JP3667434B2 - Nonspecific reaction inhibitor used for immunoassay, nonspecific reaction suppression method and measurement kit - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は標識抗体を使用する免疫測定法において用いる、微量物質を正確に検出、定量するための障害となる非特異反応を抑制するための非特異反応抑制剤、これを用いる非特異反応抑制方法及びこれを含む免疫測定キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗原抗体反応を利用した免疫測定法は微量成分を特異的に検出あるいは精度よく測定できることから、臨床検査に広く利用されている。免疫測定法には一元放射免疫拡散法、比濁法、比ろう法、凝集法（血球やラテックスを担体として用いた方法）、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法等の種類があるが、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法は測定感度も高く、特に極微量成分の検出あるいは定量に多用されている。
【０００３】
放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法はそれぞれ放射性物質、酵素、蛍光物質を抗体に結合した標識抗体を用いる方法で、一般的には、抗体や抗原を不溶性担体に結合した固相化抗体または固相化抗原と組み合わせた固相法で使用される。固相法には「固相化抗体−抗原−標識抗体」複合物を作らせ測定するサンドイッチ法や、固相化抗原と検体中の遊離抗原が反応系内に添加された一定量の標識抗体に対して競合的に反応することを原理とする競合法がある。
【０００４】
ところで、これらの免疫測定法においては、本来の目的とする特異的な抗原抗体反応以外の非特異反応により、測定値の信頼性が損なわれてしまうことがしばしば認められている。この現象は、検体中に含まれる抗原以外の成分が標識抗体と反応することによって引き起こされる。
【０００５】
モノクローナル抗体を用いた測定系においても非特異反応が認められており、せっかく優れた特異性を持つモノクローナル抗体を得ることができたとしても、それを実際の測定系において使用する段階で、その性能を十分生かすことができないことが大きな問題となっている。
【０００６】
従来より、非特異反応を抑制し正しい測定値を得るために色々な試みが行われてきた。例えば、測定すべき検体を加熱や適当な試薬により前処理したり、各種動物血清、免疫グロブリン画分、アルブミン、スキムミルク、ゼラチン、界面活性剤等を測定系に添加することが一般的に行われてきた。リュウマチ因子のように抗体のＦｃ部位に結合することにより引き起こされる非特異反応を回避するためには、ＦａｂやＦ（ａｂ’）2 等の抗体断片を特異反応に使用することも行われている。また、測定系に使用するモノクローナル抗体とは反応特異性が異なりかつ測定系に係わる反応を阻害しないモノクローナル抗体を測定系に添加することも行われている。
【０００７】
特開平１−２５４８６９号公報には、測定対象に対し非特異性で、モノクローナル又はポリクローナル抗体から誘導された凝集体の使用が提案されている。この凝集体は該抗体のホモポリマーであっても、抗体断片あるいはアルブミンのような蛋白質やデキストランのような多糖類の巨大分子とのヘテロポリマーであってもよい。
【０００８】
特開平２−１５２９９９号公報では、非特異反応の抑制のために、特異反応に使用するモノクローナル抗体を加熱処理などすることにより調製した、本来の抗体の特異活性は失っているが、非特異反応抑制活性は保持しているモノクローナル抗体由来物質が開示されている。
【０００９】
しかし、これらの方法は非特異反応の抑制にある程度の効果はあるものの、一部の検体ではその効果はまだ不十分であり、実用上必ずしも満足できるものではなかった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況に鑑み、標識抗体を用いる免疫測定法において、測定に伴う非特異反応を簡便かつ効果的に抑制し、検体中の微量成分の正確な検出ならびに定量を実現するための非特異反応抑制剤とその使用方法を提供することが本発明の目的である。
また、非特異反応を防止するための有用な非特異反応抑制剤を含有する測定キットを提供することが本発明のもう一つの目的である。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記した問題点を解決すべく非特異反応について鋭意検討した結果、本発明に至った。すなわち、本発明は、
（１）標識抗体を用いる免疫測定法において使用する非特異反応抑制剤であって、標識抗体に使用する抗体と同一の抗体の完全抗体および／または抗体断片を用いて得られる結合体からなり、抗体本来の特異反応活性を完全にもしくは実質的に喪失しているが非特異反応抑制活性は実質的に保持している非特異反応抑制剤、
（２）結合体が、共有結合させることにより製造されたものである上記（１）に記載の非特異反応抑制剤、
（３）結合体が、標識抗体に使用する抗体と同一の抗体の完全抗体および／または抗体断片とそれ以外の高分子物質とを用いて得られたものである上記（１），（２）のいずれかに記載の非特異反応抑制剤、
（４）抗体がモノクローナル抗体である上記（１）から（３）のいずれかに記載の非特異反応抑制剤、
（５）加熱処理、分解処理またはそれらの組み合わせによって抗体本来の特異反応活性が喪失させられた上記（１）から（４）のいずれかに記載の非特異反応抑制剤、
（６）検体中の抗原を標識抗体を用いて免疫測定する際に、上記（１）から（５）のいずれかに記載の非特異反応抑制剤を使用することを特徴とする非特異反応抑制方法、
（７）特異的な免疫反応工程を行う前に、検体と非特異反応抑制剤との間に反応を行わせることを特徴とする上記（６）に記載の非特異反応抑制方法、
（８）非特異反応抑制剤の共存下に、検体を測定するための特異的な免疫反応工程を行うことを特徴とする上記（６）に記載の非特異反応抑制方法、
（９）免疫測定がサンドイッチ法による測定であり、特異的な免疫反応工程の一つ以上の工程を非特異反応抑制剤の共存下で行わせることを特徴とする上記（６）に記載の非特異反応抑制方法、
（１０）標識抗体及び上記（１）〜（５）のいずれかに記載の非特異反応抑制剤を含む免疫測定キット、
に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において標識抗体は、代表的には、酵素、放射性物質、蛍光物質等の何らかの手段により定量可能なシグナルを出す物質を結合した抗体で、抗原抗体反応を行う溶液に可溶性のものを指すが、シグナルを出す物質を直接抗体に結合していなくても、アビジン−酵素複合体を結合するためのビオチンを結合した抗体や放射活性あるいは蛍光活性を有する金属イオン等と錯化合物を形成する能力のある化合物を結合した抗体で可溶性のものも含まれる。
【００１３】
これらの標識抗体を用いる免疫測定法は、固相法であろうと液相法であろうと方法は問わない。固相法には正サンドイッチ法、逆サンドイッチ法、１段階サンドイッチ法等のサンドイッチ法や競合法が含まれる。液相法には、特公平７−７２７３１号公報に開示されるような、酵素標識抗体を用いて抗原抗体反応を行わせ、標識抗体と抗原の会合の結果生じる酵素活性の変化により抗原量を測定する測定法が含まれる。また、標識物質が抗体に直接結合されていなくても、抗原抗体反応に続く反応工程で標識物質を結合するような測定法、例えば、ビオチニル化抗体を用いたサンドイッチ法による免疫反応工程の後に、アビジン−酵素複合体を反応させるような測定法も含まれる。
【００１４】
本発明における非特異反応抑制剤は標識抗体に使用する抗体と同一の抗体の完全抗体および／または抗体断片（以下「同一抗体の抗体（断片）」という）より製造される。抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、抗体を産生する実際上任意の動物種、例えば家兎、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、マウスまたはラットなど由来の抗体が使用できる。
【００１５】
標識抗体に使用される抗体の形態には完全抗体や、それを酵素処理や化学処理により切断したＦ（ａｂ’）2 やＦａｂ’等のような抗体断片があるが、本発明の非特異反応抑制剤の製造に用いる抗体の形態は、抗体が標識抗体と同一であれば、標識抗体に使用した抗体の形態と同一の形態である必要はない。形態は特に限定されず、特異的結合部位を持たないＦｃ断片であってもよい。なお、非特異反応は検体中に存在する測定対象以外の何らかの物質が標識抗体に反応して起こることを考慮すると、標識抗体に用いた抗体断片部位を含む同一抗体の抗体（断片）を用いるのが好ましい。
【００１６】
抗体断片の作製は例えばパパイン、ペプシン、トリプシン等の酵素による消化又は還元剤によるＳ−Ｓ結合の切断又はこれらを組み合わせた公知の方法で行える。例えば完全抗体をパパインで消化するとＦａｂとＦｃ断片に切断できる。ペプシンで消化すればＦ（ａｂ’）2 断片が得られ、さらに、２−メルカプトエチルアミンで還元すればＦａｂ’断片が得られる。完全抗体をジチオスレイトールや２−メルカプトエタノールで還元し、次いで、ヨードアセトアミドのようなＳＨ試薬で処理すればＬ鎖とＨ鎖に切断できる。
【００１７】
本発明における非特異反応抑制剤は同一抗体の抗体（断片）単独の結合体であっても、他の高分子物質との結合体であってもよい。同一抗体の抗体（断片）単独の結合体の場合、完全抗体のみのまたは抗体断片のみの結合体であっても、それらの混合物の結合体であってもよい。結合体を製造するために同一抗体の抗体（断片）とともに用いられる他の高分子物質としては、標識抗体に使用した抗体以外のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、アルブミン、ゼラチンなどの蛋白質、デキストラン、アミノデキストラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなどの多糖類またはその誘導体、末端をアミノ基で修飾したポリアルキレングリコール誘導体などの合成高分子などが用いられる。好ましい他の高分子物質としては標識抗体に使用した抗体以外のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、アルブミン、ヒドロキシプロピルセルロース、等が挙げられる。又、他の高分子物質の分子量は１０００〜１００００００の範囲が好ましく、特に１００００〜３０００００の範囲が好ましい。
【００１８】
同一抗体の抗体（断片）はそれのみで、あるいは蛋白質、多糖類、または合成高分子物質等の他の高分子物質とともに、有機化学的手法、または生物学的親和性に基づく相互作用などを介して文献から公知の方法により結合体を製造することができる。
【００１９】
有機化学的方法では、例えば、架橋試薬を用いて共有結合させることにより結合体を製造することができる。主な架橋試薬としてはカルボジイミド、イソシアネート、ジアゾ化合物、ベンゾキノン、グルタルアルデヒド、過ヨウ素酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物、マレイミド化合物、ピリジル・ジスルフィド化合物等があげられる。これらの架橋試薬を使用した結合体の製造は、例えば酵素標識抗体で酵素と抗体を結合する方法と同一の方法で行うことができ、石川らの「酵素免疫測定法第３版（医学書院、１９８７年）７５〜１２６頁」やＰ．Ｔｉｊｓｓｅｎの「エンザイムイムノアッセイ（生化学実験法１１、東京化学同人、１９８９年）１９６〜２５１頁」等に詳細に記載されている酵素標識抗体の作製方法を参照すればよい。これらの試薬の多くは抗体および抗体とともに使用する高分子物質のアミノ基やチオール基を利用している。抗体のチオール基を利用する方法としては抗体を酵素および還元処理してＦａｂ’に断片化して抗体のヒンジ部分にあるチオール基を利用したり、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物、メチル−４−メルカプトブチルイミデート、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート等によりチオール基を導入する方法等がある。また、架橋試薬としては主に２つの官能基を持ったものを使用し、
同じ官能基を２つ持つ同反応性二価試薬と異なる官能基を有する異反応性二価試薬がある。
【００２０】
共有結合させることによる結合体の製造方法の例をいくつか説明する。グルタルアルデヒド法はグルタルアルデヒドが２つのアルデヒド基を持っていることから、同一抗体の抗体（断片）又はこれと他の高分子物質のアミノ基と反応して架橋させる方法である。過ヨウ素酸法は同一抗体の抗体（断片）又は他の高分子物質の糖鎖を過ヨウ素酸により酸化して生成したアルデヒド基と同一抗体の抗体（断片）又は他の高分子物質のアミノ基の反応により架橋する方法である。Ｎ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ，Ｎ’−ｐ−フェニレンジマレイミドやＮ，Ｎ’−オキシジメチレンジマレイミド等の２つのマレイミド基を有する架橋試薬を使用する方法ではチオール基により架橋が行われる。ビス−コハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等のような同反応性二価試薬はアミノ基を介して架橋が行われる。Ｎ−スクシンイミジル−２−マレイミドアセテート、Ｎ−スクシンイミジル−４−マレイミドブチレート、Ｎ−スクシンイミジル−６−マレイミドヘキサノエート、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スルホスクシンイミジル−３−マレイミドベンゾエート、Ｎ−スルホスクシンイミジル−４−マレイミドベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドフェニル）−４−ブチレート等のマレイミド誘導体のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは異反応性二価試薬で、同一抗体の抗体（断片）や他の高分子物質のアミノ基とチオール基を介して架橋させる。Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートもアミノ基とチオール基の架橋に使われる。
【００２１】
生物学的親和性を利用した結合体の製造方法の例としては、アビジンとビオチンの結合を利用した方法がある。例えば同一抗体の抗体（断片）とアルブミンなどの他の高分子物質の両方にビオチン分子を導入しアビジンにより架橋する方法や、あるいは両者の一方にアビジンを導入し、もう一方にビオチンを導入して架橋する方法がある。ビオチン分子の導入にはビオチニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシミニドエステルなどが試薬として使われる。
【００２２】
前述の方法により製造した結合体は、一般にかなり広い分子量分布をもっている。結合体は分子量が大きくなるほど非特異反応抑制効果が増大するが、さらに分子量が大きくなると沈殿を起こし不溶化するため、非特異反応抑制効果は逆に低下する。結合体の分子量は可溶性を保持している範囲であることが望ましい。結合体は異なる分子量を有する混合物であってもかまわないが、ゲル濾過、限外濾過や遠心分離などの公知の方法により分別し、希望の分子量にして使用することもできる。結合体（非特異反応抑制剤）の平均分子量は１０万以上であることが好ましく、特に３０万〜４０００万の範囲であることが好ましい。又、結合体が同一抗体の抗体（断片）と他の高分子物質とを用いてえられるものである場合、同一抗体の抗体（断片）と他の高分子物質の使用割合は、モル比で１：０．０１〜１００の範囲であることが好ましく、特に１：０．１〜１０の範囲であることが好ましい。
【００２３】
同一抗体の抗体（断片）の特異活性は加熱処理、酵素による分解処理、酸・アルカリや還元剤等による化学処理、超音波処理などの公知の方法により喪失させることができる。また、これらの方法を組み合わせて行うことも可能である。同一抗体の抗体（断片）の特異活性を喪失させるための処理は、結合体を製造する前の同一抗体の抗体（断片）の段階で行ってもよいし、結合体にしてから処理してもよい。
【００２４】
ここで「抗体本来の特異反応活性を実質的に喪失している」とは、測定の正確さおよび信頼性の観点から判断して支障のない程度に特異反応活性を喪失しているという意味である。特異反応活性を完全に喪失させるために過剰の強い処理を行えば、非特異反応抑制活性も失われる場合もあるので、その処理条件を適宜選択して、特異反応活性は実質的に喪失しているが、非特異反応抑制活性は保持されうる穏和な条件で処理する必要がある。
【００２５】
この処理法の例として、最も簡便な方法の一つである加熱処理法を示す。この場合、ｐＨ３からｐＨ１２の範囲の適当な緩衝液中に同一抗体の抗体（断片）又は結合体を抗体濃度として１０μｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、５０℃から１００℃で１分間〜４８時間インキュベートすることによって非特異反応抑制剤は製造される。特異反応活性の喪失のしやすさは同一抗体の抗体（断片）又は結合体によってかなり異なり、処理条件は個々に検討しなければならないが、加熱処理の温度と時間の関係は一般的に言って、処理温度を高くすれば処理時間を短くする必要がある。酵素による分解処理の例としては、パパインやトリプシンにより完全抗体を消化し、ゲル濾過により分画してＦｃ断片を得る方法がある。Ｆｃ断片は抗体の特異活性部位を失っており、特異反応活性を有しない。このＦｃ断片を用いて、前記方法で結合体を製造することができる。
【００２６】
本発明の非特異反応抑制剤の使用方法としては、標識抗体を用いる免疫測定法において行なう特異的な免疫反応工程の前に予め適当な緩衝液中で非特異反応抑制剤と検体を接触させ、適当な時間（例えば１分〜２時間）インキュベートする方法がある。この間に、検体中の非特異反応を起こす物質（非特異反応物質）は非特異反応抑制剤と反応し、特異的免疫反応工程での標識抗体との非特異反応活性は失われる。特異的免疫反応工程にはインキュベートを完了した検体と非特異反応抑制剤の混合液をそのまま用いればよい。
【００２７】
さらに簡便な本発明の非特異反応抑制剤の使用方法は、非特異反応抑制剤の共存下に特異的免疫反応工程を行う方法である。例えば、最も一般的に用いられる正サンドイッチ法の場合、固相化抗体と検体中の抗原とを反応させる第一免疫反応工程の緩衝液に非特異反応抑制剤を添加するだけで、それ以外は何ら特別な工程を必要とせずに所望の効果を得ることができる。なぜなら、非特異反応が検出されるのは、抗体の特異的反応部位を介さずに「固相化抗体−非特異反応物質−標識抗体」サンドイッチ複合体を形成するためであるが、第一免疫反応中に非特異反応物質の標識抗体に対する反応活性が非特異反応抑制剤により吸収されるからである。さらに、抗体の特異反応部位を介して固定化された抗原と標識抗体とを反応させる第二免疫反応工程の緩衝液にも添加すれば、第一免疫反応工程で完全に吸収されなかった非特異反応物質も吸収されるため、測定の信頼性をより一層高めることができる。なお、通常は第一免疫反応工程の緩衝液に添加されていれば十分な効果が得られる。
【００２８】
また、１段階サンドイッチ法においても免疫反応工程の緩衝液に非特異反応抑制剤を添加して反応させることにより、非特異反応は回避される。本発明の非特異反応抑制剤は結合体であるために標識抗体より非特異反応を起こす物質との結合力が高められている。また、標識抗体に比べて過剰量を添加しておけば非特異反応を起こす物質は優先的に非特異反応抑制剤と反応するので非特異反応は回避される。
【００２９】
本発明の非特異反応抑制剤は、免疫反応工程の前に予め適当な緩衝液に添加して使用されるか、あるいは免疫反応工程の緩衝液に添加して使用される。非特異反応抑制剤の非特異反応物質と反応させる系における濃度は０．１〜２００μｇ／ｍｌであることが好ましくと、さらに好ましくは１〜５０μｇ／ｍｌである。使用される緩衝液は公知の通常免疫反応に使われる適当な緩衝液であってよい。また、緩衝液中に通常添加される助剤たとえば反応促進剤、洗浄剤または安定剤と共に使用することができる。さらに別の非特異反応抑制剤と共に用いることもできる。適当な緩衝液として例えばリン酸塩緩衝液２０〜１００ｍＭ ｐＨ６〜８またはトリス−塩酸５０ｍＭ／ＮａＣｌ １００ｍＭ ｐＨ７〜８などが使用できる。反応促進剤としては例えばデキストランサルフェートまたはポリエチレングリコールなど、洗浄剤としては例えばトリトンＸ−１００、ツイーン２０などを、また安定化剤としてアルブミン、スキムミルク、ゼラチンなどの蛋白質やアジ化ナトリウム、チメロサール、ケーソンＣＧなどの防腐剤を挙げることができる。
【００３０】
本発明の他の対象は、標識抗体を用いた免疫測定法に使用する、標識抗体及び本発明の非特異反応抑制剤を含む測定キットに関するものである。一般に測定キットは標識抗体液、固相化抗体、標準物質などの試薬から構成され、さらに必要に応じて、サンドイッチ法で検体と固相化抗体を反応させるため緩衝液、酵素反応のための発色液と反応停止液、固相を洗浄するための洗浄液、検体の前処理剤などを含んで構成される。これらの構成試薬が凍結乾燥品の場合、復元のための溶液も添付される場合がある。
【００３１】
本発明の非特異反応抑制剤は単独でキットの構成試薬にしてもよいし、他の構成試薬の成分としてもよい。しかし、測定操作を増やすことなしに非特異反応抑制効果が得られることを考慮すれば、構成試薬の一成分として添加するのが好ましい。通常本発明の非特異反応抑制剤は検体と固相化抗体を反応する緩衝液や標識抗体に添加してキットの構成試薬とする。これらの構成試薬が凍結乾燥品の場合には復元液に添加することもできる。標識抗体に対して非特異反応抑制剤は０．１〜１０００重量倍用いるのが好ましく、特に１〜１００重量倍用いるのが好ましい。
【００３２】
固相法に基づくキットの場合、固相の種類や形状は問わない。公知の通常免疫測定キットに使われるものでよい。固相の例としてはプラスチック試験管、ポリスチレンビーズ、ポリスチレン粒子、ポリスチレンマイクロプレート、ポリエチレンテレフタレートマイクロプレート、ポリ塩化ビニルマイクロプレート、磁性粒子、ガラスビーズ、セルロース粒子、ニトロセルロース膜、セルロース濾紙、ナイロン膜などが挙げられる。イムノクロマトグラフィーなどを原理とする簡易測定キットの試験片を使用することも可能である。
【００３３】
本発明の非特異反応抑制剤を用いる免疫測定法において使用される検体としては、例えば血清、血漿、髄液、唾液等の体液や尿、糞便抽出液等が挙げられ、又、測定物質としては、臨床検査に利用される物質、例えば体液中に含まれる、ヒトイムノグロブリン、ヒトアルブミン、ヒトフィブリノーゲン、β2-ミクログロブリン、フェリチン、Ｃ反応性蛋白、α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、ＣＡ１９−９、塩基性フェトプロティン、組織ポリペプチド抗原、免疫抑制酸性蛋白、ＣＡ−５０、膵癌胎児性抗原、シアリルＬｅX −ｉ抗原、ＳＣＣ抗原、ＣＡ１５−３、ＣＡ７２−４、シアリルＴｎ、ＣＡ１２５、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、γ−セミノプロティン、前立腺特異抗原、ニューロン特異エノラーゼ、肝炎ウイルス抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤性ラクトーゲン、インスリン、などが挙げられる。
【００３４】
【実施例】
次に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
【００３５】
実施例１ 同反応性二価試薬による非特異反応抑制剤の製造
抗ヒトＣＥＡマウスモノクローナル抗体Ｃ４３（サブクラス ＩｇＧ1 、λ、純度９５％以上）を２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）１ｍｌに２．５％グルタルアルデヒド水溶液を１０μｌ加えて室温で撹拌しながら３時間反応した。さらに、０．２Ｍ Ｌ−リジン塩酸塩水溶液を０．１ｍｌ添加し、室温で撹拌しながら１時間反応した後、１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）に対して４℃で一夜透析した。その後１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）で希釈して、抗体濃度０．５ｍｇ／ｍｌに調製し、水浴中で６０℃、３時間インキュベートし、非特異反応抑制のための結合体（非特異反応抑制剤）を得た。
【００３６】
実施例２ 過ヨウ素酸法による非特異反応抑制剤の製造
５ｍｇの抗ヒトＣＥＡマウスモノクローナル抗体Ｃ４３と１ｍｇの牛血清アルブミを溶解した１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）１ｍｌに、１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）２００μｌ及び１００ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液２００μｌを加えて室温で撹拌しながら３時間反応した。さらに、２００ｍＭエチレングリコール水溶液２００μｌ及び２００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２００μｌを加え、室温で撹拌しながら１時間反応した。その後、１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）に対して４℃で一夜透析した。透析物の分子量分布をＨＰＬＣ（東ソー社製ゲル濾過カラムＧ３０００ＳＷＸＬとＧ６０００ＳＷＸＬを直列につなぎ、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎの１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）を移動相として用い、２８０ｎｍの吸光度を測定した。）で分析した結果を図１に示す。過ヨウ素酸法により結合体が形成されるとともに一部未反応の抗体及び牛血清アルブミンが含まれていることがわかる。
【００３７】
この透析物の一部を採取し、１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）で希釈して、抗体濃度０．５ｍｇ／ｍｌに調製し、水浴中で６０℃、３時間インキュベートし、非特異反応抑制のための結合体（粗製物）（非特異反応抑制剤）を得た。残りの透析物を１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）を溶出液として、ファルマシア社製セファロースＣＬ−６Ｂを充填したゲル濾過カラム（１．６ｃｍ×６０ｃｍ）により精製し、分子量３００，０００以上の画分を集め、限外濾過により抗体濃度が０．５ｍｇ／ｍｌになるまで濃縮した。濃縮液を水浴中で６０℃、３時間インキュベートし、非特異反応抑制のための結合体（精製物）（非特異反応抑制剤）を得た。
【００３８】
実施例３ 異反応性二価試薬による非特異反応抑制剤の製造
２ｍｇの牛血清アルブミンを溶解した１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）０．５ｍｌに０．５Ｍ Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレートのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液２０μｌを添加し、室温で攪拌しながら１時間反応した後、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に対して４℃で一夜透析し、マレイミド基を導入した牛血清アルブミンを調製した。抗ヒトＣＥＡマウスモノクローナル抗体Ｃ４３の完全抗体１０ｍｇを含む１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）２ｍｌにシグマ社製ペプシン０．２ｍｇを加え、３７℃で２０時間消化した。その後、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を溶出液として、ＩＢＦ社製ウルトロゲルＡｃＡ４４を充填したゲル濾過カラム（２．６ｃｍ×９０ｃｍ）によりＦ（ａｂ’）2 を分画し、限外濾過により濃縮した。抗ヒトＣＥＡマウスモノクローナル抗体Ｃ４３のＦ（ａｂ’）2 ２ｍｇを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）０．４５ｍｌに１００ｍＭ ２−メルカプトエタノールアミンと５ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を５０μｌ加えて、３７℃で９０分間反応し、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を溶出液として、ファルマシア社製セファデックスＧ−２５を充填したカラム（１．６ｃｍ×６０ｃｍ）によりＦａｂ’を回収した。マレイミド基を導入した牛血清アルブミンと回収したＦａｂ’を混合し、３０℃で９０分間反応し、さらに５０ｍＭのＮ−エチルマレイミド ２０μｌを添加して３０℃で３０分間反応した。その後、１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）を溶出液として、ウルトロゲルＡｃＡ４４を充填したゲル濾過カラム（１．６ｃｍ×７０ｃｍ）により精製し、分子量１００，０００以上の画分を集め、限外濾過により抗体濃度が０．５ｍｇ／ｍｌになるまで濃縮した。濃縮液を水浴中で６０℃、３時間インキュベートし、非特異反応抑制のための結合体（非特異反応抑制剤）を得た。
【００３９】
実施例４ 過ヨウ素酸法による非特異反応抑制剤の製造
５ｍｇの抗ヒトルイスＹ抗原マウスモノクローナル抗体Ｓ１１３（サブクラスＩｇＭ、純度９５％以上）と１ｍｇのヒドロキシプロピルセルロース（日本曹達製）を溶解した１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）１ｍｌに、１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）２００μｌ及び１００ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液２００μｌを加えて室温で撹拌しながら３時間反応した。さらに、２００ｍＭエチレングリコール水溶液２００μｌ及び２００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２００μｌを加え、室温で撹拌しながら１時間反応した後、１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）に対して４℃で一夜透析した。この透析物を１０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．２）で希釈して、抗体濃度０．５ｍｇ／ｍｌに調製し、水浴中で６０℃、２時間インキュベートし、非特異反応抑制のための結合体（非特異反応抑制剤）を得た。
【００４０】
実施例５ 酵素免疫測定法に基づいたヒト血清中のＣＥＡ測定キットの作製と検体の測定
（１）西洋ワサビペルオキシダーゼ標識Ｃ４３抗体（ＨＲＰ−Ｃ４３）
Ｃ４３抗体のＦａｂ’は実施例３と同様の方法により調製した。一方、東洋紡社製西洋ワサビペルオキシダーゼ１０ｍｇを１．５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１２５ｍＭ Ｎ−スクシンイミジル−４−マレイミドブチレートのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液１００μｌを加え、３０℃で６０分間撹拌しながら反応した。その後、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を溶出液として、セファデックスＧ−２５を充填したカラム（１．６ｃｍ×６０ｃｍ）によりマレイミド基を導入した西洋ワサビペルオキシダーゼを回収した。Ｆａｂ’とマレイミド基を導入した西洋ワサビペルオキシダーゼをモル比で１：１になるように混合し、４℃で２０時間反応した。反応液を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を溶出液として、ウルトロゲルＡｃＡ４４を充填したゲル濾過カラム（２．６ｃｍ×９０ｃｍ）で分画し、ＨＲＰ−Ｃ４３を得た。
【００４１】
（２）Ｃ３８抗体固相化ポリスチレンビーズ
抗ヒトＣＥＡマウスモノクローナル抗体Ｃ３８（サブクラス ＩｇＧ1 、κ、純度９５％以上）はＣ４３抗体とは異なるＣＥＡ上のエピトープを認識する。この抗体を１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）に２０μｇ／ｍｌの濃度で溶解してビーズコーティング液とした。積水化学社製６．２５ｍｍ径のポリスチレンビーズ１個あたり０．１５ｍｌの液量で、ビーズをコーティング液に浸け、４℃で２０時間放置した。その後、コーティング液を捨て、ビーズを生理食塩水で洗浄した後、０．５％の牛血清アルブミン、０．０２％のツイーン２０を含む５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）に浸けて、４℃に保存した。
【００４２】
（３）ヒト血清中ＣＥＡの測定キット
ヒト血清中のＣＥＡの測定キットの構成試薬は以下の通りである。
標準液：０〜５０ｎｇ／ｍｌのＣＥＡ標品を含む１％ウシ血清アルブミン、５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）
酵素標識抗体液：０．５μｇ／ｍｌのＨＲＰ−Ｃ４３を含む、０．５％牛血清アルブミン、０．５％マウス血清、０．０２％ツイーン２０、５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）
固相化抗体ビーズ：Ｃ３８抗体固相化ポリスチレンビーズ
発色液：３０％過酸化水素０．２μｌおよびベーリンガーマンハイム社製２、２’−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）０．４５ｍｇを含む１００ｍＭクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４．０） 反応停止液：５％シュウ酸溶液
洗浄液：生理食塩水
【００４３】
（４）ヒト血清中のＣＥＡの測定と非特異反応を示す検体の選択
プラスチック試験管に健常者の血清またはＣＥＡ標準液を２５μｌとり、酵素標識抗体液を１５０μｌ加え、さらに、固相化抗体ビーズを１個入れて、室温で２時間インキュベートした。ビーズを洗浄液で洗浄後、別のプラスチック試験管に移し、発色液３００μｌを加え、室温で３０分間インキュベートした。反応停止液２ｍｌを加えた後に波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。濃度既知の標準液の吸光度から標準曲線を作成し、健常者血清中のＣＥＡ濃度を求めた。多数の健常者検体を測定し、５０ｎｇ／ｍｌ以上に測定され、市販のＣＥＡ測定キット「ＣＥＡ「ロシュ」−ＥＩＡ（日本ロシュ社）」により５ｎｇ／ｍｌ以下に測定された検体Ｎｏ．１８８および検体Ｎｏ．３５７を非特異反応を示す検体として選択した。
【００４４】
（５）血清中ＣＥＡ測定における非特異反応抑制剤の効果
（３）のＣＥＡ測定キットの酵素標識抗体液に実施例１から実施例３で製造した非特異反応抑制剤を添加し、（４）と同様にして測定を行ない非特異反応の抑制効果を調べた。結果を表１に示す。本発明の非特異反応抑制剤が極めて有効であることが確認された。非特異反応の抑制効果は検体によって異なるが、抗体濃度として２０μｇ／ｍｌ程度添加すれば十分な効果が得られた。また、実施例２の粗製品と精製品の比較では、精製により抗体と牛血清アルブミンの結合物だけとした精製品の方が多少効果が大きいことが示された。しかし、粗製物であっても十分効果が期待できることがわかった。
【００４５】
【表１】
実施例６ 酵素免疫測定法によるヒト血清中ルイスＹ抗原測定キットの作製と検体の測定
（１）西洋ワサビペルオキシダーゼ標識Ｓ１１３抗体（ＨＲＰ−Ｓ１１３）
東洋紡社製西洋ワサビペルオキシダーゼ２ｍｇを０．５ｍｌの蒸留水に溶解し、５０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム０．１ｍｌを加えて攪拌しながら室温で３０分間反応した。さらに２００ｍＭエチレングリコール０．１ｍｌを加えて３０分間反応した。反応液を１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に対して４℃で一夜透析した。６ｍｇのＳ１１３抗体を２００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）１ｍｌに溶解し、透析物を加えて、室温で攪拌しながら３時間反応させた。２００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．１ｍｌ加え、室温で撹拌しながら１時間反応した。５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）を溶出液として、ファルマシア社製セファロースＣＬ−４Ｂを充填したゲル濾過カラム（２．６ｃｍ×９０ｃｍ）で分画し、ＨＲＰ−Ｓ１１３を得た。
【００４７】
（２）Ｓ１１３抗体固相化ポリスチレンビーズ
Ｓ１１３抗体を１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）に２０μｇ／ｍｌの濃度で溶解してビーズコーティング液とした。積水化学社製６．２５ｍｍ径のポリスチレンビーズ１個あたり０．１５ｍｌの液量で、ビーズをコーティング液に浸け、４℃で２０時間放置した。その後、コーティング液を捨て、ビーズを生理食塩水で洗浄した後、０．５％の牛血清アルブミン、０．０２％のツイーン２０を含む５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）に浸けて、４℃に保存した。
【００４８】
（３）ヒト血清中ルイスＹ抗原の測定キット
標準液：ルイスＹ抗原を高濃度に有する癌患者の血清に任意の単位を設定し、１％ウシ血清アルブミン、５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）で希釈して標準液とした。
緩衝液：０．５％牛血清アルブミン、０．５％マウス血清、０．０２％ツイーン２０、５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）
酵素標識抗体液：１μｇ／ｍｌのＨＲＰ−Ｓ１１３を含む、０．５％牛血清アルブミン、０．５％マウス血清、０．０２％ツイーン２０、５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）
固相化抗体ビーズ：Ｓ１１３抗体固相化ポリスチレンビーズ
発色液：３０％過酸化水素０．２μｌおよびベーリンガーマンハイム社製２，２’−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）０．４５ｍｇを含む１００ｍＭクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４．０）
反応停止液：５％シュウ酸溶液
洗浄液：生理食塩水
【００４９】
（４）ヒト血清中のルイスＹ抗原の測定と非特異反応を示す検体の選択
プラスチック試験管に健常者の血清および標準液を２５μｌとり、緩衝液１５０μｌを加え、さらに、抗体固相化ビーズを１個入れて、３７℃で２時間インキュベートした（第一免疫反応）。抗体固相化ビーズを洗浄液で洗浄した後、酵素標識抗体液を２００μｌ入れて、３７℃で１時間インキュベートした。（第二免疫反応）。抗体固相化ビーズを洗浄液で洗浄後、別のプラスチック試験管に移し、発色液３００μｌを加え、室温で３０分間インキュベートした。反応停止液２ｍｌを加えた後に波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。標準液の吸光度から標準曲線を作成し、健常者血清中のルイスＹ抗原濃度を求めた。健常者の血清のほとんどは低い値を示したがまれに高い値を示す検体があった。非常に高い値を示した健常者の検体Ｎｏ．２１４の希釈試験を行ったところ、血清中のルイスＹ抗原濃度は希釈により急激に低下し、健常者の抗原濃度レベルになったので非特異反応を示す検体であることがわかった。また、この検体を６０℃で１時間加熱すると健常者の抗原濃度レベルを示すようになった。
【００５０】
（５）血清中ルイスＹ抗原測定における非特異反応抑制剤の効果
（３）のルイスＹ測定キットの緩衝液に実施例４で製造した非特異反応抑制剤を添加し、（４）と同様にして測定を行い非特異反応の抑制効果を調べた。結果を表２に示す。本発明の非特異反応抑制剤が極めて有効であることが確認された。
【００５１】
【表２】
実施例７ 放射免疫測定法に基づいたヒト血清中のルイスＹ抗原測定キットの作製と検体の測定
（１） 125Ｉ標識Ｓ１１３抗体（ 125Ｉ−Ｓ１１３）
２ｍｇ／ｍｌのＳ１１３抗体を溶解した５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）５０μｌに１％グルコース水溶液２５μｌおよび０．２５ｍＣｉのＮＥＮ社製Ｎａ 125Ｉを溶解した５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）２５μｌを加え、さらに、バイオラッド社製エンザイモビーズ懸濁液２５μｌを加えて室温で３０分間反応した。１％重亜硫酸ナトリウム水溶液２５μｌを加えて反応を停止し、０．５％牛血清アルブミン、５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）で平衡化したファルマシア社製ＰＤ−１０カラムで 125Ｉ−Ｓ１１３を分画した。
【００５３】
（２）ヒト血清中ルイスＹ抗原の測定キット
標準液、緩衝液、固相化抗体ビーズ、洗浄液は実施例６のキットと同一のものを用いた。
標識抗体液：０．１μｇ／ｍｌの 125Ｉ−Ｓ１１３を含む、０．５％牛血清アルブミン、０．５％マウス血清、０．０２％ツイーン２０、５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）
【００５４】
（３）ヒト血清中のルイスＹ抗原の測定
プラスチック試験管に標準液および血清（検体Ｎｏ．２１４）を２５μｌとり、緩衝液１５０μｌを加え、さらに、抗体固相化ビーズを１個入れて、３７℃で２時間インキュベートした（第一免疫反応）。抗体固相化ビーズを洗浄液で洗浄した後、標識抗体液を２００μｌ入れて、３７℃で１時間インキュベートした（第二免疫反応）。ビーズを生理食塩水で洗浄後、別のプラスチック試験管に移し、パッカード社製ガンマカウンターで放射活性を測定した。
【００５５】
（４）放射免疫測定法における血清中ルイスＹ抗原測定における非特異反応抑制剤の効果
（２）のルイスＹ測定キットの緩衝液に実施例４で製造した非特異反応抑制剤を添加し、（３）と同様にして測定を行い非特異反応の抑制効果を調べた。結果を表３に示す。本発明の非特異反応抑制剤が極めて有効であることが確認された。
【００５６】
【表３】
【発明の効果】
本発明によれば、免疫測定法において非特異反応を排除できるため、偽陽性の削減および特異性の向上が達成され、信頼性の高い臨床検査が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】過ヨウ素酸法によるＣ４３抗体とウシ血清アルブミン反応物のゲル濾過分析結果。横軸は溶出時間、縦軸は２８０ｎｍの吸光度を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a nonspecific reaction inhibitor for suppressing a nonspecific reaction that hinders accurate detection and quantification of a trace amount of substance used in an immunoassay using a labeled antibody, and a nonspecific reaction suppression method using the same And an immunoassay kit containing the same.
[0002]
[Prior art]
Immunoassays using antigen-antibody reactions are widely used in clinical tests because they can specifically detect or accurately measure trace components. Types of immunoassay include one-way radioimmuno-diffusion, nephelometry, nephelometry, agglutination (method using blood cells and latex as a carrier), radioimmunoassay, enzyme immunoassay, fluorescence immunoassay, etc. However, radioimmunoassay, enzyme immunoassay, and fluorescence immunoassay have high measurement sensitivity, and are particularly frequently used for detection or quantification of trace components.
[0003]
Radioimmunoassay, enzyme immunoassay, and fluorescence immunoassay are methods using labeled antibodies in which radioactive substances, enzymes, and fluorescent substances are bound to antibodies, respectively. Generally, antibodies and antigens bound to insoluble carriers are immobilized. Used in solid phase methods in combination with phased antibodies or immobilized antigens. The solid phase method includes a sandwich method in which a “solid phase antibody-antigen-labeled antibody” complex is prepared and measured, or a fixed amount of labeled antibody in which the solid phase antigen and the free antigen in the sample are added to the reaction system. There is a competition method based on the principle of reacting competitively with respect to.
[0004]
By the way, in these immunoassay methods, it is often recognized that the reliability of measurement values is impaired by non-specific reactions other than the specific target specific antigen-antibody reaction. This phenomenon is caused when components other than the antigen contained in the specimen react with the labeled antibody.
[0005]
Non-specific reactions have been observed even in measurement systems using monoclonal antibodies, and even if monoclonal antibodies with excellent specificity can be obtained, the performance is still in the stage where they are used in the actual measurement system. It is a big problem that we cannot make full use of it.
[0006]
Conventionally, various attempts have been made to suppress non-specific reactions and obtain correct measurement values. For example, the sample to be measured is generally pretreated by heating or with an appropriate reagent, or various animal sera, immunoglobulin fractions, albumin, skim milk, gelatin, surfactants, etc. are added to the measurement system. I came. In order to avoid a nonspecific reaction caused by binding to the Fc site of an antibody, such as rheumatoid factor, Fab and F (ab ′) 2 Such antibody fragments are also used for specific reactions. In addition, a monoclonal antibody that has a different reaction specificity from the monoclonal antibody used in the measurement system and does not inhibit the reaction related to the measurement system is also added to the measurement system.
[0007]
JP-A-1-254869 proposes the use of an aggregate that is non-specific to the measurement target and is derived from a monoclonal or polyclonal antibody. The aggregate may be a homopolymer of the antibody or a heteropolymer of an antibody fragment or a protein such as albumin or a polysaccharide macromolecule such as dextran.
[0008]
In Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-152999, the specific activity of the original antibody prepared by heat-treating the monoclonal antibody used for the specific reaction has been lost in order to suppress the nonspecific reaction. Monoclonal antibody-derived substances that retain inhibitory activity are disclosed.
[0009]
However, although these methods have a certain effect on the suppression of non-specific reactions, the effects are still insufficient for some specimens and are not always satisfactory in practice.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
In view of this situation, non-specific reactions to achieve accurate detection and quantification of trace components in a sample are easily and effectively suppressed in immunoassays using labeled antibodies. It is an object of the present invention to provide inhibitors and methods of use thereof.
Another object of the present invention is to provide a measurement kit containing a useful nonspecific reaction inhibitor for preventing nonspecific reactions.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies on non-specific reactions in order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have reached the present invention. That is, the present invention
(1) A non-specific reaction inhibitor used in an immunoassay method using a labeled antibody, comprising a conjugate obtained using a complete antibody and / or an antibody fragment of the same antibody as the antibody used for the labeled antibody, A nonspecific reaction inhibitor that completely or substantially loses the original specific reaction activity of the antibody but substantially retains the nonspecific reaction inhibitory activity,
(2) The nonspecific reaction inhibitor according to (1) above, wherein the conjugate is produced by covalent bonding,
(3) The above-mentioned (1), (2), wherein the conjugate is obtained by using a complete antibody and / or antibody fragment of the same antibody as the antibody used for the labeled antibody and other macromolecular substance The nonspecific reaction inhibitor according to any one of
(4) The nonspecific reaction inhibitor according to any one of (1) to (3), wherein the antibody is a monoclonal antibody,
(5) The nonspecific reaction inhibitor according to any one of (1) to (4), wherein the specific reaction activity inherent to the antibody is lost by heat treatment, decomposition treatment, or a combination thereof,
(6) Nonspecific reaction suppression characterized by using the nonspecific reaction inhibitor described in any one of (1) to (5) above when immunoassay of antigen in a specimen using a labeled antibody Method,
(7) The nonspecific reaction suppression method according to (6) above, wherein a reaction is performed between the specimen and the nonspecific reaction inhibitor before performing the specific immune reaction step.
(8) The nonspecific reaction suppression method according to (6) above, wherein a specific immune reaction step for measuring a sample is performed in the presence of a nonspecific reaction inhibitor,
(9) The immunoassay is a sandwich method, and one or more specific immune reaction steps are performed in the presence of a non-specific reaction inhibitor, and the non-description according to (6) above Specific reaction suppression method,
(10) An immunoassay kit comprising a labeled antibody and the nonspecific reaction inhibitor according to any one of (1) to (5) above,
About.
[0012]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, the labeled antibody is typically an antibody bound to a substance that gives a signal that can be quantified by some means such as an enzyme, a radioactive substance, or a fluorescent substance, and is soluble in an antigen-antibody reaction solution. Even if the substance that emits the signal is not directly bound to the antibody, it has the ability to form a complex compound with a biotin-conjugated antibody or a metal ion having radioactivity or fluorescence activity to bind the avidin-enzyme complex. Also included are soluble antibodies bound to a compound.
[0013]
The immunoassay method using these labeled antibodies may be a solid phase method or a liquid phase method. The solid phase method includes a sandwich method such as a forward sandwich method, a reverse sandwich method, a one-step sandwich method, and a competitive method. In the liquid phase method, an antigen-antibody reaction is performed using an enzyme-labeled antibody as disclosed in JP-B-7-72731, and the amount of antigen is determined by a change in enzyme activity resulting from the association of the labeled antibody and the antigen. Measurement methods to be measured are included. In addition, even if the labeling substance is not directly bound to the antibody, the measurement method in which the labeling substance is bound in the reaction step subsequent to the antigen-antibody reaction, for example, after the immunoreaction step by the sandwich method using a biotinylated antibody, A measurement method in which an avidin-enzyme complex is reacted is also included.
[0014]
The non-specific reaction inhibitor in the present invention is produced from a complete antibody and / or antibody fragment (hereinafter referred to as “antibody (fragment) of the same antibody”) of the same antibody as that used for the labeled antibody. The antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and an antibody derived from virtually any animal species that produces the antibody, such as rabbits, goats, sheep, pigs, horses, mice or rats, can be used. .
[0015]
The antibody used for the labeled antibody may be a complete antibody or F (ab ′) cleaved by enzymatic treatment or chemical treatment. 2 The antibody form used in the production of the non-specific reaction inhibitor of the present invention is the same as that used for the labeled antibody if the antibody is the same as the labeled antibody. It need not be in the form of The form is not particularly limited, and may be an Fc fragment having no specific binding site. In consideration of the fact that a non-specific reaction occurs when a substance other than the measurement target present in the sample reacts with the labeled antibody, the antibody (fragment) of the same antibody including the antibody fragment site used for the labeled antibody is used. Is preferred.
[0016]
The antibody fragment can be prepared, for example, by digestion with an enzyme such as papain, pepsin, or trypsin, cleavage of the SS bond with a reducing agent, or a known method combining these. For example, digestion of a complete antibody with papain can cleave into Fab and Fc fragments. F (ab ') if digested with pepsin 2 Fragments are obtained, and further reduced with 2-mercaptoethylamine yields Fab ′ fragments. A complete antibody can be cleaved into L and H chains by reducing with dithiothreitol or 2-mercaptoethanol and then treating with an SH reagent such as iodoacetamide.
[0017]
The nonspecific reaction inhibitor in the present invention may be a single antibody (fragment) conjugate of the same antibody or a conjugate with another polymer substance. In the case of a single antibody (fragment) conjugate of the same antibody, it may be a conjugate of a complete antibody alone or an antibody fragment alone, or a conjugate of a mixture thereof. Other high molecular substances used together with antibodies (fragments) of the same antibody to produce conjugates include polyclonal antibodies or monoclonal antibodies other than those used for labeled antibodies, proteins such as albumin and gelatin, dextran, aminodextran , Synthetic polymers such as polysaccharides such as hydroxypropylcellulose and hydroxyethylcellulose or derivatives thereof, and polyalkylene glycol derivatives whose ends are modified with amino groups. Preferable other high molecular substances include polyclonal antibodies or monoclonal antibodies other than the antibody used for the labeled antibody, albumin, hydroxypropylcellulose, and the like. The molecular weight of the other polymer substance is preferably in the range of 1,000 to 1,000,000, particularly preferably in the range of 10,000 to 300,000.
[0018]
An antibody (fragment) of the same antibody alone, or together with other high molecular substances such as proteins, polysaccharides, or synthetic high molecular substances, through an organic chemical method or an interaction based on biological affinity. Thus, a conjugate can be produced by a method known from the literature.
[0019]
In the organic chemical method, for example, a conjugate can be produced by covalent bonding using a crosslinking reagent. Examples of the main crosslinking reagent include carbodiimide, isocyanate, diazo compound, benzoquinone, glutaraldehyde, periodic acid, N-hydroxysuccinimide ester compound, maleimide compound, pyridyl disulfide compound and the like. The production of conjugates using these cross-linking reagents can be performed, for example, by the same method as the method of binding an enzyme and an antibody with an enzyme-labeled antibody. (1987) 75-126] and P.I. Reference may be made to the method for producing an enzyme-labeled antibody described in detail in Tijsssen's “Enzyme Immunoassay (Biochemical Experimental Method 11, Tokyo Kagaku Dojin, 1989) 196-251”. Many of these reagents utilize amino groups and thiol groups of antibodies and high-molecular substances used with antibodies. As a method of using the thiol group of the antibody, the antibody is fragmented to Fab ′ by enzyme and reduction treatment to use the thiol group in the hinge part of the antibody, or S-acetylmercaptosuccinic anhydride, methyl-4- Examples thereof include a method of introducing a thiol group with mercaptobutyrimidate, N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate, and the like. In addition, as a cross-linking reagent, use mainly those with two functional groups,
There are the same reactive divalent reagent having two identical functional groups and the different reactive divalent reagent having different functional groups.
[0020]
Several examples of methods for producing a conjugate by covalent bonding will be described. The glutaraldehyde method is a method in which glutaraldehyde has two aldehyde groups, and thus reacts with an antibody (fragment) of the same antibody or an amino group of another polymer substance to cause crosslinking. Periodic acid method is the same antibody antibody (fragment) or amino group of other high molecular substances as the aldehyde group formed by oxidizing the sugar chain of the same antibody antibody (fragment) or other high molecular substances with periodic acid. It is the method of bridge | crosslinking by reaction of these. In a method using a crosslinking reagent having two maleimide groups, such as N, N′-o-phenylene dimaleimide, N, N′-p-phenylene dimaleimide and N, N′-oxydimethylene dimaleimide, crosslinking is performed with a thiol group. Is done. The same reactive divalent reagent such as bis-succinic acid N-hydroxysuccinimide ester is crosslinked via an amino group. N-succinimidyl-2-maleimide acetate, N-succinimidyl-4-maleimidobutyrate, N-succinimidyl-6-maleimidohexanoate, N-succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxylate, N-sulfosuccinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxylate, N-sulfosuccinimidyl-3-maleimidobenzoate, N-sulfosuccinimidyl-4-maleimidobenzoate, N-hydroxysuccinimide ester of maleimide derivatives such as N-succinimidyl-4- (N-maleimidophenyl) -4-butyrate is a direactive reagent, and is an antibody (fragment) of the same antibody or amino acid of other high molecular substances. Cross-linking via a thiol group To. N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate is also used to crosslink amino groups and thiol groups.
[0021]
As an example of a method for producing a conjugate utilizing biological affinity, there is a method utilizing binding between avidin and biotin. For example, by introducing a biotin molecule into both an antibody (fragment) of the same antibody and another macromolecular substance such as albumin and crosslinking with avidin, or by introducing avidin into one of both and introducing biotin into the other There is a method of crosslinking. Biotinyl- [epsilon] -aminocaproic acid-N-hydroxysuccinimid ester or the like is used as a reagent for introducing a biotin molecule.
[0022]
The conjugate produced by the above method generally has a fairly broad molecular weight distribution. As the molecular weight of the conjugate increases, the nonspecific reaction suppressing effect increases. However, when the molecular weight further increases, precipitation occurs and insolubilization occurs, and the nonspecific reaction suppressing effect decreases conversely. It is desirable that the molecular weight of the conjugate is in a range that retains solubility. The conjugate may be a mixture having different molecular weights, but can be used after separating by a known method such as gel filtration, ultrafiltration or centrifugation to obtain a desired molecular weight. The average molecular weight of the conjugate (nonspecific reaction inhibitor) is preferably 100,000 or more, particularly preferably in the range of 300,000 to 40 million. In addition, when the conjugate is obtained using an antibody (fragment) of the same antibody and another polymer substance, the usage ratio of the antibody (fragment) of the same antibody and the other polymer substance is a molar ratio. A range of 1: 0.01 to 100 is preferable, and a range of 1: 0.1 to 10 is particularly preferable.
[0023]
The specific activity of the antibody (fragment) of the same antibody can be lost by a known method such as heat treatment, enzymatic decomposition treatment, chemical treatment with acid / alkali or reducing agent, ultrasonic treatment, and the like. Moreover, it is also possible to carry out by combining these methods. The treatment for losing the specific activity of the antibody (fragment) of the same antibody may be performed at the stage of the antibody (fragment) of the same antibody before the conjugate is manufactured, or may be processed after the conjugate is made. Good.
[0024]
Here, “substantially loss of the specific reaction activity inherent in the antibody” means that the specific reaction activity has been lost to the extent that there is no problem judging from the accuracy and reliability of the measurement. is there. If an excessively strong treatment is performed in order to completely lose the specific reaction activity, the non-specific reaction suppression activity may be lost, so the treatment conditions are appropriately selected and the specific reaction activity is substantially lost. However, the nonspecific reaction inhibitory activity needs to be treated under mild conditions that can be maintained.
[0025]
As an example of this treatment method, a heat treatment method which is one of the simplest methods will be described. In this case, the antibody (fragment) or conjugate of the same antibody is dissolved in an appropriate buffer in the range of
[0026]
As a method for using the non-specific reaction inhibitor of the present invention, the non-specific reaction inhibitor and the sample are contacted in advance in an appropriate buffer before the specific immune reaction step performed in the immunoassay using a labeled antibody, There is a method of incubating for an appropriate time (for example, 1 minute to 2 hours). During this time, a substance that causes a nonspecific reaction (nonspecific reaction substance) in the sample reacts with the nonspecific reaction inhibitor, and the nonspecific reaction activity with the labeled antibody in the specific immune reaction step is lost. In the specific immune reaction step, a mixed solution of the sample that has been incubated and the nonspecific reaction inhibitor may be used as it is.
[0027]
A simpler method of using the nonspecific reaction inhibitor of the present invention is a method in which a specific immune reaction step is performed in the presence of a nonspecific reaction inhibitor. For example, in the case of the most commonly used positive sandwich method, a nonspecific reaction inhibitor is simply added to the buffer of the first immune reaction step in which the immobilized antibody and the antigen in the sample are reacted. The desired effect can be obtained without requiring any special process. This is because the non-specific reaction is detected because the “immobilized antibody-non-specific reactant-labeled antibody” sandwich complex is formed without going through the specific reaction site of the antibody. This is because the reaction activity of the nonspecific reaction substance to the labeled antibody is absorbed by the nonspecific reaction inhibitor during the reaction. Furthermore, if it is also added to the buffer solution of the second immune reaction step in which the antigen immobilized through the specific reaction site of the antibody reacts with the labeled antibody, non-specificity that was not completely absorbed in the first immune reaction step Since the reactant is also absorbed, the measurement reliability can be further enhanced. Usually, a sufficient effect can be obtained if it is added to the buffer solution of the first immune reaction step.
[0028]
Also in the one-step sandwich method, non-specific reaction can be avoided by adding a non-specific reaction inhibitor to the buffer of the immune reaction process and causing the reaction. Since the nonspecific reaction inhibitor of the present invention is a conjugate, the binding force with a substance that causes a nonspecific reaction is higher than that of a labeled antibody. In addition, if an excessive amount is added compared to the labeled antibody, a substance that causes a non-specific reaction preferentially reacts with the non-specific reaction inhibitor, so that the non-specific reaction is avoided.
[0029]
The nonspecific reaction inhibitor of the present invention is used by adding it to an appropriate buffer in advance before the immune reaction step, or by adding it to a buffer solution for the immune reaction step. The concentration of the non-specific reaction inhibitor in the system for reacting with the non-specific reactant is preferably 0.1 to 200 μg / ml, more preferably 1 to 50 μg / ml. The buffer used may be a known appropriate buffer used for normal immune reactions. Further, it can be used together with an auxiliary agent usually added to the buffer, for example, a reaction accelerator, a detergent or a stabilizer. Furthermore, it can also be used with another nonspecific reaction inhibitor. As a suitable buffer, for example, phosphate buffer 20-100 mM pH 6-8 or Tris-hydrochloric acid 50 mM / NaCl 100 mM pH 7-8 can be used. Examples of the reaction accelerator include dextran sulfate or polyethylene glycol, examples of the detergent include Triton X-100 and Tween 20, and examples of the stabilizer include proteins such as albumin, skim milk, and gelatin, sodium azide, thimerosal, and caisson CG. And other preservatives.
[0030]
Another object of the present invention relates to a measurement kit containing a labeled antibody and the nonspecific reaction inhibitor of the present invention, which is used for an immunoassay using a labeled antibody. In general, a measurement kit consists of reagents such as labeled antibody solution, immobilized antibody, and standard substance, and if necessary, a buffer solution for reacting the sample with the immobilized antibody by the sandwich method, and color development for enzyme reaction. It includes a liquid, a reaction stop liquid, a cleaning liquid for cleaning the solid phase, a specimen pretreatment agent, and the like. When these constituent reagents are lyophilized products, a solution for restoration may be attached.
[0031]
The non-specific reaction inhibitor of the present invention may be used alone as a component reagent of a kit, or may be a component of another component reagent. However, it is preferable to add it as one component of the constituent reagent in consideration of the effect of suppressing the nonspecific reaction without increasing the measurement operation. Usually, the non-specific reaction inhibitor of the present invention is added to a buffer solution or labeled antibody for reacting a specimen with a solid-phased antibody to form a component reagent of the kit. When these constituent reagents are freeze-dried products, they can be added to the reconstitution liquid. The nonspecific reaction inhibitor is preferably used in an amount of 0.1 to 1000 times by weight, particularly preferably 1 to 100 times by weight, with respect to the labeled antibody.
[0032]
In the case of a kit based on the solid phase method, the type and shape of the solid phase are not limited. It may be one used for a known conventional immunoassay kit. Examples of solid phases include plastic test tubes, polystyrene beads, polystyrene particles, polystyrene microplates, polyethylene terephthalate microplates, polyvinyl chloride microplates, magnetic particles, glass beads, cellulose particles, nitrocellulose membranes, cellulose filter paper, nylon membranes, etc. Is mentioned. It is also possible to use a test piece of a simple measurement kit based on the principle of immunochromatography.
[0033]
Examples of the specimen used in the immunoassay using the nonspecific reaction inhibitor of the present invention include body fluids such as serum, plasma, spinal fluid, saliva, urine, fecal extract, etc. Substances used for clinical examination, for example, human immunoglobulin, human albumin, human fibrinogen, β2-microglobulin, ferritin, C-reactive protein, α-fetoprotein, carcinoembryonic antigen, CA19-9, contained in body fluids , Basic fetoprotein, tissue polypeptide antigen, immunosuppressive acidic protein, CA-50, pancreatic carcinoembryonic antigen, sialyl Le X -I antigen, SCC antigen, CA15-3, CA72-4, sialyl Tn, CA125, NCC-ST-439, gamma-seminoprotein, prostate specific antigen, neuron specific enolase, hepatitis virus antigen, human chorionic gonadotropin, human Examples include placental lactogen, insulin, and the like.
[0034]
【Example】
EXAMPLES Next, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0035]
Example 1 Production of a non-specific reaction inhibitor using the same reactive divalent reagent
Anti-human CEA mouse monoclonal antibody C43 (subclass IgG 1 , Λ, purity 95% or more) dissolved in 2.5 mg / ml of 10 mM phosphate physiological saline (pH 7.2), 10 μl of 2.5% glutaraldehyde aqueous solution was added and stirred at room temperature for 3 hours. Reacted. Furthermore, 0.1 ml of 0.2M L-lysine hydrochloride aqueous solution was added, reacted for 1 hour with stirring at room temperature, and dialyzed overnight at 4 ° C. against 10 mM phosphate physiological saline (pH 7.2). Thereafter, it is diluted with 10 mM phosphate physiological saline (pH 7.2) to prepare an antibody concentration of 0.5 mg / ml, incubated at 60 ° C. for 3 hours in a water bath, and a conjugate (non-specific) for suppressing nonspecific reaction. Specific reaction inhibitor) was obtained.
[0036]
Example 2 Production of a non-specific reaction inhibitor by the periodic acid method
In 1 ml of 10 mM phosphate physiological saline (pH 7.2) in which 5 mg of anti-human CEA mouse monoclonal antibody C43 and 1 mg of bovine serum albumin are dissolved, 200 μl of 1M sodium carbonate buffer (pH 9.5) and 100 mM sodium periodate aqueous solution 200 μl was added and reacted at room temperature with stirring for 3 hours. Furthermore, 200 μl of 200 mM ethylene glycol aqueous solution and 200 μl of 200 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 8.5) were added and reacted at room temperature for 1 hour with stirring. Then, it dialyzed overnight at 4 degreeC with respect to 10 mM phosphate physiological saline (pH 7.2). The molecular weight distribution of the dialysate was measured by HPLC (Tosoh gel filtration columns G3000SWXL and G6000SWXL were connected in series, and 10 mM phosphoric saline (pH 7.2) with a flow rate of 0.5 ml / min was used as the mobile phase. The result of analysis in (Measured) is shown in FIG. It can be seen that a conjugate is formed by the periodic acid method and partially unreacted antibody and bovine serum albumin are contained.
[0037]
A portion of this dialyzate was collected, diluted with 10 mM phosphate physiological saline (pH 7.2) to prepare an antibody concentration of 0.5 mg / ml, incubated in a water bath at 60 ° C. for 3 hours, and nonspecific A conjugate (crude product) (nonspecific reaction inhibitor) for reaction inhibition was obtained. The remaining dialyzate was purified with a gel filtration column (1.6 cm × 60 cm) packed with Sepharose CL-6B manufactured by Pharmacia, using 10 mM phosphate physiological saline (pH 7.2) as an eluent, and the molecular weight was 300,000 or more. These fractions were collected and concentrated by ultrafiltration until the antibody concentration reached 0.5 mg / ml. The concentrated solution was incubated at 60 ° C. for 3 hours in a water bath to obtain a conjugate (purified product) (non-specific reaction inhibitor) for suppressing non-specific reaction.
[0038]
Example 3 Production of a non-specific reaction inhibitor using a heteroreactive divalent reagent
N, N- of 0.5M N-succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxylate in 0.5 ml of 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.2) in which 2 mg of bovine serum albumin is dissolved After adding 20 μl of dimethylformamide solution and reacting for 1 hour with stirring at room temperature, dialyzed overnight at 4 ° C. against 100 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) to prepare bovine serum albumin introduced with maleimide group did. 0.2 mg of pepsin manufactured by Sigma was added to 2 ml of 100 mM NaCl and 100 mM acetate buffer (pH 4.5) containing 10 mg of the complete antibody of anti-human CEA mouse monoclonal antibody C43, and digested at 37 ° C. for 20 hours. Thereafter, F (ab ′) was applied to a gel filtration column (2.6 cm × 90 cm) packed with Ultrogel AcA44 manufactured by IBF using 100 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) as an eluent. 2 Were fractionated and concentrated by ultrafiltration. F (ab ′) of anti-human CEA mouse monoclonal antibody C43 2 50 μl of 100 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) containing 100 mM 2-mercaptoethanolamine and 5 mM EDTA was added to 0.45 ml of 100 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) containing 2 mg, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 90 minutes. The reaction was carried out, and Fab ′ was collected with a column (1.6 cm × 60 cm) packed with Sephadex G-25 manufactured by Pharmacia, using 100 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) containing 5 mM EDTA as an eluent. Bovine serum albumin having a maleimide group introduced therein and the recovered Fab ′ were mixed and reacted at 30 ° C. for 90 minutes, and further 20 μl of 50 mM N-ethylmaleimide was added and reacted at 30 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 10 mM phosphate physiological saline (pH 7.2) was used as an eluent and purified by a gel filtration column (1.6 cm × 70 cm) packed with Ultrogel AcA44, and fractions having a molecular weight of 100,000 or more were collected. The antibody concentration was concentrated to 0.5 mg / ml by filtration. The concentrated solution was incubated in a water bath at 60 ° C. for 3 hours to obtain a conjugate (nonspecific reaction inhibitor) for suppressing nonspecific reaction.
[0039]
Example 4 Production of non-specific reaction inhibitor by the periodic acid method
1 M sodium carbonate in 1 ml of 10 mM phosphate physiological saline (pH 7.2) in which 5 mg of anti-human Lewis Y antigen mouse monoclonal antibody S113 (subclass IgM, purity of 95% or more) and 1 mg of hydroxypropylcellulose (Nihon Soda) were dissolved A buffer solution (pH 9.5) (200 μl) and a 100 mM sodium periodate aqueous solution (200 μl) were added and reacted at room temperature with stirring for 3 hours. Furthermore, 200 μl of 200 mM ethylene glycol aqueous solution and 200 μl of 200 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) were added, reacted for 1 hour with stirring at room temperature, and then 4 ° C. against 10 mM phosphate physiological saline (pH 7.2). Dialyzed overnight. This dialyzed product was diluted with 10 mM phosphate physiological saline (pH 7.2) to prepare an antibody concentration of 0.5 mg / ml, incubated in a water bath at 60 ° C. for 2 hours, and bound to suppress nonspecific reaction. The body (nonspecific reaction inhibitor) was obtained.
[0040]
Example 5 Preparation of CEA measurement kit in human serum based on enzyme immunoassay and measurement of specimen
(1) Horseradish peroxidase-labeled C43 antibody (HRP-C43)
Fab ′ of C43 antibody was prepared in the same manner as in Example 3. On the other hand, 10 mg horseradish peroxidase manufactured by Toyobo Co., Ltd. was dissolved in 1.5 ml of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0), and 100 μl of a 125 mM N-succinimidyl-4-maleimidobutyrate N, N-dimethylformamide solution was added. The reaction was carried out at 30 ° C. with stirring for 60 minutes. Thereafter, horseradish peroxidase having a maleimide group introduced therein was recovered with a column (1.6 cm × 60 cm) packed with Sephadex G-25 using 100 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) as an eluent. Fab ′ and horseradish peroxidase into which a maleimide group was introduced were mixed at a molar ratio of 1: 1 and reacted at 4 ° C. for 20 hours. The reaction solution was fractionated with a gel filtration column (2.6 cm × 90 cm) packed with Ultrogel AcA44 using 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) as an eluent to obtain HRP-C43.
[0041]
(2) C38 antibody-immobilized polystyrene beads
Anti-human CEA mouse monoclonal antibody C38 (subclass IgG 1 , Κ, purity 95% or higher) recognizes a different epitope on CEA than the C43 antibody. This antibody was dissolved in 100 mM carbonate buffer (pH 9.5) at a concentration of 20 μg / ml to prepare a bead coating solution. The beads were immersed in the coating solution in an amount of 0.15 ml per 6.25 mm diameter polystyrene beads manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd., and left at 4 ° C. for 20 hours. Thereafter, the coating solution is discarded, the beads are washed with physiological saline, and then immersed in 50 mM phosphate physiological saline (pH 7.4) containing 0.5% bovine serum albumin and 0.02% Tween 20. Stored at 4 ° C.
[0042]
(3) Kit for measuring CEA in human serum
The components of the kit for measuring CEA in human serum are as follows.
Standard solution: 1% bovine serum albumin containing 50 to 50 ng / ml CEA preparation, 50 mM phosphate physiological saline (pH 7.4)
Enzyme-labeled antibody solution: 0.5% bovine serum albumin, 0.5% mouse serum, 0.02% Tween 20, 50 mM phosphate physiological saline (pH 7.4) containing 0.5 μg / ml of HRP-C43
Immobilized antibody beads: C38 antibody-immobilized polystyrene beads
Coloring solution: 100 mM citrate phosphate buffer (
Cleaning fluid: physiological saline
[0043]
(4) CEA measurement in human serum and selection of specimen showing non-specific reaction
25 μl of healthy human serum or CEA standard solution was taken into a plastic test tube, 150 μl of enzyme-labeled antibody solution was added, and one immobilized antibody bead was added, followed by incubation at room temperature for 2 hours. The beads were washed with a washing solution, then transferred to another plastic test tube, added with 300 μl of a coloring solution, and incubated at room temperature for 30 minutes. After adding 2 ml of the reaction stop solution, the absorbance at a wavelength of 405 nm was measured. A standard curve was prepared from the absorbance of a standard solution with a known concentration, and the CEA concentration in the serum of a healthy subject was determined. A number of healthy specimens were measured and measured to 50 ng / ml or more, and specimen No. 5 was measured to 5 ng / ml or less with a commercially available CEA measurement kit “CEA“ Roche ”-EIA (Japan Roche)”. 188 and specimen no. 357 was selected as a sample showing non-specific reaction.
[0044]
(5) Effect of non-specific reaction inhibitor on serum CEA measurement
Add the non-specific reaction inhibitor produced in Example 1 to Example 3 to the enzyme-labeled antibody solution of the CEA measurement kit in (3), and measure in the same manner as in (4) to examine the inhibitory effect on non-specific reaction It was. The results are shown in Table 1. It was confirmed that the nonspecific reaction inhibitor of the present invention is extremely effective. Although the inhibitory effect of the non-specific reaction varies depending on the specimen, a sufficient effect was obtained by adding about 20 μg / ml as the antibody concentration. In addition, the comparison between the crude product and the purified product in Example 2 showed that the purified product made only by the conjugate of antibody and bovine serum albumin was more effective than the purified product. However, it was found that sufficient effects can be expected even with crude products.
[0045]
[Table 1]
Example 6 Preparation of Lewis Y antigen measurement kit in human serum by enzyme immunoassay and measurement of specimen
(1) Horseradish peroxidase-labeled S113 antibody (HRP-S113)
2 mg of horseradish peroxidase manufactured by Toyobo Co., Ltd. was dissolved in 0.5 ml of distilled water, and 0.1 ml of 50 mM sodium periodate was added and reacted at room temperature for 30 minutes with stirring. Further, 0.1 ml of 200 mM ethylene glycol was added and reacted for 30 minutes. The reaction solution was dialyzed overnight at 4 ° C. against 1 mM acetate buffer (pH 4.5). 6 mg of S113 antibody was dissolved in 1 ml of 200 mM carbonate buffer (pH 9.5), dialyzed product was added, and the mixture was reacted at room temperature with stirring for 3 hours. 0.1 ml of 200 mM Tris-HCl buffer (pH 9.0) was added, and the mixture was reacted for 1 hour with stirring at room temperature. Fractionation was performed with a gel filtration column (2.6 cm × 90 cm) filled with Sepharose CL-4B manufactured by Pharmacia, using 50 mM phosphate physiological saline (pH 7.4) as an eluent to obtain HRP-S113.
[0047]
(2) S113 antibody-immobilized polystyrene beads
S113 antibody was dissolved in 100 mM carbonate buffer (pH 9.5) at a concentration of 20 μg / ml to prepare a bead coating solution. The beads were immersed in the coating solution in an amount of 0.15 ml per 6.25 mm diameter polystyrene beads manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd., and left at 4 ° C. for 20 hours. Thereafter, the coating solution is discarded, the beads are washed with physiological saline, and then immersed in 50 mM phosphate physiological saline (pH 7.4) containing 0.5% bovine serum albumin and 0.02% Tween 20. Stored at 4 ° C.
[0048]
(3) Measurement kit for Lewis Y antigen in human serum
Standard solution: Arbitrary units were set in the serum of a cancer patient having a high concentration of Lewis Y antigen, and diluted with 1% bovine serum albumin and 50 mM phosphate physiological saline (pH 7.4) to obtain a standard solution.
Buffer: 0.5% bovine serum albumin, 0.5% mouse serum, 0.02% Tween 20, 50 mM phosphate saline (pH 7.4)
Enzyme-labeled antibody solution: 0.5% bovine serum albumin, 0.5% mouse serum, 0.02% Tween 20, 50 mM phosphate physiological saline (pH 7.4) containing 1 μg / ml of HRP-S113
Immobilized antibody beads: S113 antibody-immobilized polystyrene beads
Coloring solution: 100 mM citrate phosphate buffer (
Reaction stop solution: 5% oxalic acid solution
Cleaning fluid: physiological saline
[0049]
(4) Measurement of Lewis Y antigen in human serum and selection of specimen showing nonspecific reaction
25 μl of healthy human serum and standard solution were placed in a plastic test tube, 150 μl of buffer solution was added, and one antibody-immobilized bead was added, followed by incubation at 37 ° C. for 2 hours (first immune reaction). After the antibody-immobilized beads were washed with a washing solution, 200 μl of enzyme-labeled antibody solution was added and incubated at 37 ° C. for 1 hour. (Second immune response). The antibody-immobilized beads were washed with a washing solution, transferred to another plastic test tube, added with 300 μl of a coloring solution, and incubated at room temperature for 30 minutes. After adding 2 ml of the reaction stop solution, the absorbance at a wavelength of 405 nm was measured. A standard curve was prepared from the absorbance of the standard solution, and the Lewis Y antigen concentration in the serum of healthy subjects was determined. Most of the sera of healthy subjects showed low values, but there were rarely high specimens. Specimen No. of a healthy person showing a very high value. When the dilution test of 214 was conducted, the Lewis Y antigen concentration in the serum rapidly decreased due to the dilution and reached the level of the antigen concentration of a healthy person. Moreover, when this specimen was heated at 60 ° C. for 1 hour, the antigen concentration level of a healthy person was shown.
[0050]
(5) Effect of non-specific reaction inhibitor on serum Lewis Y antigen measurement
The nonspecific reaction inhibitor produced in Example 4 was added to the buffer solution of the Lewis Y measurement kit of (3), and measurement was performed in the same manner as in (4) to examine the effect of suppressing the nonspecific reaction. The results are shown in Table 2. It was confirmed that the nonspecific reaction inhibitor of the present invention is extremely effective.
[0051]
[Table 2]
Example 7 Preparation of Lewis Y antigen measurement kit in human serum based on radioimmunoassay and measurement of specimen
(1) 125 I-labeled S113 antibody ( 125 I-S113)
50 μl of 50 mM phosphate physiological saline (pH 7.4) in which 2 mg / ml S113 antibody is dissolved, 25 μl of 1% glucose aqueous solution and 0.25 mCi Na made by NEN 125 25 μl of 50 mM phosphate physiological saline (pH 7.4) in which I was dissolved was added, and further 25 μl of Enzymobead suspension manufactured by Bio-Rad was added and reacted at room temperature for 30 minutes. The reaction was stopped by adding 25 μl of a 1% sodium bisulfite aqueous solution, and a PD-10 column manufactured by Pharmacia was equilibrated with 0.5% bovine serum albumin and 50 mM phosphate physiological saline (pH 7.4). 125 I-S113 was fractionated.
[0053]
(2) Measurement kit for Lewis Y antigen in human serum
The same standard solution, buffer solution, immobilized antibody beads, and washing solution as those of the kit of Example 6 were used.
Labeled antibody solution: 0.1 μg / ml 125 0.5% bovine serum albumin, 0.5% mouse serum, 0.02% Tween 20, 50 mM phosphate saline (pH 7.4) containing I-S113
[0054]
(3) Measurement of Lewis Y antigen in human serum
Take 25 μl of standard solution and serum (specimen No. 214) in a plastic test tube, add 150 μl of buffer solution, add one antibody-immobilized bead, and incubate at 37 ° C. for 2 hours (first immune reaction) . After washing the antibody-immobilized beads with a washing solution, 200 μl of a labeled antibody solution was added and incubated at 37 ° C. for 1 hour (second immune reaction). The beads were washed with physiological saline, transferred to another plastic test tube, and the radioactivity was measured with a Packard gamma counter.
[0055]
(4) Effect of non-specific reaction inhibitor on measurement of serum Lewis Y antigen in radioimmunoassay
The nonspecific reaction inhibitor produced in Example 4 was added to the buffer solution of Lewis Y measurement kit of (2), and measurement was performed in the same manner as in (3) to examine the effect of suppressing nonspecific reaction. The results are shown in Table 3. It was confirmed that the nonspecific reaction inhibitor of the present invention is extremely effective.
[0056]
[Table 3]
【The invention's effect】
According to the present invention, since non-specific reactions can be eliminated in immunoassays, false positives are reduced and specificity is improved, and highly reliable clinical tests are possible.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of gel filtration analysis of a C43 antibody and bovine serum albumin reaction product by the periodic acid method. The horizontal axis represents the elution time, and the vertical axis represents the absorbance at 280 nm.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3315969A1 (en) | 2016-06-30 | 2018-05-02 | Sysmex Corporation | Antibody reagent and reagent kit for detecting test substance by immune complex transfer method, method for producing the same, and use of the same |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4892500B2 (en) * | 2008-02-12 | 2012-03-07 | 富士フイルム株式会社 | Immunochromatographic method using non-specific adsorption inhibitor |
| JP2010127827A (en) * | 2008-11-28 | 2010-06-10 | Abbott Japan Co Ltd | Nonspecific interaction inhibitor, and its application to diagnostic measuring system |
| KR102176382B1 (en) * | 2012-09-28 | 2020-11-09 | 세키스이 메디칼 가부시키가이샤 | Immunological detection process and immunological detection reagent |
| EP2930514B1 (en) * | 2012-12-05 | 2019-08-28 | Konica Minolta, Inc. | Method for suppressing nonspecific signals from contaminants in an immunoassay using surface plasmon-field enhanced fluorescence spectroscopy (spfs) |
| JP2013152247A (en) * | 2013-04-12 | 2013-08-08 | Abbott Japan Co Ltd | Nonspecific interaction inhibitor and application of the same to diagnostic measuring system |
| TW202342979A (en) * | 2021-12-28 | 2023-11-01 | 日商積水醫療股份有限公司 | Detection method and detection reagent |
-
1996
- 1996-04-19 JP JP12078996A patent/JP3667434B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
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