JP3649765B2 - Novel glycerol kinase and process for producing the same - Google Patents

Description

以上のように本菌株の主性状はグラム陰性の桿菌で非運動性であり、カタラーゼ、オキシダーゼ、フォスファターゼ陽性でグルコースを酸化的に分解し、酸を産生し、ＧＣｍｏｌ％は３５．７±１．０％、キノンタイプはＭＫ−６、芽胞非形成であり、これらの主性状をＢｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１，Ｖｏｌ．２，Ｖｏｌ．３に対比した結果、フラボバクテリウム属に属する微生物と判明した。そこで、フラボバクテリウム属の中から本菌株と似た４菌種を選び本菌株と比較した。
Ａ；フラボバクテリウム・ブレブ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）。
Ｂ；フラボバクテリウム・グレウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｅｕｍ）。
Ｃ；フラボバクテリウム・インドロゲネス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｄｏｌｏｇｅｎｅｓ）。
Ｄ；フラボバクテリウム・メニンゴセプティクム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）。
【００１１】

性状の比較から本菌株はフラボバクテリウム・メニンゴセプティクムに属すると判断された。さらに、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼイション法によりＤＮＡ相同性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）測定を行った。測定方法はマイクロプレートを用いて蛍光法により分光光学的に定量測定を行った。また、ハイブリダイゼイションの反応温度はＧＣ含量からＤＮＡの融解温度を計算し４０℃で行った。比較対象として以下の菌株を用いて行った。
Ｎｏ．１株：フラボバクテリウム・ブレブＩＦＯ−１４９３株：タイプカルチャー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅＩＦＯ−１４９３：タイプカルチャー）。
Ｎｏ．２株：フラボバクテリウム・グレウムＩＦＯ−１５０５４株：タイプカルチャー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｅｕｍ ＩＦＯ−１５０５４：タイプカルチャー）。
Ｎｏ．３株：フラボバクテリウム・インドロゲネスＩＦＯ−１４９４４株：タイプカルチャー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｄｏｌｏｇｅｎｅｓ ＩＦＯ−１４９４４：タイプカルチャー）。
Ｎｏ．４株：フラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＩＦＯ−１２５３５株：タイプカルチャー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍＩＦＯ−１２５３５：タイプカルチャー）
ＤＮＡ相同性（％）

以上の結果から本菌株は、ＤＮＡ相同性がフラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＩＦＯ−１２５３５株：タイプカルチャー（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ ＩＦＯ−１２５３５：タイプカルチャー）と判断基準である７０％以上であることから前記知見と合わせて同種と判定し、本菌株をフラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４株と同定命名し、工業技術院生命工学技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６８として寄託したものである。
【００１２】
次いで、フラボバクテリウム属に属するグリセロールキナーゼ生産菌からのグリセロールキナーゼの精製および、諸性質の検討を行った。
本発明を実施するにあたり、その培養形態としては液体培養、個体培養いずれも可能であるが工業的には通気撹拌培養を行うのが有利である。また使用する培養源としては一般に微生物培養に用いられる炭素源、窒素源、無機塩及びその他の微量栄養源の他、フラボバクテリウム属に属する微生物の利用できる栄養源であればすべて使用できる。
【００１３】
炭素源としては、例えばグルコース、フルクトース、サッカロース、キシロース、マルトース、グリセロール、デキストリン、でんぷん、アミノ酸等の他、脂肪酸、油脂、有機酸などが単独でまたは組み合わせて用いられる。窒素源としては、例えば無機窒素源、有機窒素源のいずれも使用可能であり、無機栄養源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素、硝酸ソーダ、塩化アンモニウム等が挙げられる。また有機窒素源としては、例えば大豆、米、トウモロコシ、小麦等の粉、コーンスティープリカー、ペプトン、肉エキス、カゼイン、アミノ酸、酵母エキス、バクトソイトン等が挙げられる。
【００１４】
無機塩及び微量栄養素としては、例えばリン酸、マグネシュウム、カリウム、鉄、カルシウム、亜鉛等の塩類の他ビタミン、非イオン性界面活性剤、消泡剤等の菌の生育やグリセロールキナーゼの生産を促進するものであれば必要に応じて使用できる。
培養は好気的条件で、培養温度は菌が発育し、グリセロールキナーゼが産生する範囲であればよく、通常１５℃〜３７℃、好ましくは２５℃〜３５℃である。培養時間は条件により異なるがグリセロールキナーゼが最も産生される時間まで培養すればよく、通常２４〜１００時間程度である。
【００１５】
グリセロールキナーゼは主としてその菌体内に含有、蓄積されており、その菌体内から抽出すればよい。グリセロールキナーゼの抽出法を例示すればまず培養物を固液分離し、得られた湿潤菌体をリン酸緩衝液やトリス−塩酸緩衝液などの溶液に分散し、リゾチーム処理、超音波処理、フレンチプレス処理、ダイノミル処理などの種々の菌体処理手段を適宜選択組み合わせて、粗製のグリセロールキナーゼ含有液を得る。
【００１６】
粗製のグリセロールキナーゼ含有液から公知のタンパク質や酵素などの単離、精製手段を用いて精製グリセロールキナーゼを得る。例えば、粗製のグリセロールキナーゼ含有液にアセトン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒による分別沈澱法、硫安、食塩などによる塩析法などを適用してグリセロールキナーゼを沈澱させ、回収する。
【００１７】
さらに、この沈澱物を必要に応じ透析、等電点沈澱を行った後、電気泳動法などで単一の帯を示すまで、イオン交換体、ゲル濾過剤、吸着体などを用いるカラムクロマトグラフィーなどにより精製する。また、これらの方法を適当に組み合わせることによりグリセロールキナーゼの精製度が上がる場合は適宜組み合わせて行うことができる。
【００１８】
これらの方法によって得られる酵素は安定化剤として、各種の塩類、糖類、タンパク質、脂質、界面活性剤などを加えあるいは加える事なく、限外濾過濃縮、凍結乾燥の方法により、液状または固形のグリセロールキナーゼを得ることができ、また、適宜凍結乾燥を行ってもよく、この場合安定化剤としてサッカロース、マンニトール、食塩、アルブミンなどを０．５〜１０％程度添加してもよい。
【００１９】
つぎに本発明で得られるグリセロールキナーゼの理化学的性質及び酵素活性測定法を述べる。
グリセロールキナーゼの活性測定法
０．２Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を０．２ｍｌ、５％のグリセロールを０．１ｍｌ、０．１ＭのＡＴＰを０．０２ｍｌ、０．１ＭのＭｇＣｌ₂を０．０４ｍｌ、４５Ｕ／ｍｌのペルオキシダーゼ（シグマ社製）を０．１ｍｌ、０．３％の４−アミノアンチピリンを０．１ｍｌ、０．２５％のフェノールを０．１ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌのグリセロホスフェイトオキシダーゼ（旭化成社製）を０．２ｍｌ、および蒸留水を０．１４ｍｌよりなる反応液１ｍｌを３７℃で１分間予備加温した後、０．０２ｍｌの酵素液を添加して１０分間反応させる。反応後、０．５％のＳＤＳを２ｍｌ添加して反応を停止させ、５分以内に層長１ｃｍセルを用いて波長５００ｎｍにおける吸光度を測定する（Ａｓ）。また、盲検として酵素液のかわりに蒸留水０．０２ｍｌを用いて同一の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）、この酵素液使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単位は３７℃で１分間に１μモルのグリセロホスフェイトを生成させる酵素量とし、計算式は下記の通りである。
【００２０】
【数１】

【００２１】
理化学的性質
（１）酵素作用：基質としてグリセロールを用いた酵素作用を以下に示す。
【００２２】
【化１】

【００２３】
（２）基質特異性：グリセロールに基質特異性を示す。各種基質に対する特異性は表１の通りである。
【００２４】
【表１】

【００２５】
（３）Ｋｍ値：３．９ｘ１０^-2±０．５ｘ１０^-2ｍＭ（グリセロールに対して）、５．３ｘ１０^-2±０．５ｘ１０^-2ｍＭ（ＡＴＰに対して）
（４）等電点：４．４±０．５（キャリアー−アンホラインを用いた電気泳動法にて）
（５）分子量：１４５０００±５０００（ＴＳＫ Ｇ−３０００ＳＷによるゲル濾過法にて）、５００００±５０００（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法にて）
（６）至適ｐＨ
前記酵素活性測定法にしたがって至適ｐＨを求めたもので、その結果を図１に示した。ｐＨ４．５〜６．５の範囲は１００ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ５．５〜７．５の範囲は１００ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ６．５〜７．５の範囲は１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．０〜８．５の範囲は１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．５〜１１．０の範囲は１００ｍＭのグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を使用した場合の活性値を示すもので、至適ｐＨは７．５〜８であった。
（７）ｐＨ安定性
１００ｍＭ各種緩衝液（グリセロールキナーゼ１Ｕ／ｍｌ）を３７゜Ｃ、６０分間処理し、その残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果を図２に示す。ｐＨ０．５〜４．０は１００ｍＭのクラークアンドルブス緩衝液、ｐＨ３．５〜７．０は１００ｍＭの酢酸緩衝液、ｐＨ６．５〜８．０は１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ８．０〜９．０は１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９．０〜１１．０は１００ｍＭのグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を使用した。ｐＨ３〜１１の範囲で最も良好な安定性を示した。
（８）至適温度
前記酵素活性測定法に従って、温度を３７゜Ｃ〜９５゜Ｃの範囲で変化させて至適温度を求めた結果は図３に示すとおりであり、本酵素の至適温度は８０゜Ｃであった。
（８）熱安定性
１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．０）（グリセロールキナーゼ１Ｕ／ｍｌ）を各温度で１０分間加熱処理した後の残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果、図４に示すとおり少なくとも６０゜Ｃまで１００％安定で、７０℃、１０分間の処理では８０％以上の残存活性を保持していた。
（９）金属イオンの影響
各種金属イオン（１ｍＭ）の本酵素活性への影響について調べた結果は表２に示すとおりで、カルシウムイオンによる弱い阻害がみられた。
【００２６】
【表２】

【００２７】
（１０）Ｎ末端アミノ酸配列
Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−
（１１）保存安定性
液状化試薬の対応を目的として、０．０５％のＮａＮ₃（防腐剤）を含む、２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に、本発明グリセロールを０．８Ｕ／ｍｌの濃度となるように調製し、３７℃で２日後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後に残存活性を前記活性測定法で測定した結果、それぞれ、９４％、９１％、８１％、７１％、６０％の活性を保持していた。このことから、本酵素は安定化剤（例えばＢＳＡや糖類）の非存在下、３７℃、２週間で８０％以上の活性を保持していた。
【００２８】
以上の結果から、本発明グリセロールキナーゼと従来から知られているグリセロールキナーゼとの性質を比較すると、次のようになる。
（ＡＴＰに対するＫｍ値）
本酵素：０．０５３ｍＭ
ストレプトマイセス・キャナス由来：０．２ｍＭ
セルロモナス・エスピー由来：０．４３ｍＭ
アルスロバクター・アルトロシアネウス由来：３．７ｍＭ
（熱安定性）
本酵素：７０℃１０分間の熱処理で８０％以上の活性を保持していた。
【００２９】
セルロモナス・キャナス由来：ｐＨ７．５、４５℃、１５分間の処理で、９６％の残存活性を保持する。７０℃の処理では完全に失活する。
アルスロバクター・アルトロシアネウス由来：ｐＨ７．０、１５分間の処理で４５℃以下の温度で安定。
バチルス・ステアロサーモフィラス由来：６５℃、１０分間の熱処理で１０％の残存活性であった（図５）。
（至適温度）
本酵素：８０℃
セルロモナス・エスピー由来：５０℃付近
アルスロバクター・エスピー由来：５０℃付近
バチルス・ステアロサーモフィラス由来：６５℃±５℃
上記のように本発明グリセロールキナーゼは従来より知られている酵素とは明かに異なる性質を持っており、特に熱安定性に関しては最も優れた安定性を保持していた。
【００３０】
【実施例】
ついで、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明は何らこれにより限定されるものではない。
【００３１】
【実施例１】
フラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４株を１．０％のグリセロール、３．０％の肉エキス、０．５％のバクトソイトン（ディフコ社製）からなる培地（ｐＨ７．０）を５００ｍｌの三角フラスコに１５０ｍｌずつ分注したものに植菌した後、２８℃、３０時間培養を行い、種培養液を得た。
【００３２】
種培養液を上記と同一組成培地に消泡剤を加えた培地（ｐＨ７．０）２０ｌのジャーファーメンター４基にそれぞれ２本ずつ添加し、２８℃で２２時間培養した。培養終了後、培養物を４０００ｒｐｍで遠心し、菌体３．０Ｋｇを回収した。
この菌体に１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．３％のトリトンＸ−１００、２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）を含む、０．１％のリゾチーム溶液９ｌを加え、３７℃で９０分間反応させて可溶化を行った。その後、これを４０００ｒｐｍで２０分間遠心し、不溶物を除去してその上清９ｌ（７２０００Ｕ）を得た。
【００３３】
ついでこの上清に５．０％の硫酸プロタミン９０ｍｌを加えて沈澱物を遠心除去し、さらにその上清を５０℃で３０分間加熱し、沈澱物を遠心除去した。その遠心上清を２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて一夜透析し、Ｑ−セファロース（２．７×３０ｃｍ）（ファルマシア社製）イオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は塩化ナトリウムの０〜０．５Ｍのリニアグラジエントにより行い、０．２〜０．３Ｍの塩化ナトリウム溶出画分（２９０００Ｕ）を回収した。
【００３４】
この酵素溶液に２．５Ｍの濃度となるように塩化ナトリウムを溶解し、オクチルセファロース（２．６×２０ｃｍ）（ファルマシア社製）の疎水クロマトグラフィーを行った。溶出は２．５Ｍ〜０Ｍの塩化ナトリウムのリニアグラジエントにより行い、０Ｍの塩化ナトリウムの溶出画分（２５０００Ｕ）を回収した。ついでこの酵素液を２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて一夜透析し、ハイドロキシアパタイト（１．６×２６．５ｃｍ）（ペンタックス社製）クロマトグラフィーを行った。溶出は５〜０．２Ｍのリン酸緩衝液によるリニアグラジエントにより行い、０．１〜０．１２Ｍのリン酸緩衝液の溶出画分（１６３００Ｕ）を回収した。
【００３５】
ついでこの酵素液を２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて一夜透析し、ＤＥＡＥ−セファロース（１．６×２０ｃｍ）（ファルマシア社製）イオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は０〜０．５Ｍの塩化ナトリウムによるリニアグラジエントにより行い、０．２〜０．３Ｍの塩化ナトリウムの溶出画分（１２０００Ｕ）を回収し、２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に一夜透析後、ＢＳＡを１％となるように添加して、凍結乾燥し、精製グリセロールキナーゼ（１２０００Ｕ、９．９Ｕ／ｍｇ）を得た。
【００３６】
このようにして得られたグリセロールキナーゼの理化学的性質は前記した通りである。
【００３７】
【参考例１】
セラチア・マセセンス・ＩＦＯ−３７３６株を２．０％のグリセロール、２．０％の酵母エキスからなる培地（ｐＨ７．０）を５００ｍｌの三角フラスコに１５０ｍｌずつ分注したものに植菌した後、２８℃、３０時間培養を行った。
培養終了後、培養物を８０００ｒｐｍで遠心し、菌体３０ｍｇを回収した。得られた菌体を１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）３０ｍｌに懸濁し、超音波破砕によって可溶化を行った。
【００３８】
その後、可溶化液を１６０００ｒｐｍで遠心し、不溶物を除去した上清２９ｍｌ（７０Ｕ）を得た。次いで、遠心上清を８ｌの１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液に一夜、透析した後、Ｑ−セファロース（２ｘ８ｃｍ）（ファルマシア社製）イオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は塩化ナトリウムの０〜０．５Ｍのリニアグラジエントにより行い、０．２〜０．３Ｍの塩化ナトリウム溶出画分（６７Ｕ）を回収し、粗製グリセロールキナーゼ（６７Ｕ、２５Ｕ／ｍｇ）を得た。
理化学的性質
（１）酵素作用および基質特異性：グリセロールに対する本酵素の酵素作用および基質特異性はフラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６８）株と同じであった。
（２）Ｋｍ値：２．４ｘ１０^-2±０．５ｘ１０^-2ｍＭ（グリセロールに対して）、５．０ｘ１０^-1±０．５ｘ１０^-1ｍＭ（ＡＴＰに対して）
（３）至適ｐＨ：７．５（５０ｍＭのＰＩＰＥＳ緩衝液）
【００３９】
【参考例２】
シュードモナス・フルオレッセンス・ＩＦＯ−３９２５株を２．０％のグリセロール、２．０％の酵母エキスからなる培地（ｐＨ７．０）を５００ｍｌの三角フラスコに１５０ｍｌずつ分注したものに植菌した後、２８℃、３０時間培養を行った。
【００４０】
培養終了後、培養物を８０００ｒｐｍで遠心し、菌体３０ｍｇを回収した。得られた菌体を１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）３０ｍｌに懸濁し、超音波破砕によって可溶化を行った。その後、可溶化液を１６０００ｒｐｍで遠心し、不溶物を除去した上清２９ｍｌ（１３０Ｕ）を得た。
次いで、遠心上清を８ｌの１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液に一夜、透析した後、Ｑ−セファロース（２ｘ８ｃｍ）（ファルマシア社製）イオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は塩化ナトリウムの０〜０．５Ｍのリニアグラジエントにより行い、０．２〜０．３Ｍの塩化ナトリウム溶出画分（１１４Ｕ）を回収し、粗製グリセロールキナーゼ（１１４Ｕ、３０Ｕ／ｍｇ）を得た。
理化学的性質
（１）酵素作用および基質特異性：グリセロールに対する本酵素の酵素作用および基質特異性はフラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６８）株と同じであった。
（２）Ｋｍ値：２．０ｘ１０^-2±０．５ｘ１０^-2ｍＭ（グリセロールに対して）、２．４±０．５ｍＭ（ＡＴＰに対して）
（３）至適ｐＨ：７．５（５０ｍＭのＰＩＰＥＳ緩衝液）
【００４１】
【参考例３】
シュードモナス・プチダ・ＩＦＯ−１２６５３株を２．０％のグリセロール、２．０％の酵母エキスからなる培地（ｐＨ７．０）を５００ｍｌの三角フラスコに１５０ｍｌずつ分注したものに植菌した後、２８℃、３０時間培養を行った。
培養終了後、培養物を８０００ｒｐｍで遠心し、菌体３０ｍｇを回収した。得られた菌体を１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）３０ｍｌに懸濁し、超音波破砕によって可溶化を行った。その後、可溶化液を１６０００ｒｐｍで遠心し、不溶物を除去した上清２９ｍｌ（１９０Ｕ）を得た。
【００４２】
次いで、遠心上清を８ｌの１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液に一夜、透析した後、Ｑ−セファロース（２ｘ８ｃｍ）（ファルマシア社製）イオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は塩化ナトリウムの０〜０．５Ｍのリニアグラジエントにより行い、０．２〜０．３Ｍの塩化ナトリウム溶出画分（１１０Ｕ）を回収し、粗製グリセロールキナーゼ（１１０Ｕ、３０Ｕ／ｍｇ）を得た。
理化学的性質
（１）酵素作用および基質特異性：グリセロールに対する本酵素の酵素作用および基質特異性はフラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６８）株と同じであった。
（２）Ｋｍ値：２．０ｘ１０^-2±０．５ｘ１０^-2ｍＭ（グリセロールに対して）、２．０±０．５ｍＭ（ＡＴＰに対して）
（３）至適ｐＨ：７．５（５０ｍＭのＰＩＰＥＳ緩衝液）
【００４３】
【発明の効果】
本発明により、熱安定性の良いグリセロールキナーゼおよびその微生物学的製造法を提供できるものであり、本酵素を用いるグリセライドやリパーゼ活性などの測定のための有用かつ熱安定性の良い液状化試薬を可能とする測定用酵素を提供できた。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明のグリセロールキナーゼの至適ｐＨ曲線を示す。
【図２】図２は本発明のグリセロールキナーゼのｐＨ安定曲線を示す。
【図３】図３は本発明のグリセロールキナーゼの至適温度曲線を示す。
【図４】図４は本発明のグリセロールキナーゼの熱安定曲線を示す。
【図５】図５は本発明のグリセロールキナーゼおよびバチルス・ステアロサーモフィラス由来グリセロールキナーゼの熱安定曲線を示す。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention comprises culturing a glycerol kinase-producing bacterium belonging to the genus Glycerol kinase and Flavobacterium in a medium, which retains an activity of 80% or more by heat treatment at 70 ° C. for 10 minutes, The present invention relates to a method for producing glycerol kinase obtained by collecting glycerol kinase from the culture.
[0002]
[Prior art]
Glycerol kinase is known as an enzyme (enzyme number 2.7.1.30) that catalyzes the reaction of producing 1 mol of glycerol and 1 mol of ATP and 1 mol of glycerol-3-phosphate using glycerol as a substrate. (Enzyme Handbook, pages 341-342, Asakura Shoten Co., Ltd., published in 1982). Also, as a glycerol kinase producing bacterium, Streptomyces canus (Japanese Patent Laid-Open No. Sho 55-162987), Cellulomonas sp. (Japanese Patent Laid-Open No. 56-121484), Bacillus stearothermophilus (Japanese Patent Laid-Open No. 53-26389), Arthrobacter SP (Japanese Patent Laid-Open No. 59-2688), and the like are known. It is used in the field of clinical diagnostics.
[0003]
In addition, the present inventors screened for superior glycerol kinase in the field of clinical diagnostics, and later described Serratia macescens IFO-3736 strain, Pseudomonas fluorescens IFO-3925 strain, Pseudomonas putida IFO-12653 strain. When cultured in the medium of the reference example, it was found that glycerol kinase was produced at culture titers of 0.5 U / ml, 0.8 U / ml and 1.30 U / ml, respectively. It was not excellent in thermal stability.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Glycerol kinase is conventionally used as a reagent for measuring glyceride or lipase activity in combination with glycerol-3-phosphate oxidase or glycerol-3-phosphate dehydrogenase in the presence of lipase or glyceride in the clinical diagnostic field. It has been used as a reagent for measuring glycerol by enzymatic reaction.
[0005]
However, in recent years, in the field of clinical diagnostics, it has been required that the reagent be a liquid product rather than a lyophilized product, and it can be used for glycerol kinase with excellent storage stability and industrial production that can handle liquefied reagents. It has been desired to develop a glycerol kinase having excellent heat stability that can be produced.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention, as a result of diligent research seeking a glycerol kinase excellent in thermal stability and, more preferably, stable glycerol kinase capable of handling liquefaction reagents and a production method capable of industrial production thereof, It has been found for the first time that a microorganism identified as Flavobacterium meningocepticum GK-54 strain isolated from field soil in Ono-cho, Takata-gun, Shizuoka Prefecture has an excellent ability to produce glycerol kinase. Was completed.
[0007]
The present invention has been completed on the basis of the above-mentioned findings, and it is possible to add glycerol kinase having good heat stability that retains an activity of 80% or more by heat treatment at 70 ° C. for 10 minutes, and preferably without adding a stabilizer. Culturing glycerol kinase having excellent storage stability that retains 80% or more of activity at 37 ° C. for 2 weeks and glycerol kinase-producing bacteria belonging to the genus Flavobacterium in a medium, and collecting glycerol kinase from the culture It is a manufacturing method of the characteristic glycerol kinase.
[0008]
The present invention is described in detail below.
First, the glycerol kinase-producing bacterium of the present invention is not limited as long as it is a microorganism having the ability to produce glycerol kinase belonging to the genus Flavobacterium, and is a variant or mutant strain having glycerol kinase-producing ability. Preferably, GK-54 strain belonging to the genus Flavobacterium can be mentioned. The bacteriological properties of this strain are as follows.
[0009]
In the identification of this strain, the identification experiment was conducted according to the Medical Bacterial Identification Guide (2nd edition) and Microbiological Methods (Volume 3), and the experimental results were obtained as a medical bacteria identification guide (2nd edition), Bergey ' s Manual of Systematic Bacteriology Vol. 1, Vol. 2, Vol. 3, Int. J. et al. Syst. Identification was performed relative to Bacteriology.
[0010]
Characteristics of growth It grows well on normal agar plate lines. The surface is smooth. The edges are round. It exhibits yellow to orange color. Opacity. There is gloss.
It grows well on ordinary agar slope medium lines. The surface is smooth. The edges are round. It exhibits yellow to orange color. Opacity. There is gloss.
Liquid medium grows well and grows uniformly.
Litmus milk and BCP media Litmus was not reduced, but liquefaction and coagulation were observed.
GCmol% of DNA
35.7 ± 1.0% (HPLC)
Main isoprenoid quinone MK-6
Morphological features A single long-clad bacterium with a rounded end, and a size of 0.4 to 0.7 × 1.8 to 2.5 μm. There is no mobility. No spore formation.

As described above, the main characteristics of this strain are gram-negative bacilli and non-motile, which are positive for catalase, oxidase and phosphatase, oxidatively degrade glucose and produce acid, and GCmol% is 35.7 ± 1. 0%, quinone type is MK-6, non-spore-forming, and their main properties are described in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol. 1, Vol. 2, Vol. As a result of comparison with 3, it was found to be a microorganism belonging to the genus Flavobacterium. Therefore, four strains similar to this strain were selected from the genus Flavobacterium and compared with this strain.
A: Flavobacterium breve.
B: Flavobacterium greum.
C; Flavobacterium indologenes.
D: Flavobacterium meningosepticum.
[0011]

From the comparison of properties, this strain was judged to belong to Flavobacterium meningocepticum. Furthermore, DNA homology was measured by the DNA-DNA hybridization method. As a measuring method, quantitative measurement was performed spectrophotometrically by a fluorescence method using a microplate. The hybridization reaction temperature was calculated at 40 ° C. by calculating the melting temperature of DNA from the GC content. The following strains were used as comparison targets.
No. 1 strain: Flavobacterium bleb IFO-1493 strain: type culture (Flavobacterium breve IFO-1493: type culture).
No. 2 strains: Flavobacterium greum IFO-1554 strain: type culture (Flavobacterium greum IFO-15504: type culture).
No. 3 strains: Flavobacterium indologenes IFO-14944 strain: type culture (Flavobacterium indologenes IFO-14944: type culture).
No. 4 strains: Flavobacterium meningocepticum IFO-12535 strain: type culture (Flavobacterium meningosepeticum IFO-12535: type culture)
DNA homology (%)

Based on the above results, this strain has a DNA homology of 70% or more, which is a judgment standard with Flavobacterium meningocepticum IFO-12535 strain: type culture (F. meningosepticum IFO-12535: type culture). From the above, it was determined that the strain was the same species, and this strain was identified and named Flavobacterium meningocepticum GK-54, and deposited with the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the accession number FERM BP-4868. Is.
[0012]
Next, glycerol kinase from a glycerol kinase producing bacterium belonging to the genus Flavobacterium was purified and various properties were examined.
In practicing the present invention, liquid culture and individual culture are possible as the culture form, but industrially, aeration and agitation culture is advantageous. As the culture source to be used, any nutrient source that can be used by microorganisms belonging to the genus Flavobacterium can be used in addition to carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts and other trace nutrient sources generally used for microbial culture.
[0013]
As the carbon source, for example, glucose, fructose, saccharose, xylose, maltose, glycerol, dextrin, starch, amino acid, and the like, fatty acids, fats and oils, organic acids and the like are used alone or in combination. As the nitrogen source, for example, either an inorganic nitrogen source or an organic nitrogen source can be used. Examples of the inorganic nutrient source include ammonium sulfate, ammonium nitrate, urea, sodium nitrate, and ammonium chloride. Examples of the organic nitrogen source include flours such as soybean, rice, corn, and wheat, corn steep liquor, peptone, meat extract, casein, amino acid, yeast extract, bacto soyton, and the like.
[0014]
Inorganic salts and micronutrients, for example, promote the growth of bacteria and the production of glycerol kinase such as vitamins, nonionic surfactants, antifoaming agents, as well as salts such as phosphate, magnesium, potassium, iron, calcium, and zinc Can be used as needed.
The culture is performed under an aerobic condition, and the culture temperature may be within a range in which bacteria grow and glycerol kinase is produced, and is usually 15 ° C to 37 ° C, preferably 25 ° C to 35 ° C. Although the culture time varies depending on the conditions, it may be cultured until the time when glycerol kinase is most produced, and is usually about 24 to 100 hours.
[0015]
Glycerol kinase is mainly contained and accumulated in the microbial cells, and may be extracted from the microbial cells. For example, the extraction method of glycerol kinase is exemplified by solid-liquid separation of the culture, and the obtained wet cells are dispersed in a solution such as phosphate buffer or Tris-HCl buffer, and then treated with lysozyme, sonication, French. Various microbial cell treatment means such as press treatment and dynomill treatment are appropriately selected and combined to obtain a crude glycerol kinase-containing solution.
[0016]
From the crude glycerol kinase-containing solution, purified glycerol kinase is obtained using a known protein or enzyme isolation and purification means. For example, glycerol kinase is precipitated and recovered by applying a fractional precipitation method using an organic solvent such as acetone, methanol, ethanol, or a salting out method using ammonium sulfate, sodium chloride, or the like to a crude glycerol kinase-containing solution.
[0017]
Furthermore, after performing dialysis and isoelectric point precipitation of this precipitate as needed, until a single band is shown by electrophoresis or the like, column chromatography using an ion exchanger, gel filter agent, adsorbent, etc. Purify by Further, when the purification degree of glycerol kinase is increased by appropriately combining these methods, they can be appropriately combined.
[0018]
Enzymes obtained by these methods are used as stabilizers, with or without the addition of various salts, saccharides, proteins, lipids, surfactants, etc., by ultrafiltration concentration, lyophilization, and liquid or solid glycerol. Kinase can be obtained, and may be freeze-dried as appropriate. In this case, saccharose, mannitol, sodium chloride, albumin or the like may be added as a stabilizer in an amount of about 0.5 to 10%.
[0019]
Next, the physicochemical properties and enzyme activity measurement method of glycerol kinase obtained in the present invention will be described.
Method for measuring activity of glycerol kinase 0.2 ml of 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 8.0), 0.1 ml of 5% glycerol, 0.02 ml of 0.1 M ATP, 0.1 M MgCl ₂ 0.04 ml, 45 U / ml peroxidase (Sigma) 0.1 ml, 0.3% 4-aminoantipyrine 0.1 ml, 0.25% phenol 0.1 ml, 100 U / ml glycero 1 ml of a reaction solution consisting of 0.2 ml of phosphate oxidase (manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.) and 0.14 ml of distilled water is preheated at 37 ° C. for 1 minute, and then added with 0.02 ml of enzyme solution and reacted for 10 minutes. Let After the reaction, 2 ml of 0.5% SDS is added to stop the reaction, and the absorbance at a wavelength of 500 nm is measured using a 1 cm layer length cell within 5 minutes (As). As a blind test, 0.02 ml of distilled water is used in place of the enzyme solution to measure the absorbance (Ab). The absorbance (As) of this enzyme solution and the absorbance (Ab) of the blind test are measured. The enzyme activity is determined from the absorbance difference (As-Ab). One unit of enzyme activity is the amount of enzyme that produces 1 μmol of glycerophosphate per minute at 37 ° C., and the calculation formula is as follows.
[0020]
[Expression 1]

[0021]
Physicochemical properties (1) Enzyme action: The enzyme action using glycerol as a substrate is shown below.
[0022]
[Chemical 1]

[0023]
(2) Substrate specificity: glycerol exhibits substrate specificity. Specificities for various substrates are shown in Table 1.
[0024]
[Table 1]

[0025]
(3) Km value: 3.9 × 10 ⁻² ± 0.5 × 10 ⁻² mM (for glycerol), 5.3 × 10 ⁻² ± 0.5 × 10 ⁻² mM (for ATP)
(4) Isoelectric point: 4.4 ± 0.5 (by electrophoresis using carrier-ampholine)
(5) Molecular weight: 145000 ± 5000 (by gel filtration using TSK G-3000SW), 50000 ± 5000 (by SDS polyacrylamide gel electrophoresis)
(6) Optimum pH
The optimum pH was determined according to the enzyme activity measurement method, and the result is shown in FIG. The pH range from 4.5 to 6.5 is 100 mM citrate buffer, the pH range from 5.5 to 7.5 is 100 mM Bis-Tris buffer, the pH range from 6.5 to 7.5 is 100 mM phosphate buffer. The range of pH 7.0-8.5 shows the activity value when using 100 mM Tris-HCl buffer, and the range of pH 8.5-11.0 shows the use of 100 mM glycine-sodium hydroxide buffer. The optimum pH was 7.5-8.
(7) pH stability Various buffer solutions of 100 mM (glycerol kinase 1 U / ml) were treated at 37 ° C. for 60 minutes, and the residual activity was measured according to the enzyme activity measurement method. The result is shown in FIG. pH 0.5-4.0 is 100 mM Clark and Andrews buffer, pH 3.5-7.0 is 100 mM acetate buffer, pH 6.5-8.0 is 100 mM phosphate buffer, pH 8.0-9 0.0 used 100 mM Tris-HCl buffer, and pH 9.0-11.0 used 100 mM glycine-sodium hydroxide buffer. It showed the best stability in the range of pH 3-11.
(8) Optimum temperature According to the enzyme activity measurement method, the optimum temperature was determined by changing the temperature in the range of 37 ° C to 95 ° C, as shown in FIG. Was 80 ° C.
(8) Thermal stability The residual activity after heat treatment of 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) (glycerol kinase 1 U / ml) at each temperature for 10 minutes was measured according to the enzyme activity measurement method. As a result, as shown in FIG. 4, it was 100% stable up to at least 60 ° C., and retained at 80% or more after 70 minutes of treatment at 70 ° C.
(9) Influence of metal ions The results of examining the influence of various metal ions (1 mM) on the enzyme activity are as shown in Table 2, and weak inhibition by calcium ions was observed.
[0026]
[Table 2]

[0027]
(10) N-terminal amino acid sequence Met-Asp-Glu-Lys-Leu-Ile-Leu-Ala-Leu-Asp-Glu-Gly-Thr-Thr-
(11) For the purpose of dealing with a storage-stable liquefaction reagent, 0.8 U of glycerol of the present invention is added to 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 0.05% NaN ₃ (preservative). The residual activity was measured by the above-mentioned activity measurement method after 2 days, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, and 4 weeks at 37 ° C., and the results were 94% and 91%, respectively. %, 81%, 71% and 60% of activity were retained. Therefore, this enzyme retained 80% or more of activity at 37 ° C. for 2 weeks in the absence of a stabilizer (for example, BSA or saccharide).
[0028]
From the above results, the properties of the glycerol kinase of the present invention and the conventionally known glycerol kinase are compared as follows.
(Km value for ATP)
This enzyme: 0.053 mM
From Streptomyces canus: 0.2 mM
From Cellulomonas sp: 0.43 mM
From Arthrobacter altrusianeus: 3.7 mM
(Thermal stability)
This enzyme: Retained 80% or more of the activity after heat treatment at 70 ° C. for 10 minutes.
[0029]
Cellulomonas canus derived: Retains 96% residual activity after treatment at pH 7.5, 45 ° C. for 15 minutes. The treatment at 70 ° C. is completely deactivated.
Derived from Arthrobacter altrusiaus: pH 7.0, stable at a temperature of 45 ° C. or less after treatment for 15 minutes.
From Bacillus stearothermophilus: Residual activity of 10% after heat treatment at 65 ° C. for 10 minutes (FIG. 5).
(Optimum temperature)
This enzyme: 80 ° C
Cellulomonas sp: derived from around 50 ° C. Arthrobacter sp. Derived: around 50 ° C. derived from Bacillus stearothermophilus: 65 ° C. ± 5 ° C.
As described above, the glycerol kinase of the present invention has clearly different properties from the conventionally known enzymes, and in particular, has the most excellent stability with respect to thermal stability.
[0030]
【Example】
Next, examples of the present invention will be described in detail, but the present invention is not limited thereto.
[0031]
[Example 1]
Flavobacterium meningocepticum GK-54 strain 500 ml of a medium (pH 7.0) consisting of 1.0% glycerol, 3.0% meat extract, 0.5% Bacto Soyton (Difco) After inoculating 150 ml each of the Erlenmeyer flask, the cells were cultured at 28 ° C. for 30 hours to obtain a seed culture solution.
[0032]
Two seed cultures were added to each of four jar fermenters of 20 l of a medium (pH 7.0) obtained by adding an antifoaming agent to the same composition medium as described above, and cultured at 28 ° C. for 22 hours. After completion of the culture, the culture was centrifuged at 4000 rpm to recover 3.0 kg of cells.
To this cell, 9 l of a 0.1% lysozyme solution containing 10 mM EDTA, 0.3% Triton X-100, 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.6) was added, and the reaction was carried out at 37 ° C. for 90 minutes. Solubilized. Then, this was centrifuged at 4000 rpm for 20 minutes, the insoluble matter was removed, and 9 l (72000 U) of the supernatant was obtained.
[0033]
Next, 90 ml of 5.0% protamine sulfate was added to the supernatant, and the precipitate was removed by centrifugation. The supernatant was further heated at 50 ° C. for 30 minutes, and the precipitate was removed by centrifugation. The centrifuged supernatant was dialyzed overnight against 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) and subjected to Q-Sepharose (2.7 × 30 cm) (Pharmacia) ion exchange chromatography. Elution was performed with a 0 to 0.5 M linear gradient of sodium chloride, and a 0.2 to 0.3 M sodium chloride elution fraction (29000 U) was collected.
[0034]
Sodium chloride was dissolved in this enzyme solution to a concentration of 2.5 M, and octyl sepharose (2.6 × 20 cm) (Pharmacia) was subjected to hydrophobic chromatography. Elution was performed with a linear gradient of 2.5 M to 0 M sodium chloride, and an elution fraction (25000 U) of 0 M sodium chloride was collected. Subsequently, this enzyme solution was dialyzed overnight against 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) and subjected to hydroxyapatite (1.6 × 26.5 cm) (Pentax) chromatography. Elution was performed with a linear gradient using 5-0.2 M phosphate buffer, and an elution fraction (16300 U) of 0.1-0.12 M phosphate buffer was collected.
[0035]
Subsequently, this enzyme solution was dialyzed overnight against 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) and subjected to ion exchange chromatography using DEAE-Sepharose (1.6 × 20 cm) (Pharmacia). Elution is performed with a linear gradient of 0 to 0.5 M sodium chloride, and an elution fraction (12000 U) of 0.2 to 0.3 M sodium chloride is collected, and is added to 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5). After dialysis overnight, BSA was added to 1% and lyophilized to obtain purified glycerol kinase (12000 U, 9.9 U / mg).
[0036]
The physicochemical properties of the glycerol kinase thus obtained are as described above.
[0037]
[Reference Example 1]
After inoculating Serratia macescens IFO-3736 strain into a 500 ml Erlenmeyer flask containing 2.0% glycerol and 2.0% yeast extract medium (pH 7.0). Culturing was carried out at 30 ° C. for 30 hours.
After completion of the culture, the culture was centrifuged at 8000 rpm, and 30 mg of cells were collected. The obtained cells were suspended in 30 ml of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) and solubilized by ultrasonic disruption.
[0038]
Thereafter, the solubilized solution was centrifuged at 16000 rpm to obtain 29 ml (70 U) of the supernatant from which insoluble matter was removed. Next, the centrifuged supernatant was dialyzed overnight against 8 l of 10 mM Tris-HCl buffer, and then subjected to Q-Sepharose (2 × 8 cm) (Pharmacia) ion exchange chromatography. Elution was performed with a 0 to 0.5 M linear gradient of sodium chloride, and a 0.2 to 0.3 M sodium chloride elution fraction (67 U) was collected to obtain crude glycerol kinase (67 U, 25 U / mg).
Physicochemical properties (1) Enzyme action and substrate specificity: The enzyme action and substrate specificity of this enzyme for glycerol were the same as those of Flavobacterium meningocepticum GK-54 (FERM BP-4868) strain.
(2) Km value: 2.4 × 10 ⁻² ± 0.5 × 10 ⁻² mM (for glycerol), 5.0 × 10 ⁻¹ ± 0.5 × 10 ⁻¹ mM (for ATP)
(3) Optimal pH: 7.5 (50 mM PIPES buffer)
[0039]
[Reference Example 2]
After inoculating Pseudomonas fluorescens IFO-3925 strain into a 500 ml Erlenmeyer flask containing 2.0% glycerol and 2.0% yeast extract medium (pH 7.0). Culturing was performed at 28 ° C. for 30 hours.
[0040]
After completion of the culture, the culture was centrifuged at 8000 rpm, and 30 mg of cells were collected. The obtained cells were suspended in 30 ml of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) and solubilized by ultrasonic disruption. Thereafter, the solubilized solution was centrifuged at 16000 rpm to obtain 29 ml (130 U) of the supernatant from which insoluble matter was removed.
Next, the centrifuged supernatant was dialyzed overnight against 8 l of 10 mM Tris-HCl buffer, and then subjected to Q-Sepharose (2 × 8 cm) (Pharmacia) ion exchange chromatography. Elution was performed with a 0 to 0.5 M linear gradient of sodium chloride, and a 0.2 to 0.3 M sodium chloride elution fraction (114 U) was collected to obtain crude glycerol kinase (114 U, 30 U / mg).
Physicochemical properties (1) Enzyme action and substrate specificity: The enzyme action and substrate specificity of this enzyme for glycerol were the same as those of Flavobacterium meningocepticum GK-54 (FERM BP-4868) strain.
(2) Km value: 2.0 × 10 ⁻² ± 0.5 × 10 ⁻² mM (for glycerol), 2.4 ± 0.5 mM (for ATP)
(3) Optimal pH: 7.5 (50 mM PIPES buffer)
[0041]
[Reference Example 3]
After inoculating Pseudomonas putida IFO-12653 strain into a 500 ml Erlenmeyer flask containing 2.0% glycerol and 2.0% yeast extract medium (pH 7.0), 28 Culturing was carried out at 30 ° C. for 30 hours.
After completion of the culture, the culture was centrifuged at 8000 rpm, and 30 mg of cells were collected. The obtained cells were suspended in 30 ml of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) and solubilized by ultrasonic disruption. Thereafter, the solubilized solution was centrifuged at 16000 rpm to obtain 29 ml (190 U) of the supernatant from which insoluble matter was removed.
[0042]
Next, the centrifuged supernatant was dialyzed overnight against 8 l of 10 mM Tris-HCl buffer, and then subjected to Q-Sepharose (2 × 8 cm) (Pharmacia) ion exchange chromatography. Elution was performed with a 0 to 0.5 M linear gradient of sodium chloride, and a 0.2 to 0.3 M sodium chloride elution fraction (110 U) was collected to obtain crude glycerol kinase (110 U, 30 U / mg).
Physicochemical properties (1) Enzyme action and substrate specificity: The enzyme action and substrate specificity of this enzyme for glycerol were the same as the Flavobacterium meningocepticum GK-54 (FERM BP-4868) strain.
(2) Km value: 2.0 × 10 ⁻² ± 0.5 × 10 ⁻² mM (for glycerol), 2.0 ± 0.5 mM (for ATP)
(3) Optimal pH: 7.5 (50 mM PIPES buffer)
[0043]
【The invention's effect】
INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a glycerol kinase having a good thermostability and a microbiological production method thereof can be provided. A liquefied reagent having a useful and good thermostability for measuring glyceride and lipase activity using this enzyme We were able to provide an enzyme for measurement.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the optimum pH curve of the glycerol kinase of the present invention.
FIG. 2 shows the pH stability curve of the glycerol kinase of the present invention.
FIG. 3 shows an optimum temperature curve of the glycerol kinase of the present invention.
FIG. 4 shows a heat stability curve of the glycerol kinase of the present invention.
FIG. 5 shows a heat stability curve of glycerol kinase of the present invention and glycerol kinase derived from Bacillus stearothermophilus.

Claims (3)

Glycerol kinase having the following characteristics.
(1) It acts on glycerol in the presence of ATP to produce glycerol-3-phosphate and ADP.
(2) Maintaining an activity of 80% or more by heat treatment at 70 ° C. for 10 minutes at a glycerol kinase concentration of 1 U / ml.
( 3 ) The isoelectric point is 4.4 ± 0.5.
(4) Glycerol kinase retains at least 80% activity at 37 ° C. for 2 weeks in the absence of a stabilizer.
(5) The molecular weight determined by SDS polyacrylamide gel electrophoresis is 50000 ± 5000. (6) The producing bacterium belongs to the genus Flavobacterium.   A method for producing a glycerol kinase according to claim 1, characterized in that a glycerol kinase-producing bacterium belonging to the genus Flavobacterium is cultured in a medium, and glycerol kinase is collected from the culture. Manufacturing method. The method according to claim 2, wherein the glycerol kinase-producing bacterium belonging to the genus Flavobacterium is Flavobacterium meningocepticum GK-54 (FERM BP-4868) strain.

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