JP3667779B2 - Synthetic lipid liposome - Google Patents

Description

【００１０】
（式中Ｒはメチル基またはカルボキシルメチル基を意味する。Ｘは式−Ｎ^＋（ＣＨ_３）_３・Ｂｒ⁻で示される基または式−ＳＯ₃ ⁻・Ｎａ^＋で示される基を意味する。式中ｋは、１〜１０の整数を意味する。ｍ，ｎは、１〜２０の整数を意味する。）
【００１１】
上記合成脂質は、例えば、J.Org.Chem.,Vol.47,No.11,(1982) に記載された方法に準じて得ることができる。あるいは、上記合成脂質は、 Y.Murakami et al,J.Am.Chem.Soc.,106,3613(1984) に記載された合成脂質を用いることができる。
【００１２】
本発明において、リン脂質は、通常使用し得るものであればあらゆるものを使用できるが、一例を挙げれば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、ホスファチジン酸などを用いることができる。また、必要に応じて脂質総重量の１０〜１００重量％のコレステロールを添加することも可能である。
【００１３】
更に、構成するリン脂質と合成脂質の総重量比は、選択するリン脂質および合成脂質の数や種類によって、特に限定されないが、一般にリン脂質／合成脂質＝０．１〜５０の範囲が好ましい結果をもたらす。
【００１４】
本発明にかかるリポソームに配合し得る薬物は、脂溶性の薬物でも水溶性の薬物でもよい。一例を挙げれば、脂溶性薬物としては、ユビデカレノン、トコフェロ−ル、ビタミンＫ₁ 、ビタミンＫ₂ 、プロスタグランディンＥ₁ などのプロスタグランディン類、テプレノン、アイロプロスト、インドメサシン及びその誘導体などを挙げることができ、水溶性薬物としては、塩基長１０〜３５のオリゴヌクレオチド、ＤＮＡプラスミドなどのペプタイド薬物をあげることができるが、これらに限定されない。アドリアマイシン、マイトマイシンＣ、メトトレキセートなどの抗ガン剤なども配合し得るなど、あらゆる薬物を配合することができる。
【００１５】
本発明にかかるリポソームは、従来技術を準用して製造することができる。以下にその一例を挙げる。
製造方法１
脂溶性薬物を配合したリポソーム製剤は、以下の方法で得ることができる。すなわち、一般式（Ｉ）で示される合成脂質を適宜ナス型フラスコにとり、クロロホルムまたはエーテルを加えて溶解させる。脂溶性薬物をこの溶液に加え、溶解させる。次に、溶媒を留去し、生成した薄膜をガラスビーズ及び適当な緩衝液などを加えて剥離する。超音波処理またはマイクロフルイダイザーを用いて処理したあと、セファデックスあるいはセファロースカラムを通すことにより目的としたリポソームの画分を集める。この時、限外ろ過器を用いて目的物であるリポソームの画分を集めてもよい。また、場合によっては、カラム処理や限外ろ過をしなくとも使用し得る。
【００１６】
製造方法２
水溶性薬物を配合したリポソーム製剤は以下の方法で得ることができる。すなわち、一般式（Ｉ）で示される合成脂質または合成脂質とリン脂質を適宜ナス型フラスコにとり、クロロホルムまたはエーテルを加えて溶解させる。次いで溶媒を留去し、生成した薄膜をガラスビーズ及び適当な緩衝液などを加えて剥離する。この時、薬物を添加する。これを超音波処理またはマイクロフルイダイザーを用いて処理したあと、セファデックスあるいはセファロースカラムを通すことにより目的物であるリポソームの画分を得ることができる。限外ろ過を行って、目的画分を得てもよい。更に、カラム処理や限外ろ過することなく使用することも可能である。
【００１７】
製造方法３
水溶性薬物の中でも、イオン性の薬物である場合は、以下の方法でも製造することができる。すなわち、製造方法１及び２の方法等に準じて、薬物の配合されていないリポソームを作成し、これに薬物を加える方法である。
【００１８】
上記の方法を例として、通常行われる方法で作られた本発明にかかるリポソーム及びリポソーム製剤は、通常約０．０１μｍ〜５μｍの粒径を持つものとなる。
【００１９】
すなわち本発明によって、容易に従来とは異なった体内動態を示し、標的臓器への指向性を良好にコントロールできるリポソームを提供できるものであり、この意味からも本発明の価値は高い。
【００２０】
【作用】
一般式（Ｉ）で示される合成脂質を用いることにより、脂溶性薬物及び水溶性薬物を含む安定なリポソーム製剤を得ることができるようになった。しかも、このリポソーム製剤は、これまでのリポソームとは異なる体内動態を示し、薬物の標的臓器への指向性を良好にコントロールできるものである。また、水溶性薬物を配合したリポソームは、細胞内導入効率を上昇させるという利点もある。以下に本発明の理解を容易にするために、実施例を掲げるが、本発明は、これに限定されないことは言うまでもない。
【００２１】
【実施例】
実施例１
一般式（Ｉ）においてＲがメチル基であり、Ｘが式−Ｎ^＋（ＣＨ_３）_３・Ｂｒ⁻で示される基である合成脂質２３mg（３０マイクロモル）とビタミンＫ₂ ２．３mgを３mlのクロロホルムでナス型フラスコ中で溶解し、ロータリーエバポレーターを用いて、減圧下でクロロホルムを除去した。得られた薄膜を減圧デシケーターで一夜乾燥し、クロロホルムを完全に除去した。
【００２２】
ナス型フラスコの底に残った薄膜に３mlのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）及びガラスビーズを加え、膜が完全にはがれるまでタッチ・ミキサーで振盪した。
【００２３】
次にこの懸濁液をスクリュー・バイアルに移し、３５〜４０℃でプローブ型ソニケーターを用いて１５分間超音波処理を行うと比較的透明度の高い懸濁液が得られた。
【００２４】
実施例２
実施例１と同様にして一般式（Ｉ）において、Ｒがカルボキシルメチル基であり、Ｘが式−Ｎ^＋（ＣＨ_３）_３・Ｂｒ⁻で示される基である合成脂質２３mg（３０マイクロモル）とビタミンＫ₂ ２．３mgを含むリポソーム製剤を作成した。超音波処理は４０〜４５℃で行った。
【００２５】
実施例３
実施例１と同様にして一般式（Ｉ）において、Ｒがメチル基であり、Ｘが式−ＳＯ₃ ⁻・Ｎａ⁺ で示される基である合成脂質２．３mgを含むリポソーム製剤を作成した。超音波処理は、３５〜４０℃で行った。
【００２６】
実施例４
ジパルミトイルホスファチジルコリン１５．３mg（２０マイクロモル）、コレステロール７．７mg（２０マイクロモル）、一般式（Ｉ）においてＲがメチル基、Ｘが式−Ｎ^＋（ＣＨ_３）_３・Ｂｒ⁻で示される基である合成脂質１．５mg（２マイクロモル）を３mlのクロロホルムで、ナス型フラスコ中で溶解し、ロータリーエバポレーターを用いて、減圧下でクロロホルムを除去した。ナス型フラスコの底に残った薄膜に１２mlのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）及びガラスビーズを加え、膜が完全にはがれるまで、タッチミキサーで浸透した。次にこの懸濁液をマイクロフルイダイザーを用いて１００００ｐｓｉで１５分間処理し、合成脂質リポソームを含む懸濁液を得た。
【００２７】
実施例５
実施例４と同様にして、ジパルミトイルホスファチジルコリン１５．３mg（２０マイクロモル）、コレステロール７．７mg（２０mmol）、一般式（Ｉ）において、Ｒがメチル基、Ｘが式−Ｎ^＋（ＣＨ_３）_３・Ｂｒ⁻で示される基で表される合成脂質１．５mg（２μＭ）及びユビデカレノン１．５mgを含むリポソーム製剤を作成した。
【００２８】
実施例６
一般式（Ｉ）においてＲがメチル基、Ｘが式−Ｎ^＋（ＣＨ_３）_３・Ｂｒ⁻で示される基である合成脂質１．５mg（１．９μＭ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン１．５mg（２．０μＭ）をクロロホルム３mlを用いて、ナス型フラスコ中で溶解し、ロータリーエバポレーターを用いて、減圧下でクロロホルムを除去した。ナス型フラスコの底に残った薄膜に２０mMＨＥＰＥＳ含有ＨＢＳＳ（ハンクの平衡塩溶液(Hank's Balanced Salt Solutions) ｐＨ７．４）１０mlとガラスビーズを加え、膜が完全にはがれるまで、タッチミキサーで振盪した。
【００２９】
次に、この懸濁液をスクリューバイアルに移し、３５〜４０℃でプローブ型ソニケーターを用いて、１５分間超音波処理を行うと比較的透明度の高い懸濁液が得られた。この懸濁液を室温で１時間３０分保存した後に、ミレックスＨＡ（Millex HA)（ポアサイズ０．４５μｍ、ミリポア社製）メンブレンでろ過し、脂質濃度が１００μｇ／mlになるように２０mMＨＥＰＥＳ含有ＨＢＳＳで希釈した。このリポソーム懸濁液にｐＣＡＴ^TM−Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｐｌａｓｍｉｄ（プロメガ コーポレーション（Promega Corporation)社製）を１０μｇ／mlになるように加えた。なお、ろ過、希釈及びプラスミド添加の操作は、クリーンベンチ内で行った。
【００３０】
実施例７
実施例６と同様にして、一般式（Ｉ）においてＲがメチル基、Ｘが式−Ｎ^＋（ＣＨ_３）_３・Ｂｒ⁻で示される基である合成脂質１．５mgを用いて、ｐＣＡＴ^TM−Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｐｌａｓｍｉｄを含む合成脂質リポソームを作成した。
【００３１】
（実施例８）
実施例１と同様の方法で、実施例１に記載の合成脂質３ｍｇ、トコフェロール０．３ｇを含むリポソーム製剤を作成した。
（実施例９）
実施例４と同様の方法で、実施例４に記載の合成脂質０．３ｍｇ、ジパルミトイルホスファチジルコリン３．１ｍｇ、コレステロール１．５ｍｇ、トコフェリルアセテート０．５ｍｇを含むリポソーム製剤を作成した。
（実施例１０）
実施例４と同様の方法で、実施例４に記載の合成脂質０．３ｍｇ、ジパルミトイルホスファチジルコリン３．１ｍｇ、コレステロール１．５ｍｇ、アイロプロスト０．５ｍｇを含むリポソーム製剤を作成した。
（実施例１１）
実施例４と同様の方法で、実施例４に記載の合成脂質０．３ｍｇ、ジパルミトイルホスファチジルコリン３．１ｍｇ、コレステロール１．５ｍｇ、プロスタグランジンＥ ₁ ０．５ｍｇを含むリポソーム製剤を作成した。
（実施例１２）
実施例４と同様の方法で、実施例４に記載の合成脂質０．３ｍｇ、ジパルミトイルホスファチジルコリン３．１ｍｇ、コレステロール１．５ｍｇ、インドメサシンファルネソールエステル０．５ｍｇを含有するリポソーム製剤を作成した。
【００３２】
【発明の効果】
次に本発明にかかるリポソームの効果を示すために、実験例を掲げる。
【００３３】
実験例１ 平均粒子径の測定
１ 実験方法
合成脂質リポソーム製剤の平均粒子径をナイコンプサブミクロン粒子アナライザーにより測定した。粒子径の経時変化は、冷蔵庫（４℃）に保存して調べた。試料は、実施例１〜実施例１２の合成脂質リポソーム製剤を用いた。
【００３４】
また、比較例として、実施例１と同様の方法で作成したジパルミトイルホスファチジルコリン３．１ｍｇ、ビタミンＫ ₂ ０．３ｍｇを含有するリポソーム製剤を用いた。
【００３５】
２ 実験結果
合成脂質リポソーム製剤の平均粒子径を表１に示した。なお、表中で、平均粒子径が複数あるものは、粒子径のピークが複数現れたものである。
【００３６】
【表１】

【００３７】
表１で示されるように、合成脂質リポソーム製剤の平均粒子径は、１００nm以下の微細粒子であった。また１か月の保存のあとでも平均粒子径に大きな変化は見られなかった。以上の結果より、本発明にかかるリポソームは、安定であることがわかる。
【００３８】
実験例２ ラットによるリポソーム製剤の臓器移行性
【００３９】
１ 実験方法
ＳＤ系ラット（体重３１０〜３５０g ）の大腿部静脈内に麻酔下で検体試料を２３．０μCi ³Ｈ−ビタミンＫ₂ ／kg体重（脂質１１．５μmol ／kg体重）注入した。投与後一定時間ごとに頚静脈より約０．１mlを採血した（ｎ＝３）。採取した血中の放射能濃度を以下に記載する方法で測定した。
【００４０】
検体試料は、以下のものを用いた。
試料ＤＰＰＣ： ³Ｈ−ビタミンＫ₂ を含有するＤＰＰＣリポソーム。
試料Ａ： ³Ｈ−ビタミンＫ₂ を含有する、一般式（Ｉ）においてＲ＝メチル基、Ｘ=式−Ｎ^＋（ＣＨ_３）_３・Ｂｒ⁻で示される合成脂質よりなるリポソーム。
試料Ｂ： ³Ｈ−ビタミンＫ₂ を含有する、一般式（Ｉ）においてＲ＝カルボキシメチル基、Ｘ＝式−Ｎ^＋（ＣＨ_３）_３・Ｂｒ⁻で示される合成脂質よりなるリポソーム。
試料Ｃ： ³Ｈ−ビタミンＫ₂ を含有する、一般式（Ｉ）においてＲ＝メチル基、Ｘ＝式−ＳＯ₃ ⁻・Ｎａ⁺ で示される合成脂質よりなるリポソーム。なお、 ³Ｈ−ビタミンＫ₂ は、下記構造式によって示される放射ラベル化メナキノン４である。
【００４１】
【化６】

【００４２】
血液中放射能の測定
採血した血液の内２０μｌまたは５０μｌの血液を０．７５mlのSoluene 350／イソプロピルアルコール（ｖ／ｖ＝１／１）で可溶化し、数滴の過酸化水素水を加えて、液体シンチレーションカウンターを用い、放射能を測定した。
【００４３】
臓器内放射能の測定
【００４４】
臓器約３０mgを０．５mlのSoluene 350 に加え、室温で約１２時間振盪して可溶化し、５mlのインスタゲル（instagel) ／０．５規定塩酸（ｖ／ｖ＝９／１）を加え、液体シンチレーションカウンターを用い放射能を測定した。
【００４５】
２ 実験結果
図１は、検体試料投与後の血中の放射能濃度推移を示す。表２及び表３は、投与後３０分及び２４時間での検体間の臓器移行性を比較して示す。
【００４６】
【表２】

【００４７】
【表３】

【００４８】
図１より、本発明にかかるリポソーム製剤は、良好に血中より消失していることがわかる。また、表２、表３より、本発明にかかるリポソームは、従来のものより心臓や肺臓への移行性が良く、脾臓への移行性が低下していることがわかる。
【００４９】
実験例３
１ 実験方法
細胞の調製とトランスフェクション
ＡＴＣＣより購入したアフリカミドリザル腎由来細胞ＣＶ−１を猿腎臓細胞株４０（simian kidney cell line 40) の複製開始点欠損変異株でトランスフォームさせた細胞株（以下ＣＯＳ−７と記す）を１０％牛血清を含むＤＭＥＭ培地（Dulbecco's modified Eagle's medium：以下ＤＭＥＭと記す）を用いて、１０％二酸化炭素、３７℃インキュベーター中で継代培養した。
【００５０】
上記方法で継代培養したＣＯＳ−７（２×１０⁵ cells)を、６wellマルチウエルプレート（９．４cm²/well) で一晩培養、２mlのｐＣＡＴ^TM−コントロールプラスミド１０μｇ／mlを含む２０mMＨＥＰＥＳ含有ＨＢＳＳ溶液で洗った。これに、１mlの実施例６で調製したｐＣＰＡＴ^TM−コントロールプラスミドを１０μｇ／ml含むリポソームを添加したものを試料ａとし、ｐＣＡＴ^TM−コントロールプラスミドを１０μｇ／ml含む２０ｍＭＨＥＰＥＳ含有ＨＢＳＳ溶液を試料ｂとして、実験に用いた。１０％二酸化炭素、３７℃で２時間インキュベートした後、反応溶液を除き２回洗浄し、２ml１０％牛血清含有ＤＭＥＭを添加して２日間ＣＯ2 インキュベーターで培養した。培養した細胞をセルスクレーパーで剥離し、ＨＢＳＳで２回洗浄後、細胞凍結−溶解を３回繰り返し、最後に遠心分離（１５０００rpm,１０分）により細胞抽出溶液を得た。
【００５１】
ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）活性の測定
ＤＮＡの細胞内への導入（ＣＡＴの発現）をＣＡＴ活性を測定することにより評価した。細胞抽出液５０μｌに２０μｌアセチルＣｏＡ（３．５mg／ml）、４μｌ¹⁴Ｃ−クロラムフェニコール（０．１μCi）、６μｌＨ₂ Ｏ、５０μｌ１モルTris- 塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）を加え、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベート後、１ml酢酸エチルを添加して、タッチミキサーで３回混和後、遠心分離（１２０００rpm ，５分）し、上層の酢酸エチル層０．９mlをエッペンドルフチューブ内にとり、エバポレートした。その後、４０μｌの酢酸エチルで溶解し、薄層板にスポットした。クロロホルム−エタノール（１０：１）で展開した薄層板を乾燥後、Ｘ線フィルムを用いて、ジアセチル¹⁴Ｃ−クロラムフェニコールを測定した。
【００５２】
２ 実験結果
図２及び図３にそれぞれＸ線フィルム及びバイオイメージアナライザーによって測定した結果を示す。精製したジアセチル¹⁴Ｃ−クロラムフェニコールを測定した結果、試料ａの方が高い生成量、すなわち高いＣＡＴ活性を示した。これは、ｐＣＡＴ^TM−コントロールプラスミドの細胞内導入を合成脂質リポソームが増強していることを示している。
【００５３】
上述した実験１、２および３の結果より、本発明にかかるリポソームは１００nm以下の微細粒子であり、長期保存により安定であることが明らかとなった。また、本発明にかかるリポソームは、従来のものより、心臓、肺臓への移行に優れ、薬物の細胞導入を増強していることも明らかとなった。
【００５４】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明にかかるリポソーム製剤投与後の血中の放射能濃度推移を示す。
【図２】図２は、生成したジアセチル１４Ｃ―クロラムフェニコールをＸ線フィルムによって測定した結果を示す。
【図３】図３は、生成したジアセチル１４Ｃ―クロラムフェニコールをバイオイメージアナライザーによって測定した結果を示す。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a novel liposome and a novel liposome preparation. More specifically, the present invention relates to liposomes and liposome preparations that are stable and can well control the directivity to a target organ.
[0002]
[Prior art]
In recent years, in the field of medicine, many attempts have been made to retain a drug in a liposome and use it as a drug carrier (MJOstro, et al, Am. J. Hosp. Pharm., 46, 1576 (1989)). ).
[0003]
However, there are still some unsolved problems for the practical application of liposomes in clinical settings. These include the structural instability of liposomes, the unestablished technology for arbitrarily controlling liposome orientation toward target organs and cells, and the uncertainty of reproduction during liposome production (MJOstro, “Liposomes as Drug Carriers ", ed.byG. Gregoriadis, John Wiley & Sons Ltd., 855 (1988)).
[0004]
Regarding structure strengthening, liposomes coated with polysaccharide derivatives and phospholipid derivative liposomes disclosed in JP-A-58-49311 (Sanamoto et al., Journal of Chemical Society of Japan, page 369, 1987) are known. Liposomes used as drug carriers are usually cationic or anionic charges such as phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol, phosphatidic acid, or stearylamine to improve the encapsulation efficiency of ionic drugs and stabilize the liposome itself. It has been provided as a liposome preparation to which a small amount of a substance is added to give a cationic or anionic surface charge.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
However, lipids that can be selected as charged lipids are limited, and in addition, stearylamine, which gives cationic liposomes, is not compatible with phospholipids and cannot be added in large quantities, and it is difficult to use because of its high toxicity. The development of new lipids was not expected. As drugs with various properties corresponding to a wide variety of diseases are developed, lipids that form liposomes with different properties can be used to enable rapid migration to specific organs with diseases. It is the present condition that it is craved.
[0006]
In view of the circumstances as described above, the present inventors have started research to search for lipids having different surface electrification and different in kinetics from conventional liposomes to form stable liposomes. And it came to pay attention to the synthetic lipid shown by the following general formula (I) (Y.Murakami et al, J.Am.Chem.Soc., 106,3613 (1984)). As a result of further research, it was found that the intended purpose was achieved by blending a drug with the synthetic lipid and the liposome formed from the synthetic lipid and phospholipid, and the present invention was completed.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
That is, the present invention is a drug-containing liposome comprising a drug in the synthetic lipid represented by the general formula (I) and further comprising one or more phospholipids as required.
[0008]
The liposome according to the present invention is prepared by blending a drug with a synthetic lipid represented by the following general formula (I) or by blending a drug with a mixture of a synthetic lipid and a phospholipid represented by the general formula (I). In any case, the synthetic lipid and the phospholipid can be used alone or in combination of two or more.
[0009]
[Chemical formula 5]

[0010]
(Wherein R is .X mean a methyl group or a carboxymethyl group has the formula ^{_{-N + (CH 3) 3 ·}} Br - means a group represented by · Na ^{+ -} group represented by or formula -SO _3. In the formula, k means an integer of 1 to 10. m and n mean an integer of 1 to 20.)
[0011]
The synthetic lipid can be obtained, for example, according to the method described in J. Org. Chem., Vol. 47, No. 11, (1982). Alternatively, the synthetic lipid described in Y. Murakami et al, J. Am. Chem. Soc., 106, 3613 (1984) can be used.
[0012]
In the present invention, any phospholipid can be used as long as it can be usually used. For example, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, cardiolipin, sphingomyelin, phosphatidic acid Etc. can be used. Moreover, it is also possible to add 10-100 weight% of cholesterol of a lipid total weight as needed.
[0013]
Furthermore, the total weight ratio of the constituent phospholipids and synthetic lipids is not particularly limited depending on the number and kind of phospholipids and synthetic lipids to be selected. In general, the range of phospholipids / synthetic lipids is preferably 0.1 to 50. Bring.
[0014]
The drug that can be blended in the liposome according to the present invention may be a fat-soluble drug or a water-soluble drug. For example, examples of fat-soluble drugs include ubidecarenone, tocopherol, prostaglandins such as vitamin K ₁ , vitamin K ₂ , prostaglandin E ₁ , teprenone, iloprost, indomethacin and derivatives thereof. Examples of water-soluble drugs include, but are not limited to, peptide drugs such as oligonucleotides having a base length of 10 to 35 and DNA plasmids. Any drug can be added, such as anti-cancer drugs such as adriamycin, mitomycin C, methotrexate, and the like.
[0015]
The liposome according to the present invention can be produced by applying conventional techniques. An example is given below.
Manufacturing method 1
A liposome preparation containing a fat-soluble drug can be obtained by the following method. That is, the synthetic lipid represented by the general formula (I) is appropriately placed in an eggplant-shaped flask and dissolved by adding chloroform or ether. A fat-soluble drug is added to this solution and allowed to dissolve. Next, the solvent is distilled off, and the formed thin film is peeled off by adding glass beads and a suitable buffer solution. After treatment with sonication or a microfluidizer, the desired liposome fraction is collected by passing through a Sephadex or Sepharose column. At this time, the fraction of liposome as the target product may be collected using an ultrafilter. In some cases, it can be used without column treatment or ultrafiltration.
[0016]
Manufacturing method 2
A liposome preparation containing a water-soluble drug can be obtained by the following method. That is, the synthetic lipid represented by the general formula (I) or the synthetic lipid and the phospholipid are appropriately placed in an eggplant-shaped flask and dissolved by adding chloroform or ether. Next, the solvent is distilled off, and the formed thin film is peeled off by adding glass beads and an appropriate buffer solution. At this time, the drug is added. This is treated with sonication or a microfluidizer, and then passed through a Sephadex or Sepharose column to obtain a fraction of the target liposome. The target fraction may be obtained by performing ultrafiltration. Furthermore, it can be used without column treatment or ultrafiltration.
[0017]
Manufacturing method 3
Among water-soluble drugs, when they are ionic drugs, they can also be produced by the following method. That is, in accordance with the methods of production methods 1 and 2, etc., liposomes containing no drug are prepared and the drug is added thereto.
[0018]
Taking the above method as an example, the liposomes and liposome preparations according to the present invention produced by a conventional method usually have a particle size of about 0.01 μm to 5 μm.
[0019]
That is, according to the present invention, it is possible to provide a liposome that easily exhibits a different pharmacokinetics than the conventional one and can favorably control the directivity to the target organ, and the value of the present invention is also high in this sense.
[0020]
[Action]
By using the synthetic lipid represented by the general formula (I), a stable liposome preparation containing a fat-soluble drug and a water-soluble drug can be obtained. In addition, this liposome preparation exhibits different pharmacokinetics than conventional liposomes, and can favorably control the directionality of the drug to the target organ. Moreover, the liposome which mix | blended the water-soluble drug also has the advantage of raising the intracellular introduction | transduction efficiency. In order to facilitate the understanding of the present invention, examples will be given below, but it goes without saying that the present invention is not limited thereto.
[0021]
【Example】
Example 1
Wherein R is a methyl group in the general formula (I), X is the formula ^{_{-N + (CH 3) 3 ·}} Br - is a group represented by the synthetic lipids 23 mg (30 .mu.mol) and vitamin K ₂ 2.3 mg to 3ml Was dissolved in an eggplant-shaped flask, and the chloroform was removed under reduced pressure using a rotary evaporator. The obtained thin film was dried overnight in a vacuum desiccator to completely remove chloroform.
[0022]
3 ml of phosphate buffer (pH 7.4) and glass beads were added to the thin film remaining at the bottom of the eggplant-shaped flask, and shaken with a touch mixer until the membrane was completely removed.
[0023]
Next, when this suspension was transferred to a screw vial and sonicated for 15 minutes using a probe sonicator at 35 to 40 ° C., a suspension with a relatively high transparency was obtained.
[0024]
Example 2
In the same manner as in Example 1, in general formula (I), R is a carboxylmethyl group, and X is a group represented by the formula —N ⁺ (CH ₃ ) ₃ .Br ^— 23 mg (30 μmol) And a liposome preparation containing 2.3 mg of vitamin K ₂ . Sonication was performed at 40 to 45 ° C.
[0025]
Example 3
In the same manner as in Example 1, a liposome preparation containing 2.3 mg of a synthetic lipid in which R is a methyl group and X is a group represented by the formula —SO ₃ ^— · Na ⁺ in the general formula (I) was prepared. The ultrasonic treatment was performed at 35 to 40 ° C.
[0026]
Example 4
Represented by ^- dipalmitoylphosphatidylcholine 15.3 mg (20 micromoles), cholesterol 7.7 mg (20 micromoles), in the general formula (I) R is a methyl group, X is the formula ^{_{-N + (CH 3) 3 ·}} Br Synthetic lipid 1.5 mg (2 micromol) as a group was dissolved in 3 ml of chloroform in an eggplant type flask, and chloroform was removed under reduced pressure using a rotary evaporator. 12 ml of phosphate buffer (pH 7.4) and glass beads were added to the thin film remaining at the bottom of the eggplant-shaped flask, and permeated with a touch mixer until the membrane was completely removed. Next, this suspension was treated at 10,000 psi for 15 minutes using a microfluidizer to obtain a suspension containing synthetic lipid liposomes.
[0027]
Example 5
In the same manner as in Example 4, 15.3 mg (20 μmol) of dipalmitoylphosphatidylcholine, 7.7 mg (20 mmol) of cholesterol, R in formula (I), R is a methyl group, X is a formula —N ⁺ (CH ₃ ). A liposome preparation containing 1.5 mg (2 μM) of a synthetic lipid represented by a group represented by ₃ · Br ⁻ and 1.5 mg of ubidecarenone was prepared.
[0028]
Example 6
General formula (I) in R is a methyl group, X is the formula ^{_{-N + (CH 3) 3 ·}} Br - group in which synthetic lipid 1.5mg represented by (1.9μM), dioleoylphosphatidylethanolamine 1. 5 mg (2.0 μM) was dissolved in 3 ml of chloroform in an eggplant-shaped flask, and chloroform was removed under reduced pressure using a rotary evaporator. To the thin film remaining at the bottom of the eggplant-shaped flask, 10 ml of 20 mM HEPES-containing HBSS (Hank's Balanced Salt Solutions pH 7.4) and glass beads were added and shaken with a touch mixer until the membrane was completely removed.
[0029]
Next, when this suspension was transferred to a screw vial and sonicated for 15 minutes using a probe-type sonicator at 35 to 40 ° C., a relatively highly transparent suspension was obtained. This suspension was stored at room temperature for 1 hour 30 minutes, and then filtered through a Millex HA (pore size 0.45 μm, manufactured by Millipore) membrane with 20 mM HEPES-containing HBSS so that the lipid concentration was 100 μg / ml. Diluted. To this liposome suspension, pCAT ^™ -Control Plasmid (manufactured by Promega Corporation) was added to a concentration of 10 μg / ml. The operations of filtration, dilution and plasmid addition were performed in a clean bench.
[0030]
Example 7
In the same manner as in Example 6, the general formula R is a methyl group in (I), X is the formula ^{_{-N + (CH 3) 3 ·}} Br - synthetic lipid 1.5mg a group represented by using, pCAT ^TM -Synthetic lipid liposomes containing Control Plasmid were made.
[0031]
(Example 8)
In the same manner as in Example 1, a liposome preparation containing 3 mg of the synthetic lipid described in Example 1 and 0.3 g of tocopherol was prepared.
Example 9
In the same manner as in Example 4, a liposome preparation containing 0.3 mg of the synthetic lipid described in Example 4, 3.1 mg of dipalmitoylphosphatidylcholine, 1.5 mg of cholesterol, and 0.5 mg of tocopheryl acetate was prepared.
(Example 10)
In the same manner as in Example 4, a liposome preparation containing 0.3 mg of the synthetic lipid described in Example 4, 3.1 mg of dipalmitoylphosphatidylcholine, 1.5 mg of cholesterol and 0.5 mg of iloprost was prepared.
(Example 11)
In the same manner as in Example 4, 0.3 mg of the synthetic lipid described in Example 4, 3.1 mg of dipalmitoylphosphatidylcholine, 1.5 mg of cholesterol, prostaglandin E ₁ A liposome formulation containing 0.5 mg was made.
(Example 12)
In the same manner as in Example 4, a liposome preparation containing 0.3 mg of the synthetic lipid described in Example 4, 3.1 mg of dipalmitoylphosphatidylcholine, 1.5 mg of cholesterol, and 0.5 mg of indomethacin farnesol ester was prepared.
[0032]
【The invention's effect】
Next, in order to show the effect of the liposome according to the present invention, an experimental example will be given.
[0033]
Experimental Example 1 Measurement of Average Particle Size 1 Experimental Method The average particle size of the synthetic lipid liposome preparation was measured with a Nikon sub-micron particle analyzer. The change with time in the particle diameter was examined by storing in a refrigerator (4 ° C.). As the sample, the synthetic lipid liposome preparation of Example 1 to Example 12 was used.
[0034]
Further, as a comparative example, 3.1 mg of dipalmitoyl phosphatidylcholine prepared by the same method as in Example 1 and vitamin K ₂ A liposome formulation containing 0.3 mg was used.
[0035]
2 Experimental Results Table 1 shows the average particle size of the synthetic lipid liposome preparation. In the table, those having a plurality of average particle diameters are those in which a plurality of particle diameter peaks appear.
[0036]
[Table 1]

[0037]
As shown in Table 1, the average particle size of the synthetic lipid liposome preparation was fine particles of 100 nm or less. In addition, no significant change in the average particle size was observed even after 1 month of storage. From the above results, it can be seen that the liposome according to the present invention is stable.
[0038]
Experimental Example 2 Organ transferability of liposome preparation by rats
1 Experimental Method 23.0 μCi ³ H-vitamin K ₂ / kg body weight (lipid 11.5 μmol / kg body weight) was injected into the femoral vein of SD rats (body weight 310 to 350 g) under anesthesia. About 0.1 ml was collected from the jugular vein at regular intervals after administration (n = 3). The radioactivity concentration in the collected blood was measured by the method described below.
[0040]
The following specimens were used.
Sample DPPC: DPPC liposome containing ³ H-vitamin K ₂ .
Sample A: ³ H- containing vitamin K _2, the general formula R = a methyl group in (I), X = formula _{^{-N + (CH 3) 3 ·}} Br - liposomes composed of synthetic lipids represented by.
Sample B: A liposome comprising ³ H-vitamin K ₂ and composed of a synthetic lipid represented by R = carboxymethyl group and X = formula N ⁺ (CH ₃ ) ₃ · Br ⁻ in general formula (I).
Sample C: A liposome comprising ³ H-vitamin K ₂ and composed of a synthetic lipid represented by R = methyl group and X = formula —SO ₃ ^— · Na ⁺ in the general formula (I). ³ H-vitamin K ₂ is radiolabeled menaquinone 4 represented by the following structural formula.
[0041]
[Chemical 6]

[0042]
Measurement of radioactivity in blood 20 μl or 50 μl of the collected blood was solubilized with 0.75 ml of Soluene 350 / isopropyl alcohol (v / v = 1/1), and a few drops of hydrogen peroxide were added. Radioactivity was measured using a liquid scintillation counter.
[0043]
Measurement of radioactivity in organs [0044]
Add about 30 mg of organ to 0.5 ml of Soluene 350, solubilize by shaking for about 12 hours at room temperature, add 5 ml of instagel / 0.5 normal hydrochloric acid (v / v = 9/1), and add liquid Radioactivity was measured using a scintillation counter.
[0045]
2 Experimental Results FIG. 1 shows the change in radioactivity concentration in blood after administration of the specimen sample. Tables 2 and 3 show comparison of organ migration between specimens at 30 minutes and 24 hours after administration.
[0046]
[Table 2]

[0047]
[Table 3]

[0048]
FIG. 1 shows that the liposome preparation according to the present invention has disappeared from the blood well. Tables 2 and 3 also show that the liposomes according to the present invention have better transferability to the heart and lungs than the conventional liposomes, and transferability to the spleen is reduced.
[0049]
Experimental example 3
1. Experimental method Cell preparation and transfection A cell line obtained by transforming African green monkey kidney-derived cell CV-1 purchased from ATCC with a replication origin-deficient mutant of monkey kidney cell line 40 (hereinafter referred to as “simian kidney cell line 40”) COS-7) was subcultured in a 10% carbon dioxide, 37 ° C. incubator using a DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle's medium: hereinafter referred to as DMEM) containing 10% bovine serum.
[0050]
COS-7 (2 × 10 ⁵ cells) subcultured by the above method is cultured overnight in a 6-well multiwell plate (9.4 cm ² / well) and contains 20 mM HEPES containing 10 μg / ml of 2 ml of pCAT ^™ -control plasmid. Washed with HBSS solution. To this, 1 a of liposome containing 10 μg / ml of pCPAT ^™ -control plasmid prepared in Example 6 was added as sample a, and 20 mM HEPES-containing HBSS solution containing 10 μg / ml of pCAT ^™ -control plasmid was used as sample b. Used for experiments. After 2 hours of incubation at 37 ° C. with 10% carbon dioxide, the reaction solution was removed, washed twice, 2 ml of DMEM containing 10% bovine serum was added, and the cells were cultured in a CO 2 incubator for 2 days. The cultured cells were detached with a cell scraper, washed twice with HBSS, cell freeze-lysis was repeated three times, and finally a cell extraction solution was obtained by centrifugation (15000 rpm, 10 minutes).
[0051]
Measurement of CAT (chloramphenicol acetyltransferase) activity DNA introduction into cells (CAT expression) was evaluated by measuring CAT activity. To 50 μl of cell extract, 20 μl acetyl CoA (3.5 mg / ml), 4 μl ¹⁴ C-chloramphenicol (0.1 μCi), 6 μl H ₂ O, 50 μl 1 molar Tris-HCl buffer (pH 7.8) were added, and 37 Incubated for 2 hours at ° C. After incubation, 1 ml of ethyl acetate was added, mixed three times with a touch mixer, centrifuged (12000 rpm, 5 minutes), 0.9 ml of the upper ethyl acetate layer was placed in an Eppendorf tube and evaporated. Then, it melt | dissolved with 40 microliters ethyl acetate and spotted on the thin layer board. After drying the thin layer plate developed with chloroform-ethanol (10: 1), diacetyl ¹⁴ C-chloramphenicol was measured using an X-ray film.
[0052]
2 Experimental Results FIGS. 2 and 3 show the results of measurement using an X-ray film and a bioimage analyzer, respectively. As a result of measuring purified diacetyl ¹⁴ C-chloramphenicol, the sample a showed a higher production amount, that is, a higher CAT activity. This indicates that the synthetic lipid liposomes enhance the intracellular introduction of the pCAT ^™ -control plasmid.
[0053]
From the results of Experiments 1, 2, and 3 described above, it was revealed that the liposome according to the present invention is a fine particle of 100 nm or less, and is stable by long-term storage. In addition, it was also clarified that the liposome according to the present invention is superior in transfer to the heart and lungs and enhances the cell introduction of the drug than the conventional one.
[0054]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows changes in radioactivity concentration in blood after administration of a liposome preparation according to the present invention.
FIG. 2 shows the results of measuring the produced diacetyl 14C-chloramphenicol with an X-ray film.
FIG. 3 shows the result of measuring the produced diacetyl 14C-chloramphenicol with a bioimage analyzer.

Claims (1)

Liposome preparation with enhanced transferability of fat-soluble drugs to organs,
(1) The component of the liposome is represented by the general formula (I)

[Chemical 1]
(.X wherein R is mean a methyl group has the formula ^{_{-N + (CH 3) 3 ·}} Br -. Means a group represented in the formula k is, .m which means integer of 1 to 10, n Represents an integer of 11 to 20.) (2) The fat-soluble drug is selected from the group of ubidecarenone, tocopherol, tocopheryl acetate, vitamin K ₁ and vitamin K ₂ (3) A liposome preparation characterized in that the organ is a lung or a heart.

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