JP3656075B2 - Method for determining DNA base sequence using compound having energy transfer function - Google Patents

Method for determining DNA base sequence using compound having energy transfer function Download PDF

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本発明は、エネルギートランスファー機能を有する化合物をターミネーター、プライマーまたはイニシエーターとして利用したDNAの塩基配列決定方法に関する。   The present invention relates to a method for determining a DNA base sequence using a compound having an energy transfer function as a terminator, primer or initiator.

DNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼを用いて、チェインターミネーション反応産物を作成し、それを分離分画することにより、塩基配列を決定する方法が知られている。また、高等動物の遺伝子配列を解明するプロジェクトが進行しているが、その中でより高速の塩基配列決定法の開発が試みられている。その為に、蛍光標識したターミネーターを用いて得たシークエンシング反応産物を電気泳動により分離分画し、得られたDNA断片をレーザーで励起し、その蛍光を検出することにより塩基配列を決定する、DNA蛍光シークエンサーが用いられている。
また、2つの蛍光色素(ドナー色素、アクセプター色素)を用い、エネルギートランスファーの原理を用いて蛍光色素の量子収率を上げることができることが知られている。近年このエネルギートランスファーの原理を導入してオリゴヌクレオチドに2つの蛍光色素を共有結合させ、それをシークエンシング反応のプライマーとして用いるエネルギートランスファープライマーが開発された〔例えば、Nature Medicine, 2, 246-249(1996)、WO95/21266、特開平10-88124号〕。
A method for determining a base sequence by preparing a chain termination reaction product using DNA polymerase or RNA polymerase, and separating and fractionating it is known. In addition, while projects for elucidating gene sequences of higher animals are ongoing, development of faster nucleotide sequencing methods is being attempted. For this purpose, sequencing reaction products obtained using a fluorescently labeled terminator are separated and fractionated by electrophoresis, the obtained DNA fragment is excited with a laser, and the base sequence is determined by detecting the fluorescence. A DNA fluorescence sequencer is used.
It is also known that the quantum yield of a fluorescent dye can be increased by using two fluorescent dyes (donor dye and acceptor dye) and using the principle of energy transfer. In recent years, energy transfer primers have been developed in which the principle of energy transfer is introduced and two fluorescent dyes are covalently bound to an oligonucleotide and used as a primer for a sequencing reaction [for example, Nature Medicine, 2 , 246-249 ( 1996), WO95 / 21266, JP-A-10-88124].

DNAシークエンシングを高速化する為に、一度に多数のサンプルを解析できるシステムが開発されている。特に、キャピラリー蛍光シークエンサーは、サンプルのローディングを自動化しやすく、レーンの交差もなく多本化しやすい理想的な構造である。この蛍光シークエンサーの多本化を押し進める為に2種の光学系が用いられる。
1つはスキャン方式で、他の1つはイメージ方式である。いずれの場合も、少量のDNAでも検出できる高感度の検出計の出現が多本化を押し進める上で必要条件である。スキャン方式においては、キャピラリーの本数に係わらず一定の時間内にシークエンシングを終了する為には、キャピラリーの多本化が進めば進むほど1本のキャピラリーに割り当てられる時間が少なくなる。そのため、より高感度の検出計が必要となる。また、イメージ方式においても、検出計がカバーする視野の領域はキャピラリーの本数に係わらず一定である。キャピラリーの多本化を進めるためには光学素子の画素数を増やし、かつ1本のキャピラリーの直径を減らす必要がある。そのため、より高感度の検出計が必要となる。
In order to speed up DNA sequencing, a system that can analyze many samples at once has been developed. In particular, the capillary fluorescence sequencer has an ideal structure that facilitates automating the loading of the sample, and tends to be multiple without lane crossing. Two types of optical systems are used in order to promote the diversification of this fluorescent sequencer.
One is a scanning method and the other is an image method. In any case, the emergence of a highly sensitive detector capable of detecting even a small amount of DNA is a necessary condition for furthering the diversification. In the scanning method, in order to complete the sequencing within a certain time regardless of the number of capillaries, the more the number of capillaries is increased, the less time is allocated to one capillary. Therefore, a more sensitive detector is required. Also in the image system, the field of view covered by the detector is constant regardless of the number of capillaries. To increase the number of capillaries, it is necessary to increase the number of pixels of the optical element and reduce the diameter of one capillary. Therefore, a more sensitive detector is required.

一方、DNA検出感度を高める為、前述のように、エネルギートランスファーの原理を利用した蛍光プライマーをDNAシークエンシングに用いる技術が開発されてきた。しかしながら、本方法は蛍光プライマーである為、AGCT4種の塩基おのおのにターミネーション反応を行ない、これをさらに混ぜたシークエンシング反応産物を電気泳動にかけるという非常に繁雑な工程を必要とする。また、プロモーター依存性のRNAポリメラーゼを用いた転写反応によるシークエンシング反応ではプライマーを用いないため、このエネルギートランスファープライマーを用いることはできない。
DNAシークエンシングをより高速化するためには、多本化キャピラリーシークエンサーにおいてエネルギートランスファーのような量子収率の高い高感度検出系が必要である。しかし、それにもかかわらず、エネルギートランスファープライマーを用いる系では、前処理の繁雑さ(DNAポリメラーゼ系)やプライマーそのものを使わない( RNAポリメラーゼ系)という技術的限界がある。
On the other hand, in order to increase the DNA detection sensitivity, as described above, a technique has been developed in which a fluorescent primer using the principle of energy transfer is used for DNA sequencing. However, since this method is a fluorescent primer, it requires a very complicated process of performing a termination reaction on each of the four types of bases of AGCT and subjecting the sequencing reaction product further mixed thereto to electrophoresis. In addition, since a primer is not used in a sequencing reaction by a transcription reaction using a promoter-dependent RNA polymerase, this energy transfer primer cannot be used.
In order to increase the speed of DNA sequencing, a highly sensitive detection system with a high quantum yield such as energy transfer is required in a multi-capillary capillary sequencer. However, nonetheless, systems using energy transfer primers have technical limitations such as the complexity of pretreatment (DNA polymerase system) and the absence of primers themselves (RNA polymerase system).

そこで本発明の目的は、エネルギートランスファープライマーを用いる系での欠点を解消し、即ち、RNAポリメラーゼを用いた転写反応系にも適応でき、さらに、前処理として別々に得たAGCT4反応産物を混合する繁雑な工程を経ることなく、エネルギートランスファーを用いた高感度検出が可能なシークエンシング方法を可能にする手段を提供することにある。
特に本発明の目的は、高感度のエネルギートランスファーの原理を利用可能な化合物を提供すること、この化合物をターミネーターとして用い、チェインターミネーター法によって、標識されたDNA断片を高感度で検出できるDNAの塩基配列決定方法を提供することにある。
Therefore, the object of the present invention is to eliminate the drawbacks of the system using the energy transfer primer, that is, to be applicable to a transcription reaction system using RNA polymerase, and to mix the AGCT4 reaction product obtained separately as a pretreatment. An object of the present invention is to provide a means for enabling a sequencing method capable of high-sensitivity detection using energy transfer without going through complicated steps.
In particular, an object of the present invention is to provide a compound that can use the principle of energy transfer with high sensitivity, and to use this compound as a terminator and to detect a labeled DNA fragment with high sensitivity by the chain terminator method. It is to provide a sequencing method.

ところで、WO95/21266に開示されているエネルギートランスファープライマーでは、エネルギートランスファーを起こす2つのレポーターを、プライマーを構成するオリゴヌクレオチドの一部をリンカーとして連結している。しかるに、このようなプライマーでは、プライマーとなるオリゴヌクレオチドの配列が異なると、その都度、異なるプライマーを合成する必要があり、実用上不利である。また、特開平10-88124号に記載のエネルギートランスファープライマーでは、2つのレポーターを、脂肪族または芳香族の残基をリンカーとして連結している。そのため、WO95/21266のプライマーのような問題はないが、2つのレポーター間の距離を離す目的でリンカーを長くしようとしても、リンカーは長鎖になってもリンカーの結合様式のため、2つのレポーター間の距離を所望の値にすることが難しいという問題がある。   By the way, in the energy transfer primer disclosed in WO95 / 21266, two reporters that cause energy transfer are linked by using a part of oligonucleotide constituting the primer as a linker. However, such a primer is disadvantageous in practice because it is necessary to synthesize a different primer each time the oligonucleotide sequence used as the primer is different. Further, in the energy transfer primer described in JP-A-10-88124, two reporters are linked using an aliphatic or aromatic residue as a linker. Therefore, there is no problem like the primer of WO95 / 21266, but even if you try to lengthen the linker for the purpose of separating the distance between the two reporters, even if the linker becomes a long chain, the two reporters There is a problem that it is difficult to set the distance between them to a desired value.

そこで、本発明の別の目的は、上記問題を解決した、即ち、プライマーの配列の一部をリンカーとして用いることなく、かつ2つのレポーター間の距離の制御が容易な、エネルギートランスファープライマーとして有用な化合物を提供することにある。
さらに本発明の目的は、上記化合物をエネルギートランスファープライマーとして用いたDNAの塩基配列決定方法を提供することにある。
ターミネーターを用いる塩基配列決定法では、例えば、T7 RNAポリメラーゼ等の RNAポリメラーゼは、リボヌクレオシド5’トリフォスフェート類並びに3’デオキシリボヌクレオチドの混合物中で反応させる。この反応において、鋳型の配列に相応した塩基を有するリボヌクレオチド及び3’デオキシリボヌクレオチドが、リボヌクレオチド配列中に逐次取り込まれることで、ポリリボヌクレオチドが合成される。さらに得られるポリリボヌクレオチド(核酸転写生成物)を分離し、得られる分離分画から核酸の配列を読み取ることでDNAの塩基配列が決定される。核酸転写のターミネーターとして、例えば、蛍光標識された3’dNTP誘導体を用い、ターミネーターが有する標識を読み取ることで塩基配列を決定する。
Therefore, another object of the present invention is to solve the above problems, that is, useful as an energy transfer primer that does not use a part of the primer sequence as a linker and can easily control the distance between two reporters. It is to provide a compound.
A further object of the present invention is to provide a method for determining the base sequence of DNA using the above compound as an energy transfer primer.
In the base sequencing method using a terminator, for example, RNA polymerase such as T7 RNA polymerase is reacted in a mixture of ribonucleoside 5 ′ triphosphates and 3 ′ deoxyribonucleotides. In this reaction, polyribonucleotides are synthesized by sequentially incorporating ribonucleotides having a base corresponding to the template sequence and 3 ′ deoxyribonucleotides into the ribonucleotide sequence. Further, the obtained polyribonucleotide (nucleic acid transcription product) is separated, and the nucleotide sequence of the DNA is determined by reading the nucleic acid sequence from the obtained separated fraction. As a terminator for nucleic acid transcription, for example, a fluorescently labeled 3′dNTP derivative is used, and the base sequence is determined by reading the label possessed by the terminator.

ところが、3’dNTPに種々の標識を付したターミネーターは、標識の種類や標識の結合様式によっては、核酸配列に読み込まれにくい場合がある。特に、鎖の長さが長くなるとその傾向が大きくなる。そこで、ターミネーターは非標識の化合物とし、標識したイニシエーターを用いて塩基配列を決定することもできる。さらにその際、上述の標識したターミネーターの場合と同様に、標識の感度が問題となる。   However, terminators with various labels attached to 3'dNTP may be difficult to read into a nucleic acid sequence depending on the type of label and the binding mode of the label. In particular, the tendency increases as the chain length increases. Therefore, the terminator can be an unlabeled compound, and the base sequence can be determined using a labeled initiator. At that time, the sensitivity of the labeling becomes a problem as in the case of the above-mentioned labeled terminator.

そこで、本発明のさらなる目的は、RNAポリメラーゼを用いるDNAの塩基配列決定方法であって、標識を付したターミネーターを用いることなしに塩基配列を決定する方法にイニシエーター(転写開始剤)として使用できる、エネルギートランスファー機能を有する化合物を提供することにある。
さらに本発明の目的は、上記化合物をエネルギートランスファーイニシエーターとして用いたDNAの塩基配列決定方法を提供することにある。
Accordingly, a further object of the present invention is a method for determining a DNA base sequence using RNA polymerase, which can be used as an initiator (transcription initiator) in a method for determining a base sequence without using a labeled terminator. An object of the present invention is to provide a compound having an energy transfer function.
A further object of the present invention is to provide a method for determining the base sequence of DNA using the above compound as an energy transfer initiator.

本発明は、下記一般式(1)で表される化合物に関する。   The present invention relates to a compound represented by the following general formula (1).

Figure 0003656075
Figure 0003656075

(式中、Qはモノまたはオリゴヌクレオチド残基を示し、Vは−C≡C−(CH2n1−NH−または−CH=CH−(CH2n2−NH−(但し、n1及びn2は1以上の整数を示す)を示し、R1は3価の基を示し、R2及びR3はそれぞれ独立して水素原子若しくは炭化水素基を示すか、またはR2及びR3が互いに結合し、隣接するCH及びNHと一緒になって環を形成してもよく、W1及びW2はそれぞれ独立して蛍光性基を示し、mは1以上の整数を示す。) (Wherein Q represents a mono- or oligonucleotide residue, V represents —C≡C— (CH 2 ) n1 —NH— or —CH═CH— (CH 2 ) n2 —NH— (where n1 and n2 Represents an integer of 1 or more, R 1 represents a trivalent group, R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom or a hydrocarbon group, or R 2 and R 3 are bonded to each other And may be combined with adjacent CH and NH to form a ring, W 1 and W 2 each independently represent a fluorescent group, and m represents an integer of 1 or more.)

上記化合物において、W1及びW2の間の距離が10〜100Åの範囲となるように、R2、R3及びmが選ばれることが好ましい。
さらに上記化合物において、Qは2’,3’-ジデオキシリボヌクレオチド残基又は3’-デオキシリボヌクレオチド残基であることが好ましい。この化合物は、チェインターミネーター法によるDNAの塩基配列決定方法においてターミネーターとして用いることができる。
In the above compound, R 2 , R 3 and m are preferably selected so that the distance between W 1 and W 2 is in the range of 10 to 100 mm.
Further, in the above compound, Q is preferably a 2 ′, 3′-dideoxyribonucleotide residue or a 3′-deoxyribonucleotide residue. This compound can be used as a terminator in a method for determining a DNA base sequence by the chain terminator method.

本発明は、チェインターミネーター法によりDNAの塩基配列を決定する方法であって、Qが2’,3’-ジデオキシリボヌクレオチド残基又は3’-デオキシリボヌクレオチド残基である一般式(1)で表される化合物をターミネーターとしてチェインターミネーション反応を行なうことを特徴とする方法に関する。
この方法は、Qが2’,3’-ジデオキシリボヌクレオチド残基である一般式(1)で表される化合物をターミネーターとして用い、かつDNAポリメラーゼを用いる方法、及びQが3’-デオキシリボヌクレオチド残基である一般式(1)で表される化合物をターミネーターとして用い、かつRNAポリメラーゼを用いる方法を包含する。
The present invention is a method for determining the base sequence of DNA by the chain terminator method, wherein Q is a 2 ′, 3′-dideoxyribonucleotide residue or a 3′-deoxyribonucleotide residue. The present invention relates to a method comprising performing a chain termination reaction using a compound to be terminated as a terminator.
In this method, a compound represented by the general formula (1) in which Q is a 2 ′, 3′-dideoxyribonucleotide residue is used as a terminator and a DNA polymerase is used, and Q is a residue of 3′-deoxyribonucleotide. The method includes using a compound represented by the general formula (1) as a terminator as a terminator and using RNA polymerase.

さらにこの方法では、一般式(1)で表される化合物から選ばれた、4種類の塩基に対応する4種類の化合物(但し、各化合物は、W1及びW2の少なくとも一方として異なる4種類の蛍光性基をそれぞれ有する)をターミネーターとして用い、かつ上記4種類の化合物によるチェインターミネーション反応を同一の反応系内で行うことができる。 Furthermore, in this method, four types of compounds corresponding to four types of bases selected from the compound represented by the general formula (1) (provided that each compound is different from at least one of W 1 and W 2 ) And the chain termination reaction with the above four compounds can be carried out in the same reaction system.

本発明は、Qが2’−デオキシリボヌクレオチド残基を末端に有するオリゴヌクレオチド残基である一般式(1)で表される化合物に関する。この化合物は、プライマー法によるDNAの塩基配列決定方法においてプライマーとして用いることができる。   The present invention relates to a compound represented by the general formula (1), wherein Q is an oligonucleotide residue having a 2'-deoxyribonucleotide residue at the end. This compound can be used as a primer in a DNA base sequence determination method by a primer method.

さらに本発明は、プライマー法によりDNAの塩基配列を決定する方法であって、上記化合物をプライマーとして用いることを特徴とする方法に関し、この方法では非標識のターミネーターを用いることができる。   Furthermore, the present invention relates to a method for determining the base sequence of DNA by a primer method, wherein the compound is used as a primer. In this method, an unlabeled terminator can be used.

本発明は、Qが5'末端にフォスフェート基を持たないか、モノまたはジフォスフェート基を有するモノまたはオリゴヌクレオチド残基である一般式(1)で表される化合物に関する。この化合物は、チェインターミネーター法によるDNAの塩基配列決定方法においてイニシエーターとして用いることができる。   The present invention relates to a compound represented by the general formula (1), wherein Q is a mono or oligonucleotide residue having no phosphate group at the 5 ′ end, or having a mono or diphosphate group. This compound can be used as an initiator in a DNA base sequence determination method by the chain terminator method.

さらに本発明は、チェインターミネーター法でDNAの塩基配列を決定する方法であって、5'末端にフォスフェート基を持たないか、またはモノ若しくはジフォスフェート基を有するモノまたはオリゴヌクレオチド残基、並びにエネルギートランスファーのドナー及びアクセプターになり得る二種類のレポーターを有するイニシエーターとRNAポリメラーゼとを用いてチェインターミネーション反応を行なうことを特徴とする方法に関する。   Furthermore, the present invention relates to a method for determining the base sequence of DNA by the chain terminator method, which has no phosphate group at the 5 ′ end, or a mono or oligonucleotide residue having a mono or diphosphate group, and The present invention relates to a method comprising conducting a chain termination reaction using an initiator having two types of reporters that can serve as energy transfer donors and acceptors and RNA polymerase.

この方法において、Qが5'末端にフォスフェート基を持たないか、またはモノ若しくはジフォスフェート基を有するモノまたはオリゴヌクレオチド残基である一般式(1)で表される化合物をイニシエーターとして用いることができる。また、ターミネーターとして非標識のターミネーターを用いることができる。   In this method, a compound represented by the general formula (1) in which Q does not have a phosphate group at the 5 ′ end, or is a mono or oligonucleotide residue having a mono or diphosphate group is used as an initiator. be able to. Further, an unlabeled terminator can be used as the terminator.

さらに本発明は、チェインターミネーター法でDNAの塩基配列を決定する方法であって、3’-デオキシリボヌクレオチド残基、並びにエネルギートランスファーのドナー及びアクセプターになり得る二種類のレポーターを有するターミネーターとRNAポリメラーゼとを用いてチェインターミネーション反応を行なうことを特徴とする方法に関する。
この方法において、ターミネーター上の二種類のレポーターは、ドナーからアクセプターへのエネルギートランスファーが生じるに十分な距離を介して配置されていることが好ましい。さらに、ドナーからアクセプターへのエネルギートランスファーが生じるに十分な距離は、例えば、10〜100Åの範囲である。また、レポーターは、例えば、蛍光性を有する基、リン光を発する基、スピン標識された基、及び電子密度が高い基からなる群から選ばれる。
Furthermore, the present invention relates to a method for determining a DNA base sequence by a chain terminator method, comprising a 3′-deoxyribonucleotide residue, a terminator having two types of reporters that can serve as an energy transfer donor and acceptor, and an RNA polymerase. It is related with the method characterized by performing chain termination reaction using.
In this method, it is preferred that the two types of reporters on the terminator are arranged at a distance sufficient to cause energy transfer from the donor to the acceptor. Further, the distance sufficient for the energy transfer from the donor to the acceptor is, for example, in the range of 10 to 100 mm. The reporter is selected from the group consisting of, for example, a fluorescent group, a phosphorescent group, a spin-labeled group, and a group having a high electron density.

この方法において、ターミネーターが有するドナーは、例えば、フルオレスセイン系色素、ローダミン系色素及び4,4−ジフルオロ−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン系色素からなる群から選ばれる一種であり、アクセプターはフルオレスセイン系色素、ローダミン系色素及び4,4−ジフルオロ−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン系色素からなる群から選ばれる一種である。   In this method, the donor included in the terminator is, for example, a kind selected from the group consisting of fluorescein dyes, rhodamine dyes, and 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene dyes. And the acceptor is a kind selected from the group consisting of fluorescein dyes, rhodamine dyes and 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene dyes.

この方法において、4種類の塩基に対応する4種類のターミネーター(但し、各ターミネーターは、アクセプターとして異なる4種類のレポーターをそれぞれ有する)を用い、かつ上記4種類のターミネーターによるチェインターミネーション反応を同一の反応系内で行うことができる。
上記本発明の塩基配列決定方法では、チェインターミネーション反応を無機ピロフォスファターゼの存在下で行うことが好ましい。
In this method, four types of terminators corresponding to four types of bases (however, each terminator has four different reporters as acceptors) and the chain termination reaction by the above four types of terminators are the same reaction. Can be done in the system.
In the base sequence determination method of the present invention, the chain termination reaction is preferably performed in the presence of inorganic pyrophosphatase.

本発明の化合物
本発明の一般式(1)で表される化合物において、Qはモノまたはオリゴヌクレオチド残基を示す。より具体的には、Qは、例えば、リボヌクレオチド残基、2’,3’-ジデオキシリボヌクレオチド残基、2’-デオキシリボヌクレオチド残基、3’-デオキシリボヌクレオチド残基、5’-デオキシリボヌクレオチド残基等のヌクレオチド残基であることができる。Qが、2’,3’-ジデオキシリボヌクレオチド残基又は3’-デオキシリボヌクレオチド残基である化合物は、チェインターミネーター法によるDNAの塩基配列決定方法においてターミネーターとして用いることができる。特に、Qが2’,3’-ジデオキシリボヌクレオチド残基である化合物は、DNAポリメラーゼを用いる方法においてターミネーターとして用いられる。また、Qが3’-デオキシリボヌクレオチド残基である化合物は、RNAポリメラーゼを用いる方法においてターミネーターとして用いられる。2’,3’-ジデオキシリボヌクレオチド残基及び3’-デオキシリボヌクレオチド残基としては、下記一般式(2)及び(3)で表されるプリンヌクレオチド残基、及び下記一般式(4)及び(5)で表されるピリミジンヌクレオチド残基を挙げることができる。
Compound of the Present Invention In the compound represented by the general formula (1) of the present invention, Q represents a mono- or oligonucleotide residue. More specifically, Q is, for example, a ribonucleotide residue, 2 ′, 3′-dideoxyribonucleotide residue, 2′-deoxyribonucleotide residue, 3′-deoxyribonucleotide residue, 5′-deoxyribonucleotide residue. It can be a nucleotide residue such as a group. A compound in which Q is a 2 ′, 3′-dideoxyribonucleotide residue or a 3′-deoxyribonucleotide residue can be used as a terminator in a DNA base sequence determination method by the chain terminator method. In particular, a compound in which Q is a 2 ′, 3′-dideoxyribonucleotide residue is used as a terminator in a method using a DNA polymerase. A compound in which Q is a 3′-deoxyribonucleotide residue is used as a terminator in a method using RNA polymerase. Examples of 2 ′, 3′-dideoxyribonucleotide residues and 3′-deoxyribonucleotide residues include purine nucleotide residues represented by the following general formulas (2) and (3), and the following general formulas (4) and (4) The pyrimidine nucleotide residue represented by 5) can be mentioned.

Figure 0003656075
Figure 0003656075

上記式中、R11及びR12は、いずれもが水素原子であるか、またはR11が水酸基であり、R12が水素原子であることができる。R13は、-PO3H2、-P2O6H3、-P3O9H4またはそれらの塩であることができる。塩としては、アルカリ金属塩(例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩)、アルカリ土類金属塩(例えば、バリウム塩)、アンモニウム塩、有機アミン塩(例えば、トリエチルアンモニウム塩、ピリジン塩)等を挙げることができる。 In the above formula, each of R 11 and R 12 can be a hydrogen atom, or R 11 can be a hydroxyl group and R 12 can be a hydrogen atom. R 13 can be —PO 3 H 2 , —P 2 O 6 H 3 , —P 3 O 9 H 4 or a salt thereof. Examples of the salt include alkali metal salts (for example, sodium salt, potassium salt, lithium salt), alkaline earth metal salts (for example, barium salt), ammonium salts, organic amine salts (for example, triethylammonium salt, pyridine salt) and the like. Can be mentioned.

また、Qは、オリゴヌクレオチド残基であることができる。Qがオリゴヌクレオチド残基である化合物、特に2'-デオキシリボヌクレオチドを末端に有するオリゴヌクレオチド残基である化合物は、プライマー法によるDNAの塩基配列決定方法においてプライマーとして用いることができる。オリゴヌクレオチド残基の塩基配列や長さは、プライマーとしての機能を考慮して適宜決定できるが、長さとしては、例えば、5〜30塩基の範囲、好ましくは10〜30塩基の範囲である。   Q can also be an oligonucleotide residue. A compound in which Q is an oligonucleotide residue, particularly a compound having an oligonucleotide residue having 2′-deoxyribonucleotide at its end, can be used as a primer in a DNA base sequencing method by the primer method. The nucleotide sequence and length of the oligonucleotide residue can be appropriately determined in consideration of the function as a primer, and the length is, for example, in the range of 5 to 30 bases, preferably in the range of 10 to 30 bases.

さらにQは、5'末端にフォスフェート基を持たないか、モノまたはジフォスフェート基を有するモノまたはオリゴヌクレオチド残基であることができる。このような化合物は、チェインターミネーター法によるDNAの塩基配列決定方法においてイニシエーターとして用いることができる。5'末端にフォスフェート基を持たないか、モノまたはジフォスフェート基を有するモノまたはオリゴヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオシド残基、リボヌクレオシド5’モノフォスフェート残基、リボヌクレオシド5’ジフォスフェート残基、一般式N1(N)n(式中、N1はリボヌクレオシド、リボヌクレオシド5’モノフォスフェート、またはリボヌクレオシド5’ジフォスフェートであり、Nはリボヌクレオシド5’モノフォスフェートであり、nは1以上の整数である)で示されるオリゴリボヌクレオチド類残基、及び一般式N2(N)n(式中、N2は下記式(6)で示される基であり、Nはリボヌクレオシド5’モノフォスフェートであり、nは1以上の整数である)で示されるオリゴリボヌクレオチド類残基からなる群から選ばれることができる。 Furthermore, Q can be a mono or oligonucleotide residue that has no phosphate group at the 5 ′ end or has a mono or diphosphate group. Such a compound can be used as an initiator in a method for determining a DNA base sequence by the chain terminator method. A mono or oligonucleotide residue having no phosphate group at the 5 ′ end or having a mono or diphosphate group is, for example, a ribonucleoside residue, a ribonucleoside 5 ′ monophosphate residue, a ribonucleoside 5 ′ diester. Phosphate residue, general formula N 1 (N) n , wherein N 1 is a ribonucleoside, ribonucleoside 5 ′ monophosphate, or ribonucleoside 5 ′ diphosphate, and N is a ribonucleoside 5 ′ monophosphate And an oligoribonucleotide residue represented by the formula: N 2 (N) n (where N 2 is a group represented by the following formula (6)) , N is a ribonucleoside 5 ′ monophosphate and n is an integer of 1 or more). It is it is possible.

Figure 0003656075
Figure 0003656075

上記モノまたはオリゴヌクレオチド残基としては、より具体的には、例えば、グアノシン、グアノシン5’モノフォスフェート(GMP)、グアノシン5’ジフォスフェート(GDP)、一般式N1(N)n-1G(但し、N1はリボヌクレオシド、リボヌクレオシド5’モノフォスフェート、またはリボヌクレオシド5’ジフォスフェートであり、Nはリボヌクレオシド5’モノフォスフェートであり、nは1以上の整数であり、Gはグアノシン5’モノフォスフェートである)で示されるオリゴリボヌクレオチド類及び一般式N2(N)n-1G(式中、N2は前記式(6)で示される基であり、Nはリボヌクレオシド5’モノフォスフェートであり、nは1以上の整数であり、Gはグアノシン5’モノフォスフェートである)で示されるオリゴリボヌクレオチド類の各残基を挙げることができる。
さらに上記モノまたはオリゴヌクレオチド残基としては、より具体的には、アデノシン、アデノシン5’モノフォスフェート(AMP)、アデノシン5’ジフォスフェート(ADP)、一般式N1(N)n-1A(但し、N1はリボヌクレオシド、リボヌクレオシド5’モノフォスフェート、またはリボヌクレオシド5’ジフォスフェートであり、Nはリボヌクレオシド5’モノフォスフェートであり、nは1以上の整数であり、Aはアデノシン5’モノフォスフェートである)で示されるオリゴリボヌクレオチド類及び一般式N2(N)n-1A(式中、N2は前記式(6)で示される基であり、Nはリボヌクレオシド5’モノフォスフェートであり、nは1以上の整数であり、Aはアデノシン5’モノフォスフェートである)で示されるオリゴリボヌクレオチド類の各残基を挙げることができる。
さらに上記モノまたはオリゴヌクレオチド残基としては、具体的には、シチジン、シチジン5’モノフォスフェート(CMP)、シチジン5’ジフォスフェート(CDP)、一般式N1(N)n-1C(但し、N1はリボヌクレオシド、リボヌクレオシド5’モノフォスフェート、またはリボヌクレオシド5’ジフォスフェートであり、Nはリボヌクレオシド5’モノフォスフェートであり、nは1以上の整数であり、Cはシチジン5’モノフォスフェートである)で示されるオリゴリボヌクレオチド類及び一般式N2(N)n-1C(式中、N2は前記式(6)で示される基であり、Nはリボヌクレオシド5’モノフォスフェートであり、nは1以上の整数であり、Cはシチジン5’モノフォスフェートである)で示されるオリゴリボヌクレオチド類の各残基を挙げることができる。
More specifically, examples of the mono- or oligonucleotide residue include guanosine, guanosine 5 ′ monophosphate (GMP), guanosine 5 ′ diphosphate (GDP), and general formula N 1 (N) n−1. G (where N 1 is ribonucleoside, ribonucleoside 5 ′ monophosphate, or ribonucleoside 5 ′ diphosphate, N is ribonucleoside 5 ′ monophosphate, and n is an integer of 1 or more, G is an oligoribonucleotide represented by guanosine 5 ′ monophosphate) and a general formula N 2 (N) n−1 G (wherein N 2 is a group represented by the above formula (6); Is a ribonucleoside 5 ′ monophosphate, n is an integer of 1 or more, and G is a guanosine 5 ′ monophosphate). Mention may be made of each residue of the kind.
More specifically, examples of the mono- or oligonucleotide residue include adenosine, adenosine 5 ′ monophosphate (AMP), adenosine 5 ′ diphosphate (ADP), and general formula N 1 (N) n-1 A Wherein N 1 is ribonucleoside, ribonucleoside 5 ′ monophosphate, or ribonucleoside 5 ′ diphosphate, N is ribonucleoside 5 ′ monophosphate, n is an integer of 1 or more, and A Is an adenosine 5 ′ monophosphate) and a general formula N 2 (N) n−1 A (where N 2 is a group represented by the above formula (6), and N is Ribonucleoside 5 ′ monophosphate, n is an integer of 1 or more, and A is adenosine 5 ′ monophosphate). Examples of each residue of tides.
Specific examples of the mono- or oligonucleotide residue include cytidine, cytidine 5 ′ monophosphate (CMP), cytidine 5 ′ diphosphate (CDP), general formula N 1 (N) n-1 C ( Where N 1 is ribonucleoside, ribonucleoside 5 ′ monophosphate, or ribonucleoside 5 ′ diphosphate, N is ribonucleoside 5 ′ monophosphate, n is an integer of 1 or more, and C is Oligoribonucleotides represented by cytidine 5 ′ monophosphate) and a general formula N 2 (N) n-1 C (where N 2 is a group represented by the above formula (6), and N is a ribonucleotide) Each nucleoside 5 ′ monophosphate, n is an integer of 1 or more, and C is cytidine 5 ′ monophosphate) Can be mentioned.

さらに上記モノまたはオリゴヌクレオチド残基としては、具体的には、ウリジン、ウリジン5’モノフォスフェート(UMP)、ウリジン5’ジフォスフェート(UDP)、一般式N1(N)n-1U(但し、N1はリボヌクレオシド、リボヌクレオシド5’モノフォスフェート、またはリボヌクレオシド5’ジフォスフェートであり、Nはリボヌクレオシド5’モノフォスフェートであり、nは1以上の整数であり、Uはウリジン5’モノフォスフェートである)で示されるオリゴリボヌクレオチド類及び一般式N2(N)n-1U(式中、N2は前記式(6)で示される基であり、Nはリボヌクレオシド5’モノフォスフェートであり、nは1以上の整数であり、Uはウリジン5’モノフォスフェートである)で示されるオリゴリボヌクレオチド類の各残基を挙げることができる。 Specific examples of the mono- or oligonucleotide residues include uridine, uridine 5 ′ monophosphate (UMP), uridine 5 ′ diphosphate (UDP), and general formula N 1 (N) n−1 U ( N 1 is ribonucleoside, ribonucleoside 5 ′ monophosphate, or ribonucleoside 5 ′ diphosphate, N is ribonucleoside 5 ′ monophosphate, n is an integer of 1 or more, and U is Oligoribonucleotides represented by uridine 5 ′ monophosphate) and a general formula N 2 (N) n−1 U (where N 2 is a group represented by the above formula (6), and N is a ribonucleoside) Nucleoside 5 ′ monophosphate, n is an integer of 1 or more, and U is uridine 5 ′ monophosphate) Can be mentioned.

尚、上記一般式N1(N)n、N1(N)n-1G、N1(N)n-1A、N1(N)n-1C、N1(N)n-1U、N2(N)n、N2(N)n-1G、N2(N)n-1A、N2(N)n-1C、N2(N)n-1Uにおいて、N1で示されるリボヌクレオシド、リボヌクレオシド5’モノフォスフェート、及びリボヌクレオシド5’ジフォスフェートの塩基に特に制限はなく、グアニン、アデニン、シトシン、ウリジンから適宜選択でき、好ましくはグアニンである。また、Nで示されるリボヌクレオシド5’モノフォスフェートの塩基の種類及びnが2以上の場合の塩基の配列にも特に制限はない。さらに、イニシエーターの機能の面でnには上限はないが、実用上は、nはせいぜい10以下程度であり、好ましくは5以下であり、より好ましくは1又は2である。 The above general formulas N 1 (N) n , N 1 (N) n-1 G, N 1 (N) n-1 A, N 1 (N) n-1 C, N 1 (N) n-1 U, N 2 (N) n , N 2 (N) n-1 G, N 2 (N) n-1 A, N 2 (N) n-1 C, N 2 (N) n-1 U The base of the ribonucleoside, ribonucleoside 5 ′ monophosphate, and ribonucleoside 5 ′ diphosphate represented by N 1 is not particularly limited and can be appropriately selected from guanine, adenine, cytosine, and uridine, preferably guanine. There is no particular limitation on the type of base of the ribonucleoside 5 ′ monophosphate represented by N and the base sequence when n is 2 or more. Furthermore, although there is no upper limit for n in terms of the function of the initiator, in practice, n is at most about 10 or less, preferably 5 or less, and more preferably 1 or 2.

本発明の一般式(1)で表される化合物において、Vは−C≡C−(CH2n1−NH−または−CH=CH−(CH2n2−NH−を示す。n1及びn2は1以上の整数を示す。ここで、Vにおける−C≡C−または−CH=CH−の炭素原子の一端が、前述した如きQで示されるモノ又はオリゴヌクレオチド残基のうち、ピリミジンヌクレオチド残基についてはその5位に、また、プリンヌクレオチド残基についてはその7位に夫々結合する。 In the compound represented by the general formula (1) of the present invention, V represents —C≡C— (CH 2 ) n1 —NH— or —CH═CH— (CH 2 ) n2 —NH—. n1 and n2 represent an integer of 1 or more. Here, one end of the carbon atom of —C≡C— or —CH═CH— in V is the 5-position of the pyrimidine nucleotide residue among the mono- or oligonucleotide residues represented by Q as described above, In addition, the purine nucleotide residue is bonded to the 7th position.

また、上記−(CH2n1−及び−(CH2n2−で示されるメチレン鎖としては、例えばn1及びn2が1〜15のメチレン鎖が挙げられ、具体的には、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、ヘプタメチレン基、オクタメチレン基、ノナメチレン基、デカメチレン基等が挙げられる。 Examples of the methylene chain represented by — (CH 2 ) n1 — and — (CH 2 ) n2 — include, for example, methylene chains in which n1 and n2 are 1 to 15; specifically, a methylene group, ethylene Group, trimethylene group, tetramethylene group, pentamethylene group, hexamethylene group, heptamethylene group, octamethylene group, nonamethylene group, decamethylene group and the like.

但し、RNAポリメラーゼによるシーケンス反応のターミネーターとして用いる場合には、RNAポリメラーゼによる取り込み効率が高いという観点から、好ましくはn1及びn2は4以上、より好ましくはn1及びn2は4〜10、更に好ましくはn1及びn2は4〜8である。また、DNAポリメラーゼによるシーケンス反応のターミネーターとして用いる場合には、DNAポリメラーゼによる取り込み効率が高いという観点から、好ましくはn1及びn2は3以上、より好ましくはn1及びn2は3〜10である。また、プライマー又はイニシエーターとして使用する場合、シークエンシング反応に使用するDNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼの活性を考慮してn1及びn2は適宜決定される。
1は3価の基を示し、例えば、
However, when used as a terminator for a sequence reaction by RNA polymerase, n1 and n2 are preferably 4 or more, more preferably n1 and n2 are 4 to 10, more preferably n1 from the viewpoint of high uptake efficiency by RNA polymerase. And n2 is 4-8. When used as a terminator for a sequence reaction by DNA polymerase, n1 and n2 are preferably 3 or more, more preferably n1 and n2 are 3 to 10, from the viewpoint of high uptake efficiency by DNA polymerase. When used as a primer or an initiator, n1 and n2 are appropriately determined in consideration of the activity of DNA polymerase or RNA polymerase used for sequencing reaction.
R 1 represents a trivalent group, for example,

Figure 0003656075
(但し、R21〜R23はそれぞれ独立して結合手または2価の炭化水素基を表す)等を挙げることができる。
Figure 0003656075
(However, R 21 to R 23 each independently represents a bond or a divalent hydrocarbon group).

尚、上記2価の炭化水素基としては、脂肪族、芳香族、これらが混在しているもののいずれでも良い。2価の脂肪族炭化水素基としては、直鎖状でも分枝状でも或いは環状でも良い。直鎖状及び分枝状の2価の脂肪族炭化水素基としては、例えば炭素数1〜6の2価の脂肪族炭化水素基が挙げられ、具体的にはメチレン基、エチリデン基、1,2-エタンジイル基、プロピリデン基、1,2-プロパンジイル基、1,3-プロパンジイル基、イソプロピリデン基、ブチリデン基、1,2-ブタンジイル基、1,3-ブタンジイル基、1,4-ブタンジイル基、2-メチル-1,2-プロパンジイル基、2-メチル-1,3-プロパンジイル基、ペンチリデン基、1,2-ペンタンジイル基、1,3-ペンタンジイル基、1,4-ペンタンジイル基、1,5-ペンタンジイル基、2,3-ペンタンジイル基、2,4-ペンタンジイル基、2-メチル-1,2-ブタンジイル基、2-メチル-1,3-ブタンジイル基、2-メチル-1,4-ブタンジイル基、2-メチル-1,5-ブタンジイル基、2-メチル-2,3-ブタンジイル基、2-メチル-2,4-ブタンジイル基、2,2-ジメチル-1,3-プロパンジイル基、ヘキシリデン基、1,2-ヘキサンジイル基、1,3-ヘキサンジイル基、1,4-ヘキサンジイル基、1,5-ヘキサンジイル基、1,6-ヘキサンジイル基、2,3-ヘキサンジイル基、2,4-ヘキサンジイル基、3,4-ヘキサンジイル基等が挙げられ、なかでも炭素数1〜4の2価の脂肪族炭化水素基が好ましい。環状の2価の脂肪族炭化水素基としては、例えば炭素数3〜7の2価の脂肪族炭化水素基が挙げられ、具体的には1,2-シクロプロパンジイル基、1,2-シクロブタンジイル基、1,3-シクロブタンジイル基、1,2-シクロペンタンジイル基、1,3-シクロペンタンジイル基、1,2-シクロヘキサンジイル基、1,3-シクロヘキサンジイル基、1,4-シクロヘキサンジイル基、1,2-シクロヘプタンジイル基、1,3-シクロヘプタンジイル基、1,4-シクロヘプタンジイル基等が挙げられ、なかでも炭素数5〜7の2価の脂肪族炭化水素基が好ましい。2価の芳香族炭化水素基としては、例えばフェニレン基、ビフェニレン基、トリフェニレン基等が挙げられる。   The divalent hydrocarbon group may be aliphatic, aromatic, or a mixture thereof. The divalent aliphatic hydrocarbon group may be linear, branched or cyclic. Examples of the linear and branched divalent aliphatic hydrocarbon groups include divalent aliphatic hydrocarbon groups having 1 to 6 carbon atoms, such as a methylene group, an ethylidene group, 1, 2-ethanediyl group, propylidene group, 1,2-propanediyl group, 1,3-propanediyl group, isopropylidene group, butylidene group, 1,2-butanediyl group, 1,3-butanediyl group, 1,4-butanediyl Group, 2-methyl-1,2-propanediyl group, 2-methyl-1,3-propanediyl group, pentylidene group, 1,2-pentanediyl group, 1,3-pentanediyl group, 1,4-pentanediyl group, 1,5-pentanediyl group, 2,3-pentanediyl group, 2,4-pentanediyl group, 2-methyl-1,2-butanediyl group, 2-methyl-1,3-butanediyl group, 2-methyl-1,4 -Butanediyl group, 2-methyl-1,5-butanediyl group, 2-methyl-2,3-butanediyl group, 2-methyl-2,4-butanediyl group, 2,2- Methyl-1,3-propanediyl group, hexylidene group, 1,2-hexanediyl group, 1,3-hexanediyl group, 1,4-hexanediyl group, 1,5-hexanediyl group, 1,6-hexane Examples thereof include a diyl group, a 2,3-hexanediyl group, a 2,4-hexanediyl group, and a 3,4-hexanediyl group. Among them, a divalent aliphatic hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms is preferable. Examples of the cyclic divalent aliphatic hydrocarbon group include, for example, a divalent aliphatic hydrocarbon group having 3 to 7 carbon atoms, specifically 1,2-cyclopropanediyl group, 1,2-cyclobutane. Diyl group, 1,3-cyclobutanediyl group, 1,2-cyclopentanediyl group, 1,3-cyclopentanediyl group, 1,2-cyclohexanediyl group, 1,3-cyclohexanediyl group, 1,4-cyclohexane Diyl group, 1,2-cycloheptanediyl group, 1,3-cycloheptanediyl group, 1,4-cycloheptanediyl group, etc. are mentioned, among them divalent aliphatic hydrocarbon group having 5 to 7 carbon atoms Is preferred. Examples of the divalent aromatic hydrocarbon group include a phenylene group, a biphenylene group, and a triphenylene group.

2及びR3はそれぞれ独立して水素原子若しくは炭化水素基を示すか、またはR2及びR3が互いに結合し、隣接するCH及びNHと一緒になって環を形成してもよい。炭化水素基としては例えば、炭素数1〜6の脂肪族炭化水素基(直鎖状でも分岐状でも環状でも良く、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、sec-ブチル基、n-ペンチル基、イソペンチル基、tert-ペンチル基、1-メチルペンチル基、n-ヘキシル基、イソヘキシル基、シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等)、炭素数7〜10のアラルキル基(例えば、ベンジル基、フェネチル基、フェニルプロピル基、メチルベンジル基等)、アリール基(例えば、フェニル基、トリル基、キシリル基、ナフチル基、ビフェニル基等)等を挙げることができる。また、R2及びR3が互いに結合し、隣接するCH及びNHと一緒になって形成される環としては、更にN及びOを含んでいても良い3〜6員環が挙げられ、具体例としては、アジリジン環、アゼチジン環、ピロリジン環、ピロリン環、イミダゾリジン環、イミダゾリン環、ピラゾリジン環、ピラゾリン環、ピペリジン環、ピペラジン環、モルホリン環等を挙げることができる。また、繰り返し数mは、1以上の整数を示す。 R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom or a hydrocarbon group, or R 2 and R 3 may be bonded together to form a ring together with adjacent CH and NH. Examples of the hydrocarbon group include an aliphatic hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms (which may be linear, branched or cyclic, such as a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group). , Isobutyl group, tert-butyl group, sec-butyl group, n-pentyl group, isopentyl group, tert-pentyl group, 1-methylpentyl group, n-hexyl group, isohexyl group, cyclopropyl group, cyclopentyl group, cyclohexyl group Etc.), an aralkyl group having 7 to 10 carbon atoms (for example, benzyl group, phenethyl group, phenylpropyl group, methylbenzyl group, etc.), aryl group (for example, phenyl group, tolyl group, xylyl group, naphthyl group, biphenyl group, etc.) And the like. Examples of the ring formed by combining R 2 and R 3 together with adjacent CH and NH include a 3- to 6-membered ring which may further contain N and O. Specific examples Examples thereof include an aziridine ring, azetidine ring, pyrrolidine ring, pyrroline ring, imidazolidine ring, imidazoline ring, pyrazolidine ring, pyrazoline ring, piperidine ring, piperazine ring, morpholine ring and the like. Further, the repetition number m represents an integer of 1 or more.

本発明の化合物において、R2、R3及びmは、W1及びW2の間の距離が10〜100Åの範囲となるように選ばれることが好ましい。エネルギートランスファーの結果得られる蛍光等のシグナルは、W1及びW2の間の距離により変化する。最も強いシグナルが得られるW1及びW2の間の距離は、W1及びW2の種類により変化する。そこで、W1及びW2の種類等を考慮してR2、R3及びmを適宜選択する。 In the compound of the present invention, R 2 , R 3 and m are preferably selected such that the distance between W 1 and W 2 is in the range of 10 to 100 mm. Signals such as fluorescence obtained as a result of energy transfer vary with the distance between W 1 and W 2 . The distance between W 1 and W 2 at which the strongest signal is obtained varies depending on the types of W 1 and W 2 . Therefore, R 2 , R 3 and m are appropriately selected in consideration of the types of W 1 and W 2 .

2つの蛍光性基の分子間距離として10〜100Åの範囲、好ましくは20〜60Å、より好ましくは約30〜50Åであることが適当である。R2及びR3で形成された環がピロリジン環、即ちプロリン残基の場合、20〜60Åは約5〜16残基のプロリンストレッチに相当し、30〜50Åは8〜12残基に相当する。上記mは、プロリンストレッチを含む全アミノ酸残基が、20〜60Åに相当する数、好ましくは30〜50Åに相当する数となるようにすることが適当である。
1及びW2はそれぞれ独立して蛍光性基を示す。ここで、蛍光性基とは、蛍光を発する性質を有する基である。
The intermolecular distance between the two fluorescent groups is suitably in the range of 10 to 100 cm, preferably 20 to 60 mm, more preferably about 30 to 50 mm. When the ring formed by R 2 and R 3 is a pyrrolidine ring, that is, a proline residue, 20-60、2 corresponds to a proline stretch of about 5-16 residues, and 30-50Å corresponds to 8-12 residues. . The above m is appropriate so that all amino acid residues including the proline stretch are a number corresponding to 20 to 60%, preferably a number corresponding to 30 to 50%.
W 1 and W 2 each independently represent a fluorescent group. Here, the fluorescent group is a group having a property of emitting fluorescence.

好ましい蛍光性基としては、フルオレスセイン系色素、ローダミン系色素、4,4−ジフルオロ−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン系色素、シアニン色素、フタロシアニン色素、スクアラニン色素等が挙げられ、中でもフルオレスセイン系色素、ローダミン系色素及び4,4−ジフルオロ−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン系色素が好ましい。   Preferred fluorescent groups include fluorescein dyes, rhodamine dyes, 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene dyes, cyanine dyes, phthalocyanine dyes, squalane dyes, and the like. Of these, fluorescein dyes, rhodamine dyes and 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene dyes are preferred.

より具体的には、例えば、5(または6)カルボキシフルオレッセイン(以下、FAMと略記する。)、フルオレッセイン、イソチオシアネート、5(又は6)カルボキシ4’,5’−ジクロロ−2’,7’−ジメトキシフルオレッセイン(以下、 JOEと略記する。)、5(または6)カルボキシ2’,4',5',7'−テトラクロロフルオレッセイン、5(または6)カルボキシ2’,4',5',7'−テトラブロモフルオレッセイン、5(または6)カルボキシ4,7−ジクロロ−2’,7'−ジメトキシフルオレッセイン、5(または6)カルボキシ4,7,4',5'−テトラクロロ−2’,7'−ジメトキシフルオレッセイン、5(または6)カルボキシ2’,7'−ジメトキシフルオレッセイン、5(または6)カルボキシ4,A7−ジクロロ−1',2’,7',8'−ジベンゾフルオレッセイン、5(または6)カルボキシ4,7−ジクロロ−1',2’,7',8'−ジベンゾフルオレッセイン、5(または6)カルボキシテトラメチルローダミン(以下、TMRと略記する。)、5(または6)カルボキシローダミンX(以下、XRと略記する。)、5(または6)カルボキシローダミン6G(以下、R6Gと略記する。)、5(または6)カルボキシローダミン110(以下、R110と略記する。)、4,4―ジフルオロ−1,3,5,7―テトラメチルー4―ボラー3a,4a−ジアザ−s−インダセン−8−プロピオン酸(以下、BODIPY493/503と略記する)、2,6―ジブロモ−4,4−ジフルオロ,5,7−ジメチル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−8−プロピオン酸(以下、BODIPY FL Br2と略記する)、4,4―ジフルオロ−5−フェニル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−8−プロピオン酸(以下、BODIPY R6Gと略記する)、4,4―ジフルオロ−5,7−ジフェニル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−8−プロピオン酸(以下、BODIPY530/550と略記する)、6−((4,4−ジフルオロ−1,3−ジメチル−5(4−メトキシフェニル)−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−2−プロピオニル)アミノ)ヘキサン酸(以下、BODIPY TMRと略記する)、オレゴングリーン488カルボン酸、臭化エチジウム、2−メトキシ−6−クロロ−9−アミノアクリジン、4−トリフルオロメチル−7−ω−プロモプロピルアミノクマリン等の蛍光色素から誘導されたものが挙げられる。
本発明の化合物をターミネーターとして使用する場合、チェーンターミネーター法でDNAの塩基配列を決定する方法に於いて、従来の4色蛍光ターミネーターより効率よく強いシグナル強度を実現する為に設計された4種のエネルギートランスファーターミネーターであるという点が重要である。AGCT4種の塩基について同時にターミネーション反応を実施する為には、4種のセット(ドナー色素とアクセプター色素の組み合わせ。これらを総称してレポーターと称する場合もある)が提供される。
More specifically, for example, 5 (or 6) carboxyfluorescein (hereinafter abbreviated as FAM), fluorescein, isothiocyanate, 5 (or 6) carboxy 4 ′, 5′-dichloro-2 ′. , 7'-dimethoxyfluorescein (hereinafter abbreviated as JOE), 5 (or 6) carboxy 2 ', 4', 5 ', 7'-tetrachlorofluorescein, 5 (or 6) carboxy 2' , 4 ′, 5 ′, 7′-tetrabromofluorescein, 5 (or 6) carboxy 4,7-dichloro-2 ′, 7′-dimethoxyfluorescein, 5 (or 6) carboxy 4,7,4 ', 5'-tetrachloro-2', 7'-dimethoxyfluorescein, 5 (or 6) carboxy 2 ', 7'-dimethoxyfluorescein, 5 (or 6) carboxy 4, A7-dichloro-1' , 2 ', 7', 8'-Dibenzofluore Cein, 5 (or 6) carboxy 4,7-dichloro-1 ′, 2 ′, 7 ′, 8′-dibenzofluorescein, 5 (or 6) carboxytetramethylrhodamine (hereinafter abbreviated as TMR), 5 (or 6) carboxyrhodamine X (hereinafter abbreviated as XR), 5 (or 6) carboxyrhodamine 6G (hereinafter abbreviated as R6G), 5 (or 6) carboxyrhodamine 110 (hereinafter abbreviated as R110) 4,4-difluoro-1,3,5,7-tetramethyl-4-borer 3a, 4a-diaza-s-indacene-8-propionic acid (hereinafter abbreviated as BODIPY493 / 503), 2,6 -Dibromo-4,4-difluoro, 5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-8-propionic acid (hereinafter abbreviated as BODIPY FL Br2) 4,4-difluoro-5-phenyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-8-propionic acid (hereinafter abbreviated as BODIPY R6G) 4,4-difluoro-5,7-diphenyl -4-Bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-8-propionic acid (hereinafter abbreviated as BODIPY530 / 550), 6-((4,4-difluoro-1,3-dimethyl-5 (4- Methoxyphenyl) -4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-2-propionyl) amino) hexanoic acid (hereinafter abbreviated as BODIPY TMR), Oregon Green 488 carboxylic acid, ethidium bromide, 2-methoxy- Examples thereof include those derived from fluorescent dyes such as 6-chloro-9-aminoacridine and 4-trifluoromethyl-7-ω-promopropylaminocoumarin.
When the compound of the present invention is used as a terminator, four methods designed to achieve a stronger signal intensity more efficiently than the conventional four-color fluorescent terminator in the method of determining the DNA base sequence by the chain terminator method. It is important to be an energy transfer terminator. In order to perform the termination reaction simultaneously on four types of AGCT bases, four sets (a combination of a donor dye and an acceptor dye. These may be collectively referred to as a reporter) are provided.

本発明の実施の形態に於いてW1及びW2は、いずれか一方がドナー色素として、他方がアクセプター色素として機能し、W1及びW2のセットとして、具体的には、例えば、ドナー色素A(FAM)、アクセプター色素B(FAM、JOE、TMR、XR)、ドナー色素A(FAM)、アクセプター色素B(FAM、R6G、TMR、XR)、ドナー色素A(FAM)、アクセプター色素B(R6G、TMR、XR、R110)、ドナー色素A(BODIPY 493/503)、アクセプター色素B(BODIPY FLBr2、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY 530/550)、ドナー色素A(FAM)、アクセプター色素B(BODIPY FLBr2、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY 530/550)、ドナー色素A(オレゴングリーン488)、アクセプター色素B(BODIPY FLBr2、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY 530/550)等のセットが好ましく挙げられるがこれらに限定される物ではない。 In the embodiment of the present invention, one of W 1 and W 2 functions as a donor dye, and the other functions as an acceptor dye. As a set of W 1 and W 2 , specifically, for example, a donor dye A (FAM), acceptor dye B (FAM, JOE, TMR, XR), donor dye A (FAM), acceptor dye B (FAM, R6G, TMR, XR), donor dye A (FAM), acceptor dye B (R6G) , TMR, XR, R110), Donor Dye A (BODIPY 493/503), Acceptor Dye B (BODIPY FLBr2, BODIPY R6G, BODIPY TMR, BODIPY 530/550), Donor Dye A (FAM), Acceptor Dye B (BODIPY FLBr2) BODIPY R6G, BODIPY TMR, BODIPY 530/550), donor dye A Oregon Green 488), an acceptor dye B (BODIPY FLBr2, BODIPY R6G, BODIPY TMR, BODIPY 530/550) is set, and the like preferably not be construed as being limited thereto.

本発明の化合物は、2種の蛍光色素を1つのモノ又はオリゴヌクレオチドに結合させてあるため、これらを例えば、ターミネーターとして用いた場合、RNAポリメラーゼ及びDNAポリメラーゼが立体障害なく取り込むことできるという利点を有する。さらに、本発明の化合物は、エネルギートランスファーの原理で感度良く検出できる為の高速な特定の高次構造をとる化学構造を有し、ターミネーター、プライマー及びイニシエーターとして有用である。   Since the compound of the present invention binds two fluorescent dyes to one mono- or oligonucleotide, for example, when these are used as a terminator, RNA polymerase and DNA polymerase can take in without steric hindrance. Have. Furthermore, the compound of the present invention has a chemical structure that takes a specific high-order structure at a high speed so that it can be detected with high sensitivity by the principle of energy transfer, and is useful as a terminator, primer, and initiator.

尚、上記一般式(1)で表される本発明の化合物は、例えば、下記反応式(V)に従って下記一般式(7)で表される化合物と下記一般式(8)で表される化合物とを反応させることにより合成することができる。   The compound of the present invention represented by the general formula (1) is, for example, a compound represented by the following general formula (7) and a compound represented by the following general formula (8) according to the following reaction formula (V): Can be synthesized by reacting with.

Figure 0003656075
(式中、Q及びVは前記と同じ)
Figure 0003656075
(Wherein Q and V are the same as above)

Figure 0003656075
(式中、Suはコハク酸イミド基を示し、他は前記と同じ)
Figure 0003656075
(In the formula, Su represents a succinimide group, and the others are the same as above)

Figure 0003656075
Figure 0003656075

即ち、上記反応式[V]で示されるように、一般式(7)で表される化合物と一般式(8)で表される化合物とを、例えば、DMF、DMF−水等の溶媒中、必要により例えば、4−ジメチルアミノピリジン等の塩基性触媒の存在下、10〜40℃で、1〜数時間反応せさることにより、一般式(1)の化合物を得ることができる。   That is, as shown in the above reaction formula [V], the compound represented by the general formula (7) and the compound represented by the general formula (8) are, for example, in a solvent such as DMF, DMF-water, If necessary, for example, by reacting at 10 to 40 ° C. for 1 to several hours in the presence of a basic catalyst such as 4-dimethylaminopyridine, the compound of the general formula (1) can be obtained.

尚、一般式(7)で表される化合物は、例えば、特開平10−158293号公報9〜18欄 〔0056〕〜〔0067〕にかけて記載された方法、具体的にはその〔実施例〕の項に記載された方法等により合成することができる。   The compound represented by the general formula (7) is, for example, a method described in JP-A-10-158293, columns 9 to 18 [0056] to [0067], specifically, in the [Example]. It can be synthesized by the method described in the section.

また、一般式(8)で表される化合物は、上記反応スキーム中の(I)〜(IV)に従って合成することができる。尚、反応スキーム中のPolyは樹脂(固相)を示す。即ち、固相法等の常法により合成した例えば、(Pro)m-εBoc-Lys(式中、Proはプロリン残基を表し、Lysはリジン残基を表し、Bocはt-ブチルオキシカルボニル基を表し、mは正の整数を表す。)のN末端にW1を導入し〔反応式(I)〕、次いでBoc基を脱保護し〔反応式(II)〕、フリーのアミノ基にW2を導入し〔反応式(III)〕、さらにコハク酸イミド基(Su)を導入する〔反応式(IV)〕こと等により容易に得ることができる。 Moreover, the compound represented by General formula (8) is compoundable according to (I)-(IV) in the said reaction scheme. Poly in the reaction scheme represents a resin (solid phase). That is, for example, (Pro) m-εBoc-Lys (wherein Pro represents a proline residue, Lys represents a lysine residue, and Boc represents a t-butyloxycarbonyl group synthesized by a conventional method such as a solid phase method) And m represents a positive integer.) W 1 is introduced into the N-terminal of [Reaction Formula (I)], and then the Boc group is deprotected [Reaction Formula (II)]. It can be easily obtained by introducing 2 [reaction formula (III)] and further introducing a succinimide group (Su) [reaction formula (IV)].

塩基配列決定方法
(1)エネルギートランスファー機能を有するターミネーターを用いる方法
エネルギートランスファー機能を有するターミネーターを用いる本発明の塩基配列決定方法には、以下の方法がある。
チェインターミネーター法でDNAの塩基配列を決定する方法であって、3’-デオキシリボヌクレオチド残基、並びにエネルギートランスファーのドナー及びアクセプターになり得る二種類のレポーターを有するターミネーターとRNAポリメラーゼとを用いてチェインターミネーション反応を行なう方法(以下、この方法を第1の方法という)。
Base sequence determination method
(1) Method using a terminator having an energy transfer function The base sequence determination method of the present invention using a terminator having an energy transfer function includes the following methods.
A method for determining the base sequence of DNA by the chain terminator method, comprising 3′-deoxyribonucleotide residues, and a terminator having two kinds of reporters that can be donors and acceptors of energy transfer, and chain termination using RNA polymerase A method for carrying out the reaction (hereinafter, this method is referred to as the first method).

さらに、チェインターミネーター法によりDNAの塩基配列を決定する方法であって、前記一般式(1)で表される本発明の化合物をターミネーターとしてチェインターミネーション反応を行なう方法(以下、この方法を第2の方法という)。この方法には、Qが2’,3’-ジデオキシリボヌクレオチド残基である一般式(1)で表される化合物をターミネーターとして用い、かつDNAポリメラーゼを用いる方法とQが3’-デオキシリボヌクレオチド残基である一般式(1)で表される化合物をターミネーターとして用い、かつRNAポリメラーゼを用いる方法とがある。RNAポリメラーゼを用いる方法は、上記第1の方法と重複する。   Furthermore, a method for determining the base sequence of DNA by the chain terminator method, wherein a chain termination reaction is carried out using the compound of the present invention represented by the general formula (1) as a terminator (hereinafter, this method is referred to as a second method). Called the method). In this method, a compound represented by the general formula (1) in which Q is a 2 ′, 3′-dideoxyribonucleotide residue is used as a terminator and DNA polymerase is used, and Q is a residue of 3′-deoxyribonucleotide. There is a method in which a compound represented by the general formula (1) as a group is used as a terminator and RNA polymerase is used. The method using RNA polymerase overlaps with the first method.

上記第1の方法においては、3’-デオキシリボヌクレオチド残基、並びにエネルギートランスファーのドナー及びアクセプターになり得る二種類のレポーターを有するターミネーターを用いる。レポーターは、例えば、蛍光性基のみならず、例えば、リン光を発する基、スピン標識された基、及び電子密度が高い基からなる群からも選ぶことができる。ターミネーター上の二種類のレポーターは、ドナーからアクセプターへのエネルギートランスファーが生じるに十分な距離を介して配置されることが好ましく、 ドナーからアクセプターへのエネルギートランスファーが生じるに十分な距離は、例えば、10〜100Åの範囲である。   In the first method, a terminator having 3'-deoxyribonucleotide residues and two types of reporters that can serve as donors and acceptors for energy transfer is used. The reporter can be selected from, for example, not only a fluorescent group but also a group consisting of a phosphorescent group, a spin-labeled group, and a group having a high electron density. The two types of reporters on the terminator are preferably placed through a distance sufficient to cause energy transfer from the donor to the acceptor, and the distance sufficient to cause energy transfer from the donor to the acceptor is, for example, 10 It is in the range of ~ 100cm.

レポーターが蛍光性基である場合、蛍光性基としては、蛍光強度や蛍光の波長、RNAポリメラーゼによる取り込みの容易さ等を考慮して適宜選択できる。但し、蛍光性基は、アルゴンレーザーのような適切な供給源からのエネルギー吸収による刺激に引き続いて、検知可能な発光放射を生じる蛍光性基であり、蛍光性基は、一方の発光放射波長が他方の励起波長と共鳴する群から選ばれたセットであることが好ましい。
尚、好ましい蛍光性基としては、先にW1及びW2について挙げたもの等を挙げることができる。
When the reporter is a fluorescent group, the fluorescent group can be appropriately selected in consideration of the fluorescence intensity, the fluorescence wavelength, the ease of uptake by RNA polymerase, and the like. However, a fluorescent group is a fluorescent group that produces detectable emission radiation following stimulation by energy absorption from an appropriate source, such as an argon laser, and the fluorescent group has a wavelength of one emission radiation. A set selected from the group resonating with the other excitation wavelength is preferred.
Preferred fluorescent groups include those mentioned above for W 1 and W 2 .

レポーターが蛍光性基である場合、2つの蛍光色素(ドナー、アクセプター)の分子間距離を一定にデザインする。この分子間距離を一定に保たせる為の構造として、例えば、上述のようにプロリンのストレッチを挙げることができる。2つの蛍光色素の分子間距離として10〜100Åの範囲、好ましくは20〜60Å、より好ましくは約30〜50Åであることが適当である。プロリンストレッチの場合、20〜60Åは約5〜16残基に相当し、30〜50Åは8〜12残基に相当する。   When the reporter is a fluorescent group, the intermolecular distance between the two fluorescent dyes (donor and acceptor) is designed to be constant. Examples of the structure for keeping the intermolecular distance constant include, for example, proline stretch as described above. The intermolecular distance between the two fluorescent dyes is suitably in the range of 10 to 100 cm, preferably 20 to 60 mm, more preferably about 30 to 50 mm. In the case of proline stretch, 20 to 60 Å corresponds to about 5 to 16 residues, and 30 to 50 に corresponds to 8 to 12 residues.

レポーターが蛍光性基である場合、チェーンターミネーター法でDNAの塩基配列を決定する方法に於いて、従来の4色蛍光ターミネーターより効率よく強いシグナル強度を実現する為に設計された4種のエネルギートランスファーターミネーターを選択することが好ましい。AGCT4種の塩基について同時にターミネーション反応を実施する為には、4種のセット(ドナー色素とアクセプター色素の組み合わせ)を用いる。そのようなセットとして、具体的には、例えば、ドナー色素A(FAM)、アクセプター色素B(FAM、JOE、TMR、XR)、ドナー色素A(FAM)、アクセプター色素B(FAM、R6G、TMR、XR)、ドナー色素A(FAM)、アクセプター色素B(R6G、TMR、XR、R110)、ドナー色素A(BODIPY 493/503)、アクセプター色素B(BODIPY FLBr2、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY 530/550)、ドナー色素A(FAM)、アクセプター色素B(BODIPY FLBr2、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY 530/550)、ドナー色素A(オレゴングリーン488)、アクセプター色素B(BODIPY FLBr2、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY 530/550)等のセットが好ましく挙げられるがこれらに限定される物ではない。   When the reporter is a fluorescent group, four types of energy transfer designed to realize stronger signal intensity more efficiently than the conventional four-color fluorescent terminator in the method of determining the DNA base sequence by the chain terminator method. It is preferable to select a terminator. In order to perform the termination reaction simultaneously on the four types of AGCT bases, four sets (a combination of a donor dye and an acceptor dye) are used. As such a set, specifically, for example, donor dye A (FAM), acceptor dye B (FAM, JOE, TMR, XR), donor dye A (FAM), acceptor dye B (FAM, R6G, TMR, XR), donor dye A (FAM), acceptor dye B (R6G, TMR, XR, R110), donor dye A (BODIPY 493/503), acceptor dye B (BODIPY FLBr2, BODIPY R6G, BODIPY TMR, BODIPY 530/550) ), Donor dye A (FAM), acceptor dye B (BODIPY FLBr2, BODIPY R6G, BODIPY TMR, BODIPY 530/550), donor dye A (Oregon Green 488), acceptor dye B (BODIPY FLBr2, BODIPY R6G, BOD) PY TMR, BODIPY 530/550) is set, and the like preferably not be construed as being limited thereto.

このようなレポーターが蛍光性基であるターミネーターとしては、具体的には、例えば、前記一般式(1)で表される本発明化合物を挙げることができる。
本発明の第2の塩基配列決定方法は、チェインターミネーター法による方法であって、チェインターミネーション反応を前記一般式(1)で示される本発明の化合物をターミネーターとして用いて行なうことを特徴とする。但し、本発明の第2の方法は、ポリメラーゼとしてRNAポリメラーゼを用いる方法以外に、ポリメラーゼとしてDNAポリメラーゼを用いる方法も包含する。
Specific examples of the terminator in which such a reporter is a fluorescent group include the compound of the present invention represented by the general formula (1).
The second base sequence determination method of the present invention is a method based on the chain terminator method, characterized in that the chain termination reaction is performed using the compound of the present invention represented by the general formula (1) as a terminator. However, the second method of the present invention includes a method using a DNA polymerase as a polymerase in addition to a method using an RNA polymerase as a polymerase.

本発明の第1の方法及び第2の方法において、ターミネーターとして、前記化合物を用いる以外は、公知の方法をそのまま利用することができる。ポリメラーゼとしてDNAポリメラーゼを用いる方法は、例えば、特開平1−180455号、特表平5−502371号、特表平6−510433号に開示されている。また、DNAポリメラーゼは、耐熱性を改善したポリメラーゼや塩基の種類による取り込み率の違いを改善した変異型ポリメラーゼであることもできる。   In the first method and the second method of the present invention, a known method can be used as it is except that the compound is used as a terminator. Methods using DNA polymerase as the polymerase are disclosed in, for example, JP-A-1-180455, JP-A-5-502371, JP-A-6-510433. The DNA polymerase can also be a polymerase with improved heat resistance or a mutant polymerase with improved difference in uptake rate depending on the type of base.

ポリメラーゼとしてDNAポリメラーゼを用い、かつターミネーターとして前記一般式(1)に記載の化合物を用いる場合、この化合物は、2’,3’-ジデオキシリボヌクレオチド残基を有し、かつn1またはn2が3以上、より好ましくは3〜10の整数であることが、DNAポリメラーゼによる取り込みが良好であり、精度が高いシークエンスデータが得られるという観点から好ましい。   When DNA polymerase is used as the polymerase and the compound represented by the general formula (1) is used as the terminator, this compound has 2 ′, 3′-dideoxyribonucleotide residues and n1 or n2 is 3 or more. More preferably, it is an integer of 3 to 10 from the viewpoint of good uptake by DNA polymerase and obtaining highly accurate sequence data.

ポリメラーゼとしてRNAポリメラーゼを用いる場合、ターミネーターとして、3’−デオキシリボヌクレオチド残基を有する本発明のターミネーター、又は本発明の一般式(1)で示される3’-デオキシリボヌクレオチド残基を有する化合物を用いる。ポリメラーゼとしてRNAポリメラーゼを用いる塩基配列決定方法は、本発明のターミネーターまたは化合物を用いる以外は、例えば、WO96/14434に記載の方法を用いることができる。
即ち、RNAポリメラーゼ及び前記RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含むDNA断片の存在下、ATP、GTP、CTP及びUTP又はそれらの誘導体からなるリボヌクレオシド5'−トリフォスフェート類並びにターミネーターとして、本発明のターミネーターから選ばれる3’dATP、3’dGTP、3’dCTP、3’dUTPの誘導体からなる1種又は2種以上、好ましくは4種類の3’−デオキシリボヌクレオシド5'−トリフォスフェート(3’−dNTP誘導体)を反応させて核酸転写生成物を得、得られる核酸転写生成物を分離し、得られる分離分画から核酸の配列を読み取ることで、DNAの塩基配列を決定することができる。
When RNA polymerase is used as the polymerase, the terminator of the present invention having a 3′-deoxyribonucleotide residue or a compound having a 3′-deoxyribonucleotide residue represented by the general formula (1) of the present invention is used as a terminator. For the base sequence determination method using RNA polymerase as the polymerase, for example, the method described in WO96 / 14434 can be used except that the terminator or compound of the present invention is used.
That is, in the presence of RNA polymerase and a DNA fragment containing a promoter sequence for the RNA polymerase, ribonucleoside 5′-triphosphates consisting of ATP, GTP, CTP and UTP or their derivatives, and a terminator are used. One or more of 3′dATP, 3′dGTP, 3′dCTP, and 3′dUTP derivatives selected from terminators, preferably four kinds of 3′-deoxyribonucleoside 5′-triphosphates (3′- dNTP derivative) is reacted to obtain a nucleic acid transcription product, the resulting nucleic acid transcription product is separated, and the nucleic acid sequence is read from the obtained separated fraction, whereby the DNA base sequence can be determined.

また、RNAポリメラーゼは、耐熱性を改善したポリメラーゼや塩基の種類による取り込み率の違いを改善した変異型ポリメラーゼであることもできる。鋳型となるDNA断片には、RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含むこと以外、制限はない。例えば、プロモーター配列を含むDNA断片がポリメラーゼ連鎖反応(PCR法)により増幅したDNA生成物であることができる。さらに、増幅したDNA生成物から、ポリメラーゼ連鎖反応に用いたプライマー及び/又は2'デオキシリボヌクレオシド5’トリフォスフェート及び/又はその誘導体を除去することなしに、本発明の方法における核酸転写生成反応を行うことができる。また、プロモーター配列を含むDNA断片は、プロモーター配列と増幅対象のDNA断片とをライゲーションした後、適当な宿主を用いてクローニングされたDNA断片であることもできる。   The RNA polymerase can also be a polymerase with improved heat resistance or a mutant polymerase with improved difference in uptake rate depending on the type of base. There is no restriction | limiting in the DNA fragment used as a template other than including the promoter sequence for RNA polymerase. For example, it can be a DNA product obtained by amplifying a DNA fragment containing a promoter sequence by a polymerase chain reaction (PCR method). Furthermore, the nucleic acid transcription reaction in the method of the present invention can be carried out without removing the primer and / or 2 ′ deoxyribonucleoside 5 ′ triphosphate and / or its derivative used in the polymerase chain reaction from the amplified DNA product. It can be carried out. In addition, the DNA fragment containing the promoter sequence may be a DNA fragment cloned using a suitable host after ligating the promoter sequence and the DNA fragment to be amplified.

ポリメラーゼとしてRNAポリメラーゼを用い、かつターミネーターとして前記一般式(1)に記載の化合物を用いる場合、この化合物は、3’-デオキシリボヌクレオチド残基を有し、かつn1またはn2が4以上、より好ましくは4〜10の整数であることが、RNAポリメラーゼによる取り込みが良好であり、精度が高いシークエンスデータが得られるという観点から好ましい。   When RNA polymerase is used as the polymerase and the compound represented by the general formula (1) is used as the terminator, this compound has a 3′-deoxyribonucleotide residue and n1 or n2 is 4 or more, more preferably An integer of 4 to 10 is preferable from the viewpoint of good uptake by RNA polymerase and obtaining highly accurate sequence data.

さらに本発明のDNAの塩基配列決定方法においては、上記本発明のターミネーターまたは上記一般式(1)で表される化合物から選ばれた、4種類の塩基に対応する4種類のターミネーター(但し、各ターミネーターは、アクセプターとして異なる4種類のレポーターをそれぞれ有する)を用い、かつチェインターミネーション反応を同一の反応系内で行うことができる。尚、ターミネーターとして一般式(1)で表される化合物を用いる場合、W1及びW2のいずれか一方がアクセプターとなり、各化合物は、異なる4種類のアクセプターをそれぞれ有する。この方法においては、4種のAGCTに対応するターミネーターの取り込み反応を1本のチューブで行なうことで、より少ない操作でより効率的に塩基配列の決定を行うことができる。 Furthermore, in the method for determining the base sequence of the DNA of the present invention, four terminators corresponding to four types of bases selected from the terminator of the present invention or the compound represented by the general formula (1) (however, each Each terminator has four different reporters as acceptors), and the chain termination reaction can be carried out in the same reaction system. In the case of using the compound represented by the general formula (1) as a terminator, it is either one acceptor W 1 and W 2, each compound has four different acceptors, respectively. In this method, the base sequence can be determined more efficiently with fewer operations by carrying out the incorporation reaction of the terminators corresponding to the four types of AGCT in one tube.

さらに、本発明の方法においては、チェインターミネーション反応を後述のように無機ピロフォスファターゼの存在下で行うことが、各リボヌクレオチドに対応して得られるピークの高さの差を小さくしてシークエンスの読み取りの精度を向上させることができるという観点から好ましい。   Furthermore, in the method of the present invention, the chain termination reaction can be performed in the presence of inorganic pyrophosphatase as described later, thereby reducing the difference in peak heights corresponding to each ribonucleotide and reading the sequence. This is preferable from the viewpoint of improving the accuracy.

(2)エネルギートランスファー機能を有するプライマーを用いる方法
本発明の第3のDNAの塩基配列決定方法は、プライマー法によりDNAの塩基配列を決定する方法であって、Qがオリゴヌクレオチド残基である一般式(1)で表される本発明の化合物、中でも、Qが2‘−デオキシリボヌクレオチド残基を末端に有するオリゴヌクレオチド残基である本発明の化合物をプライマーとして用いることを特徴とする方法である。
本発明の第3の方法では、プライマーとして上記化合物を用いる以外は、DNAポリメラーゼを用いた公知のダイデオキシ法を利用することができる。公知の方法としては、例えば、WO95/21266、特開平10-88124号に開示された方法を利用することができる。
(2) Method using a primer having an energy transfer function The third DNA base sequence determination method of the present invention is a method for determining a DNA base sequence by a primer method, wherein Q is an oligonucleotide residue. It is a method characterized by using, as a primer, a compound of the present invention represented by formula (1), in particular, a compound of the present invention in which Q is an oligonucleotide residue having a 2′-deoxyribonucleotide residue at its terminal. .
In the third method of the present invention, a known dideoxy method using a DNA polymerase can be used except that the above compound is used as a primer. As a known method, for example, the method disclosed in WO95 / 21266 and JP-A-10-88124 can be used.

(3)エネルギートランスファー機能を有するイニシエーターを用いる方法
本発明の第4のDNA塩基配列決定方法は、チェインターミネーター法でDNAの塩基配列を決定する方法であって、5'末端にフォスフェート基を持たないか、またはモノ若しくはジフォスフェート基を有するモノまたはオリゴヌクレオチド残基、並びにエネルギートランスファーのドナー及びアクセプターになり得る二種類のレポーターを有するイニシエーターとRNAポリメラーゼとを用いてチェインターミネーション反応を行なうことを特徴とする方法である。上記イニシエーターとして、Qが5'末端にフォスフェート基を持たないか、モノまたはジフォスフェート基を有するモノまたはオリゴヌクレオチド残基である一般式(1)で表される本発明の化合物を用いることができる。
(3) A method using an initiator having an energy transfer function A fourth DNA base sequence determination method of the present invention is a method for determining a DNA base sequence by a chain terminator method, wherein a phosphate group is added to the 5 ′ end. A chain termination reaction is carried out using an RNA polymerase and an initiator having two or more mono- or oligonucleotide residues having no or a mono- or diphosphate group and potential energy transfer donors and acceptors. It is the method characterized by this. As the initiator, a compound of the present invention represented by the general formula (1) in which Q does not have a phosphate group at the 5 ′ end or is a mono or oligonucleotide residue having a mono or diphosphate group is used. be able to.

この方法は、より具体的には、RNAポリメラーゼ及び前記RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含むDNA断片の存在下、ATP、GTP、CTP及びUTP又はそれらの誘導体からなるリボヌクレオシド5’トリフォスフェート類並びに3’dATP、3’dGTP、3’dCTP、3’dUTP及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる1種の3’デオキシリボヌクレオシド5’トリフォスフェート(以下3’dNTP誘導体という)を反応させて核酸転写生成物を得、得られる核酸転写生成物を分離し、得られる分離分画から核酸の配列を読み取ることを含むDNAの塩基配列決定方法であって、前記核酸転写反応のイニシエーターとして、上記イニシエーターを用いる。ターミネーターとしての3’dNTP誘導体は、非標識の化合物を用いることができる。   More specifically, this method comprises ribonucleoside 5 ′ triphosphates comprising ATP, GTP, CTP and UTP or their derivatives in the presence of RNA polymerase and a DNA fragment containing a promoter sequence for said RNA polymerase. And 3'dATP, 3'dGTP, 3'dCTP, 3'dUTP, and one 3 'deoxyribonucleoside 5' triphosphate (hereinafter referred to as 3'dNTP derivative) selected from the group consisting of derivatives thereof. A method for determining a DNA base sequence comprising obtaining a nucleic acid transcription product, separating the obtained nucleic acid transcription product, and reading a nucleic acid sequence from the obtained separated fraction, as an initiator of the nucleic acid transcription reaction, The above initiator is used. An unlabeled compound can be used as the 3'dNTP derivative as a terminator.

RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含むDNA断片を鋳型として、RNAポリメラーゼを用いて核酸転写生成物を酵素的に合成する方法、核酸転写生成物の分離方法、さらには分離された分画から核酸の配列を読み取る方法は、原理的には何れも公知の方法である。従って、これらの点に関して、いずれの公知の方法及び条件、装置等を適宜利用することができる。例えば、WO96/14434に記載されたターミネーター法に関する記載を適宜参照することができる。   Using a DNA fragment containing a promoter sequence for RNA polymerase as a template, a method for enzymatically synthesizing a nucleic acid transcription product using RNA polymerase, a method for separating a nucleic acid transcription product, and a method for separating nucleic acid from a separated fraction In principle, any method for reading an array is a known method. Accordingly, any known method, conditions, apparatus, and the like can be used as appropriate regarding these points. For example, the description regarding the terminator method described in WO96 / 14434 can be appropriately referred to.

鋳型となるDNA断片には、RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含むこと以外、制限はない。例えば、プロモーター配列を含むDNA断片がポリメラーゼ連鎖反応により増幅したDNA生成物であることができる。さらに、増幅したDNA生成物から、PCR法に用いたプライマー及び/又は2'デオキシリボヌクレオシド5’トリフォスフェート及び/又はその誘導体を除去することなしに、本発明の方法における核酸転写生成反応を行うことができる。また、プロモーター配列を含むDNA断片は、プロモーター配列と増幅対象のDNA断片とをライゲーションした後、適当な宿主を用いてクローニングされたDNA断片であることもできる。即ち、本発明において、増幅の対象であるDNA配列、プライマー、増幅のための条件等には特に制限はない。   There is no restriction | limiting in the DNA fragment used as a template other than including the promoter sequence for RNA polymerase. For example, a DNA product containing a promoter sequence and amplified by polymerase chain reaction can be used. Furthermore, the nucleic acid transcription reaction in the method of the present invention is carried out without removing the primer and / or 2 ′ deoxyribonucleoside 5 ′ triphosphate and / or its derivative used in the PCR method from the amplified DNA product. be able to. In addition, the DNA fragment containing the promoter sequence may be a DNA fragment cloned using a suitable host after ligating the promoter sequence and the DNA fragment to be amplified. That is, in the present invention, there are no particular limitations on the DNA sequence, primers, amplification conditions, and the like that are to be amplified.

例えば、プロモーター配列を含むDNA断片の増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応の反応系として、10〜50ngのゲノミックDNA又は1pgのクローンされたDNA、10μMの各プライマー、200μMの各2’デオキシリボヌクレオシド5’トリフォスフェート(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)を含む20μl容量中でDNAポリメラーゼとして、例えばTaqポリメラーゼ等を用いて行うことができる。   For example, as a reaction system of polymerase chain reaction for amplification of a DNA fragment containing a promoter sequence, 10-50 ng genomic DNA or 1 pg cloned DNA, 10 μM each primer, 200 μM each 2 ′ deoxyribonucleoside 5 ′ trifo For example, Taq polymerase can be used as a DNA polymerase in a 20 μl volume containing sulfate (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

但し、ポリメラーゼ連鎖反応のためのプライマーのいずれか一方又は増幅された挿入(insert)DNAが、後述するRNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む必要がある。ダイレクト転写シークエンシング法では、PCR法において、2種類のプライマーのいずれか一方にファージプロモーター配列を持っているプライマーを用いるか、又は増幅された挿入DNA内にファージプロモーター配列を持たせることで、得られるPCR生成物はそのプロモーターにより働くRNAポリメラーゼを用いるin vitro転写に付すことができる。
RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列は、用いるRNAポリメラーゼの種類に応じて適宜選択することができる。
However, either one of the primers for the polymerase chain reaction or the amplified insert DNA needs to contain a promoter sequence for RNA polymerase described later. In the direct transcription sequencing method, a PCR method is used by using a primer having a phage promoter sequence in one of two types of primers, or by having a phage promoter sequence in the amplified inserted DNA. The resulting PCR product can be subjected to in vitro transcription using RNA polymerase working by its promoter.
The promoter sequence for RNA polymerase can be appropriately selected depending on the type of RNA polymerase used.

本発明の第4の方法ではプロモーター配列を含むDNA断片からRNA等の転写物を合成する。DNA断片は、RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含むので、このプロモーター配列が前述のRNAポリメラーゼに認識されてRNA転写物等の核酸転写物を合成する。   In the fourth method of the present invention, a transcript such as RNA is synthesized from a DNA fragment containing a promoter sequence. Since the DNA fragment contains a promoter sequence for RNA polymerase, this promoter sequence is recognized by the aforementioned RNA polymerase to synthesize a nucleic acid transcript such as an RNA transcript.

RNA等の転写物の合成は、前記核酸転写開始剤及びRNAポリメラーゼの存在下、ATP、GTP、CTP及びUTP又はこれらの誘導体からなるリボヌクレオシド5’トリフォスフェート(NTP)類並びに1種の3’dNTP誘導体を反応させる。尚、3’dNTP誘導体は、本明細書においては、3’dATP、3’dGTP、3’dCTP、3’dUTP及びこれらの誘導体の総称として用いる。リボヌクレオシド5’トリフォスフェート(NTP)類としては、その一部がNTP等の誘導体である場合も含めて、塩基が異なる少なくとも4種類の化合物が転写物の合成に必要である。   Synthesis of transcripts such as RNA is carried out in the presence of the nucleic acid transcription initiator and RNA polymerase in the presence of ribonucleoside 5 ′ triphosphates (NTPs) composed of ATP, GTP, CTP and UTP or derivatives thereof, and one type of 3 'DNTP derivative is reacted. In the present specification, the 3'dNTP derivative is used as a general term for 3'dATP, 3'dGTP, 3'dCTP, 3'dUTP and derivatives thereof. As ribonucleoside 5 'triphosphates (NTPs), at least four kinds of compounds having different bases are required for the synthesis of transcripts, including the case where some of them are derivatives such as NTP.

転写生成物であるRNA又は核酸の3’末端には、3’dNTP誘導体が取り込まれることにより、3’ヒドロキシ基が欠落し、RNA又は核酸の合成が阻害される。その結果、3’末端が3’dNTP誘導体である種々の長さのRNA又は核酸断片が得られる。塩基の異なる4種類の3’dNTP誘導体について、それぞれ、このようなリボヌクレオシド・アナログ体を得る。このリボヌクレオシド・アナログ体を4通り用意することで、RNA又は核酸配列の決定に用いることができる〔Vladimir D. Axelred er al. (1985) Biochemistry Vol. 24, 5716-5723 〕。   By incorporating a 3'dNTP derivative into the 3 'end of RNA or nucleic acid that is a transcription product, the 3' hydroxy group is lost and the synthesis of RNA or nucleic acid is inhibited. As a result, RNAs or nucleic acid fragments of various lengths having a 3 'end that is a 3'dNTP derivative are obtained. Such ribonucleoside analogs are obtained for each of the four types of 3'dNTP derivatives having different bases. By preparing four ribonucleoside analogs, it can be used to determine RNA or nucleic acid sequences [Vladimir D. Axelred er al. (1985) Biochemistry Vol. 24, 5716-5723].

尚、3’dNTP誘導体は、1つの核酸転写反応に1種類を用い、異なる4種類の3’dNTP誘導体を用いて4回核酸転写反応を行い、3’末端の3’dNTP誘導体の塩基の異なる4通りの転写生成物を得る。1回の核酸転写反応で、3’末端の3’dNTP誘導体は同一で、分子量の異なる種々のRNA又は核酸断片の混合物である転写生成物が得られる。得られた4通りの転写生成物について、独立に、後述する分離及び配列の読み取りに供することができる。また、4通りの転写生成物の2種以上を混合し、この混合物を分離及び配列の読み取りに供することもできる。   One 3 ′ dNTP derivative is used for one nucleic acid transcription reaction, four different nucleic acid transcription reactions are performed using four different 3 ′ dNTP derivatives, and the base of the 3 ′ dNTP derivative at the 3 ′ end is different. Four kinds of transcription products are obtained. In one nucleic acid transcription reaction, a transcription product is obtained which is a mixture of various RNAs or nucleic acid fragments having the same 3'dNTP derivative at the 3 'end and different molecular weights. The obtained four transcription products can be independently subjected to separation and sequence reading described later. It is also possible to mix two or more of the four transcription products and to use this mixture for separation and sequence reading.

本発明の第4の方法で用いるRNAポリメラーゼは、野性型RNAポリメラーゼ及び変異型RNAポリメラーゼのいずれでも良い。RNAポリメラーゼについては、前記第1または第2の方法に関する記載を参照できる。   The RNA polymerase used in the fourth method of the present invention may be either wild type RNA polymerase or mutant RNA polymerase. Regarding RNA polymerase, the description relating to the first or second method can be referred to.

無機ピロフォスファターゼ
本発明の第1〜第4の方法において、核酸転写生成反応は、無機ピロフォスファターゼ存在下で行うことが好ましい。各標識されたリボヌクレオチドに対応して得られるピークの高さ(シグナルの強弱)の差を小さくしてシークエンスの読み取りの精度を向上させて、より正確なシークエンスデータを得ることを可能にする。
ピロホスホロリシスは、DNA合成によって生じるピロリン酸塩が増加することによって起こり、結果として合成されたDNA生成物が分解する方向に反応を促進する働きをする。その結果、ピロホスホロリシスは、DNAポリメラーゼを用いたジデオキシシークエンシング法においてシークエンシングを阻害することになる。それに対して、無機ピロフォスファターゼをDNAポリメラーゼを用いたジデオキシシークエンシング法において使用すると、ピロホスホロリシスを阻害して、安定したシークエンスデータが得られることが知られている[特開平4−506002号]。
Inorganic pyrophosphatase In the first to fourth methods of the present invention, the nucleic acid transcription production reaction is preferably performed in the presence of inorganic pyrophosphatase. The difference in peak height (signal strength) obtained corresponding to each labeled ribonucleotide is reduced to improve the accuracy of sequence reading, and it is possible to obtain more accurate sequence data.
Pyrophosphorolysis is caused by an increase in pyrophosphate produced by DNA synthesis, and serves to promote the reaction in a direction in which the synthesized DNA product is degraded. As a result, pyrophosphorolysis inhibits sequencing in the dideoxy sequencing method using DNA polymerase. On the other hand, when inorganic pyrophosphatase is used in a dideoxy sequencing method using DNA polymerase, it is known that pyrophosphorolysis is inhibited and stable sequence data can be obtained [Japanese Patent Laid-Open No. 4-506002. ].

ピロホスホロリシスは、RNAポリメラーゼを用いたシークエンシング法においても有効である。即ち、核酸転写生成反応を無機ピロフォスファターゼ存在下で行うことで、各標識されたリボヌクレオチドに対応して得られるピークの高さ(シグナルの強弱)の差を小さくでき、より安定したシークエンスデータが得られる。
無機ピロフォスファターゼ(EC.3.6.1.1)は、市販品として入手可能であり、例えば、シクマ社からINORGANIC PYROPHOSPHATASEとして、またベーリンガー社からピロフォスファターゼとして市販されている。また、無機ピロフォスファターゼの使用量は、無機ピロフォスファターゼ及びRNAポリメラーゼの活性の程度にもよるが、例えば、RNAポリメラーゼ1単位に対して10-6〜10-2単位の範囲とすることが適当である。
Pyrophosphorolysis is also effective in sequencing methods using RNA polymerase. That is, by performing the nucleic acid transcription production reaction in the presence of inorganic pyrophosphatase, the difference in peak height (signal strength) obtained corresponding to each labeled ribonucleotide can be reduced, and more stable sequence data can be obtained. can get.
Inorganic pyrophosphatase (EC.3.6.1.1) is commercially available, for example, commercially available as INORGANIC PYROPHOSPHATASE from Shikuma and as pyrophosphatase from Boehringer. Further, the amount of inorganic pyrophosphatase used depends on the degree of activity of inorganic pyrophosphatase and RNA polymerase, but for example, it is suitable to be in the range of 10 −6 to 10 −2 units per unit of RNA polymerase. is there.

本発明によれば、蛍光色素のようなレポーターを1つしか有さない通常の蛍光標識ターミネーターに比べて、それに対応するシグナルが同一分子数で5〜20倍感度が上がる。特に、多本化キャピラリーシークエンサー等またリソグラフィーチャンネルにより、超微細リソグラフィーチャンネルによる電気泳動等による場合、特に効果を示す。特に多本化の傾向は1本の電気泳動レーンの断面積が小さくなる傾向にあり、断面積にローディングできるDNA量がほぼ比例すると考えられる。   According to the present invention, compared with a normal fluorescent labeling terminator having only one reporter such as a fluorescent dye, the corresponding signal is 5 to 20 times more sensitive with the same number of molecules. In particular, the present invention is particularly effective when electrophoresis is performed using a hyperfine lithography channel such as a multi-capillary capillary sequencer or a lithography channel. In particular, the tendency to increase the number of strands tends to reduce the cross-sectional area of one electrophoresis lane, and the amount of DNA that can be loaded on the cross-sectional area is considered to be approximately proportional.

その為ローディングできるDNA量は電気泳動レーン直径の2乗に反比例することが考えられ、そこで多本化の為にはキャピラリーアレーもしくはリソグラフィーによる超微細な泳動チャンネルの幅は1本のキャピラリーの直径に比例し、結局キャピラリーアレー全体の幅を一定とした場合、その感度は本数の2乗に比例した感度が要求される。   Therefore, the amount of DNA that can be loaded is considered to be inversely proportional to the square of the electrophoresis lane diameter. Therefore, for the purpose of diversification, the width of the ultrafine electrophoresis channel by capillary array or lithography is equal to the diameter of one capillary. When the width of the entire capillary array is constant, the sensitivity is required to be proportional to the square of the number.

本発明はこのシークエンシングレーンの多本化に極めて効果があると考えられる。また、本発明は非常に分子量の大きな構造体を1つのターミネーターヌクレオチドに結合させる為、最終的にできたシークエンシング反応産物の電気泳動の移動度が通常のターミネーターを用いた時よりも遅れる傾向にある。その為、新たにシークエンサーのベースコールのコンピューターソフトウェアをプログラムすることが適当である。   The present invention is considered to be extremely effective in diversifying this sequencing lane. In addition, since the present invention binds a structure having a very large molecular weight to one terminator nucleotide, the mobility of electrophoresis of the final sequencing reaction product tends to be delayed compared to when a normal terminator is used. is there. Therefore, it is appropriate to newly program the sequencer base call computer software.

以下実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
尚、以下の実施例において用いる略号は以下のとおりである。
Fmoc:9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基
Boc:t−ブチルオキシカルボニル基
Lys:リジン
Pro:プロリン
Ac:アセチル基
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
In addition, the symbol used in the following Examples is as follows.
Fmoc: 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group
Boc: t-butyloxycarbonyl group
Lys: Lysine Pro: Proline Ac: Acetyl group

合成例1 FAM-(Pro)8-Lys(εTMR)の合成
(1)FAM-(Pro)8-Lysの合成
αFmoc-εBoc-Lys-Alko樹脂(100〜200mesh,渡辺化学工業(株)社製)5.0g(αFmoc-εBoc-Lysとして2.4mmol)を出発原料として、文献(ペプチド合成の基礎と実験(丸善出版)p218)記載の方法に従って、固相法により合成した。
即ち、先ず、αFmoc-εBoc-Lys-Alko樹脂をピペリジンにより処理してFmoc基を除去した。これと、樹脂上のLysに対して3倍当量のFmoc-Pro(和光純薬工業(株)社製)を含む1-メチルー2-ピロリドン溶液、3倍当量のHOBt、及び3倍当量のN、N'ージイソプロピルカルボジイミドを加え、室温で5時間縮合反応を行う操作により、順次アミノ酸を導入した。全アミノ酸を導入後、3倍当量5-カルボキシフルオレッセインコハク酸イミドエステル(モレキュラープローブ社製)を縮合した。 反応終了後、樹脂をMeOH洗浄し、55%TFA-ジクロロメタンとアニソール(1ml)混液100mlを加えて室温で1時間攪拌反応させて、目的のFAM標識ポリペプチドを樹脂から切断すると同時にBoc基(Lysのεアミノ基の保護基)を切断させた。反応終了後、樹脂を濾去し、濾液を減圧濃縮後エーテルを加え反応生成物を沈殿させた。沈殿を集め、デシケーターで乾燥させ、FAM-(Pro)8-Lys 2.2gを得た。
Synthesis Example 1 Synthesis of FAM- (Pro) 8-Lys (εTMR) (1) Synthesis of FAM- (Pro) 8-Lys αFmoc-εBoc-Lys-Alko resin (100-200mesh, manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.) ) 5.0 g (2.4 mmol as αFmoc-εBoc-Lys) was used as a starting material, and was synthesized by a solid phase method according to the method described in the literature (Peptide Synthesis Fundamentals and Experiments (Maruzen Publishing) p218).
That is, first, αFmoc-εBoc-Lys-Alko resin was treated with piperidine to remove the Fmoc group. 1-methyl-2-pyrrolidone solution containing 3 times equivalent Fmoc-Pro (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 3 times equivalent HOBt, and 3 times equivalent N with respect to Lys on the resin N'-diisopropylcarbodiimide was added, and amino acids were sequentially introduced by an operation of performing a condensation reaction at room temperature for 5 hours. After all amino acids were introduced, 3-fold equivalent 5-carboxyfluorescein succinimide ester (manufactured by Molecular Probes) was condensed. After completion of the reaction, the resin was washed with MeOH, 100 ml of a mixture of 55% TFA-dichloromethane and anisole (1 ml) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour to cleave the desired FAM-labeled polypeptide from the resin and at the same time the Boc group (Lys Ε-amino group protecting group) was cleaved. After completion of the reaction, the resin was removed by filtration, the filtrate was concentrated under reduced pressure, and ether was added to precipitate the reaction product. The precipitate was collected and dried with a desiccator to obtain 2.2 g of FAM- (Pro) 8-Lys.

(2) FAM-(Pro)8-Lys(εTMR)の合成
合成例1−(1)で合成したFAM-(Pro)8-Lys 500mgをDMF1mlに溶解し、3倍当量のトリエチルアミンと2.5倍当量の5-カルボキシテトラメチルローダミンコハク酸イミドエステル(モレキュラープローブ社製)を加え、室温で19時間反応させた。反応終了後、反応液を減圧濃縮し得られた残渣をゲル濾過カラム(セファデクスLH20、ファルマシア社製)を用いて精製し、FAM-(Pro)8-Lys(εTMR) 420mgを得た。
(2) Synthesis of FAM- (Pro) 8-Lys (εTMR) 500 mg of FAM- (Pro) 8-Lys synthesized in Synthesis Example 1- (1) was dissolved in 1 ml of DMF, 3 times equivalent of triethylamine and 2.5 times equivalent Of 5-carboxytetramethylrhodamine succinimide ester (Molecular Probes) was added and allowed to react at room temperature for 19 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was concentrated under reduced pressure, and the resulting residue was purified using a gel filtration column (Sephadex LH20, manufactured by Pharmacia) to obtain 420 mg of FAM- (Pro) 8-Lys (εTMR).

合成例2 FAM-(Pro)8-Lys(εXR)の合成
合成例1−(1)で得たFAM-(Pro)8-Lys 500mgと2.5倍当量の5-カルボキシーX−ローダミンコハク酸イミドエステル(モレキュラープローブ社製)とを合成例1−(2)と同じ試薬を用い、同様の操作を行って、FAM-(Pro)8-Lys(εXR) 380mgを得た。
Synthesis Example 2 Synthesis of FAM- (Pro) 8-Lys (εXR) 500 mg of FAM- (Pro) 8-Lys obtained in Synthesis Example 1- (1) and 2.5 equivalents of 5-carboxy-X-rhodamine succinimide ester (Molecular Probe Co., Ltd.) was used in the same manner as in Synthesis Example 1- (2) to obtain 380 mg of FAM- (Pro) 8-Lys (εXR).

合成例3 FAM-(Pro)8-Lys(εR6G)の合成
合成例1−(1)で得たFAM-(Pro)8-Lys 500mgと2.5倍当量の5-カルボキシローダミン6Gコハク酸イミドエステル(モレキュラープローブ社製)とを合成例1−(2)と同じ試薬を用い、同様の操作を行って、FAM-(Pro)8-Lys(εR6G) 400mgを得た。
Synthesis Example 3 Synthesis of FAM- (Pro) 8-Lys (εR6G) 500 mg of FAM- (Pro) 8-Lys obtained in Synthesis Example 1- (1) and 2.5 equivalents of 5-carboxyrhodamine 6G succinimide ester ( (Molecular Probe Co., Ltd.) was used in the same manner as in Synthesis Example 1- (2) to obtain 400 mg of FAM- (Pro) 8-Lys (εR6G).

合成例4 FAM-(Pro)8-Lys(εR110)の合成
合成例1−(1)で得たFAM-(Pro)8-Lys 500mgと3.5倍当量の5-カルボキシローダミン110ビス-トリフルオロアセテートコハク酸イミドエステル(モレキュラープローブ社製)とを合成例1−(2)と同じ試薬を用い、反応終了後、同様の操作を行って、FAM-(Pro)8-Lys(εR110) 300mgを得た。
Synthesis Example 4 Synthesis of FAM- (Pro) 8-Lys (εR110) 500 mg of FAM- (Pro) 8-Lys obtained in Synthesis Example 1- (1) and 3.5-fold equivalent of 5-carboxyrhodamine 110 bis-trifluoroacetate Using succinimide ester (Molecular Probe Co., Ltd.) and the same reagent as in Synthesis Example 1- (2), the same operation was performed after the reaction was completed to obtain 300 mg of FAM- (Pro) 8-Lys (εR110). It was.

合成例5 FAM-(Pro)10-Lys(εTMR)の合成
(1)FAM-(Pro)10-Lysの合成
αFmoc-εBoc-Lys-Alko樹脂(100〜200mesh,渡辺化学工業(株)社製)5.0g(αFmoc-εBoc-Lysとして2.4mmol)を出発原料として、合成例1と同様の操作を行いH-Pro10- Lys(Boc)-Alko樹脂を合成した(得量6.8g)。乾燥樹脂1gに対し、5-カルボキシフルオレッセイン(モレキュラープローブ社製)(0.6g)、 N-ヒドロキシコハク酸イミド(0.37g)およびジイソプロピルカルボジイミド(500μl)より調製した5-カルボキシフルオレッセインコハク酸イミドエステルを縮合した。
反応終了後、樹脂をDMF及びMeOHで洗浄し、95%TFA-アニソール混液(8ml)を加えて室温で1時間攪拌反応させて、目的のFAM標識ポリペプチドを樹脂から切断させた。反応終了後、樹脂を濾去し、濾液を減圧濃縮後エーテルを加え反応生成物を沈殿させた。沈殿を集め、デシケーターで乾燥させ、FAM-(Pro)10-Lys (0.63g)を得た。
Synthesis Example 5 Synthesis of FAM- (Pro) 10-Lys (εTMR) (1) Synthesis of FAM- (Pro) 10-Lys αFmoc-εBoc-Lys-Alko resin (100-200mesh, manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.) ) Using 5.0 g (2.4 mmol as αFmoc-εBoc-Lys) as a starting material, the same procedure as in Synthesis Example 1 was performed to synthesize H-Pro10-Lys (Boc) -Alko resin (yield: 6.8 g). 5-carboxyfluorescein succinic acid prepared from 5-carboxyfluorescein (Molecular Probes) (0.6 g), N-hydroxysuccinimide (0.37 g) and diisopropylcarbodiimide (500 μl) per 1 g of dry resin The imide ester was condensed.
After completion of the reaction, the resin was washed with DMF and MeOH, mixed with 95% TFA-anisole (8 ml) and stirred at room temperature for 1 hour to cleave the desired FAM-labeled polypeptide from the resin. After completion of the reaction, the resin was removed by filtration, the filtrate was concentrated under reduced pressure, and ether was added to precipitate the reaction product. The precipitate was collected and dried with a desiccator to obtain FAM- (Pro) 10-Lys (0.63 g).

(2) FAM-(Pro)10-Lys(εTMR)の合成
合成例5−(1)で合成したFAM-(Pro)10-Lys (13.7mg)をDMF(1ml)に溶解し、トリエチルアミン(20μl)と6-カルボキシテトラメチルローダミンコハク酸イミドエステル(モレキュラープローブ社製)(4.88mg)を加え、室温で19時間反応させた。 反応終了後、反応液を減圧濃縮し得られた残渣をゲル濾過カラム(セファデクスLH20、ファルマシア社製)を用いて精製し、FAM-(Pro)10-Lys(εTMR) (10.9mg)を得た。
(2) Synthesis of FAM- (Pro) 10-Lys (εTMR) FAM- (Pro) 10-Lys (13.7 mg) synthesized in Synthesis Example 5- (1) was dissolved in DMF (1 ml) and triethylamine (20 μl ) And 6-carboxytetramethylrhodamine succinimide ester (Molecular Probes) (4.88 mg) were added and reacted at room temperature for 19 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was concentrated under reduced pressure, and the resulting residue was purified using a gel filtration column (Sephadex LH20, manufactured by Pharmacia) to obtain FAM- (Pro) 10-Lys (εTMR) (10.9 mg). .

合成例6 FAM-(Pro)10-Lys(εXR)の合成
合成例5−(1)で得たFAM-(Pro)10-Lys (9.63mg)をDMF(1ml)に溶解し、トリエチルアミン(20μl)と6-カルボキシ-X−ローダミンコハク酸イミドエステル(モレキュラープローブ社製)(3.78mg)とを合成例5−(2)と同様の操作を行って縮合し、精製して、FAM-(Pro)10-Lys(εXR) (6.53mg)を得た。
Synthesis Example 6 Synthesis of FAM- (Pro) 10-Lys (εXR) FAM- (Pro) 10-Lys (9.63 mg) obtained in Synthesis Example 5- (1) was dissolved in DMF (1 ml), and triethylamine (20 μl) was dissolved. ) And 6-carboxy-X-rhodamine succinimide ester (Molecular Probe Co., Ltd.) (3.78 mg) were condensed and purified in the same manner as in Synthesis Example 5- (2), and FAM- (Pro ) 10-Lys (εXR) (6.53 mg) was obtained.

合成例7 FAM-(Pro)10-Lys(εR6G)の合成
合成例5−(1)で得たFAM-(Pro)10-Lys (3.18mg)をDMF(0.5ml)に溶解し、トリエチルアミン(10μl)と6-カルボキシローダミン6Gコハク酸イミドエステル(モレキュラープローブ社製)(1.11mg)とを合成例5−(2)と同様の操作を行って縮合し、精製して、FAM-(Pro)10-Lys(εR6G) (2.66mg)を得た。
Synthesis Example 7 Synthesis of FAM- (Pro) 10-Lys (εR6G) FAM- (Pro) 10-Lys (3.18 mg) obtained in Synthesis Example 5- (1) was dissolved in DMF (0.5 ml) and triethylamine ( 10 μl) and 6-carboxyrhodamine 6G succinimide ester (Molecular Probes) (1.11 mg) were condensed and purified in the same manner as in Synthesis Example 5- (2), and FAM- (Pro) 10-Lys (εR6G) (2.66 mg) was obtained.

合成例8 FAM-(Pro)10-Lys(εR110)の合成
合成例5−(1)で得たFAM-(Pro)10-Lys (5.00mg) をDMF(0.5ml)に溶解し、トリエチルアミン(10μl)と5-カルボキシローダミン110ビス-トリフルオロアセテートコハク酸イミドエステル(モレキュラープローブ社製)(2.07mg)とを合成例5−(2)と同様の操作を行って縮合し、精製して、FAM-(Pro)10-Lys(εR110) (3.00mg)を得た。
Synthesis Example 8 Synthesis of FAM- (Pro) 10-Lys (εR110) FAM- (Pro) 10-Lys (5.00 mg) obtained in Synthesis Example 5- (1) was dissolved in DMF (0.5 ml) and triethylamine ( 10 μl) and 5-carboxyrhodamine 110 bis-trifluoroacetate succinimide ester (Molecular Probes) (2.07 mg) were condensed and purified in the same manner as in Synthesis Example 5- (2), FAM- (Pro) 10-Lys (εR110) (3.00 mg) was obtained.

合成例9 FAM-(Pro)12-Lys(εTMR)の合成
(1)FAM-(Pro)12-Lysの合成
αFmoc-εBoc-Lys-Alko樹脂(100〜200mesh,渡辺化学工業(株)社製)5.0g(αFmoc-εBoc-Lysとして2.4mmol)を出発原料として、合成例1と同様の操作を行いH-Pro12- Lys(Boc)-Alko樹脂を合成した(得量7.2g)。乾燥樹脂1gに対し、5-カルボキシフルオレッセイン(モレキュラープローブ社製)(0.47g)、 N-ヒドロキシコハク酸イミド(0.27g)およびジイソプロピルカルボジイミド(330μl)より調製した5-カルボキシフルオレッセインコハク酸イミドエステルをを縮合した。
反応終了後、樹脂をDMF及びMeOHで洗浄し、95%TFA-アニソール混液(8ml)を加えて室温で1時間攪拌反応させて、目的のFAM標識ポリペプチドを樹脂から切断させた。反応終了後、樹脂を濾去し、濾液を減圧濃縮後エーテルを加え反応生成物を沈殿させた。沈殿を集め、デシケーターで乾燥させ、FAM-(Pro)12-Lys (0.58g)を得た。
Synthesis Example 9 Synthesis of FAM- (Pro) 12-Lys (εTMR) (1) Synthesis of FAM- (Pro) 12-Lys αFmoc-εBoc-Lys-Alko resin (100-200mesh, manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.) ) H-Pro12-Lys (Boc) -Alko resin was synthesized in the same manner as in Synthesis Example 1 using 5.0 g (2.4 mmol as αFmoc-εBoc-Lys) as a starting material (yield 7.2 g). 5-carboxyfluorescein succinic acid prepared from 5-carboxyfluorescein (Molecular Probes) (0.47 g), N-hydroxysuccinimide (0.27 g) and diisopropylcarbodiimide (330 μl) per 1 g of dry resin The imide ester was condensed.
After completion of the reaction, the resin was washed with DMF and MeOH, mixed with 95% TFA-anisole (8 ml) and stirred at room temperature for 1 hour to cleave the desired FAM-labeled polypeptide from the resin. After completion of the reaction, the resin was removed by filtration, the filtrate was concentrated under reduced pressure, and ether was added to precipitate the reaction product. The precipitate was collected and dried with a desiccator to obtain FAM- (Pro) 12-Lys (0.58 g).

(2) FAM-(Pro)12-Lys(εTMR)の合成
合成例9−(1)で合成したFAM-(Pro)12-Lys (14.7mg)をDMF(1ml)に溶解し、トリエチルアミン(20μl)と6-カルボキシテトラメチルローダミンコハク酸イミドエステル(モレキュラープローブ社製)(4.17mg)を加え、室温で19時間反応させた。 反応終了後、反応液を減圧濃縮し得られた残渣をゲル濾過カラム(セファデクスLH20、ファルマシア社製)を用いて精製し、FAM-(Pro)12-Lys(εTMR) (7.6mg)を得た。
(2) Synthesis of FAM- (Pro) 12-Lys (εTMR) FAM- (Pro) 12-Lys (14.7 mg) synthesized in Synthesis Example 9- (1) was dissolved in DMF (1 ml) and triethylamine (20 μl ) And 6-carboxytetramethylrhodamine succinimide ester (Molecular Probes) (4.17 mg) were added and reacted at room temperature for 19 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was concentrated under reduced pressure, and the resulting residue was purified using a gel filtration column (Sephadex LH20, manufactured by Pharmacia) to obtain FAM- (Pro) 12-Lys (εTMR) (7.6 mg). .

合成例10 FAM-(Pro)12-Lys(εXR)の合成
合成例9−(1)で得たFAM-(Pro)12-Lys (3.76mg)をDMF(0.5ml)に溶解し、トリエチルアミン(10μl)と6-カルボキシ-X−ローダミンコハク酸イミドエステル(モレキュラープローブ社製)(1.33mg)とを合成例9−(2)と同様の操作を行って縮合し、精製して、FAM-(Pro)12-Lys(εXR) (6.53mg)を得た。
Synthesis Example 10 Synthesis of FAM- (Pro) 12-Lys (εXR) FAM- (Pro) 12-Lys (3.76 mg) obtained in Synthesis Example 9- (1) was dissolved in DMF (0.5 ml), and triethylamine ( 10 μl) and 6-carboxy-X-rhodamine succinimide ester (Molecular Probes) (1.33 mg) were condensed and purified in the same manner as in Synthesis Example 9- (2), and FAM- ( Pro) 12-Lys (εXR) (6.53 mg) was obtained.

合成例11 FAM-(Pro)12-Lys(εR6G)の合成
合成例9−(1)で得たFAM-(Pro)12-Lys (3.18mg)をDMF(0.5ml)に溶解し、トリエチルアミン(10μl)と6-カルボキシローダミン6Gコハク酸イミドエステル(モレキュラープローブ社製)(1.11mg)とを合成例9−(2)と同様の操作を行って縮合し、精製して、FAM-(Pro)12-Lys(εR6G) (2.75mg)を得た。
Synthesis Example 11 Synthesis of FAM- (Pro) 12-Lys (εR6G) FAM- (Pro) 12-Lys (3.18 mg) obtained in Synthesis Example 9- (1) was dissolved in DMF (0.5 ml), and triethylamine ( 10 μl) and 6-carboxyrhodamine 6G succinimide ester (Molecular Probes) (1.11 mg) were condensed and purified in the same manner as in Synthesis Example 9- (2), and FAM- (Pro) 12-Lys (εR6G) (2.75 mg) was obtained.

合成例12 FAM-(Pro)12-Lys(εR110)の合成
合成例9−(1)で得たFAM-(Pro)12-Lys (5.00mg) をDMF(0.5ml)に溶解し、トリエチルアミン(10μl)と5-カルボキシローダミン110ビス-トリフルオロアセテートコハク酸イミドエステル(モレキュラープローブ社製)(0.86mg)とを合成例9−(2)と同様の操作を行って縮合し、精製して、FAM-(Pro)12-Lys(εR110) (1.2mg)を得た。
Synthesis Example 12 Synthesis of FAM- (Pro) 12-Lys (εR110) FAM- (Pro) 12-Lys (5.00 mg) obtained in Synthesis Example 9- (1) was dissolved in DMF (0.5 ml), and triethylamine ( 10 μl) and 5-carboxyrhodamine 110 bis-trifluoroacetate succinimide ester (Molecular Probes) (0.86 mg) were condensed and purified in the same manner as in Synthesis Example 9- (2). FAM- (Pro) 12-Lys (εR110) (1.2 mg) was obtained.

合成例13 FAM-(Pro)4-Lys(εTMR)の合成
(1)FAM-(Pro)4-Lysの合成
αFmoc-εBoc-Lys-Alko樹脂(100〜200mesh,渡辺化学工業(株)社製)5.0g(αFmoc-εBoc-Lysとして2.4mmol)を出発原料として、合成例1と同様の操作を行いH-Pro4-Lys(Boc)-Alko樹脂を合成した(得量5.4g)。 乾燥樹脂400mgに対し5-カルボキシフルオレッセイン(モレキュラープローブ社製)(256mg)、N-ヒドロキシコハク酸イミド(72g)およびジイソプロピルカルボジイミド(90μl)より調製した5-カルボキシフルオレッセインコハク酸イミドエステルを縮合した。反応終了後、樹脂をDMF、MeOHで洗浄し、95%TFA-アニソール混液(8m)を加えて室温で1時間攪拌反応させて、目的のFAM標識ポリペプチドを樹脂から切断させた。反応終了後、樹脂を濾去し、濾液を減圧濃縮後エーテルを加え反応生成物を沈殿させた。沈殿を集め、デシケーターで乾燥させ、FAM-(Pro)4-Lys(66.8mg)を得た。
Synthesis Example 13 Synthesis of FAM- (Pro) 4-Lys (εTMR) (1) Synthesis of FAM- (Pro) 4-Lys αFmoc-εBoc-Lys-Alko resin (100-200mesh, manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.) ) Using 5.0 g (2.4 mmol as αFmoc-εBoc-Lys) as a starting material, the same operation as in Synthesis Example 1 was performed to synthesize H-Pro4-Lys (Boc) -Alko resin (yield 5.4 g). 5-carboxyfluorescein succinimide ester prepared from 5-carboxyfluorescein (Molecular Probes) (256 mg), N-hydroxysuccinimide (72 g) and diisopropylcarbodiimide (90 μl) per 400 mg of dry resin Condensed. After completion of the reaction, the resin was washed with DMF and MeOH, mixed with 95% TFA-anisole (8 m) and stirred at room temperature for 1 hour to cleave the desired FAM-labeled polypeptide from the resin. After completion of the reaction, the resin was removed by filtration, the filtrate was concentrated under reduced pressure, and ether was added to precipitate the reaction product. The precipitate was collected and dried with a desiccator to obtain FAM- (Pro) 4-Lys (66.8 mg).

(2)FAM-(Pro)4-Lys(εTMR)の合成
(1)で合成したFAM-(Pro)4-Lys(10mg)をDMF(1ml)に溶解し、トリエチルアミン(20μl)と6-カルボキシテトラメチルローダミンコハク酸イミドエステル(モレキュラープローブ社製)(5.28mg)を加え、室温で19時間反応させた。反応終了後、反応液を減圧濃縮し得られた残渣をゲル濾過カラム(セファデクスLH20、ファルマシア社製)を用いて精製し、FAM-(Pro)4-Lys(εTMR)(9.8mg)を得た。
(2) Synthesis of FAM- (Pro) 4-Lys (εTMR) FAM- (Pro) 4-Lys (10 mg) synthesized in (1) is dissolved in DMF (1 ml), triethylamine (20 μl) and 6-carboxyl Tetramethylrhodamine succinimide ester (Molecular Probes) (5.28 mg) was added and reacted at room temperature for 19 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was concentrated under reduced pressure, and the resulting residue was purified using a gel filtration column (Sephadex LH20, manufactured by Pharmacia) to obtain FAM- (Pro) 4-Lys (εTMR) (9.8 mg). .

合成例14 FAM-(Pro)6-Lys(εTMR)の合成
(1)FAM-(Pro)6-Lysの合成
αFmoc-εBoc-Lys-Alko樹脂(100〜200mesh,渡辺化学工業(株)社製)5.0g(αFmoc-εBoc-Lysとして2.4mmol)を出発原料として、合成例1と同様の操作を行いH-Pro4-Lys(Boc)-Alko樹脂を合成した(得量5.8g)。 乾燥樹脂218mgに対し5-カルボキシフルオレッセイン(モレキュラープローブ社製)(128mg)、N-ヒドロキシコハク酸イミド(73.7mg)およびジイソプロピルカルボジイミド(90μl)より調製した5-カルボキシフルオレッセインコハク酸イミドエステルを縮合した。 反応終了後、樹脂をDMF、MeOHで洗浄し、95%TFA-アニソール混液(8m)を加えて室温で1時間攪拌反応させて、目的のFAM標識ポリペプチドを樹脂から切断させた。反応終了後、樹脂を濾去し、濾液を減圧濃縮後エーテルを加え反応生成物を沈殿させた。沈殿を集め、デシケーターで乾燥させ、FAM-(Pro)6-Lys(20.6mg)を得た。
Synthesis Example 14 Synthesis of FAM- (Pro) 6-Lys (εTMR) (1) Synthesis of FAM- (Pro) 6-Lys αFmoc-εBoc-Lys-Alko resin (100-200mesh, manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.) ) Using 5.0 g (2.4 mmol as αFmoc-εBoc-Lys) as a starting material, the same operation as in Synthesis Example 1 was performed to synthesize an H-Pro4-Lys (Boc) -Alko resin (yield 5.8 g). 5-carboxyfluorescein succinimide ester prepared from 5-carboxyfluorescein (Molecular Probes) (128 mg), N-hydroxysuccinimide (73.7 mg) and diisopropylcarbodiimide (90 μl) per 218 mg of dry resin Was condensed. After completion of the reaction, the resin was washed with DMF and MeOH, mixed with 95% TFA-anisole (8 m) and stirred at room temperature for 1 hour to cleave the desired FAM-labeled polypeptide from the resin. After completion of the reaction, the resin was removed by filtration, the filtrate was concentrated under reduced pressure, and ether was added to precipitate the reaction product. The precipitate was collected and dried with a desiccator to obtain FAM- (Pro) 6-Lys (20.6 mg).

(2)FAM-(Pro)6-Lys(εTMR)の合成
(1)で合成したFAM-(Pro)6-Lys(12mg)をDMF(1ml)に溶解し、トリエチルアミン(20μl)と6-カルボキシテトラメチルローダミンコハク酸イミドエステル(モレキュラープローブ社製)(5.5mg)を加え、室温で19時間反応させた。 反応終了後、反応液を減圧濃縮し得られた残渣をゲル濾過カラム(セファデクスLH20、ファルマシア社製)を用いて精製し、FAM-(Pro)6-Lys(εTMR)(9.29mg)を得た。
(2) Synthesis of FAM- (Pro) 6-Lys (εTMR) FAM- (Pro) 6-Lys (12 mg) synthesized in (1) was dissolved in DMF (1 ml), and triethylamine (20 μl) and 6-carboxyl were dissolved. Tetramethylrhodamine succinimide ester (Molecular Probe Co., Ltd.) (5.5 mg) was added and reacted at room temperature for 19 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was concentrated under reduced pressure, and the resulting residue was purified using a gel filtration column (Sephadex LH20, manufactured by Pharmacia) to obtain FAM- (Pro) 6-Lys (εTMR) (9.29 mg). .

参考例1 Ac-(Pro)10-Lys(εTMR)の合成
(1)Ac-(Pro)10-Lysの合成
合成例5-(1)で得たH-Pro10-Lys(Boc)-Alko樹脂(1.5g)をDMF(35ml)に膨潤させ、無水酢酸(230μl)、トリエチルアミン(336μl)を加えて20時間反応させた。反応終了後、樹脂をDMF及びMeOHで洗浄し、95%TFA-アニソール混液(8ml)を加えて室温で1時間攪拌反応させて、目的のFAM標識ポリペプチドを樹脂から切断させた。反応終了後、樹脂を濾去し、濾液を減圧濃縮後エーテルを加え反応生成物を沈殿させた。沈殿を集め、デシケーターで乾燥させ、Ac-(Pro)10-Lys (0.45g)を得た。
(2) Ac-(Pro)10-Lys(εTMR)の合成
参考例1−(1)で合成したAc-(Pro)10-Lys (11.8mg)をDMF(1ml)に溶解し、トリエチルアミン(20μl)と6-カルボキシテトラメチルローダミンコハク酸イミドエステル(モレキュラープローブ社製)(5.7mg)を加え、室温で19時間反応させた。 反応終了後、反応液を減圧濃縮し得られた残渣をゲル濾過カラム(セファデクスLH20、ファルマシア社製)を用いて精製し、Ac-(Pro)10-Lys(εTMR) (6.0mg)を得た。
Reference Example 1 Synthesis of Ac- (Pro) 10-Lys (εTMR) (1) Synthesis of Ac- (Pro) 10-Lys Resin H-Pro10-Lys (Boc) -Alko resin obtained in Synthesis Example 5- (1) (1.5 g) was swollen in DMF (35 ml), and acetic anhydride (230 μl) and triethylamine (336 μl) were added and reacted for 20 hours. After completion of the reaction, the resin was washed with DMF and MeOH, mixed with 95% TFA-anisole (8 ml) and stirred at room temperature for 1 hour to cleave the desired FAM-labeled polypeptide from the resin. After completion of the reaction, the resin was removed by filtration, the filtrate was concentrated under reduced pressure, and ether was added to precipitate the reaction product. The precipitate was collected and dried with a desiccator to obtain Ac- (Pro) 10-Lys (0.45 g).
(2) Synthesis of Ac- (Pro) 10-Lys (εTMR) Ac- (Pro) 10-Lys (11.8 mg) synthesized in Reference Example 1- (1) was dissolved in DMF (1 ml) and triethylamine (20 μl ) And 6-carboxytetramethylrhodamine succinimide ester (Molecular Probes) (5.7 mg) were added and reacted at room temperature for 19 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was concentrated under reduced pressure, and the resulting residue was purified using a gel filtration column (Sephadex LH20, manufactured by Pharmacia) to obtain Ac- (Pro) 10-Lys (εTMR) (6.0 mg). .

参考例2 Ac-(Pro)10-Lys(εXR)の合成
参考例1−(1)で得たAc-(Pro)10-Lys (10mg)をDMF(1ml)に溶解し、トリエチルアミン(20μl)と6-カルボキシ-X−ローダミンコハク酸イミドエステル(モレキュラープローブ社製)(6.5mg)とを参考例1−(2)と同様の操作を行って縮合し、精製して、Ac-(Pro)10-Lys(εXR) (4.2mg)を得た。
Reference Example 2 Synthesis of Ac- (Pro) 10-Lys (εXR) Ac- (Pro) 10-Lys (10 mg) obtained in Reference Example 1- (1) was dissolved in DMF (1 ml) and triethylamine (20 μl) And 6-carboxy-X-rhodamine succinimide ester (Molecular Probes) (6.5 mg) were condensed and purified in the same manner as in Reference Example 1- (2), and Ac- (Pro) 10-Lys (εXR) (4.2 mg) was obtained.

参考例3 Ac-(Pro)10-Lys(εR6G)の合成
参考例1−(1)で得たAc-(Pro)10-Lys (10mg)をDMF(1ml)に溶解し、トリエチルアミン(20μl)と6-カルボキシローダミン6Gコハク酸イミドエステル(モレキュラープローブ社製)(5.3mg)とを参考例1−(2)と同様の操作を行って縮合し、精製して、Ac-(Pro)10-Lys(εR6G) (2.66mg)を得た。
Reference Example 3 Synthesis of Ac- (Pro) 10-Lys (εR6G) Ac- (Pro) 10-Lys (10 mg) obtained in Reference Example 1- (1) was dissolved in DMF (1 ml) and triethylamine (20 μl) And 6-carboxyrhodamine 6G succinimide ester (Molecular Probes) (5.3 mg) were condensed and purified in the same manner as in Reference Example 1- (2), and Ac- (Pro) 10- Lys (εR6G) (2.66 mg) was obtained.

参考例4 Ac-(Pro)10-Lys(εR110)の合成
参考例1−(1)で得たAC-(Pro)10-Lys (10.4mg) をDMF(1ml)に溶解し、トリエチルアミン(20μl)と5-カルボキシローダミン110ビス-トリフルオロアセテートコハク酸イミドエステル(モレキュラープローブ社製)(8.3mg)とを参考例1−(2)と同様の操作を行って縮合し、精製して、Ac-(Pro)10-Lys(εR110) (4.8mg)を得た。
Reference Example 4 Synthesis of Ac- (Pro) 10-Lys (εR110) AC- (Pro) 10-Lys (10.4 mg) obtained in Reference Example 1- (1) was dissolved in DMF (1 ml) and triethylamine (20 μl ) And 5-carboxyrhodamine 110 bis-trifluoroacetate succinimide ester (Molecular Probes) (8.3 mg) were condensed, purified in the same manner as in Reference Example 1- (2), and Ac -(Pro) 10-Lys (εR110) (4.8 mg) was obtained.

実験例1
プロリン残基10の化合物のエネルギー転移色素[FAM-(Pro)10-Lys(εTMR)、FAM-(Pro)10-Lys(εXR)、FAM-(Pro)10-Lys(εR6G)、 FAM-(Pro)10-Lys(εR110)]と単一色素[Ac-(Pro)10-Lys(εTMR)、Ac-(Pro)10-Lys(εXR)、Ac-(Pro)10-Lys(εR6G)、 Ac-(Pro)10-Lys(εR110)]の40mMトリス-塩酸緩衝液(pH8.0)中での蛍光放出強さを比較した。
各色素溶液を日立F-4010型分光蛍光光度計を用いて励起波長488nmで励起し、蛍光波長はそれぞれ、TMR(580nm)、XR(610nm)、R6G(560nm)、R110(530nm)により測定した。得られた各色素の各相対強度を棒グラフとして図6に示す。
図6から分かるように、エキルギー転移色素はアクセプター色素それ自体よりもかなり強い蛍光を示すことが分かる。
Experimental example 1
Energy transfer dyes for compounds with proline residue 10 (FAM- (Pro) 10-Lys (εTMR), FAM- (Pro) 10-Lys (εXR), FAM- (Pro) 10-Lys (εR6G), FAM- ( Pro) 10-Lys (εR110)] and a single dye (Ac- (Pro) 10-Lys (εTMR), Ac- (Pro) 10-Lys (εXR), Ac- (Pro) 10-Lys (εR6G), The fluorescence emission intensity of Ac- (Pro) 10-Lys (εR110)] in 40 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) was compared.
Each dye solution was excited with an excitation wavelength of 488 nm using a Hitachi F-4010 spectrofluorometer, and the fluorescence wavelengths were measured with TMR (580 nm), XR (610 nm), R6G (560 nm), and R110 (530 nm), respectively. . The relative intensities of the obtained pigments are shown as bar graphs in FIG.
As can be seen from FIG. 6, it can be seen that the energy transfer dye exhibits significantly stronger fluorescence than the acceptor dye itself.

実施例1
FAM及びTMR-標識3’-デオキシウリジン-5'-トリホスフェート(FAM、TMR-標識3’-dUTP)(化合物10)の合成
合成例1で得たFAM-(Pro)8-Lys(εTMR)(54.1mg)のDMF(1ml)溶液に、窒素気流下N,N'-ジスクシンイミジルカーボネート(8.2mg)及び4-ジメチルアミノピリジン(3.9mg)を加え室温で2時間反応させた。 反応溶液を5-(6"-アミノ-1"-ヘキシニル)-3’-デオキシウリジン-5'-トリホスフェート(8μmol)を含むDMF−水混合液に加え更に室温で一夜攪拌した。反応液に水(30ml)を加え希釈した後、DEAE-トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィー(1.7X15cm;溶出液:40%アセトニトリル含有炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液(pH7.5)0.1M→0.7M直線濃度勾配(全量2L))で精製した。
Example 1
Synthesis of FAM and TMR-labeled 3′-deoxyuridine-5′-triphosphate (FAM, TMR-labeled 3′-dUTP) (Compound 10) FAM- (Pro) 8-Lys (εTMR) obtained in Synthesis Example 1 N, N′-Disuccinimidyl carbonate (8.2 mg) and 4-dimethylaminopyridine (3.9 mg) were added to a solution of (54.1 mg) in DMF (1 ml) under a nitrogen stream and reacted at room temperature for 2 hours. The reaction solution was added to a DMF-water mixture containing 5- (6 "-amino-1" -hexynyl) -3'-deoxyuridine-5'-triphosphate (8 µmol) and further stirred overnight at room temperature. After diluting the reaction solution by adding water (30 ml), DEAE-Toyopearl ion exchange column chromatography (1.7X15 cm; eluent: 40% acetonitrile-containing triethylammonium bicarbonate buffer (pH 7.5) 0.1M → 0.7M linear Purified with a concentration gradient (total volume 2 L)).

実施例2
FAM及びXR-標識3’-デオキシシチジン-5'-トリホスフェート(FAM、XR-標識3’-dCTP)(化合物11)の合成
合成例2で得たFAM-(Pro)8-Lys(εXR)(71.9mg)のDMF(1ml)溶液に、窒素気流下N,N'-ジスクシンイミジルカーボネート(10.2mg)及び4-ジメチルアミノピリジン(4.9mg)を加え室温で2時間反応させた。反応溶液を5-(6"-アミノ-1"-ヘキシニル)-3’-デオキシシチジン-5'-トリホスフェート(10μmol)を含むDMF−水混合液に加え更に室温で一夜攪拌した。生成物を実施例1と同様に精製した。
Example 2
Synthesis of FAM and XR-labeled 3′-deoxycytidine-5′-triphosphate (FAM, XR-labeled 3′-dCTP) (Compound 11) FAM- (Pro) 8-Lys (εXR) obtained in Synthesis Example 2 N, N′-Disuccinimidyl carbonate (10.2 mg) and 4-dimethylaminopyridine (4.9 mg) were added to a solution of (71.9 mg) in DMF (1 ml) under a nitrogen stream and reacted at room temperature for 2 hours. The reaction solution was added to a DMF-water mixture containing 5- (6 "-amino-1" -hexynyl) -3'-deoxycytidine-5'-triphosphate (10 µmol) and further stirred overnight at room temperature. The product was purified as in Example 1.

実施例3
FAM及びR6G-標識3’-デオキシアデノシン-5'-トリホスフェート(FAM、R6G-標識3’-dATP)(化合物12)の合成
合成例3で得たFAM-(Pro)8-Lys(εR6G)(55.1mg)のDMF(1ml)溶液に、窒素気流下N,N'-ジスクシンイミジルカーボネート(8.2mg)及び4-ジメチルアミノピリジン(3.9mg)を加え室温で2時間反応させた。反応溶液を5-(6"-アミノ-1"-ヘキシニル)-3’-デオキシアデノシン-5'-トリホスフェート(8μmol)を含むDMF−水混合液に加え更に室温で一夜攪拌した。生成物を実施例1と同様に精製した。
Example 3
Synthesis of FAM and R6G-labeled 3′-deoxyadenosine-5′-triphosphate (FAM, R6G-labeled 3′-dATP) (Compound 12) FAM- (Pro) 8-Lys (εR6G) obtained in Synthesis Example 3 N, N′-Disuccinimidyl carbonate (8.2 mg) and 4-dimethylaminopyridine (3.9 mg) were added to a solution of (55.1 mg) in DMF (1 ml) under a nitrogen stream and reacted at room temperature for 2 hours. The reaction solution was added to a DMF-water mixture containing 5- (6 "-amino-1" -hexynyl) -3'-deoxyadenosine-5'-triphosphate (8 μmol), and further stirred overnight at room temperature. The product was purified as in Example 1.

実施例4
FAM及びR110-標識3’-デオキシグアノシン-5'-トリホスフェート(FAM、R110-標識3’-dGTP)(化合物13)の合成
合成例4で得たFAM-(Pro)8-Lys(εR110)(52.4mg)のDMF(1ml)溶液に、窒素気流下N,N'-ジスクシンイミジルカーボネート(8.2mg)及び4-ジメチルアミノピリジン(3.9mg)を加え室温で2時間反応させた。 反応溶液を5-(6"-アミノ-1"-ヘキシニル)-3’-デオキシグアノシン-5'-トリホスフェート(8μmol)を含むDMF−水混合液に加え更に室温で一夜攪拌した。生成物を実施例1と同様に精製した。
実施例1〜4で得られた化合物10〜13の構造式を以下に示す。
Example 4
Synthesis of FAM and R110-labeled 3′-deoxyguanosine-5′-triphosphate (FAM, R110-labeled 3′-dGTP) (Compound 13) FAM- (Pro) 8-Lys (εR110) obtained in Synthesis Example 4 N, N′-Disuccinimidyl carbonate (8.2 mg) and 4-dimethylaminopyridine (3.9 mg) were added to a solution of (52.4 mg) in DMF (1 ml) under a nitrogen stream and reacted at room temperature for 2 hours. The reaction solution was added to a DMF-water mixture containing 5- (6 "-amino-1" -hexynyl) -3'-deoxyguanosine-5'-triphosphate (8 μmol) and further stirred overnight at room temperature. The product was purified as in Example 1.
Structural formulas of Compounds 10 to 13 obtained in Examples 1 to 4 are shown below.

Figure 0003656075
Figure 0003656075
Figure 0003656075
Figure 0003656075

参考例5
野生型T7 RNA ポリメラーゼ遺伝子のクローニングと発現プラスミドの構築
大腸菌を宿主とするT7 ファージは、以下のように精製した。大腸菌C600をLB培地(Bacto tryptone 10g, Bacto yeast extract 5g, NaCl 5gを1リッターの水に溶かし、pH 7.5に調整したのち、オートクレーブにて滅菌した培地)200mlに植菌し、菌体濃度がOD(600nm)=1.0に達した時点で、多重感染度約2で感染させ、その後ODを経時的に測定し、ODが急激に落ちた時点で遠心操作にて、菌体残査をのぞき、NaCl及びポリエチレングリコール6000をそれぞれ最終濃度、0.5M、及び10%になるように加え、よく撹拌後、一晩、4℃にて静置し、沈殿を形成させた。この沈殿を遠心操作で集め、SM緩衝液(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgSO4, 50 mM NaCl, 0.01% gelatin)にて懸濁した。このT7 ファージの濃縮液を、次に遠心管に丁寧に重層した密度の異なるCsCl溶液上(下層から、CsCl濃度が、1.267g/ml, 0.817g/ml, 0.705g/mlである溶液)に重層し、22,000rpmで2時間、遠心することにより、ファージ層を形成させ、このファージの白いバンドを丁寧に分取し、TE緩衝液(10mM Tris-HCl, pH 7.5, 1mM EDTA)で透析し、CsCl成分を除去した。更にこのファージ溶液を、フェノール処理により、ファージ蛋白質を変性させ、T7 ファージのゲノムDNAを精製した。
Reference Example 5
Cloning of wild type T7 RNA polymerase gene and construction of expression plasmid T7 phage hosted in E. coli was purified as follows. Escherichia coli C600 is inoculated into 200 ml of LB medium (medium sterilized by autoclaving after dissolving 5 g of Bacto tryptone 10 g, Bacto yeast extract 5 g, NaCl 5 g in 1 liter of water and adjusting to pH 7.5). (600nm) = 1.0 When the infection reaches multiple infection degree of about 2, then measure OD over time, and when OD drops sharply, remove cell residue by centrifugation, and remove NaCl. And polyethylene glycol 6000 were added to final concentrations of 0.5 M and 10%, respectively, and after stirring well, the mixture was allowed to stand at 4 ° C. overnight to form a precipitate. This precipitate was collected by centrifugation and suspended in SM buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgSO 4 , 50 mM NaCl, 0.01% gelatin). Next, concentrate this T7 phage concentrate on a CsCl solution of different density that is carefully layered on a centrifuge tube (from the lower layer, the CsCl concentration is 1.267 g / ml, 0.817 g / ml, 0.705 g / ml). Overlay and centrifuge at 22,000 rpm for 2 hours to form a phage layer. The white band of this phage is carefully separated and dialyzed against TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA). The CsCl component was removed. Furthermore, the phage protein was denatured from this phage solution by phenol treatment, and the genomic DNA of T7 phage was purified.

T7 RNA ポリメラーゼ遺伝子はこのゲノムDNA、39,937塩基対の内、3171から5822番目にコードされている[T7ゲノム遺伝子の全塩基配列については、Dunnらによって既に報告されている(1983, J. Mol. Biol., 166(4):477-535)。但し、若干の訂正がある(GeneBank、accession No. V01148 J02518 X00411のT7 ファージDNA配列参照)]。このゲノムDNAを鋳型としてPCRを利用して増幅し、以下のように発現ベクターにクローニングした(図2参照)。すなわち、5'末端に制限酵素 Nco I 切断部位をそれぞれ含み、T7 RNA ポリメラーゼ 遺伝子のN末端アミノ酸領域上流に特異的なプライマー(T7Rpol-N 5'-ATA TTT TAG CCA TGG AGG ATT GAT ATA TGA ACA CGA TTA ACA TCG CTA AG -3’)、及び C末端アミノ酸領域下流に特異的なプライマー( T7Rpol-C 5'-ATA TTT TAG CCA TGG TAT AGT GAG TCG TAT TGA TTT GCG -3’)を用いて、この酵素遺伝子を PCR 法により増幅した。この DNA フラグメントを Nco I で消化し、1%アガロース電気泳動を行い、目的のDNAフラグメントをアガロースから切り出し、Gene Pure Kit(ニッポンジーン)を用いて精製した。 これをNco I で消化し脱リン酸化した発現ベクター pTrc99a (ファルマシア・バイオテク) と連結することで T7 RNA ポリメラーゼ を高発現する pT7R を構築した。野生型T7 RNA ポリメラーゼを発現するプラスミドpT7Rは、大腸菌DH5αに形質転換し、抗生物質アンピシリン耐性を示す大腸菌を、培養し、培養液中にIPTGを添加し、発現ベクターpT7Rに含まれるTrc プロモーターを稼働させた。IPTG添加2時間後、大腸菌を回収し、全蛋白質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析したところ、T7 RNAポリメラーゼの分子量である99kDa付近に、IPTGを添加した時のみ蛋白質のバンドが検出された。この蛋白質を更に、Zawadzki, Vら、1991, Nucl. Acids Res., 19:1948 に既に記載されている方法を一部改良した方法(詳しい方法は参考例7で例示されている変異型T7 RNA ポリメラーゼの精製法とほとんど同じ方法で行うことが出来る)で精製したところ、T7 プロモーター特異的に作用するRNAポリメラーゼの活性を有していた。   The T7 RNA polymerase gene is encoded by the 3171st to 5822th of the genomic DNA, 39,937 base pairs. [The complete base sequence of the T7 genomic gene has already been reported by Dunn et al. (1983, J. Mol. Biol., 166 (4): 477-535). However, there is some correction (see GeneBank, accession No. V01148 J02518 X00411 T7 phage DNA sequence)]. This genomic DNA was amplified using PCR as a template and cloned into an expression vector as follows (see FIG. 2). In other words, each contains a restriction enzyme Nco I cleavage site at the 5 ′ end and a specific primer upstream of the N-terminal amino acid region of the T7 RNA polymerase gene (T7Rpol-N 5′-ATA TTT TAG CCA TGG AGG ATT GAT ATA TGA ACA CGA TTA ACA TCG CTA AG -3 ') and a specific primer downstream of the C-terminal amino acid region (T7Rpol-C 5'-ATA TTT TAG CCA TGG TAT AGT GAG TCG TAT TGA TTT GCG -3') The enzyme gene was amplified by PCR. This DNA fragment was digested with Nco I and subjected to 1% agarose electrophoresis, and the target DNA fragment was excised from agarose and purified using Gene Pure Kit (Nippon Gene). This was ligated with an expression vector pTrc99a (Pharmacia Biotech) digested with NcoI and dephosphorylated to construct pT7R that highly expresses T7 RNA polymerase. Plasmid pT7R that expresses wild-type T7 RNA polymerase is transformed into E. coli DH5α, E. coli that is resistant to the antibiotic ampicillin is cultured, IPTG is added to the culture, and the Trc promoter contained in the expression vector pT7R is activated. I let you. E. coli was recovered 2 hours after the addition of IPTG, and the total protein was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. A protein band was detected only when IPTG was added in the vicinity of 99 kDa, the molecular weight of T7 RNA polymerase. . This protein was further modified from the method already described in Zawadzki, V et al., 1991, Nucl. Acids Res., 19: 1948 (detailed method is the mutant T7 RNA exemplified in Reference Example 7). When purified by the same method as the polymerase purification method), it had the activity of RNA polymerase acting specifically on the T7 promoter.

参考例6
変異型T7 RNAポリメラーゼを生産するための発現プラスミドの構築
(1)変異型T7 RNAポリメラーゼF644Yを生産するための発現プラスミドの構築(図3参照)
野生型T7 RNA ポリメラーゼ 遺伝子の挿入してある pT7R を鋳型にして、T7 RNA ポリメラーゼ 遺伝子のC末端側に相当する制限酵素 Hpa I , Nco I 部位 に挟まれる領域を PCR 法を利用して変異を導入した。更に詳しく例示すると、変異を導入したい塩基を境界として、左右に分け、変異の導入してある プライマーF646Y(+) (5'-GTT GAC GGA AGC CGT ACT CTT TGG AC-3’)、 F646Y(-) (5'-GTC CAA AGA GTA CGG CTT CCG TCA AC-3’) とそれぞれの制限酵素切断部位を5'末端に持つ プライマーT7RNAP-HpaI-N (5'-CGC GCG GTT AAC TTG CTT CCT AG-3’) 、pTrc99a-PstI-C (5'-GCA TGC CTG CAG GTC GAC TCT AG-3’)を用いて PCR によりそれぞれの DNA フラグメントを増幅した。これらの DNA フラグメントには相補する部分があり、これらを変性、アニール、伸長反応を繰り返すことで目的の変異の導入された DNA フラグメントを作製した。この DNA フラグメントをアガロースゲル電気泳動により、目的の大きさの DNA フラグメントのみを切り出すことで精製し、これを鋳型としてプライマーT7RNAP-HpaI-NとpTrc99a-PstI-Cを用いて再増幅し、制限酵素Hpa I , Pst I で切断した。このDNAは1%アガロース電気泳動を行い、分離した後、目的のDNAフラグメントを切り出し、精製した。この DNA フラグメントを pT7R のHpa I , Pst I DNA フラグメントと置き換えることで変異を導入し, 大腸菌DH5αに形質転換し、変異の導入されたプラスミドを選択し、最終的には塩基配列を確認することで目的の位置に変異が導入されているかどうかを確認した。そして、変異型T7 RNAポリメラーゼF644Yを生産するための発現プラスミドpT7RF644Yを得た。このプラスミドからの変異型T7 RNAポリメラーゼF644Yの生産は、野生型T7 RNAポリメラーゼの生産と同様、本プラスミドを含む大腸菌を培養し、IPTGを添加することにより、発現誘導可能であった。
Reference Example 6
Construction of an expression plasmid to produce mutant T7 RNA polymerase
(1) Construction of an expression plasmid for producing mutant T7 RNA polymerase F644Y (see Fig. 3)
Using the pT7R with the wild-type T7 RNA polymerase gene inserted as a template, the region between the restriction enzyme Hpa I and Nco I sites corresponding to the C-terminal side of the T7 RNA polymerase gene was introduced using PCR. did. To illustrate in more detail, primers F646Y (+) (5'-GTT GAC GGA AGC CGT ACT CTT TGG AC-3 '), F646Y (- ) (5'-GTC CAA AGA GTA CGG CTT CCG TCA AC-3 ') and primer T7RNAP-HpaI-N (5'-CGC GCG GTT AAC TTG CTT CCT AG- 3 '), each DNA fragment was amplified by PCR using pTrc99a-PstI-C (5'-GCA TGC CTG CAG GTC GAC TCT AG-3'). These DNA fragments have complementary portions, and these fragments were repeatedly denatured, annealed, and extended to produce DNA fragments into which the desired mutation was introduced. This DNA fragment was purified by agarose gel electrophoresis, cutting out only the DNA fragment of the desired size, and using this as a template, reamplification using primers T7RNAP-HpaI-N and pTrc99a-PstI-C, and restriction enzyme Cut with Hpa I and Pst I. This DNA was subjected to 1% agarose electrophoresis and separated, and then the target DNA fragment was excised and purified. By replacing this DNA fragment with the Hpa I and Pst I DNA fragments of pT7R, introducing the mutation, transforming into E. coli DH5α, selecting the plasmid with the mutation, and finally confirming the nucleotide sequence It was confirmed whether a mutation was introduced at the target position. Then, an expression plasmid pT7RF644Y for producing mutant T7 RNA polymerase F644Y was obtained. The production of mutant T7 RNA polymerase F644Y from this plasmid was inducible by culturing Escherichia coli containing this plasmid and adding IPTG, as in the production of wild-type T7 RNA polymerase.

(2)変異型T7 RNAポリメラーゼL665P/F677Yを生産するための発現プラスミドの構築(図4及び5参照)
変異型T7 RNA ポリメラーゼL665P/F667Yの構築は、先のF644Yの構築同様、PCR法をベースにして以下のように行った。
先ず、野生型T7 RNA ポリメラーゼ遺伝子を持つ発現ベクターpT7R中のT7 RNA ポリメラーゼ遺伝子領域内に、変異導入操作を容易にするため制限酵素XhoI (CTC GAG)を導入した。更に具体的に述べるとプライマーApaF1 (5'-CAT CTG GTC GCA TTG GGT CAC-3’)とプライマーXho-R (5'-CCA AGT GTT CTC GAG TGG AGA-3’)の組み合わせで、また、Xho-F (5'-CTA AGT CTC CAC TCG AGA ACA CTT GG-3’)とプライマーAflII-R (5'-CAG CCA GCA GCT TAG CAG CAG-3’)の組み合わせで、各々鋳型として発現ベクターpT7Rを用いて、PCRを行った。増幅した前者のDNAフラグメントは制限酵素ApaIとXhoIで、後者の増幅したDNAフラグメントは制限酵素AflIIとXhoIでそれぞれ反応し、さらに発現ベクターpT7Rを予めApaIとAflIIで処理して、全てをT4 DNA ライゲースを用いて結合させた。この反応物を大腸菌DH5αに形質転換し、抗生物質アンピシリンを含んだ寒天平板上で生育するコロニーを複数得た。このコロニーをいくつか選択し、培養、プラスミドDNAの抽出を行い、T7 RNA ポリメラーゼ遺伝子領域内に制限酵素XhoI部位が生まれたプラスミドpT7R-Xhoを得た(図4参照)。このXhoI部位は、制限酵素XhoIで処理することによって、切断されること及びDNAの塩基配列決定を行い、その存在を確認可能である。このプラスミドpT7R-Xhoを鋳型として、プライマーXho-Rとプライマー667R (5'-GCT GAG TGT ACA TCG GAC CCT-3’)の組み合わせとプライマー667F (5'-GCT GAG TGT ACA TCG GAC CCT-3’)とプライマーAflIIRの組み合わせで各々PCRを行った。このPCR産物を直接鋳型として、DNAの塩基配列を決定し、プライマー667Rおよび667Fの配列を確認し後、それぞれを2%アガロース電気泳動(アガロースはニッポンジーン製のアガロースXを使用)を行い、目的の大きさのDNAフラグメントを切り出し、Gene Pure Kitを用いて、このDNAフラグメントを精製した。この精製した2つのDNAを混合し、鋳型としてプライマーXhoF及びAflIIRを用いてPCRを行い、増幅したDNAフラグメントを制限酵素マッピング、DNA塩基配列の解析により目的のフラグメントであることを確認後、制限酵素XhoIとAflIIを用いて酵素反応を行い、これを予め制限酵素XhoIおよびAflIIで処理したプラスミドpT7R-XhoにT4 DNA ライゲースを用いて結合させた。この反応物を大腸菌DH5αに形質転換し、抗生物質アンピシリンを含んだ寒天平板上で生育するコロニーを複数得た。このコロニーをいくつか選択し、培養、プラスミドDNAの抽出を行い、目的の変異が導入されているかをDNA塩基配列の決定を行い、確認し、最終的に目的の変異型T7 RNAポリメラーゼL665P/F644Yを生産するための発現プラスミドpT7RL665P/F667Yを構築した(図5参照)。このプラスミドからの変異型T7 RNAポリメラーゼL665P/F667Yの生産は、野生型T7 RNAポリメラーゼの生産と同様、本プラスミドを含む大腸菌を培養し、IPTGを添加することにより、発現誘導可能であった。
(2) Construction of an expression plasmid for producing mutant T7 RNA polymerase L665P / F677Y (see FIGS. 4 and 5)
Mutant T7 RNA polymerase L665P / F667Y was constructed as follows based on the PCR method as in the construction of F644Y.
First, a restriction enzyme XhoI (CTC GAG) was introduced into the T7 RNA polymerase gene region in the expression vector pT7R having the wild type T7 RNA polymerase gene in order to facilitate the mutation introduction operation. More specifically, a combination of primer ApaF1 (5'-CAT CTG GTC GCA TTG GGT CAC-3 ') and primer Xho-R (5'-CCA AGT GTT CTC GAG TGG AGA-3'), Xho -F (5'-CTA AGT CTC CAC TCG AGA ACA CTT GG-3 ') and primer AflII-R (5'-CAG CCA GCA GCT TAG CAG CAG-3') in combination with the expression vector pT7R PCR was performed. The amplified DNA fragment is reacted with restriction enzymes ApaI and XhoI, and the latter amplified DNA fragment is reacted with restriction enzymes AflII and XhoI. The expression vector pT7R is treated with ApaI and AflII in advance, and all are T4 DNA ligase. Was used to bind. This reaction product was transformed into Escherichia coli DH5α to obtain a plurality of colonies growing on an agar plate containing the antibiotic ampicillin. Several colonies were selected, cultured, and plasmid DNA was extracted to obtain plasmid pT7R-Xho in which a restriction enzyme XhoI site was born in the T7 RNA polymerase gene region (see FIG. 4). This XhoI site can be cleaved by treating with the restriction enzyme XhoI and the nucleotide sequence of the DNA can be determined to confirm its presence. Using this plasmid pT7R-Xho as a template, a combination of primer Xho-R and primer 667R (5'-GCT GAG TGT ACA TCG GAC CCT-3 ') and primer 667F (5'-GCT GAG TGT ACA TCG GAC CCT-3' ) And primer AflIIR were used for PCR. Using this PCR product as a direct template, the DNA base sequence was determined, the sequences of primers 667R and 667F were confirmed, and each was subjected to 2% agarose electrophoresis (agarose using Nippon Gene's Agarose X). A size DNA fragment was excised and purified using the Gene Pure Kit. The purified two DNAs are mixed, PCR is performed using the primers XhoF and AflIIR as templates, and the amplified DNA fragment is confirmed by restriction enzyme mapping and analysis of the DNA base sequence. Enzymatic reaction was performed using XhoI and AflII, and this was ligated to plasmid pT7R-Xho previously treated with restriction enzymes XhoI and AflII using T4 DNA ligase. This reaction product was transformed into Escherichia coli DH5α to obtain a plurality of colonies growing on an agar plate containing the antibiotic ampicillin. Select some of these colonies, culture, extract plasmid DNA, determine if the target mutation has been introduced, determine the DNA base sequence, and finally confirm the target mutant T7 RNA polymerase L665P / F644Y An expression plasmid pT7RL665P / F667Y was produced for production of (see FIG. 5). The production of mutant T7 RNA polymerase L665P / F667Y from this plasmid was inducible by culturing Escherichia coli containing this plasmid and adding IPTG, similarly to the production of wild type T7 RNA polymerase.

参考例7
変異型T7 RNA ポリメラーゼ の精製
大腸菌に導入した変異型T7 RNA ポリメラーゼ蛋白質を精製した。
尚、本蛋白質の野生型については既にChamberlin, M et al. Nature, 228:227-231(1970), Davanloo et al., Proc.Natl. Acad. Sci.USA., 81:2035-2039(1984)に記載されている。さらに大量生産に関しては、Zawadzki, V et al., Nucl. Acids Res., 19:1948(1991)に報告されている。
変異型T7 RNA ポリメラーゼは基本的に全て同じ方法で精製できる。変異部位の違いにより、その発現量、カラムクロマトクラフィの挙動が若干異なることもある。以下、変異型T7 RNAポリメラーゼF644Yの精製法を例示する。F644Yの発現ベクターpT7RF644Yを大腸菌DH5αに導入、抗生物質アンピシリンを含んだLB培地にて、先ず、試験管培養にてOD(600nm) =0.4〜0.6になったとき、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)を終濃度0.4mMになるように加え、更に8時間培養する。このとき遠心分離により、大腸菌菌体を集め、典型的には2リッターの培養液より10gの湿重量の大腸菌が得られる。この大腸菌菌体を直ぐに使用しない時は、-20℃以下の冷凍庫で保存が可能である。
この段階以降、酵素の精製の全ての工程は、特記しない限り、室温以下の温度、好ましくは0〜5℃にて実施する。この大腸菌は、このとき菌体重量の10倍の洗浄緩衝液(20mM Tris-HCl, pH 8.1, 130 mM NaCl, 2mM EDTANa2 at 25℃)で洗い、再び遠心分離(5,000xg、4℃にて10分間)し、10倍量のソニケーション緩衝液 [50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTANa2, 5 mM ジチオスレイトール(DTT)、0.1 mM ベンザミジン, 30μg/ml フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、10μg/ml、バシトラシン] に懸濁し、ソニファイヤー450(ブランソン社)を用い、80W、15分間超音波処理を行い菌体を破砕、粘度を低下させる。続いて、12,000xg、4℃にて10分間遠心分離し、細胞残査を除いた。得られた上清を撹拌しながら、10%硫酸ストレプトマイシンをゆっくりと滴下し、終濃度2.0%とした後、更に30分間撹拌を続けた。12,000xg。4℃にて10分間遠心分離し、沈殿を除去し、粉末硫安をゆっくり添加しながら撹拌し、沈殿を形成させる。この場合、最初に30%飽和硫安で沈殿を集め(30%硫安沈殿)、上清は更に60%飽和硫安になるように硫安を撹拌しながら添加し、再び沈殿を形成させ(30-60%硫安沈殿)、更に上清を90%飽和硫安になるように粉末硫安を加え、4℃にて1時間撹拌し、遠心し回収した。この3つの硫安画分の一部をSDS-アクリルアミドゲル電気泳動を行い、蛋白質を分析したところ、目的の変異型T7 RNA ポリメラーゼのほとんどは、30-60%硫安画分に存在し、以後この画分を用いて精製を進めた。30-60%硫安画分は少量のカラム緩衝液(20 mM KPO4, pH7.7, 100 mM NaCl, 1mM DTT, 30μg/ml PMSF)に懸濁し、同じ緩衝液500mlにて、16時間透析し、脱塩した。この透析液を、カラム体積5mlのヘパリン-セファロース(ファルマシア・バイオテク)に付加する。次いで、このカラムを同緩衝液で、280nmの紫外線吸収物質が検出されなくなるまで洗浄し、カラム体積の約40倍の体積の同一緩衝液中の0.1M〜0. 64M NaClの直線濃度勾配で溶出する。溶出液は、適当量を試験管に分画して集め、直ぐにSDS-アクリルアミドゲル電気泳動を行い、蛋白質を分析し、目的の変異型T7 RNA ポリメラーゼと思われる分子量付近に蛋白質が存在する分画を検査する。典型的な例では0.4M のNaCl付近に見いだされるはずである。この蛋白質を含む分画を集め、約1リッターのカラム緩衝液(20 mM KPO4, pH7.7, 100 mM NaCl, 1mM DTT, 30μg/ml PMSF)に対して16時間透析し、脱塩操作を行った。この透析脱塩した分画を、同緩衝液で予め平衡化した5ml のカラム体積のQ-セファロース(Q-sepharose, ファルマシア・バイオテク)に付加し、同緩衝液で、280nmの紫外線吸収物質が検出されなくなるまで洗浄し、カラム体積の約40倍の体積の同一緩衝液中の0.1M〜0.64M NaClの直線濃度勾配で溶出する。溶出液は、適当量を試験管に分画して集め、直ぐにSDS-アクリルアミドゲル電気泳動行い、蛋白質を分析し、目的の変異型T7 RNA ポリメラーゼと思われる分子量付近に蛋白質が存在する分画を検査する。典型的な例では0.24M のNaCl付近に見いだされるはずである。この蛋白質を含む分画を集め、500mlの保存用緩衝液(50% glycerol, 20 mM KPO4, pH7.7, 100 mM NaCl, 1mM DTT, 30μg/ml PMSF) に対して16時間透析し、使用まで-20℃にて保存する。この状態で、イン・ビトロのRNA合成活性、或いは混入しているリボヌクレアーゼ活性について試験する。ここでこの方法を例示すると、イン・ビトロRNA合成活性については、T7 プロモーターを含むプラスミドを鋳型として用い、野生型T7 RNA ポリメラーゼの市販品(BRL・ギブコ社)を標準品として酵素希釈法を用いて、RNA合成反応を行い、合成したRNAをアガロース電気泳動する事により、おおよその力価を推定した。このとき、合成されたRNAの分解の程度も観察されるため、同時に混入リボヌクレアーゼに関しての、簡単な検定も可能である。典型的な例として、以上のような工程を踏まえた精製法で、1リッターの培養液から2,500,000単位の変異型T7 RNA ポリメラーゼF644Y蛋白質が精製され、この標品にはほとんどRNaseの混入は認められない。
Reference Example 7
Purification of mutant T7 RNA polymerase The mutant T7 RNA polymerase protein introduced into E. coli was purified.
The wild type of this protein has already been described in Chamberlin, M et al. Nature, 228: 227-231 (1970), Davanloo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81: 2035-2039 (1984). )It is described in. Furthermore, mass production is reported in Zawadzki, V et al., Nucl. Acids Res., 19: 1948 (1991).
Mutant T7 RNA polymerase can be purified essentially in the same way. Depending on the mutation site, the expression level and column chromatography behavior may be slightly different. Hereinafter, a purification method of mutant T7 RNA polymerase F644Y is exemplified. The expression vector pT7RF644Y of F644Y was introduced into Escherichia coli DH5α, and in LB medium containing the antibiotic ampicillin, when OD (600 nm) = 0.4 to 0.6 in a test tube culture, isopropyl-β-thiogalactopyrano Sid (IPTG) is added to a final concentration of 0.4 mM, and further cultured for 8 hours. At this time, Escherichia coli cells are collected by centrifugation, and typically 10 g of wet weight Escherichia coli is obtained from a 2 liter culture solution. When this Escherichia coli cell is not used immediately, it can be stored in a freezer at -20 ° C or lower.
From this stage onward, all steps of enzyme purification are performed at a temperature below room temperature, preferably 0-5 ° C., unless otherwise specified. The E. coli was then washed with a washing buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 130 mM NaCl, 2 mM EDTANa2 at 25 ° C.) 10 times the cell weight, and centrifuged again (5,000 × g, 10 ° C. at 4 ° C.). 10) volume of sonication buffer [50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTANa2, 5 mM dithiothreitol (DTT), 0.1 mM benzamidine, 30 μg / ml phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), 10 μg / ml, bacitracin] and sonicated at 80 W for 15 minutes using a Sonifier 450 (Branson) to crush the cells and reduce the viscosity. Subsequently, centrifugation was performed at 12,000 × g and 4 ° C. for 10 minutes to remove cell residues. While stirring the resulting supernatant, 10% streptomycin sulfate was slowly added dropwise to a final concentration of 2.0%, and stirring was continued for another 30 minutes. 12,000xg. Centrifuge at 4 ° C for 10 minutes to remove the precipitate and stir while slowly adding powdered ammonium sulfate to form a precipitate. In this case, the precipitate is first collected with 30% saturated ammonium sulfate (30% ammonium sulfate precipitation), and the supernatant is further added with stirring so that it becomes 60% saturated ammonium sulfate, and a precipitate is formed again (30-60%). Then, ammonium sulfate powder was added so that the supernatant became 90% saturated ammonium sulfate, stirred at 4 ° C. for 1 hour, centrifuged and collected. A portion of these three ammonium sulfate fractions were subjected to SDS-acrylamide gel electrophoresis and analyzed for protein. As a result, most of the target mutant T7 RNA polymerase was present in the 30-60% ammonium sulfate fraction. Purified using minutes. The 30-60% ammonium sulfate fraction is suspended in a small amount of column buffer (20 mM KPO 4 , pH 7.7, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 30 μg / ml PMSF), and dialyzed against the same buffer 500 ml for 16 hours. , Desalted. This dialysate is added to heparin-sepharose (Pharmacia Biotech) with a column volume of 5 ml. The column is then washed with the same buffer until no UV-absorbing material at 280 nm is detected and eluted with a linear gradient from 0.1 M to 0.64 M NaCl in the same buffer approximately 40 times the volume of the column. To do. The eluate is fractionated and collected in a test tube, immediately subjected to SDS-acrylamide gel electrophoresis, the protein is analyzed, and the fraction in which the protein exists in the vicinity of the molecular weight considered to be the target mutant T7 RNA polymerase. Inspect. A typical example would be found near 0.4M NaCl. Fractions containing this protein were collected and dialyzed against about 1 liter of column buffer (20 mM KPO 4 , pH 7.7, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 30 μg / ml PMSF) for 16 hours, and desalted. went. This dialysis desalted fraction is added to a 5 ml column volume of Q-sepharose (Pharmacia Biotech) that has been pre-equilibrated with the same buffer, and UV buffer at 280 nm can be detected with the same buffer. Wash until no more and elute with a linear gradient of 0.1M to 0.64M NaCl in the same buffer in a volume approximately 40 times the column volume. The eluate is fractionated and collected in a test tube and immediately subjected to SDS-acrylamide gel electrophoresis to analyze the protein, and the fraction in which the protein is present in the vicinity of the molecular weight considered to be the target mutant T7 RNA polymerase. inspect. A typical example would be found near 0.24M NaCl. Fractions containing this protein are collected, dialyzed against 500 ml of storage buffer (50% glycerol, 20 mM KPO 4 , pH 7.7, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 30 μg / ml PMSF) for 16 hours and used Store at -20 ℃. In this state, in vitro RNA synthesis activity or contaminating ribonuclease activity is tested. To illustrate this method, for in vitro RNA synthesis activity, a plasmid containing a T7 promoter was used as a template, and a commercially available wild type T7 RNA polymerase (BRL / Gibco) was used as a standard, using an enzyme dilution method. Then, an RNA synthesis reaction was performed, and the approximate titer was estimated by agarose electrophoresis of the synthesized RNA. At this time, since the degree of degradation of the synthesized RNA is also observed, a simple assay for contaminating ribonuclease is possible at the same time. As a typical example, 2,500,000 units of mutant T7 RNA polymerase F644Y protein was purified from 1 liter of culture solution using the purification method based on the above steps, and this sample was almost free of RNase contamination. Absent.

参考例8
RNase活性の混入のない無機ピロホスファターゼの精製
RNaseの混入のない、無機ピロホスファターゼ(PPase)は以下のように精製したが、以下の方法に限定されるものではない。
Reference Example 8
Purification of inorganic pyrophosphatase free of RNase activity contamination
Inorganic pyrophosphatase (PPase) free from RNase contamination was purified as follows, but is not limited to the following method.

無機ピロホスファターゼの出発材料としては、シグマ社製の酵母由来の粗精製品(シグマI-1643, EC.3.6.1.1)、4mg(680単位)を緩衝液(20mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.9)1mlに懸濁し、同緩衝液に対して2時間透析し、脱塩操作を行い、この透析液をカラム体積1mlのSP Sepharoseカラムクロマトグラム(ファルマシア・バイオテック)を行った。具体的には約20倍の体積の同カラム緩衝液で280nmの紫外線吸収物質が検出されなくなるまで充分洗浄し、カラム体積の約20倍の体積の同緩衝液を用いて0〜0.1MのNaCl直線濃度勾配で溶出する。溶出液は、適当量に分画して集め、直ぐにSDS-12.5%ポリアクリルアミド電気泳動を行い、分子量約32kDaの蛋白質を含む画分を検査した。典型的な例では、PPase画分は、未吸着部分に見いだされるはずである。この蛋白質を含む分画を集め、カラム体積1mlのQ-Sepharose(ファルマシア・バイオテック)に吸着させ、カラム体積の約20倍の体積の同緩衝液中を用いて0〜1.0MのNaCl直線濃度勾配で溶出する。溶出液は、適当量に分画して集め、直ぐにSDS-12.5%ポリアクリルアミド電気泳動を行い、分子量約32kDaの蛋白質を含む画分を検査した。典型的な例では、0.35MのNaCl付近に見いだされるはずである。分子量32kDaの蛋白質を含む分画を集め、500mlの保存緩衝液(20mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 50% glycer ol, pH7.9)に対して16時間透析し、使用まで-20℃にて保存する。典型的な例では、回収率62.5%でPPase蛋白質425単位、0.425単位/μlの標品を得ることが出来る。   As a starting material for inorganic pyrophosphatase, Sigma yeast crude product (Sigma I-1643, EC.3.6.1.1), 4 mg (680 units) buffer solution (20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, The suspension was suspended in 1 ml of pH 7.9), dialyzed against the same buffer solution for 2 hours, desalted, and this dialyzed solution was subjected to SP Sepharose column chromatogram (Pharmacia Biotech) with a column volume of 1 ml. Specifically, the column buffer solution of about 20 times the volume is sufficiently washed until no UV-absorbing substance at 280 nm is detected, and 0 to 0.1 M NaCl is used with the buffer solution of about 20 times the column volume. Elute with a linear gradient. The eluate was fractionated and collected in an appropriate amount and immediately subjected to SDS-12.5% polyacrylamide electrophoresis to examine a fraction containing a protein having a molecular weight of about 32 kDa. In a typical example, the PPase fraction should be found in the unadsorbed part. Fractions containing this protein are collected, adsorbed onto Q-Sepharose (Pharmacia Biotech) with a column volume of 1 ml, and a linear NaCl concentration of 0 to 1.0 M using the same buffer in a volume approximately 20 times the column volume. Elute with a gradient. The eluate was fractionated and collected in an appropriate amount and immediately subjected to SDS-12.5% polyacrylamide electrophoresis to examine a fraction containing a protein having a molecular weight of about 32 kDa. In a typical example, it should be found near 0.35M NaCl. Fractions containing a protein with a molecular weight of 32 kDa are collected, dialyzed against 500 ml of storage buffer (20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 50% glycerol, pH 7.9) for 16 hours and stored at −20 ° C. until use. To do. In a typical example, a PPase protein of 425 units and 0.425 units / μl can be obtained with a recovery rate of 62.5%.

この状態でRNase混入度合いを、大腸菌のrRNA(16Sと23S)8μgを基質として検査した。具体的には、大腸菌rRNAを8mM MgCl2、2mM spermidine-(HCl)3、5m M DTT、40mM Tris/HCl pH 8.0の緩衝液中で、PPase、0.17単位相当を加え、37℃、4時間反応させた。このRNAをホルムアミドが存在する変性条件下の1.0%アガロ―ス電気泳動を行い、共に添加した色素であるキシレンシアノールがアガロースゲルの約1/3に達したときに泳動を止め、紫外線(波長254nm)を照射して、写真撮影を行い、RNAの分解度合いを検査した。このとき、粗精製品と精製後のPPaseを比較したところ、粗精製品ではRNAの分解が観察されたが、精製品については、有為なRNA分解活性が検出されなかった。 In this state, the degree of RNase contamination was examined using 8 μg of E. coli rRNA (16S and 23S) as a substrate. Specifically, E. coli rRNA was added to PPase, equivalent to 0.17 units in a buffer solution of 8 mM MgCl 2 , 2 mM spermidine- (HCl) 3 , 5 mM DTT, 40 mM Tris / HCl pH 8.0, and reacted at 37 ° C. for 4 hours. I let you. This RNA was subjected to 1.0% agarose electrophoresis under denaturing conditions in the presence of formamide. When xylene cyanol, the dye added together, reached about 1/3 of the agarose gel, the electrophoresis was stopped, and ultraviolet light (wavelength 254 nm) and photographed to examine the degradation degree of RNA. At this time, when the crude product was compared with the purified PPase, RNA degradation was observed in the crude product, but no significant RNA degradation activity was detected in the purified product.

実施例5
変異型RNAポリメラーゼを用いたイン・ビトロ転写反応におけるエネルギートランスファーターミネーターと従来のダイターミネーターを用いたシークエンシング反応例比較
3’dNTPのエネルギートランスファーターミネーターの塩基配列決定法における効果を変異型T7 RNAポリメラーゼF644Yを用いたイン・ビトロ転写反応で調べた。シークエンシング反応は、Melton, D.A. (1984, Nucleic Acids Res., 12: 7035-7056)によって示された方法を用いた。さらに具体的に述べると、T7プロモーターを有するプラスミドベクターpBluescriptKS(+)(ストラタジーン社)を、制限酵素PvuIIで反応し、線状にしたものを鋳型として用いた。3’dNTPのエネルギートランスファーターミネーター誘導体としては、実施例1〜4で合成した化合物10〜13であるプロリンスペーサーを有するダイターミネーターを用いた。具体的には、4μM FAM及びR6G-標識3’-dATP, 4μM FAM及びR110-標識3’-dGTP, 80μM FAM及びXR-標識3’-dCTP及び20μM FAM及びTMR-標識3’-dUTP、500μM GTP, UTP及び250μM ATP, CTP、8mM MgCl2、2mM spermidine-(HCl)3、5mM DTT、40mM Tris/HCl pH 8.0 (BRL, ギブコ社)の条件下に、変異型T7 RNAポリメラーゼF644Y(25U)、酵母由来の無機ピロホスファターゼ( 0.045U)を加えて、合計反応体積10μlとして、37℃で一時間反応を行った。
Example 5
Comparison of sequencing reaction examples using energy transfer terminator and conventional dye terminator in in vitro transcription reaction using mutant RNA polymerase
The effect of the 3'dNTP energy transfer terminator on the sequencing method was examined by in vitro transcription using mutant T7 RNA polymerase F644Y. The sequencing reaction used the method shown by Melton, DA (1984, Nucleic Acids Res., 12: 7035-7056). More specifically, a plasmid vector pBluescriptKS (+) (Stratagene) having a T7 promoter was reacted with a restriction enzyme PvuII and linearized, and used as a template. As an energy transfer terminator derivative of 3′dNTP, a dye terminator having a proline spacer which is the compounds 10 to 13 synthesized in Examples 1 to 4 was used. Specifically, 4 μM FAM and R6G-labeled 3′-dATP, 4 μM FAM and R110-labeled 3′-dGTP, 80 μM FAM and XR-labeled 3′-dCTP and 20 μM FAM and TMR-labeled 3′-dUTP, 500 μM GTP, UTP and 250 μM ATP, CTP, 8 mM MgCl 2 , 2 mM spermidine- (HCl) 3 , 5 mM DTT, 40 mM Tris / HCl pH 8.0 (BRL, Gibco), mutant T7 RNA polymerase F644Y (25 U) Then, yeast-derived inorganic pyrophosphatase (0.045 U) was added to make a total reaction volume of 10 μl, and the reaction was performed at 37 ° C. for 1 hour.

また、比較のための1つの蛍光色素を有するダイターミネーターを用いた反応は、4μM R6G-4x-3’dATP, 4μM R110-4x-3’dGTP, 80μM XR-4x-3’dCTP, 20μM TMR-4x-3’dUTP), さらに500μM GTP, UTP及び250μM ATP, CTP、8mM MgCl2、2mM spermidine-(HCl)3、5mM DTT、40mM Tris/ HCl pH 8.0 (BRL, ギブコ社)の条件下に、変異型T7 RNAポリメラーゼF644Y(25U)、酵母由来の無機ピロホスファターゼ(0.05U)を加えて、合計反応体積10μlとして、同じく37℃で一時間反応を行った。次に反応産物中に残存している未反応のターミネーターを除去するため、セファデックスG-50カラム(ファルマシア・バイオテク製)を用いたゲル濾過法により転写産物を精製し、精製産物は遠心式エバポレーターを用いて蒸発乾固した。 In addition, the reaction using a dye terminator having one fluorescent dye for comparison was 4 μM R6G-4x-3'dATP, 4 μM R110-4x-3'dGTP, 80 μM XR-4x-3'dCTP, 20 μM TMR- 4x-3'dUTP), 500 μM GTP, UTP and 250 μM ATP, CTP, 8 mM MgCl 2 , 2 mM spermidine- (HCl) 3 , 5 mM DTT, 40 mM Tris / HCl pH 8.0 (BRL, Gibco) Mutant T7 RNA polymerase F644Y (25 U) and yeast-derived inorganic pyrophosphatase (0.05 U) were added to make a total reaction volume of 10 μl, and the reaction was similarly carried out at 37 ° C. for 1 hour. Next, in order to remove the unreacted terminator remaining in the reaction product, the transcription product is purified by gel filtration using a Sephadex G-50 column (Pharmacia Biotech), and the purified product is a centrifugal evaporator. Was evaporated to dryness.

この乾燥させた反応物をABI社(Perkin Elmer Corporatio n, Applied Biosystems Division)のABI PRISM 377 DNA Sequencing System取り扱い説明書Ver.1.0に従い、ホルムアミド/EDTA/Blue dextrane loading buffer 6μlに溶解し、そのうち2μlを、6M尿素/4%ロングレンジャーTMアクリルアミド溶液(FMC社)を含むシークエンス解析用変性ゲルを用い、ABI 377 DNA Sequencer及び解析プログラム(Sequencing Analysis Ver.3.0)により解析した。   This dried reaction product was dissolved in 6 μl of formamide / EDTA / Blue dextrane loading buffer according to ABI PRISM 377 DNA Sequencing System instruction manual Ver.1.0 of ABI (Perkin Elmer Corporation, Applied Biosystems Division). Using a denaturing gel for sequence analysis containing 6M urea / 4% Long Ranger ™ acrylamide solution (FMC), analysis was performed with ABI 377 DNA Sequencer and analysis program (Sequencing Analysis Ver.3.0).

その結果、エネルギートランスファーターミネーターを用いた場合、各シークエンスラダーの強度が高いことが判明し、ホルムアミド/EDTA /Blue dextrane loading bufferと用いて反応物を希釈し、そのうち2μlを泳動した。その結果、10倍希釈したものが、ほぼ、従来のダイ・ターミネーターを用いたときとほぼ同じピーク強度でシークエンシング出来ることが判明した。このエネルギートランスファーターミネーターを用いた反応物を10倍希釈したシークエンスパターンの典型例を、従来のダイ・ターミネーターを用いたときのシークエンスパターンと比較したものを図1に提示した。この結果より、エネルギートランスファーターミネーターを用いると従来のダイ・ターミネーターを用いたときの10倍の感度でシークエンシングが可能であることが判明した。
変異型T7 RNAポリメラーゼF644Yの代わりに変異型T7 RNA ポリメラーゼL665P/F667Yを用いてシークエンシングを行った結果、上記と同様の結果が得られた。
As a result, when the energy transfer terminator was used, it was found that the strength of each sequence ladder was high, and the reaction product was diluted with formamide / EDTA / Blue dextrane loading buffer, and 2 μl thereof was electrophoresed. As a result, it was found that the 10-fold diluted product could be sequenced with almost the same peak intensity as when a conventional die terminator was used. FIG. 1 shows a typical example of a sequence pattern obtained by diluting a reaction product using this energy transfer terminator 10 times with a sequence pattern obtained using a conventional die terminator. From this result, it was found that when the energy transfer terminator is used, sequencing is possible with a sensitivity 10 times that when using a conventional die terminator.
As a result of sequencing using mutant T7 RNA polymerase L665P / F667Y instead of mutant T7 RNA polymerase F644Y, results similar to the above were obtained.

上記で用いたR6G-4x-3’dATP (14)、R110-4 x-3’dGTP(15)、XR-4x-3’dCTP (16)及びTMR-4x-3’dUTP (17)の化学構造式を以下に示す。   Chemistry of R6G-4x-3'dATP (14), R110-4 x-3'dGTP (15), XR-4x-3'dCTP (16) and TMR-4x-3'dUTP (17) used above The structural formula is shown below.

Figure 0003656075
Figure 0003656075
Figure 0003656075
Figure 0003656075

図1は、実施例5で得られたシークエンスパターンである。FIG. 1 is a sequence pattern obtained in Example 5. 図2は、野生型T7 RNAポリメラーゼを発現するプラスミド、pT7Rの構築図である。FIG. 2 is a construction diagram of pT7R, a plasmid that expresses wild-type T7 RNA polymerase. 図3は、変異型T7RNA ポリメラーゼF644Yを発現するプラスミド、pT7RF644Yの構築図である。FIG. 3 is a construction diagram of pT7RF644Y, a plasmid that expresses mutant T7 RNA polymerase F644Y. 図4は、T7 RNA ポリメラーゼ遺伝子中に制限酵素XhoI部位を持つ、pT7Rの改良型プラスミド、pT7R-Xhoの構築図である。FIG. 4 is a construction diagram of pT7R-modified plasmid, pT7R-Xho, which has a restriction enzyme XhoI site in the T7 RNA polymerase gene. 図5は、変異型T7RNA ポリメラーゼL665P/F667Yを発現するプラスミド、pT7RL665P/F667Yの構築図である。FIG. 5 is a construction diagram of pT7RL665P / F667Y, a plasmid that expresses mutant T7RNA polymerase L665P / F667Y. 図6は、実験例1で得られた、エネルギー転移色素の蛍光強さの比較図である。FIG. 6 is a comparison diagram of the fluorescence intensity of the energy transfer dye obtained in Experimental Example 1.

Claims (5)

チェインターミネーター法でDNAの塩基配列を決定する方法であって、5'末端にフォスフェート基を持たないか、またはモノ若しくはジフォスフェート基を有するモノまたはオリゴヌクレオチド残基、並びにエネルギートランスファーのドナー及びアクセプターになり得る二種類のレポーターを有するイニシエーターとRNAポリメラーゼとを用いてチェインターミネーション反応を行ない、かつ、
前記イニシエーターとして、Qが5'末端にフォスフェート基を持たないか、またはモノ若しくはジフォスフェート基を有するモノまたはオリゴヌクレオチド残基である下記一般式(1)で表される化合物を用いることを特徴とする方法。
Figure 0003656075
(式中、Qはモノまたはオリゴヌクレオチド残基を示し、Vは−C≡C−(CH2n1−NH−または−CH=CH−(CH2n2−NH−(但し、n1及びn2は1以上の整数を示す)を示し、R1は3価の基を示し、R2及びR3互いに結合し、隣接するCH及びNHと一緒になって環を形成し、W1及びW2はそれぞれ独立して蛍光性基を示し、mは1以上の整数を示す。)
A method for determining the base sequence of DNA by the chain terminator method, comprising a mono- or oligonucleotide residue having no phosphate group at the 5 ′ end or having a mono- or diphosphate group, and an energy transfer donor and Perform a chain termination reaction using an initiator having two types of reporters that can be acceptors and RNA polymerase, and
As the initiator, a compound represented by the following general formula (1) wherein Q does not have a phosphate group at the 5 ′ end, or is a mono or oligonucleotide residue having a mono or diphosphate group is used. A method characterized by.
Figure 0003656075
(Wherein Q represents a mono- or oligonucleotide residue, V represents —C≡C— (CH 2 ) n1 —NH— or —CH═CH— (CH 2 ) n2 —NH— (where n1 and n2 Represents an integer of 1 or more, R 1 represents a trivalent group, R 2 and R 3 are bonded to each other, and together with adjacent CH and NH form a ring , W 1 and W 2 independently represents a fluorescent group, and m represents an integer of 1 or more.)
1
Figure 0003656075
(式中、R21〜R23はそれぞれ独立して結合手又は2価の炭化水素基を示す。)である請求項記載の方法。
R 1 is
Figure 0003656075
(Wherein, R 21 to R 23 each independently represents a bond or a divalent hydrocarbon group.) The method of claim 1 wherein the.
1及びW2の間の距離が10〜100Åの範囲となるように、R2、R3及びmが選ばれる請求項1または2記載の方法。 The method according to claim 1 or 2 , wherein R 2 , R 3 and m are selected so that the distance between W 1 and W 2 is in the range of 10 to 100 mm. ターミネーターとして非標識のターミネーターを用いる請求項1に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein an unlabeled terminator is used as the terminator. チェインターミネーション反応を無機ピロフォスファターゼの存在下で行う請求項1〜のいずれか1項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 4 , wherein the chain termination reaction is performed in the presence of inorganic pyrophosphatase.
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