JP3658782B2

JP3658782B2 - Activity measurement method of prophenoloxidase activating enzyme and its application

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Publication number: JP3658782B2
Application number: JP26981094A
Authority: JP
Inventors: 正明芦田; 智久川端; 一成平安; 正和土谷
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd; Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1993-11-18
Filing date: 1994-11-02
Publication date: 2005-06-08
Anticipated expiration: 2020-06-08
Also published as: JPH07184690A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、プロフェノールオキシダーゼ活性化酵素（以下、ＰＰＡＥという。）の活性測定法、および該測定法を利用するβ−１，３−グルカン及び／またはペプチドグリカンの測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術・発明が解決しようとする課題】
昆虫体液には、体液のメラニン化に関与するプロフェノールオキシダーゼ活性化系（以下、ｐｒｏＰＯ活性化系という）と呼ばれる一連の酵素群からなるカスケード系が存在しており、真菌細胞壁構成成分であるβ−１，３−グルカン、または／および細菌細胞壁構成成分であるペプチドグリカンがこのカスケードの引き金となることが知られている〔Onishi, Annot. Zool. Jpn., 27, 33-39 (1954), Ashida and Onishi, Arch. Biochem. Biophys., 122, 411-416 (1967)； Brunet, Insect Biochem., 10, 467-500 (1980) ； Ashida and Yamazaki, Molting and Metamorphosis, 239-265, Japan Sci. Soc. Press (1990) 〕。これは、当該ｐｒｏＰＯ活性化系にβ−１，３−グルカンに特異的親和性をもつβ−１，３−グルカン認識タンパク（βＧＲＰ；分子量６２ｋＤａ）、およびぺプチドグリカンに特異的親和性をもつペプチドグリカン認識タンパク（ＰＧＲＰ；分子量１９ｋＤａ）が存在することによるもので、これらのタンパクによりβ−１，３−グルカンまたはペプチドグリカンの存在が認識された時、カスケード系の一連反応が開始する。カスケード系はその後、Ｃａ²⁺を要求する酵素による反応を含む未解明の幾つかの反応を経て、プロフェノールオキシダーゼ（フェノールオキシダーゼの前駆体：以下、ｐｒｏＰＯという。）をフェノールオキシダーゼ（以下、ＰＯという。）に変換するＰＰＡＥが生成される〔Ashida and Dohke, Insect Biochem., 10, 37-47 (1980) 〕。
【０００３】
このような現象をもとに、治療薬などの安全性試験、或いは細菌性感染や真菌性感染を検出するための手段として、上記のカスケード反応を利用したβ−１，３−グルカン，ペプチドグリカンなどの測定方法が種々検討されている。
【０００４】
現在、治療薬などの安全性試験用試薬、或いは細菌性感染などの検出用試薬として、昆虫と同様な生体内カスケード系を有するカブトガニ血球抽出物を用いたリムルステスト試薬がある。しかし、カブトガニはペプチドグリカンに反応する系を持たないため、β−１，３−グルカン及びリポ多糖類しか検出できず、この結果リポ多糖類を持たないグラム陽性細菌は検出できないといった欠点がある。また、試薬の供給源としてのカブトガニ自身が日本国内では稀少動物であり、その将来的供給の不安定性が常に問題となっている。
【０００５】
それに対して、昆虫のカスケード系（ｐｒｏＰＯ活性化系）を利用する場合、試薬の安定した供給が望めるばかりか、真菌類はもとよりペプチドグリカンに反応する系をもつため細菌類についてもグラム陽性・陰性の区別をしないで全体を捕らえることができる。さらには、体液中からペプチドグリカンと特異的に反応する成分またはβ−１，３−グルカンと特異的に反応する成分を取り除くことによって、それぞれβ−１，３−グルカン（真菌類）またはペプチドグリカン（細菌類）を別個に測定することも可能である（特開昭６３−１４１５９８号公報、特開昭６３−１４１５９９号公報）等の利点がある。
【０００６】
昆虫のカスケード系を利用した測定方法としては、従来ＰＰＡＥによりｐｒｏＰＯがＰＯに変換されて生じるＰＯ活性を計測することによってβ−１，３−グルカンやペプチドグリカンを測定する方法がある。しかし、この測定方法では不安定な酵素であるＰＯの自己酸化などの問題と検出感度の飛躍的な上昇が望めない点で問題があった。
また、この問題を解消する測定法として、ゼーダールヘール・トルド・ケネスにより、フェノールオキシダーゼを活性化する何らかのセリンプロテアーゼ活性を、合成ペプチドを基質として計測することによって、β−１，３−グルカンや内毒素（リポ多糖類）を測定する方法が提案されている（特表昭５８−５０２０８２号公報）。
しかし、ここで使用されている基質は、ｐｒｏＰＯからＰＯへの変換を触媒するＰＰＡＥの基質特異性を考慮することなく、単にＰＰＡＥがセリンプロテアーゼであるという事実に基づいて構築されたものであることから、ＰＰＡＥ活性、ひいてはβ−１，３−グルカンや内毒素の量を正確に測定できないというおそれがある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、ＰＰＡＥ本来の基質特異性を利用することにより、反応特異性に富み、正確にＰＰＡＥ活性を測定する方法を提供することを目的とする。さらに、本発明の目的は当該ＰＰＡＥ活性測定法を利用して、β−１，３−グルカン及び／またはペプチドグリカンの正確な測定方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記目的を達成するため種々研究を重ねた結果、ＰＰＡＥ本来の基質であるｐｒｏＰＯの一次構造の解析により、ＰＰＡＥが認識，切断する領域のアミノ配列を解明することに成功した。
本発明は、かかる研究で得られた情報をもとに、ｐｒｏＰＯ上のＰＰＡＥ認識切断部位を含むペプチド鎖を基質として用いることを特徴とするＰＰＡＥ活性測定法、およびこの方法で測定されるＰＰＡＥ活性を指標とするβ−１，３−グルカン或いは／及びペプチドグリカンの測定方法に関する。
【０００９】
すなわち、本発明は一般式（Ｉ）：
Ｘ−Ａｒｇ−Ｙ
（Ｘは、標識されていても、またαアミノ基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは２〜２０個のアミノ酸残基からなる、標識されていても、またＮ末端が保護されていてもよいペプチド残基である。但し、Ａｒｇに隣接するアミノ酸残基はＧｌｙ及びＡｌａではない。Ｙは、酸アミド結合又はエステル結合によりＡｒｇのカルボキシル基に結合し得る有機残基、又は標識されていても、またαカルボキシル基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは２〜２０個のアミノ酸残基からなる、標識されていても、またＣ末端が保護されていてもよいペプチド残基である。）で表わされ、かつ昆虫類由来のＰＰＡＥによってＸ−ＡｒｇとＹに加水分解され得るペプチド鎖をＰＰＡＥと接触させ、生成するＸ−Ａｒｇ及びＹのいずれか少なくとも一方を、該化合物の化学的性質又は物理学的性質によって計測し、該計測値に基づいて、プロフェノールオキシダーゼ活性化酵素の活性を測定することを特徴とするＰＰＡＥ活性の測定法〔以下、これを測定法（１）ともいう。〕であり、特に、このＸが一般式：
Ｘ’−Ａｓｎ
〔Ｘ’は、標識されていても、またαアミノ基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは標識されていても、またＮ末端が保護されていてもよいペプチド残基（但し、Ｘの有するアミノ酸数よりアミノ酸数が１個より少ない。）、又はＡｓｎのαアミノ基の保護基である。〕で示される基、又は／及びＹが、一般式：
Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｚ
〔Ｚは、標識されていても、またαカルボキシル基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは標識されていても、またＣ末端が保護されていてもよいペプチド残基（但し、Ｙの有するアミノ酸数よりアミノ酸数が２個より少ない。）、又はＧｌｙのカルボキシル基の保護基である。〕で示される基である測定法に関する。さらに、本発明は、比色、発光、蛍光、放射能、磁気を用いるいずれかの測定手段によって測定されるＰＰＡＥ活性の測定方法に関する。
【００１０】
また、本発明は一般式（Ｉ）：
Ｘ−Ａｒｇ−Ｙ
（Ｘは、標識されていても、またαアミノ基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは２〜２０個のアミノ酸残基からなる、標識されていても、またＮ末端が保護されていてもよいペプチド残基である。但し、Ａｒｇに隣接するアミノ酸残基はＧｌｙ及びＡｌａではない。Ｙは、酸アミド結合又はエステル結合によりＡｒｇのカルボキシル基に結合し得る有機残基、又は標識されていても、またαカルボキシル基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは２〜２０個のアミノ酸残基からなる、標識されていても、またＣ末端が保護されていてもよいペプチド残基である。）で表わされ、かつ昆虫類由来のＰＰＡＥによって、Ｘ−ＡｒｇとＹに加水分解され得るペプチド鎖を、ｐｒｏＰＯ活性化系及び、β−１，３−グルカン及び／又はペプチドグリカンを含有する可能性のある検体と接触させ、生成するＸ−Ａｒｇ及びＹのいずれか少なくとも一方を、該化合物の化学的性質又は物理学的性質によって計測し、該計測値に基づいて、検体中のβ−１，３−グルカン及び／又はペプチドグリカンの測定を行うことを特徴とするβ−１，３−グルカン及び／又はペプチドグリカンの測定法〔以下、測定法（２）ともいう。〕であり、特にＸが、一般式：
Ｘ’−Ａｓｎ
〔Ｘ’は、標識されていても、またαアミノ基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは標識されていても、またＮ末端が保護されていてもよいペプチド残基（但し、Ｘの有するアミノ酸数よりアミノ酸数が１個より少ない。）、又はＡｓｎのαアミノ基の保護基である。〕で示される基、又は／及びＹが、一般式：
Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｚ
（Ｚは、標識されても、またαカルボキシル基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは標識されていても、またＣ末端が保護されていてもよいペプチド残基（但し、Ｙの有するアミノ酸数よりアミノ酸数が２個より少ない）、又はＧｌｙのカルボキシル基の保護基である。）で示される基を利用する測定法に関する。さらに、本発明は比色、発光、蛍光、放射能、磁気を用いるいずれかの測定手段によって測定されるβ−１，３−グルカン及び／又はペプチドグリカンの測定法に関する。
【００１１】
またさらに、本発明は測定法（２）において、ペプチドグリカンに特異的に反応する成分を取り除いたｐｒｏＰＯ活性化系を用いることを特徴とするβ−１，３−グルカンの測定法〔以下、測定法（３）ともいう。〕、および測定法（２）において、β−１，３−グルカンに特異的に反応する成分を取り除いたｐｒｏＰＯ活性化系を用いることを特徴とするペプチドグリカンの測定法〔以下、測定法（４）ともいう。〕に関する。
【００１２】
本発明のＰＰＡＥ活性測定法（１）は、基質であるペプチド鎖：Ｘ−Ａｒｇ−ＹにＰＰＡＥが接触することにより生じる反応生成物Ｘ−ＡｒｇおよびＹのいずれか少なくとも一方を計測することによって、ＰＰＡＥ活性を測定する方法である。
基質であるＸ−Ａｒｇ−Ｙは、２以上のアミノ酸残基からなるペプチド鎖であり、以下の条件を満たすものであれば特に限定されない。
▲１▼昆虫由来のＰＰＡＥによってＸ−ＡｒｇとＹとに分解される。
▲２▼ＰＰＡＥにより分解され生成するＸ−ＡｒｇおよびＹのうち、少なくともいずれか一方がその化学的性質あるいは物理的性質に基づいて測定できる。
▲３▼Ａｒｇのαアミノ基はアミノ酸残基と結合しており、そのアミノ酸残基はＧｌ
ｙおよびＡｌａでない。
【００１３】
なおペプチド鎖とは、ペプチド及びペプチド誘導体をも包含する意味で使用される。ペプチド誘導体としてはペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端に保護基を有するもの、ペプチド中のアミノ酸残基が標識されているものなどが例示される。
【００１４】
Ａｒｇに結合するＸおよびＹは、上記の条件を満たすものであれば、特に限定されない。
【００１５】
Ｘとしては、ＧｌｙおよびＡｌａ以外のアミノ酸残基、Ｃ末端側のアミノ酸残基がＧｌｙおよびＡｌａでないペプチド残基が挙げられる。また、アミノ酸残基は、標識されていても、そのαアミノ基が保護されていてもよく、同様にペプチド残基は、標識されていても、そのＮ末端が保護されていてもよい。
好ましくは、ＸがＸ’−Ａｓｎ〔Ｘ’は、標識されていても、またαアミノ基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは標識されていても、またＮ末端が保護されていてもよいペプチド残基（但し、Ｘの有するアミノ酸数よりアミノ酸数が１個少ない。）、またはＡｓｎのαアミノ基の保護基である。〕で表わされる基である。
より好ましくは、Ｘが、家蚕（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）のｐｒｏＰＯのアミノ酸配列を表す下式
Ｘ＝Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｎ
または、下式
Ｘ＝Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ
で表わされる配列のうちＣ末端側の少なくとも２個のアミノ酸残基を有する基である。含有するアミノ酸残基数としては、２〜２０個が好ましい。
【００１６】
ここで、ペプチド残基のＮ末端の保護基、アミノ酸残基のαアミノ基の保護基およびＡｓｎのαアミノ基の保護基とは、アミノ酸残基のαアミノ基を保護しうる基一般を意味し、例えばカルボベンゾキシ基、サクシニル基、炭素数２〜１８のアルコキシカルボニル基などが挙げられる。
【００１７】
Ｘ−Ａｒｇ−ＹのＹとしては、酸アミド結合またはエステル結合によりＡｒｇのカルボキシル基に結合しえる有機残基、またはアミノ酸残基もしくはペプチド残基が挙げられる。また、アミノ酸残基は標識されていても、そのαカルボキシル基が保護されていてもよく、同様にペプチド残基は標識されていても、そのＣ末端が保護されていてもよい。
【００１８】
ここで「有機残基」としては、Ａｒｇのカルボキシル基に酸アミド結合またはエステル結合により結合し、ＰＰＡＥの存在によってＸ−Ａｒｇから遊離するものであり、かつ有機残基（Ｙ）それ自身が物理的あるいは化学的に検出可能なもの、またはＸ−Ａｒｇ−Ｙから切断され、Ｘ−ＡｒｇおよびＹとなることにより測定系の特性が変化し、その変化が物理的もしくは化学的に測定可能なものであれば特に限定されない。
代表的なものとしては、例えばｐ−ニトロアニリノ基，２−クロロ−４−ニトロアニリノ基等の発色基、例えば２−ピリジルアミノ基，３−ピリジルアミノ基，β−ナフチルアミノ基，７−アミノ−４−メチルクマリノ基，７−ヒドロキシ−４−メチルクマリノ基等の蛍光性を有する基、例えば¹²⁵Ｉや¹⁴Ｃ，³Ｈ等の同位元素で標識された有機残基、磁気性を有する基などが例示されるが、これらの有機残基に限定されるものでないことは言うまでもない。
【００１９】
また、Ｙに関して「ペプチド残基」としては、好ましくはＰｈｅ−Ｇｌｙ−Ｚ〔Ｚは、標識されていても、またαカルボキシル基が保護されていてもよいアミノ酸残基、もしくは標識されていても、またＣ末端が保護されていてもよいペプチド残基（但し、Ｙの有するアミノ酸数よりアミノ酸数が２個少ない。）、またはＧｌｙのカルボキシル基の保護基である。〕で表わせるものである。
より好ましくは、家蚕（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）のｐｒｏＰＯのアミノ酸配列を表す下式
Ｙ＝Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ
または、下式
Ｙ＝Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ
で表わされる配列のうち、Ｎ末端側の少なくとも２個のアミノ酸残基を有する基である。含有するアミノ酸残基数としては２〜２０個が好ましい。
「アミノ酸残基」としては特に限定されないが、好適にはＰｈｅが例示される。
【００２０】
ここでペプチド残基のＣ末端の保護基、アミノ酸残基のαカルボキシル基の保護基およびＧｌｙのカルボキシル基の保護基とは、アミノ酸残基のαカルボキシル基を保護しうる基一般を意味し、例えばベンジルオキシ基，フェネチルオキシ基などのアラルキルオキシ基などが代表的なものとして挙げられる。
【００２１】
本発明で「標識」とは、ペプチド残基またはアミノ酸残基の一部を修飾もしくは置換して、その結果、かかるペプチド残基またはアミノ酸残基を有する化合物が同定され得るものであれば特に限定されない。
このような標識に係わる標識物質としては、例えばＥＩＡ（enzyme immunoassay）に於いて用いられるアルカリフォスファターゼ，β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ，マイクロペルオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素，リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素類、例えばＲＩＡ（radioimmunoassay) で用いられる^99mＴｃ，¹³¹Ｉ，¹²⁵Ｉ，¹⁴Ｃ，³Ｈ等の放射性同位元素、２−アミノピリジン，３−アミノピリジン或いはＦＩＡ（fluoroimmunoassay)で用いられるフルオレセイン，ダンシル，フルオレスカミン，クマリン，ナフチルアミン或いはこれら誘導体等の蛍光性物質、例えばルシフェリン，イソルミノール，ルミノール，ビス(2,4,6−トリフロロフェニル）オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール，ナフトール，アントラセン或いはこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば４−アミノ−2,2,6,6 −テトラメチルピペリジン−１−オキシル、３−アミノ−2,2,5,5 −テトラメチルピロリジン−１−オキシル、2,6 −ジ−t −ブチル−α−（3,5-ジ-t- ブチル−4-オキソ-2,5- シクロヘキサジエン-1- イリデン)-p-トリルオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等が挙げられるが、これらに限定されるものではないことは言うまでもない。
【００２２】
ＰＰＡＥの由来となる昆虫類（Insecta)は、特に限定されないが、飼育方法の確立しているものが好ましい。例えば、カイコガ，タバコスズメガなどの鱗翅目、イエバエ，センチニクバエなどの双翅目、トノサマバッタ，エンマコウロギなどの直翅目、センノキカミキリなどの鞘翅目などが挙げられる。
なお、昆虫類には、幼生、成体等を問わず、全ての態様のものが包含される。鱗翅目、双翅目及び鞘翅目などの完全変態類に属する昆虫については、取得の容易性から、成虫よりも幼虫であるほうが好ましい。
【００２３】
本発明のＰＰＡＥ活性測定方法において、Ｘ−Ａｒｇ−Ｙに接触させるＰＰＡＥは、昆虫に由来するＰＰＡＥそのもの、またはそれを含有するものであれば特に限定されない。ＰＰＡＥを含有するものとしては、好ましくは昆虫の体液である。体液としては、取得の容易性から一般に昆虫の体腔から得られるヘモリンパが挙げられる。
ヘモリンパの取得法については特に限定されない。好ましくは、昆虫を氷上に置き動きを止めた後、トウキビ因子（サトウキビに含まれるグルコース、アミノ酸等からなる高分子物質）を不純物として含む庶糖、またはトウキビ因子そのものを含む生理食塩水を体腔に注射し、その後しばらく放置してから体腔から集める方法が挙げられる。
さらに、上記のような方法で集めたヘモリンパを遠心分離にかけ、血球を除去した後、透析により得られる血漿を用いることもできる。
【００２４】
本発明のＰＰＡＥ活性測定方法は、前述のペプチド鎖Ｘ−Ａｒｇ−Ｙに昆虫体液等に存するＰＰＡＥが接触することによって生じる反応生成物を測定することによって行われる。
反応生成物の検出には、反応生成物であるＸ−ＡｒｇおよびＹの少なくともいずれか一方の化学的または物理的性質に基づくいずれの方法をも使用できる。
例えば吸光度測定法，比色法，蛍光法〔参考「図説蛍光抗体」（株）ソフトサイエンス社〕，発光法〔参考「酵素免疫測定法」蛋白質核酸酵素，別冊 No.31, 第251 〜263 頁, 共立出版（株）〕，ＲＩＡ法（参考「医化学実験講座」第８巻，中山書店），ＥＩＡ法〔参考「酵素免疫測定法」蛋白質核酸酵素，別冊 No.31，51〜63頁, 共立出版（株）〕、核磁気共鳴スペクトル法〔参考「酵素免疫測定法」蛋白質核酸酵素，別冊 No.31，264 〜271 頁, 共立出版（株）〕などが例示される。
【００２５】
具体的には、以下の方法が例示される。
Ｙがｐ−ニトロアニリノ基などの発色基である場合は、反応の前後における系の吸光度（吸収曲線）の変化を常法に従って測定することができ、またＹがβ−ナフチルアミノ基などの蛍光性を有する基である場合は、反応前後の系の蛍光強度の変化を常法に従って測定することができる。また、Ｙが¹⁴Ｃや³Ｈ等の同位元素で標識された有機残基である場合は、Ｘ−ＡｒｇとＹとをそれらの分子量，疎水性または親水性などの特性の違いを利用して液体クロマトグラフィーや電気泳動法などで分離後、同位元素の線種に応じた検出法によりＹの生成を測定することができる。Ｙが磁気性を有する有機残基の場合は、固相担体に磁力を利用して固定し得るＸ−Ａｒｇ−ＹからＸ−Ａｒｇが遊離することを利用して測定できる。
【００２６】
また、特にＹがそれ自身が蛍光等の検出特性を有しないものであっても、分子量，疎水性などの特性の違いを利用して液体クロマトグラフィーや電気泳動法などでＸ−ＡｒｇとＹとを分離後、吸光度を検出することによって測定することもできる。またこの場合、Ｘ−Ａｒｇが発色性，蛍光性，発光性，放射性などの特性を有していれば、それぞれに対応した検出手段によってＸ−Ａｒｇの生成量もしくはＸ−Ａｒｇ−Ｙの残量を測定することも可能である。
【００２７】
また、Ｘが酵素で標識されている場合、Ｘ−ＡｒｇまたはＸ−Ａｒｇ−Ｙを当該酵素の基質となりえる物質と接触させ、基質の変化を測定することによって、ＰＰＡＥの活性を測定することができる。例えば、Ｘがペルオキシダーゼで標識されている場合、基質として５−アミノサリチル酸，ｏ−フェニレンジアミン等を使用するなら吸光度の変化（比色法）で、３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸等を使用するなら蛍光法で、ルミノール等を使用するなら発光法で検出できる。また、Ｘがアルカリホスファターゼで標識されている場合、基質としてｐ−ニトロフェニル・リン酸を使用するなら比色法で、４−メチルウンベリフェリル・リン酸を使用するなら蛍光法、４−メトキシ−４−（３−ホスフェートフェニル）スピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２’−アダマンタン〕ジソデュウム塩（ＡＭＰＰＤ）を使用するなら発光法で検出することができる。
【００２８】
本発明のβ−１，３−グルカンあるいは／及びペプチドグリカンの測定法（２）は、前述の一般式（Ｉ）で示されるペプチド鎖，ｐｒｏＰＯ活性化系およびβ−１，３−グルカン或いは／及びペプチドグリカンをともに接触させることによって生じるＸ−ＡｒｇおよびＹのいずれか少なくとも一方を計測することによって測定されるＰＰＡＥの活性を指標として、β−１，３−グルカンあるいは／及びペプチドグリカンを検出、定量する方法である。
すなわち当該測定法（２）は、β−１，３−グルカン或いは／及びペプチドグリカンの存在によってｐｒｏＰＯ活性化系が活性化され、その結果生じるＰＰＡＥ活性を指標として、β−１，３−グルカン或いは／及びペプチドグリカンの量を測定する方法であり、指標となるＰＰＡＥ活性の検出に前述のＰＰＡＥ活性測定法（１）を利用するものである。
【００２９】
ｐｒｏＰＯ活性化系とは、β−１，３−グルカンを特異的に認識する成分あるいは／及びペプチドグリカンを特異的に認識する成分を含有しており、β−１，３−グルカンあるいは／及びペプチドグリカンの存在によって引き金が引かれ、その結果ｐｒｏＢＡＥＥａｓｅ（ベンゾイルアルギニンエチルエステルを加水分解する活性を有する酵素の前駆体）、ｐｒｏＰＰＡＥ（ｐｒｏＰＯを活性化するセリンプロテアーゼの前駆体）、ｐｒｏＰＯの少なくとも３つの前駆体を活性化する一連の酵素群からなるカスケード系をいう。
【００３０】
本発明の測定法（２）で使用されるｐｒｏＰＯ活性化系は、ｐｒｏＰＯ活性化系そのものもしくは当該系を含有するものであってもよい。ｐｒｏＰＯ活性化系を含有するものとして、好適には昆虫の体液が挙げられる。
使用される昆虫の体液としては、前述と同様に昆虫体腔から得られるヘモリンパが挙げられる。ヘモリンパの取得方法については前述と同様の方法が例示され、また使用できる昆虫の種類についても前述と同様である。
【００３１】
本発明の測定の対象となるβ−１，３−グルカンとしては、β−１，３−結合を有するグルコースポリマーやその誘導体、例えばザイモサン、カードラン、パキマン、スクレロタン、レンチナン、シゾフィラン、コリオラン、ラミナラン、リケナン及びその誘導体等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００３２】
本発明の測定の対象となるペプチドグリカンとしては、特に限定されないが、例えば、各種細菌類（例えば、Micrococcus 属、Streptococcus 属、Aureobacterium属、Bacillus属、Agrobacterium 属など) の細胞壁構成成分が挙げられる。
【００３３】
本発明の測定法（２）は、β−１，３−グルカンあるいは／およびペプチドグリカンを特異的に検出・定量する方法であり、かかる方法によれば、β−１，３−グルカンあるいは／及びペプチドグリカンを含む検体を識別すること、また検体中のβ−１，３−グルカンあるいは／およびペプチドグリカンを定量的に測定することも可能である。
【００３４】
測定法（２）は、β−１，３−グルカンまたは／及びペプチドグリカンを含有する可能性のある測定対象の検体、一般式（Ｉ）で規定されるペプチド鎖を含有する溶液およびｐｒｏＰＯ活性化系を含有する溶液、好ましくは昆虫の体液をよく混合して反応液とし、一定時間後の反応液中のＰＰＡＥ活性を、生成するＸ−ＡｒｇもしくはＹを前述の測定方法（１）で測定することによって行われる。
【００３５】
使用されるペプチド鎖の濃度は検出される程度の濃度であればよく、測定系に応じて適宜調製される。ｐｒｏＰＯ活性化系の量もｐｒｏＰＯカスケード系が働き得る量であればよく、測定系に応じて適宜調製される。
反応ｐＨとしては、通常ｐＨ４〜１１、好ましくはｐＨ６〜９である。また、かかるｐＨ値を維持するため緩衝液を使用してもよく、緩衝液としては反応に影響を与えないものであれば、種類，使用濃度とも特に制限されない。例えばリン酸塩緩衝液，ホウ酸塩緩衝液，酢酸塩緩衝液，トリス緩衝液，グッド緩衝液等が例示される。
また、反応温度および反応時間については、反応が進む温度，時間であれば特に制限されない。反応温度としては通常０〜５０℃、好ましくは４〜３０℃が挙げられる。反応時間としては通常１秒〜２０時間、好ましくは１０秒〜２時間である。
また本測定系には、０．００１〜１０００ｍＭ，好ましくは５〜１００ｍＭの範囲内の２価の金属イオン、例えばＣａ²⁺，Ｍｇ²⁺等が存在していることが好ましい。
【００３６】
このβ−１，３−グルカンあるいは／及びペプチドグリカンの測定法（２）においては、検体中にβ−１，３−グルカンとペプチドグリカンとの両者が存在する場合、得られるＰＰＡＥ活性はβ−１，３−グルカンとペプチドグリカンの総和として示される。
【００３７】
一方、本発明の測定法（３）はβ−１，３−グルカンを特異的に検出、定量する方法であり、また本発明の測定法（４）はペプチドグリカンを特異的に検出、定量する方法である。
β−１，３−グルカンの測定方法（３）は、前述の測定法（２）においてあらかじめペプチドグリカンに特異的に反応する成分を除去しておいたｐｒｏＰＯ活性化系を用いることによって行われる。ペプチドグリカンに特異的に反応する成分としては、例えばペプチドグリカン認識タンパク等が挙げられる。
【００３８】
また、ペプチドグリカンの測定方法（４）は、前述の測定法（２）の方法においてあらかじめβ−１，３−グルカンに特異的に反応する成分を除去しておいたｐｒｏＰＯ活性化系を用いることによって行われる。β−１，３−グルカンに特異的に反応する成分としては、例えばβ−１，３−グルカン認識タンパク等が挙げられる。
【００３９】
ｐｒｏＰＯ活性化系から、ペプチドグリカンまたはβ−１，３−グルカンと特異的に反応する成分を除去する方法としては、ゲル濾過法、電気泳動法、アフィニティークロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、遠心分離法など、一般に生化学の分野で用いられている分離精製法がいずれも使用できる。好適には、ペプチドグリカンと特異的に反応する成分を除去する方法として、ペプチドグリカンを結合させた担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーが例示され（特開昭６３−１４１５９９号公報）、β−１，３−グルカンと特異的に反応する成分を除去する方法として、β−１，３−グルカンを結合させた担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーが例示される（特開昭６３−１４１９８号公報）。
【００４０】
【発明の効果】
本発明によれば、ＰＰＡＥ活性の正確な定量測定が可能となる結果、このＰＰＡＥ活性を指標にしたβ−１，３−グルカンおよび／またはペプチドグリカンの正確な測定法を提供することができる。
さらに本発明は、培養法等によって増殖させることなく真菌類や細菌類の検出を可能とし、そのためこれらの微生物感染症の早期診断を可能とする。また、水、食物等への微生物混入試験や治療薬（抗生物質、注射用製剤）などの安全性試験へも広く利用可能である。
【００４１】
【実施例・参考例】
本発明をより詳細に説明するために、実施例および参考例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００４２】
参考例１家蚕型ｐｒｏＰＯ上のＰＰＡＥ認識切断部位のアミノ酸配列の決定
(1) 家蚕型ｐｒｏＰＯの精製
家蚕５令幼虫より得られたヘモリンパ約２００ｍｌに飽和硫安（ｐＨ６．５）を加えて７０％硫安溶液とし、４℃、一晩静置した。そこへ０．２Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を加えて４０％硫安溶液とした。２時間ゆっくり攪拌した後静置して、８０００rpm ，２０分間遠心し（日立ＲＰＲ９−２ロータ、以下同じ）上清を得た。この上清に飽和硫安（ｐＨ６．５）を加え、５０％硫安溶液とし、一晩静置した。これをさらに８０００rpm ，２０分間遠心し、沈澱を得た。この沈澱を０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）−２０％硫安溶液（ｐＨ６．５）で溶かして、さらに飽和硫安（ｐＨ６．５）を加えて３８％硫安溶液とした。１時間攪拌して２．５時間静置した後、１００００rpm , ２０分間遠心して上清を得た。この上清に飽和硫安（ｐＨ６．５）を加えて４８％硫安溶液とした。これを３０分間攪拌した後、一晩静置し、８０００rpm ，２０分間遠心して沈澱を得た。この沈澱を０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液に溶かして、同緩衝液中で透析した。
【００４３】
透析を終えた試料を１２０００rpm ，２０分間遠心後、得られた上清を６５℃水浴中で攪拌しながら５４．５℃に上がるまで加温し、５５℃水浴中で５分間さらに加温した。氷で急冷後、１８０００rpm ，２０分間遠心し、上清を得た。
この上清をＤＥＡＥセルロースカラムクロマトグラフィー〔和光純薬工業（株）製、φ１．５×１９ｃｍ〕に付し、ＫＣｌのグラジエントで溶出させて分画を行った。粗ＰＰＡＥを使って活性化後現れるＰＯ活性の有無を調べることにより、ｐｒｏＰＯ画分を集めた。この集めたｐｒｏＰＯ画分は、０．０４ＭＫＣｌ−０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で透析を行った。
さらにこの試料は、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー〔和光純薬工業（株）製、φ１．５×９．３ｃｍ〕にかけ、５０ｍＭ，７５ｍＭ，９５ｍＭの各リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で溶出させて得られた各分画中のＰＯ活性を先述の方法に従って測定した。その結果、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）でｐｒｏＰＯの溶出を確認したためこの画分を集めた。
この画分をザルトリウス社の Collodion Bag (SM13200)で濃縮し、０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．７５）中で透析し、精製ｐｒｏＰＯ溶液とした。
【００４４】
(2) ＰＰＥＡの精製
家蚕５令幼虫の表皮より得たホモジネートを硫安分画し、うち０．２〜０．４％硫安画分を集め、０．０１Ｍトリス−塩酸−０．０１ＭＣａＣｌ₂（ｐＨ８．５）中で透析した後、さらに０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中でさらに透析した。これをＤＥＡＥセルロースカラムにかけ、０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で溶出した。このうちＰＰＡＥ活性を示す分画を集め、これをさらにヒドロキシアパタイトカラムにかけて０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄後、０．０１〜０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）のリニアグラジエントで溶出した。このうち、ＰＰＡＥ活性を示す分画を集めて、精製ＰＰＡＥ溶液とした。
【００４５】
(3) ＰＰＡＥによってｐｒｏＰＯが切断されて得られるペプチド断片のアミノ酸配列分析
上記精製ｐｒｏＰＯを精製ＰＰＡＥと共にインキュベーションして、その反応溶液をセファデックスＧ−５０カラムにかけ、０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出し、ｐｒｏＰＯから切断され遊離してくるペプチド鎖を集めた。ついで、このペプチド鎖をＯＤＳカラムにより３種類のフラグメント（ｆＩ，ｆII，ｆIII ）に分けた。これらをそれぞれリジルエンドペプチダーゼ処理して断片化した後、エドマン分解法により、各断片のアミノ酸配列を調べた。その結果、ｆＩ，ｆIIが多少修飾に違いはあるものの同じ配列を有する断片（配列表、配列番号２）であり、ｆIII がそれとは異なるアミノ酸配列であることがわかった（配列表、配列番号１）。
【００４６】
(4) ＰＰＡＥによってｐｒｏＰＯから上記ペプチドが切断されて生じるＰＯのＮ末端のアミノ酸配列分析
０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中のｐｒｏＰＯをチオウレアと７５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中のＰＰＡＥと共に０℃で３時間インキュベーションし、全てのｐｒｏＰＯをＰＯに変換した。この反応液をＯＤＳカラムによって２つの主要分画に分け、それぞれのＮ末端のアミノ酸配列をエドマン分解法によって決定した（配列表、配列番号３，４）。
【００４７】
参考例２蚕型ｐｒｏＰＯ上のＰＰＡＥ認識切断部位のＤＮＡ塩基配列の決定
(1) 家蚕ｃＤＮＡライブラリーの作製
家蚕５令幼虫５００頭より体液を２５ｍｌ採取し、これを遠心分離（４０Ｇ，１５分，４℃）して血球細胞を沈澱させた。この血球細胞よりＲＮＡ抽出キットＩＳＯＧＥＮ〔和光純薬工業（株）製〕を用いて約８００μｇの全ＲＮＡを調製した。
この全ＲＮＡより mRNA Purification Kit（ファルマシア社製）を用いてｍＲＮＡを精製し、cDNA Synthesis Kit（ファルマシア社製）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。合成したｃＤＮＡはλＺＡＰIIファージベクターのＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、Gigapack Gold packaging extract （ストラタジーン社製）を用いて in vitro パッケージングを行った。その結果４．２×１０⁵プラークフォーミングユニット（ＰＦＵ）のファージライブラリーを得た。
【００４８】
(2) ｐｒｏＰＯクローンのスクリーニング
ｐｒｏＰＯクローンのスクリーニングには PicoBlue ^TM Immunoscreening Kit（ストラタジーン社製）を用いて行った。
１．５×１０⁴ＰＦＵの家蚕ｃＤＮＡファージライブラリーと２００μｌのE. coli XL-1 Blue(OD₆₀₀＝約 0.5）を混合し、３７℃で１５分間インキュベーションした後、ＮＺＹプレート（１．５％アガー，１％ＮＺアミン，０．２％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，０．５％バクトイーストエキストラクト，０．５％ＮａＣｌ，１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン：ｐＨ７．５）にまき、４２℃で３．５時間程培養した。プラークが現れた段階で１０ｍＭＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を染み込ませたニトロセルロースフィルター（アマシャム社製）をかぶせ、更に３７℃で３．５時間培養した後、ピンセットで注意深くニトロセルロースフィルターを取りＴＢＳＴ〔２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０５％(V/V) Ｔｗｅｅｎ２０〕で１５分間、３〜５回洗浄した。
また、同一プレートに２枚のスクリーニング用レプリカフィルターを作製するため１枚目のフィルターを剥がした後、１０ｍＭＩＰＴＧを染み込ませた別のニトロセルロースフィルターをプレートに被せ、３７℃、４時間培養した。この２枚目のフィルターも１枚目のフィルターと同様に洗浄した。
この操作を２０プレート行い、合計約３．０×１０⁵個のプラークを持つレプリカフィルターを作製した。
これらのフィルターは、ブロッキング溶液〔１％ＢＳＡ，２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１５０ｍＭＮａＣｌ〕中で１時間ゆっくりと振盪後、ブロッキング溶液で適当に希釈した抗ｐｒｏＰＯウサギ抗体溶液中に移替え１時間ゆっくりと室温で振盪した。一次反応を終えたレプリカフィルターは１回につき５分間，ＴＢＳＴで３〜５回洗浄後、ブロッキング溶液で適当に希釈したアルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体溶液中で１時間ゆっくり室温で振盪し二次反応を行った。終了後、ＴＢＳＴで５分間、３〜５回洗浄し、さらにＴＢＳ〔２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１５０ｍＭＮａＣｌ，１％ＢＳＡ〕で５分間洗浄した。レプリカフィルターの水滴を濾紙で吸い取った後、発色液〔０．３ｍｇ／ｍｌニトロブルーテトラゾリウム，０．１５ｍｇ／ｍｌ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート，１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ９．５），１００ｍＭＮａＣｌ，５ｍＭＭｇＣｌ₂〕中で発色させた。
ニトロセルロースフィルター上で青く発色した位置に対応するプラークをプレート上より拾い上げ、２次スクリーニング、３次スクリーニングを行うことによってファージの純化を行い、最終的に８つのクローンを得た。
【００４９】
(3) サブクローニング
λＺＡＰIIにクローニングされたＤＮＡ断片はヘルパーファージの働きにより自動的に切り離されて再閉環する。よって、pBluescript SK(-) ファージミドベクターにサブクローニングするため以下の操作を行った。
λＺＡＰII組換え体ファージ１００μｌ（＞１×１０⁵ＰＦＵ）と２００μｌＥ．ｃｏｌｉＸＬ−１Ｂｌｕｅ（ＯＤ₆₀₀＝約１．０），１μｌ ExAssist helper Phage（＞１×１０⁶ＰＦＵ）を混合し、３７℃で１５分間インキュベーションした後、３ｍｌの２×ＹＴ培地（１％ＮａＣｌ，１％イーストエキストラクト，１．６％バクトトリプトン）を加え、更に２．５時間振盪培養した。その後、７０℃で２０分間インキュベーションし、遠心分離（4000×g, 15 分間, 室温) して上清を回収した。このうち、１μｌを２００μｌの E. coli SOLR ^TM (OD₆₀₀＝約１．０）と混合し３７℃で１５分間インキュベーションした後、ＬＢ／Ａｍｐプレート（１．５％アガー，１％ＮａＣｌ，１％バクトトリプトン，０．５％イーストエキストラクト，５０μｇ／ｍｌアンピシリン）にプレーティングし培養後、単一コロニー（ｐＰＯ２，ｐＰＯ３，ｐＰＯ４，ｐＰＯ５，ｐＰＯ６，ｐＰＯ８，ｐＰＯ１７，ｐＰＯ２０）を選び出した。
【００５０】
(4) ｐｒｏＰＯクローンの塩基配列の決定
サブクローニングしたクローンについて制限酵素切断地図を作製したところ、ｐＰＯ２，ｐＰＯ３，ｐＰＯ４，ｐＰＯ８，ｐＰＯ１７，ｐＰＯ２０はその制限酵素部位が類似していることから同一のタンパク質をコードしているクローンであると考えられ、ｐＰＯ１７をその代表として選んだ。さらにｐＰＯ５，ｐＰＯ６はそれぞれ異なったタンパク質をコードし、またｐＰＯ６についてはｐＰＯ２などの一部分のクローンであると考えられる為、ｐＰＯ５をもう一つの候補として選んだ。
そこでｐｒｏＰＯ上のＰＰＡＥによる切断部位の検索のため、ｐＰＯ５，ｐＰＯ１７について切断部位の含まれているであろうと思われるｃＤＮＡ挿入断片５’側の塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定は組換え体プラスミドＤＮＡを鋳型とし AmpliTaq ^RＤＮＡポリメラーゼを用いたTaq DyeDeoxy^TM Terminator Cycle Sequencing kit（アプライドバイオシステムズ社製）によって行った後、ＡＢＩ３７３ＡＤＮＡシークエンサーで解析を行った。その結果（配列表、配列番号５，６）と参考例１にて決定されたアミノ酸配列と照らし合わせ、参考例１で得られたペプチドの組み合わせを決めＰＰＡＥによって認識、切断されるｐｒｏＰＯ上の領域のアミノ酸配列を確定した。該アミノ酸配列とそれに対応するコドンを後記配列表の配列番号５および配列番号６に示す。
これらの配列表から明らかにｐＰＯ５，ｐＰＯ１７の二つのクローンでは異なる配列を示し、ＰＰＡＥによって認識切断されるｐｒｏＰＯタンパクが２種類あることが示された。
【００５１】
実施例１ＰＰＡＥ活性測定
(1) ペプチド合成
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｌｋｏ樹脂〔渡辺化学工業（株）製〕を用いて、ペプチド合成機（ＰＳＳＭ−８型、島津製作所）により下記の配列のペプチドを合成した。
２−Ｐｙｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＯＨ
（配列中、２−Ｐｙｒは２−ピリジル基を示す。）
ペプチド合成は、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｌｋｏ樹脂上のＦｍｏｃ基（９−フルオレニルメトキシカルボニル基）をＤＭＦ中、３０％ピペリジンで処理し末端アミノ基を遊離させ、この遊離アミノ基にＦｍｏｃ−Ｐｈｅを縮合させ、順次Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕおよび２−ピリジルアミノ基導入のための２−Ｐｙｒ−Ａｌａを、この順でＢＯＰ試薬存在下に縮合させる反応を繰り返すことにより行った。
このようにして得られたペプチド鎖が結合する樹脂をメタノールで洗浄後乾燥させ、トリフルオロ酢酸９５０μｌ，チオアニソール５０μｌの溶液中に１時間浸しペプチドを遊離させた。それをトリフルオロ酢酸で洗い、濾液を回収後、無水エチルエーテルを加えて析出した白色沈澱を遠心（2000rpm,６分間，４℃）で集め、減圧乾燥した。更にこれを精製するため、この白色沈澱を３０％酢酸に溶かし、５Ｃ１８逆相クロマトカラム〔和光純薬工業（株）製〕を用いて主要分画を採取して凍結乾燥した。使用直前に０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、合成ペプチド溶液とした。
【００５２】
(2) ＰＰＡＥの精製
家蚕５令幼虫約５００頭より約１００ｇの表皮を切り出し、冷蒸留水で洗浄した後ホモジナイズした。得られたホモジネートは図１に記載のスキームに従い硫安分画をした。
各硫安分画中のＰＰＡＥ活性の検出は、ｐｒｏＰＯを基質として用いてＰＯ活性の出現を観察することにより行った。更に、そのＰＯ活性が添加したｐｒｏＰＯに由来するものであることを確認するため、ｐｒｏＰＯを添加しない同じ分画のＰＯ活性も調べた。これらのＰＯ活性の測定は、基質としてドーパを用い、生成されるドーパクロムの発色によるＯＤ４９０ｎｍの吸光度を測定することによって行った。
その結果、上清１，沈澱２，上清３および沈澱４（図１参照）にＰＰＡＥ活性（ＰＯ活性の出現）を認めたが、上清１および沈澱２にはかなりの、上清３には若干の、元々あるＰＯ活性の存在も認めたため、沈澱４をＰＰＡＥ画分と決定した。その画分を０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中で透析し、ＰＰＡＥ溶液とした。
【００５３】
(3) 液体クロマトグラフィーによるＰＰＡＥ活性測定
０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に適当な濃度で溶解した合成ペプチド溶液５０μｌと０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に０．３６ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解したＰＰＡＥ溶液５０μｌを混合し、３０℃、１０分間加温後、うち１０μｌを液体クロマトグラフィーで分析した〔カラム：Wakosil-5C18〔和光純薬工業（株）製〕 (4.6 i.d.×250 mm）；カラム温度：４０℃；移動相：Ａ緩衝液（50 mM AcONH₄(pH 6.0)-10 % アセトニトリル）；Ｂ緩衝液（50 mM AcONH₄(pH 6.0)- 50 %アセトニトリル）；グラジエント: Ｂ緩衝液０→５０％（０→１５分）；流速：１．５ ml/min ；検出：Ｅｘ３０５ｎｍ，Ｅｍ３７６ｎｍ〕（図２−▲１▼）。対照として、上記合成ペプチド溶液５０μｌに０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）５０μｌを加えたもの（図２−▲２▼）と、０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５０μｌに上記ＰＰＡＥ溶液５０μｌを加えたもの（図２−▲３▼）も同様の操作を行って液体クロマトグラフィーにて分析した。その結果、合成ペプチドの切断断片を確認した。すなわち、図２−▲１▼の液体クロマトグラフィー分析図中の保持時間７．２２５分に合成ペプチドの切断断片を表すピークが出現し、ＰＰＡＥ活性を検出測定することができた。
【００５４】
(4) ＰＰＡＥ濃度と活性の相関関係
０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に適当な濃度で溶解した合成ペプチド溶液５０μｌと０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に０、０．１８、０．３６、０．７２ｍｇ／ｍｌの各濃度で溶解したＰＰＡＥ溶液５０μｌをそれぞれ混合し、３０℃で５分間加温後、うち１０μｌを液体クロマトグラフィーで分析した。その結果現れる合成ペプチドの切断断片のピーク面積をＰＰＡＥ活性値としてＰＰＡＥの濃度との相関関係を調べた。その結果、互いに明らかな相関関係があることが示され（図３）、このペプチドを使ったＰＰＡＥ活性の定量測定が可能であることが判明した。
【００５５】
参考例３ＳＬＰ溶液の調製
家蚕（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）５令幼虫を氷上に１０分間置いて動きを止めた後、サトウキビから精製されたショ糖の２０ｍＭ溶液を家蚕の体重の半分量、第５腹部節と第６腹部節の間に注射した。注射した液が漏れないように縫い糸で第５腹部節の前を縛り、２０分間室温で放置した後、第３腹部節の足を切ってヘモリンパを集めた。
集めたヘモリンパを１５００Ｇで５分間、低温で遠心して血球を除いた。その上清約１００ｍｌを、０．１ｍＭＭＯＰＳ〔３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸〕、０．１ＭＫＣｌ、１％キシリトールからなる溶液３リットルに対して２日間低温下で透析して、目的のＳＬＰ溶液とした。
【００５６】
実施例２ β−１，３−グルカンの測定
(1) 家蚕の体液（ＳＬＰ）を用いたβ−１，３−グルカンの測定
β−１，３−グルカンの代表として、カルボキシメチル−カードラン（ＣＭ−カードラン）を用いた。０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に適当な濃度に溶解した実施例１（１）で調製の合成ペプチド溶液１０μｌ、０．１ＭＭＯＰＳ〔３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸〕、０．１ＭＫＣｌ、１％キシリトールに溶解したＳＬＰ溶液５μｌ、１０ｍＭフェニルチオ尿素１０μｌ、８０ｍＭＣａＣｌ₂１５μｌ、１ｍｇ／ｍｌＣＭ−カードラン５μｌ、０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）１００μｌ、蒸留水５５μｌを混合し、２５℃で２５分間加温後、うち１０μｌを液体クロマトグラフィーで分析した〔カラム：Wakosil-5C18（和光純薬工業（株）製），4.6 i.d.×250 mm；カラム温度：４０℃; 移動相：Ａ緩衝液（50 mM AcONH₄(pH 6.0)-10 % アセトニトリル）；Ｂ緩衝液（50 mM AcONH₄(pH 6.0)- 50 %アセトニトリル）；グラジエント: Ｂ緩衝液０→５０％（０→１５分）；流速：１．５ ml/min ；検出：Ｅｘ３０５ｎｍ，Ｅｍ３７６ｎｍ〕（図４−▲１▼）。対照として、１ｍｇ／ｍｌＣＭ−カードランのかわりに蒸留水を５μｌ余分に加えたもの（図４−▲２▼）も同様の操作を行って液体クロマトグラフィーにて分析した。その結果、保持時間６．２７９分に合成ペプチドの切断断片を示すピークが現れ、β−１，３−グルカンを検出することができた。
なお、使用したＳＬＰ溶液は参考例３に記載の方法により調製した。
【００５７】
(2) β−１，３−グルカン濃度と活性の相関関係
β−１，３−グルカンの代表としてＣＭ−カードランを用いた。
０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に適当な濃度で溶解した実施例１（１）で調製の合成ペプチド溶液１０μｌ、０．１ＭＭＯＰＳ、０．１ＭＫＣｌ、１％キシリトールに溶解したＳＬＰ溶液５μｌ、１０ｍＭフェニルチオ尿素１０μｌ、８０ｍＭＣａＣｌ₂１５μｌ、０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）１００μｌ、蒸留水５５μｌに０、０．１、０．２５、０．５、１．０ｍｇ／ｍｌの各濃度のＣＭ−カードラン５μｌをそれぞれ混合し、２５℃，２５分間加温後、うち１０μｌを液体クロマトグラフィーで分析した。その結果現れる合成ペプチドの切断断片のピーク面積をＰＰＡＥ活性値としてＣＭ−カードランの濃度との相関関係を調べた。その結果、互いに明らかな相関関係があることが示され（図５）、このペプチドを使ったβ−１，３−グルカンの定量測定が可能であることが判明した。
【００５８】
実施例３家蚕の体液（ＳＬＰ）を用いたペプチドグリカンの測定
以下、Micrococcus lysodeikticus （ＩＦＯ３３３３）から超音波破砕で調製したペプチドグリカンを代表として用いて実験を行った。
０．１ＭＭＯＰＳ、０．１ＭＫＣｌ、１％キシリトールに溶解したＳＬＰ溶液８０μｌ、８０ｍＭＣａＣｌ₂７．５μｌ、０．３ｍｇ／ｍｌペプチドグリカン溶液１０μｌ、蒸留水２．５μｌを混合し、３０℃で１０分間加温後、０．５ＭＥＤＴＡ５μｌ、１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）５μｌ、適当な濃度に調製した実施例１（１）で作成の合成ペプチド溶液１０μｌをこの順に加えて混合後、再び３０℃で３０分間加温した。反応終了後、そのうちの５０μｌを液体クロマトグラフィーで分析した（なお、分析条件は実施例２で行ったβ−１，３−グルカンと同じである。）（図６−▲１▼）。対照として、０．３ｍｇ／ｍｌペプチドグリカン溶液の代わりに蒸留水を１０μｌ余分に加えたもの（図６−▲２▼）も同様の操作を行って液体クロマトグラフィーにて分析した。その結果、ペプチドグリカンを加えた場合（図６−▲１▼）のみ、保持時間４．３６分に合成ペプチドの切断断片を示すピークが現れた。すなわち、合成ペプチドを使ってペプチドグリカンを測定することが可能であることが判明した。
なお、使用したＳＬＰ溶液は参考例３に記載の方法により調製した。
【００５９】
参考例４ＰＰＡＥの基質特異性
Ｎ末端に２−ピリジル基（２−Ｐｙｒ）を導入した４種類の配列のペプチド鎖２−Ｐｙｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−＊−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ（なお、＊印はＡｓｎ、Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＧｌｙである）を合成し、蒸留水でそれぞれ０．５ｍｇ／ｍｌ濃度になるように溶解した。これらの溶液１２５μｌに、１０μｇ／ｍｌＰＰＡＥ２５μｌ、１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２５μｌ、５ＭＮａＣｌ２５μｌ、蒸留水５０μｌを加え、２５℃で０、１５、３０分間反応させ、反応毎にその反応液８０μｌずつ取り出し、５０％酢酸２０μｌを加えて反応を止め、さらに蒸留水１００μｌを添加して混合した後、うち１００μｌを液体クロマトグラフィーで分析した。合成ペプチド２−Ｐｙｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−＊−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙを表すピークの面積の１５分間あたりの減少率を基質減少率として算出し、上記４種のペプチド間の比較を行った。
その結果を表１に示す。
【００６０】
【表１】

【００６１】
表１の結果から明らかな如く、＊で示されるアミノ酸残基がＧｌｙである場合には基質減少率が減り、ＰＰＡＥ反応速度が著しく低下することが判る。即ち、この＊で示されるアミノ酸残基がＧｌｙであるペプチドは、ＰＰＡＥ活性測定の基質として適していないことが判る。
【００６２】
【配列表】

【００６３】

【００６４】

20
【００６５】

【００６６】

【００６７】

【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＰＡＥ精製に至る硫安分画の手順を示すスキームを示す図である。
【図２】合成ペプチドを基質としたＰＰＡＥ活性の液体クロマトグラフィー分析結果を示す図である。
【図３】ＰＰＡＥ濃度とＰＰＡＥ活性の相関性を示すグラフである。
【図４】合成ペプチドを基質としＣＭ−カードランの検出結果を示す液体クロマトグラムである。
【図５】ＣＭ−カードラン濃度とＰＰＡＥ活性の相関性を示すグラフである。
【図６】合成ペプチドを基質としてペプチドグリカンの検出結果を示す液体クロマトグラムである。
【符号の説明】
１反応生成物 (2-Pyr-Ala-Leu-Asn-Arg-OH) のピーク
２合成ペプチド（2-Pyr-Ala-Leu-Asn-Arg-Phe-Gly-OH) のピーク[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a method for measuring the activity of prophenol oxidase activating enzyme (hereinafter referred to as PPAE), and a method for measuring β-1,3-glucan and / or peptidoglycan using the method.
[0002]
[Prior art / problems to be solved by the invention]
Insect body fluids have a cascade system consisting of a series of enzymes called a prophenol oxidase activation system (hereinafter referred to as proPO activation system) involved in melanization of body fluids. -1,3-glucan, and / or peptidoglycan, a bacterial cell wall component, is known to trigger this cascade [Onishi, Annot. Zool. Jpn., 27, 33-39 (1954), Ashida and Onishi, Arch. Biochem. Biophys., 122, 411-416 (1967); Brunet, Insect Biochem., 10, 467-500 (1980); Ashida and Yamazaki, Molting and Metamorphosis, 239-265, Japan Sci. Soc Press (1990)]. This includes a β-1,3-glucan recognition protein (βGRP; molecular weight 62 kDa) having specific affinity for β-1,3-glucan in the proPO activation system, and peptidoglycan having specific affinity for peptide glycan This is due to the presence of the recognition protein (PGRP; molecular weight 19 kDa). When the presence of β-1,3-glucan or peptidoglycan is recognized by these proteins, a series of cascade reactions starts. The cascade system is then Ca²⁺PPAE that converts prophenol oxidase (precursor of phenol oxidase: hereinafter referred to as proPO) to phenol oxidase (hereinafter referred to as PO) is produced through several unresolved reactions, including reactions by enzymes that require glycerol. [Ashida and Dohke, Insect Biochem., 10, 37-47 (1980)].
[0003]
Based on these phenomena, β-1,3-glucan, peptidoglycan, etc. using the above cascade reaction as a means for safety testing of therapeutic agents or the like, or means for detecting bacterial infection or fungal infection Various measurement methods have been studied.
[0004]
Currently, there are Limulus test reagents using horseshoe crab blood cell extracts having an in vivo cascade system similar to insects, as reagents for safety tests such as therapeutic drugs or reagents for detecting bacterial infections. However, horseshoe crabs do not have a system that reacts with peptidoglycan, so that only β-1,3-glucan and lipopolysaccharide can be detected. As a result, Gram-positive bacteria without lipopolysaccharide cannot be detected. In addition, horseshoe crab itself as a reagent supply source is a rare animal in Japan, and its future instability is always a problem.
[0005]
On the other hand, when using the insect cascade system (proPO activation system), not only can a stable supply of reagents be expected, but it also has a system that reacts with peptidoglycans as well as fungi, so it is gram positive and negative for bacteria. The whole can be captured without distinction. Further, by removing a component that specifically reacts with peptidoglycan or a component that specifically reacts with β-1,3-glucan from the body fluid, β-1,3-glucan (fungi) or peptidoglycan (bacteria) respectively. It is also possible to measure separately) (Japanese Patent Laid-Open Nos. 63-141598 and 63-141599).
[0006]
As a measuring method using an insect cascade system, there is a method of measuring β-1,3-glucan and peptidoglycan by measuring PO activity generated by converting proPO to PO by PPAE. However, this measurement method has a problem in that it cannot expect a dramatic increase in detection sensitivity and problems such as PO autooxidation which is an unstable enzyme.
In addition, as a measuring method for solving this problem, by measuring the serine protease activity that activates phenol oxidase by using a synthetic peptide as a substrate, the β-1,3-glucan or A method for measuring endotoxin (lipopolysaccharide) has been proposed (Japanese Patent Publication No. 58-502082).
However, the substrate used here was constructed based solely on the fact that PPAE is a serine protease, without considering the substrate specificity of PPAE that catalyzes the conversion of proPO to PO. Therefore, there is a possibility that the PPAE activity, and hence the amount of β-1,3-glucan and endotoxin cannot be accurately measured.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for accurately measuring PPAE activity with high reaction specificity by utilizing the inherent substrate specificity of PPAE. Furthermore, an object of the present invention is to provide an accurate measurement method of β-1,3-glucan and / or peptidoglycan using the PPAE activity measurement method.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of repeating various studies to achieve the above object, the present inventors have succeeded in elucidating the amino sequence of the region recognized and cleaved by PPAE by analyzing the primary structure of proPO, which is the original substrate of PPAE.
The present invention is based on the information obtained in such research, and uses a peptide chain containing a PPAE recognition cleavage site on proPO as a substrate, and a PPAE activity measured by this method. The present invention relates to a method for measuring β-1,3-glucan and / or peptidoglycan using as an index.
[0009]
  That is, the present invention relates to the general formula (I):
X-Arg-Y
  (X is an amino acid residue which may be labeled and whose α-amino group may be protected, orConsisting of 2 to 20 amino acid residues,It is a peptide residue that may be labeled or the N-terminus may be protected. However, the amino acid residues adjacent to Arg are not Gly and Ala. Y is an acid amide bondOrAn organic residue capable of binding to the carboxyl group of Arg by an ester bond;OrAn amino acid residue which may be labeled and whose α-carboxyl group may be protected, orConsisting of 2 to 20 amino acid residues,It is a peptide residue that may be labeled or the C-terminus may be protected. And a peptide chain that can be hydrolyzed to X-Arg and Y by insect-derived PPAEThePPAEIn contact with and produceX-Argas well asAt least one of YMeasure the chemical or physical properties of the compound and measure the activity of prophenoloxidase-activating enzyme based on the measured valueA method for measuring PPAE activity characterized in that [hereinafter, this is also referred to as measurement method (1). In particular, this X is represented by the general formula:
X'-Asn
[X ′ is an amino acid residue that may be labeled or the α-amino group may be protected, or a peptide residue that may be labeled or the N-terminus may be protected (provided that X ′ Less than one amino acid than the number of amino acids possessed byOrThis is a protecting group for the α-amino group of Asn. A group represented byOr/ And Y are the general formula:
Phe-Gly-Z
[Z is an amino acid residue that may be labeled or the α-carboxyl group may be protected, or a peptide residue that may be labeled or the C-terminus may be protected (provided that Y Fewer amino acids than 2 amino acids)OrIt is a protecting group for the carboxyl group of Gly. ] It is related with the measuring method which is group shown. Furthermore, the present invention relates to a method for measuring PPAE activity measured by any measuring means using colorimetry, luminescence, fluorescence, radioactivity, and magnetism.
[0010]
  The present invention also relates to a general formula (I):
X-Arg-Y
(X is an amino acid residue which may be labeled and whose α-amino group may be protected, orConsisting of 2 to 20 amino acid residues,It is a peptide residue that may be labeled or the N-terminus may be protected. However, the amino acid residues adjacent to Arg are not Gly and Ala. Y is an acid amide bondOrAn organic residue capable of binding to the carboxyl group of Arg by an ester bond;OrAn amino acid residue which may be labeled and whose α-carboxyl group may be protected, orConsisting of 2 to 20 amino acid residues,It is a peptide residue that may be labeled or the C-terminus may be protected. And a peptide chain that can be hydrolyzed to X-Arg and Y by insect-derived PPAEThe, ProPO activation systemas well as,β-1,3-glucanAnd / orPeptidoglycanA specimen that may containcontactAnd generateX-Argas well asAt least one of Y, Measured by chemical or physical properties of the compound, and based on the measured value, β-1,3-glucan and / or peptidoglycan in the sample is measuredΒ-1,3-glucanAnd / orPeptidoglycan measurement method [hereinafter also referred to as measurement method (2). In particular, X is a general formula:
X'-Asn
[X ′ is an amino acid residue that may be labeled or the α-amino group may be protected, or a peptide residue that may be labeled or the N-terminus may be protected (provided that X ′ Less than one amino acid than the number of amino acids possessed byOrThis is a protecting group for the α-amino group of Asn. A group represented byOr / andY is a general formula:
Phe-Gly-Z
(Z is an amino acid residue that may be labeled or the α-carboxyl group may be protected, or a peptide residue that may be labeled or the C-terminus may be protected (provided that Y has Less than 2 amino acids than amino acids),OrIt is a protecting group for the carboxyl group of Gly. It is related with the measuring method using group shown by. Furthermore, the present invention relates to β-1,3-glucan measured by any measuring means using colorimetry, luminescence, fluorescence, radioactivity, and magnetism.And / orThe present invention relates to a method for measuring peptidoglycan.
[0011]
Furthermore, the present invention uses a proPO activation system in which the component specifically reacting with peptidoglycan is used in measurement method (2), wherein β-1,3-glucan is measured [hereinafter, measurement method Also called (3). And a proPO activation system in which a component that specifically reacts with β-1,3-glucan is removed in the measurement method (2) [hereinafter, measurement method (4) Also called. ] Concerning.
[0012]
In the PPAE activity measurement method (1) of the present invention, by measuring at least one of the reaction products X-Arg and Y generated by contacting PPAE with the peptide chain: X-Arg-Y as a substrate, This is a method for measuring PPAE activity.
X-Arg-Y as a substrate is a peptide chain composed of two or more amino acid residues, and is not particularly limited as long as the following conditions are satisfied.
(1) Decomposed into X-Arg and Y by insect-derived PPAE.
(2) At least one of X-Arg and Y decomposed and formed by PPAE can be measured based on the chemical property or physical property.
(3) The α-amino group of Arg is bonded to an amino acid residue, and the amino acid residue is Gl
It is not y and Ala.
[0013]
In addition, a peptide chain is used in the meaning including a peptide and a peptide derivative. Examples of peptide derivatives include those having a protecting group at the N-terminus and / or C-terminus of the peptide, those labeled with amino acid residues in the peptide, and the like.
[0014]
X and Y bonded to Arg are not particularly limited as long as the above conditions are satisfied.
[0015]
Examples of X include amino acid residues other than Gly and Ala, and peptide residues whose C-terminal side amino acid residue is not Gly or Ala. In addition, the amino acid residue may be labeled or its α-amino group may be protected. Similarly, the peptide residue may be labeled or its N-terminus may be protected.
Preferably, X is X′-Asn [X ′ is an amino acid residue that may be labeled or an α-amino group may be protected, or may be labeled, and the N-terminus may be protected. Or a protecting group for the α-amino group of Asn. ] Is a group represented by
More preferably, X is a rabbit (Bombyx  mori) For the proPO amino acid sequence
X = Phe-Gln-Leu-Thr-Glu-Gln-Phe-Leu-Thr-Glu-Asp-Tyr-Ala-Asn-Asn-Gly-Ile-Glu-Leu-Asn-Asn
Or the following formula
X = Tyr-Gln-Arg-Val-Ser-Asn-Ala-Ile-Gly-Asn
Is a group having at least two amino acid residues on the C-terminal side. The number of amino acid residues to be contained is preferably 2-20.
[0016]
Here, the protecting group at the N-terminal of the peptide residue, the protecting group of the α-amino group of the amino acid residue and the protecting group of the α-amino group of Asn generally mean a group capable of protecting the α-amino group of the amino acid residue. Examples thereof include a carbobenzoxy group, a succinyl group, and an alkoxycarbonyl group having 2 to 18 carbon atoms.
[0017]
Examples of Y of X-Arg-Y include an organic residue that can be bonded to the carboxyl group of Arg by an acid amide bond or an ester bond, or an amino acid residue or a peptide residue. In addition, the amino acid residue may be labeled or its α-carboxyl group may be protected. Similarly, the peptide residue may be labeled or its C-terminal may be protected.
[0018]
As used herein, the “organic residue” is an acid residue bonded to the carboxyl group of Arg by an acid amide bond or an ester bond, and is released from X-Arg in the presence of PPAE, and the organic residue (Y) itself is physically That can be detected manually or chemically, or that are cleaved from X-Arg-Y to become X-Arg and Y, thereby changing the characteristics of the measurement system, and the change can be measured physically or chemically If it is, it will not specifically limit.
Typical examples include color-forming groups such as p-nitroanilino group and 2-chloro-4-nitroanilino group, such as 2-pyridylamino group, 3-pyridylamino group, β-naphthylamino group, 7-amino-4-methylcoumarino. A group having fluorescence such as a group, 7-hydroxy-4-methylcomarino group, for example,¹²⁵I and¹⁴C,^ThreeExamples include organic residues labeled with isotopes such as H, groups having magnetic properties, and the like, but it is needless to say that the organic residues are not limited to these organic residues.
[0019]
The “peptide residue” with respect to Y is preferably Phe-Gly-Z [Z may be an amino acid residue that may be labeled, an α-carboxyl group may be protected, or a label. In addition, it is a peptide residue whose C-terminus may be protected (however, the number of amino acids is 2 less than the number of amino acids Y has), or a protective group for the carboxyl group of Gly. ] Can be expressed.
More preferably, rabbit (Bombyx  mori) For the proPO amino acid sequence
Y = Phe-Gly-Asp-Asp-Ala-Ser-Glu-Lys-Ile-Pro-Leu-Lys-Asn-Leu-Ser-Leu-Pro-Glu-Phe-Lys-Ile
Or the following formula
Y = Phe-Gly-Ser-Asp-Ala-Gly-Arg-Met-Ile-Pro
Is a group having at least two amino acid residues on the N-terminal side. The number of amino acid residues contained is preferably 2-20.
The “amino acid residue” is not particularly limited, but Phe is preferably exemplified.
[0020]
Here, the protecting group at the C-terminal of the peptide residue, the protecting group for the α carboxyl group of the amino acid residue and the protecting group for the carboxyl group of Gly mean a general group capable of protecting the α carboxyl group of the amino acid residue, Typical examples include aralkyloxy groups such as benzyloxy group and phenethyloxy group.
[0021]
In the present invention, the “label” is particularly limited as long as a peptide residue or a part of an amino acid residue is modified or substituted, and as a result, a compound having such a peptide residue or amino acid residue can be identified. Not.
Examples of the labeling substance relating to such labeling include alkaline phosphatase, β-galactosidase, peroxidase, microperoxidase, glucose oxidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, malate dehydration used in EIA (enzyme immunoassay). Used in enzymes such as elementary enzymes and luciferases such as RIA (radioimmunoassay)^99mTc,¹³¹I,¹²⁵I,¹⁴C,^ThreeRadioactive isotopes such as H, fluorescent substances such as fluorescein, dansyl, fluorescamine, coumarin, naphthylamine or their derivatives used in 2-aminopyridine, 3-aminopyridine or FIA (fluoroimmunoassay), such as luciferin, isoluminol, Luminol, luminescent materials such as bis (2,4,6-trifluorophenyl) oxalate, for example, materials having absorption in the ultraviolet region such as phenol, naphthol, anthracene, or derivatives thereof, such as 4-amino-2,2, 6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl, 3-amino-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine-1-oxyl, 2,6-di-t-butyl-α- (3,5-di -t-Butyl-4-oxo-2,5-cyclohexadiene-1-ylidene) -p-tolyloxyl and other spin labels represented by compounds having an oxyl group Although materials and the like having a property as agent, it is needless to say not limited thereto.
[0022]
The insects (Insecta) from which PPAE is derived are not particularly limited, but those with established breeding methods are preferred. For example, lepidoptera such as silkworm and tobacco tin mega, diptera such as house fly and sentinum fly, straight ostrich such as Tonaba grasshopper and enma cricket, and Coleopteran such as Sennokamikiri.
Insects include all forms regardless of larvae or adults. Insects belonging to complete metamorphosis such as Lepidoptera, Diptera and Coleoptera are preferably larvae rather than adults because of their easy acquisition.
[0023]
In the PPAE activity measurement method of the present invention, the PPAE to be contacted with X-Arg-Y is not particularly limited as long as it is PPAE itself derived from insects or contains it. As the material containing PPAE, an insect body fluid is preferable. Examples of the body fluid include hemolymph that is generally obtained from the body cavity of insects because of its ease of acquisition.
The method for obtaining hemolymph is not particularly limited. Preferably, after the insect is placed on ice and stopped moving, sucrose containing impurities such as sugarcane factor (a high-molecular substance composed of glucose and amino acids contained in sugarcane), or physiological saline containing the sugarcane factor itself is injected into the body cavity. And then collecting from the body cavity after leaving for a while.
Furthermore, the hemolymph collected by the above method can be centrifuged to remove blood cells, and then plasma obtained by dialysis can be used.
[0024]
The PPAE activity measurement method of the present invention is carried out by measuring a reaction product produced by contacting the above-mentioned peptide chain X-Arg-Y with PPAE present in an insect body fluid or the like.
Any method based on the chemical or physical properties of at least one of the reaction products X-Arg and Y can be used to detect the reaction product.
For example, absorbance measurement method, colorimetric method, fluorescence method [reference “illustrated fluorescent antibody”, Soft Science Co., Ltd.], luminescence method [reference “enzyme immunoassay” protein nucleic acid enzyme, separate volume No. 31, pages 251-263 , Kyoritsu Shuppan Co., Ltd.], RIA method (reference "medical chemistry experiment course" Vol. 8, Nakayama Shoten), EIA method [reference "enzyme immunoassay" protein nucleic acid enzyme, separate volume No. 31, pages 51-63, Kyoritsu Publishing Co., Ltd.], nuclear magnetic resonance spectroscopy [reference “enzyme immunoassay” protein nucleic acid enzyme, separate volume No. 31, pages 264-271, Kyoritsu Publishing Co., Ltd.] and the like.
[0025]
Specifically, the following method is exemplified.
When Y is a chromogenic group such as a p-nitroanilino group, the change in absorbance (absorption curve) of the system before and after the reaction can be measured according to a conventional method, and Y is a fluorescent property such as a β-naphthylamino group. In the case of a group having, the change in fluorescence intensity of the system before and after the reaction can be measured according to a conventional method. Y is¹⁴C or^ThreeIn the case of an organic residue labeled with an isotope such as H, liquid chromatography, electrophoresis, etc. using X-Arg and Y by utilizing their molecular weight, hydrophobicity, hydrophilicity, etc. After separation, the production of Y can be measured by a detection method according to the isotope line type. In the case where Y is an organic residue having magnetic properties, it can be measured using the fact that X-Arg is released from X-Arg-Y that can be fixed to a solid phase carrier using magnetic force.
[0026]
In particular, even if Y itself does not have detection characteristics such as fluorescence, X-Arg and Y can be compared with X-Arg and Y by liquid chromatography or electrophoresis using the difference in characteristics such as molecular weight and hydrophobicity. It is also possible to measure by detecting the absorbance after separation. In this case, if X-Arg has characteristics such as color development, fluorescence, luminescence, and radiation, the amount of X-Arg produced or the remaining amount of X-Arg-Y is detected by the corresponding detection means. Can also be measured.
[0027]
When X is labeled with an enzyme, the activity of PPAE can be measured by contacting X-Arg or X-Arg-Y with a substance that can be a substrate of the enzyme and measuring the change in the substrate. it can. For example, when X is labeled with peroxidase, if 5-aminosalicylic acid, o-phenylenediamine or the like is used as a substrate, the change in absorbance (colorimetric method) can be changed to 3- (p-hydroxyphenyl) propionic acid or the like. If it is used, it can be detected by a fluorescence method. When X is labeled with alkaline phosphatase, the colorimetric method is used when p-nitrophenyl phosphate is used as the substrate, and the fluorescence method is used when 4-methylumbelliferyl phosphate is used. If -4- (3-phosphatephenyl) spiro [1,2-dioxetane-3,2′-adamantane] disodium salt (AMPPD) is used, it can be detected by a luminescence method.
[0028]
The β-1,3-glucan or / and peptidoglycan measurement method (2) of the present invention comprises a peptide chain represented by the aforementioned general formula (I), a proPO activation system and a β-1,3-glucan or / and Method for detecting and quantifying β-1,3-glucan and / or peptidoglycan using PPAE activity measured by measuring at least one of X-Arg and Y produced by contacting peptidoglycan together as an index It is.
That is, in the measurement method (2), the proPO activation system is activated by the presence of β-1,3-glucan or / and peptidoglycan, and the resulting PPAE activity is used as an index to determine whether β-1,3-glucan or / And the above-mentioned PPAE activity measurement method (1) is used for detecting PPAE activity as an index.
[0029]
The proPO activation system includes a component that specifically recognizes β-1,3-glucan and / or a component that specifically recognizes peptidoglycan, and a β-1,3-glucan or / and peptidoglycan Triggered by its presence, the result is proBAEEase (a precursor of an enzyme with the activity of hydrolyzing benzoylarginine ethyl ester), proPPAE (a precursor of a serine protease that activates proPO), and at least three precursors of proPO A cascade system consisting of a series of activated enzymes.
[0030]
The proPO activation system used in the measurement method (2) of the present invention may be the proPO activation system itself or a system containing the system. Insect body fluids are preferred as those containing the proPO activation system.
Examples of the insect body fluid used include hemolymph obtained from the insect body cavity as described above. The method for obtaining hemolymph is exemplified by the same method as described above, and the types of insects that can be used are also the same as described above.
[0031]
Examples of β-1,3-glucan to be measured in the present invention include β-1,3-bonded glucose polymers and derivatives thereof such as zymosan, curdlan, pachyman, sclerotane, lentinan, schizophyllan, coriolan, laminaran. , Lichenan, and derivatives thereof, but are not particularly limited thereto.
[0032]
The peptidoglycan to be measured in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include cell wall constituents of various bacteria (eg, Micrococcus genus, Streptococcus genus, Aureobacterium genus, Bacillus genus, Agrobacterium genus, etc.).
[0033]
The measuring method (2) of the present invention is a method for specifically detecting and quantifying β-1,3-glucan or / and peptidoglycan. According to this method, β-1,3-glucan or / and peptidoglycan is used. It is also possible to discriminate a specimen containing γ, and to quantitatively measure β-1,3-glucan and / or peptidoglycan in the specimen.
[0034]
The measurement method (2) includes a specimen to be measured that may contain β-1,3-glucan or / and peptidoglycan, a solution containing a peptide chain defined by the general formula (I), and a proPO activation system A solution containing a solution, preferably an insect body fluid, is mixed well to obtain a reaction solution, and PPAE activity in the reaction solution after a certain period of time is measured by measuring the generated X-Arg or Y by the above-described measurement method (1). Is done by.
[0035]
The concentration of the peptide chain to be used may be a concentration that can be detected, and is appropriately prepared according to the measurement system. The amount of the proPO activation system may be an amount that allows the proPO cascade system to work, and is appropriately prepared according to the measurement system.
The reaction pH is usually pH 4-11, preferably pH 6-9. In addition, a buffer solution may be used to maintain such a pH value, and the type and concentration used are not particularly limited as long as the buffer solution does not affect the reaction. For example, phosphate buffer, borate buffer, acetate buffer, Tris buffer, Good buffer and the like are exemplified.
In addition, the reaction temperature and reaction time are not particularly limited as long as the reaction proceeds at the temperature and time. As reaction temperature, 0-50 degreeC is mentioned normally, Preferably 4-30 degreeC is mentioned. The reaction time is usually 1 second to 20 hours, preferably 10 seconds to 2 hours.
The measurement system also includes a divalent metal ion in the range of 0.001 to 1000 mM, preferably 5 to 100 mM, such as Ca.²⁺, Mg²⁺Etc. are preferably present.
[0036]
In this β-1,3-glucan or / and peptidoglycan measurement method (2), when both β-1,3-glucan and peptidoglycan are present in the sample, the PPAE activity obtained is β-1, It is shown as the sum of 3-glucan and peptidoglycan.
[0037]
On the other hand, the measurement method (3) of the present invention is a method for specifically detecting and quantifying β-1,3-glucan, and the measurement method (4) of the present invention is a method for specifically detecting and quantifying peptidoglycan. It is.
The measurement method (3) of β-1,3-glucan is carried out by using a proPO activation system in which a component that specifically reacts with peptidoglycan in the above-described measurement method (2) has been removed in advance. Examples of the component that specifically reacts with peptidoglycan include peptidoglycan recognition protein.
[0038]
Moreover, the measurement method (4) of peptidoglycan uses the proPO activation system from which the component specifically reacting with β-1,3-glucan has been removed in the above-described measurement method (2). Done. Examples of the component that specifically reacts with β-1,3-glucan include β-1,3-glucan recognition protein.
[0039]
Methods for removing components that specifically react with peptidoglycan or β-1,3-glucan from the proPO activation system include gel filtration, electrophoresis, affinity chromatography, ion exchange chromatography, centrifugation Any of the separation and purification methods generally used in the field of biochemistry such as the method can be used. Preferably, affinity chromatography using a carrier to which peptidoglycan is bound is exemplified as a method for removing a component that specifically reacts with peptidoglycan (Japanese Patent Laid-Open No. 63-141599), and β-1,3- A method for removing a component that specifically reacts with glucan is exemplified by affinity chromatography using a carrier to which β-1,3-glucan is bound (Japanese Patent Laid-Open No. 63-14198).
[0040]
【The invention's effect】
According to the present invention, accurate quantitative measurement of PPAE activity becomes possible, and as a result, an accurate measurement method of β-1,3-glucan and / or peptidoglycan using this PPAE activity as an index can be provided.
Furthermore, the present invention enables detection of fungi and bacteria without causing growth by a culture method or the like, and thus enables early diagnosis of these microbial infections. In addition, it can be widely used for microbial contamination tests in water, foods, etc. and safety tests such as therapeutic drugs (antibiotics, injectable preparations).
[0041]
[Examples and Reference Examples]
In order to describe the present invention in more detail, examples and reference examples will be given, but the present invention is not limited to these examples.
[0042]
Reference Example 1 Determination of the amino acid sequence of the PPAE recognition cleavage site on rabbit proPO
(1) Purification of rabbit proPO
Saturated ammonium sulfate (pH 6.5) was added to about 200 ml of hemolymph obtained from 5th instar larvae to prepare a 70% ammonium sulfate solution, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. overnight. Thereto was added 0.2 M potassium phosphate buffer (pH 6.5) to obtain a 40% ammonium sulfate solution. After slowly stirring for 2 hours, the mixture was allowed to stand and centrifuged at 8000 rpm for 20 minutes (Hitachi RPR9-2 rotor, the same applies hereinafter) to obtain a supernatant. Saturated ammonium sulfate (pH 6.5) was added to the supernatant to make a 50% ammonium sulfate solution, which was allowed to stand overnight. This was further centrifuged at 8000 rpm for 20 minutes to obtain a precipitate. This precipitate was dissolved in 0.1M potassium phosphate buffer (pH 6.5) -20% ammonium sulfate solution (pH 6.5), and saturated ammonium sulfate (pH 6.5) was further added to obtain a 38% ammonium sulfate solution. The mixture was stirred for 1 hour and allowed to stand for 2.5 hours, and then centrifuged at 10,000 rpm for 20 minutes to obtain a supernatant. Saturated ammonium sulfate (pH 6.5) was added to the supernatant to make a 48% ammonium sulfate solution. This was stirred for 30 minutes, then allowed to stand overnight, and centrifuged at 8000 rpm for 20 minutes to obtain a precipitate. This precipitate was dissolved in 0.01 M potassium phosphate buffer and dialyzed in the same buffer.
[0043]
The dialyzed sample was centrifuged at 12,000 rpm for 20 minutes, and the resulting supernatant was heated to 54.5 ° C. while stirring in a 65 ° C. water bath, and further heated in a 55 ° C. water bath for 5 minutes. After quenching with ice, the mixture was centrifuged at 18000 rpm for 20 minutes to obtain a supernatant.
This supernatant was subjected to DEAE cellulose column chromatography [manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., φ1.5 × 19 cm], and eluted with a KCl gradient for fractionation. The proPO fraction was collected by examining the presence or absence of PO activity that appeared after activation using crude PPAE. The collected proPO fraction was dialyzed in 0.04M KCl-0.01M potassium phosphate buffer (pH 6.0).
Furthermore, this sample was subjected to hydroxyapatite column chromatography [manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., φ1.5 × 9.3 cm], and eluted with 50 mM, 75 mM, and 95 mM potassium phosphate buffers (pH 6.0). The PO activity in each fraction obtained was measured according to the method described above. As a result, elution of proPO was confirmed with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0), and this fraction was collected.
The fraction was concentrated with a Sartorius Collodion Bag (SM13200) and dialyzed in 0.01 M Tris-HCl buffer (pH 7.75) to obtain a purified proPO solution.
[0044]
(2) Purification of PPEA
Homogenate obtained from the skin of 5th instar larvae was fractionated with ammonium sulfate, and 0.2-0.4% ammonium sulfate fraction was collected, and 0.01M Tris-HCl-0.01M CaCl.₂After dialyzing in (pH 8.5), it was further dialyzed in 0.01 M Tris-HCl buffer (pH 8.5). This was applied to a DEAE cellulose column and eluted with 0.01 M Tris-HCl buffer (pH 8.5). Among these, fractions showing PPAE activity were collected, and this was further applied to a hydroxyapatite column, washed with 0.01 M potassium phosphate buffer (pH 7.5), and then 0.01 to 0.5 M potassium phosphate buffer (pH 7. Elution was performed with the linear gradient of 5). Among these, fractions showing PPAE activity were collected to obtain a purified PPAE solution.
[0045]
(3) Amino acid sequence analysis of peptide fragments obtained by cleaving proPO with PPAE
The above purified proPO is incubated with purified PPAE, the reaction solution is applied to a Sephadex G-50 column, eluted with 0.01 M potassium phosphate buffer (pH 8.0), and released from the peptide chain cleaved from proPO Collected. Subsequently, this peptide chain was divided into three types of fragments (fI, fII, fIII) using an ODS column. These were each fragmented by lysyl endopeptidase treatment, and then the amino acid sequence of each fragment was examined by Edman degradation. As a result, it was found that fI and fII are fragments (Sequence Listing, SEQ ID NO: 2) having the same sequence although there are some differences in modification, and fIII is a different amino acid sequence (Sequence Listing, SEQ ID NO: 1) ).
[0046]
(4) Analysis of the amino acid sequence at the N-terminus of PO produced by cleaving the above peptide from proPO with PPAE
ProPO in 0.01 M potassium phosphate buffer (pH 7.5) was incubated with thiourea and PPAE in 75 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) for 3 hours at 0 ° C. to convert all proPO to PO. . This reaction solution was divided into two main fractions using an ODS column, and the amino acid sequence of each N-terminal was determined by the Edman degradation method (sequence table, SEQ ID NOs: 3 and 4).
[0047]
Reference Example 2 Determination of DNA base sequence of PPAE recognition cleavage site on type IV proPO
(1) Preparation of rabbit cDNA library
25 ml of body fluid was collected from 500 larvae of 5th instar rabbits, and centrifuged (40 G, 15 minutes, 4 ° C.) to precipitate blood cells. About 800 μg of total RNA was prepared from these blood cells using an RNA extraction kit ISOGEN (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
From this total RNA, mRNA was purified using mRNA Purification Kit (Pharmacia), and cDNA was synthesized using cDNA Synthesis Kit (Pharmacia). The synthesized cDNA was cloned into the EcoRI site of the λZAPII phage vector and packaged in vitro using Gigapack Gold packaging extract (Stratagene). As a result, 4.2 × 10^FiveA phage library of plaque forming unit (PFU) was obtained.
[0048]
(2) ProPO clone screening
PicoBlue for proPO clone screening^TM An immunoscreening kit (Stratagene) was used.
1.5 × 10^FourPFU Rabbit cDNA Phage Library and 200 μl E. coli XL-1 Blue (OD₆₀₀= About 0.5) and incubated at 37 ° C for 15 minutes before NZY plates (1.5% agar, 1% NZ amine, 0.2% MgSO)_Four・ 7H₂O, 0.5% Bacto yeast extract, 0.5% NaCl, 12.5 μg / ml tetracycline: pH 7.5) and cultured at 42 ° C. for about 3.5 hours. At the stage of appearance of the plaque, cover with a nitrocellulose filter (Amersham) soaked with 10 mM IPTG (isopropylthiogalactoside), and further cultured at 37 ° C. for 3.5 hours, carefully remove the nitrocellulose filter with tweezers and remove TBST [ 20 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.05% (V / V) Tween 20] was washed 3 to 5 times for 15 minutes.
In order to prepare two replica filters for screening on the same plate, the first filter was peeled off, and another nitrocellulose filter soaked with 10 mM IPTG was placed on the plate and cultured at 37 ° C. for 4 hours. The second filter was washed in the same manner as the first filter.
This operation is performed for 20 plates for a total of about 3.0 × 10.^FiveA replica filter having a single plaque was prepared.
These filters were gently shaken in a blocking solution [1% BSA, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl] for 1 hour, and then transferred to an anti-proPO rabbit antibody solution appropriately diluted with the blocking solution. Shake slowly for 1 hour at room temperature. The replica filter after completing the primary reaction was washed with TBST for 3-5 times each time, and then shaken slowly in an alkaline phosphatase-labeled anti-rabbit IgG goat antibody solution appropriately diluted with a blocking solution for 1 hour at room temperature. Reaction was performed. After completion, the plate was washed 3 to 5 times with TBST for 5 minutes, and further washed with TBS [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% BSA] for 5 minutes. After the water droplets of the replica filter were blotted with filter paper, the color developing solution [0.3 mg / ml nitro blue tetrazolium, 0.15 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, 100 mM Tris-hydrochloric acid (pH 9. 5), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂The color was developed.
The plaques corresponding to the blue-colored positions on the nitrocellulose filter were picked up from the plate and purified by performing secondary screening and tertiary screening, and finally eight clones were obtained.
[0049]
(3) Subcloning
The DNA fragment cloned into λZAPII is automatically cleaved and reclosed by the helper phage. Therefore, the following operation was performed for subcloning into the pBluescript SK (-) phagemid vector.
100 μl of λZAPII recombinant phage (> 1 × 10^FivePFU) and 200 μl E.I. E. coli XL-1 Blue (OD₆₀₀= Approx. 1.0), 1 μl ExAssist helper Phage (> 1 × 10⁶PFU) was mixed and incubated at 37 ° C. for 15 minutes, 3 ml of 2 × YT medium (1% NaCl, 1% yeast extract, 1.6% bactotryptone) was added, and the mixture was further shaken for 2.5 hours. did. Thereafter, the mixture was incubated at 70 ° C. for 20 minutes, and centrifuged (4000 × g, 15 minutes, room temperature) to recover the supernatant. Of these, 1 μl was replaced with 200 μl of E. coli SOLR.^TM (OD₆₀₀= About 1.0) and incubated at 37 ° C. for 15 minutes, then LB / Amp plate (1.5% agar, 1% NaCl, 1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 50 μg / ml) After plating on ampicillin) and culturing, single colonies (pPO2, pPO3, pPO4, pPO5, pPO6, pPO8, pPO17, pPO20) were selected.
[0050]
(4) Determination of base sequence of proPO clone
When a restriction enzyme cleavage map was prepared for the subcloned clone, pPO2, pPO3, pPO4, pPO8, pPO17, and pPO20 were considered to be clones encoding the same protein because their restriction enzyme sites were similar. PPO17 was selected as the representative. Furthermore, since pPO5 and pPO6 each encode a different protein, and pPO6 is considered to be a partial clone such as pPO2, pPO5 was selected as another candidate.
Therefore, in order to search for the cleavage site by PPAE on proPO, the nucleotide sequence on the 5 'side of the cDNA insert fragment, which seems to contain the cleavage site, was determined for pPO5 and pPO17. The nucleotide sequence was determined using AmpliTaq using recombinant plasmid DNA as a template.^RTaq DyeDeoxy using DNA polymerase^TM After using a Terminator Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems), analysis was performed with an ABI 373A DNA sequencer. The region on proPO that is recognized and cleaved by PPAE by determining the combination of the peptides obtained in Reference Example 1 by comparing the results (Sequence Listing, SEQ ID NOs: 5 and 6) with the amino acid sequence determined in Reference Example 1 The amino acid sequence of was confirmed. The amino acid sequence and codon corresponding thereto are shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 in the Sequence Listing described later.
These sequence listings clearly show that the two clones of pPO5 and pPO17 show different sequences and that there are two types of proPO proteins that are recognized and cleaved by PPAE.
[0051]
Example 1 PPAE activity measurement
(1) Peptide synthesis
Using Fmoc-Gly-Alko resin [manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.], peptides having the following sequences were synthesized by a peptide synthesizer (PSSM-8 type, Shimadzu Corporation).
2-Pyr-Ala-Leu-Asn-Arg-Phe-Gly-OH
(In the sequence, 2-Pyr represents a 2-pyridyl group.)
In peptide synthesis, the Fmoc group (9-fluorenylmethoxycarbonyl group) on the Fmoc-Gly-Alko resin was treated with 30% piperidine in DMF to release the terminal amino group, and Fmoc-Phe was added to this free amino group. By repeating the reaction of condensing and sequentially condensing Fmoc-Arg, Fmoc-Asn, Fmoc-Asn, Fmoc-Leu and 2-Pyr-Ala for introducing 2-pyridylamino group in this order in the presence of BOP reagent went.
The resin bound to the peptide chain thus obtained was washed with methanol and dried, and then immersed in a solution of 950 μl of trifluoroacetic acid and 50 μl of thioanisole for 1 hour to release the peptide. It was washed with trifluoroacetic acid, and the filtrate was recovered. Then, anhydrous ethyl ether was added, and the precipitated white precipitate was collected by centrifugation (2000 rpm, 6 minutes, 4 ° C.) and dried under reduced pressure. In order to further purify this, this white precipitate was dissolved in 30% acetic acid, and the main fraction was collected using a 5C18 reverse phase chromatography column (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and lyophilized. Immediately before use, it was dissolved in 0.01 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) to obtain a synthetic peptide solution.
[0052]
(2) Purification of PPAE
About 100 g of epidermis was cut out from about 500 5th instar larvae, washed with cold distilled water, and homogenized. The obtained homogenate was subjected to ammonium sulfate fractionation according to the scheme shown in FIG.
The PPAE activity in each ammonium sulfate fraction was detected by observing the appearance of PO activity using proPO as a substrate. Furthermore, in order to confirm that the PO activity was derived from the added proPO, the PO activity of the same fraction without the addition of proPO was also examined. These PO activities were measured by measuring absorbance at OD 490 nm due to color development of dopachrome produced using dopa as a substrate.
As a result, PPAE activity (appearance of PO activity) was observed in the supernatant 1, the precipitate 2, the supernatant 3 and the precipitate 4 (see FIG. 1). Also recognized the presence of some original PO activity, so precipitate 4 was determined to be the PPAE fraction. The fraction was dialyzed in 0.01 M Tris-HCl buffer (pH 8.5) to obtain a PPAE solution.
[0053]
(3) PPAE activity measurement by liquid chromatography
Synthetic peptide solution 50 μl dissolved in 0.01 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) and PPAE dissolved in 0.01 M Tris-HCl buffer (pH 8.5) at a concentration of 0.36 mg / ml 50 μl of the solution was mixed and heated at 30 ° C. for 10 minutes, 10 μl of which was analyzed by liquid chromatography [column: Wakosil-5C18 [manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.] (4.6 id × 250 mm); column temperature : 40 ° C; mobile phase: A buffer (50 mM AcONH_Four(pH 6.0) -10% acetonitrile); B buffer (50 mM AcONH)_Four(pH 6.0) -50% acetonitrile); Gradient: B buffer 0 → 50% (0 → 15 min); Flow rate: 1.5 ml / min; Detection: Ex305 nm, Em376 nm] (FIG. 2- (1)). As controls, 50 μl of the above synthetic peptide solution plus 50 μl of 0.01M Tris-HCl buffer (pH 8.5) (FIG. 2- (2)) and 0.01 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) A solution obtained by adding 50 μl of the PPAE solution to 50 μl (FIG. 2- (3)) was analyzed by liquid chromatography by performing the same operation. As a result, a cleaved fragment of the synthetic peptide was confirmed. That is, a peak representing a cleaved fragment of the synthetic peptide appeared at a retention time of 7.225 minutes in the liquid chromatographic analysis diagram of FIG. 2- (1), and PPAE activity could be detected and measured.
[0054]
(4) Correlation between PPAE concentration and activity
Synthetic peptide solution 50 μl dissolved in 0.01 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) at an appropriate concentration and 0.01 M Tris-HCl buffer (pH 8.5) 0, 0.18, 0.36, 0 50 μl of PPAE solution dissolved at each concentration of .72 mg / ml was mixed, heated at 30 ° C. for 5 minutes, and 10 μl of which was analyzed by liquid chromatography. The peak area of the cleaved fragment of the synthetic peptide appearing as a result was taken as the PPAE activity value, and the correlation with the PPAE concentration was examined. As a result, it was shown that there was a clear correlation with each other (FIG. 3), and it was found that quantitative measurement of PPAE activity using this peptide was possible.
[0055]
Reference Example 3 Preparation of SLP solution
Rabbit (Bombyx  mori) The 5th instar larvae were placed on ice for 10 minutes to stop the movement, and then a 20 mM solution of sucrose purified from sugarcane was injected between half the body weight of the rabbit and between the 5th and 6th abdominal nodes. The front of the fifth abdominal node was tied up with a sewing thread so that the injected liquid did not leak, and left at room temperature for 20 minutes, and then the leg of the third abdominal node was cut to collect hemolymph.
The collected hemolymph was centrifuged at 1500 G for 5 minutes at low temperature to remove blood cells. About 100 ml of the supernatant was dialyzed at a low temperature for 2 days against 3 liters of a solution consisting of 0.1 mM MOPS [3- (N-morpholino) propanesulfonic acid], 0.1 M KCl, 1% xylitol. SLP solution.
[0056]
Example 2 Measurement of β-1,3-glucan
(1) Measurement of β-1,3-glucan using rabbit body fluid (SLP)
As a representative of β-1,3-glucan, carboxymethyl-curdlan (CM-curdlan) was used. 10 μl of the synthetic peptide solution prepared in Example 1 (1) dissolved in 0.01 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) at an appropriate concentration, 0.1 M MOPS [3- (N-morpholino) propanesulfonic acid] 0.1 μM KCl, 5 μl of SLP solution dissolved in 1% xylitol, 10 μl of 10 mM phenylthiourea, 80 mM CaCl₂15 μl, 1 mg / ml CM-curdlan 5 μl, 0.01 M Tris-hydrochloric acid buffer (pH 8.5) 100 μl, distilled water 55 μl were mixed and heated at 25 ° C. for 25 minutes, 10 μl of which was analyzed by liquid chromatography [Column: Wakosil-5C18 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 4.6 id × 250 mm; column temperature: 40 ° C .; mobile phase: A buffer (50 mM AcONH_Four(pH 6.0) -10% acetonitrile); B buffer (50 mM AcONH)_Four(pH 6.0) -50% acetonitrile); Gradient: B buffer 0 → 50% (0 → 15 min); Flow rate: 1.5 ml / min; Detection: Ex305 nm, Em376 nm] (FIG. 4- (1)). As a control, 5 μl of distilled water added in place of 1 mg / ml CM-curdlan (FIG. 4- (2)) was subjected to the same operation and analyzed by liquid chromatography. As a result, a peak indicating a cleaved fragment of the synthetic peptide appeared at a retention time of 6.279 minutes, and β-1,3-glucan could be detected.
The SLP solution used was prepared by the method described in Reference Example 3.
[0057]
(2) Correlation between β-1,3-glucan concentration and activity
CM-curdlan was used as a representative of β-1,3-glucan.
10 μl of the synthetic peptide solution prepared in Example 1 (1) dissolved in 0.01 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) at an appropriate concentration, dissolved in 0.1 M MOPS, 0.1 M KCl, 1% xylitol 5 μl of SLP solution, 10 μl of 10 mM phenylthiourea, 80 mM CaCl₂15 μl, 0.01 μM Tris-HCl buffer (pH 8.5) 100 μl, distilled water 55 μl, 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0 mg / ml CM-curdlan 5 μl After mixing each mixture and heating at 25 ° C. for 25 minutes, 10 μl of the mixture was analyzed by liquid chromatography. The peak area of the resulting synthetic peptide cleaved fragment was taken as the PPAE activity value and the correlation with the CM-curdlan concentration was examined. As a result, it was shown that there was a clear correlation with each other (FIG. 5), and it was found that quantitative measurement of β-1,3-glucan using this peptide was possible.
[0058]
Example 3 Measurement of Peptidoglycan Using Rabbit Body Fluid (SLP)
Hereinafter, experiments were performed using peptidoglycan prepared from Micrococcus lysodeikticus (IFO3333) by ultrasonic disruption as a representative.
80 μl of SLP solution dissolved in 0.1 M MOPS, 0.1 M KCl, 1% xylitol, 80 mM CaCl₂7.5 μl, 0.3 mg / ml peptidoglycan solution 10 μl, distilled water 2.5 μl are mixed, heated at 30 ° C. for 10 minutes, 0.5 M EDTA 5 μl, 1 M Tris-HCl buffer (pH 8.5) 5 μl, appropriate 10 μl of the synthetic peptide solution prepared in Example 1 (1) prepared to a suitable concentration was added in this order and mixed, and then heated again at 30 ° C. for 30 minutes. After completion of the reaction, 50 μl thereof was analyzed by liquid chromatography (the analysis conditions are the same as β-1,3-glucan performed in Example 2) (FIG. 6- (1)). As a control, 10 μl extra distilled water added in place of the 0.3 mg / ml peptidoglycan solution (FIG. 6- 2) was subjected to the same operation and analyzed by liquid chromatography. As a result, only when peptidoglycan was added (FIG. 6- (1)), a peak indicating a cleaved fragment of the synthetic peptide appeared at a retention time of 4.36 minutes. That is, it was found that peptidoglycan can be measured using a synthetic peptide.
The SLP solution used was prepared by the method described in Reference Example 3.
[0059]
Reference Example 4 Substrate specificity of PPAE
Four types of peptide chain 2-Pyr-Ala-Leu-Asn-*-Arg-Phe-Gly with a 2-pyridyl group (2-Pyr) introduced at the N-terminus (* indicates Asn, Asp, Ser Or Gly) and dissolved in distilled water to a concentration of 0.5 mg / ml. To 125 μl of these solutions, 25 μl of 10 μg / ml PPAE, 25 μl of 1M Tris-HCl buffer (pH 8.5), 25 μl of 5M NaCl, and 50 μl of distilled water were added and reacted at 25 ° C. for 0, 15, and 30 minutes. 80 μl of the reaction solution was taken out, 20 μl of 50% acetic acid was added to stop the reaction, 100 μl of distilled water was further added and mixed, and then 100 μl was analyzed by liquid chromatography. The reduction rate per 15 minutes of the peak area representing the synthetic peptide 2-Pyr-Ala-Leu-Asn-*-Arg-Phe-Gly was calculated as the substrate reduction rate, and the above four peptides were compared. .
The results are shown in Table 1.
[0060]
[Table 1]

[0061]
As is apparent from the results in Table 1, it can be seen that when the amino acid residue indicated by * is Gly, the substrate reduction rate is decreased and the PPAE reaction rate is significantly decreased. That is, it can be seen that the peptide whose amino acid residue indicated by * is Gly is not suitable as a substrate for measuring PPAE activity.
[0062]
[Sequence Listing]

[0063]

[0064]

20
[0065]

[0066]

[0067]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a scheme showing the procedure of ammonium sulfate fractionation to PPAE purification.
FIG. 2 shows the results of liquid chromatography analysis of PPAE activity using a synthetic peptide as a substrate.
FIG. 3 is a graph showing the correlation between PPAE concentration and PPAE activity.
FIG. 4 is a liquid chromatogram showing the detection results of CM-curdlan using a synthetic peptide as a substrate.
FIG. 5 is a graph showing the correlation between CM-curdlan concentration and PPAE activity.
FIG. 6 is a liquid chromatogram showing the detection results of peptidoglycan using a synthetic peptide as a substrate.
[Explanation of symbols]
1 Peak of reaction product (2-Pyr-Ala-Leu-Asn-Arg-OH)
2 Peak of synthetic peptide (2-Pyr-Ala-Leu-Asn-Arg-Phe-Gly-OH)

Claims

Formula (I):
X-Arg-Y
(X is an amino acid residue that may be labeled or the α-amino group may be protected, or is composed of 2 to 20 amino acid residues, and may be labeled or the N-terminus may be protected. The amino acid residues adjacent to Arg are not Gly and Ala. Y is an organic residue that can be bonded to the carboxyl group of Arg by an acid amide bond or an ester bond, or is labeled. An amino acid residue whose α-carboxyl group may be protected, or a peptide residue consisting of 2 to 20 amino acid residues, which may be labeled or whose C-terminus may be protected .)
And a peptide chain that can be hydrolyzed to X-Arg and Y by a prophenol oxidase activating enzyme derived from insects (Insecta) is brought into contact with the prophenol oxidase activating enzyme to produce X-Arg and Prophenoloxidase activity characterized in that at least one of Y is measured by the chemical or physical properties of the compound and the activity of the prophenoloxidase activating enzyme is measured based on the measured value Method for measuring the activity of oxidase.

X is a general formula:
X'-Asn
[X ′ is an amino acid residue that may be labeled or the α-amino group may be protected, or a peptide residue that may be labeled or the N-terminus may be protected (provided that X ′ The number of amino acids is one less than the number of amino acids possessed by A), or a protecting group for the α-amino group of Asn. The method for measuring the activity of a prophenoloxidase activating enzyme according to claim 1, wherein the group is a group represented by the formula:

Y is a general formula:
Phe-Gly-Z
[Z is an amino acid residue that may be labeled or the α-carboxyl group may be protected, or a peptide residue that may be labeled or the C-terminus may be protected (provided that Y The number of amino acids is 2 less than the number of amino acids possessed), or a protective group for the carboxyl group of Gly. ]
The method for measuring the activity of a prophenoloxidase activating enzyme according to claim 1 or 2, wherein

Color measurement means the ratio, luminescence, fluorescence, radioactivity, activity assay of prophenoloxidase activating enzyme according to any one of claims 1 to 3, characterized in that it is one of means of the magnetic.

Formula (I):
X-Arg-Y
(X is an amino acid residue that may be labeled or the α-amino group may be protected, or is composed of 2 to 20 amino acid residues, and may be labeled or the N-terminus may be protected. The amino acid residues adjacent to Arg are not Gly and Ala. Y is an organic residue that can be bonded to the carboxyl group of Arg by an acid amide bond or an ester bond, or is labeled. An amino acid residue whose α-carboxyl group may be protected, or a peptide residue consisting of 2 to 20 amino acid residues, which may be labeled or whose C-terminus may be protected .)
And a peptide chain that can be hydrolyzed to X-Arg and Y by a prophenoloxidase activating enzyme derived from insects (Insecta), a prophenoloxidase activation system, and a β-1,3-glucan And / or contact with an analyte that may contain peptidoglycan , and at least one of X-Arg and Y produced is measured according to the chemical or physical property of the compound, and based on the measured value Then, β-1,3-glucan and / or peptidoglycan in a sample is measured, and the β-1,3-glucan and / or peptidoglycan measurement method is characterized.

X is a general formula:
X'-Asn
[X ′ is an amino acid residue that may be labeled or the α-amino group may be protected, or a peptide residue that may be labeled or the N-terminus may be protected (provided that X ′ The number of amino acids is one less than the number of amino acids possessed by A), or a protecting group for the α-amino group of Asn. ] The measuring method of (beta) -1, 3- glucan and / or peptidoglycan of Claim 5 shown by these.

Y is a general formula:
Phe-Gly-Z
[Z is an amino acid residue that may be labeled or the α-carboxyl group may be protected, or a peptide residue that may be labeled or the C-terminus may be protected (provided that Y The number of amino acids is 2 less than the number of amino acids possessed), or a protective group for the carboxyl group of Gly. ]
The method for measuring β-1,3-glucan and / or peptidoglycan according to claim 5 or 6.

Measuring means colorimetric, luminescent, fluorescent, radioactive, beta-1,3-glucan and / or peptidoglycan as claimed in any one of claims 5-7, characterized in that any of the method of the magnetic Measuring method.

Method of measuring the beta-1,3-glucan according to any one of claims 6-8, characterized by using a prophenoloxidase activating system obtained by removing a component which specifically reacts with peptidoglycan.

method of measuring peptidoglycan according to any one of claims 6-8, characterized by using a prophenoloxidase activating system obtained by removing a component which specifically reacts with beta-1,3-glucan.

Formula (I):
X-Arg-Y
(X is an amino acid residue that may be labeled or the α-amino group may be protected, or is composed of 2 to 20 amino acid residues, and may be labeled or the N-terminus may be protected. The amino acid residues adjacent to Arg are not Gly and Ala. Y is an organic residue that can be bonded to the carboxyl group of Arg by an acid amide bond or an ester bond, or is labeled. An amino acid residue whose α-carboxyl group may be protected, or a peptide residue consisting of 2 to 20 amino acid residues, which may be labeled or whose C-terminus may be protected .)
And a reagent for measuring the activity of a prophenoloxidase activating enzyme comprising a peptide that can be decomposed into X-Arg and Y by a prophenoloxidase activating enzyme derived from insects (Insecta).

Formula (I):
X-Arg-Y
(X is an amino acid residue that may be labeled or the α-amino group may be protected, or is composed of 2 to 20 amino acid residues, and may be labeled or the N-terminus may be protected. The amino acid residues adjacent to Arg are not Gly and Ala. Y is an organic residue that can be bonded to the carboxyl group of Arg by an acid amide bond or an ester bond, or is labeled. An amino acid residue whose α-carboxyl group may be protected, or a peptide residue consisting of 2 to 20 amino acid residues, which may be labeled or whose C-terminus may be protected .)
And a peptide that can be degraded to X-Arg and Y by a prophenoloxidase activating enzyme derived from insects (Insecta), and a β-1,3-glucan comprising a prophenoloxidase activation system And / or a reagent for peptidoglycan measurement.

Formula (I):
X-Arg-Y
(X is an amino acid residue that may be labeled or the α-amino group may be protected, or is composed of 2 to 20 amino acid residues, and may be labeled or the N-terminus may be protected. The amino acid residues adjacent to Arg are not Gly and Ala. Y is an organic residue that can be bonded to the carboxyl group of Arg by an acid amide bond or an ester bond, or is labeled. An amino acid residue whose α-carboxyl group may be protected, or a peptide residue consisting of 2 to 20 amino acid residues, which may be labeled or whose C-terminus may be protected .)
And a peptide that can be degraded to X-Arg and Y by a prophenoloxidase activating enzyme derived from insects (Insecta), and a β-1,3-glucan comprising a prophenoloxidase activation system And / or a peptidoglycan measurement kit.