 1 = C (CH 3) was prepared using the general procedure of reaction scheme 1 is 2.
ジメチルホルムアミド(15ml、リチウム水酸化アルミニウムから蒸留)中で、モノメチルグルタル酸塩の攪拌溶液(0.14ml、1.1mmol、Aldrich)に、N−ヒドロキシスクシンイミド(126.5mg、1.1mmol、Aldrich)を室温で加えた。 Dimethylformamide in (15 ml, lithium aluminum hydroxide distillation), stirred solution of monomethyl glutarate (0.14 ml, 1.1 mmol, Aldrich) in, N- hydroxysuccinimide (126.5 mg, 1.1 mmol, Aldrich) It was added at room temperature. この混合物を氷浴槽内で冷却し、ジシクロヘキシルカルボジイミド(226.6mg、1.1mmol)を加えた。 The mixture was cooled in an ice bath, was added dicyclohexylcarbodiimide (226.6mg, 1.1mmol). その反応混合物を徐々に室温まで温め、さらに3時間攪拌した。 The reaction mixture was warmed slowly room temperature and stirred for a further 3 hours. 次に、その反応混合物を新たに調整した化合物8(700mg、0.7mmol)の含むフラスコに移し、この反応混合物を室温で30時間攪拌し続けた。 Then, the reaction mixture was freshly prepared compound 8 (700 mg, 0.7 mmol) was transferred to a flask containing the, the reaction mixture was kept under stirring at room temperature for 30 hours. その後ジメチルホルムアミドを高圧下で除去し、結果として得られた未加工生成物を無水エタノール(250ml)と水(250ml)で希釈した。 Then the dimethylformamide was removed under high pressure, diluted raw product obtained as a result of absolute ethanol (250 ml) with water (250 ml). その後、酢酸銀(434mg、2.6mmol)を加えて30分間攪拌したのち、飽和塩化ナトリウム溶液(100ml)を加え、その混合物をさらに30分間攪拌した。 Thereafter, silver acetate (434 mg, 2.6 mmol) After stirring for 30 min by addition of a saturated sodium chloride solution (100ml) was added and the mixture stirred for an additional 30 minutes. 水層を塩化メチレン(4×100ml)で抽出し、混合有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して濃縮した。 The aqueous layer was extracted with methylene chloride (4 × 100 ml), the combined organic layers were dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated. 残留物に対してflashクロマトグラフィ(シリカゲル、塩化メチレン中で2.5%、続いて10%のメタノールで溶離)を実施し、5−[N−(モノメチルグルタリル)−アミノメチル]−1'−ドコサニル−1−テトラデシル−3、3、3'、3'−テトラメチルインドカルボシアニン塩化物(14)(520mg、63%)を生成した。 flash chromatography respect residue (silica gel, 2.5% in methylene chloride, followed by elution with 10% methanol) was carried out, 5-[N-(monomethyl glutaryl) - aminomethyl] -1' docosanyl-1-tetradecyl-3,3,3 ', produced 3'-tetramethyl indocarbocyanine chloride (14) (520mg, 63%).
得られた5−[N−(モノメチルグルタリル)−アミノメチル]−1'−ドコサニル−1−テトラデシル−3、3、3'、3'−テトラメチル−インドカルボシアニン塩化物(520mg、0.44mmol)の無水エタノール中の攪拌した溶液に、無水ヒドラジン(5ml、Aldrich)をゆっくりと室温で加えた。 The resulting 5-[N-(monomethyl glutaryl) - aminomethyl] -1' docosanyl-1-tetradecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethyl - indocarbocyanine chloride (520 mg, 0. to a stirred solution of absolute ethanol 44 mmol), it was added at room temperature slowly anhydrous hydrazine (5ml, Aldrich). その反応混合物を2時間連続的に攪拌し、その後、回転蒸発させて濃縮し、その残留物に対してflashクロマトグラフィ(シリカゲル、塩化メチレン中10%、続いて30%のメタノールで溶離)を実施し、5−[N−(モノヒドラジノ)グルタリル−アミノメチル]−1'−ドコサニル−1−テトラデシル−3、3、3'、3'−テトラメチル−インドカルボシアニン塩化物(15)(110mg、27%)を生成した。 The reaction mixture was stirred for 2 hours continuously, then rotoevaporated and concentrated, flash chromatography for the residue (silica gel, 10% methylene chloride, followed by eluting with 30% methanol) was carried out , 5-[N-(Monohidorajino) glutaryl - aminomethyl] -1' docosanyl-1-tetradecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethyl - indocarbocyanine chloride (15) (110mg, 27% ) were generated.
無水グルタル酸(111.2mg、0.975mmol、Aldrich)を室温で塩化メチレン(5ml)中の攪拌したデアセチルコルヒチン(16)(0.2902g、0.81mmol、Molecular Probes)に加え、その反応混合物を室温で2時間連続的に攪拌した。 Glutaric anhydride (111.2mg, 0.975mmol, Aldrich) stirred at room temperature in methylene chloride (5ml) was the deacetyl colchicine (16) (0.2902g, 0.81mmol, Molecular Probes) was added to the reaction mixture It was stirred for 2 hours continuously at room temperature. その後、塩化メチレンを回転蒸発で除去し、未加工生成物を高真空下で乾燥させ、7−(N−グルタリル)デアセチルコルヒチン(0.397g、100%)を固体として生成した。 Thereafter, methylene chloride was removed by rotary evaporation, the raw product is dried under high vacuum, 7- (N- glutaryl) deacetyl colchicine (0.397 g, 100%) was produced as a solid.
次に、カルボニルジイミダゾール(0.197g、1.22mmol、Aldrich)を、ジメチルホルムアミド(5mL、水素化リチウムアルミニウムから新たに蒸留)中で7−(N−グルタリル)デアセチルコルヒチン(0.397g、0.83mmol)の溶液を攪拌したものに室温で加え、その反応混合物を室温で2時間攪拌し続けた。 Then, carbonyldiimidazole (0.197 g, 1.22 mmol, Aldrich), and dimethylformamide (5 mL, freshly distilled from lithium aluminum hydride) in 7- (N-glutaryl) deacetyl colchicine (0.397 g, It was added at room temperature to a stirred of 0.83 mmol), the reaction mixture was left to stir at room temperature for 2 hours. この時間内に溶液中に沈澱物が形成された。 Precipitate in the solution in this time was formed. ジメチルホルムアミドを真空蒸留によって除去し、残留物を塩化メチレン(5mL)中に溶解させた。 The dimethylformamide was removed by vacuum distillation, the residue was dissolved in methylene chloride (5 mL). この溶液にテトラブチルアンモニウム水素化ホウ素(250mg、0.972mmol、Aldrich)を加え、その反応混合物を3時間攪拌した。 To this solution tetrabutylammonium borohydride (250 mg, 0.972 mmol, Aldrich) and the mixture was stirred for 3 hours the reaction mixture. 次にこれを水(50mL)の中に注ぎ、有機層を分離し、水層を塩化メチレン(2×25mL)で再抽出した。 Then poured it into water (50 mL), the organic layer was separated, the aqueous layer was re-extracted with methylene chloride (2 × 25mL). 混合有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して濃縮した。 The combined organic layers were dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated. その未加工生成物に対してflashクロマトグラフィ(シリカゲル、塩化メチレン中10%メタノール)を実施し、7−N−(5−ヒドロキシルペンタノイル)デアセチルコルヒチン(17)(72mg、25%)を生成した。 flash chromatography (silica gel, 10% methanol in methylene chloride) for the raw product is carried out to produce a 7-N-(5-hydroxyl pentanoyl) deacetyl colchicine (17) (72 mg, 25%) .
塩化メチレン(5mL)中の7−N−(5−ヒドロキシルペンタノイル)デアセチルコルヒチン(72mg、0.16mmol)溶液に、室温でピリジニウムクロルクロム酸塩(41.3mg、0.19mmol、Aldrich)を加え、その混合物を2時間攪拌した。 7-N- (5- hydroxyl pentanoyl) deacetyl colchicine (72 mg, 0.16 mmol) in methylene chloride (5 mL) was added at room temperature pyridinium chloro chromate (41.3 mg, 0.19 mmol, Aldrich) and It was added and the mixture was stirred for 2 hours. その後、それを水(50mL)中に注ぎ、有機層を分離し、水層を塩化メチレン(2×25mL)で再抽出した。 Thereafter, it is poured into water (50 mL), the organic layer was separated, the aqueous layer was re-extracted with methylene chloride (2 × 25mL). 結合有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して濃縮した。 The combined organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated. 得られた残留物に対してflashクロマトグラフィ(シリカゲル、塩化メチレン中10%メタノール)を実施し、7−N−(5−オキソペンタノイル)デアセチルコルヒチン(18)(35mg、49%)を油として生成した。 flash chromatography (silica gel, 10% methanol in methylene chloride) to the residue obtained was conducted, 7-N-a (5-oxo-pentanoyl) deacetyl colchicine (18) (35 mg, 49%) as an oil It generated.
無水エタノール(20ml)中の5−[N−グルタリル(モノヒドラジノ)−アミノメチル]−1'−ドコサニル−1−テトラデシル−3、3、3'、3'−テトラメチルインドカルボシアニン塩化物溶液(110mg、0.12mmol)を、7−N−(5−オキソペンタノイル)デアセチルコルヒチン(40mg、0.088mmol)を含むフラスコに加え、その反応混合物を20時間攪拌した。 Absolute ethanol (20ml) solution of 5-[N-glutaryl (Monohidorajino) - aminomethyl] -1' docosanyl-1-tetradecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethyl indocarbocyanine chloride solution (110 mg the 0.12mmol), 7-N- (5- oxo-pentanoyl) deacetyl colchicine (40 mg, 0.088 mmol) was added to the flask containing the reaction mixture was stirred for 20 hours. その後エタノールを回転蒸発によって除去し、その残留物に対してflashクロマトグラフィ(シリカゲル、塩化メチレン中10%のメタノール)を実施し、表題の化合物を提供した。 Then ethanol was removed by rotary evaporation, the flash chromatography respect residue (silica gel, 10% methanol in methylene chloride) was performed to provide the title compound. (19)(26.5mg、27%)。 (19) (26.5mg, 27%). この化合物の200MHzプロトンNMRの積算は1:1の結合比を示し、高速原子衝突質量分光法(グリセロール/チオグリセロール複合体)では、生成イオンC 9013568の期待されるM +に対応し、M + =1429を示した。 This integration of 200MHz proton NMR of Compound 1: 1 shows the binding ratio, the fast atom bombardment mass spectrometry (glycerol / thioglycerol complex) are expected to produce ion C 90 H 135 N 6 O 8 M + corresponds to, it showed the M + = 1429. さらにこの生成物は、以下に記述する条件に従って、逆相高圧流体クロマトグラフィ(HPLC)によって特徴付けられ、55分間の保持時間を備えていた。 In addition, this product, according to the conditions described below, characterized by reverse-phase high pressure fluid chromatography (HPLC), was equipped with a retention time of 55 minutes. 350nmにおけるUV検出を用いて、98%の純度であることが見出された。 With UV detection at 350 nm, it was found to be 98% pure. 0.30%未満の遊離7−N−(5−オキソペンタノイル)デアセチルコルヒチン(保持時間=12分)がこの生成物中に検出された。 Free of less than 0.30% 7-N- (5- oxo-pentanoyl) deacetylcolchicine (retention time = 12 min) were detected in the product.
使用したHPLCシステムは、W600E勾配コントローラとU6K注入装置およびModel 990フォトダイオード配列検出装置を備えたWaters Model 600E溶媒供給装置で構成されている。 HPLC system used is composed of a Waters Model 600E solvent delivery system equipped with W600E gradient controller and U6K implanter and Model 990 photodiode array detector. クロマトグラフィの条件は、以下の通りである:カラム:Waters Nova−Pak(フェニル、4μm、3.9mm×15cm);Mobile相:溶媒A=水:メタノール:アセトニトリル:PIC A試薬(水)(395:25:80:4)、溶媒B=水:メタノール:アセトニトリル:PIC A試薬(水)(225:25:250:4)、溶媒C=メタノール:水:PIC A試薬(水)(490:15:4)。 Conditions of chromatography are as follows: Column: Waters Nova-Pak (phenyl, 4μm, 3.9mm × 15cm); Mobile phase: solvent A = water: methanol: acetonitrile: PIC A reagent (water) (395: 25: 80: 4), solvent B = water: methanol: acetonitrile: PIC A reagent (water) (225: 25: 250: 4), solvent C = methanol: water: PIC A reagent (water) (490: 15: 4). 勾配条件:20分以上で100%(A)から60%:40%(A:B)、その後10分以上で100%(C)まで、さらに40分で100%(C)。 Gradient Conditions: 100% 20 minutes or more (A) from 60%: 40% (A: B), 100% at 10 minutes or more (C) up, even 100% in 40 min (C). 流速:2mL/分。 Flow rate: 2mL / minute. 検出:240〜575nmのフォトダイオード配列。 Detection: 240~575nm photo diode array of.
(b)酸切断性の測定7−N−(5−オキソペンタノイル)デアセチルコルヒチンを生成するヒドラゾン抱合体(19)の酸加水分解率を、異なる3種類のpHにおけるHPLCによって調査した。 (B) acid cleavage of measurement 7-N-(5-oxo-pentanoyl) de hydrazone conjugates to produce acetyl colchicine acid hydrolysis rate (19), was investigated by HPLC in three different pH.
緩衝液をGomoriの、“Methods in Enzymology”、 16 :138(1955)の記述した方法に従って調整した。 Buffer of Gomori, "Methods in Enzymology", 16: was prepared according to the process described for 138 (1955). HPLC条件と保持時間は、上述のものと同一であった。 HPLC conditions and retention times were the same as described above. 7−N−(5−オキソペンタノイル)デアセチルコルヒチンの検出限界は、350nmにおいて約100ngとした。 The detection limit of 7-N- (5- oxo-pentanoyl) deacetyl colchicine was about 100ng in 350 nm.
50μlのヒドラゾン抱合体溶液(1mg/mlメタノール)を、目的のpHのクエン酸塩リン酸塩緩衝液(200μl)を含むねじ蓋付きガラスびんに加えて、調査する化合物溶液を調整した。 50μl of hydrazone conjugate solution (1 mg / ml methanol) was added to a glass bottle with a screw cap containing citrate phosphate buffer pH object of (200 [mu] l), to prepare a compound solution to investigate. ガラスびんを閉じ、HPLC(350nmにおける検出)によって溶液を分析し、残っている抱合体(19)、さらに24時間後と48時間後に生成した7−N−(5−オキソペンタノイル)デアセチルコルヒチンを調べた。 Close the vial and the solution analyzed by HPLC (detection at 350 nm), the remaining conjugates (19), further 24 h and after 7-N-(5-oxo-pentanoyl) produced after 48 hours deacetylcolchicine They were examined. 各hplc注入は200μlであった。 Each hplc injection was 200μl.
pH4.21、5.74、7.35における加水分解の結果を以下に要約した。 The results of the hydrolysis in pH4.21,5.74,7.35 summarized below.
pH4.21:24時間後において、(19)の78%が切断されて(18)を生成し、48時間後に100%が切断された。 PH4.21: after 24 hours, (19) 78% is cleaved of generating (18), was cleaved 100% after 48 hours.
pH5.74:24時間後において、(19)の45%が切断されて(18)を生成し、48時間後に100%が切断された。 PH5.74: after 24 hours, (19) 45% is cleaved of generating (18), was cleaved 100% after 48 hours.
pH7.35:24時間後において、(19)の36%が切断されて(18)を生成し、48時間後に77%が切断された。 pH 7.35: after 24 hours, 36% (19) is cut to generate (18), was cut 77% after 48 hours.
HPLCによって検出されたヒドラゾン抱合体の遊離コルヒチンヒドロリシス生成物だけが化合物(18)のアルデヒドであると考えられた。 Only free colchicine hydro lysis product hydrazone conjugate detected by HPLC was considered aldehyde compound (18).
(j)ヘパリン脂肪親和性シアニン抱合体表題の化合物を、上記の反応機構4に記載した一般的方法に従って調整した。 The (j) heparin lipophilic cyanine conjugates title compound was prepared according to the general method described in reaction scheme 4 above. この引例番号は、反応機構4の数字に対応している。 This reference number corresponds to the number of reaction mechanism 4. 得られた生成物は化合物21によって表される種類の式を備え、XおよびX 1 =C(CH 32 、R/R 1 =C 1429 /C 2245 、A=Clである。 The resulting product comprises a kind of expression represented by compound 21, is X and X 1 = C (CH 3) 2, R / R 1 = C 14 H 29 / C 22 H 45, A = Cl .
上述したように化合物8を調整した。 It was prepared Compound 8 as described above.
新たに調整した化合物8(18.0mg、18.0μmol)を、NMR管中で、重水素化クロロホルム(0.5ml、Aldrich)中に溶解させた。 Newly adjusted Compound 8 (18.0mg, 18.0μmol) and, in a NMR tube and dissolved in deuterated chloroform (0.5 ml, Aldrich). その後トリエチルアミン(5μl、0.036mmol)、続いてトリホスゲン(1.95mg、6.7μmol、Aldrich)を加え、この混合物を2分間振った。 Then triethylamine (5 [mu] l, 0.036 mmol), followed by triphosgene (1.95mg, 6.7μmol, Aldrich) was added and shaking the mixture for 2 minutes. その後、プロトンNMRを実施し、化合物(8)で見られたようにベンジル陽子中の3.95から4.95へのシフトを示し、生成物5−イソシアン酸メチレン−1'−ドコサニル−1−テトラデシル−3、3、3'、3'−テトラメチルインドカルボシアニン塩化物(20)の形成を示した。 Then, conduct proton NMR, the compound shows a shift from 3.95 in benzyl protons as seen in (8) to 4.95, the product 5-isocyanate-methylene-1'docosanyl-1 tetradecyl-3,3,3 ', indicating the formation of 3'-tetramethyl indocarbocyanine chloride (20).
イソシアン酸塩の重水素化したクロロホルム溶液(20)を回転蒸留によって濃縮し、その残留物をジメチルホルムアミド(4ml、乾燥させて蒸留)の中に溶解させ、急速に攪拌した。 Deuterated chloroform solution of the isocyanate (20) was concentrated by rotary evaporation, the residue dimethylformamide was dissolved in (4 ml, dried by distillation), it was stirred rapidly. このように急速に攪拌した溶液に、ヘパリンのホルムアミド溶液(9.4mg/ml、2ml、0.0016mmol)を加え、さらにフラスコに蓋をし、室温で20時間攪拌した。 Such rapidly stirred solution, heparin formamide solution (9.4mg / ml, 2ml, 0.0016mmol) was added, further the flask was capped and stirred at room temperature for 20 hours. 次に濾過によって不溶性物質を除去し、濾過液を50℃で高真空下で回転蒸留によって濃縮した。 Then the insoluble material was removed by filtration, the filtrate was concentrated by rotary evaporation under high vacuum at 50 ° C.. 残留物を水(20ml)と塩化メチレンの混合物に加えた。 The residue was added to a mixture of methylene chloride and water (20ml). 水層を分離し、塩化メチレンで再度洗浄した。 The aqueous layer was separated and washed again with methylene chloride. 次に、水性溶液を透析バッグ(Spectra/Por膜 MWCO:1000)に入れ、水を透析し、その後凍結乾燥させて、ピンク色の固体を生成した(24.3mg)。 Then, the aqueous solution dialysis bag (Spectra / Por membrane MWCO: 1000) to put, dialyzed water, and then lyophilized to yield a pink solid (24.3 mg). この物質をさらに精製することなく、化合物21と未反応ヘパリンの混合物であるとみなした。 Without further purification this material was regarded as compound 21 as a mixture of unreacted heparin. それを、生物学的評価のために使用した(例14を参照)。 It was used for biological evaluation (see Example 14).
例4 Example 4
治療上有効な蛋白質を脂肪親和性分子に抱合させることの生物学的作用上記の例3dで生成した化合物のin vivoのレセプタ薬理学を、U. The receptor pharmacology of in vivo therapeutically active compounds that proteins produced in biological effects above example 3d of be conjugated to lipophilic molecules, U. Forstermannら、J. Forstermann et al., J. Pharmacol. Pharmacol. Exp. Exp. Ther. Ther. 、234:1055〜61(1987)が記述した方法と同様にして、血液を潅流させたウサギの後肢標本で調査した。 , 234: 1055-61 (1987) is in a manner similar to that described, were investigated in the hind limb specimens rabbits were perfused with blood. ペントバルビタールで麻酔し、人工的に換気させたウサギのカニューレを挿入した頚動脈から血液を取り出し、定速ローラーポンプを用いて医療等級のsilastic管内を通過させ、カニューレを挿入した大腿動脈に導いた。 Were anesthetized with pentobarbital, removed artificially ventilated allowed rabbit blood cannula from the inserted carotid artery, passed through a silastic tube medical grade with constant speed roller pump, it led to femoral artery cannulated. 大腿動脈床における末端潅流圧(mmHg)を、微小圧変換器(Millar)が大腿カテーテル先端の僅か先に位置するように潅流管を通るようにして測定した。 Terminus perfusion pressure in the femoral artery bed (mmHg), micro-pressure transducer (Millar) was measured as through the perfusion tube so as to be positioned slightly away femoral catheter tip. 最初に、末端潅流圧が全身平均動脈圧に近付くようにポンプ速度を調整し、その後残りの各実験の間は血流を一定に維持した。 First, end perfusion pressure by adjusting the pump speed to approach the systemic mean arterial pressure during subsequent remainder of each experiment was maintained blood flow constant. その後、抵抗の変動は、オームの法則が記述するのと同様に末端潅流圧に従って次のように変化する: Then, variation of resistance, Ohm's law is changed as follows to according Similarly terminus perfusion pressure and to describe:
血管抵抗=潅流圧/血流したがって、各実験時に血流を一定に維持することによって、圧力の低下が血管拡張を意味し、圧力の上昇が血管収縮を意味するように、末梢潅流圧の変化が直接血管抵抗に反映される。 Vascular resistance = wants flowed perfusion pressure / blood, by maintaining blood flow constant during each experiment, as the pressure drop is meant vasodilatation, increase of the pressure means vasoconstriction, changes in peripheral perfusion pressure There is reflected in the direct vascular resistance. したがって、血管の生物学と、in vivoで血管平滑筋の緊張に作用を及ぼすと考えられる物質の薬理学を分析するために、潅流系への直接的な注入を利用することができる。 Therefore, in order to analyze and biology of the vessel, the pharmacology of substances believed to act on the tension of the vascular smooth muscle in vivo, and can be utilized directly injected into the perfusion system.
図1は、物質Pと例3dの抱合体のin vivoでの反応の定性的な同一性を示す。 Figure 1 shows the qualitative identity of the reaction in in vivo of the conjugates of substance P and Example 3d. 物質Pと抱合体の両者が、潅流したウサギの後肢標本に局所的に注入したときに、短時間の投与量に関連した後肢潅流圧の低下を生じている。 Both substances P and conjugates, when injected locally into hind specimens rabbit perfusion, occurs a reduction in associated hindlimb perfusion pressure to the dose of a short time. これらの拡張薬の反応は、物質Pの既知の血管薬理学と完全に一致している。 The reaction of these dilators are entirely consistent with the known vascular pharmacology of substance P. 例えば、J. For example, J. Benyら、 J. Beny et al., J. Physiol. Physiol. 398 :277から89(1988)を参照。 , 398: 277 refers to the 89 (1988) from.
図2に見られるように、物質Pと抱合体の反応の間には定量的な差が存在する。 As seen in FIG. 2, there are quantitative differences between the reactions with substances P conjugate. 物質Pの平均投与量閾値はおよそ0.003pmolesの潅流圧の低下が起こることを必要としているのに対し、圧力の最大の低下は3〜10pmolesの投与量範囲で達成されている。 While average dose threshold substance P is in need of a decrease of approximately 0.003pmoles perfusion pressure occurs, the maximum drop in pressure is achieved in the dose range of 3~10Pmoles. 潅流圧の低下を引き起こすのに必要な抱合体の最小投与量は物質Pの場合よりも大きく、1〜10pmolesであり、最大の低下は1000pmolesのときに達成している。 The minimal dosage of conjugate required to cause a reduction in the perfusion pressure is greater than in the material P, a 1~10Pmoles, greatest reduction is achieved when the 1000Pmoles. 論理関数によって物質Pと抱合体について計算したED 50値は、それぞれ0.13と34pmolesであり、物質Pの効力が250倍大きいことを示している。 ED 50 values calculated for conjugates and substance P by the logic function are respectively 0.13 and 34Pmoles, indicates that the 250-fold greater potency of substance P. しかし、どちらの物質も通常のレセプタの相互作用に一致する平行な投与量−反応曲線の勾配を示した。 However, parallel dose Both substances matching the interaction of normal receptor - showed a gradient of response curves. さらに図2は、既知の物質Pの拮抗薬である[D−PRO 2 、D−Trp 7,9 ]−物質Pの注入時の物質Pと抱合体の投与量−反応関係も示している。 Further Figure 2 is an antagonist of the known substance P [D-PRO 2, D -Trp 7,9] - dosage of a substance P when injected substance P conjugate - also shows response relationship. このDアミノ酸との位置3における合成ペプチドは、内因性物質Pと外因性に投与した物質Pのニューロン、行動および血管作用に拮抗することが報告されてきた。 The synthetic peptide at position 3 with D amino acids, endogenous substances P and exogenous in administered substance P neurons, have been reported to antagonize the behavioral and vasoactive. 物質Pと抱合体の両者に対する潅流圧の低下は、拮抗薬が存在するときの両化合物の投与量−反応曲線の右側への平行な移動によって分析されるように、[D−PRO 2 、D−Trp 7,9 ]−物質Pによって抑制される。 Decrease in perfusion pressure to both substance P and the conjugate, the dosage of both compounds when there are antagonists - as analyzed by parallel movement to the right of the response curve, [D-PRO 2, D -Trp 7, 9] - it is suppressed by the substance P. 拮抗薬存在下での投与量−反応曲線の右向きの移動の大きさは、物質Pと抱合体に関して同様であり、これらの二つの物質が共通のレセプタ部位に作用することをさらに示唆している。 Dose in the presence of antagonist - right magnitude of movement of the response curve is similar with respect to the substance P conjugates, these two materials are further suggests that act on a common receptor site . 図2に記載したデータは、3頭のウサギを含む試験に基づいたものであり、最大反応から拮抗薬非存在下での物質Pまでの潅流圧の平均(±SEM)変化率として表している。 Data described in Figure 2 is one based on tests involving three rabbits are expressed as the mean perfusion pressure until the material P in antagonist absence from the maximum reaction (± SEM) change rate .
上記に加えて、対応する非抱合脂肪親和性シアニンの1および10nmolesの濃度における投与が、血管弛緩作用をまったく示さなかったことが実験的に確認された。 In addition to the above, administration in concentrations of 1 and 10nmoles corresponding unconjugated lipophilic cyanine, it showed no vascular relaxing action was observed experimentally. さらに、βアドレナリン受容体作用薬であるイソプロテレノールの1、10、100pmolesの濃度における投与もまた、潅流圧の投与量に関連した低下を生じたが、それはSP拮抗薬[D−PRO 2 、D−Trp 7,9 ]−SPによって拮抗されることはなく、SPレセプタに対する[D−PRO 2 、D−Trp 7,9 ]−SPの特異性を示した。 Furthermore, the administration at concentrations 1,10,100pmoles isoproterenol a β-adrenergic receptor agonists also produced a decrease in relation to the dose of perfusion pressure, it SP antagonist [D-PRO 2, D-Trp 7,9] not be antagonized by -SP, it showed [D-PRO 2, D- Trp 7,9] -SP specificity for SP receptors.
1mMのEDTAと0.5%のウサギ血清アルブミンを加えたリン酸塩緩衝食塩水に懸濁した、洗浄したウサギの赤血球に例3dの抱合体(100uM)を容易に結合させ、両者をともにex vivoで培養した。 Were suspended in phosphate buffered saline plus 1mM of EDTA and 0.5% rabbit serum albumin, easily to bind the conjugate of Example 3d (100 uM) in erythrocytes washed rabbit, both together ex They were cultured in vivo. 抱合体の蛍光成分によって、フロー血球計算法を用いたRBCでの素早い検出が可能になる。 The fluorescent component of the conjugate allows rapid detection in RBC using flow cytometry. 抱合体で標識したウサギのRBCをウサギの後肢内に注入すると、潅流圧の低下が生じ、その大きさは注入した細胞の数に関係する。 When the RBC rabbit labeled with conjugate is injected into the hind limb of rabbits caused a decrease in perfusion pressure, whose magnitude is related to the number of injected cells. 別の実験は、10 6 〜10 9個のRBCの注入によってウサギの後肢標本の潅流圧が大きく低下したことを示した。 Another experiment showed that the perfusion pressure of the hind specimens rabbits was significantly decreased by injection of 10 6 to 10 9 of RBC. 抱合体で標識したRBCの標本を上澄み液分画と細胞分画に分離し、それを上記のRBC緩衝液に再懸濁して再注入すると、上澄み液分画が本来の細胞懸濁液の生物学的活性の大部分を含み、抱合体がRBCを拡散させる能力を備えていることを示す。 Specimens labeled RBC in conjugate was separated into supernatant fraction and cell fraction, when it is re-injected resuspended in RBC buffer above supernatant fraction organisms of the original cell suspension wherein the majority of the biological activity indicates that the conjugates have the ability to diffuse the RBC. RBCの洗浄を繰り返すことによって血管拡張作用を備える上澄み液分画が生じ、RBCからの、抱合体の放出能力の延長を示唆する。 Supernatant fraction occurs with vasodilatory activity by repeated washing of the RBC, suggests from RBC, prolonged release capability of the conjugate.
前述の実験から、上記の例3dの物質P脂肪親和性シアニン抱合体は自然の物質Pの作用と定性的に同様な血管拡張作用を備え、このような作用は物質Pレセプタの既知の拮抗薬によって拮抗されうるものであることが理解される。 From the foregoing experiments, substance P lipophilic cyanine conjugate of the above example 3d has a qualitatively similar vasodilating action and the action of the natural substances P, known antagonists of such effect materials P receptor it is one that can be antagonized understood by. これらの実験結果は、脂肪親和性リポーター分子との化学的抱合に関わらず、物質Pとそのレセプタの相互作用が維持されることを示す傾向がある。 These experimental results, regardless of the chemical conjugation with lipophilic reporter molecule, tend to indicate that interaction of the receptor and substance P is maintained.
例5 Example 5
脂肪親和性シアニンで誘導させた物質Pの構造と生物学的相互作用への細胞結合の効果の測定例3dの抱合体の物質P成分が構造的に受けておらず、末梢赤血球(RBC)の表面に認識可能であることを測定するために、2mlのヒトRBC(10 6細胞/ml)を抱合体(10μM;赤の蛍光性)を用いて標識し、その後フロー血球計算法を使用して調査した。 Substance P component of the conjugate measurement example 3d of the effect of cell binding to structural and biological interactions of a substance P which was induced by the lipophilic cyanine not received Structurally, the peripheral red blood cell (RBC) to measure that is recognizable on the surface, human RBC (10 6 cells / ml) the conjugate of 2 ml; labeled with (10 [mu] M fluorescent red), then using flow cytometry investigated. この調査の結果を図3A〜Cに示す。 The results of this survey are shown in Figure 3A~C. 特別に、未処理のRBCと抱合体で標識したRBCを分析して以下のことを測定した: Specially, it was to analyze the labeled RBC in RBC and conjugate untreated measures that:
1. 1. 抱合体が細胞表面上に結合していること(図3Aの比較)。 The conjugate is bound on the cell surface (compare Figure 3A).
2. 2. イソチオシアン酸フルオレセイン(FITC)を抱合したヤギ抗ウサギ抗体が抱合体標識RBCあるいは非標識細胞に非特異的に結合すること(図3Bの比較)、あるいは3. The goat anti-rabbit antibody conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) is non-specifically bound to the conjugate-labeled RBC or non-labeled cells (compare Fig. 3B), or 3. ウサギ抗物質P抗体+FITC抗ウサギ抗体が抱合体標識RBCに特異的に結合すること(図3Cの比較)。 The rabbit anti-substance P antibody + FITC anti-rabbit antibody that specifically binds to the conjugate-labeled RBC (comparison of Fig. 3C).
図3Aでは、未染色RBCの検査では、バックグラウンドの自己蛍光(緑(LFL1)と赤(LFL2)の軸の起点の近くに位置する細胞母集団)のみを示したが、抱合体標識細胞は、非標識細胞に比べて赤の蛍光信号の増大を示した。 In Figure 3A, the examination of unstained RBC, showed only background autofluorescence (green (LFL1) and red (LFL2) cells population located near the origin of the axis of) conjugate labeled cells showed increased red fluorescent signal when compared to the non-labeled cells.
図3Bでは、図3Aの結果に比べ、緑の蛍光信号(LFL1)の小さな増大によって証拠付けられるように、フルオレセインで染色したヤギ抗ウサギ抗体による抱合体標識細胞の処理が、この抗体がRBCに対して最小の非特異的結合のみを行ったことを示した。 In Figure 3B, as compared to the results of FIG. 3A, as evidenced by a small increase in green fluorescent signal (LFL1), the processing of the conjugates labeled cells by staining with goat anti-rabbit antibody with fluorescein is, the antibody to RBC It showed that where only minimal non-specific binding against.
図3Cは、ウサギ抗物質P抗体を用いて一次試薬として間接的に蛍光標識し、その後二次試薬としてヤギ抗ウサギ抗体でフルオレセイン染色した非標識RBCあるいは抱合体標識RBCの蛍光ヒストグラムを示す。 Figure 3C is indirectly fluorescently labeled as the primary reagent with rabbit anti-substance P antibody, then show fluorescence histograms of unlabeled RBC or conjugates labeled RBC was fluorescein stained with goat anti-rabbit antibody as the secondary reagent. 抱合体標識細胞では、細胞上に顕著な量の緑および赤の蛍光が検出可能であり(LFL1信号が図3Bよりも増大)、細胞結合抱合体に対する特異的結合を示している。 The conjugate-labeled cells, green and red fluorescence significant amount on a cell are possible detection (LFL1 signal is increased than Figure 3B), shows specific binding to cell-bound conjugate. この蛍光の増大は、抱合体で標識しなかったRBCでは認められなかった。 This increase in fluorescence was not observed in not labeled RBC in conjugates. したがってこの方法は、物質Pが抗物質P抗体によって抗原性にRBCの表面上に”認識”されたことを示し、赤血球上における物質Pの構造の存在と維持を確認する。 Thus, the method indicates that the substance P is "recognized" on the surface of the RBC to antigenic by anti substance P antibody, confirming the maintaining the presence of the structure of the substance P on erythrocytes.
例6 Example 6
赤血球細胞上における物質P−脂肪親和性シアニン抱合体のIn Vivoでの安定性の測定上記の例3dの抱合体で標識した赤血球細胞のin vivoでの特徴を調査するために、2頭のウサギのそれぞれから得た0.5mlの新鮮な抗凝固化血液を抱合体(最終濃度10μM)で標識し、血液を採取した同一のウサギに再注入した。 To investigate the characteristics of the in vivo red blood cells labeled with conjugate stability measurements above example 3d in In Vivo substance P- lipophilic cyanine conjugate on red blood cells, 2 rabbits of 0.5ml of fresh anticoagulated blood obtained from each labeled with conjugate (final concentration 10 [mu] M), was re-injected into the same rabbit blood was taken. 抱合体による標識後、注入に先立って標識細胞のアリクウォットをフロー血球計算法を用いて検査し、標識が適切に行われたことを確認した。 After labeling with conjugate, the aliquots of labeled cells were examined by flow cytometry prior to injection, labeling was confirmed that it was properly performed. 標識細胞のin vivoでの投与に続いて、30分、1、2、3、4、および7日目の時点で血液標本を取り出し、フロー血球計算法を用いて細胞の蛍光性を検査した。 Following in vivo administration of labeled cells, 30 minutes, 1, 2, 3, 4, and take out blood samples at day 7 were examined fluorescent cells by flow cytometry.
本調査の結果を図4のグラフに示したが、そのグラフから、標識細胞からの抱合体のin vivoでの分離が比較的ゆっくりとした速度で起こることを理解することができる。 The results of this study has been shown in the graph of FIG. 4, it is possible to appreciate from the graph, takes place at a speed separation of the in vivo conjugate from labeled cells were relatively slow. 標識細胞に関する蛍光(対数蛍光強度)は5〜6日間の半減期で低下したが、自然の物質Pの循環における寿命は分単位であった。 Fluorescent for labeled cells (log fluorescence intensity) was reduced with a half-life of 5-6 days, the life in the circulation of the natural substance P was minutes.
したがって、上記の実験結果から、治療薬を備える脂肪親和性分子によるバイオ粒子の標識は、治療薬の非経口投与において革新的な供給賦形剤を提供することが明らかになる。 Therefore, from the above experimental results, labeled bio particles according to lipophilic molecules with therapeutic agents, it is clear that providing innovative supply excipients in parenteral administration of a therapeutic agent.
例7 Example 7
色素結合、細胞の生存可能性および膜結合安定性に対するヨウ化の作用本化合物の化合物へのヨウ素原子の付加が、その細胞標識特性に対して実質的に影響を及ぼさないことを実証するために、化合物のin vitroでの取り込み、標識後の細胞の生存可能性、および膜保持の測定を以下の化合物について実施した: Dye binding, for the addition of an iodine atom to a compound of action the compounds of iodide on the viability and membrane binding stability of the cells demonstrates that substantially no effect on the cell labeling properties , uptake in in vitro of the compounds, the viability of cells after labeling, and the measurement of the film holding were performed for the following compounds:
前述の反応機構1に記載し、上記の例3に記述した一般的な方法に従って、化合物T、AA、ABを調整することができる。 Described in reaction scheme 1 above, according to the general method described in Example 3 above, it is possible to adjust compound T, AA, and AB.
SlezakとHoran、 Blood74 :2172〜2177(1989)が記述したように、5、10、20μMの標識濃度と、化合物AAとABについては5または10μMの標識濃度で回復と生存可能性を計算した。 Slezak and Horan, Blood, 74: 2172~2177 ( 1989) as has been described, the labeling density of 5,10,20MyuM, calculate the viability and recovery labeled concentration of 5 or 10μM for Compound AA and AB did. しかし、化合物AAとABでは20μMの標識濃度において生存可能性と回復が70〜80%に低下した。 However, viability and recovery in labeling concentrations of compound AA and AB at 20μM was reduced to 70-80%.
1個の細胞当たりに結合した化合物分子の数を、10μMの化合物で標識した細胞について測定した。 The number of compound molecules bound per one cell were measured for cells labeled with a compound of 10 [mu] M. 最終再懸濁と計数後に洗浄した細胞から10 6個の細胞のアリクウォット(10ul)を取り出し、250μlの100%エタノールとの混合物によって細胞膜から化合物を抽出し、蛍光microplate readerFluoroskan IIとフィルターの組み合わせを用いて抽出物200μlの蛍光強度を測定した。 The final resuspension from washed cells of 106 cells after counting aliquot (10 ul) was taken out, with a mixture of 100% ethanol 250μl extract the compound from the cell membrane, using a combination of fluorescent microplate readerFluoroskan II and filters the fluorescence intensity of the extract 200μl Te were measured. 100%エタノール中で作成し、FluoroskanIIで測定した既知の化合物濃度のキャリブレーション曲線から各抽出物の化合物濃度を測定した。 Created in 100% ethanol, it was measured compound concentration of each extract from the calibration curve of known compound concentration measured by FluoroskanII. 次に、既知の抽出物濃度、抽出物の全容積、および既知の抽出した細胞数から細胞1個当たりの化合物の分子数を計算した。 Next, the known extract concentration, total volume of extract, and known extracted cell number was calculated the number of molecules of compound per cell. 計算値は、化合物Tが(4.0±0.4)×10 6 、化合物AAが(1.3±0.2)かける10 6 、化合物ABが(2.5±0.7)×10 6であった。 Calculated values, compound T is (4.0 ± 0.4) × 10 6 , compound AA exerts (1.3 ± 0.2) 10 6, compound AB is (2.5 ± 0.7) × 10 It was 6.
NH 4 Cl溶解によって調整した赤血球膜ゴーストを用いて相対的な膜保持を測定した(SlezakとHoran、 Bloodsupra )。 To determine the relative film holder using erythrocyte membrane ghosts adjusted by NH 4 Cl dissolved (Slezak and Horan, Blood, supra). ゴーストを10μMの化合物を用い、4×10 8 /ml、室温で前述の方法を使用して5分間標識した。 With a compound of 10μM ghost, 4 × 10 8 / ml, were labeled for 5 minutes using the methods described above at room temperature. しかし、PBSを含む1mMのEDTAと5%のBSAを使用して標識後の洗浄を実施した。 However, washing was carried out after labeling using 1mM of EDTA and 5% BSA containing PBS. 最終洗浄ののち、4×10 8 /mlでPBS+EDTA+5%BSAにゴーストを再懸濁し、37℃で24時間培養した。 After the final wash, resuspend the ghost PBS + EDTA + 5% BSA in 4 × 10 8 / ml, were cultured for 24 hours at 37 ° C.. 24時間の時点で二倍にした50μlのアリクウォットを、a)ゴーストの十分に混合した懸濁液(存在する全化合物の測定用)、およびb)ゴーストを12、500×gで15分間ペレット化した残りの上澄み液(存在する未結合化合物の測定用)から取り出した。 The aliquot of 50μl was doubled at 24 hours, a) for the measurement of total compound thoroughly mixed suspension (present ghost), and b) pelleted 15 min at 12,500 × g ghost were removed from the remaining supernatant was (for the determination of unbound compound present). 200μlの100%エタノールの混合物によってアリクウォットを抽出し、各抽出物の蛍光強度を蛍光microplate readerFluoroskan IIを使用して測定した。 Extract the aliquots with a mixture of 100% ethanol 200 [mu] l, the fluorescence intensity of each extract was measured using a fluorescence microplate readerFluoroskan II. 保持された化合物の割合を次の式によって計算した: The percentage of retained compounds were calculated by the following equation:
全化合物−非結合化合物×100 All compounds - unbound compound × 100
全化合物計算値は、化合物Tが(91.9±2.9)%、化合物AAが(97.7±0.2)%、化合物ABが(96.8±1.3)%であることを見出した。 All compounds calculated value, Compound T is (91.9 ± 2.9)%, compound AA is (97.7 ± 0.2)%, the compound AB is (96.8 ± 1.3)% It was heading.
前述の実験に基づいて、本発明のヨウ化化合物が、非ヨウ化化合物と同等またはより優れた膜保持特性を示すという結論を得た。 Based on the foregoing experiments, iodide compounds of the present invention, it was concluded that indicates a non-iodide compound equivalent or superior membrane retention characteristics. 赤血球膜内への結合は、等価な濃度の非ヨウ化化合物に比べてある程度低かったが、その分子サイズと分子量が大きいことから予想されるように、この差が、上述の種類の細胞標識適用における有効性を変化させるほど大きいとは思われない。 Binding to erythrocyte membrane is was somewhat lower than the non-iodinated compound equivalent concentration, as expected due to its molecular size and molecular weight is large, the difference is, cell labeling applications of the type described above It does not seem to large enough to change the efficacy in.
例8 Example 8
人工的表面への保持本発明の化合物が人工的表面に保持される能力を分析するために、100%エタノール中の放射性ヨウ素( 125 I)と結合した脂肪親和性シアニン(上記の化合物12、反応機構2、例3g)を、医療用silastic(SIL)、ポリカーボネート(PC)、ポリ塩化ビニル(PVC)、およびポリエチレン(PE)を含む複数の種類の異なるプラスチック管の短い断片の管腔面に接触するように配置した。 To analyze the ability of the compounds of the retention invention to artificial surfaces is kept artificially surface, 100% radioiodine in ethanol (125 I) and bound lipophilic cyanine (above compound 12, reaction mechanism 2, an example 3 g), medical Silastic (SIL), polycarbonate (PC), polyvinyl chloride (PVC), and in contact with the luminal surface of the short piece of a plurality of different types of plastic tubes comprising polyethylene (PE) It was arranged to be. 10分間にわたって化合物が管に接触してとどまることができるようにし、その後取り出して管をPBSで静かに流した。 Compound for 10 minutes to be able to stay in contact with the tube and gently flowed then removed the tube with PBS. 標識した管の基線放射能測定を行ったのち、約30mlの抗凝固処理を施していない新鮮なヒトの血液を含む閉じた管の回路に断片を接続した。 After performing baseline radioactivity measurements of the labeled tubing, fragments were connected to the circuit closed tube containing fresh human blood not subjected to anticoagulation treatment to about 30 ml. 管の回路をローラーポンプに通過させ、血液を6時間循環させた。 The circuit of the tube is passed through the roller pump, it was circulated blood 6 hours. 6時間後に管の断片を取り外し、PBSを静かに流して付着した血液をすべて取り除き、放射能を計測した。 Remove the pieces of tube after 6 hours, remove any blood adhered gently flowing PBS, and counted for radioactivity. この実験の結果を図5に図式的に示す。 The results of this experiment graphically shown in Figure 5. 管腔面の放射性ヨウ素を結合させた化合物/mm 2 (棒グラフのx軸)をピコグラムで表すことができるように、管断片の長さ、直径、および放射性ヨウ素を結合させた本発明の化合物の特異的活性を記録した。 Compounds were bound radioactive iodine luminal surface / mm 2 to (x-axis of the bar graph) so that it can be represented in picograms, the length of the tube pieces, of a compound of the invention conjugated diameter, and radioiodine It was recorded specific activity. 図5は、開始時に最大量の放射性ヨウ素が結合した化合物がPVC管に結合し、PEに結合した化合物が最小であったことを示している。 Figure 5 shows that compound a maximum amount of radioactive iodine is bonded at the beginning is attached to PVC pipe, compounds bound to PE was minimal. 6時間後に血液と接触した管への最大の保持を示したのはPVC(最初に保持された放射能の97.6±2.1%)であり、PCへの保持は最小であった(最初に保持された放射能の56.0±10.4%)。 The showed the greatest retention of the tube in contact with the blood after 6 hours is PVC (97.6 ± 2.1% of the initially retained radioactivity), held to the PC was minimal ( 56.0 ± 10.4% of the first to be held radioactivity). しかし、すべてに管について平均の保持は50%を超えており、PVCでは100%近くまで達し、本発明の化合物が、生物学的液体との接触していても長期間人工的表面にとどまる能力を備えていることを示した。 However, the average retention for the tube in all are over 50%, reaching nearly 100% in PVC, ability of the compounds of the present invention, it remains in long-term artificial surfaces be in contact with the biological fluid It showed that it comprises a. したがって、本発明の化合物は、生物作用性物質の人工的表面への保持に有効となりうる。 Accordingly, the compounds of the present invention may be effective in the retention of the artificial surface of the bioactive substance.
例9 Example 9
腫瘍内注入後の186 Re−キレート脂肪親和性シアニン抱合体とNa 186 ReO 4のIn Vivoでの保持過剰なゲンチジン酸を除去し、in vivoの投与前のpH調整の必要を回避するためにエタノールによる生成物の溶離に先立ってSepPakを約10mLの蒸留水で洗浄した点を除き、基本的に例3hに記述した方法に従って186 Reキレート脂肪親和性シアニン抱合体を調整した(反応機構5の化合物24)。 Ethanol To a retaining excess gentisic acid in the In Vivo of 186 Re- chelating lipophilic cyanine conjugate after intratumoral injection and Na 186 ReO 4 is removed, avoiding the need for pH adjustment prior to in vivo administration prior to elution of the product by except that washing the SepPak with distilled water to about 10 mL, essentially to adjust the 186 Re chelates lipophilic cyanine conjugates according to the procedure described in example 3h (compound of the reaction mechanism 5 24). 真空蒸発後、濃縮した貯蔵溶液をエチルアルコール中で約25μLの最終容積にした(約500μMの濃度の化合物24;約123mCi/μモルの特異的活性)。 After vacuum evaporation, concentrated stock solution was brought to a final volume of about 25μL in ethyl alcohol (compound at a concentration of about 500 [mu] M 24; about 123mCi / μ mol of specific activity). in vivo注入のための、約5〜6μCiの186 Reを含む化合物24とNa 186 ReO 4の調整を以下のように行った。 for in vivo injection, the adjustment of compound 24 and Na 186 ReO 4 containing 186 Re to about 5~6μCi was performed as follows. Na 186 ReO 4 (NEZ301、0.1NのNaOH中)を300mOsMの滅菌したダルベッコのリン酸塩緩衝食塩水で希釈し、pH紙を用いてpHが7.0であることを確認し、次にその調整剤を0.22μmのフィルターを通して再滅菌した。 Diluted with Na 186 ReO 4 (in NaOH in NEZ301,0.1N) sterile phosphate buffered saline Dulbecco's 300 mOsm, to verify that the pH is 7.0 with pH paper, then the modifier was re-sterilized through a 0.22μm filter. 化合物24を滅菌300mOsMグルコースで希釈した。 Compound 24 was diluted in sterile 300mOsM glucose. 滅菌した50μLのハミルトン注射器に5.0μLのNa 186 ReO 4または化合物24の調整剤を滅菌法を用いて入れた。 The modifier of Na 186 ReO 4 or compound 24 of 5.0μL were placed with sterile technique to Hamilton syringe sterile 50 [mu] L. 各調整の計数基準を提供し、全身画像の崩壊補正と生物分布測定のための基準として用いるために、別々のアリクウォットを取り出した。 Providing a count criteria for each adjustment, for use as a reference for decay correction and biodistribution measurements whole body imaging was removed separate aliquots.
腫瘍内注入後の上述の調整剤の保持を以下のように評価した。 The holding of the above-mentioned modifier after intratumoral injection was evaluated as follows. 腫瘍内注入前の5〜6日間に、メスのC57Bl/6マウスの右後肢への、滅菌ハンクス緩衝食塩水に懸濁した約1×10 6生存腫瘍細胞の接種物を用いた皮内注入によって、成長したMC38腺癌小結節を導入した。 5-6 days prior to intratumor injection, into C57Bl / 6 mice right hind limb of a female, the inoculum intradermal injection with approximately 1 × 10 6 viable tumor cells suspended in sterile Hanks buffered saline , it was introduced into the grown MC38 adenocarcinoma nodules. 0日目に動物に再麻酔を行い、アルコール綿棒を用いて右後肢を滅菌し、化合物24の5.0μLのアリクウォットまたはNa 186 ReO 4を腫瘍小結節内に直径約5mmで直接注入した。 And re-anesthetized animals on day 0, sterilized right hind paw with an alcohol swab, the aliquot or Na 186 ReO 4 of 5.0μL of Compound 24 were injected directly with a diameter of about 5mm in the tumor nodules. 約10秒間にわたって注入を実施し、さらに注入完了後5〜10秒間その位置に針を保持して、背圧をすべて消散させ、注入部位における漏出を最小にした。 Implement infusion over about 10 seconds, further holding the needle injection completion 5-10 seconds that position, to dissipate any back pressure was leakage at the injection site to a minimum. 注入の直後(10〜15分以内)と4日間にわたって毎日、140±20keVのエネルギーウインドウを使用し、GEのStarcam300システムを用いて動物と計測基準を画像化した。 Daily immediately after injection and (within 10-15 minutes) over 4 days, using an energy window of 140 ± 20 keV, and the image of an animal and the measurement reference using Starcam300 system GE. 2日目と4日目に画像化を終えたのち、動物群を犠牲にして各種の器官を集めて計量し、 186 Reの生物分布を評価するためにcpm/gmを測定した。 After finishing the imaging on the second day and fourth day, at the expense of animal groups are weighed collect various organs were measured cpm / gm to assess the biodistribution of 186 Re.
選択した器官の4日目の186 Reの生物分布を表IVのAに示す。 186 Biodistribution of Re of the fourth day of the selected organ are shown in A in Table IV. 結果は、注入した総数に対する、特定の器官からの回収の崩壊補正後の比率で表している。 Results, with respect to the total number of injected is represented by a ratio after decay-corrected recovery from a particular organ. 器官と腫瘍はその大きさが著しく異なっているので、各器官に見出した186 Reの相対濃度を表IVBで比較している。 Since organs and tumor size thereof is significantly different, the relative concentrations of 186 Re which was found in each organ is compared in Table IVB. 結果は、1gの組織塊に見出される注入数の比率を崩壊補正を行って表している。 Results are representative of injection speed ratio found in tissue mass 1g performed decay correction. 腫瘍あるいは全身に対応する関心領域(ROI)を確認することによって、全身のシンチグラフィ画像を分析した;次に、各関心領域の数量を注入後の時間の関数として求めた。 By checking the region-of-interest (ROI) corresponding to the tumor or systemically, were analyzed scintigraphic image of the whole body; it was then calculated as a function of time after injection quantity of each region of interest. 腫瘍内の標識の局在化を、腫瘍ROIの数量と全身ROIの数量の比として計算した(表Vの2列目および3列目)。 The localization of the label within the tumor was calculated as the ratio of the quantities in quantity and systemic ROI tumor ROI (2 and third columns of Table V). 身体内の標識の保持率を、全身ROIの数量と基準ROIの数量の比として計算した(表2、4列目と5列目)。 The retention of the label within the body was calculated as the ratio of the quantity of the quantity and the reference ROI systemic ROI (Table 2,4 and fifth columns).
表IVと表Vのデータは、腫瘍内部位からの186 Reの漏出の大きさが、化合物24の形での放射性核種の投与によって大きく減少していることを示している。 The data in Table IV and Table V, the magnitude of the leakage of 186 Re from intratumoral site indicates that it is greatly reduced by the administration of the radionuclide in the form of compound 24. さらにこれらのデータは、腫瘍内保持を測定するために用いた二つの異なる方法(全身ガンマシンチグラフィと直接励起)の間における優れた一致を示している。 Furthermore, these data show excellent agreement between the two different methods used to measure the tumor in the holding (systemic gamma scintigraphy and direct excitation).
例10 Example 10
186 Re−キレート脂肪親和性シアニン抱合体とNa 186 ReO 4の関節内注入後のIn Vivo保持本発明の化合物の二つの特性は、治療上の有効性とともに、部位選択的な投与と保持を実現するうえで重要である: 186 two characteristics of Re- chelating lipophilic cyanine conjugates and Na 186 compounds of In Vivo retention invention after intraarticular injection of ReO 4, together with the therapeutic efficacy, realize regioselective administration and retention it is important to:
a)非結合治療薬に比べた場合の、適用部位への保持の強さと、 a) when compared to the unconjugated therapeutic agent, and strength retention of the application site,
b)部位への注入後のその分布形態(不均質と均質)。 b) the distribution form after injection into the site (heterogeneous and homogeneous).
蛍光あるいは放射標識化合物を用いて、レニウムを含む化合物の関節腔内の滑膜内層への供給に基づいて、これらの特性を分析した。 Fluorescence or using radiolabeled compounds, based on the supply to the synovial lining of the joint cavity of the compounds containing rhenium, and analyzed these characteristics.
186 Re−キレート脂肪親和性シアニン抱合体(反応機構5の化合物24)を例3hに記述したように調整し、濃縮貯蔵溶液をエチルアルコール中で約40μLの最終容積にした。 186 Re- chelating Lipophilic Cyanine Conjugates adjusted to the (compound 24 of Reaction Scheme 5) described in Example 3h, to a final volume of about 40μL concentrated stock solution in ethyl alcohol. in vivo注入のために、以下のようにして化合物24の調整剤とNa 186 ReO 4を作成した。 for in vivo injection to prepare a modifier and Na 186 ReO 4 of Compound 24 as follows. Na 186 ReO 4 (NEZ301、0.1NのNaOH中)を300mOsMの滅菌したダルベッコのリン酸塩緩衝食塩水で希釈し、pH紙を用いてpHが7.0であることを確認し、次にその調整剤を0.22μmのフィルターを通して再滅菌した。 Diluted with Na 186 ReO 4 (in NaOH in NEZ301,0.1N) sterile phosphate buffered saline Dulbecco's 300 mOsm, to verify that the pH is 7.0 with pH paper, then the modifier was re-sterilized through a 0.22μm filter. 滅菌した300mOsMグルコースで化合物24を希釈し、滅菌した0.1NのNaOHの付加によってpHを7.0に調整した(グルコース希釈液に緩衝液が存在しないことと、ゲンチジン酸が最終調整剤に存在し、未調整のpH1〜2を生じているという事実を必要とする)。 Diluted Compound 24 with sterile 300mOsM glucose, and the absence of buffer (glucose dilution the pH was adjusted to 7.0 by the addition of sterile 0.1N of NaOH, there gentisic acid in the final modifier and requires a fact that occur pH1~2 unadjusted). 滅菌した25G×5/8インチの針を備えた1.0mLのツベルクリン注射器を計量し、約0.1mLのNa 186 ReO 4 、あるいは化合物24の調整剤を滅菌法を用いて入れ、注入前の重量を求めるために再計量を行った。 Sterile 25G × 5/8-inch needle tuberculin syringe 1.0mL equipped with a weighed, placed Na 186 ReO 4 to about 0.1 mL, or modifier compound 24 using a sterile technique, before injection It was reweighed to determine the weight. さらに、各調整剤のcpm/μLを求めるために、アリクウォットを取り出した。 Furthermore, in order to determine the cpm / [mu] L of each adjusting agent was removed aliquot.
関節内注入後の上述の調整剤の保持を、以下のようにして評価した。 The holding of the above-mentioned modifier after intraarticular injection was evaluated as follows. 体重3〜4kgのメスのニュージーランドホワイトウサギを、ケタミンとキシラジン(xylazine)を用いて麻酔し、膝の部位を慎重に剃り、ヨウ素の溶液で消毒した。 New Zealand White rabbits female weighing 3-4 kg, were anesthetized with ketamine and xylazine (xylazine), shaved carefully the site of the knee, and disinfected with a solution of iodine. 滅菌法を使用して膝を約120°に屈曲させて膝蓋骨を一時的に側方へ移動させ、関節空間内へ皮膚を通って針を中央に挿入し、約0.1mLの化合物24(3頭の動物)あるいはNa 186 ReO 4調整剤(2頭の動物)を注入し、針を取り出して膝蓋骨を正常な位置に戻した。 Using sterile technique by bending the knee at approximately 120 ° is moved temporarily to the side of the patella, through the skin into the joint space to insert the needle in the center, the compounds of about 0.1 mL 24 (3 injecting head animals) or Na 186 ReO 4 adjusting agent (2 animals), were back removed needle patella normal position. 注射器を再計量し、注入前後の重量の間の差を計算し(注入物の密度を1.0g/mLと仮定)、各調整剤の既知の体積のアリクウォットの計数によって得たcpm/μL値に測定した体積を掛けて、注入した化合物24またはNa 186 ReO 4の正確な体積と作用を求めた。 Syringe reweighed and the difference between the weight of before and after injection was calculated (assuming the density of the implants with a 1.0g / mL), cpm / μL value obtained by counting aliquots of known volume of each modifier by multiplying the volume was measured to obtain the correct volume as the effect of the injected compound 24 or Na 186 ReO 4. 関節内注入の5〜10分後以内に、既知の体積の血液(約1mL)を耳中心動脈から取り出した。 Within After 5-10 minutes intraarticular injection and extraction known volume of blood (approximately 1 mL) from the ear central artery. 尿と便を独立に採取できるケージに動物を入れ、6日間にわたって観察した。 Put the animal in a cage that can be collected urine and feces independently, it was observed over a period of six days. それぞれの日に血液を取り出し、それまでの24時間に排出されたすべての尿を集め、Packard Cobra Model 5003ガンマ計測器を使用して既知の体積の血液と尿のアリクウォットのcpm/mLを求めた。 Each day removed blood, collect all urine that is discharged to 24 hours so far, using a Packard Cobra Model 5003 gamma counter to determine the cpm / mL of aliquots of blood and urine known volume . 総血液生産量を、全体重の5.5%と血液のcpm/mLに基づいて見積もった;総尿量を、24時間の尿体積と尿とcpm/mLに基づいて計算した。 The total blood production was estimated on the basis of 5.5% and cpm / mL of blood total body weight; the total urine volume was calculated based on the urine volume and urine and cpm / mL of 24 hours. 便については有意な分量を検出しなかった。 It did not detect a significant amount for the flights. 0、1、4、および6日目にGEのStarcam 300システムを約120〜150kEVのエネルギーウインドウで使用してガンマシンチグラフィを実施した。 0, 1, 4, and was carried out gamma scintigraphy using STARCAM 300 system GE in energy windows of approximately 120~150kEV on day 6. 6日目に、血液および尿標本の採取後に動物を犠牲にし、各種の器官を集めて計測し、 186 Reの生物分布の評価のためにcpm/mLを測定した。 On day 6, the animals were sacrificed after the collection of blood and urine specimens were measured to collect a variety of organs, it was measured cpm / mL for the evaluation of the biodistribution of 186 Re.
化合物24およびNa 186 ReO 4の血液中における循環濃度と、注入後6日間にわたる期間に尿中に排出された分量を表VIに示す。 A circulating concentration in the blood of Compound 24 and Na 186 ReO 4, the amount excreted in the urine during over 6 days after infusion are shown in Table VI. 選択した器官の6日目における186 Reの分布を表VIIに示す。 The distribution of 186 Re in the sixth day of the selected organ shown in Table VII. 表VIおよび表VIIのすべての結果は、崩壊の補正後の注入量に対する比率で表している。 All results in Table VI and Table VII are expressed as a percentage of the amount of injected after correction collapse. 表VIおよび表VIIのデータは、血液濃度、尿排出量、および他の器官への蓄積によって測定した関節内空間からの186 Reの漏出の大きさが、化合物24の形での放射性核種の投与によって大きく減少したことを示している。 Table VI and Table VII data indicate that the blood concentration, urine output, and 186 the size of the leakage of Re from the joint space was measured by the accumulation of the other organs, administration of the radionuclide in the form of compound 24 It indicates that greatly reduced by. さらに、ガンマシンチグラフィ画像からの特定の関心領域(膝および/または全身)の分量の測定によって、膝への保持の評価を行い、表VIIIに示した。 Furthermore, by measuring the amount of a particular region of interest from gamma scintigraphic images (knee and / or systemic), evaluates the retention of the knee, as shown in Table VIII. これらの結果も、化合物24の形で放射性核種を投与したときの保持の大きな改善を示している。 These results show a significant improvement in retention upon administration of the radionuclide in the form of compound 24.
例11 Example 11
関節内注入後の脂肪親和性シアニン抱合体の滑膜における分布関節内注入後の滑膜細胞による結合の均質性あるいは不均一性を評価するために、300mOsMでpH7.0のグルコース内の化合物T(上記の例2を参照)のヨウ化塩10μM溶液約0.1mLを例10に記述したように膝の中に注入した。 In order to evaluate the homogeneity or heterogeneity of binding by synovial cells after distribution joint injection in synovial lipophilic cyanine conjugate after intraarticular injection, a compound of the glucose pH7.0 at 300 mOsm T It was injected into the knee as described iodide Casio 10μM solution of about 0.1mL (see above example 2) in example 10. 1時間後に動物を犠牲にし、注入を行った膝関節と行っていない膝関節の両方を切開した。 Animals were sacrificed after 1 hour, the both knee joint is not performed and the injection was performed knee joint was dissected. 薄い切片を切開するためには鉱物質除去が必要であり、鉱物質除去を行う媒質は本発明の化合物を組織から除去してしまうため、全関節の横断切片は実現不可能であった。 To incise the thin sections are required demineralization, for medium performing demineralization would remove the compound of the present invention from tissue cross sections of all the joints it was not feasible. したがって、膝蓋骨の下に入れて滑膜腔との境界を形成する膝蓋下脂肪パッドを慎重に除去し、ドライアイス上で急速に凍結させ、凍結切片が調整されるまで−80°で貯蔵した。 Therefore, the infrapatellar fat pad placed below the patella to form an interface between the synovial cavity were carefully removed, rapidly frozen on dry ice and stored at -80 ° until frozen sections are adjusted. 厚い(10μ)低温槽切片を切断し、スライドガラスに付着させ、光学顕微鏡と蛍光顕微鏡によって分析した。 Thick (10 [mu]) were cut cryostat sections adhered to a glass slide and analyzed by optical microscopy and fluorescence microscopy.
脂肪パッド切片(注入を行った膝と行わなかった膝)の光学顕微鏡写真は、滑膜細胞が、脂肪パッドの関節空間に面する表面に薄く暗い線状に切片の内側の縁に沿って層をなしていることが、100倍の拡大率で調べたときに観察された。 Optical micrographs of fat pad sections (injection was not carried out and knees were knee), the synovial cells, along the inner edge of the sections in a thin dark line pattern on the front surface facing the joint space of the fat pad layer it forms a were observed when examined at 100 × magnification. (滑膜層は、正常な関節では僅かに1から2つの細胞の厚さであるが、関節炎の関節では過剰増殖によって厚みを増している)。 (Nameramakuso is the thickness of the two cells from slightly 1 is a normal joint, is thicker by hyperproliferation arthritic joints). 残りの組織は、主に大きな脂肪細胞によって構成されていた。 The remaining tissue was constituted mainly by large adipocytes. 注入を行った膝から青の励起光を当てたときの切片の照明は、明るく比較的均一な標識の存在が基本的に滑膜細胞層に限定されていることを示し、一方、脂肪細胞領域あるいは注入を行わなかった膝は、非常に暗い緑の自己蛍光のみを示した。 Lighting sections when injected from the knee was performed was irradiated with excitation light of blue, indicates that the presence of bright relatively uniform labeling is basically limited to the synovial cell layer, while the fat cell region Alternatively injection was not the knee showed only autofluorescence very dark green.
例12 Example 12
血管内部位への脂肪親和性シアニン抱合体の保持本発明の化合物が一度適用された血管内部位にとどまるかどうかを調べるために実験を実施し、その実験では、例2に記述したように調整した125 Iで置換した脂肪親和性シアニン(化合物12、反応機構2)を麻酔したウサギの大腿動脈の管腔表面に適用した。 Compounds of holding the invention lipophilic cyanine conjugate to intravascular sites conducted experiments to see whether remain once applied intravascular site, in that experiment, adjusted as described in Example 2 was 125 lipophilic cyanine (compound 12, reaction mechanism 2) substituted with I was applied to the luminal surface of the femoral artery of anesthetized rabbits. 大腿動脈を外科的に分離し、小さな近心の側枝に短長のPE10管でカニューレを挿入した。 The femoral artery was surgically isolated and cannulated with PE10 tube short length to a side branch of a small mesial. 側枝の周囲の1cmの動脈部分を閉塞させ、 125 Iで置換した化合物12を含む溶液20〜50μlをカニューレを通して閉塞部分に投与し、5〜10分間とどまるようにした。 Clog the 1cm arterial portion of the periphery of the side branch, the solution 20~50μl containing compound 12 was replaced with 125 I and administered to the closure portion through the cannula, and so remain 5-10 minutes. その後125 Iで置換した化合物をカニューレに沿って取り出して側枝を恒久的に接合し、血流を回復させるために大腿動脈の閉塞を取り除き、大腿の切開を閉じた。 Permanently joining the side branch is taken out subsequently compounds substituted with 125 I along the cannula to remove an obstruction in the femoral artery in order to restore blood flow, closed incision thigh. 次に、Ludium Model 2200 Scaler RatemeterとModel 44−17 2インチcrystalを用いて、 125 Iの検出用に最適化したウインドウで125 Iの放射能をその後3週間にわたって選択した時間で観察した。 Next, with reference to Ludium Model 2200 Scaler Ratemeter and Model 44-17 2 inches crystal, it was observed with optimized window for detection of the 125 I 125 I time selected radioactivity over the following 3 weeks.
結果として得られたデータの図による分析は、2相の放出過程において、適用物質(放射能)の34.0±10.9%(平均±sem、n=4)が最初の24時間後に動脈にとどまり、最初の放出半減期が0.77±0.29日であることを示した。 Analysis by figure data obtained as a result, in the 2-phase emission process, 34.0 ± 10.9% of the applied material (radioactivity) (mean ± sem, n = 4) arteries within the first 24 hours after remains showed that initial release half-life of 0.77 ± 0. 29 days. しかし、最初の24時間後ののちには、残りの物質は非常にゆっくりと放出され、放出の半減期は15.24±2.89日であった。 However, after the first 24 hours after, the remaining material is very slowly released, the half-life of release was 15.24 ± 2. 89 days. したがって、血管内適用部位からの放出が遅いことから、顕著な量の125 I置換化合物を適用後少なくとも3週間に検出することができた。 Accordingly, since the slow release from intravascular application site, it could be detected in at least 3 weeks after applying significant amounts of 125 I-substituted compound.
例13 Example 13
A10細胞に対するIn Vitroでのコルヒチン脂肪親和性シアニン抱合体の抗増殖作用本発明の化合物の抗増殖作用を調べるために、筋原細胞として増殖し、表現型的に平滑筋細胞に類似した細胞に成長する、A10細胞と胚のラットの胸大動脈に由来するクローン細胞系を用いたin vitroの研究を実施した(B.KimesとB.Brandt、Exptl.Cell Res. 98 :349(1976)。通常は、12槽の平板で2500〜10、000のA10細胞/cm 2を10%子ウシ血清(FCS)を加えたダルベッコの修正イーグル培地(DMEM)に接種し、37℃で24時間かけて付着させ、安定化させた。次に、試験物質を必要な濃度で適切な細胞結合媒質に調整し、平板培養の培地を吸引したのち、個々の To examine the antiproliferative action of the compounds of the antiproliferative effects present invention colchicine lipophilic cyanine conjugates in In Vitro for A10 cells, to grow as myoblast, similar to phenotypically smooth muscle cells cells to growth, A10 cells and the study of in vitro using the clonal cell lines derived from the thoracic aorta of rat embryos was performed (B.Kimes and B.Brandt, Exptl.Cell Res 98:.. 349 (1976) normal the 12 tank of A10 cells / cm 2 of the plate in 2500~10,000 inoculated into modified Eagle's medium with 10% calf serum (FCS) and Dulbecco's plus (DMEM), deposited over 24 hours at 37 ° C. is, stabilized. then, the test substance was adjusted to an appropriate cell binding medium at the required concentration, after aspirating the medium of plating, the individual 槽に37℃で僅かに10分間だけ入れた。次に処理物を吸引し、媒質を含む非処理の培地で槽を4回洗浄し、研究の期間中は非処理の10%のFCSを加えたDMEMを含む培地に入れた。処理適用後の異なる時間に、3つの槽を吸引し、吸引物を保存して、0.25mlの0.25%トリプシンで槽を処理して付着した細胞を除去した。トリプシンの細胞に対する酵素作用を、余分な蛋白質(1.75mlのDMEM+10%のFCS)の付加によって停止させ、吸引物を槽に戻し、結果として得た細胞懸濁液のアリクウォットをCoulter Counter(Model ZMとSampling Stand II)で計測した。細胞数は、成長領域(槽底の表面領域)のcm 2当たりの細胞数に規格化した。 Was placed just 10 minutes slightly at 37 ° C. in a bath. Then aspirated treated, the medium was washed 4 times the bath in a medium with the non-processing including, 10% FCS in untreated added during the duration of the study was placed in medium containing DMEM. processing application different times after, sucks the three tanks, save the aspirate, cells attached by treating the bath with 0.25% trypsin 0.25ml the removed. the enzyme action on trypsin cells was stopped by the addition of extra protein (1.75 ml of DMEM + 10% of FCS), returned to aspirate the bath, the aliquots of the cell suspension obtained as a result of Coulter Counter (Model ZM with Sampling Stand II) was measured in. the number of cells was normalized to the number of cells per cm 2 of growth area (surface area of the bottom of the tank).
下記の表IXに示すように、本発明の化合物(化合物19、反応機構3、例3i、ここでは”コルヒチン抱合体”と呼ぶ)で処理した細胞培養における7日後の増殖は、賦形剤で処理した最大の成長の僅かに5.2%であった。 As shown in Table IX below, the compounds of the present invention (compound 19, reaction mechanisms 3, Example 3i, where "colchicine conjugate" hereinafter) growth after 7 days in the treated cell culture is a excipient It was only 5.2% of the maximum of the growth treated. 顕著な細胞結合の蛍光が見られ(フロー血球計算法によって測定)、コルヒチン抱合体のA10細胞への結合の存在を示した。 Observed fluorescence marked cellular binding (flow measured by cytometry), it showed the presence of binding to A10 cells colchicine conjugate. 反対に、同一の初期濃度の非抱合コルヒチンで処理した細胞の存在は、賦形剤処理細胞の細胞密度の半分でしかなく、本発明の化合物で得たものの約10倍の細胞数の上昇を示した。 Conversely, the presence of cells treated with unconjugated colchicine same initial concentration is not only half the cell density of vehicle-treated cells, the compound in approximately 10-fold increase in cell number despite yield of the present invention Indicated. したがって、本発明の化合物は、僅かに10分間の暴露にも関わらず母体化合物の抗増殖作用のA10細胞内への顕著な保持を可能にし、同じ方法で適用した非抱合コルヒチンよりもはるかに大きな抗増殖作用を示した。 Accordingly, the compounds of the present invention allow significant retention into A10 cells antiproliferative action of the parent compound despite the slight of 10 minutes exposure, large far more than unconjugated colchicine applied in the same way It showed anti-proliferative effects.
例14 Example 14
抗凝固薬脂肪親和性シアニン抱合体の生体膜への結合本発明の抗凝固薬化合物を生体膜へ安定して結合することができるかどうかを評価するために、上記の例1に記述したようにウサギの赤血球ゴーストでin vitroの研究を実施した。 To assess whether the anticoagulant compounds of the bonds present invention to biological membranes anticoagulants Lipophilic Cyanine Conjugates can be stably bound to biological membranes, as described in Example 1 above studies were conducted in vitro in rabbit erythrocyte ghost. 2×10 8ゴースト/mlを、(1)抗凝固薬を含まない誘導脂肪親和性シアニン(反応機構1、例3aの化合物7)、(2)抗凝固薬脂肪親和性シアニン抱合体(反応機構4、例3jの化合物21)、または(3)蛍光イソチオシアン酸塩標識ヘパリン(FITCヘパリン)で、10μM、20μM、および20μMの濃度でそれぞれ標識した。 The 2 × 10 8 ghosts / ml, (1) anticoagulants inductive lipophilic cyanine not containing (reaction mechanism 1, compound 7 in Example 3a), (2) anticoagulant Lipophilic Cyanine Conjugates (Reaction mechanism 4, compound 21 example 3j), or (3) a fluorescent isothiocyanate-labeled heparin (FITC heparin) were respectively labeled with a concentration of 10 [mu] M, 20 [mu] M, and 20 [mu] M. 次にゴーストをさらに洗浄し、1mMのEDTAと5%のBSAを含むリン酸塩緩衝食塩水中に37℃で24時間入れた。 Then further washed ghost were placed for 24 hours at 37 ° C. in phosphate buffered saline containing 1mM of EDTA and 5% BSA. 試料を撹拌し、各試料から50μlのアリクウォットを取り出し、マイクロタイター平板培養槽の200μlのTriton X−100▲R▼の中に入れた(全懸濁液蛍光を意味する)。 The samples were stirred, the aliquot of 50μl from each sample was taken out, (meaning all suspension fluorescence) that Triton X-100 ▲ R ▼ brewed in a 200μl microtiter plate culture tank. 元の試料を10分間遠心分離し、50μlのゴースト上澄み液の試料を取り出し、200μlのTriton X−100▲R▼の中に入れた(液相中のみでの遊離蛍光を意味する)。 The original samples were centrifuged for 10 minutes, the sample was taken out of the ghost supernatant 50 [mu] l, (which means the free fluorescence in the liquid phase only) were placed in a Triton X-100 ▲ R ▼ of 200 [mu] l. 全試料の蛍光を、蛍光光度マイクロタイター平板培養リーダーで測定した。 The fluorescence of all samples was measured with a fluorometer microtiter plate culture reader. 結合した蛍光を、未染色ゴーストからのバックグラウンドの補正後に、全体から遊離蛍光を減算することによって求めた;結合および遊離蛍光を全蛍光で割り、100を掛けることによって、遊離および結合蛍光の比率をそれぞれ求めた。 The bound fluorescence, after background correction from unstained ghosts was determined by subtracting the free fluorescent from whole; split coupling and free fluorescence in total fluorescence, and multiplying by 100, the ratio of free and bound fluorescence It was determined, respectively.
以下の表Xに示した結果は、本発明の抗凝固薬抱合体は、抗凝固薬を含まない本発明の化合物の94.69%の保持と比べて、24時間後にゴーストの膜に90.94%結合しており、優れた膜保持を示したことを表している。 The following results shown in Table X, the anticoagulant conjugate of the present invention, compared with 94.69% of the retention of the compounds of the present invention containing no anticoagulants, 90 to the membrane ghost after 24 hours. are bound 94%, indicates that the exhibited excellent film holder. FITCヘパリンは、24時間後にとどまっていた蛍光が僅かに37.63%であり、不十分な保持しか得られなかった。 FITC heparin is fluorescence slightly 37.63% had remained after 24 hours, was only poor retention is obtained. この数値は、ゴースト上のFITCヘパリンの蛍光信号がバックグラウンド蛍光強度を僅かに上回る程度であったことから、FITCヘパリンの実際の保持率の過大評価であると考えられ、これらの数値から計算した結合および遊離率は、その精度に疑問が残る。 This number, since the fluorescence signal of FITC heparin on ghosts was extent slightly above background fluorescence intensity is considered to be the overestimation of the actual retention of FITC heparin, it was calculated from these values bound and free rate questionable accuracy. しかし、以下のデータは、本発明の化合物は、蛍光ヘパリンとは異なり、生体膜上に十分保持されていることを明らかに示している。 However, the following data, the compounds of the present invention, unlike the fluorescent heparin, clearly show that it is sufficiently retained on biological membranes.
例15 Example 15
生体膜表面に結合したときの抗凝固薬−脂肪親和性シアニン抱合体の抗凝固薬保持特性本発明の化合物の抗凝固特性が、生体膜表面上に被膜したときに保持されるかどうかを調べるためにin vitro研究を実施し、本発明の化合物の凝固酵素トロンビンを阻止する能力を分析した。 Anticoagulants when bound to a biological membrane surface - anticoagulant properties of the compounds of the anticoagulant retention characteristics invention lipophilic cyanine conjugate, check whether it is being held when the coating on the biological membrane surface performed in vitro studies to, were analyzed for their ability to inhibit the clotting enzyme thrombin compounds of the present invention. ウサギの赤血球ゴーストを10μMの抗凝固剤−脂肪親和性シアニン抱合体(反応機構4、例3jの化合物21)で最初に標識し、0.1%のBSAを含むPBSで4回洗浄し、次に様々な数量のゴースト/mlに希釈した。 Anticoagulants erythrocytes ghosts 10μM rabbit - first labeled with lipophilic cyanine conjugate (reaction mechanism 4, Example 3j compound 21), then washed 4 times with PBS containing 0.1% BSA, following It was diluted to ghost / ml of various quantities. 既知の分量のゴーストをマイクロタイター平板培養槽中に入れ、化合物の既知の標準濃度によって生じる蛍光と、観察された蛍光を比較することによって、ゴースト上の化合物21の濃度を分析した。 Put ghost known quantity microtiter plating bath, and the fluorescence produced by known standard concentrations of the compound, by comparing the observed fluorescence were analyzed concentration of compound 21 on ghosts. 次に、KrtenanskyとMao、FEBS Let. Then, Krtenansky and Mao, FEBS Let. 211:10(1987)によって報告されたものと同様の方法によって活性分析を実施し、その分析では、リン酸塩緩衝食塩水(PBS)の緩衝液中の1:10に希釈したヒト血漿100μl、様々な濃度の標識したゴーストあるいはトロンビン阻止剤を含む50μlのPBS、そして一定量(0.5nM)のトロンビンを含む50μlのPBSを、マイクロタイター平板培養槽に加え、分光光度平板培養リーダー(Bio−Tek)で405nmにおける吸光度の変化を60分にわたって記録した。 211: 10 the activity analysis was performed by a method similar to that reported by (1987), in the analysis, phosphate buffered saline (PBS) human plasma 100μl diluted 1:10 in buffer at, PBS of 50μl containing various concentrations of labeled ghosts or thrombin inhibitors, and of PBS 50μl containing thrombin fixed amount (0.5 nM), was added to the microtiter plate culture tank, spectrophotometric plate culture reader (Bio- It was recorded over 60 minutes the change in absorbance at 405nm with tek). 阻止剤で処理した槽から得たデータを、阻止剤の非存在下で得た吸光度領域の阻止率として表した。 The data obtained from the treated vessel in inhibitor was expressed as inhibition rate of absorbance areas obtained in the absence of inhibitor. 代表的な実験から得られたデータを図6に示す。 The data obtained from a representative experiment shown in Figure 6. ヘパリン(●)および本発明の抗凝固薬抱合体(○)のそれぞれの3変数非線形論理回帰によって得たEC 50値である1.03nMおよび21.23nM(@1.43×10 7ゴースト/200ul)は、生体膜に適用したときに、本発明の化合物は親化合物に比べて、トロンビン阻止薬としての効果が20培よりある程度少ない大きさだけ小さいことを示している。 Heparin (●) and anticoagulant conjugate of the present invention are The EC 50 values obtained by each of the 3 variables nonlinear logistic regression for (○) 1.03nM and 21.23nM (@ 1.43 × 10 7 ghosts / 200 ul ), when applied to biomembranes, the compound of the present invention as compared to the parent compound, the effect of the thrombin inhibiting agent indicates that smaller by a certain extent less magnitude than 20 culture. しかし、同時に分析した順次希釈したゴーストを含まない上澄み液(◇)がトロンビン阻止作用をまったくもっていないことから、この阻止作用はすべての膜に結合している。 However, the bound from the supernatant without sequentially ghost diluted analyzed (◇) does not have any thrombin inhibitory action, the blocking effect on all membranes simultaneously. したがって、本発明の化合物は、生体膜に結合したときにおいても、依然として強力な抗トロンビン作用を提供する。 Accordingly, the compounds of the present invention, even when bound to biomembranes, still provide a strong antithrombin effect.
本発明の様々な側面を、特定の好ましい実施例、すなわち化学療法および放射線療法の抗増殖化合物の合成と使用に関して上記に記述し、例示してきた。 Various aspects of the present invention, certain preferred embodiments, i.e. described above for use as in the synthesis of anti-proliferative compounds of chemotherapy and radiotherapy, have been illustrated. しかし、他の数多くの実施例が、技術に精通した者には明らかである。 However, a number of embodiments of the others, be apparent to those skilled in the art. 例えば、様々な疾患状態あるいは病的状態の治療または分析のために、他の化学療法および放射線療法の抱合体を合成し、使用することができる。 For example, for the treatment or analysis of various disease states or pathological conditions, to synthesize a conjugate of other chemotherapy and radiation therapy, it may be used. さらに、本発明の化合物と方法を、抗菌薬、抗真菌薬、あるいは抗炎症薬などの他の種類の薬物の部位選択的供給と保持の開発のために使用することができる。 Furthermore, it is possible to use the compounds and methods of the present invention, antimicrobial agents, antifungal agents, or for the development of the holding and regioselective supply of other types of drugs, such as anti-inflammatory agents. したがって、本発明は、具体的に記述し、例示した実施例に限定されるものではなく、以下の請求範囲の範囲から離脱しない範囲で変形と修正を行うことができる。 Accordingly, the present invention is specifically described, but the invention is not limited to the illustrated embodiment, it is possible to perform variations and modifications within a range without departing from the scope of the following claims.

Claims (10)

  1. 式: formula:
    [式中、 [In the formula,
    Bは、ヘパリン; Of B, heparin; ヒルジン;コルヒチン;ビンカアルカロイド;タキソール;物質P; Hirudin; colchicine; vinca alkaloids; Taxol; substance P; インターフェロンγ;ならびに式: Interferon-γ; as well as the formula:
    (式中、Z'はHまたは金属配位位置を表し; (Wherein, Z 'represents H or a metal coordination sites;
    R'は、R''または式: R 'is, R' 'or the formula:
    で示される基であり、ここでそれぞれのR'は、独立に水素原子またはアルキル基であり、R''およびR'''は独立に水素原子またはアルキル基であり、mおよびnはそれぞれ0または1にすることができる) A a group represented by wherein each R 'is independently a hydrogen atom or an alkyl group, R' 'and R' '' are independently a hydrogen atom or an alkyl group, respectively m and n are 0 or it can be set to 1)
    または式: Or the formula:
    (式中、nは2、3または4であり、mは1または2であり、pは1〜6である) (Wherein, n is 2, 3 or 4, m is 1 or 2, p is 1 to 6)
    で示されるキレート試薬と放射性金属との錯体; In complex with a chelating agent and a radioactive metal represented;
    からなる群より選択され Is selected from the group consisting of,
    RおよびR 1は1個から30個の炭素原子を備える炭化水素置換基であり、ここで、RおよびR 1 の一方は少なくとも12個の炭素原子を有し、RおよびR 1 の直鎖状炭素原子の合計は少なくとも23個であり、 R and R 1 is a hydrocarbon substituent with one to 30 carbon atoms, wherein one of R and R 1 has at least 12 carbon atoms, R and R 1 linear the sum of carbon atoms is at least 23,
    2は次の式のスペーサ成分を表し: R 2 represents a spacer component of the following formula:
    −(Q'−R 4 q −Q−(R 3 p - (Q'-R 4) q -Q- (R 3) p -
    ここでR 3は脂肪族炭化水素を表し、 4 は脂肪族、脂環式または芳香族炭化水素、複素環式またはCH 2 C(CO 2 H)=CHで構成される基の中から独立に選択し、 QおよびQ'は、アミド(−NHCO−)、チオ尿素(−NHCSNH−)、 Wherein R 3 represents an aliphatic hydrocarbon, independent R 4 is an aliphatic, cycloaliphatic or aromatic hydrocarbons, from the group consisting of heterocyclic or CH 2 C (CO 2 H) = CH select, Q and Q 'is an amide (-NHCO-), thiourea (-NHCSNH-), the アシルヒドラゾン(−CH=NHNCO−)、 Acylhydrazone (-CH = NHNCO-), エステル(−COO−)、 Ester (-COO-), 尿素(−NHCONH−)、カルバマート(−NHCO 2 −) Urea (-NHCONH-), carbamate (-NHCO 2 -) 結合で構成される官能結合基から独立に選択したものであり; QおよびQ'は、さらに独立に原子価結合を表すことができ;前記脂肪族炭化水素は1個から12個の直線状炭素原子を備え;前記芳香族炭化水素は6個から12個の炭素原子を備え;nは1であり; pは0または1であり;qは0ないし4であり、qが2以上のとき、各Q'は同一であっても、異なっていてもよく ;但し、 QおよびQ'の少なくとも1つは、アミド(−NHCO−)、チオ尿素(−NHCSNH−)、 Are those independently selected from the consisting functional bond group bonded; Q and Q 'may be further independently represent a valence bond; 12 linear carbon wherein the aliphatic hydrocarbon is from 1 It includes an atom; the aromatic hydrocarbon comprises from 6 to 12 carbon atoms; n is 1; p is 0 or 1; q is 0 to 4, when q is 2 or more, each Q 'be the same or different; however, Q and Q' at least one of the amide (-NHCO-), thiourea (-NHCSNH-), アシルヒドラゾン(−CH=NHNCO−)、尿素(−NHCONH−)、カルバマート(−NHCO 2 −) Acylhydrazone (-CH = NHNCO-), urea (-NHCONH-), carbamate (-NHCO 2 -) 結合で構成される官能結合基から選択され、かつ、q=0のとき、Qは原子価結合ではなく、 Is selected from the consisting functional bond group bond and, when q = 0, Q is not a valence bond,
    XおよびX 1は同一または異なる値をとることができ、O、S、C(CH 32またはSeを表し X and X 1 may take the same or different values, represent O, S, and C (CH 3) 2 or Se,
    Yは、=CR 8 −、=CR 8 −CR 8 =CR 8 −、=CR 8 −CR 8 =CR 8 −CR 8 =CR 8 −、あるいは=CR 8 −CR 8 =CR 8 −CR 8 =CR 8 −CR 8 =CR 8 −から選択した結合基を表し、ここでR 8はH、CH 3 、CH 2 CH 3 、CH 2 CH 2 CH 3 、あるいはCH(CH 32から選択され、 Y is, = CR 8 -, = CR 8 -CR 8 = CR 8 -, = CR 8 -CR 8 = CR 8 -CR 8 = CR 8 -, or = CR 8 -CR 8 = CR 8 -CR 8 = CR 8 -CR 8 = CR 8 - represents the selected linking groups from where R 8 is selected from H, CH 3, CH 2 CH 3, CH 2 CH 2 CH 3 or CH (CH 3) 2,,
    Zは、H、アルキル、OH、−O−アルキル、COOH、CONH 2 、SO 3 H、SO 2 NH 2 、SH、S−アルキル、CONH−アルキル、CON−(アルキル) 2 、NH−アシル、NH−アルキル、N(アルキル) 2 、NO 2またはハロゲン Z is, H, alkyl, OH, -O- alkyl, COOH, CONH 2, SO 3 H, SO 2 NH 2, SH, S- alkyl, CONH- alkyl, CON- (alkyl) 2, NH- acyl, NH - alkyl, N (alkyl) 2, NO 2 or halogen, 基から選択した置換基を表し、前記Z置換基で構成されるアルキル基は1個から4個の炭素原子を備えさらに、 Represents a substituent selected from the group, alkyl group composed of said Z substituent comprises from 1 to 4 carbon atoms, further,
    Aは薬学的に許容可能な陰イオンを表す A represents a pharmaceutically acceptable anion]
    で示される化合物。 In the compound represented.
  2. Bを、コルヒチン、ビンカアルカロイドおよびタキソールよりなる群から選択することを特徴とする、請求項1に記載の化合物。 B and colchicine, and selecting from the group consisting of vinca alkaloids and taxol compound according to claim 1.
  3. Bがビンブラスチンである、請求項1に記載の化合物。 B is vinblastine, compound of Claim 1.
  4. Bがヘパリン B heparin である、請求項1に記載の化合物。 In a compound of claim 1.
  5. Bがヒルジンである請求項1に記載の化合物。 A compound according to claim 1 B is hirudin.
  6. 上記の式で与えられることを特徴とする、請求項1に記載の化合物。 Characterized in that given by the above equation, the compounds according to claim 1.
  7. 上記の式で与えられることを特徴とする、請求項1に記載の化合物。 Characterized in that given by the above equation, the compounds according to claim 1.
  8. 上記の式で与えられることを特徴とする、請求項1に記載の化合物。 Characterized in that given by the above equation, the compounds according to claim 1.
  9. 以下の式で与えられる化合物であって A compound given by the following formula
    ここでRおよびR 1は1個から30個の炭素原子を備える炭化水素置換基であり、ここで、RおよびR 1 の一方は少なくとも12個の炭素原子を有し、RおよびR 1 の直鎖状炭素原子の合計は少なくとも23個であり; Wherein R and R 1 is a hydrocarbon substituent with one to 30 carbon atoms, wherein, having one of at least 12 carbon atoms of R and R 1, straight of R and R 1 total chain carbon atoms is at least 23;
    XおよびX 1は同一または異なる値にすることができ、O、S、C(CH 32またはSeを表し; X and X 1 may be the same or different values, represent O, S, and C (CH 3) 2 or Se;
    Aは薬学上許容することができる陰イオンを表し; A represents an anion capable of acceptable pharmaceutical;
    Mは、銅、テクネチウム、ロジウム、パラジウム、インジウム、サマリウム、ガドリニウム、ホルミウム、エルビウム、イッテルビウム、ルテチウム、レニウム、イットリウム、金、エルビウム、ホルミウムあるいはそれらの組み合わせで構成される群から選択した放射性金属を表し;nは2、3あるいは4である;mは1あるいは2である;pは1から6であることを特徴とする、請求項1に記載の化合物。 M represents copper, technetium, rhodium, palladium, indium, samarium, gadolinium, holmium, erbium, ytterbium, lutetium, rhenium, yttrium, gold, erbium, radioactive metal selected from the group consisting of holmium, or a combination thereof ; n is 2, 3 or 4; m is 1 or 2; p is characterized by from 1 to 6 a compound according to claim 1.
  10. Bが、 キレート試薬と放射性金属の形の錯体である、請求項1に記載の化合物。 B is in the form of a complex of radioactive metal chelating agent, compound of Claim 1.
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