JP3655312B2 - Complex compounds for the diagnosis of vascular diseases - Google Patents

Abstract

The present invention concerns novel complexes for use in the diagnosis of vascular diseases, methods of manufacturing such complexes and diagnostic agents containing them. These complexes strongly enrich themselves in atherosclerotic plaques and are thus suitable for use in non-invasive procedures for diagnosing atherosclerosis.

Description

式中：
Ｔは、水素原子、または金属原子における結合、または適切な硫黄保護基であり、例えば、アルカリ金属イオン、炭素数１〜６のアシル基、ベンゾイル基、ヒドロキシアセチル基、アセトアミドメチル基、ｐ−メトキシベンジル基、エトキシエチル基、ベンジル基、オルト−またはパラ−ヒドロキシベンジル基、オルト−またはパラ−アセトキシベンジル基、ｐ−ニトロベンジル基、４−ピコリル基、２−ピコリル−Ｎ−オキシド基、９−アントリルメチル基、９−フルオレニル基、フェロセニルメチル基、ジフェニルメチル基、ビス（４−メトキシフェニル）メチル基、ジベンゾスベリル基、トリフェニルメチル基、ジフェニル−４−ピリジルメチル基、フェニル基、2,4−ジニトロフェニル基、ｔ−ブチル基、１−アダマンチル基、メトキシメチル基、イソブトキシメチル基、２−テトラヒドロピラニル基、ベンジルチオメチル基、フェニルチオメチル基、トリメチルアセトアミドメチル基、ベンズアミドメチル基、アセチルメチル基、カルボキシメチル基、シアノメチル基、２−ニトロ−１−フェニルエチル基、２−（4'−ピリジル）エチル基、２−シアノエチル基、2,2−ビス（カルボエトキシ）エチル基、１−ｍ−ニトロフェニル−２−ベンゾイルエチル基、２−フェニルスルホニルエチル基、１−（４−メチルフェニルスルホニル）−２−メチルプロピ−２−イル残基、シリル基、Ｎ−｛［（ｐ−ビフェニル）イソプロポキシ］カルボニル｝−Ｎ−メチル−γ−アミノブチレート基、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−メチル−γ−アミノブチレート基、2,2,2−トリクロロエトキシカルボニル残基、ｔ−ブトキシカルボニル残基、ベンジルオキシカルボニル残基、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基、Ｎ−エチル基、Ｎ−メトキシメチル基、Ｓ−エチル基、ｔ−Ｓ−ブチル基、置換Ｓ−フェニル基、スルホネート基、スルフェニルチオカーボネート基、または３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基であり、またはそれによって２つのＴ残基が、結合しているＳ原子と共に分子間または分子内ジスルフィドを形成する、
R₄は、式II CまたはII Dを有する残基を表し、

式中：
＊の印の付いた炭素原子は、式II Bのイミノ基に結合している
n'は、整数１または２を表し、
ｉは、２〜６のいずれかの数字を表し、
TTは、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、チロシン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、シトルリン、ホモシステイン、ホモセリン、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン、オルニチン、サルコシンまたはタウリンのようなα−アミノ酸、および／または、それらの同族体β−アミノ酸の残基を表し、これらは通常の方法でアミド基を介して結合している、
および、式II Eを有するキレート形成残基を表し、

式中：
R₆は、水素または炭素数１〜６のアルキル基を表す
および、式II Fを有するキレート形成残基を表し、

式中：
残基R₇〜R₁₈は各々独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル鎖および／またはＬとの結合を表し、ｏ、ｐおよびｒは各々整数１または２を表し、
Ｔは前記と同意義である
および、式II Gを有するキレート形成残基を表し、

式中：
R₁₉〜R₂₄は、同じであるかまたは異なっており、互いに独立して、水素原子または炭素数１〜４のアルキル基を表し、
m'は、整数２または３を表す
および、式II Hを有するキレート形成残基を表し、

式中：
X₁は、結合、メチレン基またはCHY₄−基を表し、
基Y₁、Y₂、Y₃またはY₄のうちの１つがＬとの結合を表し、残りの基は水素、または選択的に酸素原子を表し、
Ｔは前記と同意義であり、
A₁、A₂、A₃およびA₄は同じであっても異なっていてもよく、互いに独立して、水素または炭素数１〜６のアルキル基を表す
および、式II Jを有するキレート形成残基を表し、

式中：
R₂₇は、水素原子、または任意に１つまたは２つのヒドロキシル基で置換された炭素数１〜６のアルキル基を表し、
R₂₅およびR₂₆は、各々水素原子または共に酸素原子を表し、
Ａは、ヒドロキシルまたはメルカプト基を表し、
Ｙは、水素原子、カルボキシまたはスルホニル基を表し、
Ｚは、炭素原子または窒素原子を表す
および、式II Kを有するキレート形成残基を表し、
（AA¹）_mm−（AA²）_nn−（AA³）_oo−（AA⁴）_pp−（AA⁵）_qq−（AA⁶）_rr （II K）
式中：
mm、nn、oo、pp、qqおよびrrは、互いに独立して、整数０、１または２を表し、
AA¹〜AA⁶は、互いに独立して、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、チロシン、トレオニンまたはシステイン（選択的に、硫黄原子部位の水素原子の代わりに前記と同意義のＴ基を有する）、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、シトルリン、ホモシステイン、ホモセリン、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン、オルニチン、サルコシンまたはタウリンのようなα−アミノ酸、および／または、それらの同族体β−アミノ酸の残基を表し、これらは通常の方法でアミド基を介して結合し、それによって任意に各２つの利用可能なシステイン残基が互いに結合して１つのシスチン残基を形成する
および、式II Lを有するキレート化物質を表し、

式中：
R^a、R^b、R^c、R^d、R^f、R^gおよびR^hは、同じであっても異なっていてもよく、各々水素原子、および／または、分枝鎖または非分枝鎖の炭素数１〜６のアルキル残基を表し、
R^eは、カルボキシ基または非分枝鎖、分枝鎖、環式または多環式の炭素数１〜60のアルキル−、アルケニル−、ポリアルケニル−、アルキニル−、ポリアルキニル−、アリール−、アルキルアリール−またはアリールアルキル基を表し、これは、炭素数20以下であり、および／またはＯ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、As、Seからの１つまたはそれ以上のヘテロ原子を介して選択的に中断および／または置換されているヒドロキシ−、オキシ−、オキソ−、カルボキシ−、アミノカルボニル−、アルコキシカルボニル−、アミノ−、アルデヒド−またはアルコキシ基で選択的に置換されている、
Ｔは、前記と同意義である；
Ｌは、結合または水素原子または非分枝鎖、または分枝鎖、環式または多環式の炭素数１〜60のアルキル−、アルケニル−、ポリアルケニル−、アルキニル−、ポリアルケニル−、アリール−、アルキルアリール、またはアリールアルキル基を表し、これは、炭素原子最大20個までを有し、および／またはＯ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、As、Seからの１つまたはそれ以上のヘテロ原子を介して選択的に中断および／または置換されているヒドロキシ−、メルカプト−、アルキルメルカプト−、オキソ−、オキシ−、カルボキシ−、アミノカルボニル−、アルコキシカルボニル−、アミノ−、アルデヒド−またはアルコキシ基１つまたはそれ以上で任意に置換されている、
または、Z₁−Ｒ−Z₂残基を表し、
式中：
Ｒは、直鎖、分枝鎖、飽和または不飽和の炭素数１〜20のアルキル基を表し、これは、１つまたはそれ以上の酸素および／または硫黄原子および／またはカルボニル−、NHCO−、−Ｎ（炭素数１〜６のアルキル）CO−、−NH−および−Ｎ（炭素数１〜６のアルキル）基を介して選択的に中断され、およびヒドロキシ−および／またはエポキシ基で選択的に置換されている、
Z₁およびZ₂は、互いに独立して、各々、−Ｏ−、−Ｓ−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−NH（Ｃ＝Ｓ）NH−、−（Ｃ＝Ｏ）−、または−NH（Ｃ＝Ｓ）−基である
または、式αで示される残基を表し、

式中：
ｓおよびｔは、互いに独立して、整数０、１、２または３を表し、環Ｂは、フェニル−またはシクロヘキシル基を表し、Z₁およびZ₂は前記と同意義である；
A¹〜A¹¹は、互いに独立して、Ｌ−α−またはＤ−α−アミノ酸残基、−NH−CH（Ｚ）−CO−残基を表し、
式中：
Ｚは、Ｈ−、（CH₃）₂CH−、（CH₃）₂CH−CH₂−、CH₃−CH₂−CH（CH₃）−、CH₃−Ｓ−（CH₂）_２−、HOOC−CH₂−、HOOC−（CH₂）_２−、H₂N−（CH₂）_３−、H₂N−Ｃ（＝NH）−（CH₂）_３−、HO−CH₂−、CH₃−CH（OH）−、HS−CH₂−、HS−（CH₂）_２−、H₂N−CO−CH₂−、H₂N−CO−（CH₂）_２−、（HOOC）₂CH−CH₂−、の意味であり、

式中：
ｎは、整数０、１または２である、
または、残基、

または、タウリン残基を表す；
および、原子数21−32、37−39、42−51および57−83を有する金属イオンとそれらの錯体およびそれらの水溶性の塩であり、
これらの物質は、驚くべきことに、動脈硬化プラークをかなり強い程度に濃縮させ、これらの物質の急速除去の結果として生じる他の組織および器官における低いバックグラウンド放射線により、これらは動脈硬化症の非侵襲的診断に特に適している。
一般式Ｉで示される特に好ましい本発明の化合物は、Asp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−His−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp、Asp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−Ｄ−Trp−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp、Asp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp、Ｎ−（４−ヒドロキシカルボキシ−１−オキソ−３−チア−ブチ−１−イル）−Cys−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp、Ｎ−（４−ヒドロキシカルボキシ−１−オキソ−３−チア−ブチ−１−イル）−Cys−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp、Ｎ−（４−ヒドロキシカルボキシ−１−オキソ−３−チア−ブチ−１−イル）−Cys−His−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp、Ｎ−（メルカプトアセチル）−Gly−Gly−Asp−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpおよびＮ−（メルカプトアセチル）−Gly−Gly−Asp−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−Trpである。
本発明の特に好ましい錯化合物は、Asp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−His−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体、Asp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−Ｄ−Trp−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体、Asp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体、Ｎ−（４−ヒドロキシカルボキシ−１−オキソ−３−チア−ブチ−１−イル）−Cys−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体、Ｎ−（４−ヒドロキシカルボキシ−１−オキソ−３−チア−ブチ−１−イル）−Cys−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体、Ｎ−（４−ヒドロキシカルボキシ−１−オキソ−３−チア−ブチ−１−イル）−Cys−His−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体、Ｎ−（メルカプトアセチル）−Gly−Gly−Asp−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体およびＮ−（メルカプトアセチル）−Gly−Gly−Asp−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体である。
本発明の一般式Ｉの放射性標識金属錯体が、動脈硬化症血管領域において驚くほど強く濃縮し、この結果、シンチレーションカメラを有するディスプレーまたは核医学において一般的なその他の適切な装置にとって十分な濃度に達する。驚くべき発見は、適用された本発明の物質がインビボでこのような濃度に非常に速く達し、その結合が非常に安定しているので、受容体に結合している過剰の物質を移動および除去した後でさえも、診断のために高くかつ十分な濃度が残ることであった。さらに、エンドテリン自体は全ての血管領域に有効であるにもかかわらず、非常に様々な方法を介して変化した診断すべき動脈壁領域において、好んで濃縮が起こるということは驚くべきことであった。
適用された本発明の物質は、他の多くの物質の種類および試験された物質と比較して追加的な利点を有し、他の組織および器官において付加的および非特異的に濃縮することがなく、このことは診断薬としての適性にとって決定的なことである。
図１および２は本発明の化合物のインビボでの濃縮を示す。図１は、Asp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体74MBqの静脈内投与後0.5時間の、WHHLウサギ（Ａ）およびニュージーランド対照標準ウサギ（Ｂ）の左側面のシンチグラムである（実施例3c参照）。対照標準ウサギ（Ｂ）と対照してみると、濃縮活性が、WHHLウサギ（Ａ）の大動脈弓の領域、左頚動脈および腹大動脈の領域においてインビボで見ることができる。図２は、Asp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体74MBqの静脈内投与後0.5時間の、右頚動脈をFogartyカテーテルの補助によって４週間早く露出されたニュージーランドウサギの腹側のシンチグラム（Ａ）（実施例2c）、および静脈内投与後５時間の、切開された胸大動脈、露出および未処理頚動脈のオートダイアグラム（B1）およびズダンIII染色（B2）、を示す。B1およびB2の切開された組織の順序は各々、左から右に向かって以下の通りである：胸大動脈、右露出頚動脈、左未処理頚動脈。強度動脈硬化症の右頚動脈がインビボで検出された（Ａ）。インビトロでの検査（B1およびB2）は、未処理左頚動脈と比較して、露出右頚動脈における本発明の化合物の高い沈着と選択的沈着との間の高い相互関係を確認するものである。
本発明の一般式Ｉの化合物およびその溶液は、前記の必要条件を驚くほど高い程度に満たした。これらは、好ましい薬物動態学により、血管の疾患を評価するための前述した診断薬よりも、疾患組織領域の高い濃縮および優れた対比特性の両方を兼ね備えている。本発明の新規物質を実際に使用することは、それらの高い化学安定性により容易である。
表１において、プラーク、および大動脈の非プラーク領域における、本発明の化合物の濃縮（cpm/mm²）が、濃縮ファクター（プラークにおける濃縮と非プラーク大動脈組織における濃縮との比）と共に示されている。本発明の各々の化合物74MBq（2mCi）を、WHHLウサギに耳の血管から投与した。５時間p.i.、そのウサギを殺し、除去された大動脈の定量オートラジオグラフィおよびズダンIII染色の両方を行った。異なる組織における本発明の各々の化合物のそのように測定された沈着を表１に示す。

本発明の錯体にも存在する錯体形成残基Ｋが、配位および／または共有結合の形態で、各々の金属イオンに結合できなければならない。
錯体形成残基Ｋは、本発明の錯体を完成するのに有効かつ十分な結合が生じるように、錯体化される金属イオンおよびその電荷、酸化数、原子およびイオン半径に従って、選択されなければならない。
好ましい錯体形成残基は、４−カルボキシエチル−フェニルグリオキサル−ビス−（Ｎ−メチルチオセミカルバゾン）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、６−（4'−イソチオシアナトベンジル）−3,3,9,9−テトラメチル−4,8−ジアザウンデカン−2,10−ジオン−ジオキシム、２−メチル−２−（４−イソチオシアナトベンジル）−N,N'−プロピレン−ビス−サリチリデンアミン、２−メチル−２−（４−イソチオシアナトベンジル）−N,N'−プロピレン−ビス−［５−（スルホ）サリチリデンアミン、N,N'−ビス（２−メルカプトピリジル）メチル］−２−メチル−２−（４−イソチオシアナトベンジル）−1,3−プロパンジアミン、Ｓ−ベンゾイルチオアセチルグリシルグリシルグリシン、N,N'−ビス（ベンゾイルチオアセチル）−2,3−ジアミノプロピオン酸、N,N'−ビス（ベンゾイルチオアセチル）−3,4−ジアミノブタン酸、N,N'−ビス（ベンゾイルチオアセチル）−4,5−ジアミノペンタン酸、N,N'−1,2−エチレン−ジ−イル−ビス−（２−メルカプト−１−カルボキシエチルアミン）、Cys（Acm）GlyCys（Acm）GlyGlyArg GlyAspSerである。
本発明による一般式（Ｉ）の化合物と金属イオンとの錯体の製造は、当業者によく知られている方法を用いて行うことができ、既知の方法によって、還元剤および要すれば補助リガンドの存在下に、過金属酸塩の形態の放射性金属イオンを一般式（Ｉ）の化合物と反応させる。
好ましい金属イオンは、過テクネチウム酸塩または過レニウム酸塩の形態の^99mTcまたはReである。
この反応は、室温において、水性媒体中で行うのが好ましい。SH保護基の除去は、当業者によく知られている方法によって、例えば、塩基性加水分解、還元性開裂などによって、系中で行うことができる（例えば、「Protective Groups in Organic Synthesis」、T.W.Greene,John Wiley and Sons 1981を参照）。
発明による一般式（Ｉ）の化合物と金属イオンとの錯体の製造は、既知の方法において、適切な放射性陽イオンの適切な塩または酸化物を、一般式（Ｉ）の化合物と反応させることによっても行うことができる：
（Ｋ）_ｚ−（Ｌ）_ｙ−（A¹）_aa−（A²）_bb−（A³）_cc−（A⁴）_dd−（A⁵）_ee−（A⁶）_ff−（A⁷）_gg−（A⁸）_hh−（A⁹）_jj−（A¹⁰）_kk−（A¹¹）_ll−Ile−Ile−Trp （Ｉ）．
好ましい放射性金属イオン例えば、TcおよびReの同位体である。
一般式II Aのキレート化剤Ｋの製造は、文献（EP0248506を参照）に記載の方法によって行うことができ、その方法は、ジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ−またはヘキサペプチドのＮ−末端アミノ基をクロロ−アセチル化し、それに続いて、得られるＮ−クロロアセチルペプチドをチオ炭酸のアルカリ金属塩を用いて変化する方法である。一般式II Aを有するキレート化剤Ｋのその他の製造方法は、文献（EP0248506を参照）に記載の方法であり、その方法は、対応する活性化（例えばNHS−エステル）およびＳ−アシル化チオ酢酸誘導体または３−チオプロピオン酸誘導体と、ペプチドとを反応させる方法である。対応する炭酸の活性化は、当業者に既知の方法によって行うことができ、例えば、混合または環状無水物を介して（Org.Prep.Proc.Int.1975,７,215）、または活性エステルを介して（Adv.Org.Chem.Part B,472）の、カルボ−ジイミド法（Fieser,Reagents for Organic Synthesis 10,142）によるものである。
一般式II Bを有するキレート化剤Ｋの製造は、文献（EP0248506を参照）に記載の方法によって行われ、その方法は、1,2−ジアミノプロピオン酸または1,3−ジアミノブタン酸の遊離アミノ基のクロロ−アセチル化、それに続いて、得られるN,N'−ジクロロアセチル−ジアミノ炭酸をチオ炭酸のアルカリ金属塩を用いて変換する方法である。一般式II Bを有するキレート化剤Ｋのその他の製造方法は、文献（EP0248506を参照）に記載の方法であり、その方法は、対応する活性化（例えばNHS−エステル）およびＳ−アシル化チオ酢酸誘導体または３−チオプロピオン酸誘導体と、1,2−ジアミノプロピオン酸または1,3−ジアミノブタン酸とを反応させる方法である。対応する炭酸の活性化は、当業者に既知の方法によって行うことができ、例えば、混合または環状無水物を介して（Org.Prep.Proc.Int.1975,7,215）、または活性エステルを介して（Adv.Org.Chem.Part B,472）の、カルボ−ジイミド法（Fieser,Reagents for Organic Synthesis 10,142）によるものである。
一般式II Eを有するキレート化剤Ｋの製造は、欧州特許出願番号EP0306168に記載されているように、置換1,2−ジカルボニル化合物を、チオセミカルバジドを用いて変換するという既知の方法で行われる。
一般式II Fを有するキレート化剤Ｋの製造は、本質的に、欧州特許出願番号第EP279417号に記載のように、置換、非置換、保護または非保護アミノチオフェンを用いての、置換または非置換1,2−ジケト−または1,3−ジケト化合物の還元的アミノ化によって行われる。
一般式II Gを有するキレート化剤Ｋの製造は、本質的に、既知の方法によって行われ、欧州特許出願EP0417870号およびEP0502594号に記載のように、２−置換1,3−プロパンジアミンを２−クロロ−２−アルキル−３−ニトロアルカンで変換するか、または、２−置換1,3−プロパンジアミンを1,3−ジカルボニルモノキシムを用いて対応するイミンに変換し、これらが既知の方法によって対応するアミンに還元される。
一般式II Hを有するキレート化剤Ｋの製造は、既知の方法によって行われ（U.S.−PS4897255参照）、1,2−または1,3−ジアミノアルカン酸の遊離アミノ基をクロロアセチル化し（EP0248506参照）、それに続いて、得られるN,N−ジクロロアセチルジアミノ炭酸がチオ炭酸のアルカリ金属塩を用いて変換される。一般式II Hを有するキレート化剤Ｋのその他の製造法は、文献（U.S.−PS4897255参照）に記載の方法によって行われ、対応する活性化（例えばNHS−エステル）およびＳ−保護チオ炭酸誘導体を1,2−または1,3−ジアミノアルカン酸と反応させることによって行われる。対応する炭酸の活性化は、当業者に既知の方法によって行われ、例えば、カルボ−ジイミド法（Fieser,Reagents for Organic Synthesis 10,142）に従い、混合または環状無水物（Org.Prep.Proc Int.1975,７,215）または活性エステル（Adv.Org.Chem.Part B,472）を介して行われる。
一般式II Jを有するキレート化剤Ｋの製造は、本質的に、欧州特許出願EP0417870、EP0502594およびEP0502595に記載のような既知の方法によって行われ、２−置換1,3−プロパンジアミンを任意に付加的カルボキシル−またはスルホン酸基およびｏ−置換ベンズアルデヒドで変換し、続いて、得られるシッフ塩基（Schiff's base）を対応するアミンに還元し、任意に保護基を除去する、または置換マロン酸ハロゲン化物を任意に、付加的カルボキシル−またはスルホン酸基およびｏ−置換ベンジルアミンで変換する。
一般式II Kを有するキレート化剤Ｋの製造は、固相ペプチド合成によって行われる（Merrifield,J.Am chem.Soc.,85（1963）,2149）。この化合物は、文献に記載のペプチド合成に従って化学的に合成される（例えば、The Practice of Peptide Synthesis,M.BodanszkyおよびA.Bodanszky;Springer Verlag（1984）およびFieser,Reagents for Organic Synthesis 10,142）。例えば、第一または第二アミンの付加／除去反応を介して、当業者に既知の方法によって、Ｎ−保護α−、β−またはγ−アミノ酸が、活性化炭酸化合物（例えば、酸性塩化物、混合無水物、活性エステル）と、Ｎ−保護、樹脂結合アミノ酸部位で結合される。文献（Solid Phase Peptide Synthesis,A Practical Approach;E.AthertonおよびR.C.Sheppard;Oxford University Press;Oxford,New York,Tokyo）に記載の方法によってアミノ保護基を除去した後、残るアミノ官能基を、文献に記載の方法による第二反応において、Ｎ−保護α−、β、またはγ−アミノ酸で新たに誘導体化する。アミノ保護基の除去が、再び、既知の方法を用いて行われる。好ましくは、Ｎ−保護アミノ酸FMOC−保護誘導体が使用される。樹脂にペプチドを形成後、完成ペプチドを樹脂から開裂し、例えば調製用HPLCで精製する（固相ペプチド合成、上記参照）。
金属チオニンのシステインに富むアミノ酸配列の製造が、同様の方法で行われる（特許出願WO91/17173参照）。
一般式II Lのキレート形成残基Ｋの製造が、既知の方法で行われる。
好ましい調製用変形は、一般式XX:

式中：
R^a、R^b、R^cおよびR^dは前記と同意義である
の環状無水物を、一般式：
（A¹）_aa−（A²）_bb−（A³）_cc−（A⁴）_dd−（A⁵）_ee−（A⁶）_ff−（A⁷）_gg−
（A⁸）_hh−（A⁹）_jj−（A¹⁰）_kk−（A¹¹）_ll−Ile−Ile−Trp
式中：
Ｎ−末端アミノ酸は、一般式：

の残基を表す
の化合物と反応させることを特徴とする。
３〜25個のアミノ酸残基を有し、Ｃ−末端にIle−Ile−Trpのトリペプチドを有するペプチドの製造は、文献（Analysis,Synthesis,Biology Academic Press,New York 1980;Stewart and Young,Solid−Phase Peptide Synthesis,2nd ed.,Pierre Chemical Co.,Rockford IL,1984;Atherton and Sheppard,Solid−Phase Peptide Synthesis,IRL Press,Oxfored,England 1989）から知られる標準的方法に従って行なった。
本発明の目的はさらに、本発明の一般式Ｉの化合物、および原子数21−32、37−39、42−51および57−83の金属イオンとそれらの化合物との錯体の製造方法であり、この製造方法は、一般式II:
（A¹）_aa−（A²）_bb−（A³）_cc−（A⁴）_dd−（A⁵）_ee−（A⁶）_ff−（A⁷）_gg−
（A⁸）_hh−（A⁹）_jj−（A¹⁰）_kk−（A¹¹）_ll−Ile−Ile−Trp （II）
式中：
A¹〜A¹¹、aa、bb、cc、dd、ee、ff、gg、hh、jj、kkおよびllは前記と同意義である
を有する化合物を、選択的に、既知の方法で、一般式III:
（Ｋ）_ｚ−（Ｌ）_ｙ−Ｈ III
式中：
Ｋ、Ｌ、ｚおよびｙは前記と同意義である
を有する化合物と反応させること、および、任意に、各々既知の方法によって、還元剤、要すれば補助リガンドの存在下に、ペルメタレートの形態の放射性金属イオンと反応させる、または放射性陽イオンの塩または酸化物と反応させること、を特徴とする。
本発明はさらに診断薬を提供するものであり、この診断薬は、一般式（Ｉ）の化合物と、原子数21−32、37−39、42−51および57−83の金属イオンとの錯体を含むことを特徴とする。金属イオンを適切に選択することによって、この診断薬は種々の診断方法に適したものとなる。
本発明の診断薬が放射線診断に適用される場合、錯塩の中央イオンは放射性でなければならない。
これらは特に、原子数27、29、30−32、37−39、42−51、62、64、70、75および77の元素のイオンである。好ましい同位体は^99mTc、¹⁸⁶Reおよび¹¹¹Inである。
本発明の目的はさらに、本発明による診断薬の製造方法を含む。
本発明の放射性医薬の製造は既知の方法によって行われ、その方法によれば、一般式Ｉの本発明の錯生成剤およびそれらのコンジュゲートを、要すれば医薬技術において一般的な添加剤を付加して、水性媒体に溶解または懸濁させ、続いて、その溶液または懸濁液を任意に凍結乾燥または滅菌する。適切な添加剤は、例えば、生理学的に安全な緩衝剤（例えばトロメタミン）、補助リガンドの添加剤（例えば、クエン酸ナトリウムまたは酒石酸ナトリウム）、還元剤（例えば、スズ（II）−クロリド）または、必要であれば、例えば塩化ナトリムのような電解質または、必要であれば、１つまたは複数の一般的な医薬補助剤（例えば、ラクトース、メチルセルロース、マンニット）および／または界面活性剤（例えば、レシチン、Tween（登録商標）、Myrj（登録商標））である。使用されている添加剤は、それらの組成に関連して、本発明の化合物の製造を可能にするものでなければならない。インビボ核医薬適用の際に、本発明の物質は、１×10^-5〜５×10⁴nmol/kg体重の量で、優先的には１×10^-3〜５×10²nmol/kg体重の量で投与される。平均体重70kgと考えれば、診断用途における放射能の量は、１投与当たり0.05〜50mCi、優先的には５〜30mCiである。
投与は通常、本発明の物質の溶液0.1ビス5mlの静脈、動脈または腹膜注射によって行われる。静脈内投与が好ましい。そのような投与法および投与量の詳細については、例えば、「Radiotracers for Medical Applications」、CRC−Press,Boca Raton,Floridaに記載されている。本発明の化合物は、原子数27、29、30−32、37−39、42−51、62、64、70、75および77の元素の放射性同位体との錯体の形態で、放射線診断法および放射線療法に使用することができる。
本発明の放射性医薬は、放射線診断および放射線療法のための放射性医薬としての適性のための種々の必要条件を満たしている。従って、それらは、静脈内投与後、標的組織の濃縮に著しく適しており、対応する組織の非侵襲的診断を可能にする。本発明の放射性医薬の水溶性は、必要であれば、前記のような医薬技術において一般的な助剤によって、確実なものとされる。
さらに、本発明の放射性医薬は、インビトロで高い安定性を示すだけでなく、インビボでも高い安定性を示し、そのために、錯体に結合している放射性核種の放出または交換が生じないかまたは臨床的に関係しない程度にしか生じない。
本発明の医薬の製造はまた、既知の方法によっても行うことができ、本発明の錯生成剤を、還元剤、好ましくは塩化物または酒石酸塩のようなスズ（II）塩を加え、任意に医薬技術において一般的な添加剤を加えて、水性媒体に溶解し、続いて滅菌ろ過する。適切な添加剤は、例えば、生理学的に安全な緩衝液（例えば、トレメタミン）、少量の電解質添加剤（例えば、塩化ナトリウム）、安定剤（例えば、グルコネート、ホスフェートまたはホスホネート）である。本発明の医薬は、溶液の形態または凍結乾燥形態で存在し、投与の直前に、例えば、商業的に入手される発生剤から溶離されたTc−99m−過テクネチウム酸塩の溶液、または過レニウム酸塩溶液に添加される。
放射性医薬の製造が、コールドキット（Cold Kit）を用いて本発明によって提供される。このコールドキットは、一般式（Ｉ）の本発明の化合物、還元剤、任意に１つまたはそれ以上の補助リガンドを、溶液、乾燥形態、または凍結乾燥形態で含む。このコールドキットはさらに、一般式（Ｉ）の本発明の化合物を、放射性金属イオンの過金属酸塩で変換し、一般式（Ｉ）の本発明の化合物の金属イオンとの錯体を形成するための反応規定を含む使用説明書も含んでいる。
このコールドキットは、閉じることができるレセプタクル（receptacle）から成り、所定量のエンドテリン、エンドテリン誘導体、エンドテリン部分配列、エンドテリン類似体およびエンドテリン拮抗薬がペプチド、誘導体、キレートに結合していることを示し、これらは金属イオンを結合することができるものであり、さらにこの化合物を^99mTcで標識付けするために十分な量の還元剤を含み、放射性医薬を製造する機能を有しており、このコールドキットの実施もまた本発明の目的である。
本発明の目的はさらに、疾患の血管変化を図形的に提示する方法であり、この方法は、原子数21−32、37−39、42−51および57−83を有する金属イオンと一般式（Ｉ）との錯体がコントラスト剤として適用されることを特徴とする。
放射診断検査を実施する１つの方法において、放射生医薬組成物が、患者の体重70kg当たり0.1〜30mCi、好ましくは0.5〜10mCiの量で投与され、患者により放出される放射線が記録される。
下記実施例によって本発明を例示する。
実施例１
ａ） Asp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−His−Leu−Asp−Ile−Ile−Trpの合成。
Asp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−His−Leu−Asp−Ile−Ile−Trpを、Barany and Marrifield,The Peptides:Analysis,Biology,Academic Press,New York,1980;Stewart and Young,Solid−Phase Peptide Synthesis,2nd ed.,Pierce Chemical Co.,Rockford.IL,1984に従って製造する。
分子量：計算値 1288.4
観測値 1288（FAB−MS）
ｂ） Asp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−His−Leu−Asp−Ile−Ile−Trpの^99mTc−錯体。
ホスフェート緩衝液（Na₂HPO₄、0.5モル/l、pH8.5）300μｌ中のAsp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−His−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp0.5mgに、0.15モルのクエン酸三ナトリウム二水化物溶液50μｌおよび0.2モルの塩化スズ（II）二水化物溶液2.5Lを加える。Mo−99/Tc−99m発生剤からの過テクネチウム酸塩溶液（0.4ビス0.9mCi）を、反応混合物に加え、次にこれを室温で10分間インキュベートする。標識の分析をHPLCによって行う。
ｃ） WHHLウサギにおけるAsp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−His−Leu−Asp−Ile−Ile−Trpの^99mTc−錯体のインビボおよびインビトロ濃縮。
ｂ） 標識Asp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−His−Leu−Asp−Ile−Ile−Trpの類似体2mCi（1ml）を、麻酔をかけたWHHLウサギ（Rompun/Ketavet1:2）に耳の血管を通して投与した。WHHLウサギは、失われたまたは欠損したLDL受容体によって、高LDLレベルを示し、そのために自発的な動脈硬化症の血管変化を示す。投与から５時間の実験期間中に、様々な暴露時間および位置の静止写真を、ガンマカメラ（Elcint SP4 HR）で撮影した。投与から５時間後にウサギを殺し、大動脈のオートラジオグラフィーおよびズダンIII染色の両方を行った。WHHLウサギの大動脈弓の領域の動脈硬化症プラークが、インビボで10分p.i.で描かれた。それに続いて行われたオートラジオグラフィーは、全大動脈壁および動脈硬化症プラークの標識を生じた。正常および動脈硬化壁領域間の濃縮ファクタ−は、プラーク形成（ズダンIII染色）に依存して６〜９であった。結果を、表１に要約する。
実施例２
ａ） Asp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−Ｄ−Trp−Leu−Asp−Ile−Ile−Trpの合成。
Asp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−Ｄ−Trp−Leu−Asp−Ile−Ile−Trpを、Barany and Marrifield,The Peptides:Analysis,Biology,Academic Press,New York,1980;Stewart and Young,Solid−Phase Peptide Synthesis,2nd ed.,Pierce Chemical Co.,Rockford.IL,1984に従って製造する。
分子量：計算値 1337.5
観測値 1337（FAB−MS）
ｂ） Asp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−Ｄ−Trp−Leu−Asp−Ile−Ile−Trpの99mTc−錯体。
ホスフェート緩衝液（Na2HPO4、0.5モル/l、pH8.5）300μｌ中のAsp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−Ｄ−Trp−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp0.5mgに、0.15モルのクエン酸三ナトリウム二水化物溶液50μｌおよび0.2モルの塩化スズ（II）二水化物溶液2.5lを加える。Mo−99/Tc−99m発生剤からの過テクネチウム酸塩溶液（0.4ビス0.9mCi）を、反応混合物に加え、次にこれを室温で10分間インキュベートする。標識の分析をHPLCによって行う。
ｃ） WHHLウサギにおけるAsp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−Ｄ−Trp−Leu−Asp−Ile−Ile−Trpの^99mTc−錯体のインビボおよびインビトロ濃縮。
WHHLウサギにおけるAsp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−Ｄ−Trp−Leu−Asp−Ile−Ile−Trpの^99mTc−錯体のインビボおよびインビトロ濃縮が、実施例1c）に記載のように行われた。結果を表１に要約する。
実施例３
ａ） Asp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−Trpの合成。
Asp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−Trpを、Barany and Marrifield,The Peptides:Analysis,Biology,Academic Press,New York,1980;Stewart and Young,Solid−Phase Peptide Synthesis,2nd ed.,Pierce Chemical Co.,Rockford.IL,1984に従って製造する。
分子量：計算値 1484.68
観測値 1484（FAB−MS）
ｂ） Asp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−Trpの^99mTc−錯体。
ホスフェート緩衝液（Na₂HPO₄、0.5モル/l、pH8.5）300μｌ中のAsp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp0.5mgに、0.15モルのクエン酸三ナトリウム二水化物溶液50μｌおよび0.2モルの塩化スズ（II）二水化物溶液2.5lを加える。Mo−99/Tc−99m発生剤からの過テクネチウム酸塩溶液（0.4ビス0.9mCi）を、反応混合物に加え、次にこれを室温で10分間インキュベートする。標識の分析をHPLCによって行う。
ｃ） WHHLウサギにおけるAsp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体のインビボおよびインビトロ濃縮。
WHHLウサギにおけるAsp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体のインビボおよびインビトロ濃縮が、実施例1c）に記載のように行われた。結果を表１に要約する。
実施例４
ａ） Ｎ−（４−ヒドロキシカルボキシ−１−オキソ−３−チア−ブチ−１−イル）−Cys−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−Trpの合成。
NH₂−Cye−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp（E.Atherton,R.C.Sheppard,Solid phase peptide synthesis,Oxford University press,New York,Tokyoによって製造）109.5mg（0.1ミリモル）を、アルゴン雰囲気下、トリエチルアミン30.36mg（0.3ミリモル）を添加して、水を含まないジメチルホルムアミド3mlに溶解する。０℃で、チオジグリコール酸無水物13.21mg（0.1ミリモル）を加える。続いて、この溶液を０℃で２時間、その後室温で一夜撹拌する。未処理のペプチドを、水を含まないジエチルエーテル10mlを添加して沈殿させ、シリカゲルRP−18でクロマトグラフィーにかけて精製する（溶離：水/0.1％トリフルオロ酢酸、アセトニトリル/0.1％トリフルオロ酢酸、線状勾配）。凍結乾燥後、白色粉末を得る。
収量:48.5mg（39.5％Th.）、白色粉末
分子量：計算値 1227.4438
観測値 1227（FAB−MS）
ｂ） Ｎ−（４−ヒドロキシカルボキシ−１−オキソ−３−チア−ブチ−１−イル）−Cys−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体。
実施例4a）に記載のペプチドコンジュゲートHOOC−CH₂−Ｓ−CH₂−CONH−Cys−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp 1mgを、リン酸水素二ナトリウム緩衝液500μｌ（0.01モル/l、pH8.5）に溶解し、0.15モルのクエン酸三ナトリウム二水化物溶液50μｌを加える。Mo−99/Tc−99m発生剤からの過テクネチウム酸塩溶液（0.4〜0.9mCi）を添加後、0.2モルの塩化スズ（II）二水化物溶液５μｌを加え、この反応混合物を、室温で10分間インキュベートする。標識収量を分析HPLCによって測定し、それは95％を超過する。
ｃ） WHHLウサギにおけるＮ−（４−ヒドロキシカルボキシ−１−オキソ−３−チア−ブチ−１−イル）−Cys−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体のインビボおよびインビトロ濃縮。
Ｎ−（４−ヒドロキシカルボキシ−１−オキソ−３−チア−ブチ−１−イル）−Cys−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体のWHHLウサギにおけるインビボおよびインビトロ濃縮が、実施例1c）に記載のように行われた。結果を表１に要約する。
実施例５
ａ） Ｎ−（４−ヒドロキシカルボキシ−１−オキソ−３−チア−ブチ−１−イル）−Cys−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−Trpの合成。
NH₂−Cys−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp（E.Atherton,R.C.Sheppard,Solid phase peptide synthesis,Oxford University press,Oxford,New York,Tokyoによって製造）94.8mg（0.1ミリモル）を、アルゴン雰囲気下、トリエチルアミン30.36mg（0.3ミリモル）を添加して、水を含まないジメチルホルムアミド3mlに溶解する。０℃で、チオジグリコール酸無水物13.21mg（0.1ミリモル）を加える。続いて、この溶液を０℃で２時間、その後室温で一夜撹拌する。未処理のペプチドを、水を含まないジエチルエーテル10mlを添加して沈殿させ、シリカゲルRP−18でクロマトグラフィーにかけて精製する（溶離：水/0.1％トリフルオロ酢酸、アセトニトリル/0.1％トリフルオロ酢酸、線状勾配）。凍結乾燥後、白色粉末を得る。
収量:39.3mg（36.4％Th.）、白色粉末
分子量：計算値 1080.2738
観測値 1080（FAB−MS）
ｂ） Ｎ−（４−ヒドロキシカルボキシ−１−オキソ−３−チア−ブチ−１−イル）−Cys−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体。
実施例5a）に記載のペプチドコンジュゲートHOOC−CH₂−Ｓ−CH₂−CONH−Cys−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp 1mgを、リン酸水素二ナトリウム緩衝液500μｌ（0.01モル/1、pH8.5）に溶解し、0.15モルのクエン酸三ナトリウム二水化物溶液50μｌを加える。Mo−99/Tc−99m発生剤からの過テクネチウム酸塩溶液（0.4〜0.9mCi）を添加後、0.2モルの塩化スズ（II）二水化物溶液５μｌを加え、この反応混合物を、室温で10分間インキュベートする。標識収量を分析HPLCによって測定し、それは95％を超過する。
ｃ） WHHLウサギにおけるＮ−（４−ヒドロキシカルボキシ−１−オキソ−３−チア−ブチ−１−イル）−Cys−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体のインビボおよびインビトロ濃縮。
Ｎ−（４−ヒドロキシカルボキシ−１−オキソ−３−チア−ブチ−１−イル）−Cys−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体のWHHLウサギにおけるインビボおよびインビトロでの濃縮が、実施例1c）に記載のように行われた。結果を表１に要約する。
実施例６
ａ） Ｎ−（４−ヒドロキシカルボキシ−１−オキソ−３−チア−ブチ−１−イル）−Cys−His−Leu−Asp−Ile−Ile−Trpの合成。
NH₂−Cys−His−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp（E.Atherton,R.C.Sheppard,Solid phase peptide synthesis,Oxford University press,Oxford,New York,Tokyoによって製造）89.9mg（0.1ミリモル）を、アルゴン雰囲気下、トリエチルアミン30.36mg（0.3ミリモル）を添加して、水を含まないジメチルホルムアミド3mlに溶解する。０℃で、チオジグリコール酸無水物13.21mg（0.1ミリモル）を加える。続いて、０℃で２時間、その後室温で一夜撹拌する。未処理のペプチドを、水を含まないジエチルエーテル10mlを添加して沈殿させ、シリカゲルRP−18でクロマトグラフィーにかけて精製する（溶離：水/0.1％トリフルオロ酢酸、アセトニトリル/0.1％トリフルオロ酢酸、線状勾配）。凍結乾燥後、白色粉末を得る。
収量:26.9mg（26.1％Th.）、白色粉末
分子量：計算値 1031.2038
観測値 1031（FAB−MS）
ｂ） Ｎ−（４−ヒドロキシカルボキシ−１−オキソ−３−チア−ブチ−１−イル）−Cys−His−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体。
実施例6a）に記載のペプチドコンジュゲートHOOC−CH₂−Ｓ−CH₂−CONH−Cys−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp 1mgを、リン酸水素二ナトリウム緩衝液500μｌ（0.01モル/l、pH8.5）に溶解し、0.15モルのクエン酸三ナトリウム二水化物溶液50μｌを加える。Mo−99/Tc−99m発生剤からの過テクネチウム酸塩溶液（0.4〜0.9mCi）を添加後、0.2モルの塩化スズ（II）二水化物溶液５μｌを加え、この反応混合物を、室温で10分間インキュベートする。標識収量を分析HPLCによって測定し、それは95％を超過する。
ｃ） WHHLウサギにおけるＮ−（４−ヒドロキシカルボキシ−１−オキソ−３−チア−ブチ−１−イル）−Cys−His−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体のインビボおよびインビトロ濃縮。
Ｎ−（４−ヒドロキシカルボキシ−１−オキソ−３−チア−ブチ−１−イル）−Cys−His−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体のWHHLウサギにおけるインビボおよびインビトロ濃縮が、実施例1c）に記載のように行われた。結果を表１に要約する。
実施例７
ａ） Ｎ−（メルカプトアセチル）Gly−Gly−Asp−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−Trpの合成。
NH₂−Gly−Gly−Asp−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp（E.Atherton,R.C.Sheppard,Solid phase peptide synthesis,Oxford University press,Oxford,New York,Tokyoによって製造）122.1mg（0.1ミリモル）を、アルゴン雰囲気下、トリエチルアミン40.48mg（0.4ミリモル）を添加して、水を含まないジメチルホルムアミド3mlに溶解する。０℃において、水を含まないジメチルホルムアミド3ml中のＳ−トリチル−メルカプト酢酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの溶液［製法:S−トリチル−メルカプト酢酸36.79mg（0.11ミリモル）を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド12.66mg（0.11ミリモル）を添加して、水を含まないジメチルホルムアミド2ml中に溶解する。水を含まないジメチルホルムアミド1mL中のジシクロヘキシルカルボジイミド22.70mg（0.11ミリモル）の溶液を加え、30分間インキュベートする。ろ過後、系中で製造されたＳ−トリチル−メルカプト酢酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル溶液をカップリングに使用することができる］。続いて、０℃で２時間、その後室温で一夜撹拌する。未処理のペプチドを、水を含まないジエチルエーテル20mlを加えて沈殿させ、アルゴン雰囲気下、5mlトリフルオロ酢酸/5％水/22mgトリブチルシラン中で10分間撹拌する。保護基を含まない未処理のペプチドを、水を含まないジエチルエーテル25mlで沈殿させて分離し、シリカゲルRP−18でクロマトグラフィーにかけて精製する（溶離：水/0.1％トリフルオロ酢酸、アセトニトリル/0.1％トリフルオロ酢酸、線状勾配）。凍結乾燥後、白色粉末を得る。
収量:56.3mg（43.4％Th.）、白色粉末
分子量：計算値 1296.4551
観測値 1296（FAB−MS）
ｂ） Ｎ−（メルカプトアセチル）−Gly−Gly−Asp−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体。
実施例7a）に記載のペプチドコンジュゲートHS−CH₂−CONH−Gly−Gly−Asp−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp 1mgを、リン酸水素二ナトリウム緩衝液500μｌ（0.01モル/l、pH8.5）に溶解し、0.15モルのクエン酸三ナトリウム二水化物溶液50μｌを加える。Mo−99/Tc−99m発生剤からの過テクネチウム酸塩溶液（0.4〜0.9mCi）を添加後、0.2モルの塩化スズ（II）二水化物溶液５μｌを加え、この反応混合物を、室温で10分間インキュベートする。標識収量を分析HPLCによって測定し、それは95％を超過する。
ｃ）WHHLウサギにおけるＮ−（メルカプトアセチル）−Gly−Gly−Asp−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体のインビボおよびインビトロ濃縮。
Ｎ−（メルカプトアセチル）−Gly−Gly−Asp−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体のWHHLウサギにおけるインビボおよびインビトロ濃縮が、実施例1c）に記載のように行われた。結果を表１に要約する。
実施例８
ａ） Ｎ−（メルカプトアセチル）−Gly−Gly−Asp−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−Trpの合成。
NH₂−Gly−Gly−Asp−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp（E.Atherton,R.C.Sheppard,Solid phase peptide synthesis,Oxford University press,Oxford,New York,Tokyoによって製造）107.4mg（0.1ミリモル）を、アルゴン雰囲気下、トリエチルアミン40.48mg（0.4ミリモル）を添加して、水を含まないジメチルホルムアミド3mlに溶解する。０℃において、水を含まないジメチルホルムアミド3ml中のＳ−トリチル−メルカプト酢酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの溶液［製法:S−トリチル−メルカプト酢酸36.79mg（0.11ミリモル）を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド12.66mg（0.11ミリモル）を添加して、水を含まないジメチルホルムアミド2ml中に溶解する。水を含まないジメチルホルムアミド1mL中のジシクロヘキシルカルボジイミド22.70mg（0.11ミリモル）の溶液を加え、30分間インキュベートする。ろ過後、系中でそのように製造されたＳ−トリチル−メルカプト酢酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル溶液をカップリングに使用することができる］。続いて、０℃で２時間、その後室温で一夜撹拌する。未処理のペプチドを、水を含まないジエチルエーテル20mlを加えて沈殿させ、アルゴン雰囲気下、5mlトリフルオロ酢酸/5％水/22mgトリブチルシラン中で10分間撹拌する。保護基を含まない未処理のペプチドを、水を含まないジエチルエーテル25mlで沈殿させて分離し、シリカゲルRP−18でクロマトグラフィーにかけて精製する（溶離：水/0.1％トリフルオロ酢酸、アセトニトリル/0.1％トリフルオロ酢酸、線状勾配）。凍結乾燥後、白色粉末を得る。
収量:46.3mg（40.3％Th.）、白色粉末
分子量：計算値 1049.2851
観測値 1049（FAB−MS）
ｂ） Ｎ−（メルカプトアセチル）−Gly−Gly−Asp−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体。
実施例8a）に記載のペプチドコンジュゲートHS−CH₂−CONH−Gly−Gly−Asp−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp 1mgを、リン酸水素二ナトリウム緩衝液500μｌ（0.01モル/1、pH8.5）に溶解し、0.15モルのクエン酸三ナトリウム二水化物溶液50μｌを加える。Mo−99/Tc−99m発生剤からの過テクネチウム酸塩溶液（0.4〜0.9mCi）を添加後、0.2モルの塩化スズ（II）二水化物溶液５μｌを加え、室温で10分間インキュベートする。標識収量を分析HPLCによって測定し、それは95％を超過する。
ｃ） WHHLウサギにおけるＮ−（メルカプトアセチル）−Gly−Gly−Asp−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体のインビボおよびインビトロ濃縮。
Ｎ−（メルカプトアセチル）−Gly−Gly−Asp−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−TrpのTc−99m−錯体のWHHLウサギにおけるインビボおよびインビトロ濃縮が、実施例1c）に記載のように行われた。結果を表１に要約する。
図１は、Tc−99m−Asp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−Phe−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp 74MBqの静脈内投与後0.5時間のWHHLウサギ（Ａ）およびニュージーランド対照標準ウサギ（Ｂ）の左側面のシンチグラムを示す（実施例3c参照）。対照標準ウサギ（Ｂ）と対照してみると、濃縮活性が、WHHLウサギ（Ａ）の大動脈弓の領域、左頚動脈および腹大動脈の領域においてインビボで観察することができる。
図２は、Tc−99m−Asp−Gly−Gly−Cys−Gly−Cys−（Ｄ−Trp）−Leu−Asp−Ile−Ile−Trp 74MBqの静脈内投与後0.5時間の、右頚動脈をFogartyカテーテルの補助によって４週間早く露出されたニュージーランドウサギの腹側のシンチグラム（Ａ）、および静脈内投与後５時間で除去された胸大動脈、露出および未処理頚動脈のオートダイアグラム（B1）およびズダンIII染色（B2）を示す。（実施例3c参照）。B1およびB2の切開された組織の順序は各々、左から右に向かって以下の通りである：胸大動脈、右露出頚動脈、左未処理頚動脈。
強度動脈硬化症の右頚動脈がインビボで検出された（Ａ）。インビトロでの検査（Ｂ）は、未処理左頚動脈と比較して、露出右頚動脈における医薬の高い沈着と選択的沈着との間の高い相互関係を確認するものである。The present invention relates to a novel complex compound for diagnosing vascular diseases, a method for producing the same, and a diagnostic agent containing these compounds.
Arteriosclerosis is a chronic, progressive disease of blood vessels, which previously could only be clinically diagnosed at an advanced stage. Blood vessel changes caused by arteriosclerosis are measured today by conventional arteriography. In this method, a contrast agent is administered to a target blood vessel via a catheter, and stenosis of the region of the blood vessel is detected by X-ray. The deficiency of this method is that only a partial area of the vasculature can be observed. Since arteriography is an invasive method, it can cause complications such as pain, arterial perforation, arrhythmia, heart attack when applied, resulting in patient death under unfortunate conditions It can happen.
Furthermore, methods based on the application of ultrasound and MR tomography are also used for the diagnosis of arteriosclerosis.
All currently used methods are only detected at an advanced stage of atherogenesis since changes in arteriosclerotic blood vessels were detected by observing blood flow contraction or significant changes in the arterial wall. Have major drawbacks.
Early detection of arteriosclerosis includes control of therapeutic effects of therapeutic diets, calcium antagonists, lipid- and antihypertensive agents, suppression of recurrent stenosis after angiogenesis, diagnosis of coronary heart disease, and vascular deposition of thrombosis It is very important for the detection of objects.
A non-invasive method for diagnosing arteriosclerosis has been disclosed. Radiolabeled antibodies or similar labeled low density lipoproteins (LDL) that bind to the arteriosclerotic wall region are derived (Lees et al., 1993, J. Nucl. Med. 24,154-156; Kaliman et al., 1985, Circulation, 72,300; Virgolini Et al., 1991, Eur. J. Nucl. Med., 18, 944-947). However, these methods have decisive drawbacks, such as the antigenic effect of antibodies on the living body and the long time (several days) required for the separation, purification and labeling of LDL from patient blood. These large molecules also exhibit a long half-life in the blood, which, together with high background radiation to the whole body, makes arteriosclerotic injury localization difficult if not impossible.
Shih et al. (1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 1436-1440) synthesized a partial sequence of the LDL protein part (apo-B-100), which still binds to atherosclerotic plaques. However, it exhibits a short half-life and a high signal-noise ratio overall in the blood. Due to the low affinity for plaque and / or the low density of binding sites for apo-B-peptide in the plaque, a diagnosis of arteriosclerotic warts could not be fully established.
The object of the present invention is to provide novel compounds and drugs suitable for non-invasive diagnostic methods, particularly for the diagnosis of vascular diseases that are early but not yet stenotic.
Endothelin is a physiologically active peptide that performs hormonal and neuromodulatory functions in the body (MacCumber et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., 7285-7289; Yanagisawa et al., 1989, Trends Pharmacol. Sci. , 10, 374-378; LeMonier die Gouville et al., 1989, Life Sci., 45, 1499-1513; Yanagisawa et al., 1988, Nature, 332, 411-415). To date, four isotypes have been identified in humans (Inoue et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., 86, 2863-2867). Endothelin 1 is a polypeptide having the following sequence of 21 amino acids:
Cys-Ser-Cys-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu-Cys-Val-Tyr-Phe-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp
(Yanagisawa et al., 1988, Nature, 332, 411-415)
From the vascular endothelium, the inactive precursor of endothelin, the Big Endotheline, is formed. After the heptadecapeptide is degraded via Endotheline-Converting-Enzyme (ECE), endothelin is generated and this endothelin binds to a specific receptor in smooth vascular muscle tissue. This leads to accelerated contraction of smooth muscle cells Ca ++ (Yanagisawa et al., Nature, 332, 411-415; Takuwa et al., 1991, Contrib. Nephrol., 90, 99-104).
One of the early irreversible changes resulting from atherogenesis is, among other things, the proliferation of vascular wall smooth muscle cells caused by growth factors such as PDGF (Desmouliere and Gabbiani, 1992, Cerebrovasc. Dis., 2, 63-71). Human atherosclerotic coronary artery ¹²⁵ In vitro incubation with I-endothelin 1 in Tunica media and Vasa Vasora region ¹²⁵ It has been shown that increased binding of I-endothelin 1 appears (Dashwood et al., 1991, J. Cardiovasc. Pharmacol., 17, 458-462). To a rabbit whose abdominal aorta has already been de-endotheliated with a balloon catheter, ¹²⁵ By applying I-endothelin 1 in the de-endothelinized region of the aorta ¹²⁵ Increased uptake of I-endothelin 1 has been shown, indicating a high density of binding sites for endothelin 1 in damaged vascular regions (Kurata et al., 1992, J. Nucl. Med., 33,845). From this study, it can be concluded that proliferated smooth muscle cells also express more endothelin receptors.
Endothelin 1 has a strong vasoconstrictive effect on smooth vascular muscle tissue (AMDoherty, 1992, Medical Chemistry, 35, 1493-1508). Therefore, only a relatively low concentration can be applied to the vein of a living body. High concentrations can be applied only for endothelin subsequences, endothelin derivatives, endothelin analogs or endothelin antagonists that bind to the endothelin receptor but do not lead to such significant contraction of smooth muscle cells.
Endothelin is cleared from the kidney so quickly that very little disturbing background radiation is generated by the uptake of endothelin by other organs or tissues.
German Patent Application No. P4301871.8 has already disclosed compounds comprising endothelin, a partial sequence of endothelin, an endothelin derivative, an endothelin antagonist, or an endothelin analog that binds to the endothelin receptor.
During the study of additional compounds, a substance of general formula I was found:
(K) _z -(L) _y − (A ¹ ) _aa − (A ² ) _bb − (A ^Three ) _cc − (A ^Four ) _dd − (A ^Five ) _ee − (A ⁶ ) _ff −
(A ⁷ ) _gg − (A ⁸ ) _hh − (A ⁹ ) _jj − (A ^Ten ) _kk − (A ¹¹ ) _ll -Ile-Ile-Trp (I)
In the formula:
aa, bb, cc, dd, ee, ff, gg, hh, jj, kk and ll each independently represent an integer 0, 1 or 2;
y and z independently of one another represent the integer 0 or 1;
K represents a chelating residue having the general formula II A or II B;

In the formula:
T is a hydrogen atom or a bond at a metal atom, or a suitable sulfur protecting group such as an alkali metal ion, an acyl group having 1 to 6 carbon atoms, a benzoyl group, a hydroxyacetyl group, an acetamidomethyl group, p-methoxy group. Benzyl group, ethoxyethyl group, benzyl group, ortho- or para-hydroxybenzyl group, ortho- or para-acetoxybenzyl group, p-nitrobenzyl group, 4-picolyl group, 2-picolyl-N-oxide group, 9- Anthrylmethyl group, 9-fluorenyl group, ferrocenylmethyl group, diphenylmethyl group, bis (4-methoxyphenyl) methyl group, dibenzosuberyl group, triphenylmethyl group, diphenyl-4-pyridylmethyl group, phenyl group 2,4-dinitrophenyl group, t-butyl group, 1-adamantyl group, methoxy Methyl group, isobutoxymethyl group, 2-tetrahydropyranyl group, benzylthiomethyl group, phenylthiomethyl group, trimethylacetamidomethyl group, benzamidomethyl group, acetylmethyl group, carboxymethyl group, cyanomethyl group, 2-nitro-1 -Phenylethyl group, 2- (4'-pyridyl) ethyl group, 2-cyanoethyl group, 2,2-bis (carboethoxy) ethyl group, 1-m-nitrophenyl-2-benzoylethyl group, 2-phenylsulfonyl Ethyl group, 1- (4-methylphenylsulfonyl) -2-methylprop-2-yl residue, silyl group, N-{[(p-biphenyl) isopropoxy] carbonyl} -N-methyl-γ-aminobutyrate Group, N- (t-butoxycarbonyl) -N-methyl-γ-aminobutyrate group, 2,2,2-trichloro Ethoxycarbonyl residue, t-butoxycarbonyl residue, benzyloxycarbonyl residue, p-methoxybenzyloxycarbonyl group, N-ethyl group, N-methoxymethyl group, S-ethyl group, t-S-butyl group, substitution An S-phenyl group, a sulfonate group, a sulfenylthiocarbonate group, or a 3-nitro-2-pyridinesulfenyl group, whereby two T residues can be intermolecular or intramolecular with the S atom attached. Form disulfides,
R _Four Represents a residue having the formula II C or II D;

In the formula:
The carbon atom marked with * is attached to the imino group of formula II B
n ′ represents the integer 1 or 2,
i represents any number of 2 to 6,
TT is alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, tryptophan, phenylalanine, methionine, glycine, serine, tyrosine, threonine, cysteine, asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, histidine, citrulline, homocysteine, homoserine Represents residues of α-amino acids such as 4-hydroxyproline, 5-hydroxylysine, ornithine, sarcosine or taurine, and / or their homologous β-amino acids, which are mediated by amide groups in the usual manner. Combined
And represents a chelating residue having the formula II E,

In the formula:
R ₆ Represents hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
And represents a chelating residue having the formula II F,

In the formula:
Residue R ₇ ~ R ₁₈ Each independently represents a hydrogen atom, an alkyl chain having 1 to 6 carbon atoms and / or a bond to L, o, p and r each represents an integer 1 or 2,
T is as defined above
And represents a chelating residue having the formula II G

In the formula:
R ₁₉ ~ R _{twenty four} Are the same or different and each independently represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms,
m ′ represents the integer 2 or 3
And represents a chelating residue having the formula II H

In the formula:
X ₁ Is a bond, methylene group or CHY _Four -Represents a group,
Group Y ₁ , Y ₂ , Y _Three Or Y _Four One of which represents a bond to L, the remaining groups represent hydrogen, or optionally an oxygen atom,
T is as defined above,
A ₁ , A ₂ , A _Three And A _Four May be the same or different and each independently represents hydrogen or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
And represents a chelating residue having the formula II J

In the formula:
R ₂₇ Represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, optionally substituted with one or two hydroxyl groups,
R _{twenty five} And R ₂₆ Each represents a hydrogen atom or both oxygen atoms,
A represents a hydroxyl or mercapto group;
Y represents a hydrogen atom, a carboxy group or a sulfonyl group,
Z represents a carbon atom or a nitrogen atom
And represents a chelating residue having the formula II K
(AA ¹ ) _mm -(AA ² ) _nn -(AA ^Three ) _oo -(AA ^Four ) _pp -(AA ^Five ) _qq -(AA ⁶ ) _rr (II K)
In the formula:
mm, nn, oo, pp, qq and rr, independently of one another, represent the integers 0, 1 or 2;
AA ¹ ~ AA ⁶ Are independently of each other alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, tryptophan, phenylalanine, methionine, glycine, serine, tyrosine, threonine or cysteine (optionally the same meaning as described above in place of the hydrogen atom at the sulfur atom site). Α-amino acids such as asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, histidine, citrulline, homocysteine, homoserine, 4-hydroxyproline, 5-hydroxylysine, ornithine, sarcosine or taurine And / or their homologous β-amino acid residues, which are linked via an amide group in the usual way, so that each two available cysteine residues are optionally linked together. Forms one cystine residue Do
And represents a chelating agent having the formula II L

In the formula:
R ^a , R ^b , R ^c , R ^d , R ^f , R ^g And R ^h May be the same or different and each represents a hydrogen atom and / or a branched or unbranched C 1-6 alkyl residue,
R ^e Is a carboxy group or an unbranched, branched, cyclic or polycyclic alkyl group having 1 to 60 carbon atoms, alkenyl, polyalkenyl, alkynyl, polyalkynyl, aryl, alkylaryl Or an arylalkyl group, which has 20 or fewer carbon atoms and / or is optionally interrupted and / or interrupted through one or more heteroatoms from O, N, S, P, As, Se. Or optionally substituted with a substituted hydroxy-, oxy-, oxo-, carboxy-, aminocarbonyl-, alkoxycarbonyl-, amino-, aldehyde- or alkoxy group,
T is as defined above;
L is a bond, a hydrogen atom or an unbranched chain, or a branched, cyclic or polycyclic alkyl group having 1 to 60 carbon atoms, alkenyl group, polyalkenyl group, alkynyl group, polyalkenyl group, aryl group, Represents an alkylaryl, or arylalkyl group, which has up to 20 carbon atoms and / or via one or more heteroatoms from O, N, S, P, As, Se. A hydroxy-, mercapto-, alkylmercapto-, oxo-, oxy-, carboxy-, aminocarbonyl-, alkoxycarbonyl-, amino-, aldehyde- or alkoxy group which is optionally interrupted and / or substituted Optionally substituted with more,
Or Z ₁ -R-Z ₂ Represents a residue,
In the formula:
R represents a linear, branched, saturated or unsaturated alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, which includes one or more oxygen and / or sulfur atoms and / or carbonyl-, NHCO-, Selectively interrupted via -N (C1-6 alkyl) CO-, -NH- and -N (C1-6 alkyl) groups, and selective with hydroxy- and / or epoxy groups Has been replaced with
Z ₁ And Z ₂ Are independently of each other -O-, -S-,-(C = O) O-, -NH (C = S) NH-,-(C = O)-, or -NH (C = S) -group
Or a residue represented by formula α,

In the formula:
s and t, independently of one another, represent the integer 0, 1, 2 or 3, ring B represents a phenyl- or cyclohexyl group, Z ₁ And Z ₂ Is as defined above;
A ¹ ~ A ¹¹ Independently of one another, represents an L-α- or D-α-amino acid residue, -NH-CH (Z) -CO- residue,
In the formula:
Z is H-, (CH _Three ) ₂ CH−, (CH _Three ) ₂ CH-CH ₂ -, CH _Three −CH ₂ -CH (CH _Three )-, CH _Three -S- (CH ₂ ) ₂ -, HOOC-CH ₂ -, HOOC- (CH ₂ ) ₂ -, H ₂ N− (CH ₂ ) ₃ -, H ₂ N-C (= NH)-(CH ₂ ) ₃ -, HO-CH ₂ -, CH _Three -CH (OH)-, HS-CH ₂ −, HS− (CH ₂ ) ₂ -, H ₂ N-CO-CH ₂ -, H ₂ N-CO- (CH ₂ ) ₂ -, (HOOC) ₂ CH-CH ₂ −, Meaning

In the formula:
n is an integer 0, 1 or 2;
Or residue,

Or represents a taurine residue;
And metal ions having 21-32, 37-39, 42-51 and 57-83 atoms and their complexes and their water-soluble salts,
These substances surprisingly concentrate the atherosclerotic plaque to a fairly strong degree, and due to the low background radiation in other tissues and organs resulting from the rapid removal of these substances, they are non-arteriosclerotic. Particularly suitable for invasive diagnosis.
Particularly preferred compounds of the invention of the general formula I are Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp, Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys- D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp, Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp, N- (4-hydroxy Carboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) -Cys-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp, N- (4-hydroxycarboxy-1-oxo-3 -Thia-but-1-yl) -Cys- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp, N- (4-hydroxycarboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp, N- (mercaptoacetyl) -Gly-Gly-Asp-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp and N- (mercapto) Acetyl) -Gly-Gly-Asp- (D-Trp) -Leu-Asp Is the Ile-Ile-Trp.
Particularly preferred complex compounds of the present invention include Asc-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp Tc-99m-complex, Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys. Tc-99m-complex of D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp, Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp Tc-99m-complex of N- (4-hydroxycarboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) -Cys-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp Tc-99m-complex, Tc-99m of N- (4-hydroxycarboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) -Cys- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp -Tc-99m-complex of N- (4-hydroxycarboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) -Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp, N- (mercapto Acetyl) -Gly-Gly-Asp-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp A Tc-99m-complex and N- (mercaptoacetyl) -Gly-Gly-Asp- Tc-99m- complex (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.
The radiolabeled metal complex of general formula I of the present invention is surprisingly strongly concentrated in the arteriosclerotic vascular region, resulting in a concentration sufficient for displays with scintillation cameras or other suitable devices common in nuclear medicine. Reach. The surprising discovery is that the applied substances of the invention reach such concentrations very quickly in vivo and their binding is very stable, so that the excess substances bound to the receptor are transferred and removed. Even after doing so, a high and sufficient concentration remained for diagnosis. In addition, it was surprising that enrichment preferably occurs in the arterial wall region to be diagnosed that has been altered through a wide variety of methods, even though endothelin itself is effective in all vascular regions. .
The applied substances of the present invention have additional advantages compared to many other substance types and substances tested, and can concentrate additional and non-specifically in other tissues and organs. This is not decisive for its suitability as a diagnostic agent.
Figures 1 and 2 show the in vivo enrichment of the compounds of the invention. FIG. 1 shows WHHL 0.5 hours after intravenous administration of 74 MBq of Tc-99m-complex of Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp. Scintigrams of left side of rabbit (A) and New Zealand control rabbit (B) (see Example 3c). In contrast to the control rabbit (B), enrichment activity can be seen in vivo in the region of the aortic arch, left carotid artery and abdominal aorta of the WHHL rabbit (A). FIG. 2 shows the right carotid artery 0.5 hours after intravenous administration of 74 MBq Tc-99m-complex of Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp. Ventral scintigrams (A) (Example 2c) of New Zealand rabbits exposed 4 weeks early with the aid of Fogarty catheters, and autopsy of dissected thoracic aorta, exposed and untreated carotid artery 5 hours after intravenous administration A diagram (B1) and a Sudan III staining (B2) are shown. The order of B1 and B2 incised tissues is as follows from left to right: thoracic aorta, right exposed carotid artery, left untreated carotid artery. The right carotid artery with severe arteriosclerosis was detected in vivo (A). In vitro studies (B1 and B2) confirm a high correlation between high and selective deposition of the compounds of the invention in the exposed right carotid artery compared to the untreated left carotid artery.
The compounds of general formula I according to the invention and their solutions fulfilled the above requirements to a surprisingly high degree. They combine both high concentration of diseased tissue area and superior contrast properties than the previously described diagnostics for assessing vascular disease due to favorable pharmacokinetics. Practical use of the novel materials of the present invention is easy due to their high chemical stability.
In Table 1, the concentration of compounds of the invention (cpm / mm) in plaques and non-plaque areas of the aorta ² ) With the concentration factor (ratio of concentration in plaques to concentration in non-plaque aortic tissue). Each compound of the present invention, 74MBq (2mCi), was administered to WHHL rabbits from the ear vessels. The rabbits were killed for 5 hours pi and both quantitative autoradiography and Zudan III staining of the removed aorta were performed. The so measured deposition of each compound of the present invention in different tissues is shown in Table 1.

The complexing residue K present in the complexes of the invention must be able to bind to each metal ion in the form of coordination and / or covalent bonds.
The complexing residue K must be selected according to the metal ion to be complexed and its charge, oxidation number, atom and ionic radius so that an effective and sufficient bond to complete the complex of the invention occurs. .
A preferred complexing residue is 4-carboxyethyl-phenylglyoxal-bis- (N-methylthiosemicarbazone) N-hydroxysuccinimide ester, 6- (4'-isothiocyanatobenzyl) -3,3,9 , 9-Tetramethyl-4,8-diazaundecane-2,10-dione-dioxime, 2-methyl-2- (4-isothiocyanatobenzyl) -N, N′-propylene-bis-salicylideneamine 2-methyl-2- (4-isothiocyanatobenzyl) -N, N′-propylene-bis- [5- (sulfo) salicylideneamine, N, N′-bis (2-mercaptopyridyl) methyl] -2-methyl-2- (4-isothiocyanatobenzyl) -1,3-propanediamine, S-benzoylthioacetylglycylglycylglycine, N, N'-bis (benzoylthioacetyl) -2,3-diamy Propionic acid, N, N'-bis (benzoylthioacetyl) -3,4-diaminobutanoic acid, N, N'-bis (benzoylthioacetyl) -4,5-diaminopentanoic acid, N, N'-1, 2-Ethylene-di-yl-bis- (2-mercapto-1-carboxyethylamine), Cys (Acm) GlyCys (Acm) GlyGlyArg GlyAspSer.
The preparation of the complex of the compound of general formula (I) with the metal ion according to the present invention can be carried out using methods well known to those skilled in the art. In the presence of, a radiometal ion in the form of a permetalate is reacted with a compound of general formula (I).
Preferred metal ions are in the form of pertechnetate or perrhenate. ^99m Tc or Re.
This reaction is preferably carried out in an aqueous medium at room temperature. Removal of the SH protecting group can be performed in the system by methods well known to those skilled in the art, for example, basic hydrolysis, reductive cleavage, etc. (eg, “Protective Groups in Organic Synthesis”, TWGreene , John Wiley and Sons 1981).
The preparation of a complex of a compound of general formula (I) with a metal ion according to the invention is carried out in a known manner by reacting a suitable salt or oxide of a suitable radioactive cation with a compound of general formula (I). Can also do:
(K) _z -(L) _y − (A ¹ ) _aa − (A ² ) _bb − (A ^Three ) _cc − (A ^Four ) _dd − (A ^Five ) _ee − (A ⁶ ) _ff − (A ⁷ ) _gg − (A ⁸ ) _hh − (A ⁹ ) _jj − (A ^Ten ) _kk − (A ¹¹ ) _ll -Ile-Ile-Trp (I).
Preferred radiometal ions are, for example, isotopes of Tc and Re.
The chelating agent K of the general formula II A can be prepared by the method described in the literature (see EP0248506), which comprises N-di-, tri-, tetra-, penta- or hexapeptide N- In this method, the terminal amino group is chloro-acetylated, and the resulting N-chloroacetyl peptide is changed using an alkali metal salt of thiocarbonate. Other methods for the preparation of chelating agents K having the general formula II A are those described in the literature (see EP0248506), which correspond to the corresponding activation (eg NHS-esters) and S-acylated thiols. In this method, an acetic acid derivative or a 3-thiopropionic acid derivative is reacted with a peptide. Corresponding carbonic acid activation can be carried out by methods known to those skilled in the art, for example via mixing or cyclic anhydrides (Org. Prep. Proc. Int. 1975, 7 215), or via an active ester (Adv. Org. Chem. Part B, 472), by the carbo-diimide method (Fieser, Reagents for Organic Synthesis 10,142).
The preparation of chelating agent K having the general formula II B is carried out according to the method described in the literature (see EP0248506), which comprises free amino of 1,2-diaminopropionic acid or 1,3-diaminobutanoic acid. Chloro-acetylation of the group, followed by conversion of the resulting N, N′-dichloroacetyl-diaminocarbonic acid using an alkali metal salt of thiocarbonic acid. Another method for the preparation of chelating agent K having the general formula II B is that described in the literature (see EP0248506), which comprises the corresponding activation (eg NHS-ester) and S-acylated thiol. In this method, an acetic acid derivative or a 3-thiopropionic acid derivative is reacted with 1,2-diaminopropionic acid or 1,3-diaminobutanoic acid. Corresponding carbonic acid activation can be carried out by methods known to the person skilled in the art, for example via mixed or cyclic anhydrides (Org. Prep. Proc. Int. 1975, 7, 215) or via active esters. (Adv. Org. Chem. Part B, 472) by the carbo-diimide method (Fieser, Reagents for Organic Synthesis 10, 142).
The preparation of chelating agent K having the general formula II E is carried out in the known manner of converting substituted 1,2-dicarbonyl compounds with thiosemicarbazide, as described in European Patent Application No. EP0306168. Is called.
The preparation of chelating agent K having the general formula II F essentially consists of substituted or non-substituted aminothiophene with substituted, non-substituted, protected or non-protected aminothiophenes as described in European Patent Application No. EP279417. This is done by reductive amination of a substituted 1,2-diketo- or 1,3-diketo compound.
The preparation of the chelating agent K having the general formula II G is essentially carried out by known methods, as described in European patent applications EP0417870 and EP0502594, with 2-substituted 1,3-propanediamine Conversion with -chloro-2-alkyl-3-nitroalkanes or conversion of 2-substituted 1,3-propanediamine to the corresponding imine using 1,3-dicarbonylmonoxime, which are known The method is reduced to the corresponding amine.
The preparation of chelating agent K having the general formula II H is carried out by known methods (see US Pat. No. 4,897,255), and the free amino group of 1,2- or 1,3-diaminoalkanoic acid is chloroacetylated (see EP0248506). ), Followed by conversion of the resulting N, N-dichloroacetyldiaminocarbonate using an alkali metal salt of thiocarbonate. Other processes for the preparation of chelating agents K having the general formula II H are carried out according to the methods described in the literature (see US Pat. No. 4,897,255), with corresponding activation (for example NHS-esters) and S-protected thiocarbonate derivatives. This is done by reacting with 1,2- or 1,3-diaminoalkanoic acid. The corresponding activation of carbonic acid is carried out by methods known to those skilled in the art, for example according to the carbo-diimide method (Fieser, Reagents for Organic Synthesis 10,142), mixed or cyclic anhydride (Org. Prep. Proc Int. 1975, 7 , 215) or active esters (Adv. Org. Chem. Part B, 472).
The preparation of chelating agent K having the general formula II J is essentially carried out by known methods such as those described in European patent applications EP0417870, EP0502594 and EP0502595, and optionally with 2-substituted 1,3-propanediamine. Conversion with additional carboxyl- or sulfonic acid groups and o-substituted benzaldehyde, followed by reduction of the resulting Schiff's base to the corresponding amine, optionally removing protecting groups, or substituted malonic acid halides Is optionally converted with an additional carboxyl- or sulfonic acid group and an o-substituted benzylamine.
Production of chelating agent K having the general formula II K is carried out by solid phase peptide synthesis (Merrifield, J. Am chem. Soc., 85 (1963), 2149). This compound is chemically synthesized according to the peptide synthesis described in the literature (eg The Practice of Peptide Synthesis, M. Bodanszky and A. Bodanszky; Springer Verlag (1984) and Fieser, Reagents for Organic Synthesis Ten 142). For example, an N-protected α-, β-, or γ-amino acid can be converted to an activated carbonate compound (eg, acid chloride, by methods known to those skilled in the art via addition / removal reactions of primary or secondary amines). Mixed anhydride, active ester) and N-protected, resin-bound amino acid sites. After removing the amino protecting group by the method described in the literature (Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach; E. Atherton and RCSheppard; Oxford University Press; Oxford, New York, Tokyo), the remaining amino functional group is described in the literature. In the second reaction according to the method, a new derivatization is performed with an N-protected α-, β, or γ-amino acid. Removal of the amino protecting group is again performed using known methods. Preferably, N-protected amino acid FMOC-protected derivatives are used. After forming the peptide on the resin, the finished peptide is cleaved from the resin and purified, for example by preparative HPLC (solid phase peptide synthesis, see above).
The production of the cysteine-rich amino acid sequence of the metal thionine is carried out in a similar manner (see patent application WO 91/17173).
The preparation of the chelating residue K of the general formula II L is carried out in a known manner.
A preferred preparative variant is the general formula XX:

In the formula:
R ^a , R ^b , R ^c And R ^d Is as defined above
A cyclic anhydride of the general formula:
(A ¹ ) _aa − (A ² ) _bb − (A ^Three ) _cc − (A ^Four ) _dd − (A ^Five ) _ee − (A ⁶ ) _ff − (A ⁷ ) _gg −
(A ⁸ ) _hh − (A ⁹ ) _jj − (A ^Ten ) _kk − (A ¹¹ ) _ll -Ile-Ile-Trp
In the formula:
The N-terminal amino acid has the general formula:

Represents the residue of
It is made to react with the compound of this.
The preparation of peptides having 3-25 amino acid residues and a tripeptide of Ile-Ile-Trp at the C-terminus is described in the literature (Analysis, Synthesis, Biology Academic Press, New York 1980; Stewart and Young, Solid -Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierre Chemical Co., Rockford IL, 1984; Atherton and Sheppard, Solid-Phase Peptide Synthesis, IRL Press, Oxford, England 1989).
The object of the present invention is further a process for the preparation of the compounds of the general formula I according to the invention and complexes of metal ions of the atoms 21-32, 37-39, 42-51 and 57-83 with these compounds, This production method has the general formula II:
(A ¹ ) _aa − (A ² ) _bb − (A ^Three ) _cc − (A ^Four ) _dd − (A ^Five ) _ee − (A ⁶ ) _ff − (A ⁷ ) _gg −
(A ⁸ ) _hh − (A ⁹ ) _jj − (A ^Ten ) _kk − (A ¹¹ ) _ll -Ile-Ile-Trp (II)
In the formula:
A ¹ ~ A ¹¹ , Aa, bb, cc, dd, ee, ff, gg, hh, jj, kk and ll are as defined above
A compound having the general formula III:
(K) _z -(L) _y -H III
In the formula:
K, L, z and y are as defined above.
And optionally reacting with a radioactive metal ion in the form of a permetalate, or a salt of a radioactive cation, each in a known manner, in the presence of a reducing agent, optionally an auxiliary ligand. Reacting with an oxide.
The present invention further provides a diagnostic agent, which comprises a complex of a compound of general formula (I) with a metal ion having 21-32, 37-39, 42-51 and 57-83 atoms. It is characterized by including. By appropriately selecting metal ions, this diagnostic agent is suitable for various diagnostic methods.
When the diagnostic agent of the present invention is applied to radiodiagnosis, the central ion of the complex salt must be radioactive.
These are in particular ions of the elements 27, 29, 30-32, 37-39, 42-51, 62, 64, 70, 75 and 77. The preferred isotope is ^99m Tc, ¹⁸⁶ Re and ¹¹¹ In.
The object of the present invention further includes a method for producing a diagnostic agent according to the present invention.
The production of the radiopharmaceuticals of the invention is carried out by known methods, according to which the complexing agents of the invention of the general formula I and their conjugates are added, if necessary with additives which are common in pharmaceutical technology. In addition, it is dissolved or suspended in an aqueous medium, and then the solution or suspension is optionally lyophilized or sterilized. Suitable additives include, for example, physiologically safe buffers (eg, tromethamine), auxiliary ligand additives (eg, sodium citrate or sodium tartrate), reducing agents (eg, tin (II) -chloride), or If necessary, an electrolyte such as sodium chloride or, if necessary, one or more common pharmaceutical auxiliaries (eg lactose, methylcellulose, mannitol) and / or a surfactant (eg lecithin) , Tween (registered trademark), Myrj (registered trademark)). The additives used must be capable of producing the compounds of the invention in relation to their composition. Upon in vivo nuclear medicine application, the substance of the invention is 1 × 10 ^-Five ~ 5 × 10 ^Four nmol / kg body weight, preferentially 1 x 10 ^-3 ~ 5 × 10 ² Administered in an amount of nmol / kg body weight. Considering an average body weight of 70 kg, the amount of radioactivity in diagnostic applications is 0.05-50 mCi per dose, preferentially 5-30 mCi.
Administration is usually done by intravenous, arterial or peritoneal injection of 0.1 ml 5 ml of a solution of the substance of the invention. Intravenous administration is preferred. Details of such administration methods and dosages are described in, for example, “Radiotracers for Medical Applications”, CRC-Press, Boca Raton, Florida. The compounds of the present invention are in the form of complexes with radioisotopes of the elements 27, 29, 30-32, 37-39, 42-51, 62, 64, 70, 75 and 77, and Can be used for radiation therapy.
The radiopharmaceuticals of the present invention meet various requirements for their suitability as radiopharmaceuticals for radiodiagnosis and radiotherapy. They are therefore highly suitable for the enrichment of target tissues after intravenous administration, allowing non-invasive diagnosis of the corresponding tissues. The water-solubility of the radiopharmaceutical of the present invention is ensured, if necessary, by an auxiliary agent common in the pharmaceutical technology as described above.
Furthermore, the radiopharmaceuticals of the present invention not only show high stability in vitro, but also show high stability in vivo, so that release or exchange of the radionuclide bound to the complex does not occur or clinically It occurs only to the extent that it is not related to
The production of the medicament according to the invention can also be carried out by known methods, wherein the complexing agent according to the invention is added with a reducing agent, preferably a tin (II) salt such as chloride or tartrate, optionally. Additives common in pharmaceutical technology are added and dissolved in an aqueous medium followed by sterile filtration. Suitable additives are, for example, physiologically safe buffers (eg tremethamine), small amounts of electrolyte additives (eg sodium chloride), stabilizers (eg gluconate, phosphate or phosphonate). The medicament of the present invention exists in the form of a solution or lyophilized, and immediately before administration, for example, a solution of Tc-99m-pertechnetate eluted from a commercially available generator, or perrhenium Added to the acid salt solution.
The manufacture of a radiopharmaceutical is provided by the present invention using a Cold Kit. This cold kit comprises a compound of the invention of general formula (I), a reducing agent and optionally one or more auxiliary ligands in solution, in dry form or in lyophilized form. The cold kit further converts a compound of the invention of general formula (I) with a permetalate salt of a radioactive metal ion to form a complex with the metal ion of the compound of the invention of general formula (I). It also includes instructions for use that include reaction regulations.
This cold kit consists of a receptacle that can be closed, showing that a certain amount of endothelin, endothelin derivatives, endothelin subsequences, endothelin analogs and endothelin antagonists are bound to peptides, derivatives, chelates, These are those that can bind metal ions, and this compound ^99m It contains a sufficient amount of reducing agent for labeling with Tc and has the function of producing a radiopharmaceutical, and the implementation of this cold kit is also an object of the present invention.
A further object of the present invention is a method for graphically presenting vascular changes in a disease, which comprises a metal ion having the number of atoms 21-32, 37-39, 42-51 and 57-83 and a general formula ( A complex with I) is applied as a contrast agent.
In one method of performing a radiodiagnostic test, a radiobiopharmaceutical composition is administered in an amount of 0.1 to 30 mCi, preferably 0.5 to 10 mCi, per 70 kg of patient weight, and the radiation emitted by the patient is recorded.
The following examples illustrate the invention.
Example 1
a) Synthesis of Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.
Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp, Barany and Marrifield, The Peptides: Analysis, Biology, Academic Press, New York, 1980; Stewart and Young, Solid- Produced according to Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chemical Co., Rockford. IL, 1984.
Molecular weight: Calculated 1288.4
Observed value 1288 (FAB-MS)
b) Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp ^99m Tc-complex.
Phosphate buffer (Na ₂ HPO _Four 0.5 mol / l, pH 8.5) 0.5 mg of Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp in 300 μl, 0.15 mol of trisodium citrate dihydrate Add 50 μl of the solution and 2.5 L of 0.2 molar tin (II) chloride dihydrate solution. A pertechnetate solution from Mo-99 / Tc-99m generator (0.4 bis 0.9 mCi) is added to the reaction mixture which is then incubated for 10 minutes at room temperature. Label analysis is performed by HPLC.
c) Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp in WHHL rabbits ^99m In vivo and in vitro enrichment of Tc-complexes.
b) Labeled Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp analog 2mCi (1 ml) was given to anesthetized WHHL rabbits (Rompun / Ketavet 1: 2). Administered through the blood vessels. WHHL rabbits exhibit high LDL levels due to lost or missing LDL receptors, and thus spontaneous atherogenic vascular changes. During the experimental period of 5 hours after dosing, still pictures of various exposure times and positions were taken with a gamma camera (Elcint SP4 HR). Rabbits were sacrificed 5 hours after dosing and both aortic autoradiography and Sudan III staining were performed. Atherosclerotic plaques in the area of the aortic arch of a WHHL rabbit were drawn at 10 min pi in vivo. Subsequent autoradiography resulted in marking of the entire aortic wall and atherosclerotic plaque. The enrichment factor between normal and atherosclerotic wall regions was 6-9 depending on plaque formation (Zudan III staining). The results are summarized in Table 1.
Example 2
a) Synthesis of Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.
Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp, Barany and Marrifield, The Peptides: Analysis, Biology, Academic Press, New York, 1980; Stewart and Young, Solid-Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chemical Co., Rockford. IL, 1984.
Molecular weight: Calculated 1337.5
Observed value 1337 (FAB-MS)
b) 99mTc-complex of Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.
0.15 mol of Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp 0.5 mg in 300 μl of phosphate buffer (Na2HPO4, 0.5 mol / l, pH 8.5) Add 50 μl of trisodium citrate dihydrate solution and 2.5 l of 0.2 molar tin (II) chloride dihydrate solution. A pertechnetate solution from Mo-99 / Tc-99m generator (0.4 bis 0.9 mCi) is added to the reaction mixture which is then incubated for 10 minutes at room temperature. Label analysis is performed by HPLC.
c) Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp in WHHL rabbits ^99m In vivo and in vitro enrichment of Tc-complexes.
Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp in WHHL rabbits ^99m In vivo and in vitro enrichment of Tc-complexes was performed as described in Example 1c). The results are summarized in Table 1.
Example 3
a) Synthesis of Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.
Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp, Barany and Marrifield, The Peptides: Analysis, Biology, Academic Press, New York, 1980; Stewart and Young, Solid-Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chemical Co., Rockford. IL, 1984.
Molecular weight: Calculated 1484.68
Observed value 1484 (FAB-MS)
b) Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp ^99m Tc-complex.
Phosphate buffer (Na ₂ HPO _Four 0.5 mol / l, pH 8.5) 0.5 mg of Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp in 300 μl Add 50 μl of trisodium acid dihydrate solution and 2.5 l of 0.2 molar tin (II) chloride dihydrate solution. A pertechnetate solution from Mo-99 / Tc-99m generator (0.4 bis 0.9 mCi) is added to the reaction mixture which is then incubated for 10 minutes at room temperature. Label analysis is performed by HPLC.
c) In vivo and in vitro enrichment of Tc-99m-complex of Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp in WHHL rabbits.
In vivo and in vitro enrichment of the Tc-99m-complex of Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp in WHHL rabbits is described in Example 1c). Was done as described. The results are summarized in Table 1.
Example 4
a) Synthesis of N- (4-hydroxycarboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) -Cys-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.
NH ₂ -Cye-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp (E.Atherton, RCSheppard, Solid phase peptide synthesis, manufactured by Oxford University press, New York, Tokyo) 109.5 mg (0.1 mmol) Under an argon atmosphere, add 30.36 mg (0.3 mmol) of triethylamine and dissolve in 3 ml of dimethylformamide without water. At 0 ° C., 13.21 mg (0.1 mmol) of thiodiglycolic anhydride are added. The solution is subsequently stirred at 0 ° C. for 2 hours and then at room temperature overnight. The crude peptide is precipitated by adding 10 ml of water free diethyl ether and purified by chromatography on silica gel RP-18 (elution: water / 0.1% trifluoroacetic acid, acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid, linear Gradient). A white powder is obtained after lyophilization.
Yield: 48.5 mg (39.5% Th.), White powder
Molecular weight: Calculated 1227.4438
Observed value 1227 (FAB-MS)
b) Tc-99m-complex of N- (4-hydroxycarboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) -Cys-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp .
The peptide conjugate HOOC-CH described in Example 4a) ₂ -S-CH ₂ 1 mg of CONH-Cys-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp was dissolved in 500 μl of disodium hydrogen phosphate buffer (0.01 mol / l, pH 8.5). Add 50 μl of trisodium citrate dihydrate solution. After the addition of the pertechnetate solution (0.4-0.9 mCi) from the Mo-99 / Tc-99m generator, 5 μl of a 0.2 molar tin (II) chloride dihydrate solution is added and the reaction mixture is stirred at room temperature for 10 minutes. Incubate for minutes. The labeling yield is measured by analytical HPLC, which exceeds 95%.
c) Tc- of N- (4-hydroxycarboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) -Cys-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp in WHHL rabbits In vivo and in vitro enrichment of 99m-complex.
WHHL of Tc-99m-complex of N- (4-hydroxycarboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) -Cys-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp In vivo and in vitro enrichment in rabbits was performed as described in Example 1c). The results are summarized in Table 1.
Example 5
a) Synthesis of N- (4-hydroxycarboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) -Cys- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.
NH ₂ 94.8 mg (0.1 mmol) of Cys- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp (produced by E. Atherton, RCS Heppard, Solid phase peptide synthesis, Oxford University press, Oxford, New York, Tokyo) Under an argon atmosphere, add 30.36 mg (0.3 mmol) of triethylamine and dissolve in 3 ml of dimethylformamide without water. At 0 ° C., 13.21 mg (0.1 mmol) of thiodiglycolic anhydride are added. The solution is subsequently stirred at 0 ° C. for 2 hours and then at room temperature overnight. The crude peptide is precipitated by adding 10 ml of water free diethyl ether and purified by chromatography on silica gel RP-18 (elution: water / 0.1% trifluoroacetic acid, acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid, linear Gradient). A white powder is obtained after lyophilization.
Yield: 39.3 mg (36.4% Th.), White powder
Molecular weight: Calculated 1080.2738
Observed value 1080 (FAB-MS)
b) Tc-99m-complex of N- (4-hydroxycarboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) -Cys- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.
The peptide conjugate HOOC-CH described in Example 5a) ₂ -S-CH ₂ 1 mg of CONH-Cys- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp is dissolved in 500 μl of disodium hydrogen phosphate buffer (0.01 mol / 1, pH 8.5), and 0.15 mol of citric acid Add 50 μl of trisodium dihydrate solution. After the addition of the pertechnetate solution (0.4-0.9 mCi) from the Mo-99 / Tc-99m generator, 5 μl of a 0.2 molar tin (II) chloride dihydrate solution is added and the reaction mixture is stirred at room temperature for 10 minutes. Incubate for minutes. The labeling yield is measured by analytical HPLC, which exceeds 95%.
c) Tc-99m- of N- (4-hydroxycarboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) -Cys- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp in WHHL rabbits In vivo and in vitro concentration of the complex.
In WHHL rabbits of Tc-99m-complex of N- (4-hydroxycarboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) -Cys- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp In vivo and in vitro enrichment was performed as described in Example 1c). The results are summarized in Table 1.
Example 6
a) Synthesis of N- (4-hydroxycarboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) -Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.
NH ₂ Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp (manufactured by E. Atherton, RCS Heppard, Solid phase peptide synthesis, Oxford University press, Oxford, New York, Tokyo) 89.9 mg (0.1 mmol) under argon atmosphere Add 30.36 mg (0.3 mmol) of triethylamine and dissolve in 3 ml of dimethylformamide without water. At 0 ° C., 13.21 mg (0.1 mmol) of thiodiglycolic anhydride are added. Subsequently, it is stirred at 0 ° C. for 2 hours and then at room temperature overnight. The crude peptide is precipitated by adding 10 ml of water free diethyl ether and purified by chromatography on silica gel RP-18 (elution: water / 0.1% trifluoroacetic acid, acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid, linear Gradient). A white powder is obtained after lyophilization.
Yield: 26.9 mg (26.1% Th.), White powder
Molecular weight: Calculated 1031.2038
Observed value 1031 (FAB-MS)
b) Tc-99m-complex of N- (4-hydroxycarboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) -Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.
The peptide conjugate HOOC-CH described in Example 6a) ₂ -S-CH ₂ 1 mg of CONH-Cys-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp is dissolved in 500 μl of disodium hydrogen phosphate buffer (0.01 mol / l, pH 8.5), and 0.15 mol of trisodium citrate dihydrate solution Add 50 μl. After the addition of the pertechnetate solution (0.4-0.9 mCi) from the Mo-99 / Tc-99m generator, 5 μl of a 0.2 molar tin (II) chloride dihydrate solution is added and the reaction mixture is stirred at room temperature for 10 minutes. Incubate for minutes. The labeling yield is measured by analytical HPLC, which exceeds 95%.
c) In vivo and of Tc-99m-complex of N- (4-hydroxycarboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) -Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp in WHHL rabbits In vitro concentration.
In vivo and in vitro enrichment of Tc-99m-complexes of N- (4-hydroxycarboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) -Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp in WHHL rabbits Was performed as described in Example 1c). The results are summarized in Table 1.
Example 7
a) Synthesis of N- (mercaptoacetyl) Gly-Gly-Asp-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.
NH ₂ Gly-Gly-Asp-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp (produced by E. Atherton, RCS Heppard, Solid phase peptide synthesis, Oxford University press, Oxford, New York, Tokyo) 122.1 mg (0.1 mmol) is dissolved in 3 ml of dimethylformamide without water by adding 40.48 mg (0.4 mmol) of triethylamine under an argon atmosphere. A solution of S-trityl-mercaptoacetic acid-N-hydroxysuccinimide ester in 3 ml of water-free dimethylformamide at 0 ° C. [Preparation: 36.79 mg (0.11 mmol) of S-trityl-mercaptoacetic acid was added to 12.66 mg of N-hydroxysuccinimide. (0.11 mmol) is added and dissolved in 2 ml of dimethylformamide without water. Add a solution of 22.70 mg (0.11 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide in 1 mL of dimethylformamide without water and incubate for 30 minutes. After filtration, the S-trityl-mercaptoacetic acid-N-hydroxysuccinimide ester solution produced in the system can be used for coupling]. Subsequently, it is stirred at 0 ° C. for 2 hours and then at room temperature overnight. The untreated peptide is precipitated by adding 20 ml of water-free diethyl ether and stirred for 10 minutes in 5 ml trifluoroacetic acid / 5% water / 22 mg tributylsilane under an argon atmosphere. Untreated peptide without protecting group is separated by precipitation with 25 ml of diethyl ether without water and purified by chromatography on silica gel RP-18 (elution: water / 0.1% trifluoroacetic acid, acetonitrile / 0.1% Trifluoroacetic acid, linear gradient). A white powder is obtained after lyophilization.
Yield: 56.3 mg (43.4% Th.), White powder
Molecular weight: Calculated 1296.4551
Observed value 1296 (FAB-MS)
b) Tc-99m-complex of N- (mercaptoacetyl) -Gly-Gly-Asp-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.
Peptide conjugate HS-CH as described in Example 7a) ₂ -1 mg of CONH-Gly-Gly-Asp-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp was dissolved in 500 μl of disodium hydrogenphosphate buffer (0.01 mol / l, pH 8.5). Add 50 μl of 0.15 molar trisodium citrate dihydrate solution. After the addition of the pertechnetate solution (0.4-0.9 mCi) from the Mo-99 / Tc-99m generator, 5 μl of a 0.2 molar tin (II) chloride dihydrate solution is added and the reaction mixture is stirred at room temperature for 10 minutes. Incubate for minutes. The labeling yield is measured by analytical HPLC, which exceeds 95%.
c) In vivo and in vitro enrichment of Tc-99m-complexes of N- (mercaptoacetyl) -Gly-Gly-Asp-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp in WHHL rabbits.
In vivo and in vitro enrichment of Tc-99m-complex of N- (mercaptoacetyl) -Gly-Gly-Asp-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp in WHHL rabbits is described in Example 1c). Was done as described. The results are summarized in Table 1.
Example 8
a) Synthesis of N- (mercaptoacetyl) -Gly-Gly-Asp- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.
NH ₂ -Gly-Gly-Asp- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp (E.Atherton, RCSheppard, Solid phase peptide synthesis, manufactured by Oxford University press, Oxford, New York, Tokyo) 107.4 mg ( 0.1 mmol) is dissolved in 3 ml of dimethylformamide without water by adding 40.48 mg (0.4 mmol) of triethylamine under an argon atmosphere. A solution of S-trityl-mercaptoacetic acid-N-hydroxysuccinimide ester in 3 ml of water-free dimethylformamide at 0 ° C. [Preparation: 36.79 mg (0.11 mmol) of S-trityl-mercaptoacetic acid was added to 12.66 mg of N-hydroxysuccinimide. (0.11 mmol) is added and dissolved in 2 ml of dimethylformamide without water. Add a solution of 22.70 mg (0.11 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide in 1 mL of dimethylformamide without water and incubate for 30 minutes. After filtration, the S-trityl-mercaptoacetic acid-N-hydroxysuccinimide ester solution so prepared in the system can be used for coupling]. Subsequently, it is stirred at 0 ° C. for 2 hours and then at room temperature overnight. The untreated peptide is precipitated by adding 20 ml of water-free diethyl ether and stirred for 10 minutes in 5 ml trifluoroacetic acid / 5% water / 22 mg tributylsilane under an argon atmosphere. Untreated peptide without protecting group is separated by precipitation with 25 ml of diethyl ether without water and purified by chromatography on silica gel RP-18 (elution: water / 0.1% trifluoroacetic acid, acetonitrile / 0.1% Trifluoroacetic acid, linear gradient). A white powder is obtained after lyophilization.
Yield: 46.3 mg (40.3% Th.), White powder
Molecular weight: Calculated 1049.2851
Observed value 1049 (FAB-MS)
b) Tc-99m-complex of N- (mercaptoacetyl) -Gly-Gly-Asp- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.
Peptide conjugate HS-CH as described in Example 8a) ₂ 1 mg of CONH-Gly-Gly-Asp- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp is dissolved in 500 μl of disodium hydrogen phosphate buffer (0.01 mol / 1, pH 8.5), 0.15 Add 50 μl of molar trisodium citrate dihydrate solution. After the addition of pertechnetate solution (0.4-0.9 mCi) from Mo-99 / Tc-99m generator, 5 μl of 0.2 molar tin (II) chloride dihydrate solution is added and incubated at room temperature for 10 minutes. The labeling yield is measured by analytical HPLC, which exceeds 95%.
c) In vivo and in vitro enrichment of Tc-99m-complex of N- (mercaptoacetyl) -Gly-Gly-Asp- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp in WHHL rabbits.
In vivo and in vitro enrichment of Tc-99m-complex of N- (mercaptoacetyl) -Gly-Gly-Asp- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp in WHHL rabbits is described in Example 1c). Was done like that. The results are summarized in Table 1.
FIG. 1 shows WHHL rabbits 0.5 hours after intravenous administration of Tc-99m-Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp 74MBq. ) And a New Zealand control rabbit (B) left side scintigram is shown (see Example 3c). In contrast to the control rabbit (B), enrichment activity can be observed in vivo in the region of the aortic arch, left carotid artery and abdominal aorta of the WHHL rabbit (A).
FIG. 2 shows that the right carotid artery is Fogarty catheter 0.5 hours after intravenous administration of Tc-99m-Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp 74MBq. Ventral scintigrams (A) of New Zealand rabbits exposed 4 weeks early with the assistance of thoracic and autodiagrams (B1) and Sudan III staining of thoracic aorta, exposed and untreated carotid arteries removed 5 hours after intravenous administration (B2) is shown. (See Example 3c). The order of B1 and B2 incised tissues is as follows from left to right: thoracic aorta, right exposed carotid artery, left untreated carotid artery.
The right carotid artery with severe arteriosclerosis was detected in vivo (A). The in vitro test (B) confirms a high correlation between high and selective deposition of the drug in the exposed right carotid artery compared to the untreated left carotid artery.

Claims (4)

The following compounds:
Tc-99m-complex of Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp Tc-99m-complex,
Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp Tc-99m-complex,
Tc-99m-complex of N- (4-carboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) -Cys-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp;
A Tc-99m complex of N- (4-carboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) -Cys- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp;
A Tc-99m complex of N- (4-carboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) -Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp;
N- (mercaptoacetyl) -Gly-Gly-Asp-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp Tc-99m-complex, or N- (mercaptoacetyl) -Gly-Gly-Asp -(D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp Tc-99m-complex. The following compounds:
Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp Re-complex,
Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp Re-complex,
Re-complex of Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
Re-complex of N- (4-carboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) -Cys-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
Re-complex of N- (4-carboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) -Cys- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
Re-complex of N- (4-carboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) -Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp;
N- (mercaptoacetyl) -Gly-Gly-Asp-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp Re-complex, or N- (mercaptoacetyl) -Gly-Gly-Asp- ( D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp Re-complex. The following compounds:
Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
Asp-Gly-Gly-Cys-Gly-Cys-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
N- (4-carboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) -Cys-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
N- (4-carboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) -Cys- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
N- (4-carboxy-1-oxo-3-thia-but-1-yl) -Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp,
N- (mercaptoacetyl) -Gly-Gly-Asp-Phe- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp, or N- (mercaptoacetyl) -Gly-Gly-Asp- (D-Trp) -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp. A diagnostic agent characterized in that it comprises a compound according to any one of claims 1 to 3 and, optionally, a suitable adjuvant or excipient.

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