JP3655615B2

JP3655615B2 - Chromatographic packing material

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Publication number: JP3655615B2
Application number: JP2003052305A
Authority: JP
Inventors: 洋介東條; 武利神田; 和之宮沢
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 2003-02-28
Filing date: 2003-02-28
Publication date: 2005-06-02
Anticipated expiration: 2023-02-28
Also published as: JP2004258013A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はクロマトグラフィー用充填剤に関する。さらに詳しくは、ホスホリルコリン基が担体表面に直接的に化学結合していることを特徴とするクロマトグラフィー用充填剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ホスホリルコリン基を有する重合体は生体適合性高分子として検討されている。そして、この重合体を各種基剤に被覆させた生体適合性材料が開発されている。
【０００３】
例えば、特許文献１にはホスホリルコリン基を有する重合体で被覆した医療用材料が記載されている。また、特許文献２にはホスホリルコリン基を有する重合体で被覆した分離剤が開示されている。
【０００４】
上記の材料は、主に水酸基を有するアクリル系モノマーと２−クロロ−１，３，２−ジオキサホスホラン−２−オキシドを反応させ、更にトリメチルアミンにより４級アンモニウムとすることによりホスホリルコリン構造を有するモノマーを合成しこれを重合して得られる重合体により、その表面が被覆されたものである（重合体の製造方法に関しては特許文献３及び４を参照）。
【０００５】
特許文献３には、２−メタクロイルオキシエチルホスホリルコリンとメタクリル酸エステルの共重合体が製造され、特許文献４には２−メタクロイルオキシエチルホスホリルコリンの単独重合体が製造されている。
【０００６】
一方、タンパク質やタンパク質よりも分子量が小さいポリペプチド等の生体試料をサイズ排除によって分離するＧＦＣ用充填剤には、多くの市販品が存在する。このＧＦＣ用充填剤には、架橋された親水性高分子を担体とする充填剤と、シリカゲルを担体とする充填剤が存在する。
【０００７】
架橋された親水性高分子を担体とする充填剤は、適用できる移動相のｐＨ範囲が広く、汎用性が高い。しかしながら、高分子を担体とする充填剤はシリカゲルを担体とする充填剤よりも、▲１▼細孔径の制御が困難であるために高理論段数を得づらく、また、▲２▼高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で使用される際にかかる高圧条件に対する強度が悪いことと移動相溶媒によって粒子が膨潤することのために再現性のよいクロマトグラムを得られないことも多い。
【０００８】
シリカゲルを担体とする充填剤は、タンパク質やポリペプチドのシリカゲル担体表面への吸着が問題となる。そこで、分析試料中のタンパク質やポリペプチドのシリカゲルへの吸着を抑制する目的で、非解離性の親水性基によって表面が修飾されたシリカゲルを用いた充填剤が市販されている。
例えば、シリカゲル系ＧＦＣ用カラムとして、昭和電工株式会社からは、ＳｈｏｄｅｘＰＲＯＴＥＩＮＫＷ−８０３（製品名）が市販されている。このシリカゲル系カラムは、カタログに、分子量数千から１００万程度のタンパク質の分析に適したシリカゲル系のＧＦＣモードのカラムであると説明されている。
また、株式会社ワイエムシィからは、ＹＭＣ−ＰａｃｋＤｉｏｌ（製品名）が市販されている。これもシリカゲル系のＧＦＣ用カラムであり、ジオール構造を有する官能基をシリカゲル担体に化学結合したもので、分子量一万から数十万のタンパク質の分離に適用できると説明されている。
【０００９】
【特許文献１】
特開２０００−２７９５１２号公報
【特許文献２】
特開２００２−９８６７６号公報
【特許文献３】
特開平９−３１３２号公報
【特許文献４】
特開平１０−２９８２４０号公報
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規なクロマトグラフィー用充填剤を提供することを目的とする。本発明のクロマトグラフィー用充填剤をＧＦＣ用カラムに使用すると、タンパク質やポリペプチドの吸着が極めて少ない上に高い分離能力を発揮する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、下記式（１）で示されるホスホリルコリン基が担体表面に直接的に化学結合していることを特徴とするクロマトグラフィー用充填剤を提供するものである。
【化２】

【００１２】
また、本発明は、担体表面に直接的にアミノ基を導入し、次にグリセロホスホリルコリンの酸化的解裂反応により得られるアルデヒド体を含有する化合物を該アミノ基に反応させて得られることを特徴とする上記のクロマトグラフィー用充填剤を提供するものである。
【００１３】
さらに、本発明は、前記担体が、球状多孔質シリカゲルであることを特徴とする上記のクロマトグラフィー用充填剤を提供するものである。
【００１４】
また、本発明は、前記球状多孔質シリカゲルの平均粒径が１〜２００μｍであることを特徴とする上記のクロマトグラフィー用充填剤を提供するものである。
【００１５】
さらに、本発明は、前記球状多孔質シリカゲルの細孔の平均径が１０〜５００オングストロームであることを特徴とする上記のクロマトグラフィー用充填剤を提供するものである。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤において、ホスホリルコリン基が担体表面に直接的に化学結合しているとは、ホスホリルコリン基が担体表面に化学的な結合状態によって導入されていることを意味し、ホスホリルコリン基を有する重合体で被覆することによりホスホリルコリン基を導入した担体は含まないという意味である。
【００１８】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤は下記のステップにより製造される。すでに担体表面にアミノ基を有しており、それ以上のアミノ基を導入する必要がない場合は、ステップ１は省略される。
ステップ１：任意の担体に、公知の方法若しくは今後開発される方法にてアミノ基を導入する。アミノ基は担体表面に直接的に導入される。直接的とは、アミノ基を有する重合体で被覆する方法は含まないことを意味する。アミノ基は一級アミン若しくは二級アミンである。
ステップ２：アミノ基を有する担体に対し、グリセロホスホリルコリンの酸化的解裂反応により得られたアルデヒド体あるいはハイドレート体を、還元的アミノ化反応によって、ホスホリルコリン基を担体表面に直接的に付加させる。
【００１９】
本発明で使用する担体には、シリカ、シリカゲル、活性炭、ゼオライト、アルミナ、粘土鉱物等の無機多孔質体、多孔質の有機高分子樹脂がある。担体は粉体が好ましい。好ましくは球型または破砕型多孔質シリカゲルである。球状多孔質シリカゲルの平均粒径は１〜２００μｍ、好ましくは１〜１０μｍ、球状多孔質シリカゲルの細孔の平均径が１０〜５００オングストローム、好ましくは８０〜３００オングストロームで、比表面積は５０〜８００ｍ²／ｇ、好ましくは１００〜６００ｍ²／ｇである。
【００２０】
これらの担体にアミノ基を導入する公知の方法（ステップ１）としては、下記が挙げられる。
１．プラズマ処理の表面反応によるアミノ基の導入
窒素ガス雰囲気下で低温プラズマにより担体表面にアミノ基を導入する。具体的には担体となる粉体をプラズマ反応容器内に収容し、反応容器内を真空ポンプで真空にした後、窒素ガスを導入する。続いてグロー放電により、担体表面にアミノ基を導入できる。プラズマ処理した担体を機械的に粉体化することも可能である。プラズマ処理に関する文献を下記に示す。
1. M. Muller, C. oehrPlasma aminofunctionalisation of PVDF microfiltration membranes: comparison of the in plasma modifications with a grafting method using ESCA and an amino-selective fluorescent probeSurface and Coatings Technology 116-119 (1999) 802-807
２．ＬｉｄｉｊａＴｕｓｅｋ，ＭｉｒｋｏＮｉｔｓｃｈｋｅ，ＣａｒｓｔｅｎＷｅｒｎｅｒ，ＫａｒｉｎＳｔａｎａ−Ｋｌｅｉｎｓｃｈｅｋ，ＶｏｌｋｅｒＲｉｂｉｔｓｃｈＳｕｒｆａｃｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＮＨ３ｐｌａｓｍａｔｒｅａｔｅｄｐｏｌｙａｍｉｄｅ６ｆｏｉｌｓＣｏｌｌｏｉｄｓａｎｄＳｕｒｆａｃｅｓＡ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ａｓｐｅｃｔｓ１９５（２００１）８１−９５
３．ＦａｂｉｅｎｎｅＰｏｎｃｉｎ−Ｅｐａｉｌｌａｒｄ，Ｊｅａｎ−ＣｌａｕｄｅＢｒｏｓｓｅ，ＴｈｉｅｒｒｙＦａｌｈｅｒ
Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｓｕｒｆａｃｅｇｒｏｕｐｓｆｏｒｍｅｄｏｎｔｏａｐｌａｓｍａｔｒｅａｔｅｄｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）ｆｉｌｍ
Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．２００．９８９−９９６（１９９９）
【００２１】
２．表面改質剤によるアミノ基の導入
アミノ基を有するアルコキシシラン、クロロシラン、シラザンなどの表面改質剤を用いて、シラノール含有粉体、酸化チタン等の担体表面を処理する。
例えば、１級アミノ基を有する３−アミノプロピルトリメトキシシランにより、シリカゲル粉体を処理してアミノ基を導入する。具体的には、シリカゲルを水−２−プロパノール混合液中に浸し、３−アミノプロピルトリメトキシシランを添加後、１００℃に加熱し６時間反応させる。室温に冷却後、シリカゲルをメタノールで洗浄し、乾燥してアミノ基がシリカ表面に直接導入された粉体が得られる。本法において好ましく処理される担体としては、シリカゲル以外に、ガラス、アルミナ、タルク、クレー、アルミニウム、鉄、マイカ、アスベスト、酸化チタン、亜鉛華、酸化鉄等の粉体が挙げられる。
【００２２】
次に、アミノ化された担体表面にホスホリルコリン基を導入する方法（ステップ２）を以下に示す。
担体をメタノール中に漬し、ホスファチジルグリセロアルデヒドを添加し、室温で６時間放置する。そして、シアノホウ素酸ナトリウムを０℃で添加、一晩加熱攪拌し、アミノ基にホスホリルコリン基を付加させる。担体をメタノールで洗浄後、乾燥し、ホスホリルコリン基を表面に直接有する担体が得られる。反応溶媒はメタノール以外にも水、エタノール、２−プロパノール等プロトン性溶媒であれば使用可能であるが、メタノールを用いた場合の導入率が高い傾向にある。
【００２３】
表面改質剤に３−アミノプロピルトリメトキシシランを用いて、ホスホリルコリン基（ＰＣと略す）を導入する方法のスキームを下記に示す。
【化３】

【００２４】
上記で説明したように、アミノ基を有する担体を調製し、グリセロホスホリルコリンの酸化的解裂反応により得られたアルデヒド体あるいはハイドレート体との還元的アミノ化反応によりホスホリルコリン基が担体表面に直接付加した担体を製造する方法よって、本発明のカラム充填剤が容易に得られる。本発明のクロマトグラフィー用充填剤の製造方法は、ホスホリルコリン基の導入率が高く、また、様々な担体の表面を修飾できるという大きな利点がある。
【００２５】
上記の製造方法において、グリセロホスホリルコリンの酸化的解裂反応により得られるアルデヒド体を含有する化合物は、公知のグリセロホスホリルコリン基を、公知の方法により酸化的解裂を行わせるもので、極めて簡単なステップである。この反応は、１，２−ジオールを過ヨウ素酸、或いは過ヨウ素酸塩を用いて酸化することにより結合を開裂させ、２つのアルデヒド体を得るものであり、本法の場合、ホスホリルコリンアルデヒド体とホルムアルデヒドを生成する。反応は通常水中または水を含む有機溶媒中で行われる。反応温度は０度から室温である。アルデヒド体は水中で平衡反応を経てハイドレートとなることもあるが、続くアミンとの反応には影響しない。下記にホスホリルコリン基を含有する一官能のアルデヒド体を調製するスキームを示す。
【化４】

【００２６】
アミノ基を有する担体は、担体の表面、場合によっては多孔質の担体の内部表面にグリセロホスホリルコリンの酸化的解裂反応により得られるアルデヒド体が反応できるアミノ基があればよい。担体はシリカゲルが好ましい。
【００２７】
グリセロホスホリルコリンの酸化的解裂反応により得られるアルデヒド体(若しくはハイドレート体)を担体のアミノ基に結合させる還元的アミノ化反応は、両者を溶媒中にて攪拌することにより容易に行うことが出来る。この反応は両者を水或いはアルコール中に溶解または分散し（第三成分の有機溶媒を混合しても良い）、イミンを形成させた後、これを還元剤により還元して２級アミンを得るものである。還元剤としてはシアノホウ素酸ナトリウム等マイルドな還元剤が好ましいが、ホスホリルコリンが安定な限り、他の還元剤を用いることも可能である。反応は通常０度から室温で行われるが、場合により加熱することもある。
【００２８】
上記の製造方法により、親水性のホスホリルコリン基を任意の量で含有する担体が簡単に得られる。また、担体が合成ポリマーの場合、その親水部として、カルボン酸基、水酸基、１級〜３級アミノ基、スルホン酸基、リン酸基、ポリオキシエチレン基、アンモニウム基、アミド、カルボキシベタイン、糖類等を含有してもよく、これらの種類及び含有量で、充填剤の機能を設計できる。さらに、その疎水部として、炭素原子数２〜２２の直鎖状または分岐アルキル、コレステロール等の環状アルキル、オレイル等不飽和結合を含むアルキル基、ベンゼン環、ナフタレン環、ピレンをはじめとする炭化水素系芳香族、ピリジン環、イミダゾール、チアゾール、インドール等のヘテロ系芳香族、パーフルオロアルキル、ポリアルキルシロキサン等の疎水基を含有してもよく、粉体の用途に応じて選択し、設計できる。合成ポリマー粉体の疎水基の結合形態は、エステル、エーテル、アミド、ウレタン、尿素結合等により直接ポリマー主鎖と結合されていても良いし、スペーサーを介して主鎖と結合されていても良い。スペーサーの種類としては、親水性のポリエチレンオキサイド、疎水性のポリプロピレンオキサイド、直鎖状アルキル（炭素原子数２〜２２）等が挙げられる。
また、担体表面に存在するアミノ基の１部をホスホリルコリン基により修飾し、残部を他の官能基で修飾することで、新たな機能を発現する充填剤を設計できる。担体に導入されたアミノ基を元素分析等により定量し、グリセロホスホリルコリンの酸化的解裂反応により得られるアルデヒド体を含有する化合物を、付加させたい量だけ使用することにより製造される。そして、残りのアミノ基に任意の官能基を付加させることが出来る。
【００２９】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤は、タンパク質およびポリペプチドの吸着を抑制することに優れたカラム充填剤である。したがって、タンパク質およびポリペプチドを分子量の違いによって分離するモード（ＧＦＣモード）に適用することが可能である。
さらに、ホスホリルコリン基の有する双電荷によって試料の分子量の違いのみならず、試料の持つ微弱な電荷の違いに基づいた、より高い分離能力を有するカラム充填剤である。このように、双電荷を有する官能基がタンパク質の吸着を抑制するために導入された例は無く、全く新しいタイプのＧＦＣ用カラム充填剤であると言える。この電荷を有するという特徴によって、タンパク質やポリペプチドを分子量の違い以上に分離できるだけでなく、移動相のｐＨを変化させることによって充填剤表面とタンパク質やポリペプチドとの相互作用の強さを制御することも可能であることを示している。したがって、移動相のｐＨを最適化することで目的とするタンパク質やポリペプチドを自由に保持させることができる可能性がある。
ＧＦＣモードはタンパク質や酵素を失活させずにこれらを分離、精製できることから、未知生体試料の単離や医療用途の面でも本発明のカラム充填剤の高分離能が役立つことが期待される。
本発明のクロマトグラフィー用充填剤は、具体的には、タンパク質およびポリペプチドの吸着が極めて少ない高分離能カラム充填剤として、例えばヒト血清中のタンパク質の分離、または、タンパク質をトリプシン消化して得られた試料に含まれるポリペプチドの分離に優れている。
【００３０】
【実施例】
次に、本発明を実施例に基づきさらに詳しく説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３１】
合成例１ホスホリルコリン基を含有するアルデヒド体
Ｌ−α−グリセロホスホリルコリン（４５０ｍｇ）を蒸留水１５ｍｌに溶解し、氷水浴中で冷却する。過ヨウ素酸ナトリウム（７５０ｍｇ）を添加し、２時間攪拌する。更にエチレングリコール（１５０ｍｇ）を添加して１晩攪拌する。反応液を減圧濃縮、減圧乾燥し、メタノールにより目的物を抽出する。
構造式及びＮＭＲスペクトルを図１に示す。
【００３２】
実施例１クロマトグラフィー用充填剤
ホスホリルコリン基結合シリカゲル担体の調製（細孔径３００オングストローム）
平均粒子径が５μｍ、平均細孔径が３００オングストロームの多孔性シリカゲル１０ｇを水（１５ｍｌ）−２−プロパノール（１５ｍｌ）に分散、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（５ｇ）を添加後、１００℃に加熱し６時間反応させる。室温に冷却後、シリカゲルをろ過、洗浄し、減圧乾燥してアミノプロピル基の導入されたシリカゲルを得る。このシリカゲルの反射型ＦＴ−ＩＲスペクトルを図２に示す。
このアミノプロピル基が導入されたシリカゲルをメタノール１００ｍｌに分散し、合成例１により得られた化合物１０ｇと混合、室温で６時間撹拌する。続いてこの混合液を氷浴中で冷却し、シアノヒドロホウ酸ナトリウム３ｇを添加し、室温で一晩撹拌した後、シリカゲルをろ過し、メタノールで洗浄し、減圧乾燥して目的とするホスホリルコリン基を表面に直接有するシリカゲル１０．３ｇを得る。このシリカゲルの反射型ＦＴ−ＩＲスペクトルを図３に示す。
図３から１２５０ｃｍ^-1付近にリン酸基由来のピークが出現しており、ホスホリルコリン基が粉体表面に導入されたことがわかる。
また、以上の手続きによって得られた粉体の元素分析値を表１に示す。
【表１】

上記元素分析値より、実施例１の粉体にはホスホリルコリン基がシリカゲル表面に導入されたことが分かる。実際にホスホリルコリン基と反応したアミノ基は、全体のアミノ基の約３８％であることがわかる。
【００３３】
次に、実施例１のクロマトグラフィー用充填剤を、内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍのステンレスカラムにスラリー法により充填した。５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸バッファー（Ｎａ₂ＨＰＯ₄およびＫＨ₂ＰＯ₄より調製）に５００ｍｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウムを添加した移動相を用い、流速を０．１ｍｌ／ｍｉｎ、カラムオーブン温度４０℃にてヒト血清試料（コンセーラＮ（製品名）を生理食塩水にて二倍に希釈した）のタンパク質の分離を試みた。検出はＵＶ２８０ｎｍで行った。結果を図４に示す。
【００３４】
比較例１
次に、市販品のクロマトグラフィー用カラム（ＹＭＣ−ＰａｃｋＤｉｏｌ３００、株式会社ワイエムシィ製）を市販の状態のまま用いてヒト血清試料（コンセーラＮ（製品名）を生理食塩水にて二倍に希釈した）のタンパク質の分離を試みた。比較例で挙げた本カラムは、実施例１で述べたカラムと同じ内径と長さである。
この充填剤は多孔性シリカゲルの表面に、ジオール構造を持つ官能基を化学結合させたサイズ排除モード用の充填剤であると説明されている。平均細孔径３００オングストローム、平均粒子径５μｍであり、実施例１で述べた充填剤との比較に好適である。分子量１万から数十万のタンパク質の分離に適していると説明されている。ＹＭＣ−ＰａｃｋＤｉｏｌは、親水性基として非解離性のジオールを用いているために、本願発明の充填剤と違って電荷を帯びた官能基を有していない。したがってタンパク質とのイオン的な相互作用はほとんど無いと考えられる。
実施例１と同様に、５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸バッファー（Ｎａ₂ＨＰＯ₄およびＫＨ₂ＰＯ₄から調製）に５００ｍｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウムを加えた移動相を用い、流速を０．１ｍｌ／ｍｉｎ、カラムオーブン温度４０℃にてヒト血清試料（コンセーラＮ（製品名）を生理食塩水にて二倍に希釈した）のタンパク質の分離を試みた。検出はＵＶ２８０ｎｍで行った。結果を図５に示す。
【００３５】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤を使用したクロマトグラム（図４）においては、ヒト血清において主要なタンパク質であるγ−グロブリンとアルブミンの他に、トランスフェリンが分離されていることが大きな特徴である。ピークの帰属は単離された各タンパク質の市販品を用いて行った。
従来のクロマトグラフィー用充填剤を使用した場合は（図３）、アルブミンとトランスフェリンの分離が不完全である。これは、単離された市販品の各タンパク質の溶出時間が同じであったことから確認された。アルブミンとトランスフェリンの分子量はそれぞれ、約６９，０００と７５，０００であり、分子量が近いと言える。従来のＧＦＣ用カラムではアルブミンとトランスフェリンのような分子量の近い試料を分離することはできない。本発明のクロマトグラフィー用充填剤はタンパク質の吸着が極めて少ないだけでなく、ホスホリルコリン基の持つ双電荷によってタンパク質と微弱なイオン的相互作用を持つために、分子量の近いタンパク質についても等電点や疎水性の違いに基づいて分離することができることが分かる。すなわち、本発明のクロマトグラフィー用充填剤はＧＦＣモードにおいて、分子量の違いだけでなくタンパク質の持つ等電点や疎水性の違いに応じて試料を分離することができることが分かる。
【００３６】
実施例２クロマトグラフィー用充填剤
ホスホリルコリン基結合シリカゲル担体の調製（細孔径１２０オングストローム）
平均粒子径が５μｍ、平均細孔径が１２０オングストロームの多孔性シリカゲルを使用し、実施例１と同様の処理により、ホスホリルコリン基結合シリカゲル担体を調製した。これを、実施例１と同一のカラムに充填した。
５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸バッファー（Ｎａ₂ＨＰＯ₄およびＫＨ₂ＰＯ₄より調製）に５００ｍｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウムを添加した移動相を用い、流速を０．２ｍｌ／ｍｉｎ、カラムオーブン温度４０℃にてミオグロビンのトリプシン消化によって生じたペプチドの分離を試みた。検出はＵＶ２８０ｎｍで行った。結果を図６に示す。
ミオグロビンのトリプシン消化の手順を以下に示す。８．８ｍｇのミオグロビン結晶（市販品）を２０ｍｍｏｌ／ｌ（ｐＨ８．３）のリン酸バッファー（Ｎａ₂ＨＰＯ₄およびＫＨ₂ＰＯ₄より調製）に溶解させる。一方でトリプシン結晶（市販品）を５ｍｍｏｌ／ｌ（ｐＨ５．０）のリン酸バッファー（Ｎａ₂ＨＰＯ₄およびＫＨ₂ＰＯ₄より調製）に溶解させる。ミオグロビンのリン酸バッファー溶液３６０μｌを湯浴中で９５℃に加熱し、１時間熱変成させる。この後にトリプシン溶液を３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離にかけ、沈殿を分離する。遠心分離後の試料の上清を３６０μｌを分取し、これに先に述べたトリプシン溶液を８０μｌ添加し、３５℃で５時間インキュベートしてトリプシン消化物を得る。この後、孔径０．２μｍのフィルターで消化物をろ過し、サンプルとした。
【００３７】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤を使用したクロマトグラム（図５）から、ミオグロビンのトリプシンによる消化によって生成したポリペプチドが分離されていることがわかる。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によれば、微弱な電荷を帯びながらもタンパク質やポリペプチドの吸着が極めて少ないクロマトグラフィー用充填剤を提供出来る。
本発明のクロマトグラフィー用充填剤の特徴は、分子量の違いだけでなくタンパク質やポリペプチドの持つ等電点や疎水性の違いに応じた、優れた分離能を有することである。
特にＧＦＣモードにおいて優れた分離特性を有している。
【図面の簡単な説明】
【図１】合成例１の構造式及びＮＭＲスペクトルである。
【図２】実施例１のアミノプロピル基が導入されたシリカゲルの反射型ＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図３】実施例１のホスホリルコリン基が導入されたシリカゲルの反射型ＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図４】本発明のクロマトグラフィー用充填剤を使用してヒト血清タンパク質の分離を行った液体クロマトグラフィーのクロマトグラムである。
【図５】従来のクロマトグラフィー用充填剤を使用してヒト血清タンパク質の分離を行った液体クロマトグラフィーのクロマトグラムである。
【図６】本発明のクロマトグラフィー用充填剤を使用してミオグロビンのトリプシン消化物の分離を行った液体クロマトグラフィーのクロマトグラムである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a chromatographic filler. More particularly, the present invention relates to a chromatographic packing material characterized in that a phosphorylcholine group is directly chemically bonded to a support surface.
[0002]
[Prior art]
Polymers having a phosphorylcholine group have been studied as biocompatible polymers. Biocompatible materials in which this polymer is coated on various bases have been developed.
[0003]
For example, Patent Document 1 describes a medical material coated with a polymer having a phosphorylcholine group. Patent Document 2 discloses a separating agent coated with a polymer having a phosphorylcholine group.
[0004]
The above materials have a phosphorylcholine structure by reacting mainly an acrylic monomer having a hydroxyl group with 2-chloro-1,3,2-dioxaphosphorane-2-oxide and further converting to quaternary ammonium with trimethylamine. The surface is coated with a polymer obtained by synthesizing a monomer and polymerizing the monomer (see Patent Documents 3 and 4 for the method for producing the polymer).
[0005]
Patent Document 3 manufactures a copolymer of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine and methacrylic acid ester, and Patent Document 4 manufactures a homopolymer of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine.
[0006]
On the other hand, there are many commercially available GFC fillers for separating biological samples such as proteins and polypeptides having a molecular weight smaller than that of proteins by size exclusion. The GFC filler includes a filler having a crosslinked hydrophilic polymer as a carrier and a filler having silica gel as a carrier.
[0007]
A filler using a cross-linked hydrophilic polymer as a carrier has a wide range of applicable mobile phase pH and high versatility. However, the packing using a polymer as a carrier is difficult to obtain a high theoretical plate number because (1) it is more difficult to control the pore diameter than the packing using a silica gel as a carrier, and (2) high performance liquid chromatography. In many cases, chromatograms with good reproducibility cannot be obtained due to poor strength against high pressure conditions when used in (HPLC) and swelling of particles by mobile phase solvent.
[0008]
In the case of a filler using silica gel as a carrier, adsorption of protein or polypeptide onto the surface of the silica gel carrier becomes a problem. Therefore, for the purpose of suppressing adsorption of proteins and polypeptides in the analysis sample to the silica gel, a filler using a silica gel whose surface is modified with a non-dissociable hydrophilic group is commercially available.
For example, Shodex PROTEIN KW-803 (product name) is commercially available from Showa Denko KK as a silica gel-based GFC column. This silica gel column is described in the catalog as being a silica gel GFC mode column suitable for the analysis of proteins having a molecular weight of about several thousand to one million.
YMC-Pack Diol (product name) is commercially available from YMC Co., Ltd. This is also a silica gel-based GFC column, which is obtained by chemically bonding a functional group having a diol structure to a silica gel carrier, and is described as being applicable to separation of proteins having a molecular weight of 10,000 to several hundred thousand.
[0009]
[Patent Document 1]
JP 2000-279512 A [Patent Document 2]
JP 2002-98676 A [Patent Document 3]
Japanese Patent Laid-Open No. 9-3132 [Patent Document 4]
Japanese Patent Laid-Open No. 10-298240
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a novel packing material for chromatography. When the chromatographic packing material of the present invention is used in a GFC column, the adsorption of proteins and polypeptides is extremely small and a high separation ability is exhibited.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
That is, the present invention provides a chromatographic filler characterized in that a phosphorylcholine group represented by the following formula (1) is chemically bonded directly to the surface of a carrier.
[Chemical formula 2]

[0012]
Further, the present invention is obtained by directly introducing an amino group onto the surface of a carrier and then reacting the amino group with a compound containing an aldehyde obtained by oxidative cleavage of glycerophosphorylcholine. The above-mentioned packing material for chromatography is provided.
[0013]
Furthermore, the present invention provides the above-mentioned packing material for chromatography, wherein the carrier is spherical porous silica gel.
[0014]
The present invention also provides the above-mentioned chromatographic filler, wherein the spherical porous silica gel has an average particle diameter of 1 to 200 μm.
[0015]
Furthermore, the present invention provides the above-mentioned packing material for chromatography, wherein the average diameter of the pores of the spherical porous silica gel is 10 to 500 angstroms.
[0016]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention is described in detail below.
[0017]
In the chromatographic packing material of the present invention, the phosphorylcholine group is directly chemically bonded to the surface of the carrier means that the phosphorylcholine group is introduced into the surface of the carrier in a chemically bonded state. This means that a carrier into which a phosphorylcholine group has been introduced by coating with a polymer having the above is not included.
[0018]
The chromatographic packing material of the present invention is produced by the following steps. If the carrier surface already has amino groups and no further amino groups need to be introduced, step 1 is omitted.
Step 1: An amino group is introduced into an arbitrary carrier by a known method or a method developed in the future. Amino groups are introduced directly onto the support surface. Direct means that a method of coating with a polymer having an amino group is not included. The amino group is a primary amine or a secondary amine.
Step 2: An aldehyde or hydrate obtained by oxidative cleavage reaction of glycerophosphorylcholine is directly added to the surface of the carrier by reductive amination reaction with respect to the carrier having an amino group.
[0019]
The carrier used in the present invention includes inorganic porous materials such as silica, silica gel, activated carbon, zeolite, alumina and clay mineral, and porous organic polymer resins. The carrier is preferably a powder. Spherical or crushed porous silica gel is preferred. The average particle diameter of the spherical porous silica gel is 1 to 200 μm, preferably 1 to 10 μm, the average diameter of the pores of the spherical porous silica gel is 10 to 500 Å, preferably 80 to 300 Å, and the specific surface area is 50 to 800 m ^2. / G, preferably 100 to 600 m ² / g.
[0020]
As a known method (step 1) for introducing an amino group into these carriers, the following may be mentioned.
1. Introduction of amino groups by surface reaction of plasma treatment Amino groups are introduced onto the support surface by low temperature plasma in a nitrogen gas atmosphere. Specifically, powder serving as a carrier is accommodated in a plasma reaction vessel, the inside of the reaction vessel is evacuated with a vacuum pump, and then nitrogen gas is introduced. Subsequently, an amino group can be introduced onto the surface of the carrier by glow discharge. It is also possible to mechanically pulverize the plasma-treated carrier. The literature regarding plasma processing is shown below.
1. M. Muller, C. oehrPlasma aminofunctionalisation of PVDF microfiltration membranes: comparison of the in plasma modifications with a grafting method using ESCA and an amino-selective fluorescent probeSurface and Coatings Technology 116-119 (1999) 802-807
2. Lidja Tusek, Mirko Nitschke, Carsten Werner, Karin Stana-Kleinschek, Volker Ribitsch Surface charcoalization of NH3 plasma reformed. Eng. Aspects 195 (2001) 81-95
3. Fabienne Poncin-Epallard, Jean-Claud Brosse, Thierry Falher
Reactivity of surface groups formed on a plasma treated poly (propylene) film
Macromol. Chem. Phys. 200. 989-996 (1999)
[0021]
2. Introduction of amino group by surface modifier The surface of a carrier such as silanol-containing powder or titanium oxide is treated using a surface modifier such as alkoxysilane, chlorosilane, or silazane having an amino group.
For example, silica gel powder is treated with 3-aminopropyltrimethoxysilane having a primary amino group to introduce amino groups. Specifically, silica gel is immersed in a water-2-propanol mixed solution, and 3-aminopropyltrimethoxysilane is added, followed by heating to 100 ° C. and reaction for 6 hours. After cooling to room temperature, the silica gel is washed with methanol and dried to obtain a powder in which amino groups are directly introduced on the silica surface. Examples of the carrier that is preferably treated in this method include powders such as glass, alumina, talc, clay, aluminum, iron, mica, asbestos, titanium oxide, zinc white, and iron oxide in addition to silica gel.
[0022]
Next, a method (step 2) for introducing a phosphorylcholine group onto the aminated carrier surface is shown below.
The carrier is soaked in methanol, phosphatidylglyceraldehyde is added, and the mixture is allowed to stand at room temperature for 6 hours. Then, sodium cyanoborate is added at 0 ° C., and the mixture is heated and stirred overnight to add a phosphorylcholine group to the amino group. The carrier is washed with methanol and then dried to obtain a carrier having phosphorylcholine groups directly on the surface. The reaction solvent can be used as long as it is a protic solvent such as water, ethanol, 2-propanol in addition to methanol, but the introduction rate tends to be high when methanol is used.
[0023]
A scheme of a method for introducing a phosphorylcholine group (abbreviated as PC) using 3-aminopropyltrimethoxysilane as a surface modifier is shown below.
[Chemical 3]

[0024]
As explained above, a carrier having an amino group is prepared, and a phosphorylcholine group is directly added to the surface of the carrier by a reductive amination reaction with an aldehyde or hydrate obtained by oxidative cleavage of glycerophosphorylcholine. The column filler of the present invention can be easily obtained by the method for producing the prepared carrier. The method for producing a packing material for chromatography of the present invention has a great advantage that the introduction rate of phosphorylcholine groups is high and the surface of various carriers can be modified.
[0025]
In the production method described above, the compound containing an aldehyde obtained by oxidative cleavage reaction of glycerophosphorylcholine causes oxidative cleavage of a known glycerophosphorylcholine group by a known method. It is. In this reaction, 1,2-diol is oxidized with periodic acid or periodate to cleave the bond to obtain two aldehydes. In this method, phosphorylcholine aldehyde and Formaldehyde is produced. The reaction is usually carried out in water or an organic solvent containing water. The reaction temperature is from 0 degree to room temperature. Aldehydes may undergo hydration through an equilibrium reaction in water, but do not affect the subsequent reaction with amines. A scheme for preparing a monofunctional aldehyde compound containing a phosphorylcholine group is shown below.
[Formula 4]

[0026]
The carrier having an amino group only needs to have an amino group that can react with an aldehyde obtained by oxidative cleavage of glycerophosphorylcholine on the surface of the carrier, or in some cases, on the inner surface of the porous carrier. The carrier is preferably silica gel.
[0027]
The reductive amination reaction in which the aldehyde (or hydrate) obtained by oxidative cleavage of glycerophosphorylcholine is bound to the amino group of the carrier can be easily performed by stirring both in a solvent. . In this reaction, both are dissolved or dispersed in water or alcohol (the third organic solvent may be mixed) to form an imine, which is then reduced with a reducing agent to obtain a secondary amine. It is. The reducing agent is preferably a mild reducing agent such as sodium cyanoborate, but other reducing agents can be used as long as phosphorylcholine is stable. The reaction is usually performed at 0 ° C. to room temperature, but may be heated in some cases.
[0028]
By the above production method, a carrier containing a hydrophilic phosphorylcholine group in an arbitrary amount can be easily obtained. In addition, when the carrier is a synthetic polymer, the hydrophilic part includes carboxylic acid group, hydroxyl group, primary to tertiary amino group, sulfonic acid group, phosphoric acid group, polyoxyethylene group, ammonium group, amide, carboxybetaine, saccharide. Etc., and the function of the filler can be designed with these types and contents. Further, as the hydrophobic part, hydrocarbons such as linear or branched alkyl having 2 to 22 carbon atoms, cyclic alkyl such as cholesterol, alkyl group containing unsaturated bond such as oleyl, benzene ring, naphthalene ring and pyrene. Aromatic aromatics, pyridine rings, heteroaromatics such as imidazole, thiazole and indole, and hydrophobic groups such as perfluoroalkyl and polyalkylsiloxane may be selected and selected according to the application of the powder. The binding form of the hydrophobic group of the synthetic polymer powder may be directly bonded to the polymer main chain by an ester, ether, amide, urethane, urea bond or the like, or may be bonded to the main chain via a spacer. . Examples of the spacer include hydrophilic polyethylene oxide, hydrophobic polypropylene oxide, and linear alkyl (having 2 to 22 carbon atoms).
Further, a filler that exhibits a new function can be designed by modifying one part of an amino group present on the surface of the carrier with a phosphorylcholine group and modifying the remaining part with another functional group. The amino group introduced into the carrier is quantified by elemental analysis or the like, and the compound containing an aldehyde obtained by oxidative cleavage reaction of glycerophosphorylcholine is used in an amount to be added. Any functional group can be added to the remaining amino groups.
[0029]
The chromatographic packing material of the present invention is a column packing material excellent in suppressing adsorption of proteins and polypeptides. Therefore, it is possible to apply to the mode (GFC mode) which isolate | separates protein and polypeptide by the difference in molecular weight.
Furthermore, the column packing material has higher separation ability based on not only the difference in molecular weight of the sample but also the weak charge difference in the sample due to the dual charge of the phosphorylcholine group. Thus, there is no example in which a functional group having a dual charge is introduced to suppress protein adsorption, and it can be said that this is a completely new type of column packing material for GFC. This charge-bearing feature not only separates proteins and polypeptides beyond molecular weight differences, but also controls the strength of the interaction between the filler surface and proteins and polypeptides by changing the pH of the mobile phase. It also shows that it is possible. Therefore, there is a possibility that the target protein or polypeptide can be freely retained by optimizing the pH of the mobile phase.
Since the GFC mode can separate and purify proteins and proteins without inactivating them, it is expected that the column packing material of the present invention will be useful in isolation of unknown biological samples and medical applications.
The chromatographic packing material of the present invention is specifically obtained as a high-resolution column packing material with very little protein and polypeptide adsorption, for example, separation of proteins in human serum or trypsin digestion of proteins. It is excellent in separating polypeptides contained in the obtained sample.
[0030]
【Example】
Next, the present invention will be described in more detail based on examples. The present invention is not limited to these examples.
[0031]
Synthesis Example 1 An aldehyde compound L-α-glycerophosphorylcholine (450 mg) containing a phosphorylcholine group is dissolved in 15 ml of distilled water and cooled in an ice-water bath. Add sodium periodate (750 mg) and stir for 2 hours. Add more ethylene glycol (150 mg) and stir overnight. The reaction mixture is concentrated under reduced pressure, dried under reduced pressure, and the desired product is extracted with methanol.
The structural formula and NMR spectrum are shown in FIG.
[0032]
Example 1 Preparation of chromatographic filler phosphorylcholine group-bonded silica gel support (pore size 300 angstrom)
Disperse 10 g of porous silica gel having an average particle size of 5 μm and an average pore size of 300 Å in water (15 ml) -2-propanol (15 ml), add 3-aminopropyltrimethoxysilane (5 g), and then heat to 100 ° C. And react for 6 hours. After cooling to room temperature, the silica gel is filtered, washed, and dried under reduced pressure to obtain a silica gel having an aminopropyl group introduced. The reflection type FT-IR spectrum of this silica gel is shown in FIG.
The silica gel introduced with the aminopropyl group is dispersed in 100 ml of methanol, mixed with 10 g of the compound obtained in Synthesis Example 1, and stirred at room temperature for 6 hours. Subsequently, the mixture was cooled in an ice bath, 3 g of sodium cyanohydroborate was added, and the mixture was stirred overnight at room temperature. Then, the silica gel was filtered, washed with methanol, and dried under reduced pressure to obtain the desired phosphorylcholine group. 10.3 g of silica gel having directly on the surface is obtained. The reflection type FT-IR spectrum of this silica gel is shown in FIG.
As can be seen from FIG. 3, a peak derived from a phosphate group appears in the vicinity of 1250 cm ⁻¹ , and a phosphorylcholine group is introduced on the powder surface.
Table 1 shows the elemental analysis values of the powder obtained by the above procedure.
[Table 1]

From the above elemental analysis values, it can be seen that phosphorylcholine groups were introduced into the silica gel surface in the powder of Example 1. It can be seen that the amino group actually reacted with the phosphorylcholine group is about 38% of the total amino group.
[0033]
Next, the chromatographic packing material of Example 1 was packed into a stainless steel column having an inner diameter of 4.6 mm and a length of 250 mm by a slurry method. Using a mobile phase in which 500 mmol / l sodium chloride was added to 50 mmol / l phosphate buffer (prepared from Na ₂ HPO ₄ and KH ₂ PO ₄ ), the flow rate was 0.1 ml / min, and the column oven temperature was 40 ° C. An attempt was made to separate the protein of a serum sample (Concerer N (product name) diluted twice with physiological saline). Detection was performed at UV 280 nm. The results are shown in FIG.
[0034]
Comparative Example 1
Next, a commercially available column for chromatography (YMC-Pack Diol 300, manufactured by YMC Co., Ltd.) is used in a commercially available state, and a human serum sample (Concerer N (product name) is diluted twice with physiological saline. Was attempted to isolate the protein. The column mentioned in the comparative example has the same inner diameter and length as the column described in Example 1.
This filler is described as a filler for size exclusion mode in which a functional group having a diol structure is chemically bonded to the surface of porous silica gel. The average pore diameter is 300 angstroms and the average particle diameter is 5 μm, which is suitable for comparison with the filler described in Example 1. It is described that it is suitable for separation of proteins having a molecular weight of 10,000 to several hundred thousand. Since YMC-Pack Diol uses a non-dissociable diol as the hydrophilic group, it does not have a charged functional group unlike the filler of the present invention. Therefore, it is considered that there is almost no ionic interaction with the protein.
As in Example 1, using a mobile phase in which 500 mmol / l sodium chloride was added to 50 mmol / l phosphate buffer (prepared from Na ₂ HPO ₄ and KH ₂ PO ₄ ), the flow rate was 0.1 ml / min, column At an oven temperature of 40 ° C., protein separation of human serum sample (Concerer N (product name) diluted twice with physiological saline) was attempted. Detection was performed at UV 280 nm. The results are shown in FIG.
[0035]
The chromatogram using the packing material for chromatography of the present invention (FIG. 4) is characterized in that transferrin is separated in addition to γ-globulin and albumin which are main proteins in human serum. Peak assignment was performed using commercial products of each isolated protein.
When a conventional chromatographic packing is used (FIG. 3), the separation between albumin and transferrin is incomplete. This was confirmed by the elution time of each protein in the isolated commercial product being the same. The molecular weights of albumin and transferrin are about 69,000 and 75,000, respectively, which can be said to be close to each other. A conventional GFC column cannot separate samples with similar molecular weights such as albumin and transferrin. The chromatographic packing material of the present invention not only has very little protein adsorption, but also has a weak ionic interaction with the protein due to the dual charge of the phosphorylcholine group. It can be seen that separation is possible based on gender differences. That is, it can be seen that the chromatographic packing material of the present invention can separate samples in the GFC mode according to not only the difference in molecular weight but also the isoelectric point and hydrophobicity of proteins.
[0036]
Example 2 Preparation of silica gel carrier bonded with phosphorylcholine group for chromatography (pore size 120 angstrom)
Using a porous silica gel having an average particle diameter of 5 μm and an average pore diameter of 120 Å, a phosphorylcholine group-bonded silica gel support was prepared by the same treatment as in Example 1. This was packed in the same column as in Example 1.
Myoglobin was used at a flow rate of 0.2 ml / min and a column oven temperature of 40 ° C. using a mobile phase in which 500 mmol / l sodium chloride was added to 50 mmol / l phosphate buffer (prepared from Na ₂ HPO ₄ and KH ₂ PO ₄ ). Attempts were made to isolate the peptides produced by trypsin digestion. Detection was performed at UV 280 nm. The results are shown in FIG.
The procedure for trypsin digestion of myoglobin is shown below. 8.8 mg of myoglobin crystals (commercially available) are dissolved in 20 mmol / l (pH 8.3) phosphate buffer (prepared from Na ₂ HPO ₄ and KH ₂ PO ₄ ). On the other hand, trypsin crystals (commercially available) are dissolved in 5 mmol / l (pH 5.0) phosphate buffer (prepared from Na ₂ HPO ₄ and KH ₂ PO ₄ ). 360 μl of myoglobin phosphate buffer solution is heated to 95 ° C. in a hot water bath and heat-denatured for 1 hour. After this, the trypsin solution is centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes to separate the precipitate. 360 μl of the supernatant of the sample after centrifugation is separated, and 80 μl of the aforementioned trypsin solution is added thereto, and incubated at 35 ° C. for 5 hours to obtain a trypsin digest. Thereafter, the digested product was filtered with a filter having a pore size of 0.2 μm to prepare a sample.
[0037]
From the chromatogram using the chromatographic packing material of the present invention (FIG. 5), it can be seen that polypeptides produced by digestion of myoglobin with trypsin are separated.
[0038]
【The invention's effect】
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the packing material for chromatography can be provided with very few adsorption | suction of protein and polypeptide, although it is weakly charged.
A feature of the packing material for chromatography of the present invention is that it has an excellent separation ability not only according to the difference in molecular weight but also according to the difference in isoelectric point and hydrophobicity of proteins and polypeptides.
In particular, the GFC mode has excellent separation characteristics.
[Brief description of the drawings]
1 is a structural formula and NMR spectrum of Synthesis Example 1. FIG.
2 is a reflection FT-IR spectrum of silica gel having an aminopropyl group introduced in Example 1. FIG.
3 is a reflection FT-IR spectrum of silica gel having a phosphorylcholine group introduced in Example 1. FIG.
FIG. 4 is a liquid chromatographic chromatogram obtained by separating human serum proteins using the chromatographic packing material of the present invention.
FIG. 5 is a chromatogram of liquid chromatography obtained by separating human serum proteins using a conventional packing material for chromatography.
FIG. 6 is a chromatogram of liquid chromatography in which tryptic digest of myoglobin was separated using the chromatographic packing material of the present invention.

Claims

A packing material for chromatography, wherein a phosphorylcholine group represented by the following formula (1) is directly chemically bonded to a support surface.

2. An amino group introduced directly on the surface of a carrier, and then obtained by reacting the amino group with a compound containing an aldehyde obtained by oxidative cleavage reaction of glycerophosphorylcholine. Chromatographic packing material.

The chromatography carrier according to claim 1 or 2, wherein the carrier is spherical porous silica gel.

4. The packing material for chromatography according to claim 3, wherein the spherical porous silica gel has an average particle diameter of 1 to 200 [mu] m.

The packing material for chromatography according to claim 3 or 4, wherein the average diameter of the pores of the spherical porous silica gel is 10 to 500 angstroms.