JP3648109B2 - Phosphodiesterase enzyme - Google Patents

Description

【００１８】
便宜上、ここでアミノ酸のために使用されるコードを示す表を提示する。
【表１】

【００１９】
ここで、式Ｉ−これは配列番号：９として表すことができる−は一般式である。式Ｉは本明細書において提示される特定の新規な配列の配列の分析から構築された。
便宜上、本発明のＰＤＥを時には PDE＿XIV と呼ぶ。本発明者はまた、この酵素を時にはPDEXIVと呼ぶ。酵素をヒトから得ることができる場合、本発明者は添字または接頭語ＨＳ（またはＨＭ）あるいはｈｓ（またはｈｍ）を使用する。酵素をマウスから得ることができる場合、本発明者は添字または接頭語ＭＭ（またはＭｍもしくはｍｍ）を使用する。
【００２０】
本発明のＰＤＥはcAMPの分解を触媒することができる。
配列番号：９について、アミノ酸の任意の１または複数はその類似体であることができる。
用語「類似体」は、本明細書において使用するとき、式Ｉの配列に類似するが、有害ではない（すなわち、酵素活性に対して有害ではない）アミノ酸の置換または欠失がなされている配列を有する配列を意味する。
好ましくは、本発明のＰＤＥ酵素は、Ｃ末端の触媒ドメイン内に少なくとも２価のカチオン結合モチーフおよび／または保存されたcAMP依存性タンパク質キナーゼリン酸化モチーフを有する。
【００２１】
好ましくは、本発明のＰＤＥ酵素は、Ｃ末端の触媒ドメイン内に少なくとも２価のカチオン結合モチーフおよび保存されたcAMP依存性タンパク質キナーゼリン酸化モチーフを有する。
好ましくは、配列番号：９のアミノ酸配列はＺ１〜Ｚ２６のうちの少なくとも５つを含む。
好ましくは、配列番号：９のアミノ酸配列はＺ１〜Ｚ２６のうちの少なくとも１０を含む。
好ましくは、配列番号：９のアミノ酸配列はＺ１〜Ｚ２６のうちの少なくとも１５を含む。
好ましくは、配列番号：９のアミノ酸配列はＺ１〜Ｚ２６のうちの少なくとも２０を含む。
【００２２】
好ましくは、配列番号：９のアミノ酸配列はＺ１〜Ｚ２６のうちの少なくとも２５を含む。
好ましくは、配列番号：９のアミノ酸配列はＺ１〜Ｚ２６のうちの少なくとも各々を含む。
好ましくは、アミノ酸配列は約２３０より多いアミノ酸残基から構成されている。
好ましくは、アミノ酸配列は約２５０より多いアミノ酸残基から構成されている。
好ましくは、アミノ酸配列は約２６０より多いアミノ酸残基から構成されている。
【００２３】
好ましくは、アミノ酸配列は少なくとも２６８のアミノ酸残基から構成されている。
好ましくは、式Ｉのアミノ酸配列は、Ｚ７、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５、Ｚ１６、Ｚ１７およびＺ１８またはそれらの類似体の少なくとも１またはそれ以上からなる。
好ましくは、式Ｉのアミノ酸配列は、Ｚ７、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５、Ｚ１６、Ｚ１７およびＺ１８またはそれらの類似体の各々からなる。
好ましくは、式Ｉのアミノ酸配列は、Ｚ１、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５、Ｚ１６、Ｚ１７およびＺ１８またはそれらの類似体の各々からなる。
【００２４】
【化３】

【００２５】
式中、
Ｚ１〜Ｚ２６の各々は上記において定義した通りであり、そして
Ｘ１〜Ｘ２４の各々は任意の適当なペプチド配列またはアミノ酸から独立して選択される。
式Ｉとして表される配列を含んでなるアミノ酸配列のより好ましい例は、式ＩＩＩとして示されるアミノ酸配列またはその変異型、相同体、フラグメントまたは誘導体である。
【００２６】
【化４】

【００２７】
式中、
Ｚ１〜Ｚ２６の各々は上記において定義した通りであり、そして
Ｘ１ ＝ ＶまたはＩ
Ｘ２ ＝ ＳまたはＮ
Ｘ３ ＝ ＥまたはＤ
Ｘ４ ＝ Ｓ、Ｖ、ＮまたはＡの少なくとも２またはそれ以上からなるペプチド
Ｘ５ ＝ ＶまたはＩ
Ｘ６ ＝ ＰまたはＲ
Ｘ７ ＝ ＮまたはＳ
Ｘ８ ＝ ＨまたはＹ
Ｘ９ ＝ ＴまたはＭ
Ｘ１０ ＝ ＳまたはＴ
Ｘ１１ ＝ Ｇ、Ｈ、Ｓ、Ｑの少なくとも２またはそれ以上からなるペプチド
【００２８】
Ｘ１２ ＝ Ｄ、Ａ、Ｎ、Ｖの少なくとも２またはそれ以上からなるペプチド
Ｘ１３ ＝ ＥまたはＤ
Ｘ１４ ＝ ＳまたはＴ
Ｘ１５ ＝ ＨまたはＲ
Ｘ１６ ＝ ＧまたはＳ
Ｘ１７ ＝ Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｎの少なくとも２またはそれ以上からなるペプチド
Ｘ１８ ＝ ＳまたはＲ
Ｘ１９ ＝ Ｓ、Ｇ、Ｐ、Ｄ、Ｈ、Ｑの少なくとも２またはそれ以上からなるペプチド
Ｘ２０ ＝ ＨまたはＬ
Ｘ２１ ＝ Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｐ、Ａの少なくとも２またはそれ以上からなるペプチド
【００２９】
Ｘ２２ ＝ Ｓ、Ｅ、Ｔ、Ｌの少なくとも２またはそれ以上からなるペプチド
Ｘ２３ ＝ 任意のＴ
Ｘ２４ ＝ Ｄ、Ｓ、Ａ、Ｔの少なくとも２またはそれ以上からなるペプチド
式Ｉとして表される配列を含んでなるアミノ酸配列のより好ましい例は、式ＩＶとして示されるアミノ酸配列またはその変異型、相同体、フラグメントまたは誘導体である。
【００３０】
【化５】

【００３１】
式中、
Ｚ１〜Ｚ２６の各々は上記において定義した通りであり、そして
Ｘ１ ＝ ＶまたはＩ
Ｘ２ ＝ ＳまたはＮ
Ｘ３ ＝ ＥまたはＤ
Ｘ４ ＝ ＳＶまたはＮＡ
Ｘ５ ＝ ＶまたはＩ
Ｘ６ ＝ ＰまたはＲ
Ｘ７ ＝ ＮまたはＳ
Ｘ８ ＝ ＨまたはＹ
Ｘ９ ＝ ＴまたはＭ
Ｘ１０ ＝ ＳまたはＴ
Ｘ１１ ＝ ＧＨまたはＳＱ
Ｘ１２ ＝ ＤＡまたはＮＶ
【００３２】
Ｘ１３ ＝ ＥまたはＤ
Ｘ１４ ＝ ＳまたはＴ
Ｘ１５ ＝ ＨまたはＲ
Ｘ１６ ＝ ＧまたはＳ
Ｘ１７ ＝ ＰＲまたはＳＮ
Ｘ１８ ＝ ＳまたはＲ
Ｘ１９ ＝ SGSGPDH またはＧＱ
Ｘ２０ ＝ ＨまたはＬ
Ｘ２１ ＝ ＱＧＴまたはＰＡＰ
Ｘ２２ ＝ ＳＥまたはＴＬ
Ｘ２３ ＝ 任意のＴ
Ｘ２４ ＝ ＤＳまたはＡＴ
【００３３】
上記式の任意の１つの例は、基．．．．HZ₁₇GZ₁₈PRZ₁₉ ．．．．が．．．．RZ₁₇SZ₁₈SNZ₁₉ ．．．．で置換されているアミノ酸配列である。
式Ｉとして表される配列を含んでなる本発明によるアミノ酸の好ましい例は、次のように示される：配列番号：１、配列番号：３もしくは配列番号：５、またはその変異型、相同体、フラグメントもしくは誘導体。
前記式の任意の１または複数に対する言及はまた、配列番号：１、配列番号：３もしくは配列番号：５の任意の１または複数に等しく適用されることを理解すべきである。
【００３４】
好ましくは、本明細書における前記式の任意の１またはそれ以上に対する言及は、配列番号：１、配列番号：３もしくは配列番号：５の任意の１または複数を意味する。
より好ましくは、前記式の任意の１またはそれ以上に対する言及は配列番号：３または配列番号：５を意味する。
本発明の第２の観点によれば、式Ｉとして表される配列を含んでなるアミノ酸が提供される。
本発明の第３の観点によれば、本発明のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供される。
【００３５】
本発明の第４の観点によれば、配列番号：２、配列番号：４もしくは配列番号：６として表される配列、またはその変異型、相同体、フラグメントもしくは誘導体を含んでなるヌクレオチド配列が提供される。
本発明の第５の観点によれば、配列番号：２、配列番号：４または配列番号：６として表される配列を含んでなるヌクレオチド配列が提供される。
本発明の第６の観点によれば、本発明によるヌクレオチド配列、またはそれに対して相補的である配列に対してハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列が提供される。
【００３６】
本発明の第７の観点によれば、本発明の第６の観点に従うヌクレオチド配列、またはそれに対して相補的である配列に対してハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列が提供される。
本発明の第８の観点によれば、本発明のヌクレオチド配列を含んでなるベクターが提供される。
本発明の第９の観点によれば、本発明のヌクレオチド配列が組込まれた宿主細胞が提供される。
【００３７】
本発明の第１０の観点によれば、 PDE＿XIV の活性または発現に影響を与えることができる因子を同定するアッセイ法が提供され、このアッセイ法は、因子を本発明のアミノ酸または本発明のヌクレオチド配列と接触させ、そして PDE＿XIV の活性または発現を測定することを含んでなり、ここでａ）前記因子の非存在下でのＰＤＥの活性または発現と、ｂ）前記因子の存在下でのＰＤＥの活性または発現との間の差が、前記因子が PDE＿XIV の活性または発現に影響を与えることができることを示す。
【００３８】
好ましくは、前記アッセイは、被殻、脳の尾状核、脳の後頭葉、心臓、卵巣、下垂体、腎臓、肝臓、小腸、胸腺、骨格筋、白血球領域、背根神経節、子宮、蝸牛、小腸（十二指腸）、星状細胞腫、および虫垂の１または複数において見出される障害の治療において使用である因子についてスクリーニングすることである。
本発明の第１１の観点によれば、（ａ）本発明のアッセイを実施し、（ｂ） PDE＿XIV の活性または発現に影響を与える１または複数の因子を同定し、そして（ｃ）ある量のそれらの１または複数の同定された因子を調製する、ことを含んでなる方法が提供される。
【００３９】
本発明の第１２の観点によれば、in vivo において因子で PDE＿XIV の活性または発現に影響を与える方法であって前記因子がin vitroアッセイ法において PDE＿XIV の活性または発現に影響を与えることができ、そして前記in vitroアッセイ法が本発明のアッセイ法であることを特徴とする方法が提供される。
本発明の第１３の観点によれば、本発明のアッセイ法によりin vitroにおいてアッセイするとき、因子がＰＤＥの活性または発現に対する作用を有することができる、 PDE＿XIV に関連する疾患または症状を治療するための医薬組成物の製造における因子の使用が提供される。
【００４０】
本発明の第１４の観点によれば、 PDE＿XIV に対して発生させた抗体と免疫学的に反応することができる酵素が提供される。
本発明の第１５の観点によれば、ＰＤＥをコードし、NCIMB40995、NCIMB40996またはNCIMB40997から得ることができるヌクレオチド配列が提供される。
本発明の第１６の観点によれば、NCIMB40995、NCIMB40996またはNCIMB40997から得ることができるヌクレオチド配列から発現されるＰＤＥが提供される。
本発明の第１７の観点によれば、 PDE＿XIV に関連する疾患または症状を治療するための医薬組成物の製造における、 PDE＿XIV の活性またはその発現に対する作用を有する因子の使用が提供される。
【００４１】
本発明のそれ以上の観点によれば、下記のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列が提供される：
（ａ）配列番号：２、４または６の任意の１つとして表されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号：２、４または６の任意の１つとして表されるヌクレオチド配列の変異型、相同体、誘導体またはフラグメントであるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号：２、４または６の任意の１つに記載するヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号：２、４または６の任意の１つとして表されるヌクレオチド配列の変異型、相同体、誘導体またはフラグメントであるヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列；
【００４２】
（ｅ）配列番号：２、４または６の任意の１つに記載するヌクレオチド配列に対してハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号：２、４または６の任意の１つとして表されるヌクレオチド配列の変異型、相同体、誘導体またはフラグメントに対してハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列；
（ｇ）配列番号：２、４または６の任意の１つに記載するヌクレオチド配列に対してハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列；
（ｈ）配列番号：２、４または６の任意の１つとして表されるヌクレオチド配列の変異型、相同体、誘導体またはフラグメントに対してハイブリダイゼーションすることができるヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド配列；
【００４３】
（ｉ）配列番号：２、４または６の任意の１つに記載するヌクレオチド配列の相補体に対してハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列；
（ｊ）配列番号：２、４または６の任意の１つとして表されるヌクレオチド配列の変異型、相同体、誘導体またはフラグメントの補体に対してハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列；
（ｋ）前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）または（ｊ）において規定するヌクレオチドに対する遺伝コードの結果として縮重を有するヌクレオチド配列。
（ｌ）前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）および／または（ｋ）の任意の１つを含んでなるヌクレオチド配列。
【００４４】
本発明の他の観点をここで下に提示する：
本発明の単離されたヌクレオチド配列または単離されたタンパク質配列。
本発明の実質的に純粋なヌクレオチド配列または実質的に純粋なタンパク質配列。
本発明のヌクレオチド配列の発現のパターンまたはその発現産物の活性に影響を与えることができる因子を同定するアッセイ法であって、本発明のヌクレオチド配列または発現産物（「ＥＰ」）を前記因子に暴露し；前記因子が本発明のヌクレオチド配列またはその発現産物をモジュレートする（例えば、発現パターンまたは活性に影響を与える）かどうかを決定する。
【００４５】
本発明のアッセイ法により同定された因子。
本発明のアッセイ法により同定された因子、であって従来本発明によるＰＤＥモジュレーションを有することが知られていなかった因子。
下記の工程を含んでなる方法：（ａ）本発明のアッセイを実施し、（ｂ）本発明のヌクレオチド配列の発現のパターンまたはその発現産物の活性に影響を与える１または複数の因子を同定し、そして（ｃ）ある量のそれらの１または複数の同定された因子を調製する。
【００４６】
下記の工程を含んでなる方法：（ａ）本発明のアッセイを実施し、（ｂ）本発明のヌクレオチド配列の発現のパターンまたはその発現産物の活性に影響を与える１または複数の因子を同定し、そして（ｃ）１または複数の同定された因子を含んでなる医薬組成物を製造する。
下記の工程からなる方法：（ａ）本発明のアッセイを実施し、（ｂ）本発明のヌクレオチド配列の発現のパターンまたはその発現産物の活性に影響を与える１またはそれ以上の因子を同定し、そして（ｃ）１または複数の同定された因子を修飾して、本発明のヌクレオチド配列の発現のパターンまたはその発現産物の活性に対する異なる作用を引き起こす。
本発明のヌクレオチド配列の発現のパターンまたはその発現産物の活性に影響を与える薬物の製造における、本発明のアッセイにより同定された因子の使用。
【００４７】
本発明のヌクレオチド配列の発現のパターンまたはその発現産物の活性をモジュレートすることができる因子の有効量を標的に供給する（例えば、投与または暴露する）ことを含んでなる、標的（前記標的は哺乳動物、好ましくはヒトであることができる）を処置する方法。
本発明のアッセイにより同定された因子の有効量を標的に送出す（例えば、投与または暴露する）ことからなる、標的（前記標的は哺乳動物、好ましくはヒトであることができる）を処置する方法。
被検者に本発明のヌクレオチド配列またはその発現産物を投与することを含んでなる、被検者における免疫学的応答を誘導する方法。
【００４８】
PDE ＿ XIV
上に説明したように、本発明は、新規なＰＤＥ酵素− PDE＿XIV と呼ぶ−およびそれをコードするヌクレオチド配列に関する。本発明はまた、疾患の診断および治療における新規な核酸およびアミノ酸配列の使用に関する。本発明は、また、ホスホジエステラーゼ活性をモジュレートすることができる因子を評価および／またはスクリーニングするための、新規な核酸およびアミノ酸配列の使用に関する。本発明はさらに、ホスホジエステラーゼ活性をモジュレートすることができる因子を評価および／またはスクリーニングするための新規な核酸およびアミノ酸配列を含んでなるか、あるいはそれらを発現する、遺伝子操作された宿主細胞に関する。
【００４９】
本明細書において使用するとき、用語「 PDE＿XIV 」は、現在まで、特性決定されてきていない、ＰＤＥの新規なファミリーを意味する。
１例として、本発明者はヒト PDE＿XIV （時にはHSPDE XIV と呼ぶ）を同定した。本発明者はまた、マウス配列− PDE＿XIV （時にはMMPDE XIV と呼ぶ）を同定した。
便宜上、特記しない限り、 PDE＿XIV に対する言及はHSPDE XIV および／またはMMPDE XIV を包含するであろう。
PDE＿XIV は、種々の源の中に存在し、そしてそれらから得ることができると考えられる。
【００５０】
１例として、 PDE＿XIV は、被殻、脳の尾状核、脳の後頭葉、心臓、卵巣、下垂体、腎臓、肝臓、小腸、胸腺、骨格筋、白血球領域、背根神経節、子宮、蝸牛、小腸（十二指腸）、星状細胞腫、および虫垂の１またはそれ以上において見出される。
PDE＿XIV は、また、多数の他の源−例えば、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、およびウマの中に存在すると、我々は考える。
好ましくは、本発明は、前述の源の任意のものを包含するが、これらに限定されない、哺乳動物の PDE＿XIV を包含する。
より好ましくは、本発明はヒト PDE＿XIV を包含する。
【００５１】
PDE＿XIV は−この観点について−天然に存在する形態と同一であることができ、好ましくは PDE＿XIV は非天然のアミノ酸配列である（すなわち、それはその天然の環境の中に存在しない）か、あるいはその変異型、相同体、フラグメントまたは誘導体である。さらに、あるいは別に、 PDE＿XIV は単離された PDE＿XIV および／または精製された PDE＿XIV である。 PDE＿XIV は、天然またはそれ以外の、任意の適当な源から得ることができるか、あるいは産生されるか、あるいはそれは合成的、半合成的または組換え体であることができる。
【００５２】
PDE＿XIV コード配列は−この観点について−天然に存在する形態と同一であることができ、好ましくは PDE＿XIV コード配列は非天然のアミノ酸配列である（すなわち、それはその天然の環境の中に存在しない）か、あるいはその変異型、相同体、フラグメントまたは誘導体である。さらに、あるいは別に、 PDE＿XIV コード配列は単離された PDE＿XIV コード配列および／または精製された PDE＿XIV コード配列である。 PDE＿XIV コード配列は、天然またはそれ以外の、任意の適当な源から得ることができるか、あるいは産生されるか、あるいはそれは合成的、半合成的または組換え体であることができる。
【００５３】
PDE＿XIV および／またはそのコード配列および／またはそれに対してハイブリダイズすることができる配列は、異なるペプチドの間の薬剤の候補の選択性を試験するために有用である。
PDE＿XIV はcAMPのＡＭＰへの変換を触媒すると考えられる。
本発明の好ましい観点は、組換え PDE＿XIV 酵素および PDE＿XIV 酵素をコードする組換えヌクレオチド配列を包含する。
好ましくは、本発明の組換え PDE＿XIV 酵素および／または組換えヌクレオチド配列は、組換え哺乳動物 PDE＿XIV 酵素および／または組換え哺乳動物ヌクレオチド配列である。
【００５４】
好ましくは、本発明の組換え PDE＿XIV 酵素および／または組換えヌクレオチド配列は、組換えヒト PDE＿XIV 酵素および／または組換えヒトヌクレオチド配列である。
本発明によれば、組換え PDE＿XIV 酵素は少なくとも式Ｉとして表される式を有する。
【００５５】
PDE＿XIV をコードするヌクレオチド配列または酵素 PDE＿XIV それ自体のいずれかまたは双方を使用して、 PDE＿XIV 活性に影響を与えることができる因子についてスクリーニングすることができる。特に、 PDE＿XIV をコードするヌクレオチド配列または PDE＿XIV それ自体を使用して、 PDE＿XIV 活性を阻害することができる因子についてスクリーニングすることができる。さらに、 PDE＿XIV をコードするヌクレオチド配列または酵素 PDE＿XIV それ自体を使用して、 PDE＿XIV 活性に選択的に影響を与える阻害することができる、例えば、 PDE＿XIV 活性を選択的に阻害することができる、因子についてスクリーニングすることができる。
【００５６】
さらに、 PDE＿XIV をコードするヌクレオチド配列またはそれに対して相補的である配列は、また、ヒト細胞中の PDE＿XIV コード配列の存在を検出するアッセイにおいて使用することができる。これらのアッセイは、この酵素の組織の分布および特定の疾患の状態に関する、その生物学的関連性に関する情報を提供するであろう。
本発明は、また、 PDE＿XIV （その誘導体、フラグメント、相同体または変異型を包含する）に対する抗体を包含する。 PDE＿XIV に対する抗体は、ヒト細胞中の PDE＿XIV の存在を検出するアッセイにおいて使用することができる。これらのアッセイは、この酵素の組織の分布および特定の疾患の状態に関する、その生物学的関連性に関する情報を提供するであろう。
【００５７】
特に、 PDE＿XIV アイソザイムの任意の１または複数、をコードするヌクレオチド配列、それに対して相補的であるヌクレオチド配列、およびそれに対して向けられた抗体を、アイソザイムの１つに選択的に影響を与える因子についてスクリーニングするアッセイにおいて使用することができる。これらのアッセイは、アイソザイムの各々の組織の分布および特定の疾患の状態に関するアイソザイムの各々の生物学的関連性に関する情報を提供するであろう。これらのアッセイはまた、 PDE＿XIV の発現または活性、例えば、特定の組織中の、または特定の疾患の状態における、 PDE＿XIV の発現または活性、に影響を与える因子についての試験および同定を可能とする。
【００５８】
本発明のポリペプチド
用語「ポリペプチド」−これは用語「タンパク質」と互換的である−は、一本鎖のポリペプチド分子ならびに多数のポリペプチドの複合体（ここで個々の構成成分のポリペプチドは共有結合または非共有結合により結合されている）を包含する。
好ましくは、本発明のポリペプチドは一本鎖ポリペプチドである。
【００５９】
本発明のポリペプチドは、実質的に単離された形態であることができる。ポリペプチドをポリペプチドの意図する目的を妨害しない担体または希釈と混合することができ、そしてポリペプチドはなお実質的に単離されていると見なすことができることが理解されるであろう。本発明のポリペプチドは、また、実質的に精製された形態であることができ、この場合において、ポリペプチドは調製物中のポリペプチドの９０％より多く、例えば、９５％、９８％または９９％が本発明のポリペプチドである、調製物中のポリペプチドからなる。本発明のポリペプチドは、例えば、ポリペプチドの精製を促進するヒスチジンの付加によるか、あるいは後述するように細胞からのポリペプチドを促進するシグナル配列の付加により、修飾することができる。
【００６０】
本発明のポリペプチドは、合成手段（例えば、Geysen et al.,1996に記載されているように）または、後述するように、組換え的に、製造することができる。
好ましい態様において、本発明の天然の PDE＿XIV がその天然の環境中に存在するとき、および同様に天然の環境中に存在する、そのヌクレオチドコード配列により本発明の天然の PDE＿XIV が発現されたとき、およびそのヌクレオチド配列が、同様に天然の環境中に存在する、その天然のプロモーターの制御下にあるとき、本発明のアミノ酸配列それ自体は本発明による天然の PDE＿XIV を包含しない。言及を容易するために、本発明者はこの好ましい態様を「非天然のアミノ酸配列」と呼ぶ。
【００６１】
本発明の酵素についてのアミノ酸配列に関する用語「変異型」、「相同体」または「フラグメント」は、生ずる酵素が PDE＿XIV 活性を有するかぎり、好ましくは付属の配列のリストに示す酵素と少なくとも同様な生物学的活性を有するかぎり、配列からのまたは配列に対する、１つ（またはそれ以上）のアミノ酸の任意の置換、変動、修飾、取替え、欠失または付加を包含する。特に、用語「相同体」は構造および／または機能に関する相同性を包含する。配列の相同性に関すると、式Ｉとして示す配列に対して、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性が存在する。
【００６２】
より好ましくは、式Ｉとして示す配列に対して、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性が存在する。より好ましくは、付属する配列のリストに示す配列の任意の１つに対して、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性が存在する。より好ましくは、付属する配列のリストに示す配列の任意の１つに対して、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性が存在する。
【００６３】
典型的には、行うことができるアミノ酸置換の型はアミノ酸配列の疎水性／親水性を維持すべきである。修飾された配列が本発明に従いＰＤＥ酵素として作用する能力を保持するかぎり、アミノ酸置換は、例えば、１、２または３〜１０、２０または３０の置換を行うことができる。アミノ酸置換は、例えば、血液プラスミドの半減期を増加するための、天然に存在しない類似体の使用を包含することができる。
本発明のアミノ酸配列は、適当な発現系においてそれをコードするヌクレオチド配列の発現により製造することができる。
【００６４】
さらに、あるいは別に、全体または一部分において、ＰＤＥアミノ酸配列を合成する化学的方法を使用して、タンパク質それ自体を製造することができる。例えば、ペプチドを固相技術により合成し、樹脂から切断し、調製用高性能液体クロマトグラフィーにより精製することができる（例えば、Creighton(1983)Proteins Structure And Molecular Principles, WH Freeman and Co.New York,NY)。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定により確証することができる（例えば、エドマン分解法）。
【００６５】
直接的ペプチド合成は種々の固相技術（Roberge JY et al.(1995)Science 269:202-204) を使用して実施することができ、そして自動化合成は、例えば、製造業者により提供される取扱説明書に従いABI431A ペプチド合成装置（Perkin Elmer) を使用して達成することができる。さらに、ＰＤＥのアミノ酸配列、またはその任意の部分を直接的合成の間に変更し、そして／または化学的方法により他のサブユニットからの配列、またはその任意の部分と組合わせて、変異型ポリペプチドを製造することができる。
【００６６】
本発明の他の態様において、ＰＤＥの天然の、修飾されたまたは組換えの配列を異種配列に結合して融合タンパク質をコードすることができる。例えば、ＰＤＥ活性のインヒビターについてペプチドのライブラリーをスクリーニングするために、商業的に入手可能な抗体により認識される異種エピトープを発現するキメラＰＤＥタンパク質をコードすることが有用であることがある。また、ＰＤＥ配列と異種タンパク質配列との間に切断部位を含有するように、融合タンパク質を操作し、こうしてＰＤＥを異種部分から切断し、精製することができる。
【００６７】
また、１または複数の追加のポリペプチドドメインが付加された組換えタンパク質としてＰＤＥを発現させて、タンパク質の精製を促進することができる。このような精製促進ドメインは下記のものを包含するが、これらに限定されない：金属キレート化ペプチド、例えば、固定化された金属上の精製を可能とするヒスチジン−トリプトファンモジュール（Porath J(1992)Protein Exp.Purif.3-.26328 1) 、固定化された免疫グロブリン上の精製を可能とするプロテインＡドメイン、およびFLAGS エクステンション／アフィニティー精製システムにおいて利用されるドメイン（Immunex Corp. 、ワシントン州シアトル）。精製ドメインとＰＤＥとの間に切断可能なリンカー配列、例えば、因子ＸＡまたはエンテロキナーゼ（Invitrogen、カリフォルニア州サンディエゴ）を含めることは、精製の促進に有効である。好ましい面において、FLAGエピトープ標識を使用して酵素を発現させて、発現された酵素の単離および精製促進する。
【００６８】
PDE＿XIV の特定のアミノ酸配列は、配列番号：１、配列番号：３または配列番号：５として示される。しかしながら、本発明は、アミノ酸配列の任意の１つに対して少なくとも６０％の同一性（より好ましくは少なくとも７５％の同一性）を有するアミノ酸配列を包含する、 PDE＿XIV ファミリーからの他のメンバーをコードするアミノ酸配列を包含する。示すように、本発明に従う PDE＿XIV ファミリーに適当な一般式は式Ｉとして表される。
【００６９】
本発明のポリペプチドは、また、提示されたアミノ酸配列のフラグメントおよびそれらの変異型を包含する。適当なフラグメントは少なくとも５、例えば、少なくとも１０、１２、１５または２０アミノ酸の大きさであろう。
本発明のポリペプチドは、また、保存された置換を包含する、１または複数（例えば、少なくとも２、３、５または１０）の置換を含有するように修飾することができる。これらの面は、後の節において論考される。
【００７０】
本発明のヌクレオチド配列
用語「ヌクレオチド配列」は、本明細書において使用するとき、オリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列、およびそれらの変異型、相同体、フラグメントまたは誘導体（例えば、それらの一部分）を意味する。ヌクレオチド配列はＤＮＡまたはＲＮＡであることができ、ゲノムまたは合成または組換えの由来であることができ、センスまたはアンチセンスの鎖であるかどうかにかかわらず、二本鎖または一本鎖であることができる。
【００７１】
好ましくは、用語「ヌクレオチド配列」はＤＮＡを意味する。
より好ましくは、用語「ヌクレオチド配列」は組換えＤＮＡ技術を使用して製造されたＤＮＡ（すなわち、組換えＤＮＡ）を意味する。
好ましい態様において、本発明の天然のヌクレオチドコード配列が、同様に天然の環境中に存在する、その天然のプロモーターの制御下にあるとき、本発明のアミノ酸配列それ自体はその天然の環境中の本発明による天然のヌクレオチドコード配列を包含しない。言及を容易するために、本発明者はこの好ましい態様を「非天然のヌクレオチド配列」と呼ぶ。
【００７２】
本発明のヌクレオチド配列は、それらの範囲内に、合成のヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを包含することができる。オリゴヌクレオチドに対する多数の型の修飾がこの分野において知られている。これらはメチルホスホネートおよびホスホロチオエートの主鎖、分子の３’および／または５’末端におけるアクリジン鎖またはポリリジン鎖の付加を包含する。本発明の目的に対して、本明細書において記載するヌクレオチド配列はこの分野において入手可能な任意の方法により修飾することができる。本発明のヌクレオチド配列のin vivo 活性または寿命を増大するために、このような修飾を実施することができる。
【００７３】
本発明はまた、本明細書において提示する配列に対して相補的であるヌクレオチド配列、またはそれらの任意の誘導体、フラグメントまたは誘導体を包含する。配列がそのフラグメントに対して相補的である場合、他の生物およびその他における同様なコード配列を同定するためのプローブとして、その配列を使用することができる。
本発明はまた、本明細書において提示する配列に対してハイブリダイズすることができる配列、またはそれらの任意の誘導体、フラグメントまたは誘導体を包含する。
【００７４】
本発明は、また、本明細書において提示する配列に対して相補的である配列に対してハイブリダイズすることができる配列、またはそれらの任意の誘導体、フラグメントまたは誘導体を包含する。
用語「変異型」は、また、本明細書において提示するヌクレオチド配列に対してハイブリダイズすることができる配列を包含する。
好ましくは、用語「変異型」は、ストリンジェント条件（例えば、５５℃および０．５×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのNaCl、0.015 Ｎａ₃ クエン酸塩ｐＨ７．０｝）下に本明細書において提示するヌクレオチド配列に対してハイブリダイズすることができる配列に対して相補的である配列を包含する。
【００７５】
より好ましくは、用語「変異型」は、高いストリンジェント条件（例えば、６５℃および０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのNaCl、0.015 Ｎａ₃ クエン酸塩ｐＨ７．０｝）下に本明細書において提示するヌクレオチド配列に対してハイブリダイズすることができる配列に対して相補的である配列を包含する。
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列に対してハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列（本明細書において提示する配列の相補的配列を包含する）に関する。
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列に対してハイブリダイズすることができる配列に対して相補的であるヌクレオチド配列（本明細書において提示する配列の相補的配列を包含する）に関する。
【００７６】
また、中間〜最大のストリンジェント条件下に本明細書において提示するヌクレオチド配列に対してハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列は本発明の範囲内に含まれる。
好ましい観点において、本発明は、ストリンジェント条件（例えば、５５℃および０．２×ＳＳＣ）下に、本発明のヌクレオチド配列、またはその相補体に対してハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を包含する。
より好ましい面において、本発明は、高いストリンジェント条件（例えば、６５℃および０．１×ＳＳＣ）下に、本発明のヌクレオチド配列、またはその補体に対してハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を包含する。
【００７７】
典型的な核酸は、別に、 PDE＿XIV タンパク質をコードしかつ付属する配列のリストに示すＤＮＡ配列の任意の１または複数に対してハイブリダイズするヌクレオチド配列として特徴づけることができる。付属する配列のリストに示す配列またはそれらの補体の任意の１つに対して高いストリンジェンシイ条件下にハイブリダイズする、 PDE＿XIV をコードする、このような配列は好ましい。
好都合には、本発明は、付属する配列のリストに示す配列またはそれらの補体の任意の１つのフラグメントに対して、ストリンジェンシイ条件下に、ハイブリダイズすることができる核酸配列を提供する。好ましくは、フラグメントは１５〜５０塩基の長さである。好都合には、それは約２５塩基の長さである。
【００７８】
本発明の好ましい酵素をコードするヌクレオチド配列に関する、用語「変異型」、「相同体」または「フラグメント」は、生ずるヌクレオチド配列が PDE＿XIV 活性を有する酵素をコードするか、あるいはコードすることができるかぎり、好ましくは付属の配列のリストに示す酵素の任意の１つによりコードされる酵素と少なくとも同様な生物学的活性を有するかぎり、配列からのまたは配列に対する、１つ（またはそれより多く）のアミノ酸の任意の置換、変動、修飾、取替え、欠失または付加を包含する。特に、生ずるヌクレオチド配列が PDE＿XIV 活性を有する酵素をコードするか、あるいはコードすることができるかぎり、用語「相同体」は構造および／または機能に関する相同性を包含する。
【００７９】
配列の相同性に関すると、式Ｉとして示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性が存在する。より好ましくは、式Ｉとして示す配列をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性が存在する。好ましくは、配列の相同体に関すると、付属する配列のリストに示す配列の任意の１つに対して、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性が存在する。より好ましくは、付属する配列のリストに示す配列の任意の１つに対して、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性が存在する。
【００８０】
示されるように、本発明は、 PDE＿XIV をコードするＤＮＡ配列（好ましくはcDNA配列）に関する。特に、本発明は、 PDE＿XIV をコードするcDNA配列に関する。
本発明は、また、付属する配列表に示す配列の任意の１つのＤＮＡ配列またはこのような配列のアレレ変異型からなるＤＮＡセグメントに関する。
本発明は、また、前述のＤＮＡ配列またはそれらのアレル変異型が組込まれた宿主細胞における発現により産生されたポリペプチドに関する。
本発明は、また、付属する配列表に示す配列の任意の１つのＤＮＡ配列またはそれらのアレレ変異型からなるＤＮＡに関する。
【００８１】
本発明は、また、付属する配列表に示す配列の任意の１つのＤＮＡ配列またはそれらのアレレ変異型からなる非天然のＤＮＡに関する。
本発明の高度に好ましい面は、付属する配列表に示す配列の任意の１つのＤＮＡ配列またはそれらのアレレ変異型からなる組換えＤＮＡに関する。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド酸配列を包含する。理解されるように、遺伝子コードの縮重の結果として、ある範囲の異なるポリヌクレオチドは所定のアミノ酸配列をコードする。
【００８２】
本明細書に記載するアミノ酸配列の知識により、本発明のポリペプチドをコードする部分的および全長の核酸配列、例えば、cDNAおよび／またはゲノムのクローンを案出することができる。例えば、本明細書において提示するアミノ酸配列をコードする配列を標的化するように設計されたプロモーターを使用する縮重ＰＣＲを使用して、本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。プロモーターは典型的には多重縮重位置を含有するであろう。
【００８３】
しかしながら、縮重を最小するために、ただ１つのトリプレットによりコードされるアミノ酸、例えば、メチオニンを含有する本明細書において提示するアミノ酸配列の領域をコードする配列を選択する。さらに、その核酸がＰＣＲ法の鋳型ＤＮＡとして使用すされる微生物における、コドンの使用を考慮して、配列は選択されるであろう。既知の配列に対する単一の配列（非縮重）のプライマーを用いる配列のクローニングに使用されるよりも、低いストリンジェンシイの条件下に、ＰＣＲは使用されるであろう。
【００８４】
次いで、ＰＣＲにより得られた、本発明のポリペプチドフラグメントをコードする核酸配列を、ハイブリダイズライブラリー技術に従って使用して、より大きい配列を得ることができる。例えば、ＰＣＲクローンを放射性原子で標識化し、他の種、好ましくは他の哺乳動物種からのcDNAまたはゲノムのライブラリーのスクリーニングに使用することができる。ハイブリダイズ条件は、典型的には、中程度〜高いストリンジェンシイ（例えば、０．０３Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、約５０℃〜約６０℃）の条件であろう。
【００８５】
また、アミノ酸配列のすべてまたは一部分をコードする縮重核酸プローブを使用して、cDNAおよび／またはゲノムのライブラリーを他の種、好ましくは他の哺乳動物種からプローブすることができる。しかしながら、最初にＰＣＲ技術実施して、それ以上のスクリーニング手順において使用するためのシグナル配列を得ることが好ましい。
【００８６】
本発明によれば、 PDE＿XIV 、ポリペプチドのフラグメント、融合タンパク質またはそれらの機能的同等物を使用して、適当な宿主細胞において PDE＿XIV の発現を指令する組換えＤＮＡ分子を発生させることができる。遺伝子コードの固有の縮重のために、実質的に同一であるか、あるいは機能的に同等のアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を使用して、 PDE＿XIV をクローニングし、発現させることができる。当業者は理解するように、天然に存在しないコドンを有するＰＤＥをコードするヌクレオチド配列を生成することが好都合であることがある。特定の原核宿主または真核宿主が好むコドン（Murray E et al.(1989)Nuc.Acids Res.17:477-508 ）を選択して、例えば、 PDE＿XIV の発現を増加するか、あるいは天然に存在する配列から産生された転写物よりも、望ましい性質、例えば、より長い半減期を有する組換えＲＮＡ転写物を生成することができる。
【００８７】
前述の技術を使用して得られた本発明のポリヌクレオチド配列を、前述の技術に従って使用して、相同性配列および変異型をさらに得ることができる。種々の宿主細胞系において本発明のポリペプチドを発現して、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現されている特定の宿主細胞のためのコドンの採択を最適化するために、また、それらの相同性配列および変異型を修飾することができる。制限酵素認識部位を導入するか、あるいはポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの性質または機能を変更するために、他の配列の変化が望ましいことがある。
【００８８】
本発明に従い使用することができる変更された PDE＿XIV ポリヌクレオチド配列は、異なるヌクレオチド残基の欠失、挿入または置換を含んで、同一の、または機能的に同等のＰＤＥをコードするポリヌクレオチドを生ずる。タンパク質はまた、サイレント変化を生成しかつ機能的に同等のＰＤＥを生ずる、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有することができる。ＰＤＥの生物学的活性が保持されるかぎり、残基の極性、電荷、安定性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて、計画的アミノ酸置換を行うことができる。例えば、負に帯電したアミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を包含する；正に帯電したアミノ酸は、リジンおよびアルギニンを包含する；そして非帯電の極性ヘッドをもち、同様な親水性値を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンを包含する。
【００８９】
ＰＤＥのアレルは本発明の範囲内に含まれる。本明細書において使用するとき、「アレル」または「アレル配列」はＰＤＥの多くある中の１つ形態である。アレルは突然変異、すなわち、核酸配列における変化から生じ、そして一般に変更されたmRNAまたはポリペプチド生成し、それらの構造または機能は変更されているか、あるいは変更されていないことがある。任意の所定の遺伝子はアレルの形態をもたないか、あるいは１つまたは多数のアレル形態を有することができる。アレルを生ずる普通の突然変異の変化は、一般に、アミノ酸の欠失、付加または置換に帰属される。これらの変化の型の各々は単独で、あるいは他との組合わせで、所定の配列において１回または２回以上起こることがある。
【００９０】
用語「アレル」は、また、遺伝的多形性、例えば、SNPs（単一のヌクレオチドの多形性）を包含する。
本発明のヌクレオチド配列は種々の理由でＰＤＥコード配列を変更するために操作することができる。このような理由は、遺伝子産物のクローニング、プロセシングおよび／または発現を修飾する変更を包含するが、これらに限定されない。例えば、新しい制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを変更し、あるいはコドンの採択を変化させるために、この分野においてよく知られている技術、例えば、部位特異的突然変異誘発を使用して、突然変異を導入することができる。
【００９１】
本発明のポリヌクレオチドを使用して、プライマー、例えば、ＰＣＲプライマー、オールタネイティブ増幅反応のためのプライマー、プローブ、例えば、放射性または非放射性の標識を使用する慣用手段により顕現標識で標識化されたプローブを生成することができるか、あるいはポリヌクレオチドをベクターの中にクローニングすることができる。このようなプライマー、プローブおよび他のフラグメントは少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば、少なくとも２５、３０または４０ヌクレオチドの長さであり、そしてまた、本明細書において使用する本発明のヌクレオチドという用語に包含される。
【００９２】
本発明のポリヌクレオチドまたはプロモーターは顕現標識を有することができる。適当なレベルは、放射性同位元素、例えば、³²Ｐまたは³⁵Ｓ、酵素の標識、または他のタンパク質の標識、例えば、ビオチンを包含する。このような標識は、それ自体知られている技術に従い、本発明のポリヌクレオチドまたはプライマーに付加し、検出することができる。
本発明によるポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドおよびプライマーは、組換え的に、合成的に製造するか、あるいは当業者に利用可能な任意の手段により製造することができる。また、それらを標準的技術によりクローニングすることができる。
【００９３】
一般に、プライマーは合成手段により製造されるであろう、このような合成手段は一度に１つのヌクレオチドの所望の核酸配列の段階的製造を包含する。自動化技術を使用してこれを達成する技術は、この分野において容易に入手可能である。
より長いポリヌクレオチドは、一般に、組換え手段、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術により製造されるであろう。これは、クローニングしようとするヌクレオチド配列の領域に対して１対のプライマー（例えば、約１５〜３０ヌクレオチドの）を作り、プライマーを菌類、植物または原核細胞から得られたmRNAまたはcDNAと接触させ、所望の領域の増幅を生じさせる条件下にポリメラーゼ連鎖反応を実施し、増幅されたフラグメントを単離し（例えば、反応混合物をアガロースゲル上で精製することによって）そして増幅されたＤＮＡを回収することを含む。増幅されたＤＮＡを適当なクローニングベクターの中にクローニングできるように、適当な制限酵素認識部位を含有するようにプライマーを設計することができる。
【００９４】
細胞内の安定性および半減期を増加するように、ＤＮＡ分子を修飾することができる。可能な修飾は、分子の５’および／または３’末端のフランキング配列の付加または分子の主鎖内のホスホジエステラーゼ結合よりむしろホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルの使用を包含するが、これらに限定されない。
前述したように、本発明は、また、付属の配列のリストに示す配列の任意の１つのすべてまたは一部分にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列またはそれらのアレレ変異型に関する。これらのヌクレオチド配列をアンチセンス技術において使用して、 PDE＿XIV の発現を修飾することができる。また、これらの配列（またはその一部分）をプローブとして使用することができるか、あるいはポリメラーゼ連鎖反応のプライマーとして使用するとき、このような配列のすべてまたは一部分を修飾するために使用することができる。
【００９５】
組換えＤＮＡ配列に加えて、ゲノム配列はまた薬剤の発見の関係において実用性を有する。特定のイソ型のmRNA転写を阻害することは、その翻訳されたタンパク質を阻害することよりも、価値があるであろう。スプライス変異型が存在し、それらの異なるスプライス変異型を異なるプロモーターから転写することができる場合、これは PDE＿XIV を使用するとき真実であろう。マウス脳の２’，３’−環状ヌクレオチド３’ホスホジエステラーゼの転写を指令する多重プロモーターの先例が存在する（Kurihala T.et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.170:1074 ［1990］) 。
【００９６】
本発明の他の実用性は、ＤＮＡ配列が、いったん知られれると、アイソザイムまたはスプライス変異型を特異的に検出するアッセイを設計するために必要な情報を与えるということである。アイソザイム特異的ＰＣＲプライマーの対は、アイソザイムまたはスプライス変異型の特異的ＤＮＡ配列の知識に完全に依存するアッセイの唯一の例である。このようなアッセイはアイソザイムのmRNAの検出を可能として、各アイソザイムの組織の分布および特定の疾患の状態に対する生物学的関連性をアクセスすることができる。また、このアッセイはただ１つのアイソザイムを自然に発現することができる細胞系統の同定−組換え遺伝子を発現する必要性を排除する発見−を可能とする。特異的 PDE＿XIV アイソザイムが特定の疾患の状態に関連することが示される場合、本発明はアイソザイムmRNAを検出する診断アッセイの設計において価値があるであろう。
【００９７】
生物学的試料中の PDE＿XIV をコードするヌクレオチド配列の異常なレベルは、染色体の異常、例えば、核酸の欠失または突然変異を反映するであろう。したがって、 PDE＿XIV をコードするヌクレオチド配列は、ＰＤＥをコードする遺伝子における染色体の異常、例えば、欠失、突然変異または染色体の転位を検出するために診断的に使用できるプローブの基準を提供する。 PDE＿XIV 遺伝子の発現はこのような疾患の状態において変更されることがあるか、あるいは PDE＿XIV をコードする遺伝子の領域の中に存在する染色体の異常が存在することがある。
【００９８】
本発明の別の態様において、この分野においてよく知られている化学的方法に従い、ＰＤＥのコード配列の全体または一部分を合成することができる（Caruthers MH et al.(1980)Nuc.Acids Res.Symp.Ser.215-23、 Horn T et al.(1980)Nuc.Acids Res.Symp.Ser.225-233 、を参照のこと）。
天然に存在する
本明細書において使用する「天然に存在する」は、天然に見出されるアミノ酸配列を有する PDE＿XIV を意味する。
【００９９】
単離された／精製された
本明細書において使用する「単離された／精製された」は、天然の環境から取出されそして、天然に関連する少なくとも１つの他の成分から単離または分離された、分子、核酸配列またはアミノ酸配列を意味する。
生物学的活性
本明細書において使用する「生物学的活性」は、天然に存在する PDE＿XIV と同様な構造的機能（しかし同一程度に必要ではない）、および／または同様な調節機能（しかし同一程度に必要ではない）、および／または同様な生化学的機能（しかし同一程度に必要ではない）、および／または免疫学的活性（しかし同一程度に必要ではない）を有する、本発明による PDE＿XIV −例えば、組換え PDE＿XIV −を意味する。
【０１００】
免疫学的活性
本明細書において使用する「免疫学的活性」は、適当な動物または細胞において特異的免疫応答を誘導しかつ特異的抗体と結合する、天然、組換えもしくは合成の PDE＿XIV またはそのオリゴペプチドの能力として定義される。
誘導体
アミノ酸配列に関して本明細書において使用する用語「誘導体」は、 PDE＿XIV の化学的修飾を包含する。このような修飾は、アルキル、アシルまたはアミノ基による水素の置換であろう。
【０１０１】
欠失
本明細書において使用する「欠失」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化であって、それぞれ、１または複数のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が存在しないものとして定義される。
挿入／付加
本明細書において使用する「挿入または付加」は、天然に存在するＰＤＥに比較して、それぞれ、１または複数のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の付加が生じたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化である。
【０１０２】
置換
本明細書において使用する「置換」は、それぞれ、異なるヌクレオチドまたはアミノ酸による１または複数のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の置換から生ずる。
相同体
本発明のヌクレオチド配列および本発明のアミノ酸配列に関する用語「相同体」は、配列のアレル変異型と同義であることができる。
【０１０３】
特に、用語「相同性」は、本明細書において使用するとき、用語「同一性」に等しい場合がある。ここで、本発明のヌクレオチド配列および本発明のアミノ酸配列に関する配列の相同性は、１又は複数の配列と他の配列との単純な肉眼比較（すなわち、厳格な比較）により、その配列に対して他の配列が７５％以上の同一性を有するか否かを知ることにより決定することができる。配列の相対的相同性（すなわち、配列の同一性）はまた、２以上の配列の間の相同性％を計算できる商業的に入手可能なコンピュータープログラムにより決定することができる。このようなコンピュータープログラムはCLUSTAL である。
【０１０４】
相同性％は隣接する配列にわたって計算することができる。すなわち、１つの配列を他の配列と整列させ、そして１つの配列中の各アミノ酸を他の配列中の対応するアミノ酸と、一度に１つの残基で、比較する。これは「アンギャップド」整列と呼ばれる。典型的には、このようなアンギャップド整列は比較的小さい数の残基（例えば、５０より小さい隣接アミノ酸）にわたってのみ実施される。
【０１０５】
これは非常に簡単な、終始一貫した方法であるが、例えば、そうでなければ同一の対の配列において、１つの挿入または欠失により次に続くアミノ酸残基を整列から除外し、こうして包括的整列を実施するときに相同性％の大きい減少を生ずるということを考慮していない。従って、大部分の配列比較法は、全体の相同性のスコアに不当にペナルティーを課さないで、起こりうる挿入および欠失を考慮する最適な整列を生成するように設計される。これは配列の整列の中に「ギャップ」を挿入して局所的相同性を最大とすることを試みることによって達成される。
【０１０６】
しかしながら、これらのいっそう複雑な方法は整列の中に生ずる各ギャップに「ギャップペナルティー」を割り当て、こうして、同一数の同一アミノ酸について、できるだけ少ないギャップをもつ配列の整列−２つの比較した配列の間のより高い関連性を反映する−は多数のギャップをもつものよりも高いスコアを達成するようにする。典型的には、「密接な関係のあるギャップのコスト」を使用する。密接な関係のあるギャップのコストは、ギャップの存在について比較的高いコストを負荷し、そしてギャップ中の各引き続く残基に小さいペナルティーを負荷する。
【０１０７】
これは最も普通に使用されているギャップのスコアリングシステムである。高いギャップのペナルティーは、もちろん、より少ないギャップをもつ最適化された整列を生成するであろう。大部分の整列プログラムは、ギャップのペナルティーの変更を可能とする。しかしながら、このような配列の比較のソフトウェア使用するとき、デフォルト値を使用するすることが好ましい。例えば、ＧＣＧウィスコンシン・ベストフィット（Wisconsin Bestfit ）パッケージ（下記を参照のこと）を使用するとき、アミノ酸配列についてのデフォルトギャップペナルティーはギャップについて−１２であり、そして各エクステンションについて−４である。
【０１０８】
したがって、最大の相同性％の計算は、ギャップペナルティー考慮する、最適な整列の生成をまず必要とする。このような整列を実施するために適当なコンピュータープログラムはＧＣＧウィスコンシン・ベストフィット・パッケージである（University of Wisconsin,U.S.A.;Devereux et al.,1984,Nucleic Acids Research 12:387 ）。配列の比較を実施できる以外の他のソフトウェアの例は下記のものを包含するが、これらに限定されない：ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubel et al.,1999 ibid-Chapter 18,参照）、FASTA(Atschul et al.,1990,J.Mol.Biol.403-410) および比較ツールのGENEWORKS スウィート。BLAST およびFASTA の双方はオフラインおよびオンラインの検索について入手可能である（Ausubel et al., 1999 ibid, pp.7-58〜7-60、参照）。しかしながら、ある適用のために、ＧＣＧベストフィットプログラムを使用することが好ましい。
【０１０９】
最終的相同性％を同一性により測定することができるが、ある場合において、整列プロセスそれ自体は典型的には有るか無いかの対の比較に基づかない。その代わりに、目盛りのある同様なスコアマトリックスが一般に使用される。このマトリックスは、化学的類似性または進化距離に基づいて各対ずつの比較にスコアを割り当てる。このような普通に使用されているマトリックスの１例はBLOSUM62マトリックス−プログラムのBLAST スウィートのためのデフォルトマトリックスである。一般に、ＧＣＧウィスコンシンプログラムは、公衆用デフォルト値、あるいは、供給される場合、カスタムの記号比較テーブルを使用する（それ以上の詳細については、ユーザーのマニュアルを参照のこと）。ＧＣＧパッケージのための公衆用デフォルト値を使用するか、あるいは他のソフトウェアの場合において、デフォルトマトリックス、例えば、BLOSUM62を使用することが好ましい。
【０１１０】
いったんソフトウェアが最適な整列を生成したとき、相同性％、好ましくは配列の同一性％を計算することができる。ソフトウェアは、典型的には、配列の比較の一部分としてこれを実施し、そして数値の結果を発生する。
示したように、ある用途について、配列の相同性（または同一性）は任意の適当な相同性の整列を使用して、例えば、デフォルトパラメーターを使用して決定することができる。好都合には、デフォルト値に対して設定されたパラメーターを使用して、BLAST アルゴリズムを用いる。BLAST アルゴリズムは、http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast ＿hel.html. に詳細に記載されている。検索のパラメーターは次のように定義され、そして定義されたデフォルトパラメーターに対して好都合に設定される。
【０１１１】
好都合には、BLAST により評価された「実質的な相同性」は、少なくとも約７、好ましくは少なくとも約９、最も好ましくは１０またはそれ多いEXPECT値と合致する配列に等しい。BLAST 検索におけるEXPECTについてのデフォルト限界値は通常１０である。
【０１１２】
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool ）は、プログラムblastp,blastn,tblastn,およびtblastx により用いられる発見的検索アルゴリズムである；これらのプログラムは意味をわずかの強化を伴うKarlinおよびAltschulの統計的方法(http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast＿hel.html. 参照）を使用するそれらの結果とみなす。BLAST プログラムは配列の類似性の検索のために、例えば、疑問の配列に対する相同体を同定するために、製作される。プログラムはモチーフスタイルの検索について一般に有用ではない。配列のデータベースの類似性の検索における基本的刊行物の論考については、下記の文献を参照のこと：Altschul et al.(1994)Nature Genetics 6:119-129。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov において入手可能なBLAST プログラムは、下記の仕事を実行する：
【０１１３】
blastpは、タンパク質配列のデータベースに対するアミノ酸の疑問配列を比較する；
blastnは、ヌクレオチド配列のデータベースに対してヌクレオチドの疑問配列を比較する；
blastxは、タンパク質配列のデータベースに対するヌクレオチドの疑問配列（双方の鎖）の６フレームの概念的翻訳産物からなる；
tblastn は、すべての６つのリーディングフレーム（双方の鎖）においてダイナミックに翻訳されたヌクレオチド配列に対するタンパク質の疑問配列を比較する；
【０１１４】
tblastx は、ヌクレオチド配列のデータベースの６フレームの翻訳に対するヌクレオチド疑問配列の６フレームの翻訳を比較する；
BLAST は下記の検索パラメーターを使用する：
HISTOGRAM 各検索のためのスコアのヒストグラムドをディスプレイする；デフォルトはｙｅｓである。（BLAST マニュアル中のパラメーターＨ参照）。
DESCRIPTIONS 特定した数に対して報告された合致する配列の短い記載の数を制限する；デフォルトの限界は１００記載である。（マニュアルのページのパラメーターＶ参照）。また、EXPECTおよびCUTOFF参照。
【０１１５】
ALIGNMENTS 高いスコアリングセグメント対（HSPs）が報告されている特定された数に対してデータベースの配列を制限する；デフォルトの限界は５０である。これより多いデータベースの配列が報告のための統計的に有意である限界値を満足することがあった場合（下記のEXPECTおよびCUTOFF参照）、合致が帰属する最大の統計的意味のみを報告する。（BLAST マニュアル中のパラメーターＢ参照）。
【０１１６】
EXPECT データベースの配列に対する合致を報告する統計的に有意である限界値；KarlinおよびAltschul(1990)の確率モデルに従い、デフォルト値は１０であり、こうして１０の合致が偶然に見出されることが期待される。合致に帰属される統計的意味がEXPECT限界値より大きい場合、合致は報告されない。より低いEXPECT限界値はいっそう厳格であり、より少ない機会の合致が報告されることになる。（BLAST マニュアル中のパラメーターＥ参照）。
【０１１７】
CUTOFF 高いスコアリングセグメント対を報告するカットオフスコア。デフォルト値はEXPECT値（上を参照）から計算される。HSPsに帰属される統計的意味がCUTOFF値に等しいスコアを有する唯一のＨＳＰに帰属される程度に少なくとも高い場合にのみ、HSPsはデータベースの配列について報告される。より高いCUTOFF値はいっそう厳格であり、より少ない機会の合致が報告されることになる。（BLAST マニュアル中のパラメーターＳ参照）。典型的には、EXPECTを使用して、意味の限界値をいっそう直観的に管理することができる。
【０１１８】
MATRIX BLASTP, BLASTX, TBLASTNおよびTBLASTX のための別のスコアリングマトリックスを特定する。デフォルトマトリックスはBLOSUM62である（Henikoff & Henikoff, 1992)。有効な別の選択は下記のものを包含する：PAM40, PAM120, PAM250 およびIDENTITY。別のスコアリングマトリックスはBLASTNについて入手可能ではない；BLASTNにおいて欠如するMATRIXの特定はエラーの応答に戻る。
STRAND データベースの配列のちょうど上部または下部の鎖に対するTBLASTN 検索を制限する；または疑問配列の上部または下部上のちょうどリーディングフレームに対するBLASTN, BLASTXまたはTBLASTX の検索を制限する。
【０１１９】
FILTER Wootton & Federhen(1993)Computers and Chemistry 17:149-163 のＳＥＧプログラムにより決定して、低い組成の複雑さを有する疑問配列のセグメントをマスクするか、あるいはClaverie & States(1993)Computers and Chemistry 17:191-201 のＸＮＵプログラムにより、またはBLASTNについて、Tatusov およびLipmanのDUSTプログラム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov 参照）決定して、短い周期の内部の反復から成るセグメントをマスクする。フィルタリングは統計的に有意であるが、生物学的に重要でない報告をブラストアウトプット（例えば、普通の酸性、塩基性またはプロリンに富んだ領域に対するヒット）から排除し、データベースの配列に対する特異的合致に有効な疑問配列のいっそう生物学的に重要な領域を残す。
【０１２０】
フィルタープログラムにより見出される複雑さの低い配列を、ヌクレオチド配列において文字「Ｎ」を使用して（例えば、「NNNNNNNNNNNNN 」）で置換し、そしてタンパク質において文字「Ｘ」を使用して（例えば、「XXXXXXXXX 」）で置換する。
フィルタリングが疑問配列（またはその翻訳産物）のみ適用され、データベースの配列に適用されない。
【０１２１】
SWISS-PROT中の配列に適用するとき、ＳＥＧ、ＸＮＵ、または双方によりまったくマスクされないことは異常でないので、フィルタリングは常に効果を生ずることを実験すべきではない。さらに、ある場合において、配列はそれらの全体においてマスクされ、フィルタリングされない疑問配列に対して報告された合致が存在する場合、それらの合致の統計的意味を疑うべきであることを示す。
NCBI-gi は、アクセスおよび／または遺伝子座の名称に加えて、アウトプットの中にＮＣＢＩｇｉ同定因子を表示させる。
最も好ましくは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST において提供される簡単なBLAST 検索アルゴリズムを使用して、配列の比較を実施する。
配列を同定するとき、ギャップペナルティーを使用すべきであり、好ましくは下記のパラメーターを使用する：
【０１２２】
【表２】

【０１２３】
２つの配列の間の同一性および類似性を決定する他のコンピュータープログラムは、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux et al.,1984,Nucleic Acids Research 12:387) およびFASTA(Atschul et al.,1990,J.Molec.Biol.403-410）を包含するが、これらに限定されない。
【０１２４】
ポリペプチドの変異型および誘導体
本発明のアミノ酸配列に関する用語「変異型」および「誘導体」は、生ずるアミノ酸配列がＰＤＥ活性を有する、好ましくは配列表中に表されているポリペプチドの任意の１つと少なくとも同一の活性を有するかぎり、配列たらまたは配列に対する１（またはそれ以上）のアミノ酸の任意の置換、変動、修飾、取替え、欠失または付加を包含する。
【０１２５】
本発明の配列は本発明において使用するために修飾することができる。典型的には、配列のＰＤＥ活性を維持するように、修飾はなされる。アミノ酸の置換は、修飾された配列がＰＤＥ活性を保持するかぎり、例えば、１、２または３〜１０、２０または３０の置換であることができる。アミノ酸配列の置換は、例えば、療法的に投与されたポリペプチドの血漿中の半減期を増加するために、天然に存在しない類似体の使用を包含する。
保存的置換は、例えば、下記表に従い、行うことができる。第２列中の同一ブロック、好ましくは第３列中の同一ライン中のアミノ酸を互いに置換することができる：
【０１２６】
【表３】

【０１２７】
上に示したように、本発明のタンパク質は、典型的には、組換え手段により、例えば本明細書において記載するように、そして／または当業者によく知られている技術、例えば固相合成を使用する合成手段により製造される。このような配列の変異型および誘導体は融合タンパク質を包含し、ここで融合タンパク質は他のアミノ酸配列に結合した（直接的または間接的に）少なくとも本発明のアミノ酸配列からなる。
【０１２８】
これらの他のアミノ酸配列−これらは時には融合タンパク質の相手と呼ぶ−は典型的には好適な機能性を付与して−例えば、本発明のアミノ酸配列の抽出および精製を促進するであろう。融合タンパク質の相手は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓ、GAL4（ＤＮＡ結合ドメインおよび／または転写活性化ドメイン）およびβ−ガラクトシダーゼを包含する。また、融合タンパク質の相手と本発明のタンパク質配列との間にタンパク質分解切断部位を含めて後者の除去を可能とすることは好都合であることがある。好ましくは、融合タンパク質の相手は本発明のタンパク質の機能を妨害しない。
【０１２９】
ポリヌクレオチドの変異型および誘導体
本発明のヌクレオチド配列に関する用語「変異型」および「誘導体」は、生ずるヌクレオチド配列がＰＤＥ活性を有する、好ましくは配列表の中に表されている配列の任意の１つと少なくとも同一の活性を有するポリペプチドをコードするかぎり、配列からまたは配列に対する１（またはそれ以上）の核酸の任意の置換、変動、修飾、取替え、欠失または付加を包含する。
【０１３０】
上に示したように、配列の相同性に関し、本明細書において配列表に示す配列に対して好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性が存在する。より好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性が存在する。ヌクレオチドの相同性の比較は前述したように実施することができる。いくつかの用途について、好ましい配列の比較のプログラムは、前述のＧＣＧウィスコンシン・ベストフィットである。デフォルトスコアリングマトリックスは、各同一ヌクレオチドについて１０および各ミスマッチについて−９の合致値を有する。各ヌクレオチドについて、デフォルトギャップ発生のペナルティーは−５０であり、そしてデフォルトギャップエクステンションのペナルティーは−３である。
【０１３１】
本明細書において使用するとき、用語「変異型」、「相同性」、「フラグメント」および「誘導体」は、配列のアレレ変異型を包含する。
用語「変異型」は、また、本明細書において表示されるヌクレオチド配列に対してハイブリダイズすることができる配列に対して相補的である配列を包含する。
【０１３２】
ハイブリダイズ
本明細書において使用する用語「ハイブリダイズ」は、「核酸の鎖を塩基対を通して相補的鎖と結合させる方法」（Coombs J(1994)Dictionary of Biotechnology, Stockton Press,New York,NY)ならびにDieffenbach CWおよびGS Dveksler(1995,PCR Primer,a Labotatory Manual,Cold Spring Harbor Press,Plainview NY ）に記載されているようなポリメラーゼ連鎖反応技術において実施されたような増幅方法を包含するであろう。
【０１３３】
ハイブリダイズ条件は、BergerおよびKimmel(1987,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology,Vol.152, Academic Press,カリフォルニア州サンディエゴ）に教示されているように、核酸結合複合体の融点（Ｔｍ）に基づき、そして以後説明するように定められた「ストリンジェンシイ」を付与する。
【０１３４】
ハイブリダイズのストリンジェンシイは、ポリ核酸のハイブリッドが安定である条件を意味する。このような条件は当業者にとって明らかである。当業者に知られているいるように、ハイブリッドの安定性はハイブリッドの融点（Ｔｍ）において反映され、ここで融点（Ｔｍ）は配列の相同性の１％減少毎にほぼ１〜１．５℃だけ低下する。一般に、ハイブリッドの安定性はナトリウムイオンおよび温度の関数である。典型的には、ハイブリダイズ反応はより高いストリンジェンシイおよび引き続く変化するストリンジェンシイの洗浄の条件下に実施される。本明細書において使用するとき、高いストリンジェンシイは１ＭのＮａ⁺ 中で６５〜６８℃において安定にハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイズを可能とする条件を意味する。
【０１３５】
最大のストリンジェンシイは典型的には約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５℃低い）において起こる。
高いストリンジェンシイはプローブのＴｍよりも約５℃〜１０℃低い温度において起こる。高いストリンジェンシイ条件は、例えば、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１ Ｎａ＋ピロリン酸塩および非特異的競合体として０．１ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含有する水溶液中のハイブリダイズにより提供される。ハイブリダイズ後、高いストリンジェンシイの洗浄をいくつかの工程において実施することができ、最終の洗浄（約３０分）は０．２〜０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中でハイブリダイズ温度において実施することができる。
【０１３６】
中程度の、または中間のストリンジェンシイは典型的にはプローブのＴｍよりも約１０℃〜２０℃低い温度において発生する。
低いストリンジェンシイは典型的にはプローブのＴｍよりも約２０℃〜２５℃低い温度において発生する。
当業者は理解するように、最大のストリンジェンシイのハイブリダイズを使用して同一のポリヌクレオチド配列を同定または検出することができるが、中間の（低い）ストリンジェンシイのハイブリダイズを使用して同様なまたは関係するポリヌクレオチド配列を同定または検出することができる。
【０１３７】
中程度のストリンジェンシイは、前述の溶液中であるが、約６０〜６２℃におけるハイブリダイズに等しい条件を意味する。その場合において、最終の洗浄は１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中でハイブリダイズ温度において実施される。
低いストリンジェンシイは、前述の溶液中で約５０〜５２℃におけるハイブリダイズに等しい条件を意味する。その場合において、最終の洗浄は２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでハイブリダイズ温度において実施される。
ある用途のために、低い〜中程度のストリンジェンシイ条件を使用して、異なる生物からの同様な酵素コード配列を同定することは有用であることがある。
【０１３８】
理解されるように、これらの条件は種々の緩衝液、例えば、ホルムアミドをベースとする緩衝液、および温度を使用して適合させかつ重複させることができる。デンハルト溶液およびＳＳＣならびに他の適当なハイブリダイズ緩衝液は当業者によく知られている（例えば、下記の文献を参照のこと：Sambrook,et al. 編（1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York またはAusubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.) 。プローブの長さおよびＧＣ含量もまたある役割を演ずるので、最適なハイブリダイズ条件を実験的に決定しなくてはならない。
【０１３９】
本明細書において表示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる本発明のポリヌクレオチドは、本明細書において表示される対応するヌクレオチド配列に対して、少なくとも２０、好ましくは少なくとも２５または３０、例えば、少なくとも４０、６０または１００またはそれ多い隣接ヌクレオチドの領域にわたって、一般に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは少なくとも９５％または９８％の相同性を有するであろう。
【０１４０】
用語「選択的にハイブリダイズ可能」は、本発明のターゲットポリヌクレオチドがバックグラウンドよりも有意に高いレベルにおいてプローブにハイブリダイズすることが見出された条件下に、プローブとして使用するポリヌクレオチドを使用することを意味する。バックグラウンドのハイブリダイズは、他のポリヌクレオチドが、例えば、スクリーニングするcDNAまたはゲノムＤＮＡのライブラリーの中に存在するために、起こることがある。この場合において、バックグラウンドは、プローブとライブラリーの非特異的ＤＮＡメンバーとの間の相互作用により発生するシグナルのレベルを意味し、この相互作用はターゲットＤＮＡを使用して観測される特異的相互作用よりも強度が１０倍、好ましくは１００倍より小さい。本発明の強度は、例えば、プローブを、例えば、³²Ｐで放射能標識化することによって測定することができる。
【０１４１】
好ましい観点において、本発明は、ストリンジェント条件（例えば、６０℃および０．２×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０，１５ＭのNaCl、0.015 ＭのＮａ₃ クエン酸塩ｐＨ７．０｝）下に任意の１または複数の本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を包含する。
より好ましい面において、本発明は、ストリンジェント条件（例えば、６５℃および０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０，１５ＭのNaCl、0.015 ＭのＮａ₃ クエン酸塩ｐＨ７．０｝）下に任意の１または複数の本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を包含する。
【０１４２】
本発明のポリヌクレオチドが二本鎖である場合、二本鎖の双方の鎖は、個々にまたは組合わせで、本発明に包含される。本発明のポリヌクレオチドが一本鎖である場合、ポリヌクレオチドの相補的配列は、また、本発明の範囲内に含まれる。
本発明の配列に対して１００％相同性ではないが、本発明の範囲内に入るポリヌクレオチドは、多数の方法において得ることができる。本明細書において記載する他の種々の配列は、例えば、ある範囲の個体から、例えば、異なる集団からの個体から、作られたＤＮＡライブラリーをプロービングすることによって得ることができる。
【０１４３】
さらに、他のウイルス／細菌、または細胞の相同体、特に哺乳動物細胞（例えば、ラット、ウシおよび霊長類の細胞）の中に見出される細胞の相同体を得ることができ、そしてこのような相同体およびそれらのフラグメントは一般に本明細書において列挙する配列に示す配列に選択的にハイブリダイゼーションすることができるであろう。このような配列は、他の動物種からのcDNAライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーをプロービングし、そして付属する配列のリスト中の配列の任意の１つからなるプローブを使用して、このようなライブラリーを中程度〜高いストリンジェンシイの条件下にプロービングすることによって、得ることができる。本発明のポリペプチドまたはヌクレオチド配列の種の相同性およびアレレの変異型に、同様な考察が適用される。
【０１４４】
変異型および株／種の相同体はまた、縮重ＰＣＲを使用して得ることができる。縮重ＰＣＲは、本発明の配列内の保存されたアミノ酸配列をコードする変異型または相同体内の配列ターゲットするように設計されたプライマーを使用する。保存された配列は、例えば、選択的変異型／相同体からのアミノ酸配列を整列させることによって、予測することができる。配列の整列は、この分野において知られているコンピューターのソフトウェアを使用して実施することができる。例えば、ＧＣＧウィスコンシン・パイルアップ（PileUp）プログラムが広く使用されている。
【０１４５】
デジェネレイトＰＣＲにおいて使用するプライマーは１または複数の縮重位置を含有し、そして既知の配列に対する単一の配列のプライマーを使用する配列のクローニングに使用するよりも、低いストリンジェンシイの条件において使用されるであろう。
あるいは、このようなポリヌクレオチドは、特性決定された配列の部位特異的突然変異誘発により得ることができる。これは、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現されている特定の宿主細胞のためにコドンの採択を最適化するために、サイレントコドンの変化が配列に対して要求される場合において、有用であることがある。制限酵素認識部位を導入するために、あるいはポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの性質または機能を変更するために、他の配列の変化を必要とすることがある。
【０１４６】
本発明のポリヌクレオチドを使用して、プライマー、例えば、ＰＣＲプライマー、オールタネイティブ増幅反応のためのプライマー、プローブ、例えば、放射性または非放射性標識を使用する慣用手段により顕現標識で標識化されたプローブを製造することができるか、あるいはポリヌクレオチドをベクターの中にクローニングすることができる。このようなプライマー、プローブまたは他のフラグメントは、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば、少なくとも２５、３０または４０ヌクレオチドの長さであり、そしてまた、本明細書において使用する本発明のポリヌクレオチドという用語により包含される。
【０１４７】
本発明によるポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドおよびプローブは、組換え的に、合成的に製造するか、あるいは当業者に利用可能な任意の手段により製造することができる。また、それらを標準的技術によりクローニングすることができる。
一般に、プライマーは合成手段により製造されるであろう、このような合成手段は一度に１つのヌクレオチドの所望の核酸配列の段階的製造を包含する。自動化技術を使用してこれを達成する技術は、この分野において容易に入手可能である。
【０１４８】
より長いポリヌクレオチドは、一般に、組換え手段、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術により製造されるであろう。これは、クローニングしようとする脂質ターゲッティング配列の領域をフランキングする１対のプライマー（例えば、約１５〜３０ヌクレオチドの）を作り、プライマーを動物またはヒト細胞から得られたmRNAまたはcDNAと接触させ、所望の領域の増幅を生じさせる条件下にポリメラーゼ連鎖反応を実施し、増幅されたフラグメントを単離し（例えば、反応混合物をアガロースゲル上で精製することによって）そして増幅されたＤＮＡを回収することを含む。増幅されたＤＮＡを適当なクローニングベクターの中にクローニングできるように、適当な制限酵素認識部位を含有するようにプライマーを設計することができる。
【０１４９】
調節配列
好ましくは、コード配列を、例えば、選択された宿主細胞により、発現することができる調節配列に、本発明のポリヌクレオチドを作用可能に連結する。１例として、本発明は。このような調節配列に作用可能に連結された本発明のポリヌクレオチドからなるベクターを包含する、すなわち、ベクターは発現ベクターである。
【０１５０】
用語「作用可能に連結された」は、記載する成分がそれらの意図する方法で機能できる関係にある、並列位置を意味する。コントロール配列とコンパティブルである条件下にコード配列の発現が達成されるように、コード配列に「作用可能に連結された」調節配列が結合される。
用語「調節配列」は、プロモーターおよびエンハンサー並びに他の発現調節シグナルを包含する。
用語「プロモーター」は、この分野での標準の意味において使用され、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位である。
【０１５１】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現の増強はまた、選択された発現宿主からの注目のタンパク質の発現および、所望ならば、分泌レベル、を増加し、そして／または本発明のポリペプチドの発現の誘導可能なコントロールを提供する働きをする、異種調節領域、例えば、プロモーター、分泌リーダーおよびターミネーター領域の選択により達成することができる。
好ましくは、本発明のヌクレオチド配列を少なくとも２つのプロモーターに作用可能に連結することができる。
【０１５２】
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子に対して固有であるプロモーターを別として、他のプロモーターを使用して本発明のポリペプチドの発現を指令することができる。プロモーターは、所望の発現宿主における本発明のポリペプチドの発現を指令する、その効能について選択することができる。
他の態様において、構成的プロモーターを選択して、本発明の所望のポリペプチドの発現を指令することができる。このような発現構築物は、誘導基質を含有する培地上で発現宿主を培養する必要性を回避するので、追加の利点を提供する。
【０１５３】
菌類の発現宿主において使用するために好ましい、強い構成的および／または誘導可能なプロモーターの例は、キシラナーゼ（xlnA）、フィターゼ、ＡＴＰシンターゼ、サブユニット９（oliC）、トリオースホスフェートイソメラーゼ（ｔｐｉ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（AldhA ）、α−アミラーゼ（ａｍｙ）、アミログルコシダーゼ（AG-glaA 遺伝子から）、アセトアミダーゼ（amdS）およびグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｇｐｄ）のプロモーターの菌類の遺伝子から得るすることができるものである。
【０１５４】
強い酵母のプロモーターの例は、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、３−ホスホグリセレートキナーゼおよびトリオースホスフェートイソメラーゼの遺伝子から得ることができるものである。
強い細菌のプロモーターの例は、α−アミラーゼおよびSP02プロモーターならびに細胞外プロテアーゼ遺伝子からのプロモーターである。
また、ハイブリッドプロモーターを使用して、発現構築物の誘導可能な調節を改良することができる。
【０１５５】
プロモーターは適当な宿主における発現を増強するか、あるいは増加する特徴をさらに含むことができる。例えば、特徴は保存された領域、例えば、Pribnow BoxまたはTATAボックスであることができる。プロモーターは本発明のヌクレオチド配列の発現レベルに影響を与える（例えば、維持する、増強する、減少させる）他の配列を含有することさえできる。例えば、適当な他の配列はＳｈ１−イントロンまたはＡＤＨイントロンを包含する。他の配列は誘導可能な因子−例えば、温度、化学的、光またはストレスの誘導可能な因子を包含する。また、転写または翻訳を増強する適当な因子が存在することができる。後者の因子の例は、TMV5’シグナル配列である（Sleat Gene 217［1987］217-225;およびDawson,Plant Mol.Biol.23 [1993] 97、参照）。
【０１５６】
分泌
しばしば、本発明のポリペプチドは発現宿主から培地の中に分泌されることが望ましく、この培地から本発明のポリペプチドは最も容易に回収することができる。本発明によれば、分泌リーダー配列は所望の発現宿主に基づいて選択することができる。また、ハイブリッドシグナル配列を本発明の関係して使用することができる。
異種分泌リーダー配列の典型的な例は、菌類のアミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（glaA−例えば、アスペルギルス（Aspergillus ）からの、１８および２４アミノ酸のバージョン）、ａ−因子の遺伝子（酵母、例えば、サッカロマイセス（Saccharomyces ）およびクルイベロマイセス（Kluyveromyces)) またはα−アミラーゼ（バシラス（Bacillus))から由来するものである。
【０１５７】
構築物
用語「構築物」−これは「複合体」、「カセット」および「ハイブリッド」のような用語と同義である−は、プロモーターに直接的または間接的に結合したヌクレオチド配列を包含する。間接的結合の例は、プロモーターと本発明のヌクレオチド配列の中間に適当なスペーサー基、例えば、イントロン配列、例えば、Ｓｈ１−イントロンおよびＡＤＨイントロンを設けることである。同一の事柄は本発明に関する用語「融合」について真実であり、これは直接的または間接的結合を包含する。各場合において、用語は通常野生型遺伝子のプロモーターに関連するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の天然の組合わせを包含せず、そしてそれらの双方が天然の環境の中に存在するときを包含しない。
【０１５８】
構築物は、例えば、細菌、好ましくはバシラス（Bacillus）属の細菌、例えば、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）、またはそれが形質転換された植物における、遺伝的構築物の選択を可能とするマーカーを含有するか、あるいは発現することさえできる。使用することができる種々のマーカーが存在し、例えば、マンノース−６−ホスフェートイソメラーゼ（特に植物のための）をコードするもの、あるいは抗生物質耐性、例えば、G418、ヒグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシンおよびゲンタマイシンに対する耐性を提供するマーカーが存在する。
好ましくは、本発明の構築物は、少なくとも、プライマーに作用可能に連鎖された本発明のヌクレオチド配列からなる。
【０１５９】
ベクター
用語「ベクター」は、発現ベクターおよび形質転換ベクターおよびシャトルベクターを包含する。
用語「発現ベクター」は、in vivo またはin vitroの発現を行うことができる構築物を意味する。
【０１６０】
用語「形質転換ベクター」は、１つの実在物から他の実在物に転移することができる構築物を意味する−他の実在物は同一種であるか、あるいは異なる種であることができる。構築物が１つの実在物から他の実在物に−例えば、大腸菌（E.coli）プラスミドから細菌、例えば、バシラス（Bacillus）属に転移することができる場合、形質転換ベクターは時には「シャトルベクター」と呼ばれる。それは大腸菌（E.coli）プラスミドからアグロバクテリウム（Agrobacterium ）に、さらに植物にさえ転移することができる構築物である。
【０１６１】
本発明のベクターは、後述するように、適当な宿主細胞の中に形質転換して、本発明のポリペプチドを発現させることができる。したがって、それ以上の面において、本発明は、ポリペプチドをコードするコード配列のベクターによる発現を提供する条件下に、前述の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を培養し、そして発現されたポリペプチドを回収することからなる、本発明のポリペプチドを製造する方法を提供する。
【０１６２】
ベクターは、例えば、複製起点を有するプラスミド、ウイルスまたはファージのベクター、必要に応じて前記ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターおよび必要に応じてプロモーターのレギュレーターであることができる。
本発明のベクターは、１または複数の選択可能なマーカー遺伝子を含有することができる。工業用微生物に最も適当な選択系は、宿主生物における突然変異を必要としない選択マーカーのグループにより形成されたものである。菌類の選択マーカーの例は、アセトアミダーゼ（amdS）、ＡＴＰシンターゼ、サブユニット９（oliC）、オロチジン−５’−ホスフェート−デカルボキシラーゼ（pvrA）、フレオマイシンおよびベノミル耐性（benA）の遺伝子である。非菌類の選択マーカーの例は、細菌のG418耐性遺伝子（これはまた酵母において使用できるが、フィラメント状菌類において使用できない）、アンピシリン耐性遺伝子（E.coli）、ネオマイシン耐性遺伝子（Bacillus）および大腸菌（E.coli)uidA 遺伝子、β−ガラクトシダーゼ（ＧＵＳ）をコードする、である。
【０１６３】
ベクターは、in vitroにおいて、例えば、ＲＮＡの製造のために使用できるか、あるいは宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換するために使用できる。
したがって、本発明のポリヌクレオチドを組換えベクター（典型的には複製可能なベクター）、例えば、クローニングまたは発現ベクターの中に組込むことができる。ベクターはコンパティブル宿主細胞中の核酸の複製のために使用することができる。したがって、それ以上の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能なベクターの中に導入し、ベクターをコンパティブル宿主細胞の中に導入し、そしてベクターの複製を生じさせる条件下に宿主細胞を成長することによって、本発明のポリヌクレオチドを製造する方法を提供する。ベクターを宿主細胞から回収することができる。適当な宿主細胞は発現ベクターと関連して後述される。
【０１６４】
本発明はまた、ホスホジエステラーゼ活性をモジュレートし、これによりサイクルのヌクレオチドレベルをモジュレートする PDE＿XIV のインヒビターおよびアンタゴニストを同定するスクリーニング法において、 PDE＿XIV またはその変異型、相同体、フラグメントまたは誘導体を発現する遺伝子操作された宿主細胞の使用に関する。このような遺伝子操作された宿主細胞を使用して、 PDE＿XIV 活性をモジュレートすることができるペプチドライブラリーまたは有機分子をスクリーニングすることができる。 PDE＿XIV のアンタゴニストおよびインヒビター、例えば、抗体、ペプチドまたは小さい有機分子は、例えば、 PDE＿XIV に関連する疾患の治療のための医薬組成物の基礎を提供するであろう。このようなインヒビターまたはアンタゴニストは、単独で、あるいはこのような疾患の治療のための療法と組み合わせて投与することができる。
【０１６５】
本発明は、また、 PDE＿XIV タンパク質のin vivo またはin vitro生産のための、あるいは PDE＿XIV の発現または活性に影響を与えることができる因子についてスクリーニングするための、 PDE＿XIV またはその変異型、相同体、フラグメントまたは誘導体をコードするポリヌクレオチド配列からなる発現ベクターおよび宿主細胞に関する。
【０１６６】
組織
用語「組織」は、本明細書において使用するとき、組織それ自体または器官を包含する。
宿主細胞
用語「宿主細胞」は、本発明に関して、本発明による組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列および／またはそれから得られた産物からなることができる、任意の細胞を包含し、ここでプロモーターは、宿主細胞の中に存在するとき、本発明によるヌクレオチド配列の発現を可能とする。
【０１６７】
したがって、本発明のそれ以上の態様は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドの複製および発現のためのウイルスの中に担持される。細胞は前記ベクターとコンパティブルであるように選択され、そして、例えば、原核（例えば、細菌）、菌類、酵母または植物の細胞であることができる。
グラム陰性細菌大腸菌（E.coli）は、異種遺伝子の発現のための宿主として広く使用される。しかしながら、大量の異種タンパク質は細胞の内部に蓄積する傾向がある。大量の大腸菌（E.coli）細胞内タンパク質からの所望のタンパク質の引き続く精製は、時には困難であることがある。
【０１６８】
大腸菌（E.coli）と対照的に、バシラス（Bacillus）属からの細菌は、培地の中にタンパク質を分泌する能力を有するので、異種宿主として非常に適する。宿主として適当な他の細菌は、ストレプトマイセス（Streptomyces）属およびシュードモナス（Pseudomonas ）属からのものである。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの特質および／または発現されたタンパク質のそれ以上のプロセシングの望ましさに依存して、真核宿主、例えば、酵母または他の菌類が好ましいことがある。一般に、酵母細胞は、操作が容易であるので、菌類細胞よりも好ましい。しかしながら、いくつかのタンパク質は酵母細胞からの分泌が低いか、あるいはある場合において、適切にプロセスされない（例えば、酵母における過グリコシル化）。これらの場合において、異なる菌類の宿主微生物を選択すべきである。
【０１６９】
本発明の範囲内に入る適当な発現宿主の例は、菌類、例えば、アスペルギルス（Aspergillus ）種（例えば、EP-A-0184438号およびEP-A-0284603号に記載されているもの）およびトリコデルマ（Trichoderma ）種；細菌、例えば、バシラス（Bacillus）種（例えば、EP-A-0134048号およびEP-A-0253455号に記載されているもの）、ストレプトマイセス（Streptomyces）種およびシュードモナス（Pseudomonas ）種；および酵母、例えば、クルイベロマイセス（Kluyveromyces ）種（例えば、EP-A-0096430号およびEP-A-0301670号に記載されているもの）およびサッカロマイセス（Saccharomyces ）種である。
【０１７０】
１例として、典型的な発現宿主は、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger ）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger)var.tubigenis 、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger)var.awamori 、アスペルギルス・アクレアツス（Aspergillus aculeatus)、アスペルギルス・ニヅランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、トリコデルマ・リーシエ（Trichoderma reesie）、バシラス・サチリス（B.subtilis）、バシラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・アミロリクファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、クルイベロマイセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）およびサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）から選択することができる。
【０１７１】
適当な宿主細胞−例えば、酵母、菌類および植物の宿主細胞−を使用すると、本発明の組換え発現産物に最適な生物学的活性を与えるために必要であることがあるように、翻訳後の修飾（例えば、ミリストイル化、グリコシル化、トランケーション、ラピデーションおよびチロシン、セリンまたはスレオニンのリン酸化）が可能となる。
【０１７２】
生物
本発明に関して用語「生物」は、本発明による組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列および／またはそれから得られた産物からなることができる、任意の生物を包含し、ここでここでプロモーターは、植物の中に存在するとき、本発明によるヌクレオチド配列の発現の発現を可能とすることができる。生物の例は菌類、酵母または植物を包含するすることができる。
【０１７３】
本発明に関する用語「トランスジェニック生物」は、本発明によるタンパク質をコードするヌクレオチド配列および／またはそれから得られた産物からなる任意の生物を包含し、ここでプロモーターは生物内の本発明によるヌクレオチド配列の発現を可能とすることができる。好ましくは、ヌクレオチド配列は生物のゲノムの中に組込まれる。
【０１７４】
用語「トランスジェニック生物」は、本発明による天然のヌクレオチドのコード配列が同様に天然の環境の中に存在する天然のプロモーター制御下にあるとき、天然の環境の中に存在する本発明による天然のヌクレオチドのコード配列を包含しない。さらに、本発明は、本発明による天然のタンパク質が天然の環境の中に存在するとき、かつ同様に天然の環境の中に存在する天然のヌクレオチドのコード配列により発現されるとき、かつ同様に天然の環境の中に存在する天然のプロモーター制御下にあるとき、本発明による天然のタンパク質を包含しない。
【０１７５】
したがって、本発明のトランスジェニック生物は、本発明によるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列のの任意の１つ、または組合わせ、本発明による構築物（それらの組合わせを包含する）、本発明によるベクター、本発明によるプラスミド、本発明による細胞、本発明による組織またはその産物からなる生物を包含する。形質転換された細胞または生物は、細胞または生物から容易に取出すすることができる所望の化合物を受容される量で生産することができる。
本発明は、また、増加した量の酵素を発現するように、修飾された生物を包含する。
【０１７６】
アテニュエーション／ノックアウトの動物モデル
本発明はまた、酵素活性がアテニュエートまたは排除されように修飾された生物を包含する。このような態様の例は、天然のコード配列が除去され、例えば、リポーター遺伝子、例えば、β−ｇａｌで置換された、ノックアウトの速度またはマウスである。あるいは、遺伝子の発現が起こらないように、プロモーターをサイレンスさせることができる。これらの型の生物は、標準的技術を使用して製造することができる。
【０１７７】
宿主細胞／宿主生物の形質転換
前に示したように、宿主生物は原核生物または真核生物であることができる。適当な原核宿主の例は、大腸菌（E.coli）およびバシラス・サチリス（Bacillus subtilis ）を包含する。原核生物の形質転換についての教示はこの分野においてよく記載されており、例えば、下記の文献を参照のこと：Sambrook, et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 第２版, 1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press、およびAusubel,et al.,Current Protocols in Molecular Biology(1985),John Wiley & Sons,Inc.。
【０１７８】
原核生物の宿主を使用する場合、形質転換前にヌクレオチド配列を、例えば、イントロンの除去により、適当な修飾することが必要である。
他の態様において、トランスジェニック生物は酵母であることができる。これに関して、酵母はまた異種遺伝子の発現のためのビヒクルとして広く使用されてきている。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）種は、異種遺伝子の発現のための使用を包含する、長い工業的使用の歴史を有する。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）中の０種遺伝子の発現は下記の文献において概観されている：Goodey et al.,1987,Yeast Biotechnology,D R Berry et al.,編、pp.401-429,AllenおよびUnwin,London、およびKing et al.,1989,Molecular and Cell Biology of Yeasts,E F Walton and G T Yarronton編, pp.107-133,Balckie,Galsgow。
【０１７９】
いくつかの理由で、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）は遺伝子の発現のためによく適している。第１に、それはヒトに対して非病原性であり、そしてある種のエンドトキシンを産生することができない。第２に、それは種々の目的で数世紀にわたる商業的利用において安全に使用されてきている歴史を有する。これは広い公衆の受容に導いた。第３に、生物に向けられた広範な商業的使用および研究は、遺伝学および生理学に関する豊富な知識ならびにサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の特徴を示す大規模の発酵を生じた。
【０１８０】
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）における異種遺伝子の発現の原理は下記の文献において概観されている：E Hinchcliffe E Kenny, 1993, ″Yeast as vehicle for the expresson of heterologous genes″,Yeasts,Vol.5, Anthony H Rose およびJ Stuart Harrison,編，第２版，Academic Press Ltd. 。
維持のために宿主ゲノムとの組換えを必要とする、組込みベクター、および自律的に複製するベクターを包含する、いくつかの型の酵母ベクターが入手可能である。
【０１８１】
トランスジェニックサッカロマイセス（Saccharomyces ) を調製するために、酵母における発現のために設計された含量の中に本発明のヌクレオチド配列を挿入することによって、発現構築物を調製する。異種発現のために使用された、いくつかの型の構築物が開発されてきている。構築物は、本発明のヌクレオチド配列に融合された酵母中で活性なプロモーターを含有し、通常酵母由来のプロモーター、例えば、GAL1プロモーターが使用される。通常、酵母由来のシグナル配列、例えば、SUC2シグナルペプチドをコードする配列が使用される。酵母において活性なターミネーターは発現系において終わる。
【０１８２】
酵母の形質転換のために、いくつかの形質転換のプロトコールが開発された。例えば、本発明によるトランスジェニックサッカロマイセス（Saccharomyces ) は、下記の文献の教示に従い調製することができる：Hinnen et al.,1978, Proceeding of the National Academy of Science of the USA 75,1929;Beggs,J D,1978,Nature,London,275,104;およびIto,H et al.,1983,J.Bacteriology153,163-168 。
形質転換された酵母細胞を種々の選択マーカーを使用して選択する。形質転換に使用されるマーカーとして、多数の栄養要求性マーカー、例えば、LEU2、HIS4およびTRP1、および優性抗生物質耐性マーカー、例えば、アミノグリコシド、抗生物質マーカー、例えば、G418が存在する。
【０１８３】
他の宿主生物は植物である。遺伝的に修飾された植物の構築における基本的原理は、植物ゲノムの中に遺伝情報を挿入して、挿入された遺伝物質の安定に維持を得ることである。
遺伝情報を挿入する、いくつかの技術が存在し、２つの主な原理は遺伝情報の直接的導入およびベクター系による遺伝情報の導入である。遺伝技術は下記の文献において概観されている：Potrykus,Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.(1991)42:205-225 、およびChristou,Argo-Food-Industry Hi-Tech.March/April 1994,17-27。植物の形質転換についてのそれ以上の教示は、EP-A-0449375号に記載されている。
【０１８４】
したがって、本発明は、また、付属の配列表に示されている配列の任意の１つとして示すヌクレオチド配列またはその誘導体、相同体、変異型またはフラグメントで宿主細胞を形質転換する方法を提供する。
ＰＤＥヌクレオチドのコード配列で形質転換された宿主細胞を、細胞培養物からコードされたタンパク質の発現および回収に適当な条件下に、培養することができる。組換え細胞により生産されるタンパク質は、使用する配列および／またはベクターに依存して、分泌されるか、あるいは細胞内に含有されることがある。当業者は理解するように、特定の原核細胞または真核細胞の膜を通してＰＤＥコード配列の分泌を向けるシグナル配列を使用して、ＰＤＥコード配列を含有する発現ベクターを設計することができる。他の組換え構築物は、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に、ＰＤＥコード配列を結合させることができる（Kroll DJ et al.(1993)DNA Cell Biol.12:441-53、また、融合タンパク質を含有するベクターの論考を参照のこと）。
【０１８５】
ポリペプチドの製造
本発明によれば、本発明のポリペプチドの製造は、例えば、本発明の１または複数のポリヌクレオチドで形質転換された微生物の発現宿主を慣用の栄養発酵培地中で培養することによって、実施することができる。適当な培地の選択は、発現宿主の選択および／または発現構築物の調節の要件に基づくことができる。このような培地は当業者によく知られている。培地は、所望ならば、他の潜在的に汚染性の微生物よりも形質転換された発現宿主を好む追加の成分を含有することができる。
【０１８６】
したがって、本発明は、また、 PDE＿XIV 活性を有するポリペプチドを有する方法を提供し、この方法は下記の工程からなる：ａ）付属の配列のリストに示されている配列の任意の１つとして示すヌクレオチド配列またはその誘導体、相同体、変異型またはフラグメントで宿主細胞を形質転換し、そしてｂ）前記ポリペプチドの発現に適当な条件下に形質転換された宿主細胞を培養する。
本発明は、また、 PDE＿XIV 活性を有するポリペプチドを有する方法を提供し、この方法は下記の工程からなる：ａ）付属の配列のリストに示されている配列の任意の１つとして示すヌクレオチド配列またはその誘導体、相同体、変異型またはフラグメントで形質転換された宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現に適当な条件下に培養し、そしてｂ）前記ポリペプチドを回収する。
【０１８７】
本発明は、また、 PDE＿XIV 活性を有するポリペプチドを有する方法を提供し、この方法は下記の工程からなる：ａ）付属の配列のリストに示されている配列の任意の１つとして示すヌクレオチド配列またはその誘導体、相同体、変異型またはフラグメントで宿主細胞を形質転換し、ｂ）前記ポリペプチドの発現に適当な条件下に形質転換された宿主細胞を培養し、そしてｃ）前記ポリペプチドを回収する。
【０１８８】
リボザイム
リボザイムは、ＲＮＡの特異的培養を触媒することができる酵素のＲＮＡ分子である。リボザイムの作用のメカニズムは、相補的ターゲットＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイズ、引き続くエンドヌクレアーゼ分解的切断を包含する。PDE RNA 配列のエンドヌクレアーゼ分解的切断を特異的にかつ効率よく触媒する、操作されたハンマーヘッドのモチーフのリボザイム分子は本発明の範囲内に入る。
【０１８９】
下記の配列を含むリボザイム切断部位について標的分子を走査することによって、任意の潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は最初に同定された：ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣ。いったん同定されると、切断部位を含有する標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列を操作不能とする二次構造の特徴について評価することができる。リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズのアクセス可能性を試験することによって、候補の標的の適当性をまた評価することができる。
【０１９０】
本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡおよびリボザイムの双方は、ＲＮＡ分子の合成についてこの分野において知られている任意の方法により製造することができる。これらはオリゴヌクレオチドの化学的合成、例えば、固相ホスホルアミダイト化学的合成の技術を包含する。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のin vitroまたはin vivo 転写により、ＲＮＡ分子を発生させることができる。このようなＤＮＡ配列は、適当なＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えば、Ｔ７またはＳＰ６を使用して、種々のベクターの中に組込むことができる。あるいは、アンチセンスＲＮＡを構成的または誘導可能に合成するアンチセンスcDNA構築物を細胞系統、細胞または組織の中に導入することができる。
【０１９１】
検出
ＰＤＥポリヌクレオチドコード配列の存在は、付属の配列のリストに示されている配列の任意の１つとして示す配列のプローブ、部分またはフラグメントを使用して、DNA-DNA またはDNA-RNA ハイブリダイズにより検出することができる。核酸の増幅をベースとするアッセイは、ＰＤＥコード配列をベースとするオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーを使用して、PDE DNA またはＲＮＡを含有する形質転換体を検出することを包含する。本明細書において使用するとき、「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、少なくとも約１０かつ約６０程度に多いヌクレオチド、好ましくは約１５〜３０ヌクレオチド、より好ましくは約２０〜２５ヌクレオチドの核酸配列を意味し、これはプローブまたはアンプリマーとして使用することができる。好ましくは、オリゴヌクレオチドは付属の配列のリストに示されている配列の任意の１つとして示すヌクレオチド配列の３’領域から誘導される。
【０１９２】
ＰＤＥポリペプチドの発現を検出および測定する種々のプロトコール、例えば、タンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用するプロトコールはこの分野において知られている。例は酵素結合イムノアッセイ（ELISA ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化細胞選別（FACS）を包含する。ＰＤＥポリペプチド上の２つの非妨害性エピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を利用する２部位のモノクローナルをベースとするイムノアッセイは好ましいが、競合結合アッセイを使用することができる。これらおよび他のアッセイは、なかでも、下記の文献に記載されている：Hampton R et al.,1990,Serological Methods,A Laboratoy Manual,APS Press,St Paul MN 、およびMaddox DE et al.,J.Exp.Med.158:1211 。
【０１９３】
広範な種類の標識および結合技術はこの分野において知られており、そして種々の核酸およびアミノ酸のアッセイにおいて使用可能である。ＰＤＥポリヌクレオチド配列を検出するための標識化ハイブリダイズまたはＰＣＲプローブを製造する手段は、オリゴ標識化、ニック翻訳、末端標識化または標識化ヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅を包含する。あるいは、mRNAプローブ製造するためのベクターの中に、ＰＤＥコード配列またはその任意の部分をクローニングすることができる。このようなベクターはこの分野において知られており、商業的に入手可能であり、そして適当なＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６および標識化ヌクレオチドの付加によりin vitroのＲＮＡプローブの合成に使用することができる。
【０１９４】
多数の会社、例えば、ファーマシア・バイオテク（Pharmacia Biotech.）（ニュージャージイ州ピスカタウェイ）、プロメガ（Promega ）（ウイスコンシン州マディソン）、およびＵＳバイオケミカル・コーポレーション（US Biochemical Corp.）（オハイオ州クレブランド）は、これらの手法のための商用キットおよびプロトコールを供給している。適当なリポーター分子および標識は、それらの放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、または色素形成因子ならびに基質、コファクター、磁気粒子およびその他を包含する。このような標識の使用を教示する特許は次の通りである：米国特許第 3,817,837号、米国特許第 3,850,752号、米国特許第 3,939,350号、米国特許第 3,996,345号、米国特許第 4,277,437号、米国特許第 4,275,149号および米国特許第 4,366,241号。また、組換え免疫グロブリンを米国特許第 4,816,567号に示されているように製造することができる。
【０１９５】
特定の分子の発現を定量する追加の方法は、ヌクレオチドの放射能標識化（Melby PC et al.,1993,J.Immunol.Methods 159:235-44 ）またはビオチン化（Duplaa C et al.,Anal.Biochem.229-36 ）、対照核酸の共増幅、および実験結果をその上に内挿する標準曲線を包含する。ELISA フォーマットにおけるアッセイの実行により、多数の試料の定量を加速することができ、ここで問題のオリゴマーを種々の希釈で提示し、そして分光光度測定または熱量測定の応答は急速な定量を与える。
【０１９６】
マーカー遺伝子の発現の存在／非存在は問題の遺伝子がまた存在すること示唆するが、その存在および発現を確証すべきである。例えば、ＰＤＥコード配列がマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、ＰＤＥコーディング領域を含有する組換え細胞をマーカー遺伝子機能の非存在により同定することができる。あるいは、マーカー遺伝子をシグナルプロモーター制御下にＰＤＥコード配列と直列に配置することができる。誘導または選択に対して応答するマーカー遺伝子の発現は、通常ＰＤＥの発現をまた示す。
【０１９７】
あるいは、ＰＤＥのコード配列を含有しかつＰＤＥコーディング領域を発現する宿主細胞を、この分野において知られている種々の手順により同定することができる。これらの手順は下記のものを包含するが、これらに限定されない：DNA-DNA またはDNA-RNA ハイブリダイズおよびタンパク質のバイオアッセイまたはイムノアッセイ技術、前記技術は核酸またはタンパク質の検出および／または定量のための膜をベースとする、溶液をベースとする、またはチップをベースとする技術を包含する。
【０１９８】
抗体
本発明のアミノ酸配列はまた、標準的技術に従い、アミノ酸配列に対する抗体の発生に使用することができる。
PDE＿XIV ポリペプチドに対する抗体の製造に、この分野においてよく知られている手法を使用することができる。このような抗体下記のものを包含するが、これらに限定されない：ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーにより生産されたフラグメント。中和抗体、すなわち、ＰＤＥポリペプチドの生物学的活性を阻害する抗体は診断および療法のために特に好ましい。
【０１９９】
抗体を製造するために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウスおよびその他を包含する種々の宿主をインヒビターまたはその任意の部分、変異型、相同体、フラグメントまたは誘導体、あるいは免疫原性を保持するオリゴペプチドを注射することによって免疫化することができる。宿主種に依存して、種々のアジュバントを使用して免疫学的応答を増加させることができる。このようなアジュバントは下記のものを包含するが、これらに限定されない：フロインドアジュバント、無機質ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、および表面活性物質、例えば、リゾレシチン、プロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノール。ＢＣＧ（Bacille Calmette-Guerin)およびコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum) は、使用可能な、潜在的に有用なヒトアジュバントである。
【０２００】
培養において連続的細胞系統により抗体分子を産生させる任意の技術により、アミノ酸配列に対するモノクローナル抗体を製造することができる。これらの技術は下記のものを包含するが、これらに限定されない：Koehler およびMilstein(1975 Nature 256:495-497）により最初に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor et al.(1983)Immunol.Today 4:72;Cote et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80:2026-2030）およびＥＢ−ハイブリドーマ技術（Cole et al.(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R Liss Inc., pp.77-96）。
【０２０１】
さらに、「キメラ抗体」の製造について開発された技術、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングして適当な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得る技術を使用することができる（Morrison et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81:6851-6855;Neuberger et al.(1984)Nature 312:604-608;Takeda et al.(1985)Nature 314:452-454 ）。あるいは、一本鎖抗体の製造について記載された技術（米国特許第 4,946,779号）をインヒビター特異的一本鎖抗体の製造に適合させることができる。
【０２０２】
また、リンパ球集団中のin vivo 産生を誘導するか、あるいは下記の文献に記載されている高度に特異的な結合試薬の組換え免疫グロブリンライブラリーまたはパネルのスクリーニングにより、抗体を製造することができる：Orlandi et al.(1989), Proc.Natl.Acad.Sci.86:3833-3837 、およびWinter G およびMilstein C(1991)Nature 349:293-299。
【０２０３】
PDE＿XIV に対する特異的結合部位を含有する抗体フラグメントをまた発生させることができる。例えば、このようなフラグメント下記のものを包含するが、これらに限定されない：抗体分子のペプシン消化により製造することができるF(ab')2 およびF(ab')2 フラグメントのジサルファイド架橋の還元により発生させることができるＦａｂフラグメント。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの急速かつ容易な同定を行うことができる（Huse WD et al.(1989)Science 256:1275-1281 ）。別の技術はファージディスプレイライブラリーのスクリーニングを包含し、ここで、例えば、ファージは広範な種類の相補性決定領域（CDRs）を有するコートの表面上にscFvフラグメントを発現する。この技術はこの分野においてよく知られている。
【０２０４】
PDE＿XIV 特異的抗体は、 PDE＿XIV ポリペプチドの発現に関連する症状および疾患の診断に有用である。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用する、競合結合または免疫放射線測定アッセイの種々のプロトコールはこの分野においてよく知られている。典型的には、このようなイムノアッセイは PDE＿XIV ポリペプチドとその特異的抗体（または同様な PDE＿XIV 結合性分子）との間の複合体の形成、および複合体形成の測定を包含する。特異的 PDE＿XIV タンパク質上の２つの非妨害エピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を利用する２部位モノクローナルをベースとするイムノアッセイは競合結合アッセイを使用することもできる。これらのアッセイはMaddox DE et al.(1983)J.Exp.Med.158:1211に記載されている。
【０２０５】
抗 PDE＿XIV 抗体は、炎症、造血細胞の増殖およびＨＩＶ感染に関連する症状および他の障害または PDE＿XIV の異常な発現により特徴づけられる疾患の診断に有用である。 PDE＿XIV についての診断アッセイは、抗体および標識を利用して、ヒト体液、細胞、組織またはこのような組織の分泌物または抽出物中の PDE＿XIV ポリペプチドを検出する方法を包含する。本発明のポリペプチドおよび抗体は、修飾するか、あるいはしないで、使用することができる。頻繁に、ポリペプチドおよび抗体は、それらを共有結合または非共有結合により、リポーター分子と結合することによって標識化されるであろう。広範な種類のリポーター分子はこの分野において知られている。
【０２０６】
抗体は、下記の工程からなる方法により、生物学的試料の中に存在する本発明のポリペプチドを検出する方法において使用することができる：（ａ）本発明の抗体を準備し、（ｂ）生物学的試料を前記抗体と抗体−抗原複合体の形成を可能とする条件下にインキュベートし、そして（ｃ）前記抗体からなる抗体−抗原複合体が形成されたかどうかを決定する。
環境に依存して、適当な試料は、抽出物、組織、組織、例えば、脳、乳房、卵巣、肺、結腸、膵臓、精巣、肝臓、筋肉および骨組織またはこのような組織に由来する新形成増殖物を包含する。
本発明の抗体を固体の支持体に結合することができ、および／または適当な試薬、対照、使用説明書およびその他と一緒に適当な容器中のキットの中にパッケージすることができる。
【０２０７】
アッセイ／同定の方法
本発明はまた、下記の工程からなる細胞（例えば、ヒト細胞）中の PDE＿XIV の存在を検出するアッセイ法に関する：（ａ）付属の配列のリストに示されている配列の任意の１つのＤＮＡ配列またはそのアレレ変異型から決定して、 PDE＿XIV に対して特異的である、１対のポリメラーゼ連鎖反応のプライマーを使用して、このような細胞からのＲＮＡ（例えば、全体のＲＮＡ）に対して逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応を実施し、そして（ｂ）例えば、アガロースゲル電気泳動により、適当な大きさなＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）フラグメントの出現をアッセイする。
【０２０８】
本発明はまた、 PDE＿XIV の活性および／またはその発現に影響を与える（例えば、阻害するか、あるいはそうでなければ修飾する）因子（例えば、化合物、他の物質またはそれらからなる組成物）を同定する方法に関し、この方法は PDE＿XIV またはそれをコードするヌクレオチド配列を前記因子と接触させ、次いで PDE＿XIV の活性および／またはその発現を測定することからなる。
【０２０９】
本発明はまた、 PDE＿XIV の活性および／またはその発現に選択的に影響を与える（例えば、阻害するか、あるいはそうでなければ修飾する）因子（例えば、化合物、他の物質またはそれらからなる組成物）を同定する方法に関し、この方法は PDE＿XIV またはそれをコードするヌクレオチド配列を前記因子と接触させ、次いで PDE＿XIV の活性および／またはその発現を測定することからなる。
【０２１０】
本発明はまた、 PDE＿XIVA1 または PDE＿XIVA2 または PDE＿XIVA3 または PDE＿XIVA4 の活性および／またはそれらの発現に選択的に影響を与える（例えば、阻害するか、あるいはそうでなければ修飾する）因子（例えば、化合物、他の物質またはそれらからなる組成物）を同定する方法に関し、この方法は関係する PDE＿XIV またはそれをコードするヌクレオチド配列を前記因子と接触させ、次いで関係する PDE＿XIV の活性および／またはその発現を測定することからなる。
【０２１１】
本発明はまた、 PDE＿XIV の活性および／またはその発現に影響を与える（例えば、阻害するか、あるいはそうでなければ修飾する）因子（例えば、化合物、他の物質またはそれらからなる組成物）を同定する方法に関し、この方法は、（ａ）付属の配列のリストに示されている配列の任意の１つのＤＮＡ配列またはそのアレレ変異型からなる組換えＤＮＡが組込まれた細胞系統、または（ｂ） PDE＿XIV を自然に選択的に発現する細胞集団または細胞系統中で、前記因子の存在下に、あるいは前記因子の添加後に、 PDE＿XIV の活性および／またはその発現を測定することからなる。好ましくは、前述のアッセイ方法により、 PDE＿XIV の活性を測定することからなる。
【０２１２】
本発明はまた、 PDE＿XIV の活性および／またはその発現に選択的に影響を与える（例えば、阻害するか、あるいはそうでなければ修飾する）因子（例えば、化合物、他の物質またはそれらからなる組成物）を同定する方法に関し、この方法は、（ａ）付属の配列のリストに示されている配列の任意の１つのＤＮＡ配列またはそのアレレ変異型からなる組換えＤＮＡが組込まれた細胞系統、または（ｂ） PDE＿XIV を自然に選択的に発現する細胞集団または細胞系統中で、前記因子の存在下に、あるいは前記因子の添加後に、 PDE＿XIV の活性および／またはその発現を測定することからなる。好ましくは、前述のアッセイ方法により、 PDE＿XIV の活性を測定することからなる。
【０２１３】
本発明はまた、 PDE＿XIVA1 または PDE＿XIVA2 または PDE＿XIVA3 または PDE＿XIVA4 の活性および／またはその発現に選択的に影響を与える（例えば、阻害するか、あるいはそうでなければ修飾する）因子（例えば、化合物、他の物質またはそれらからなる組成物）を同定する方法に関し、この方法は、（ａ）付属の配列のリストに示されている配列の任意の１つのそれぞれのＤＮＡ配列またはそのアレレ変異型からなる組換えＤＮＡが組込まれた細胞系統、または（ｂ）それぞれの PDE＿XIV を自然に選択的に発現する細胞集団または細胞系統中で、前記因子の存在下に、あるいは前記因子の添加後に、それぞれの PDE＿XIV の活性および／またはその発現を測定することからなる。好ましくは、前述のアッセイ方法により、 PDE＿XIV の活性を測定することからなる。
【０２１４】
本発明はまた、 PDE＿XIV （またはその誘導体、相同体、変異型またはフラグメント）の活性またはそれをコードするヌクレオチド配列（その誘導体、相同体、変異型またはフラグメントを包含する）の発現のモジュレーション（好ましくは特異的モジュレーション）について因子をスクリーニングする方法を提供し、この方法は下記の工程からなる：ａ）候補の因子を準備し、ｂ） PDE＿XIV （またはその誘導体、相同体、変異型またはフラグメント）またはそれをコードするヌクレオチド配列（またはその誘導体、相同体、変異型またはフラグメント）を前記候補の因子と、適当な条件下にモジュレーションを可能とするために十分な時間の間、組合わせ、そしてｃ） PDE＿XIV （またはその誘導体、相同体、変異型またはフラグメント）またはそれをコードするヌクレオチド配列（またはその誘導体、相同体、変異型またはフラグメント）に対する前記候補の因子のモジュレーションを検出して、前記候補の因子が PDE＿XIV （またはその誘導体、相同体、変異型またはフラグメント）の活性またはそれをコードするヌクレオチド配列（またはその誘導体、相同体、変異型またはフラグメント）の発現をモジュレートするかどうかを確認する。
【０２１５】
本発明はまた、 PDE＿XIV （またはその誘導体、相同体、変異型またはフラグメント）またはそれをコードするヌクレオチド配列（その誘導体、相同体、変異型またはフラグメントを包含する）との特異的結合のアフィニティーについて因子をスクリーニングする方法を提供し、この方法は下記の工程からなる：ａ）候補の因子を準備し、ｂ） PDE＿XIV （またはその誘導体、相同体、変異型またはフラグメント）またはそれをコードするヌクレオチド配列（またはその誘導体、相同体、変異型またはフラグメント）を前記候補の因子と、適当な条件下に結合を可能とするために十分な時間の間、組合わせ、そしてｃ） PDE＿XIV （またはその誘導体、相同体、変異型またはフラグメント）またはそれをコードするヌクレオチド配列（またはその誘導体、相同体、変異型またはフラグメント）に対する前記候補の因子の結合を検出して、前記候補の因子が PDE＿XIV （またはその誘導体、相同体、変異型またはフラグメント）またはそれをコードするヌクレオチド配列（またはその誘導体、相同体、変異型またはフラグメント）に結合するかどうかを確認する。
【０２１６】
本発明はまた、 PDE＿XIV をモジュレートすることができる因子を同定する方法を提供し、この方法は下記の工程からなる：ａ）前記因子を PDE＿XIV （またはその誘導体、相同体、変異型またはフラグメント）またはそれをコードするヌクレオチド配列（またはその誘導体、相同体、変異型またはフラグメント）と接触させ、ｂ）工程ａ）の混合物を環状ヌクレオチドと環状ヌクレオチドの加水分解に適当な条件下にインキュベートし、ｃ）環状ヌクレオチドの加水分解の量を測定し、そしてｂ）工程ｃ）の環状ヌクレオチドの加水分解の量を、前記化合物を使用しないでインキュベートした PDE＿XIV （またはその誘導体、相同体、変異型またはフラグメント）またはそれをコードするヌクレオチド配列（またはその誘導体、相同体、変異型またはフラグメント）を使用して得られた環状ヌクレオチドの加水分解の量と比較し、これにより前記因子が環状ヌクレオチドの加水分解に影響を与える（例えば、刺激または阻害する）かどうかを決定する。
【０２１７】
したがって、本発明のある態様において、 PDE＿XIV またはその変異型、相同体、フラグメントまたは誘導体および／または PDE＿XIV またはその変異型、相同体、フラグメントまたは誘導体を発現する細胞系統を使用して、ホスホジエステラーゼ活性のモジュレーターとして作用する、抗体、ペプチド、または他の因子、例えば、有機または無機の分子について、またはそれらの発現についてスクリーニングし、これにより環状ヌクレオチドのレベルをモジュレートすることができる治療剤を同定することができる。例えば、 PDE＿XIV の活性を中和することができる抗 PDE＿XIV 抗体を使用して、環状ヌクレオチドの PDE＿XIV の加水分解を阻害し、これにより環状ヌクレオチドのレベルを増加することができる。
【０２１８】
あるいは、組換え的に発現された PDE＿XIV またはその変異型、相同体、フラグメントまたは誘導体または PDE＿XIV またはその変異型、相同体、フラグメントまたは誘導体を発現する細胞系統との組合わせ化学により作られたペプチドまたは有機ライブラリーのスクリーニングは、環状ヌクレオチドの PDE＿XIV の加水分解をモジュレートすることによって機能する治療剤の同定に有用であろう。合成化合物、天然の産物、および潜在的に生物学的に活性な物質の他の源を、当業者にとって日常的であると思われる多数の方法でスクリーニングすることができる。
【０２１９】
例えば、 PDE＿XIV のＮ末端をコードするヌクレオチド配列を細胞系統中で発現させ、この細胞系統は PDE＿XIV 活性のアロステリックモジュレーター、アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングに使用することができる。あるいは、 PDE＿XIV の保存された触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列を細胞系統において発現させ、そして環状ヌクレオチドの加水分解のインヒビターについてスクリーニングするために使用することができる。
【０２２０】
PDE＿XIV 活性または環状ヌクレオチドの加水分解を妨害する被験因子の能力は、 PDE＿XIV のレベルまたは環状ヌクレオチドのレベルを測定することによって決定することができる（Smith et al.,1993,Appl.Biochem.Biotechnol.41:189-218、に開示されているように）。また、商業的に入手可能なｃＡＭＰおよびｃＧＭＰを測定するイムノアッセイキットが存在する（例えば、Amersham International、イリノイ州アーリントンハイツ、およびDuPont、マサチュセッツ州ボストン）。 PDE＿XIV の活性は、また、他の応答、例えば、これらの目的に開発された慣用技術を使用する他のタンパク質のリン酸化または脱リン酸化を測定することによってモニターすることができる。
【０２２１】
したがって、本発明は、下記の工程からなる、 PDE＿XIV 、またはその変異型、相同体、フラグメントまたは誘導体の環状ヌクレオチドのホスホジエステラーゼ活性をモジュレートすることができる化合物を同定する方法を提供する：ａ）前記化合物を PDE＿XIV 、またはその変異型、相同体、フラグメントまたは誘導体と接触させ、ｂ）工程ａ）の混合物を環状ヌクレオチドと環状ヌクレオチドの加水分解に適当な条件下にインキュベートし、ｃ）環状ヌクレオチドの加水分解の量を測定し、そしてｄ）工程ｃ）の量を前記化合物を使用しないでインキュベートした、 PDE＿XIV 、またはその変異型、相同体、フラグメントまたは誘導体を使用して得られた環状ヌクレオチドの加水分解の量と比較し、これにより前記化合物が環状ヌクレオチドの加水分解を刺激または阻害するかどうかを決定する。
【０２２２】
この方法の１つの態様において、フラグメントは PDE＿XIV のＮ末端領域からのものであることができ、そして PDE＿XIV のアロステリックモジュレーターを同定する方法を提供する。本発明の他の態様において、 PDE＿XIV のカルボキシ末端領域からのものであることができ、そして環状ヌクレオチドの加水分解のインヒビターを同定する方法を提供する。
【０２２３】
種々の薬剤スクリーニング技術の任意の技術において治療化合物をスクリーニングするために、 PDE＿XIV ポリペプチド、その免疫原性フラグメントまたはオリゴペプチドを使用することができる。このような試験において使用されるポリペプチドは溶液中で遊離であり、固体の支持体に添付され、細胞表面の担持されるか、あるいは細胞内に位置することができる。 PDE＿XIV ポリペプチドと試験される因子との間の結合性複合体の活性または形成の壊滅を測定することができる。
【０２２４】
したがって、本発明は、 PDE＿XIV またはその発現、またはその一部分、またはその変異型、相同体、フラグメントまたは誘導体のモジュレーション（好ましくは特異的モジュレーション、例えば、特異的結合のアフィニティー）について１つまたは複数の化合物をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、つまたは複数の化合物を準備し、 PDE＿XIV またはそれまたはその一部分をコードするヌクレオチド配列またはその変異型、相同体、フラグメントまたは誘導体を複数の化合物の各々と、適当な条件下にモジュレーションを可能とするために十分な時間の間、組合わせ、そして複数の化合物の各々に対する PDE＿XIV 、またはその一部分、またはその変異型、相同体、フラグメントまたは誘導体を結合を検出し、これにより PDE＿XIV またはそれをコードするヌクレオチド配列をモジュレートする１または複数の化合物を同定することからなる。このようなアッセイにおいて、複数の化合物はこの分野において知られている化学技術の組合わせにより製造することができる。
【０２２５】
薬剤をスクリーニングする他の技術は、 PDE＿XIV ポリペプチドに対する適当な結合アフィニティーを有する化合物の高い処理量のスクリーニングを提供し、そしてGeysen、欧州特許出願84/03564号、1984年９月13日発行、に詳細に記載されている方法に基づく。要約すると、多数の異なる小さいペプチドの被検化合物を、固体の支持体、例えば、プラスチックピンまたはある種の他の表面上で合成する。ペプチドの被検化合物を PDE＿XIV フラグメントと反応させ、洗浄する。次いで結合した PDE＿XIV を、例えば、この分野においてよく知られている方法を適当な採用することによって、検出する。精製された PDE＿XIV を、また、プレート上に直接的にコーティングして、前述の薬剤スクリーニング技術において使用する。あるいは、非中和性抗体を使用して、ペプチドを捕捉し、それを固体の支持体上に固定化することができる。
【０２２６】
本発明はまた、競争的薬剤スクリーニングアッセイを提供し、この方法においては、 PDE＿XIV を結合することができる中和抗体が、 PDE＿XIV との結合について被験化合物と競争する。この方法において、抗体を使用して１または複数の抗原決定基を PDE＿XIV と共有するペプチドの存在を検出することができる。
本発明のアッセイ法は高い処理量のスクリーン（ＨＴＳ）であることができる。これに関して、 WO84/0356号の技術を本発明のＰＤＥに採用することができる。
【０２２７】
米国特許第 5,738,985号の教示を本発明のアッセイ法に採用することができる。
本発明は、また、本発明のアッセイ法および同定法により同定された１または複数の因子を提供する。
本発明の因子は、例えば、有機化合物または無機化合物であることができる。因子は、例えば、付属の配列のリストに示されている配列のすべてまたは一部分に対してアンチセンスであるヌクレオチド配列であることができる。
【０２２８】
本発明は、さらに、薬剤として使用するための、本発明の因子（またはその生理学上許容される塩、または薬学上許容される溶媒和物）または前述の任意のものを含有する医薬組成物を提供する。
本発明は、また、被殻、脳の尾状核、脳の後頭葉、心臓、卵巣、下垂体、腎臓、肝臓、小腸、胸腺、骨格筋、白血球領域、背根神経節、子宮、蝸牛、小腸（十二指腸）、星状細胞腫、および虫垂の任意の１または複数における PDE＿XIV 活性に影響を与える（例えば、阻害、変調または作用する）因子の使用を提供する。
【０２２９】
診断
本発明はまた、 PDE＿XIV ヌクレオチド配列を検出する診断組成物を提供する。診断組成物は、付属の配列表に示されている配列の任意の１つまたはその変異型、相同体、フラグメントまたは誘導体、あるいは付属の配列のリストに示されている配列の任意の１つのすべてまたは一部分にハイブリダイズすることができる配列またはそのアレレ変異型を含んでなることができる。
【０２３０】
疾患の診断の基準を提供するするために、 PDE＿XIV ポリペプチドの発現からの正常または標準の値を確立すべきである。これは、動物またはヒトの正常の被検体から採った体液または細胞抽出物を PDE＿XIV に対して抗体と、この分野においてよく知られている複合体形成の条件下に、組合わせることによって達成される。標準の複合体の形成量を、既知の量の抗体を既知の濃度の精製された PDE＿XIV ポリペプチドと組合わせた陽性の対照の希釈系列と比較することによって、標準の複合体の形成量を定量することができる。次いで、正常の試料から得られた標準値を、 PDE＿XIV ポリペプチドの発現に関係する障害または疾患により潜在的に影響を受けた被検体からの試料から得られた値と比較することができる。標準値と被検体の値との間の偏りは、疾患の状態を確立する。
【０２３１】
PDE＿XIV ポリヌクレオチド、またはその任意の部分は、診断化合物および／または治療化合物のための基準を提供することができる。診断の目的で、 PDE＿XIV ポリヌクレオチド配列を使用して、 PDE＿XIV 活性が関係づけられる症状、障害または疾患における遺伝子の発現を検出しかつ定量することができる。
【０２３２】
PDE＿XIV をコードするポリヌクレオチド配列を PDE＿XIV の発現から生ずる疾患の診断に使用することができる。例えば、 PDE＿XIV をコードするポリヌクレオチド配列をバイオプシーまたは剖検または生物学的流体、例えば、血清、滑液または腫瘍のバイオプシーからの組織のハイブリダイズまたはＰＣＲアッセイにおいて使用して、 PDE＿XIV の発現の異常を検出することができる。このような定性的または定量的方法は、サザンまたはノザン分析、ドットブロットまたは他の膜に基づく技術；ＰＣＲ技術；ディップスティック、ピンまたはチップ技術；およびＥＬＩＳＡまたは他の多数の試料の形式的技術を包含する。これらの技術のすべてはこの分野においてよく知られており、そして事実多数の商業的に入手可能な診断キットの基礎である。
【０２３３】
このようなアッセイは特定の療法的処置の養生法の効能のために調製し、そして動物の研究、臨床的試験、または個々の患者の治療のモニターにおいて使用することができる。疾患の診断の基礎を提供するために、ＰＤＥ発現の正常または標準のプロフィルを確立すべきである。これは動物またはヒトの正常の被検体から採った体液または細胞抽出物を PDE＿XIV またはその一部分と、ハイブリダイズまたは増幅に適当な条件下に、組合わせることによって達成される。標準的ハイブリダイズは、正常の被検体から得られた値を、既知量の精製された PDE＿XIV を使用する同一実験においてなされた陽性の対照の希釈系列と比較することによって、定量することができる。
【０２３４】
正常の試料から得られた標準値を、ＰＤＥコード配列の発現に関係する障害または疾患により潜在的に影響を受けた被検体からの試料から得られた値と比較することができる。標準値と被検体の値との間の偏りは疾患の状態を確立する。疾患が確立された場合、現存する治療剤を投与し、そして治療のプロフィルまたは値を発生させることができる。最後に、アッセイを規則的な基準で反復して、値が正常または標準のパターンに向かうまたは戻る進行であるかどうかを評価することができる。連続的治療のプロフィルを使用して、数日または数カ月の期間にわたる治療の効能を示すことができる。
【０２３５】
したがって、本発明は、例えば、診断的を使用して疾患の状態における PDE＿XIV のレベルを検出または定量することができる抗 PDE＿XIV 抗体を生産するための、 PDE＿XIV ポリペプチド、またはその変異型、相同体、フラグメントまたは誘導体の使用に関する。
さらに、本発明は、陽性の対照として使用することができる、精製された PDE＿XIV と、抗 PDE＿XIV 抗体とからなる、細胞および組織中の PDE＿XIV を検出する診断アッセイおよびキットを提供する。このような抗体は溶液をベースとする、膜をベースとする、または組織をベースとする技術においてを使用して、 PDE＿XIV タンパク質の発現または欠失またはその変異型、相同体、フラグメントまたは誘導体の発現に関係する疾患の状態または症状を検出することができる。
【０２３６】
プローブ
本発明の他の面は、ＰＤＥコーディング領域をコードする、ゲノムの配列を包含する、ポリヌクレオチド配列または密接に関係する分子、例えば、アレレを検出することができる、核酸のハイブリダイズまたはＰＣＲプローブを提供することである。プローブの特異性、例えば、プローブが高度に保存された、保存されたまたは非保存の領域またはドメインから誘導されたかどうか、およびハイブリダイズまたは増幅のストリンジェンシイ（高い、中間または低い）は、プローブが天然に存在するＰＤＥコード配列のみ、または関係する配列を同定するかどうかを決定するであろう。
【０２３７】
関係する核酸配列を検出するプローブは、環状ヌクレオチドのＰＤＥファミリーのメンバーの保存されたまたは高度に保存されたヌクレオチド領域、例えば、３’領域から選択され、そしてこのようなプローブはデジェネレイトプローブのプールにおいて使用することができる。同一の核酸配列を検出するために、または最大の特異性を望む場合、核酸プローブをＰＤＥポリヌクレオチドの非保存ヌクレオチド領域またはユニーク領域から選択する。本明細書において使用するとき、用語「非保存ヌクレオチド領域」は、本明細書において開示するＰＤＥコード配列に対してユニークでありかつ関係するファミリーのメンバー、例えば、既知の環状ヌクレオチドのPDEsの中に存在しない、ヌクレオチド領域を意味する。
【０２３８】
米国特許第 4,683,195号、米国特許第 4,800,195号および米国特許第 4,965,188号に記載されているようなＰＣＲは、 PDE＿XIV 配列をベースとするオリゴヌクレオチドについての追加の使用を提供する。このようなオリゴマーは一般に化学的に合成されるが、酵素的に発生させるか、あるいは組換え源から製造することができる。オリゴマーは一般に２つのヌクレオチド配列からなり、１つはセンスの向き（５’→３’）をもち、そして１つはアンチセンスの向き（３’←５’）をもち、特異的遺伝子または症状の同定のために最適化された条件下に使用される。同一の２つのオリゴマーは、オリゴマーのネスチングされた組、またはさらにオリゴマーのデジェネレイトプールを密接に関係するＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出および／または定量のために低いストリンジェント条件下に使用することができる。
【０２３９】
内因的ゲノム配列のマッピングのために、前に記載したハイブリダイズプローブを発生させるために、 PDE＿XIV の核酸配列を使用することもできる。よく知られている技術を使用して、配列を特定の染色体に、または染色体の特異的領域にマッピングすることができる。これらは染色体の拡大に対するin situ ハイブリダイズ（Verma et al.(1988)Human Chromsomes:A Manual of Basic Techniques,Pergamon Press,New York City) 、流れ選別染色体調製物、または人工的染色体構築物、例えば、YACs、細菌の人工的染色体（BACs）、細菌のＰＩ構築物または単一の染色体cDNAライブラリーを包含する。
【０２４０】
染色体調製物のin situ ハイブリダイズおよび物理的マッピング技術、例えば、確立された染色体マーカーを使用する連鎖分析は遺伝地図の拡張において非常に価値がある。遺伝地図の例はScience(1995;270:410f および1994;265:1981f）の中に見出される。しばしば、特定のヒト染色体の数またはアームが未知である場合であってさえ、他の哺乳動物種の染色体上の遺伝子の配置は関連するマーカーを明らかにすることがある。新しい配列は、物理的マッピングにより、染色体のアームまたは一部分に帰属させることができる。
【０２４１】
これは、位置のクローニングまたは他の遺伝子の発見技術を使用して疾患の遺伝子を検索する研究者らに、価値がある情報を提供する。いったん疾患または症候群、例えば、毛細血管拡張性運動失調（ＡＴ）は、特定のゲノム領域に対する遺伝的連鎖、例えば、ＡＴの1lq22-23への連鎖によりありのままに局在化され（Gatti et al.(1988)Nature 336:577-580）、その領域に対する配列のマッピングはそれ以上の研究のためにアソシエートした遺伝子または調節遺伝子を表すことがある。また、本発明のヌクレオチド配列を使用して、正常の、キャリヤーまたは影響を受けた個体の間の転位、逆位、およびその他における差を検出することができる。
【０２４２】
薬品
本発明は、また、 PDE＿XIV 活性のために治療を必要とする個体を治療する医薬組成物を提供し、この組成物は治療的に有効量の前記活性に影響を与える（例えば、それを阻害する）因子と、薬学上許容される担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバントとを含んでなる。
したがって、本発明は、また、本発明の因子（本発明の寝汗の発現パターンまたはその発現産物の活性および／または本発明によるアッセイにより同定された因子の活性をモジュレートすることができる因子）を含んでなる医薬組成物を包含する。これに関して、そしてヒトの療法において、本発明の因子を単独で投与することができるが、因子は一般に意図する投与の経路および標準的薬学上の実施に関して選択された薬学上の担体、賦形剤または希釈剤と混合されて投与されるであろう。
【０２４３】
１例として、本発明の医薬組成物において、本発明の因子を１種または２種以上の任意の適当な結合剤、滑剤、懸濁剤、被覆剤、または可溶化剤と混合することができる。
一般に、本発明の因子の療法的に有効な毎日の経口的または静脈内の投与量は０．０１〜５０ｍｇ／治療すべき被検体の体重ｋｇ、好ましくは０．１〜２０ｍｇ／ｋｇであろう。本発明の因子は、また、静脈内注入により投与することができ、その投与量は0.001 〜１０ｍｇ／ｋｇ／時である。
因子の錠剤またはカプセル剤を、適当に、単一でまたは一度に２回またはそれ以上の回数で投与することができる。また、本発明の因子を持続放出性処方物の形態で投与することができる。
【０２４４】
したがって、本発明は、また、 PDE＿XIV 活性のために治療を必要とする個体に有効量の本発明の医薬組成物を投与することからなる、前記個体を治療する方法を提供する。
典型的には、医師は個々の患者に最も適当である実際の投与量を決定し、そして投与量は特定の患者の年齢、体重および応答とともに変化するであろう。前述の投与量は平均の症例の典型である。もちろん、より高いまたはより低い投与量の範囲が有益である個々の場合が存在することがあり、そしてこのような場合は本発明の範囲内に入る。
【０２４５】
適当ならば、医薬組成物は吸入により、坐剤またはペッサリーの形態で、典型的にはローション、溶液、クリーム、軟膏またはダスチング粉剤の形態で、皮膚パッチの使用により、賦形剤、例えば、澱粉またはラクトースを含有する錠剤の形態で経口的に、あるいは単独でまたは賦形剤と混合したカプセル剤または小卵の形態で、あるいは香味剤または着色剤を含有するエリキシル剤、溶液または懸濁液の形態で投与することができるか、あるいは医薬組成物は非経口的に、例えば、空洞内、静脈内、筋肉内または皮下に注射することができる。非経口的投与のために、組成物は無菌の水溶液の形態で最良に使用することができ、前記水溶液は他の物質、例えば、溶液を血液と等張するために十分な塩類または単糖類を含有することができる。頬または舌下の投与のために、組成物は慣用法で処方することができる錠剤またはロゼンジの形態で投与することができる。
【０２４６】
ある適用のために、好ましくは組成物は経口的に賦形剤、例えば、澱粉またはラクトースを含有する錠剤の形態で、あるいは単独でまたは賦形剤と混合したカプセル剤または小卵の形態で、あるいは香味剤または着色剤を含有するエリキシル剤、溶液または懸濁液の形態で投与することができる。
非経口投与のために、組成物は無菌の水溶液の形態で最良に使用することができ、前記水溶液は他の物質、例えば、溶液を血液と等張するために十分な塩類または単糖類を含有することができる。
頬または舌下の投与のために、組成物は慣用法で処方することができる錠剤またはロゼンジの形態で投与することができる。
【０２４７】
被検体（例えば、患者）に経口的、非経口的、頬および舌下に投与するために、本発明の因子の毎日の投与レベルは典型的には１０〜５００ｍｇ（単一または分割した投与量）であることができる。したがって、１例として、錠剤またはカプセル剤は、適当に、単一でまたは一度に２回またはそれ以上の回数で投与するために５〜１００ｍｇの活性因子を含有することができる。上に示したように、医師は個々の患者に最も適当である実際の投与量を決定し、そして投与量は特定の患者の年齢、体重および応答とともに変化するであろう。前述の投与量は平均の症例の典型であるが、もちろん、より高いまたはより低い投与量の範囲が有益である個々の場合が存在することがあり、そしてこのような場合は本発明の範囲内に入ることに注意すべきである。
【０２４８】
ある適用において、一般に、ヒトにおいて、本発明の因子の経口投与は好ましい経路であり、最も好都合であり、そして、ある場合において、他の投与の経路に関連する欠点、例えば、空洞内（ｉ．ｃ．）投与に関連する欠点を回避することができる。受容体が嚥下の障害または経口投与後の薬剤の吸収の障害を患う場合において、薬剤は非経口的に、例えば、舌下または頬に投与することができる。
獣医学的使用のために、本発明の因子は典型的には通常の獣医学的実施に従い適当に許容される処方物として投与され、そして獣医外科医は特定の動物に対して最も適当な投与の養生法および投与経路を決定するであろう。しかしながら、ヒトの治療におけるように、獣医学的治療のために因子を単独で投与することができる。
【０２４９】
典型的には、医薬組成物−これはヒトまたは動物の用途であることができる−は、任意の１または複数の薬学上許容される希釈剤、担体、賦形剤またはアジュバントを含むであろう。薬学上の担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図する投与経路および標準的薬学上の実施に関する選択することができる。上に示したように、医薬組成物は、担体、賦形剤または希釈剤として、あるいはそれらに加えて、任意の適当な１または２以上の結合剤、滑剤、懸濁剤、被覆剤、可溶化剤を含むことができる。
【０２５０】
本発明のある態様において、医薬組成物は下記の１または２以上の成分を含んでなるであろう：本発明のアッセイによりスクリーニングされた因子；付属の配列のリストに示されている配列の任意の１つまたはその誘導体、フラグメント、相同体または変異型、あるいは付属の配列のリストに示されている配列の任意の１つにハイブリダイズすることができる配列と相互作用することができる因子。
【０２５１】
PDE＿XIV mRNAを脱安定化するか、あるいは PDE＿XIV の翻訳を阻害する機能をする、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子およびリボザイムは本発明の範囲内に含まれる。このようなヌクレオチド配列は、環状ヌクレオチドのレベルを増加させることが好ましい症状、例えば、炎症において使用することができる。
PDE＿XIV アンチセンス分子は、例えば、 PDE＿XIV 活性の増加に関する、種々の異常な症状の治療の基礎を提供することができる。
PDE＿XIV 核酸のアンチセンス分子は、環状ヌクレオチドのレベルを増加させることが好ましい症状において PDE＿XIV の活性をブロックするために使用できる。
【０２５２】
レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクシニアウイルスから、あるいは種々の細菌のプラスミドに由来する発現ベクターは、組換え PDE＿XIV センスまたはアンチセンス分子をターゲッテッド細胞集団に送出すために使用できる。当業者によく知られている方法を使用して、 PDE＿XIV を含有する組換えベクターを構築することができる。あるいは、組換え PDE＿XIV をリポソーム中のターゲット細胞に送出することができる。
【０２５３】
全長のcDNA配列および／またはその調節因子は、遺伝子機能のセンスの研究（Youssoufian H およびHF Lodish 1993P,Mol.Cell.Biol.13:98-104 ）またはアンチセンスの研究（Eguchi et al.(1991)Ann.Rev.Biochem.60:631-652 ）における道具として PDE＿XIV が研究者らが使用できるようにする。ゲノムＤＮＡから得られたcDNAまたは制御配列から設計されたオリゴヌクレオチドを、in vitroまたはin vivo において使用して発現を阻害することができる。このような技術は現在この分野においてよく知られており、そしてセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはより大きいフラグメントをコーディングまたは制御領域に沿った種々の位置から設計することができる。適当なオリゴヌクレオチドは、２０ヌクレオチドの長さであることができ、 PDE＿XIV 配列または密接に関係する分子をヒトライブラリーから単離するために使用することができる。
【０２５４】
さらに、ホスホジエステラーゼ活性をブロックするために好ましい条件において、高いレベルの PDE＿XIV フラグメントを発現する発現ベクターで細胞または組織をトランスフェクトすることによって、 PDE＿XIV の発現をモジュレートし、これにより環状ヌクレオチドのレベルを増加させることができる。このような構築物は、非翻訳可能なセンスまたはアンチセンス配列で細胞を氾濫させることができる。ＤＮＡの中への組込みの非存在においてさえ、ベクターのすべてのコピーが内因的ヌクレアーゼにより不能とされるまで、このようなベクターはＲＮＡ分子を転写し続けることができる。このような一時的発現は非複製ベクターとともに１月またはそれ以上持続し、適当な複製因子がベクター系の一部分である場合、さらに長く持続することができる。
【０２５５】
ＰＤＥ遺伝子の制御領域、例えば、プロモーター、エンハンサー、およびイントロンに対してアンチセンス配列を設計することによって、遺伝子の発現を修飾することができる。
転写開始部位、例えば、リーダー配列の−１０〜＋１０から誘導されたオリゴヌクレオチドは好ましい。転写物がリボソームへ結合するのを妨害することによって、mRNAの翻訳をブロックするように、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子を設計することもできる。同様に、ホウジブーム（Hogeboom）塩基対の方法（また、「三重らせん」塩基対として知られている）を使用して、阻害を達成することができる。三重らせんの対合は二重らせんの能力を弱体化して、ポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結合のために十分に開かせる。
【０２５６】
したがって、本発明は、本発明の因子（またはその薬学上許容される塩、または薬学上許容される溶媒和物）と、生理学上許容される希釈剤、賦形剤または担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。
医薬組成物は、獣医学的（すなわち、動物）にまたはヒトに使用することができる。
したがって、本発明は、また、有効量の PDE＿XIV タンパク質（アンチセンスの核酸配列を包含する）のインヒビターまたはアンタゴニストと、薬学上許容される希釈剤、担体、賦形剤またはアジュバント（それらの組合わせを包含する）とを含んでなる医薬組成物に関する。
【０２５７】
本発明は、 PDE＿XIV ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部分、 PDE＿XIV アンチセンス分子、 PDE＿XIV ポリペプチド、タンパク質、ペプチドまたは PDE＿XIV 生物活性の有機モジュレーター、例えば、インヒビター、アンタゴニスト（抗体を包含する）またはアゴニストを単独で、あるいは少なくとも１種の他の因子、例えば、安定化化合物と組み合わせてを含んでなることができ、そして生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、および水を包含するが、これらに限定されない、任意の無菌の、生体適合性の薬学上の担体と組み合わせて投与できる医薬組成物に関する。
【０２５８】
一般的方法の参考文献
一般に本明細書において説明した技術はこの分野においてよく知られており、特に下記の文献において言及されている：Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1989)およびAusubel et al., Short Protocols in Molecular Biolgy(1999) 第４版、John Wiley & Sons,Inc. 。ＰＣＲは米国特許第 4,683,195号、米国特許第 4,800,195号および米国特許第 4,965,188号に記載されている。
【０２５９】
寄託
下記の試料は、ブダベスト条約の規定に従い、承認された寄託機関（The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB),23 St.Machar Drive,Aberdeen,Scotland,United Kingdam,AB2 1RY)に1998年12月18日に受託された：
大腸菌（E.coli)pHS-PDE＿XIVNCIMB No.NCIMB 40995
大腸菌（E.coli)pMM-PDE＿XIV NCIMB No.NCIMB40996
下記の試料は、ブダベスト条約の規定に従い、承認された寄託機関（The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB),23 St.Machar Drive,Aberdeen,Scotland,United Kingdam,AB2 1RY)に1999年９月９日に受託された：
NCIMB No.NCIMB 41027は、大腸菌（E.coli)pHS-PDE＿XIVhm である。
【０２６０】
本発明は、また、それらの受託物およびそれらからなる態様から誘導可能なおよび／または発現可能なな配列を包含する。本発明は、また、部分的配列が活性酵素部位をコードする、それらの受託物およびそれらからなる態様から誘導可能なおよび／または発現可能なな部分的配列を包含する。本発明は、また、それらの受託物およびそれらからなる態様から誘導可能なおよび／または発現可能なな配列からなるタンパク質を包含する。本発明は、また、部分的配列が活性酵素部位をコードする、それらの受託物およびそれらからなる態様から誘導可能なおよび／または発現可能なな部分的配列からなるタンパク質を包含する。
本発明は、また、それらの受託物およびそれらからなる態様から誘導可能なおよび／または発現可能なな配列を包含する。
【０２６１】
実施例の節および図面に対して序論
１例として、添付図面を参照して、本発明を説明する。
第１図は、写真の影像を表し、
第２図は、写真の影像を表し、
第３図は、表１および写真の影像を表し、
第４図は、ヌクレオチド配列の整列を表し（ここでヒト配列はトランケート配列である）、
第５図は、タンパク質配列の整列を表し（ここでヒト配列はトランケート配列である）、そして
第６図は、グラフを表す。
【０２６２】
【実施例】
ノザンハイブリダイズおよびプローブの調製
クロンテク（Clontech）から入手したノザンブロットをExpressHybハイブリダイズ溶液（Clontech）中の５５℃において１時間プレハイブリダイズした後、放射能標識化 PDE＿XIV フラグメント（厳格に製造業者の指示に従い５０μＣｉの³²Ｐ−dATPでメガプライム（Megaprime ）ランダム標識化系（Amersham）を使用して、ＤＮＡを標識化した）を新鮮なExpresshybに添加し、おだやかに震盪しながら５５℃においてブロットに一夜ハイブリダイズさせた。次いでブロットを室温において各１０分間２×ＳＳＣ（１５０ｍＭのNaCl、３０ｍＭのクエン酸ナトリウム）中で３回洗浄し、次いで５５℃において各２０分間０．２×ＳＳＣ（１５ｍＭのNaCl、３ｍＭのクエン酸ナトリウム）中で２回洗浄した。次いでブロットをオートラジオグラフィーのフィルムに対して露出した。
【０２６３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
標準的試薬および条件を使用して、ＰＣＲを実施した。簡単に述べると、すべての反応の緩衝液および酵素はキットのフォーマットでクロンテク（Clontech)(cDNA末端の（RACE）反応の急速増幅のために）から、あるいは標準的ＰＣＲのためにライフ・テクノロジーズ（Life technologies ）から入手した。オリゴヌクレオチドは商業的供給会社（OSWEL DNA サービス）から入手し、４００ｎＭの濃度で使用した。使用するキットの製造業者により推奨されるサイクリングパラメーターを使用して、反応をＭＪリサーチPTC-200 サーマルサイクラー上で実施した。
【０２６４】
PDE ＿ XIV の同定
クローン（IMAGE クローン id 1364394 ）をリサーチ・ジェネティクス（Research Genetics)(2130,Memorial Pkwy,SW Huntsville,AL 358801,USA ）からＬ−寒天中のスタブ培養物として入手した。スタブ培養物からの細菌を３７ｍｍのＬ−寒天プレート上に１００ｍｇ／ｍｌの濃度のアンピシリンの存在においてストリーキングした。
【０２６５】
３７℃において一夜増殖させた後、無菌の技術を使用して単一のクローンを取り上げて、１００ｍｇ／ｍｌの濃度のアンピシリンを含有するＬＢ−ブロスの中に入れ、３７℃において一夜震盪（２２０ｒｐｍ）しながら増殖させた。厳格に製造業者の指示に従い標準的な商業的に入手可能なミニプレプキット（QiagenTM）を使用して、プラスミドＤＮＡを細菌から単離した。次いで、標準的な登録のキットおよび試薬およびABI (PE Applied Biosystems Incoporated）自動配列決定装置を使用して、単離されたＤＮＡを全長の配列決定に付した。
【０２６６】
PDE ＿ XIV をコードする推定上の全長の cDNA クローンの単離
完全なコード領域およびターミネーター環状ヌクレオチドを含有する PDE＿XIV のための全長のcDNA の単離を促進するために、 PDE＿XIV の発現を組織のある領域においてノザンハイブリダイズを使用して測定した。これらのデータ（第１図および第２図）が示すように、 PDE＿XIV に対してハイブリダイズするメッセンジャーＲＮＡ（長さ５．５ｋｂ）はいくつかの組織の中に存在するが、それはネズミ脳、骨格筋および肝臓においてかつ下記の胚発生段階において特に高度に発現される：１０．５、１３．５、１５．５日。
【０２６７】
１３．５日のネズミ胚cDNAライブラリーをcDNA陽性選択法 (Gene Trappe,Life Technologies,Inc.) において使用して PDE＿XIV を単離した。この方法を製造業者の使用説明書のように実施した。クローン1364394 のもとのＥＳＴ配列は逆向きであったので、選択オリゴヌクレオチドの設計は５’→３’に走るコーディング鎖と同一であることが必要であり、この工程はクローニング戦略を成功に導くために重大であった。選択および修復のために使用したオリゴヌクレオチドを下に詳述する。
【０２６８】
オリゴ１：
選択１ 5'-GGT CAC AGA ACT GCC ACT ATG GTT AAA TGT-3'
ネズミ PDE＿XIV のヒト相同体を単離するために、ＰＣＲプライマーを既知のEST1364394配列をベースとして設計し（プライマー１およびプライマー２）そしてcDNAライブラリーのパネルをスクリーニングするために使用した。これらのプライマーを使用して実施したＰＣＲ（標準的サイクリングのパラメーターを使用し、製造業者の指示に従いＰＣＲ試薬系キット（Life Technologies ）から入手した試薬を使用して、ＰＣＲを設定した）は、ヒトHELA細胞系統cDNAライブラリー（Life Technologies,Inc.）から入手した、期待された大きさ１６４ｂｐのフラグメントを発生させ、同一選択／修復オリゴヌクレオチド（オリゴ１）を使用して、ヒトクローンを単離した。
【０２６９】
プライマー１：
新しいPDE1 5'-ACC GCT CAG AGA TTT CAC AGC A-3'
プライマー２：
新しいPDE2 5'-CCC GTC TGA CCC CTT AGT CGT A-3'
前述のプライマーおよび下記の方法を使用するコロニーＰＣＲによる引き続くスクリーニングのために、クローンを選択した。
【０２７０】
無菌のつまようじを使用して、単一のコロニーを取り上げ、２５μｌの１＊ＰＣＲスーパーミックス（Life Technologies,Inc.）および２００ｎＭのプライマーを含有する管に添加した。この管を１秒間渦形成し、14,000×ｇで２秒間遠心した。次いで、管を前もって加温したサーマルサイクラー（MJ Research PTC-200 サーマルサイクラー）の中に９４℃において入れた。下記のプログラムを使用して、ＰＣＲを実施した：１サイクル；９４℃、１分、次いで３０サイクル：９４℃、３０秒、５５℃、３０秒、７２℃、１分。次いでＰＣＲ生成物を標準的方法に従いゲル電気泳動により分析した。
【０２７１】
単離されたネズミクローンの分析により、４４６残基のＯＲＦを含有する2823ｂｐの隣接配列を組立てることができた。ネズミ PDE＿XIV の全長のcDNA配列は配列番号：７として表され、このcDNA内の最大のオープンリーディングフレームの翻訳は配列番号：１として表される。コーディング領域は配列番号：３として表される。
【０２７２】
単離されたヒトクローンの分析により、２８８残基のＯＲＦを含有する2992ｂｐの隣接配列を組立てることができた。ヒト PDE＿XIV の全長のcDNA配列は配列番号：８として表され、このcDNA内の最大のオープンリーディングフレームの翻訳は配列番号：３として表される。コーディング領域は配列番号：４として表される。このクローンを使用して、標準的ノザンブロット法に従いマスターＲＮＡブロット（Clontech）をスクリーニングして、このcDNAについての組織の分布を同定した。
【０２７３】
結果（第３図参照）が示すように、転写物は被殻および脳の尾状核、ならびに脳の後頭葉、心臓、卵巣、下垂体、腎臓、肝臓、小腸、胸腺、および虫垂骨において高度に発現される。
今日までに配列決定されたすべての哺乳動物のホスホジエステラーゼと同様に、 PDE＿XIV は、触媒活性について必須であると考えられるタンパク質のカルボキシル末端の半分の中に、ほぼ２５０アミノ酸の保存された触媒ドメインの配列を含有する。このセグメントは配列番号：１中のアミノ酸１０８−４１３からなり、そして他のＰＤＥの対応する領域をもつ配列の保存を示す。ヌクレオチドの整列（第４図参照）およびタンパク質の整列（第５図参照）から明らかように、位置1102ｂｐにおける未成熟の停止コドンのために、ヒト PDE＿XIV クローンは３’末端においてトランケートされている。
【０２７４】
PDE ＿ XIV をコードする推定上の全長のヒト cDNA の単離
ヒト胎児脳cDNAライブラリーをライフ・テクノロジーズ・インコーポレーテッド（Life Technologies,Inc.) (LTI) から購入した。１００ｍｌのルリア・ブロス（Luria Broth ）（１０ｇのトリプシン、５ｇの酵母エキス、５ｇのNaCl／リットル）＋１００μｇ／ｍｌのアンピシリンに、２．５×１０9 ｃ．ｆ．ｕ．の各cDNAライブラリーを接種した。各ライブラリーを個々に増殖させ、調製した。培養物を３０℃において一夜増殖させ、そしてGene Trapper^TMプロトコール（ＬＴＩ）に記載されているようにして、プラスミドＤＮＡを調製した。
【０２７５】
Gene Trapper^TM (LTI)を使用するcDNAクローンの陽性の選択について詳細な方法はキットのプロトコールの中に概説されており、下記の変更を除外して、これらに従った。一本鎖cDNAライブラリーを２０ｎｇのビオチニル化捕捉オリゴヌクレオチドと組合わせ、３７℃において１時間インキュベートした。ＤＮＡポリメラーゼエクステンションのプライマーとして捕捉オリゴヌクレオチドを使用して、溶離された一本鎖ＤＮＡを調製した。修復されたcDNAライブラリーを、製造業者のプロトコールに従い、大腸菌（E.coli) DH10B 株（ＬＴＩ）の中にエレクトロポレーションした。
【０２７６】
ヒト PDE ＿ XIV のクローニング、組織分布および配列の分析
全長のcDNAの単離を促進するために、 PDE＿XIV の発現プロフィルをある範囲のマウス組織中でノザンハイブリダイズにより決定した。これは５．０ｂｋの転写物を同定し、この転写物はマウス胚中で１３．５日においてそして成体マウスの心臓、脳および肝臓において特に高度に発現される。この転写物は、また、８．５、１０．５、１５．５日の胚において、そして成体の骨格筋、腎臓および肺において低いレベルで存在する。
【０２７７】
転写物は脾臓または精巣において検出されなかった。データに基づいて、陽性cDNA選択技術、Gene Trapper (LTI)に従い、１３．５日の胚のcDNAライブラリー（ＬＴＩ）を鋳型として使用して、全長の配列を単離した。これは PDE＿XIV 特異的オリゴヌクレオチド使用することによって達成される。ＰＣＲを実施し、少なくともＥＳＴフラグメントを含有するcDNAを同定することができた。制限エンドヌクレアーゼの消化により、２８８５ｂｐのインサートを含有する多数のクローンが同定され、そして全長の配列の分析により、これらのクローンが５１．３ｋＤＡの予測分子量を有する４４６アミノ酸のＯＲＦをコードすることが示された。
【０２７８】
さらに、Gene Trapperにより同一の特異的捕捉オリゴヌクレオチドおよび鋳型としてヒト胎児脳cDNAライブラリーを使用して、全長のヒトcDNAを単離した。２６５３ｂｐのインサートを含有する多数のクローンが単離され、そして完全な配列の分析は５１．８ｋＤＡの予測分子量を有する４５０残基のＯＲＦを同定した。全長のヒトcDNAを使用して、ＲＮＡマスターブロットをプロービングした。これにより、ヒト PDE＿XIV のmRNAは候補の核、被殻および脳の後頭葉において高度に発現され、そして心臓、卵巣、下垂体、腎臓、肝臓、小腸および胸腺において末梢的に発現されることが同定された。低いレベルが骨格筋、結腸、膀胱、子宮、前立腺、胃、下垂体、胸腺において観測された。転写物は、精巣、脾臓、膵臓、末梢白血球、リンパ節、骨髄、大動脈または小脳において観測されなかった。
【０２７９】
マウスおよびヒト PDE＿XIV の配列の比較は、それらが９１％のアミノ酸の同一性を有することを示す。予測されたヒトＯＲＦは４アミノ酸だけ拡張されており、これはマウス配列の位置４２８における５つのアミノ酸の挿入および位置４４１における単一のアミノ酸の欠失の結果である。さらに、双方のcDNAはセリン４５において単一のcAMPタンパク質キナーゼリン酸化部位を含有する。 PDE＿XIV の２３０アミノ酸の触媒ドメイン（アミノ酸１７２−４２０）と他のＰＤＥの代表との系統発生的整列は、 PDE＿XIV がPDE7A に対して最高の相同性（約７０％の同一性）を有し、それにクラスターすることを示す。
【０２８０】
それ以上の生物情報科学的分析は、このドメインが他の９つの既知のＰＤＥサブファミリーにおける同等の領域と５０％の配列の同一性を共有することを示し、こうしてこれは PDE＿XIV がPDE7ファミリーの第２の代表であるうることを示すことができる。
PDE＿XIV 配列は２つの推定上の２価のカチオン結合モチーフＨＸＸＸＨＸ8-20Ｄ（アミノ酸１７３−１８０、２１３−２７０）を含有し、これらは加水分解活性のために必須であると考えられる。それゆえ、これは PDE＿XIV が機能的ホスホジエステラーゼ酵素をコードするというそれ以上の証拠である。
【０２８１】
粗製の哺乳動物細胞ライゼイトについてのホスホジエステラーゼアッセイ
リポフェクタミン（Life Technologies,Inc.）および標準的方法を使用して、ネズミおよびヒト双方の PDE＿XIV cDNAを哺乳動物COS7細胞系統（ATCC）の中にトランスフェクトした。COS7細胞をトランスフェクション後７２時間に収集し、cAMP SPAアッセイ（Amersham）のための商業的に入手可能なＳＰＡ（シンチレーション近接性アッセイ）キット（Amersham）により、下記のホスホジエステラーゼ活性を使用して、ＰＤＥ活性についてアッセイした。溶解緩衝液（５０ｍＭのHEPES 、ｐＨ７．２、１．９２ｍＭのMgCl₂ 、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのEGTA、１プロテアーゼインヒビタータブレット／５０ｍｌ）中で細胞ライゼイトの連続希釈を行って、内因的阻害作用を希釈した。
【０２８２】
２５ｍｌの希釈された粗製のライゼイトに、２５ｍｌの緩衝液Ｄ（緩衝液Ｃ＋ＢＳＡ、２ｍｇ／ｍｌ）を添加し、次いで５００ｎＭのcAMP基質（２０μｌの［ ³Ｈ］cAMP（１μＭの４μＣｉ／ｍｌ）＋４２３μｌの冷cAMP、１０μＭ／５ｍｌ）を含有する２５ｍｌの緩衝液Ｃ（２０ｍＭのTris／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのMgCl₂ ・6H₂O）を添加した。この反応を３０℃において３０分間インキュベートした。次いで５０μｌのＳＰＡビーズを添加し、直ちに２０００ｒｐｍにおいて５分間遠心した。読みをトップカウント（Topcount) (Wallac)シンチレーションカウター上の収集した。
結果（第６図）が示すように、ヒトおよびネズミの双方の PDE＿XIV クローンは、モック形質転換された対照よりも、１０倍より高い活性を有した。
【０２８３】
バキュロウイルス中のホスホジエステラーゼの発現
PDE＿XIV は、Ｎ末端のFLAG標識に融合されたとき、バキュロウイルス中で発現された。その詳細は後に提示される。
ホスホジエステラーゼ cDNA の活性
cAMP濃度が０〜１０μＭの精製された発現した PDE＿XIV についてのcAMPシンチレーション近接性アッセイを使用して、発現された PDE＿XIV は０．０８μＭの強いcAMP活性を示した（反応速度の曲線から誘導されたヘンズ（Hanes ）プロットにより決定して）。また、研究において、 PDE＿XIV はcGMPに対して活性をもたないことが明らかにされた。こうして、 PDE＿XIV はcAMP特異的であることができる。
【０２８４】
ホスホジエステラーゼ阻害の研究
PDE＿XIV はＰＤＥインヒビターのミルリノン（Rolipram and Ariflo ）に対して感受性ではないことが見出された。しかしながら、ジピリダモールおよびIBMX（それぞれ、10.72 μＭおよび９．３２μＭのＩＣ５０値を有する）を使用して、 PDE＿XIV 活性の阻害が見られた。これらの研究のデータを下記表に表す。
【０２８５】
【表４】

【０２８６】
バキュロウイルスの発現
下記の研究において、バキュロウイルス発現合成を使用して、本発明のＰＤＥ酵素（ここで略してＰＤＥと呼ぶ）を発生させることができることを証明する。
下記の研究においても、ＰＤＥがバキュロウイルス系において発現されたとき、ＰＤＥは環状ヌクレオチドの加水分解活性を示すことを証明する。
スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda ）昆虫細胞（Ｓｆ９細胞）のオートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核の多核体病ウイルス（AcNPV ）の感染をベースとするバキュロウイルスの発現系を使用して、ＰＤＥ酵素を発生させた。
【０２８７】
これらの研究において、ミニ−Ｔｎ７転位因子を含有するドナープラスミドpFASTBAC-FLAG の中に、ＰＤＥをコードするcDNAをクローニングした。親バクミドbBON14272 (AcNPV感染性ＤＮＡ）およびヘルパープラスミドを含有するDH10BAC コンピテント細胞の中に、組換えプラスミドを形質転換した。pFASTBACドナー上のミニ−Ｔｎ７因子はバクミド上のattTn7結合部位に転位することができ、こうしてＰＤＥ遺伝子をウイルスのゲノムの中に導入する。組換えバクミドを含有するコロニーはlacZ遺伝子の崩壊により同定される。次いでＰＤＥ／バクミド構築物を単離し、昆虫細胞（Ｓｆ９細胞）の中に感染させると、感染性組換えバキュロウイルス粒子が生成し、そして組換えPDE-FLAG融合タンパク質が発現される。
【０２８８】
粗製の細胞抽出物のホスホジエステラーゼ活性を測定した。
細胞を収集し、トランスフェクション後２４、４８および７２時間に抽出物を調製した。
これらの結果が確証するように、PDE cDNAはcAMPを加水分解することができるホスホジエステラーゼをコードする。
【０２８９】
精製されたIgG1モノクローナル抗FLAG抗体が加水分解可能な結合により結合されたアガロースビーズ（Ｍ２アフィニティーゲル）を含有するカラム（Eastman Kodak ）を使用するFPLCにより、粗製のライゼイト物質を精製した。これにより、組換え物質をカラム上に特異的に保持することができる（組換え物質はFLAGエピトープに融合されるので）が、内因的昆虫タンパク質は溶出液の中に洗浄除去される。次いで組換え物質を低いｐＨの条件下に洗浄除去する。
【０２９０】
この精製された物質は詳細な酵素およびインヒビターの研究のためにいっそう適当であった。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動（SDS-PAGE）後におけるクーマッシー染色によるか、あるいは非染色SDS-PAGE（組換えＰＤＥを含有する）のニトロセルロース膜上へのウェスタンブロッティングおよびIgG1モノクローナル抗FLAGエピトープ抗体を使用する分析により、この物質の純度をアッセイする。抗FLAG抗体と、ＰＤＥタンパク質に融合されたFLAGエピトープとの間の相互作用のために、PDE-FLAG融合タンパク質は検出される。
【０２９１】
商業的に入手可能なＳＰＡ（シンチレーション近接性アッセイ）キット（Amersham-Amersham place,Little Chalfont,Bucks,HP79NA UK ）を使用して、精製されたPDE-FLAG融合タンパク質のホスホジエステラーゼ活性をcAMPおよび／またはcGMPについてアッセイした。これを使用すると、ある範囲の基質濃縮において酵素活性を測定することによって、cAMPに対するＰＤＥのＫｍ値を測定し、これにより酵素について近似Vmaxを計算することができる。
これらの実験結果が示すように、PDE cDNAはcAMPを加水分解することができるホスホジエステラーゼをコードする。
要約すると、なかでも、下記の事実を本発明は提供しそして実施例はを示す：
【０２９２】
１．新規なアミノ酸。
２．新規なヌクレオチド配列。
３．前記新規な配列を使用するアッセイ。
４．前記アッセイの使用により同定された化合物／組成物。
５．前記新規な配列からなるか、あるいはそれらを発現する発現系。
６．前記新規な配列をベースとする治療の方法。
７．前記新規な配列をベースとする医薬組成物。
【０２９３】
上記明細書の中に記載されたすべての刊行物は引用することによって本明細書の一部とされる。本発明の範囲および精神から逸脱しないで、本発明の記載された方法および系の種々の変更および変化は当業者にとって明らかとなるであろう。本発明は特定の好ましい態様と関連して記載されたが、請求の範囲に記載されている本発明はこのような特定の態様に不当に限定されないことを理解すべきである。事実、生化学およびバイオテクノロジーまたは関係する分野において当業者にとって明らかである、本発明を実施する記載されたモードの種々の変更は本発明の範囲内に入ることを意図する。
【０２９４】
【配列表】
下記の配列が提示される：
配列表：１＝ネズミアミノ酸配列
配列表：２＝ネズミコーディングヌクレオチド配列
配列表：３＝トランケートヒトアミノ酸配列
配列表：４＝トランケートヒトコーディングヌクレオチド配列
配列表：５＝ヒトアミノ酸配列
配列表：６＝ヒトコーディングヌクレオチド配列
配列表：７＝ネズミcDNA配列
配列表：８＝トランケートヒトcDNA配列
配列表：９＝式Ｉ
（上記テキストにおいて、配列表：２に関する言及は配列表：７に等しく適用可能であることに注意すべきである。また、配列表：４または配列表：６に関する言及は配列表：８に等しく適用可能である。）
【０２９５】
【表５】

【０２９６】
【表６】

【０２９７】
【表７】

【０２９８】
【表８】

【０２９９】
【表９】

【０３００】
【表１０】

【０３０１】
【表１１】

【０３０２】
【表１２】

【０３０３】
【表１３】

【０３０４】
【表１４】

【０３０５】
【表１５】

【０３０６】
【表１６】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、³²Ｐ標識化ネズミペプチドによりプロービングしたネズミＭＴＮのブロットを示す電気泳動図であり図面代用写真である。
【図２】図２は、³²Ｐ標識化ネズミペプチドによりプロービングしたネズミ胚ＭＴＮのブロットを示す電気泳動図であり、図面代用写真である。
【図３】図３は、³²Ｐ標識化ヒトペプチドによりプロービングしたヒトＲＮＡのマスターブロットの図である。
【図４】図４は、ネズミ及びヒトの PDE＿XIV ヌクレオチド配列の整列を示す図である。新しい配列は PDE＿XIV である。パップル：遺伝子コンピューターグループである。
【図５】図５は、ネズミ及びヒトの PDE＿XIV ヌクレオチド配列の整列を示す図である。新しい配列は PDE＿XIV である。パップル：遺伝子コンピューターグループである。
【図６】図６は、ネズミ及びヒトの PDE＿XIV ヌクレオチド配列の整列を示す図である。新しい配列は PDE＿XIV である。パップル：遺伝子コンピューターグループである。
【図７】図７は、ネズミ及びヒトの PDE＿XIV ヌクレオチド配列の整列を示す図である。新しい配列は PDE＿XIV である。パップル：遺伝子コンピューターグループである。
【図８】図８は、ネズミ及びヒト PDE＿XIV の整列を示す図である。
【図９】図９は、ネズミ及びヒトの PDE＿XIV のcAMP加水分解活性を測定した結果を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an enzyme. The invention also relates to the nucleotide sequence that encodes it.
In particular, the present invention relates to a novel nucleic acid sequence encoding a novel phosphodiesterase enzyme.
The invention also relates to the use of novel nucleic acid and amino acid sequences in the diagnosis and treatment of diseases.
[0002]
The present invention also relates to the use of novel nucleic acid and amino acid sequences to evaluate and / or screen for factors that can modulate phosphodiesterase activity.
Furthermore, the present invention relates to genetically engineered host cells comprising or expressing novel nucleic acid and amino acid sequences for evaluating and / or screening for factors capable of modulating phosphodiesterase activity. .
[0003]
[Prior art]
Cyclic nucleotides such as cAMP and cGMP are important intracellular second messengers. Cyclic nucleotide phosphodiesterases, also known as PDEs, are a family of enzymes that are one of the cellular components that catalyze the degradation of cyclic nucleotides and regulate the concentration of cyclic nucleotides in their execution.
[0004]
In recent years, at least 10 PDE enzymes, and a number of subtypes of these enzymes have been defined based on substrate affinity and cofactor requirements (Beavo JA and Reifsnyder DH, Trends Pharmacol. Sci. 11). : 150 [1990]; Beavo J, Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action, Beavo J and Housley MD (eds.), Wiley: Chichester, pp. 3-15 [1990]).
[0005]
Examples of subfamilies include: PDE1 (sometimes described as PDEI), Ca²⁺/ Calmodulin dependent; PDE2 (sometimes written as PDEII), cGMP-specific; PDE3 (sometimes written as PDEIII), cGMP-inhibited cAMP hydrolyzable; PDE4 (sometimes written as PDEIV), cAMP-specific, rolipram Sensitive; PDE5 (sometimes written as PDEV), cGMP-specific; PDE6 (sometimes written as PDEVI), photoreceptor cGMP-specific; PDE7 (sometimes written as PDEVII), cAMP-specific, rolipram-insensitive; PDE8 ( (Sometimes written as PDEVIII), cAMP specific IBMX insensitivity; PDE9 (sometimes written as PDEIX), cGMP specific IBMX insensitive; PDE10 (sometimes written as PDEX) dual substrate, IBMX sensitive.
[0006]
PDE is a conserved C-terminal catalytic domain of approximately 270 amino acids (Charbonneau et al., PNAS 83 (24): 9308-12), regulation of catalytic activity by binding cofactors, and subcellular localization. It contains a specific N-terminal domain (Juilfs et al., (1999) Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 135: 67-104).
[0007]
Each PDE family can contain two or more isoforms (ie there can be two or more PDE isoenzymes). As an example, the mammalian PDEIV, a homologue of the Drosophila Dunce gene (Chen CN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83: 9313 [1986]) It is known to have an isoform (Swinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 5325 [1989]). Human PDE is also known to exist as an isoform and has a splice variant. For example, the cloning of one human isoform of PDEIV from monocytes was reported in 1990 (Livi GP et al., Mol. Cell. Biol. 10: 2678 [1990]). As another example, other researchers have independently cloned three splice variants of PDEIV, which are now designated hPDEIV-B1, hPDEIV-B2, and hPDEIV-B3.
[0008]
Teachings on cyclic nucleotide phosphodiesterases can also be found in US Pat. No. 5,932,423 and US Pat. No. 5,932,465.
Teachings regarding other cyclic nucleotide phosphodiesterases, such as CN PDE8, can be found in WO-A-97 / 35989. According to WO-A-97 / 35989, CN PDE8 has two isoenzymes, which were designated as CN PDE8A and CN PDE8B. The term “isoenzyme” is sometimes referred to in this field as “isoform”.
[0009]
 According to WO-A-97 / 35989, numerous inhibitors of different PDEs have been identified and some have been clinically evaluated. For example, PDEIII inhibitors have been developed as antithrombotic, antihypertensive and cardiotonic agents useful in the treatment of congestive heart failure. Rolipram, a PDEIV inhibitor, has been used in the treatment of depression, and other inhibitors of PDEIV are being evaluated as anti-infective agents.
[0010]
Rolipram has also been shown to inhibit lipopolysaccharide (LPS) induced TFN-alpha, which has been shown to enhance HIV-1 replication in vitro. Thus, rolipram can inhibit HIV-1 replication (Angel, et al., 1995, AIDS 9: 1137-44). Furthermore, based on its ability to suppress the production of TFN-alpha and beta, rolipram has been shown to be effective in the treatment of experimental animals for encephalomyelitis, multiple sclerosis (Sommer, et al., 1995, Nat Med 1: 244-248) and may be effective in the treatment of late dyskinesia (Sasaki, et al., 1995 Eur. J. Pharmacol. 282: 71-76).
[0011]
 According to WO-A-97 / 35989 also non-specific PDE inhibitors such as theophylline used in the treatment of bronchial asthma and other respiratory diseases, and intermittent claudication and diabetes-induced peripheral vascular disease There are pentoxifylline used in therapy. Theophylline acts on airway smooth muscle function and is thought to act in anti-inflammatory or immunomodulatory capacity in the treatment of respiratory diseases (Banner et al., 1995, Respir. J.8: 996-1000 ) Where it appears to act by inhibiting the hydrolysis of both CN PDE cAMP and cGMP (Banner et al., Monaldi. Arch. Chest. Dis. 50: 286-292). Pentoxifylline is also known to block TFN-alpha and can inhibit HIV-1 replication (Angel et al., Supra). A list of CN PDE inhibitors is given in Beavo 1995 supra.
[0012]
In addition to their isoenzymes and their subtypes, selective inhibitors of PDE will lead to more effective treatments with fewer side effects. See, for example, the teachings in the literature review: Wieshaar RE et al., J. Med. Chem. 28: 537 [1985]), Giembycz MA, Biochem. Pharm. 43: 2041 [1992] and Lowe JA And Cheng JB, Drugs of the Future, 17: 799-807 [1992].
Thus, in certain applications it is desirable to have selective inhibition of individual types of PDEs. Therefore, the cloning and expression of novel PDEs greatly facilitates the discovery of selective inhibitors.
[0013]
[Summary of the Invention]
Aspects of the invention are expressed in the claims and in the following description.
Briefly stated, some aspects of the present invention are as follows:
1. New amino acid.
2. New nucleotide sequence.
3. Assay using the novel sequence.
4). A compound / composition identified using the assay.
5). An expression system comprising or expressing said novel sequences.
6). A therapeutic method based on said novel sequence.
7). A pharmaceutical composition based on said novel sequence.
[0014]
Other aspects relating to the amino acid sequences of the invention and / or the nucleotide sequences of the invention include the following: constructs comprising or capable of expressing the sequences of the invention; sequences of the invention A vector comprising or capable of expressing them; a plasmid comprising or expressing the sequences of the invention; comprising a sequence of the invention or expressing them Tissue capable of; organs comprising or expressing the sequences of the invention; transformed hosts comprising or capable of expressing the sequences of the invention; A transformed organ comprising or capable of expressing the sequences of the invention. The invention also encompasses methods for expressing them, eg, expression in microorganisms, eg, methods for transforming them.
[0015]
For ease of reference, aspects of the present invention will now be discussed under the appropriate section headings. However, the teachings under each section are not necessarily limited to each particular section.
In the following discussion, references to “nucleotide sequence of the invention” and “amino acid sequence of the invention” refer to any one or more of the nucleotide sequences presented or discussed herein, and Means any one or more of the amino acid sequences presented or discussed. Also, as used herein, “amino acid sequence” means a peptide or protein sequence and may refer to a portion thereof. Furthermore, the term “amino acid sequence of the invention” is synonymous with the phrase “polypeptide sequence of the invention”. The term “nucleotide sequence of the present invention” is synonymous with the phrase “polynucleotide sequence of the present invention”.
[0016]
[Detailed aspects of the present invention]
According to a first aspect of the present invention there is provided an amino acid sequence consisting of a sequence represented as Formula I or a variant, homologue, fragment or derivative thereof, wherein the amino acid sequence can exhibit PDE activity. .
Formula I is represented as:
[0017]
[Chemical 2]

[0018]
For convenience, a table showing the codes used for amino acids is presented here.
[Table 1]

[0019]
Here, Formula I—which can be represented as SEQ ID NO: 9—is a general formula. Formula I was constructed from sequence analysis of certain novel sequences presented herein.
For convenience, the PDE of the present invention is sometimes called PDE_XIV. The inventor also sometimes refers to this enzyme as PDEXIV. If the enzyme can be obtained from a human, we use the subscript or prefix HS (or HM) or hs (or hm). If the enzyme can be obtained from a mouse, we use the subscript or prefix MM (or Mm or mm).
[0020]
The PDE of the present invention can catalyze the degradation of cAMP.
For SEQ ID NO: 9, any one or more of the amino acids can be an analogue thereof.
The term “analog” as used herein is a sequence that is similar to the sequence of formula I, but is not deleterious (ie not deleterious to enzyme activity) amino acid substitutions or deletions. Means a sequence having
Preferably, the PDE enzymes of the invention have at least a divalent cation binding motif and / or a conserved cAMP-dependent protein kinase phosphorylation motif in the C-terminal catalytic domain.
[0021]
Preferably, the PDE enzyme of the invention has at least a divalent cation binding motif and a conserved cAMP-dependent protein kinase phosphorylation motif within the C-terminal catalytic domain.
Preferably, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 includes at least five of Z1 to Z26.
Preferably, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 includes at least 10 of Z1 to Z26.
Preferably, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 comprises at least 15 of Z1-Z26.
Preferably, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 includes at least 20 of Z1 to Z26.
[0022]
Preferably, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 comprises at least 25 of Z1-Z26.
Preferably, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 includes at least each of Z1 to Z26.
Preferably, the amino acid sequence is composed of more than about 230 amino acid residues.
Preferably, the amino acid sequence is composed of more than about 250 amino acid residues.
Preferably, the amino acid sequence is composed of more than about 260 amino acid residues.
[0023]
Preferably, the amino acid sequence is composed of at least 268 amino acid residues.
Preferably, the amino acid sequence of formula I consists of at least one or more of Z7, Z9, Z10, Z11, Z12, Z13, Z14, Z15, Z16, Z17 and Z18 or analogues thereof.
Preferably, the amino acid sequence of formula I consists of each of Z7, Z9, Z10, Z11, Z12, Z13, Z14, Z15, Z16, Z17 and Z18 or analogs thereof.
Preferably, the amino acid sequence of formula I consists of each of Z1, Z5, Z6, Z7, Z9, Z10, Z11, Z12, Z13, Z14, Z15, Z16, Z17 and Z18 or analogs thereof.
[0024]
[Chemical 3]

[0025]
Where
Each of Z1-Z26 is as defined above, and
Each of X1-X24 is independently selected from any suitable peptide sequence or amino acid.
A more preferred example of an amino acid sequence comprising the sequence represented as Formula I is the amino acid sequence represented as Formula III or a variant, homologue, fragment or derivative thereof.
[0026]
[Formula 4]

[0027]
Where
Each of Z1-Z26 is as defined above, and
X1 = V or I
X2 = S or N
X3 = E or D
X4 = peptide consisting of at least 2 or more of S, V, N or A
X5 = V or I
X6 = P or R
X7 = N or S
X8 = H or Y
X9 = T or M
X10 = S or T
X11 = Peptide consisting of at least 2 or more of G, H, S, Q
[0028]
X12 = peptide consisting of at least 2 or more of D, A, N, V
X13 = E or D
X14 = S or T
X15 = H or R
X16 = G or S
X17 = Peptide consisting of at least 2 or more of P, R, S, N
X18 = S or R
X19 = peptide consisting of at least 2 or more of S, G, P, D, H, Q
X20 = H or L
X21 = Peptide consisting of at least 2 or more of Q, G, T, P, A
[0029]
X22 = peptide consisting of at least 2 or more of S, E, T, L
X23 = any T
X24 = peptide consisting of at least 2 or more of D, S, A, T
A more preferred example of an amino acid sequence comprising the sequence represented as Formula I is the amino acid sequence represented as Formula IV or a variant, homologue, fragment or derivative thereof.
[0030]
[Chemical formula 5]

[0031]
Where
Each of Z1-Z26 is as defined above, and
X1 = V or I
X2 = S or N
X3 = E or D
X4 = SV or NA
X5 = V or I
X6 = P or R
X7 = N or S
X8 = H or Y
X9 = T or M
X10 = S or T
X11 = GH or SQ
X12 = DA or NV
[0032]
X13 = E or D
X14 = S or T
X15 = H or R
X16 = G or S
X17 = PR or SN
X18 = S or R
X19 = SGSGPDH or GQ
X20 = H or L
X21 = QGT or PAP
X22 = SE or TL
X23 = any T
X24 = DS or AT
[0033]
Any one example of the above formula is a group. . . . HZ₁₇GZ₁₈PRZ₁₉. . . . But. . . . RZ₁₇SZ₁₈SNZ₁₉. . . . It is the amino acid sequence substituted by.
Preferred examples of amino acids according to the invention comprising the sequence represented by formula I are shown as follows: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5, or variants, homologues thereof, Fragment or derivative.
It should be understood that reference to any one or more of the above formulas also applies equally to any one or more of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5.
[0034]
Preferably, reference herein to any one or more of the above formulas means any one or more of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5.
More preferably, reference to any one or more of the above formulas means SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5.
According to a second aspect of the present invention there is provided an amino acid comprising the sequence represented as Formula I.
According to a third aspect of the present invention, there is provided a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the present invention.
[0035]
According to a fourth aspect of the present invention there is provided a nucleotide sequence comprising the sequence represented as SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6, or a variant, homologue, fragment or derivative thereof. Is done.
According to a fifth aspect of the invention there is provided a nucleotide sequence comprising the sequence represented as SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6.
According to a sixth aspect of the present invention there is provided a nucleotide sequence capable of hybridizing to a nucleotide sequence according to the present invention or a sequence which is complementary thereto.
[0036]
According to a seventh aspect of the present invention there is provided a nucleotide sequence capable of hybridizing to the nucleotide sequence according to the sixth aspect of the present invention or to a sequence which is complementary thereto.
According to an eighth aspect of the present invention there is provided a vector comprising the nucleotide sequence of the present invention.
According to a ninth aspect of the present invention, there is provided a host cell incorporating the nucleotide sequence of the present invention.
[0037]
According to a tenth aspect of the present invention, there is provided an assay for identifying an agent capable of affecting the activity or expression of PDE_XIV, the assay comprising an agent of the present invention or a nucleotide sequence of the present invention. And measuring the activity or expression of PDE_XIV, wherein: a) the activity or expression of PDE in the absence of said factor; and b) the activity of PDE in the presence of said factor Or the difference between expression indicates that the factor can affect the activity or expression of PDE_XIV.
[0038]
Preferably, the assay comprises the putamen, caudate nucleus of the brain, occipital lobe of the brain, heart, ovary, pituitary, kidney, liver, small intestine, thymus, skeletal muscle, leukocyte region, dorsal root ganglion, uterus, cochlea Screening for factors that are used in the treatment of disorders found in one or more of the small intestine (duodenum), astrocytoma, and appendix.
According to an eleventh aspect of the present invention, (a) performing the assay of the present invention, (b) identifying one or more factors that affect the activity or expression of PDE_XIV, and (c) an amount of There is provided a method comprising preparing those one or more identified factors.
[0039]
According to a twelfth aspect of the present invention, a method of influencing the activity or expression of PDE_XIV with a factor in vivo, wherein the factor can affect the activity or expression of PDE_XIV in an in vitro assay, A method is provided wherein the in vitro assay method is the assay method of the present invention.
According to a thirteenth aspect of the present invention, to treat a disease or condition associated with PDE_XIV, wherein the factor can have an effect on the activity or expression of PDE when assayed in vitro by the assay method of the present invention. Use of factors in the manufacture of a pharmaceutical composition is provided.
[0040]
According to a fourteenth aspect of the present invention, there is provided an enzyme capable of reacting immunologically with an antibody raised against PDE_XIV.
According to a fifteenth aspect of the present invention there is provided a nucleotide sequence encoding PDE and obtainable from NCIMB40995, NCIMB40996 or NCIMB40997.
According to a sixteenth aspect of the present invention there is provided a PDE expressed from a nucleotide sequence obtainable from NCIMB40995, NCIMB40996 or NCIMB40997.
According to a seventeenth aspect of the present invention, there is provided the use of a factor having an effect on the activity of PDE_XIV or its expression in the manufacture of a pharmaceutical composition for treating a disease or condition associated with PDE_XIV.
[0041]
According to a further aspect of the invention, there is provided a nucleotide sequence selected from the following nucleotide sequences:
(A) a nucleotide sequence represented as any one of SEQ ID NOs: 2, 4 or 6;
(B) a nucleotide sequence that is a variant, homologue, derivative or fragment of the nucleotide sequence represented as any one of SEQ ID NO: 2, 4 or 6;
(C) a nucleotide sequence that is the complement of the nucleotide sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 2, 4, or 6;
(D) a nucleotide sequence that is the complement of a nucleotide sequence that is a variant, homologue, derivative or fragment of the nucleotide sequence represented as any one of SEQ ID NOs: 2, 4 or 6;
[0042]
(E) a nucleotide sequence capable of hybridizing to the nucleotide sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 2, 4 or 6;
(F) a nucleotide sequence capable of hybridizing to a variant, homologue, derivative or fragment of the nucleotide sequence represented as any one of SEQ ID NO: 2, 4 or 6;
(G) a nucleotide sequence that is the complement of a nucleotide sequence capable of hybridizing to the nucleotide sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 2, 4, or 6;
(H) a nucleotide sequence that is the complement of a nucleotide sequence capable of hybridizing to a variant, homologue, derivative or fragment of the nucleotide sequence represented as any one of SEQ ID NOs: 2, 4 or 6 ;
[0043]
(I) a nucleotide sequence capable of hybridizing to the complement of the nucleotide sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 2, 4 or 6;
(J) a nucleotide sequence capable of hybridizing to the complement of a nucleotide sequence variant, homologue, derivative or fragment represented as any one of SEQ ID NOs: 2, 4 or 6;
(K) The genetic code for the nucleotide defined in (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i) or (j) Nucleotide sequence having degeneracy as a result of.
(L) of (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j) and / or (k) Nucleotide sequence comprising any one.
[0044]
Other aspects of the invention are now presented below:
Isolated nucleotide sequence or isolated protein sequence of the invention.
A substantially pure nucleotide sequence or a substantially pure protein sequence of the invention.
An assay for identifying a factor capable of affecting the pattern of expression of a nucleotide sequence of the invention or the activity of its expression product, wherein the nucleotide sequence or expression product ("EP") of the invention is exposed to said factor Determining whether the factor modulates the nucleotide sequence of the invention or its expression product (eg, affects the expression pattern or activity).
[0045]
Factors identified by the assay method of the present invention.
Factors identified by the assay method of the present invention that have not previously been known to have PDE modulation according to the present invention.
A method comprising the following steps: (a) performing the assay of the present invention, and (b) identifying one or more factors that affect the pattern of expression of the nucleotide sequence of the present invention or the activity of the expression product. And (c) preparing an amount of those one or more identified factors.
[0046]
A method comprising the following steps: (a) performing the assay of the present invention, and (b) identifying one or more factors that affect the pattern of expression of the nucleotide sequence of the present invention or the activity of the expression product. And (c) producing a pharmaceutical composition comprising one or more identified factors.
A method comprising the following steps: (a) performing the assay of the present invention, (b) identifying one or more factors that affect the pattern of expression of the nucleotide sequence of the present invention or the activity of its expression product, And (c) modifying one or more of the identified factors to cause a different effect on the expression pattern of the nucleotide sequence of the invention or the activity of its expression product.
Use of an agent identified by an assay of the present invention in the manufacture of a drug that affects the pattern of expression of the nucleotide sequence of the present invention or the activity of its expression product.
[0047]
Providing a target (eg, administering or exposing) an effective amount of an agent capable of modulating the pattern of expression of the nucleotide sequence of the invention or the activity of its expression product, said target comprising A method of treating a mammal, preferably a human.
A method of treating a target (which can be a mammal, preferably a human), comprising delivering (eg, administering or exposing) an effective amount of an agent identified by the assay of the present invention to the target .
A method of inducing an immunological response in a subject comprising administering to the subject a nucleotide sequence of the present invention or an expression product thereof.
[0048]
PDE _ XIV
As explained above, the present invention relates to a novel PDE enzyme—referred to as PDE_XIV—and the nucleotide sequence that encodes it. The invention also relates to the use of novel nucleic acid and amino acid sequences in the diagnosis and treatment of diseases. The present invention also relates to the use of novel nucleic acid and amino acid sequences to evaluate and / or screen for factors that can modulate phosphodiesterase activity. The invention further relates to genetically engineered host cells that comprise or express novel nucleic acid and amino acid sequences for evaluating and / or screening for agents that can modulate phosphodiesterase activity.
[0049]
As used herein, the term “PDE_XIV” refers to a new family of PDEs that have not been characterized to date.
As an example, the inventor has identified human PDE_XIV (sometimes referred to as HSPDE XIV). The inventor has also identified the mouse sequence -PDE_XIV (sometimes referred to as MMPDE XIV).
For convenience, references to PDE_XIV will encompass HSPDE XIV and / or MMPDE XIV unless otherwise specified.
 PDE_XIV exists in various sources and is believed to be obtainable from them.
[0050]
For example, PDE_XIV is the putamen, caudate nucleus of the brain, occipital lobe of the brain, heart, ovary, pituitary, kidney, liver, small intestine, thymus, skeletal muscle, leukocyte region, dorsal root ganglion, uterus, cochlea , Found in one or more of the small intestine (duodenum), astrocytoma, and appendix.
 We believe that PDE_XIV is also present in many other sources, such as rats, cows, sheep, pigs, and horses.
Preferably, the invention encompasses mammalian PDE_XIV, including but not limited to any of the aforementioned sources.
More preferably, the present invention includes human PDE_XIV.
[0051]
 PDE_XIV—in this respect—can be identical to the naturally occurring form, preferably PDE_XIV is a non-natural amino acid sequence (ie, it does not exist in its natural environment) or a mutation thereof A type, homologue, fragment or derivative. Additionally or alternatively, PDE_XIV is isolated PDE_XIV and / or purified PDE_XIV. PDE_XIV can be obtained from any suitable source, natural or otherwise, or can be produced, or it can be synthetic, semi-synthetic or recombinant.
[0052]
 The PDE_XIV coding sequence can be identical to the naturally occurring form-in this respect-preferably the PDE_XIV coding sequence is a non-natural amino acid sequence (ie it does not exist in its natural environment) Or a variant, homologue, fragment or derivative thereof. Additionally or alternatively, the PDE_XIV coding sequence is an isolated PDE_XIV coding sequence and / or a purified PDE_XIV coding sequence. The PDE_XIV coding sequence can be obtained from or produced in any suitable source, natural or otherwise, or it can be synthetic, semi-synthetic or recombinant.
[0053]
 PDE_XIV and / or its coding sequence and / or sequences capable of hybridizing thereto are useful for testing drug candidate selectivity between different peptides.
   PDE_XIV is thought to catalyze the conversion of cAMP to AMP.
Preferred aspects of the invention include recombinant PDE_XIV enzymes and recombinant nucleotide sequences encoding PDE_XIV enzymes.
Preferably, the recombinant PDE_XIV enzyme and / or recombinant nucleotide sequence of the present invention is a recombinant mammalian PDE_XIV enzyme and / or a recombinant mammalian nucleotide sequence.
[0054]
Preferably, the recombinant PDE_XIV enzyme and / or recombinant nucleotide sequence of the present invention is a recombinant human PDE_XIV enzyme and / or recombinant human nucleotide sequence.
According to the present invention, the recombinant PDE_XIV enzyme has at least the formula represented as Formula I.
[0055]
 Either or both of the nucleotide sequence encoding PDE_XIV or the enzyme PDE_XIV itself can be screened for factors that can affect PDE_XIV activity. In particular, the nucleotide sequence encoding PDE_XIV or PDE_XIV itself can be used to screen for factors that can inhibit PDE_XIV activity. In addition, nucleotide sequences encoding PDE_XIV or the enzyme PDE_XIV itself can be used to selectively affect PDE_XIV activity, eg, screen for factors that can selectively inhibit PDE_XIV activity. can do.
[0056]
Furthermore, nucleotide sequences encoding PDE_XIV or sequences complementary thereto can also be used in assays that detect the presence of PDE_XIV coding sequences in human cells. These assays will provide information regarding the tissue relevance of this enzyme and its biological relevance regarding specific disease states.
The invention also encompasses antibodies to PDE_XIV (including derivatives, fragments, homologues or variants thereof). Antibodies against PDE_XIV can be used in assays that detect the presence of PDE_XIV in human cells. These assays will provide information regarding the tissue relevance of this enzyme and its biological relevance regarding specific disease states.
[0057]
In particular, a nucleotide sequence encoding any one or more of the PDE_XIV isozymes, a nucleotide sequence that is complementary thereto, and an agent that selectively affects one of the isozymes It can be used in assays to screen. These assays will provide information on the tissue distribution of each isozyme and the biological relevance of each isozyme with respect to a particular disease state. These assays also allow testing and identification of factors that affect PDE_XIV expression or activity, eg, PDE_XIV expression or activity in a particular tissue or in a particular disease state.
[0058]
  Polypeptide of the present invention
The term “polypeptide” —which is interchangeable with the term “protein” —is a single-chain polypeptide molecule as well as a complex of multiple polypeptides, where individual constituent polypeptides are covalently bonded or non-conjugated. Which are linked by a covalent bond).
Preferably, the polypeptide of the present invention is a single chain polypeptide.
[0059]
The polypeptides of the present invention can be in a substantially isolated form. It will be appreciated that the polypeptide can be mixed with a carrier or dilution that does not interfere with the intended purpose of the polypeptide, and that the polypeptide can still be considered substantially isolated. The polypeptides of the present invention can also be in substantially purified form, in which case the polypeptide is greater than 90% of the polypeptide in the preparation, eg, 95%, 98% or 99 % Of the polypeptide in the preparation, wherein% is the polypeptide of the invention. The polypeptides of the present invention can be modified, for example, by the addition of histidine that facilitates the purification of the polypeptide, or by the addition of a signal sequence that promotes the polypeptide from the cell as described below.
[0060]
The polypeptides of the present invention can be produced by synthetic means (eg, as described in Geysen et al., 1996) or recombinantly as described below.
In preferred embodiments, when the native PDE_XIV of the present invention is present in its natural environment, and also in the natural environment, when the native PDE_XIV of the present invention is expressed by its nucleotide coding sequence, and The amino acid sequence of the present invention itself does not encompass the native PDE_XIV according to the invention when the nucleotide sequence is under the control of its native promoter, also present in the natural environment. For ease of reference, the inventors refer to this preferred embodiment as a “non-natural amino acid sequence”.
[0061]
The terms “mutant”, “homologue” or “fragment” with respect to the amino acid sequence for the enzyme of the present invention preferably refer to a biology that is at least similar to the enzyme shown in the list of attached sequences, so long as the resulting enzyme has PDE_XIV activity. Any substitution, variation, modification, replacement, deletion or addition of one (or more) amino acids from or relative to the sequence is included so long as it has a specific activity. In particular, the term “homologue” encompasses homology with respect to structure and / or function. With regard to sequence homology, there is preferably at least 75%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90% homology to the sequence shown as Formula I.
[0062]
More preferably, there is at least 95%, more preferably at least 98% homology to the sequence shown as Formula I. More preferably, there is at least 75%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90% homology to any one of the sequences shown in the attached sequence list. More preferably, there is at least 95%, more preferably at least 98% homology to any one of the sequences shown in the list of attached sequences.
[0063]
Typically, the type of amino acid substitution that can be made should maintain the hydrophobicity / hydrophilicity of the amino acid sequence. As long as the modified sequence retains the ability to act as a PDE enzyme according to the present invention, amino acid substitutions can be made, for example, 1, 2, or 3-10, 20 or 30 substitutions. Amino acid substitutions can include, for example, the use of non-naturally occurring analogs to increase the half-life of blood plasmids.
The amino acid sequence of the present invention can be produced by expression of the nucleotide sequence encoding it in an appropriate expression system.
[0064]
Additionally or alternatively, the protein itself can be produced using chemical methods of synthesizing PDE amino acid sequences in whole or in part. For example, peptides can be synthesized by solid phase technology, cleaved from the resin, and purified by preparative high performance liquid chromatography (see, eg, Creighton (1983) Proteins Structure And Molecular Principles, WH Freeman and Co. New York, NY). The composition of the synthetic peptide can be verified by amino acid analysis or sequencing (eg, Edman degradation).
[0065]
Direct peptide synthesis can be performed using a variety of solid phase techniques (Roberge JY et al. (1995) Science 269: 202-204) and automated synthesis can be performed, for example, using the handling provided by the manufacturer. This can be achieved using an ABI431A peptide synthesizer (Perkin Elmer) according to the instructions. In addition, the amino acid sequence of PDE, or any part thereof, may be altered during direct synthesis and / or combined with sequences from other subunits, or any part thereof, by chemical methods, Peptides can be produced.
[0066]
In other embodiments of the invention, the native, modified or recombinant sequence of the PDE can be linked to a heterologous sequence to encode a fusion protein. For example, to screen a library of peptides for inhibitors of PDE activity, it may be useful to encode a chimeric PDE protein that expresses a heterologous epitope recognized by a commercially available antibody. Alternatively, the fusion protein can be engineered to contain a cleavage site between the PDE sequence and the heterologous protein sequence, thus cleaving the PDE from the heterologous portion and purifying.
[0067]
Alternatively, PDE can be expressed as a recombinant protein to which one or more additional polypeptide domains have been added to facilitate protein purification. Such purification facilitating domains include, but are not limited to: metal chelated peptides, such as the histidine-tryptophan module (Porath J (1992) Protein, which allows purification on immobilized metal). Exp.Purif.3-.26328 1), a protein A domain that allows purification on immobilized immunoglobulins, and a domain utilized in the FLAGS extension / affinity purification system (Immunex Corp., Seattle, WA). Inclusion of a cleavable linker sequence between the purification domain and the PDE, such as Factor XA or enterokinase (Invitrogen, San Diego, Calif.), Is useful to facilitate purification. In a preferred aspect, the FLAG epitope tag is used to express the enzyme to facilitate isolation and purification of the expressed enzyme.
[0068]
 The specific amino acid sequence of PDE_XIV is shown as SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5. However, the present invention encodes other members from the PDE_XIV family comprising amino acid sequences having at least 60% identity (more preferably at least 75% identity) to any one of the amino acid sequences. The amino acid sequence is included. As shown, a general formula suitable for the PDE_XIV family according to the present invention is represented as Formula I.
[0069]
The polypeptides of the present invention also include the presented amino acid sequence fragments and variants thereof. Suitable fragments will be at least 5, eg, at least 10, 12, 15 or 20 amino acids in size.
The polypeptides of the present invention may also be modified to contain one or more (eg, at least 2, 3, 5 or 10) substitutions, including conserved substitutions. These aspects will be discussed in later sections.
[0070]
Nucleotide sequence of the present invention
The term “nucleotide sequence” as used herein means an oligonucleotide or polynucleotide sequence, and variants, homologues, fragments or derivatives thereof (eg, portions thereof). The nucleotide sequence can be DNA or RNA, can be of genomic or synthetic or recombination origin, and can be double stranded or single stranded, whether it is a sense or antisense strand Can do.
[0071]
Preferably, the term “nucleotide sequence” means DNA.
More preferably, the term “nucleotide sequence” means DNA produced using recombinant DNA technology (ie, recombinant DNA).
In a preferred embodiment, when the natural nucleotide coding sequence of the present invention is under the control of its natural promoter, which is also present in the natural environment, the amino acid sequence of the present invention itself is the book in its natural environment. It does not include the natural nucleotide coding sequence according to the invention. For ease of reference, the inventors refer to this preferred embodiment as a “non-natural nucleotide sequence”.
[0072]
The nucleotide sequences of the present invention can include within their scope synthetic or modified nucleotides. Many types of modifications to oligonucleotides are known in the art. These include methylphosphonate and phosphorothioate backbones, addition of acridine or polylysine chains at the 3 'and / or 5' ends of the molecule. For purposes of the present invention, the nucleotide sequences described herein can be modified by any method available in the art. Such modifications can be made to increase the in vivo activity or lifetime of the nucleotide sequences of the invention.
[0073]
The invention also encompasses nucleotide sequences that are complementary to the sequences presented herein, or any derivative, fragment or derivative thereof. If the sequence is complementary to the fragment, the sequence can be used as a probe to identify similar coding sequences in other organisms and elsewhere.
The invention also encompasses sequences that can hybridize to the sequences presented herein, or any derivative, fragment or derivative thereof.
[0074]
The present invention also encompasses sequences that can hybridize to sequences that are complementary to the sequences presented herein, or any derivative, fragment or derivative thereof.
The term “variant” also encompasses sequences that are capable of hybridizing to the nucleotide sequences presented herein.
Preferably, the term “mutant” refers to stringent conditions (eg, 55 ° C. and 0.5 × SSC {1 × SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 Na_ThreeCitrate pH 7.0}) includes sequences that are complementary to sequences that can hybridize to the nucleotide sequences presented herein.
[0075]
More preferably, the term “mutant” refers to high stringency conditions (eg, 65 ° C. and 0.1 × SSC {1 × SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 Na_ThreeCitrate pH 7.0}) includes sequences that are complementary to sequences that can hybridize to the nucleotide sequences presented herein.
The present invention also relates to nucleotide sequences that can hybridize to the nucleotide sequences of the present invention, including complementary sequences of those presented herein.
The present invention also relates to nucleotide sequences that are complementary to sequences that are capable of hybridizing to the nucleotide sequences of the present invention, including complementary sequences of those presented herein.
[0076]
Also included within the scope of the invention are polynucleotide sequences that can hybridize to the nucleotide sequences presented herein under intermediate to maximum stringent conditions.
In a preferred aspect, the present invention includes nucleotide sequences that can hybridize to the nucleotide sequence of the present invention, or its complement, under stringent conditions (eg, 55 ° C. and 0.2 × SSC). .
In a more preferred aspect, the present invention provides a nucleotide sequence capable of hybridizing to the nucleotide sequence of the present invention, or its complement, under high stringency conditions (eg, 65 ° C. and 0.1 × SSC). Include.
[0077]
A typical nucleic acid can be separately characterized as a nucleotide sequence that encodes a PDE_XIV protein and hybridizes to any one or more of the DNA sequences shown in the accompanying list of sequences. Such sequences encoding PDE_XIV that hybridize under high stringency conditions to any one of the sequences shown in the accompanying sequence list or their complements are preferred.
Conveniently, the present invention provides nucleic acid sequences that are capable of hybridizing under stringency conditions to the sequences shown in the accompanying list of sequences or any one fragment of their complement. Preferably, the fragment is 15-50 bases in length. Conveniently it is about 25 bases long.
[0078]
The term “mutant”, “homologue” or “fragment” with respect to a nucleotide sequence encoding a preferred enzyme of the present invention, as long as the resulting nucleotide sequence encodes or can encode an enzyme having PDE_XIV activity, Preferably one (or more) amino acid from or to the sequence so long as it has at least similar biological activity as the enzyme encoded by any one of the enzymes listed in the attached sequence listing Includes any substitutions, variations, modifications, replacements, deletions or additions. In particular, as long as the resulting nucleotide sequence encodes or can encode an enzyme having PDE_XIV activity, the term “homologue” encompasses homology with respect to structure and / or function.
[0079]
With regard to sequence homology, there is preferably at least 75%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90% homology to the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence shown as Formula I. More preferably, there is at least 95%, more preferably at least 98% homology to the nucleotide sequence encoding the sequence shown as Formula I. Preferably, with respect to sequence homologues, there is at least 75%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90% homology to any one of the sequences shown in the list of attached sequences. . More preferably, there is at least 95%, more preferably at least 98% homology to any one of the sequences shown in the list of attached sequences.
[0080]
As indicated, the present invention relates to a DNA sequence (preferably a cDNA sequence) encoding PDE_XIV. In particular, the present invention relates to a cDNA sequence encoding PDE_XIV.
The invention also relates to a DNA segment consisting of any one DNA sequence of the sequences shown in the attached sequence listing or an allelic variant of such a sequence.
The invention also relates to polypeptides produced by expression in a host cell into which the aforementioned DNA sequences or allelic variants thereof have been incorporated.
The present invention also relates to a DNA comprising any one of the sequences shown in the attached sequence listing, or an allelic variant thereof.
[0081]
The present invention also relates to non-natural DNA comprising any one DNA sequence of the sequences shown in the attached sequence listing, or an allelic variant thereof.
A highly preferred aspect of the present invention relates to recombinant DNA consisting of any one DNA sequence of the sequences shown in the attached sequence listing or an allelic variant thereof.
The polynucleotide of the present invention includes a nucleotide acid sequence encoding the polypeptide of the present invention. As will be appreciated, as a result of the degeneracy of the genetic code, a range of different polynucleotides encode a given amino acid sequence.
[0082]
With knowledge of the amino acid sequences described herein, it is possible to devise partial and full-length nucleic acid sequences encoding the polypeptides of the invention, eg, cDNA and / or genomic clones. For example, degenerate PCR using promoters designed to target sequences encoding the amino acid sequences presented herein can be used to obtain the polynucleotides of the invention. A promoter will typically contain multiple degenerate positions.
[0083]
However, in order to minimize degeneracy, a sequence is selected that encodes a region of the amino acid sequence presented herein that contains only one triplet-encoded amino acid, eg, methionine. Furthermore, the sequence will be selected in view of the use of codons in the microorganism in which the nucleic acid is used as a template DNA for the PCR method. PCR would be used under conditions of lower stringency than would be used for cloning a sequence with a single sequence (non-degenerate) primer against a known sequence.
[0084]
The nucleic acid sequence obtained by PCR and encoding the polypeptide fragment of the present invention can then be used according to hybridizing library technology to obtain larger sequences. For example, PCR clones can be labeled with radioactive atoms and used to screen cDNA or genomic libraries from other species, preferably other mammalian species. Hybridization conditions will typically be moderate to high stringency conditions (eg, 0.03 M sodium chloride and 0.03 M sodium citrate, about 50 ° C. to about 60 ° C.).
[0085]
Also, degenerate nucleic acid probes encoding all or part of the amino acid sequence can be used to probe cDNA and / or genomic libraries from other species, preferably other mammalian species. However, it is preferred to first perform a PCR technique to obtain a signal sequence for use in further screening procedures.
[0086]
According to the present invention, PDE_XIV, polypeptide fragments, fusion proteins or functional equivalents thereof can be used to generate recombinant DNA molecules that direct the expression of PDE_XIV in a suitable host cell. Because of the inherent degeneracy of the genetic code, PDE_XIV can be cloned and expressed using other DNA sequences that encode substantially identical or functionally equivalent amino acid sequences. As one skilled in the art will appreciate, it may be advantageous to generate a nucleotide sequence that encodes a PDE having a non-naturally occurring codon. Select codons preferred by a particular prokaryotic or eukaryotic host (Murray E et al. (1989) Nuc. Acids Res. 17: 477-508) to increase, for example, the expression of PDE_XIV or occur naturally Recombinant RNA transcripts with desirable properties, such as longer half-lives, can be produced than transcripts produced from sequences that do.
[0087]
The polynucleotide sequences of the present invention obtained using the aforementioned techniques can be used according to the aforementioned techniques to further obtain homologous sequences and variants. To express the polypeptides of the present invention in a variety of host cell systems, for example, to optimize codon adoption for the particular host cell in which the polynucleotide sequence is expressed, and also to homologous sequences thereof. And variants can be modified. Other sequence changes may be desirable to introduce restriction enzyme recognition sites or to alter the properties or functions of the polypeptide encoded by the polynucleotide.
[0088]
Modified PDE_XIV polynucleotide sequences that can be used in accordance with the present invention include deletions, insertions or substitutions of different nucleotide residues, resulting in polynucleotides encoding the same or functionally equivalent PDEs. Proteins can also have amino acid residue deletions, insertions or substitutions that produce silent changes and result in functionally equivalent PDEs. As long as the biological activity of the PDE is retained, deliberate amino acid substitutions can be made based on residue polarity, charge, stability, hydrophobicity, hydrophilicity, and / or amphiphilic similarity . For example, negatively charged amino acids include aspartic acid and glutamic acid; positively charged amino acids include lysine and arginine; and amino acids with uncharged polar heads and similar hydrophilicity values are: Includes leucine, isoleucine, valine, glycine, alanine, asparagine, glutamine, serine, threonine, phenylalanine, and tyrosine.
[0089]
PDE alleles are included within the scope of the present invention. As used herein, an “allele” or “allelic sequence” is one of many forms of PDE. Alleles arise from mutations, ie, changes in the nucleic acid sequence, and generally produce altered mRNAs or polypeptides, whose structure or function may or may not have been altered. Any given gene may have no allelic form or may have one or multiple allelic forms. Common mutational changes that give rise to alleles are generally attributed to amino acid deletions, additions or substitutions. Each of these types of changes may occur once or more than once in a given sequence, either alone or in combination with the others.
[0090]
The term “allele” also encompasses genetic polymorphisms, eg, SNPs (single nucleotide polymorphisms).
The nucleotide sequences of the present invention can be manipulated to alter the PDE coding sequence for a variety of reasons. Such reasons include, but are not limited to, alterations that modify the cloning, processing and / or expression of the gene product. For example, using techniques well known in the art, such as site-directed mutagenesis, to insert new restriction sites, alter glycosylation patterns, or change codon adoption, Mutations can be introduced.
[0091]
Using the polynucleotides of the invention, labeled with a revealing label by conventional means using primers, eg PCR primers, primers for alternative amplification reactions, probes, eg radioactive or non-radioactive labels Probes can be generated or polynucleotides can be cloned into vectors. Such primers, probes and other fragments are at least 15, preferably at least 20, such as at least 25, 30 or 40 nucleotides in length, and are also in accordance with the term nucleotide of the invention as used herein. Is included.
[0092]
The polynucleotide or promoter of the present invention can have a manifestation label. A suitable level is a radioisotope, for example,³²P or³⁵S, enzyme labels, or other protein labels such as biotin. Such a label can be added to and detected by the polynucleotide or primer of the present invention according to a technique known per se.
The polynucleotides according to the invention, for example DNA polynucleotides and primers, can be produced recombinantly, synthetically or by any means available to those skilled in the art. They can also be cloned by standard techniques.
[0093]
In general, primers will be produced by synthetic means, such synthetic means including stepwise production of the desired nucleic acid sequence one nucleotide at a time. Techniques that accomplish this using automated techniques are readily available in the field.
Longer polynucleotides will generally be produced by recombinant means, such as PCR (polymerase chain reaction) cloning techniques. This creates a pair of primers (eg, about 15-30 nucleotides) for a region of the nucleotide sequence to be cloned, contacting the primers with mRNA or cDNA obtained from a fungus, plant or prokaryotic cell, Performing a polymerase chain reaction under conditions that result in amplification of the desired region, isolating the amplified fragment (eg, by purifying the reaction mixture on an agarose gel) and recovering the amplified DNA. Including. Primers can be designed to contain appropriate restriction enzyme recognition sites so that the amplified DNA can be cloned into an appropriate cloning vector.
[0094]
DNA molecules can be modified to increase intracellular stability and half-life. Possible modifications include, but are not limited to, the addition of flanking sequences at the 5 ′ and / or 3 ′ ends of the molecule or the use of phosphorothioates or 2′O-methyl rather than phosphodiesterase linkages within the backbone of the molecule. .
As noted above, the present invention also relates to nucleotide sequences or their allelic variants that can hybridize to all or part of any one of the sequences shown in the accompanying sequence listing. These nucleotide sequences can be used in antisense technology to modify the expression of PDE_XIV. These sequences (or portions thereof) can also be used as probes, or when used as primers for polymerase chain reaction, can be used to modify all or a portion of such sequences.
[0095]
In addition to recombinant DNA sequences, genomic sequences also have utility in the context of drug discovery. Inhibiting mRNA transcription of a particular isoform may be more valuable than inhibiting its translated protein. If splice variants exist and these different splice variants can be transcribed from different promoters, this will be true when using PDE_XIV. There is a precedent for multiple promoters that direct the transcription of mouse brain 2 ', 3'-cyclic nucleotide 3' phosphodiesterase (Kurihala T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 170: 1074 [1990]).
[0096]
Another utility of the invention is that once a DNA sequence is known, it provides the information necessary to design an assay that specifically detects isozymes or splice variants. Isozyme-specific PCR primer pairs are the only examples of assays that rely entirely on knowledge of the specific DNA sequence of the isozyme or splice variant. Such assays allow for the detection of isozyme mRNA and can access the tissue distribution of each isozyme and its biological relevance to a particular disease state. This assay also allows the identification of cell lines that can naturally express only one isozyme—a discovery that eliminates the need to express recombinant genes. Where specific PDE_XIV isozymes are shown to be associated with a particular disease state, the present invention would be valuable in the design of diagnostic assays that detect isozyme mRNA.
[0097]
An abnormal level of nucleotide sequence encoding PDE_XIV in a biological sample will reflect a chromosomal abnormality, eg, a nucleic acid deletion or mutation. Thus, the nucleotide sequence encoding PDE_XIV provides a basis for probes that can be used diagnostically to detect chromosomal abnormalities in the gene encoding PDE, such as deletions, mutations or chromosomal translocations. The expression of the PDE_XIV gene may be altered in such disease states, or there may be chromosomal abnormalities present in the region of the gene encoding PDE_XIV.
[0098]
In another embodiment of the present invention, all or part of the coding sequence of PDE can be synthesized according to chemical methods well known in the art (Caruthers MH et al. (1980) Nuc. Acids Res. Symp Ser. 215-23, Horn T et al. (1980) Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 225-233).
  Exists naturally
As used herein, “naturally occurring” means PDE_XIV having an amino acid sequence found in nature.
[0099]
  Isolated / purified
As used herein, “isolated / purified” is a molecule, nucleic acid sequence or amino acid that has been removed from its natural environment and isolated or separated from at least one other component with which it is naturally associated. Means an array.
  Biological activity
As used herein, a “biological activity” is a structural function similar to (but not required to be) the same as naturally occurring PDE_XIV and / or a similar regulatory function (but not to the same extent). ), And / or PDE_XIV according to the invention having similar biochemical function (but not to the same extent) and / or immunological activity (but not to the same extent)-eg recombinant PDE_XIV -Means.
[0100]
  Immunological activity
As used herein, “immunological activity” refers to the ability of a natural, recombinant or synthetic PDE_XIV or oligopeptide thereof to induce a specific immune response and bind to a specific antibody in an appropriate animal or cell. Defined.
  Derivative
The term “derivative” as used herein with respect to amino acid sequence encompasses chemical modification of PDE_XIV. Such modifications would be replacement of hydrogen with alkyl, acyl or amino groups.
[0101]
  Deletion
As used herein, a “deletion” is defined as a change in a nucleotide or amino acid sequence that is free of one or more nucleotides or amino acid residues, respectively.
  Insert / Append
As used herein, an “insertion or addition” is a change in nucleotide or amino acid sequence that results in the addition of one or more nucleotides or amino acid residues, respectively, compared to a naturally occurring PDE.
[0102]
  Replace
As used herein, “substitution” results from the replacement of one or more nucleotides or amino acid sequences by different nucleotides or amino acids, respectively.
  Homologue
The term “homologue” relating to the nucleotide sequence of the invention and the amino acid sequence of the invention can be synonymous with allelic variants of the sequence.
[0103]
In particular, the term “homology” as used herein may be equal to the term “identity”. Here, the sequence homology of the nucleotide sequence of the present invention and the amino acid sequence of the present invention is determined by comparing the sequence or sequences of one or more sequences to other sequences by simple visual comparison (ie, strict comparison). It can be determined by knowing whether other sequences have 75% or more identity. The relative homology of sequences (ie, sequence identity) can also be determined by commercially available computer programs that can calculate% homology between two or more sequences. Such a computer program is CLUSTAL.
[0104]
% Homology can be calculated over adjacent sequences. That is, one sequence is aligned with another sequence, and each amino acid in one sequence is compared to the corresponding amino acid in the other sequence, one residue at a time. This is called “ungapped” alignment. Typically, such ungapped alignments are performed only over a relatively small number of residues (eg, less than 50 contiguous amino acids).
[0105]
This is a very simple and consistent method, but, for example, in the same pair of sequences, the next amino acid residue is excluded from the alignment by one insertion or deletion, thus making it comprehensive It does not take into account that a large reduction in% homology occurs when performing the alignment. Thus, most sequence comparison methods are designed to produce optimal alignments that take into account possible insertions and deletions without unduly penalizing the overall homology score. This is accomplished by trying to maximize local homology by inserting “gaps” in the sequence alignment.
[0106]
However, these more complex methods assign a “gap penalty” to each gap that occurs in the alignment, thus aligning sequences with as few gaps as possible for the same number of identical amino acids—between the two compared sequences. Reflect higher relevance-to achieve higher scores than those with multiple gaps. Typically, “closely related gap costs” are used. The cost of closely related gaps places a relatively high cost for the existence of the gap and a small penalty for each subsequent residue in the gap.
[0107]
This is the most commonly used gap scoring system. A high gap penalty will of course produce an optimized alignment with fewer gaps. Most alignment programs allow changing the gap penalty. However, it is preferred to use the default values when using such sequence comparison software. For example, when using the GCG Wisconsin Bestfit package (see below), the default gap penalty for amino acid sequences is -12 for gaps and -4 for each extension.
[0108]
Thus, the calculation of the maximum% homology first requires the generation of an optimal alignment that takes into account gap penalties. A suitable computer program for performing such alignment is the GCG Wisconsin Bestfit package (University of Wisconsin, U.S.A .; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12: 387). Examples of other software that can perform sequence comparisons include, but are not limited to: BLAST package (see Ausubel et al., 1999 ibid-Chapter 18,) FASTA (Atschul et al. , 1990, J. Mol. Biol. 403-410) and GENEWORKS suite of comparison tools. Both BLAST and FASTA are available for offline and online searching (see Ausubel et al., 1999 ibid, pp. 7-58 to 7-60). However, for certain applications it is preferred to use the GCG best fit program.
[0109]
Although the final% homology can be measured by identity, in some cases the alignment process itself is typically not based on a pairwise comparison. Instead, a similar score matrix with a scale is commonly used. This matrix assigns a score to each pairwise comparison based on chemical similarity or evolutionary distance. One example of such a commonly used matrix is the BLOSUM62 matrix-the default matrix for the BLAST suite of programs. In general, GCG Wisconsin programs use public default values or custom symbol comparison tables if supplied (see user manual for further details). It is preferred to use public default values for the GCG package, or in the case of other software, to use a default matrix, such as BLOSUM62.
[0110]
Once the software has produced an optimal alignment, it is possible to calculate% homology, preferably% sequence identity. The software typically does this as part of the sequence comparison and generates a numerical result.
As indicated, for certain applications, sequence homology (or identity) can be determined using any suitable homology alignment, eg, using default parameters. Conveniently, the BLAST algorithm is used with parameters set for default values. The BLAST algorithm is described in detail at http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_hel.html. The search parameters are defined as follows and are conveniently set to the defined default parameters.
[0111]
Conveniently, the “substantial homology” as assessed by BLAST is equal to a sequence that matches an EXPECT value of at least about 7, preferably at least about 9, and most preferably 10 or more. The default limit for EXPECT in a BLAST search is usually 10.
[0112]
  BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) is a heuristic search algorithm used by the programs blastp, blastn, tblastn, and tblastx; these programs are statistical methods of Karlin and Altschul (http: (See //www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_hel.html.). The BLAST program is created for sequence similarity searches, eg, to identify homologues to a questioned sequence. The program is not generally useful for searching for motif styles. For a discussion of basic publications in searching for similarity in sequence databases, see: Altschul et al. (1994) Nature Genetics 6: 119-129.
  The BLAST program available at http://www.ncbi.nlm.nih.gov performs the following tasks:
[0113]
  blastp compares amino acid query sequences against a protein sequence database;
  blastn compares nucleotide query sequences against a database of nucleotide sequences;
  blastx consists of a six-frame conceptual translation product of a nucleotide query sequence (both strands) against a protein sequence database;
  tblastn compares a protein's query sequence against a dynamically translated nucleotide sequence in all six reading frames (both strands);
[0114]
  tblastx compares the 6-frame translation of the nucleotide query sequence to the 6-frame translation of the nucleotide sequence database;
  BLAST uses the following search parameters:
  HISTOGRAM Displays a histogram of the scores for each search; the default is yes. (See parameter H in the BLAST manual).
  DESCRIPTIONS Limits the number of short descriptions of matching sequences reported for a specified number; the default limit is 100 descriptions. (See parameter V on the manual page). See also EXPECT and CUTOFF.
[0115]
  ALIGNMENTS Limits database sequences to the specified number for which high scoring segment pairs (HSPs) are reported; the default limit is 50. If more database sequences may meet the statistically significant limits for reporting (see EXPECT and CUTOFF below), report only the maximum statistical meaning to which the match belongs. (See parameter B in the BLAST manual).
[0116]
  A statistically significant limit value that reports matches to sequences in the EXPECT database; according to the probability model of Karlin and Altschul (1990), the default value is 10 and thus 10 matches are expected to be found by chance. . If the statistical meaning attributed to a mate is greater than the EXPECT limit, no match is reported. Lower EXPECT limits are more stringent and fewer chance matches will be reported. (See parameter E in the BLAST manual).
[0117]
  CUTOFF Cut-off score that reports high scoring segment pairs. The default value is calculated from the EXPECT value (see above). HSPs are reported for database sequences only if the statistical meaning attributed to the HSPs is at least high enough to be attributed to a single HSP with a score equal to the CUTOFF value. Higher CUTOFF values are more stringent and fewer chance matches will be reported. (See parameter S in the BLAST manual). Typically, EXPECT can be used to manage semantic limits more intuitively.
[0118]
  Identify different scoring matrices for MATRIX BLASTP, BLASTX, TBLASTN and TBLASTX. The default matrix is BLOSUM62 (Henikoff & Henikoff, 1992). Other valid choices include: PAM40, PAM120, PAM250 and IDENTITY. Another scoring matrix is not available for BLASTN; identifying a missing MATRIX in BLASTN reverts to an error response.
  Restrict the TBLASTN search to just the top or bottom strand of the sequence in the STRAND database; or restrict the BLASTN, BLASTX or TBLASTX search to the reading frame just above or below the query sequence.
[0119]
  FILTER Wootton & Federhen (1993) Computers and Chemistry 17: 149-163 to mask segments of questionable sequences with low composition complexity or Claverie & States (1993) Computers and Chemistry 17 : Determination of Tatusov and Lipman's DUST program (see http://www.ncbi.nlm.nih.gov) by XNU program of: 191-201 or for BLASTN to mask segments consisting of short period internal repeats To do. Filtering is statistically significant, but eliminates biologically insignificant reports from blasting output (eg hits against normal acidic, basic or proline rich regions) and specific matches to database sequences Leaving more biologically important areas of questionable sequences useful.
[0120]
The low complexity sequences found by the filter program are replaced with the letter “N” in the nucleotide sequence (eg “NNNNNNNNNNNNN”) and the letter “X” in the protein (eg “XXXXXXXXX )).
Filtering is applied only to the query sequence (or its translation product) and not to the database sequence.
[0121]
  When applied to an array in SWISS-PROT, it should not be an experiment that filtering always has an effect because it is not unusual that it is not masked at all by SEG, XNU, or both. In addition, in some cases, sequences are masked in their entirety, indicating that if there are reported matches for unfiltered interrogative sequences, the statistical meaning of those matches should be questioned.
  NCBI-gi displays the NCBIgi identifier in the output in addition to the name of the access and / or locus.
Most preferably, the sequence comparison is performed using a simple BLAST search algorithm provided at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.
Gap penalties should be used when identifying sequences, preferably using the following parameters:
[0122]
[Table 2]

[0123]
Other computer programs that determine identity and similarity between two sequences are the GCG program package (Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12: 387) and FASTA (Atschul et al., 1990, J. Molec. Biol. 403-410).
[0124]
  Variants and derivatives of polypeptides
The terms “mutant” and “derivative” with respect to the amino acid sequences of the present invention are as long as the resulting amino acid sequence has PDE activity, preferably at least the same activity as any one of the polypeptides represented in the sequence listing. Includes any substitution, variation, modification, replacement, deletion or addition of one (or more) amino acids once or to the sequence.
[0125]
The sequences of the present invention can be modified for use in the present invention. Typically, modifications are made to maintain the PDE activity of the sequence. Amino acid substitutions can be, for example, 1, 2, or 3-10, 20 or 30 substitutions as long as the modified sequence retains PDE activity. Amino acid sequence substitutions include, for example, the use of non-naturally occurring analogs to increase the plasma half-life of therapeutically administered polypeptides.
Conservative substitution can be performed, for example, according to the following table. Amino acids in the same block in the second row, preferably in the same line in the third row, can be substituted for each other:
[0126]
[Table 3]

[0127]
As indicated above, the proteins of the invention are typically produced by recombinant means, eg as described herein, and / or techniques well known to those skilled in the art, eg solid phase synthesis. Produced by synthetic means. Such sequence variants and derivatives include fusion proteins, wherein the fusion protein consists of at least the amino acid sequence of the invention linked (directly or indirectly) to other amino acid sequences.
[0128]
These other amino acid sequences—these are sometimes referred to as fusion protein partners—typically confer suitable functionality—for example, to facilitate the extraction and purification of the amino acid sequences of the present invention. Fusion protein partners include glutathione-S-transferase (GST), 6 × His, GAL4 (DNA binding domain and / or transcriptional activation domain) and β-galactosidase. It may also be advantageous to allow for the removal of the latter by including a proteolytic cleavage site between the fusion protein partner and the protein sequence of the invention. Preferably, the fusion protein partner does not interfere with the function of the protein of the invention.
[0129]
  Polynucleotide variants and derivatives
The terms “mutant” and “derivative” with respect to the nucleotide sequences of the present invention are polymorphs in which the resulting nucleotide sequence has PDE activity, preferably at least the same activity as any one of the sequences represented in the sequence listing. Any substitution, variation, modification, substitution, deletion or addition of one (or more) nucleic acid from or to the sequence is included so long as it encodes a peptide.
[0130]
As indicated above, with respect to sequence homology, there is preferably at least 75%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90% homology to the sequences shown in the sequence listing herein. . More preferably there is at least 95% homology, more preferably at least 98%. Comparison of nucleotide homologies can be performed as described above. For some applications, the preferred sequence comparison program is the aforementioned GCG Wisconsin Bestfit. The default scoring matrix has a match value of 10 for each identical nucleotide and -9 for each mismatch. For each nucleotide, the default gap creation penalty is -50 and the default gap extension penalty is -3.
[0131]
As used herein, the terms “variant”, “homology”, “fragment” and “derivative” encompass allelic variants of the sequence.
The term “variant” also encompasses sequences that are complementary to sequences that are capable of hybridizing to the nucleotide sequences displayed herein.
[0132]
  Hybridize
As used herein, the term “hybridization” refers to “a method of joining a strand of nucleic acid to a complementary strand through base pairing” (Coombs J (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York, NY) and Dieffenbach CW. And GS Dveksler (1995, PCR Primer, a Labotatory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY) will include amplification methods such as those performed in the polymerase chain reaction technique.
[0133]
Hybridization conditions are at the melting point (Tm) of the nucleic acid binding complex as taught by Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego, Calif.). "Stringency" defined as described below and as described below.
[0134]
Hybridization stringency refers to conditions under which polynucleic acid hybrids are stable. Such conditions will be apparent to those skilled in the art. As is known to those skilled in the art, the stability of the hybrid is reflected in the melting point (Tm) of the hybrid, where the melting point (Tm) is approximately 1-1.5 ° C for every 1% reduction in sequence homology. Only drops. In general, hybrid stability is a function of sodium ion and temperature. Typically, the hybridization reaction is performed under conditions of higher stringency and subsequent stringency wash. As used herein, high stringency is 1M Na.⁺In particular, it means conditions that allow hybridization of only nucleic acid sequences that stably form hybrids at 65 to 68 ° C.
[0135]
Maximum stringency typically occurs at about Tm-5 ° C (5 ° C below the Tm of the probe).
High stringency occurs at temperatures about 5 ° C. to 10 ° C. below the Tm of the probe. High stringency conditions include, for example, 6 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 1% SDS (sodium dodecyl sulfate), 0.1 Na + pyrophosphate and 0.1 mg / ml denatured salmon sperm as non-specific competitors. Provided by hybridization in an aqueous solution containing DNA. After hybridization, high stringency washing can be performed in several steps, with the final wash (about 30 minutes) hybridized in 0.2-0.1 × SSC, 0.1% SDS. It can be carried out at temperature.
[0136]
Moderate or intermediate stringency typically occurs at temperatures about 10-20 ° C. below the Tm of the probe.
Low stringency typically occurs at temperatures about 20-25 ° C. below the Tm of the probe.
As those skilled in the art will appreciate, maximal stringency hybridization can be used to identify or detect identical polynucleotide sequences, but intermediate (low) stringency hybridization can be used. Similar or related polynucleotide sequences can be identified or detected.
[0137]
Moderate stringency refers to conditions equivalent to hybridization at about 60-62 ° C., but in the aforementioned solution. In that case, the final wash is performed at the hybridization temperature in 1 × SSC, 0.1% SDS.
Low stringency means conditions equivalent to hybridization at about 50-52 ° C. in the aforementioned solution. In that case, the final wash is performed at 2 × SSC, 0.1% SDS at the hybridization temperature.
For certain applications, it may be useful to identify similar enzyme coding sequences from different organisms using low to moderate stringency conditions.
[0138]
As will be appreciated, these conditions can be adapted and duplicated using various buffers, eg, formamide based buffers, and temperature. Denhardt's solution and SSC and other suitable hybridization buffers are well known to those skilled in the art (see, eg, the following literature: edited by Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York or Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.). Since probe length and GC content also play a role, optimal hybridization conditions must be determined experimentally.
[0139]
A polynucleotide of the invention that is capable of hybridizing to the nucleotide sequence displayed herein is at least 20, preferably at least 25 or 30, relative to the corresponding nucleotide sequence displayed herein, for example It will generally have at least 70%, preferably at least 80 or 90%, more preferably at least 95% or 98% homology over a region of at least 40, 60 or 100 or more adjacent nucleotides.
[0140]
The term “selectively hybridizable” uses a polynucleotide to be used as a probe under conditions where the target polynucleotide of the invention has been found to hybridize to the probe at a level significantly above background. It means to do. Background hybridization may occur because other polynucleotides are present, for example, in the library of cDNA or genomic DNA to be screened. In this case, background refers to the level of signal generated by the interaction between the probe and the non-specific DNA member of the library, and this interaction is the specific interaction observed using the target DNA. The strength is 10 times that of the action, preferably less than 100 times. The strength of the present invention is, for example, a probe, for example,³²It can be measured by radiolabeling with P.
[0141]
In a preferred aspect, the present invention provides stringent conditions (eg, 60 ° C. and 0.2 × SSC {1 × SSC = 0,15M NaCl, 0.015 M Na_ThreeCitrate pH 7.0}) including any nucleotide sequence that can hybridize to any one or more of the nucleotide sequences of the present invention.
In a more preferred aspect, the present invention provides stringent conditions (eg, 65 ° C. and 0.1 × SSC {1 × SSC = 0,15 M NaCl, 0.015 M Na_ThreeCitrate pH 7.0}) including any nucleotide sequence that can hybridize to any one or more of the nucleotide sequences of the present invention.
[0142]
When the polynucleotide of the present invention is double-stranded, both strands of the double-stranded are included in the present invention individually or in combination. If the polynucleotide of the invention is single stranded, the complementary sequence of the polynucleotide is also included within the scope of the invention.
Polynucleotides that are not 100% homologous to the sequences of the invention but fall within the scope of the invention can be obtained in a number of ways. Various other sequences described herein can be obtained, for example, by probing DNA libraries made from a range of individuals, eg, individuals from different populations.
[0143]
In addition, homologs of other viruses / bacteria, or cell homologs, particularly those found in mammalian cells (eg, rat, bovine and primate cells) can be obtained and such homology The bodies and their fragments will generally be capable of selectively hybridizing to the sequences shown in the sequences listed herein. Such sequences can be probed with cDNA libraries or genomic DNA libraries from other animal species, and live using such probes using any one of the sequences in the attached list of sequences. Can be obtained by probing the rally under moderate to high stringency conditions. Similar considerations apply to species homology and allelic variants of the polypeptide or nucleotide sequences of the invention.
[0144]
Variants and strain / species homologues can also be obtained using degenerate PCR. Degenerate PCR uses primers designed to target variants or homologous sequences that encode conserved amino acid sequences within the sequences of the invention. Conserved sequences can be predicted, for example, by aligning amino acid sequences from selective variants / homologs. Sequence alignment can be performed using computer software known in the art. For example, the GCG Wisconsin PileUp program is widely used.
[0145]
Primers used in degenerate PCR contain one or more degenerate positions and are used at conditions of lower stringency than are used for cloning sequences using single sequence primers against known sequences Will be done.
Alternatively, such polynucleotides can be obtained by site-directed mutagenesis of the characterized sequence. This may be useful, for example, when silent codon changes are required for the sequence to optimize codon adoption for the particular host cell in which the polynucleotide sequence is expressed. is there. Other sequence changes may be required to introduce restriction enzyme recognition sites or to alter the nature or function of the polypeptide encoded by the polynucleotide.
[0146]
Using the polynucleotides of the present invention, primers, eg, PCR primers, primers for alternative amplification reactions, probes, eg, probes labeled with a manifestation label by conventional means using radioactive or non-radioactive labels Or the polynucleotide can be cloned into a vector. Such a primer, probe or other fragment is at least 15, preferably at least 20, such as at least 25, 30 or 40 nucleotides in length and is also referred to as a polynucleotide of the invention as used herein. Included by term.
[0147]
The polynucleotides according to the invention, for example DNA polynucleotides and probes, can be produced recombinantly, synthetically or by any means available to those skilled in the art. They can also be cloned by standard techniques.
In general, primers will be produced by synthetic means, such synthetic means including stepwise production of the desired nucleic acid sequence one nucleotide at a time. Techniques that accomplish this using automated techniques are readily available in the field.
[0148]
Longer polynucleotides will generally be produced by recombinant means, such as PCR (polymerase chain reaction) cloning techniques. This creates a pair of primers (eg, about 15-30 nucleotides) flanking the region of the lipid targeting sequence to be cloned, contacting the primers with mRNA or cDNA obtained from an animal or human cell, Performing a polymerase chain reaction under conditions that result in amplification of the desired region, isolating the amplified fragment (eg, by purifying the reaction mixture on an agarose gel) and recovering the amplified DNA. Including. Primers can be designed to contain appropriate restriction enzyme recognition sites so that the amplified DNA can be cloned into an appropriate cloning vector.
[0149]
  Regulatory sequences
Preferably, a coding sequence is operably linked to a regulatory sequence that can be expressed, for example, by a selected host cell. As an example, the present invention. It includes a vector comprising a polynucleotide of the invention operably linked to such a regulatory sequence, ie, the vector is an expression vector.
[0150]
The term “operably linked” means a side-by-side position where the components described are in a relationship that allows them to function in their intended manner. A regulatory sequence “operably linked” is ligated to the coding sequence so that expression of the coding sequence is achieved under conditions compatible with the control sequences.
The term “regulatory sequence” includes promoters and enhancers as well as other expression control signals.
The term “promoter” is used in the standard sense in the art, eg, an RNA polymerase binding site.
[0151]
Enhanced expression of a polynucleotide encoding a polypeptide of the invention also increases the expression of the protein of interest from the selected expression host and, if desired, the level of secretion, and / or the polypeptide of the invention Can be achieved by selection of heterologous regulatory regions, such as promoters, secretory leaders and terminator regions, which serve to provide inducible control of the expression of.
Preferably, the nucleotide sequence of the present invention can be operably linked to at least two promoters.
[0152]
Apart from promoters that are native to the genes encoding the polypeptides of the invention, other promoters can be used to direct the expression of the polypeptides of the invention. A promoter can be selected for its efficacy in directing the expression of a polypeptide of the invention in the desired expression host.
In other embodiments, a constitutive promoter can be selected to direct expression of a desired polypeptide of the invention. Such expression constructs provide additional advantages because they avoid the need to culture the expression host on a medium containing the induction substrate.
[0153]
Examples of strong constitutive and / or inducible promoters preferred for use in fungal expression hosts include xylanase (xlnA), phytase, ATP synthase, subunit 9 (oliC), triose phosphate isomerase (tpi), Obtained from fungal genes of alcohol dehydrogenase (AldhA), α-amylase (amy), amyloglucosidase (from AG-glaA gene), acetamidase (amdS) and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gpd) promoter It is something that can be done.
[0154]
Examples of strong yeast promoters are those that can be obtained from the genes for alcohol dehydrogenase, lactase, 3-phosphoglycerate kinase and triose phosphate isomerase.
Examples of strong bacterial promoters are the α-amylase and SP02 promoters and promoters from extracellular protease genes.
Hybrid promoters can also be used to improve inducible regulation of expression constructs.
[0155]
A promoter can further include features that enhance or increase expression in a suitable host. For example, the feature can be a conserved area, such as a Pribnow Box or a TATA box. A promoter can even contain other sequences that affect (eg, maintain, enhance, decrease) the expression level of the nucleotide sequences of the invention. For example, suitable other sequences include Sh1-intron or ADH intron. Other sequences include inducible factors-such as temperature, chemical, light or stress inducible factors. There may also be suitable factors that enhance transcription or translation. An example of the latter factor is the TMV 5 'signal sequence (see Sleat Gene 217 [1987] 217-225; and Dawson, Plant Mol. Biol. 23 [1993] 97).
[0156]
  secretion
Often, it is desirable that the polypeptide of the present invention be secreted from the expression host into the medium, from which the polypeptide of the present invention can be most easily recovered. According to the present invention, the secretory leader sequence can be selected based on the desired expression host. Hybrid signal sequences can also be used in the context of the present invention.
Typical examples of heterologous secretory leader sequences are the fungal amyloglucosidase (AG) gene (glaA—for example, 18 and 24 amino acid versions from Aspergillus), the a-factor gene (yeast, for example Saccharomyces) (Saccharomyces) and Kluyveromyces) or α-amylase (Bacillus).
[0157]
  Construct
The term “construct” —which is synonymous with terms such as “complex”, “cassette” and “hybrid” —includes a nucleotide sequence directly or indirectly linked to a promoter. An example of indirect binding is the provision of a suitable spacer group, such as an intron sequence, such as a Sh1-intron and an ADH intron, between the promoter and the nucleotide sequence of the present invention. The same is true for the term “fusion” in relation to the present invention, which includes direct or indirect binding. In each case, the term does not encompass a natural combination of nucleotide sequences that normally encode proteins associated with the promoter of a wild type gene, and does not include when both of them are present in the natural environment.
[0158]
The construct contains a marker that allows selection of the genetic construct in, for example, a bacterium, preferably a bacterium of the genus Bacillus, such as Bacillus subtilis, or a plant into which it has been transformed. Or even express. There are a variety of markers that can be used, such as those encoding mannose-6-phosphate isomerase (especially for plants) or antibiotic resistance such as resistance to G418, hygromycin, bleomycin, kanamycin and gentamicin There are markers that provide
Preferably, the construct of the present invention consists at least of the nucleotide sequence of the present invention operably linked to a primer.
[0159]
  vector
The term “vector” includes expression vectors and transformation vectors and shuttle vectors.
The term “expression vector” means a construct capable of in vivo or in vitro expression.
[0160]
The term “transformation vector” refers to a construct that can transfer from one entity to another—the other entity can be the same or a different species. If the construct can be transferred from one entity to another—for example, from an E. coli plasmid to a bacterium, such as the genus Bacillus, the transformation vector is sometimes referred to as a “shuttle vector”. Called. It is a construct that can be transferred from E. coli plasmids to Agrobacterium and even to plants.
[0161]
As will be described later, the vector of the present invention can be transformed into an appropriate host cell to express the polypeptide of the present invention. Accordingly, in a further aspect, the present invention cultivates and expresses host cells transformed or transfected with the aforementioned expression vector under conditions that provide for expression of the coding sequence encoding the polypeptide by the vector. A method for producing the polypeptide of the present invention, comprising recovering the produced polypeptide.
[0162]
The vector can be, for example, a plasmid having an origin of replication, a viral or phage vector, optionally a promoter for expression of the polynucleotide and optionally a promoter regulator.
The vectors of the present invention can contain one or more selectable marker genes. The most suitable selection system for industrial microorganisms is that formed by a group of selectable markers that do not require mutation in the host organism. Examples of fungal selectable markers are the genes for acetamidase (amdS), ATP synthase, subunit 9 (oliC), orotidine-5'-phosphate-decarboxylase (pvrA), phleomycin and benomyl resistance (benA). Examples of non-fungal selectable markers are the bacterial G418 resistance gene (which can also be used in yeast but not in filamentous fungi), ampicillin resistance gene (E. coli), neomycin resistance gene (Bacillus) and E. coli ( E. coli) encodes the uidA gene, β-galactosidase (GUS).
[0163]
Vectors can be used in vitro, for example, for the production of RNA, or can be used to transfect or transform host cells.
Thus, the polynucleotides of the invention can be incorporated into recombinant vectors (typically replicable vectors), such as cloning or expression vectors. Vectors can be used for replication of nucleic acids in compatible host cells. Thus, in a further aspect, the present invention introduces the polynucleotide of the present invention into a replicable vector, introduces the vector into a compatible host cell, and under conditions that cause replication of the vector. A method for producing a polynucleotide of the present invention by growing a cell is provided. The vector can be recovered from the host cell. Suitable host cells are described below in connection with expression vectors.
[0164]
The invention also relates to a gene that expresses PDE_XIV or a variant, homologue, fragment or derivative thereof in a screening method for identifying inhibitors and antagonists of PDE_XIV that modulate phosphodiesterase activity and thereby modulate the nucleotide level of the cycle. It relates to the use of engineered host cells. Such genetically engineered host cells can be used to screen for peptide libraries or organic molecules that can modulate PDE_XIV activity. Antagonists and inhibitors of PDE_XIV, such as antibodies, peptides or small organic molecules, will provide the basis for pharmaceutical compositions for the treatment of diseases associated with, for example, PDE_XIV. Such inhibitors or antagonists can be administered alone or in combination with therapies for the treatment of such diseases.
[0165]
The present invention also relates to PDE_XIV or a variant, homologue, fragment or fragment thereof for in vivo or in vitro production of PDE_XIV protein or for screening for factors that can affect the expression or activity of PDE_XIV. The present invention relates to an expression vector comprising a polynucleotide sequence encoding a derivative and a host cell.
[0166]
  Organization
The term “tissue” as used herein encompasses the tissue itself or an organ.
  Host cell
The term “host cell” in the context of the present invention encompasses any cell that can consist of a nucleotide sequence encoding a recombinant protein according to the present invention and / or a product derived therefrom, wherein the promoter is a host cell. When present in, allows expression of the nucleotide sequence according to the present invention.
[0167]
Accordingly, a further aspect of the present invention provides a host cell transformed or transfected with a polynucleotide of the present invention. Preferably, the polynucleotide is carried in a virus for replication and expression of the polynucleotide. The cells are selected to be compatible with the vector and can be, for example, prokaryotic (eg, bacteria), fungi, yeast or plant cells.
The gram negative bacterium E. coli is widely used as a host for the expression of heterologous genes. However, large amounts of heterologous proteins tend to accumulate inside the cell. Subsequent purification of the desired protein from large amounts of E. coli intracellular protein can sometimes be difficult.
[0168]
In contrast to E. coli, bacteria from the genus Bacillus are very suitable as heterologous hosts because of their ability to secrete proteins into the medium. Other bacteria suitable as hosts are from the genera Streptomyces and Pseudomonas.
Depending on the nature of the polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention and / or the desirability of further processing of the expressed protein, eukaryotic hosts such as yeast or other fungi may be preferred. In general, yeast cells are preferred over fungal cells because they are easy to manipulate. However, some proteins are less secreted from yeast cells or in some cases are not processed properly (eg, hyperglycosylation in yeast). In these cases, different fungal host microorganisms should be selected.
[0169]
Examples of suitable expression hosts falling within the scope of the present invention are fungi such as Aspergillus species (eg those described in EP-A-0184438 and EP-A-0284603) and Trichoderma ( Trichoderma species; bacteria, eg, Bacillus species (eg, those described in EP-A-0134048 and EP-A-0253455), Streptomyces species and Pseudomonas species And yeasts such as Kluyveromyces species (for example those described in EP-A-0096430 and EP-A-0301670) and Saccharomyces species.
[0170]
As an example, typical expression hosts are Aspergillus niger, Aspergillus niger var. Tubigenis, Aspergillus niger var.awamori, Aspergillus aculeatus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger -Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesie, B. subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amylofacilis , Kluyveromyces lactis and Saccharomyces cerevisiae.
[0171]
The use of suitable host cells--for example, yeast, fungal and plant host cells--can be post-translational as may be necessary to confer optimal biological activity on the recombinant expression products of the invention. Modifications (eg, myristoylation, glycosylation, truncation, rapidization and tyrosine, serine or threonine phosphorylation) are possible.
[0172]
  Creature
The term “organism” in the context of the present invention encompasses any organism, which can consist of a nucleotide sequence encoding a recombinant protein according to the present invention and / or a product obtained therefrom, wherein the promoter is a plant When present in, it may be possible to express the expression of the nucleotide sequence according to the invention. Examples of organisms can include fungi, yeasts or plants.
[0173]
The term “transgenic organism” in relation to the present invention encompasses any organism consisting of a nucleotide sequence encoding a protein according to the present invention and / or a product obtained therefrom, wherein the promoter is a nucleotide sequence according to the present invention within the organism. Expression may be possible. Preferably, the nucleotide sequence is integrated into the genome of the organism.
[0174]
The term “transgenic organism” refers to a native nucleotide according to the invention that is present in the natural environment when the coding sequence of the natural nucleotide according to the invention is under the control of a natural promoter that is also present in the natural environment. It does not include the nucleotide coding sequence. Furthermore, the present invention relates to a natural protein according to the present invention when present in the natural environment and also when expressed by the coding sequence of a natural nucleotide present in the natural environment and Natural proteins according to the present invention are not included when under the control of the native promoter present in the environment.
[0175]
Accordingly, the transgenic organism of the present invention comprises any one or combination of nucleotide sequences encoding the amino acid sequence according to the present invention, a construct according to the present invention (including combinations thereof), a vector according to the present invention, It includes an organism comprising a plasmid according to the invention, a cell according to the invention, a tissue according to the invention or a product thereof. A transformed cell or organism can produce an acceptable amount of the desired compound that can be readily removed from the cell or organism.
The invention also encompasses organisms that have been modified to express increased amounts of enzyme.
[0176]
  Animal model of attenuation / knockout
The invention also encompasses organisms that have been modified such that enzymatic activity is attenuated or eliminated. An example of such an embodiment is the rate of knockout or mouse in which the native coding sequence has been removed and replaced, for example, with a reporter gene, eg, β-gal. Alternatively, the promoter can be silenced so that gene expression does not occur. These types of organisms can be produced using standard techniques.
[0177]
  Transformation of host cell / host organism
As indicated previously, the host organism can be prokaryotic or eukaryotic. Examples of suitable prokaryotic hosts include E. coli and Bacillus subtilis. Teachings of prokaryotic transformation are well documented in this field, see for example: Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, and Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology (1985), John Wiley & Sons, Inc.
[0178]
When using prokaryotic hosts, it is necessary to appropriately modify the nucleotide sequence prior to transformation, for example, by removal of introns.
In other embodiments, the transgenic organism can be a yeast. In this regard, yeast has also been widely used as a vehicle for the expression of heterologous genes. Saccharomyces cerevisiae species have a long history of industrial use, including use for the expression of heterologous genes. The expression of zero genes in Saccharomyces cerevisiae is reviewed in the following literature: Goodey et al., 1987, Yeast Biotechnology, DR Berry et al., Ed., Pp. 401-429, Allen and Unwin, London, and King et al., 1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, EF Walton and GT Yarronton, pp. 107-133, Balckie, Galsgow.
[0179]
For several reasons, Saccharomyces cerevisiae is well suited for gene expression. First, it is non-pathogenic to humans and cannot produce certain endotoxins. Second, it has a history of being used safely in commercial applications for centuries for various purposes. This led to wide public acceptance. Third, extensive commercial use and research directed at organisms has resulted in extensive fermentations that are characterized by a wealth of genetics and physiology knowledge and characteristics of Saccharomyces cerevisiae.
[0180]
The principle of heterologous gene expression in Saccharomyces cerevisiae is reviewed in the following literature: E Hinchcliffe E Kenny, 1993, “Yeast as vehicle for the expresson of heterologous genes”, Yeasts, Vol. 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, ed., 2nd edition, Academic Press Ltd.
Several types of yeast vectors are available, including integration vectors that require recombination with the host genome for maintenance, and autonomously replicating vectors.
[0181]
In order to prepare transgenic Saccharomyces, an expression construct is prepared by inserting the nucleotide sequence of the present invention into the content designed for expression in yeast. Several types of constructs that have been used for heterologous expression have been developed. The construct contains a promoter active in yeast fused to the nucleotide sequence of the present invention, and usually a promoter from yeast, such as the GAL1 promoter, is used. Usually, a signal sequence derived from yeast, for example, a sequence encoding a SUC2 signal peptide is used. Terminators active in yeast end in the expression system.
[0182]
Several transformation protocols have been developed for yeast transformation. For example, transgenic Saccharomyces according to the present invention can be prepared according to the teachings of the following literature: Hinnnen et al., 1978, Proceeding of the National Academy of Science of the USA 75,1929; Beggs, JD, 1978, Nature, London, 275, 104; and Ito, H et al., 1983, J. Bacteriology 153, 163-168.
Transformed yeast cells are selected using various selectable markers. There are a number of auxotrophic markers such as LEU2, HIS4 and TRP1, and dominant antibiotic resistance markers such as aminoglycosides, antibiotic markers such as G418 as markers used for transformation.
[0183]
Another host organism is a plant. The basic principle in the construction of genetically modified plants is to insert genetic information into the plant genome to obtain stable maintenance of the inserted genetic material.
There are several techniques for inserting genetic information, and two main principles are the direct introduction of genetic information and the introduction of genetic information by a vector system. Genetic techniques are reviewed in the following literature: Potrykus, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. (1991) 42: 205-225, and Christou, Argo-Food-Industry Hi-Tech. March / April 1994, 17-27. Further teachings on plant transformation are described in EP-A-0449375.
[0184]
Accordingly, the present invention also provides a method of transforming a host cell with a nucleotide sequence shown as any one of the sequences shown in the attached sequence listing or a derivative, homologue, variant or fragment thereof.
Host cells transformed with a coding sequence for PDE nucleotides can be cultured under conditions suitable for the expression and recovery of the encoded protein from cell culture. Depending on the sequence and / or vector used, the protein produced by the recombinant cell may be secreted or contained within the cell. As will be appreciated by those skilled in the art, an expression vector containing a PDE coding sequence can be designed using a signal sequence that directs secretion of the PDE coding sequence through the membrane of a particular prokaryotic or eukaryotic cell. Other recombinant constructs can link the PDE coding sequence to a nucleotide sequence encoding a polypeptide domain that facilitates purification of soluble proteins (Kroll DJ et al. (1993) DNA Cell Biol. 12: 441- 53, see also the discussion of vectors containing fusion proteins).
[0185]
Production of polypeptides
According to the present invention, the production of the polypeptide of the present invention is carried out, for example, by culturing an expression host of a microorganism transformed with one or more polynucleotides of the present invention in a conventional nutrient fermentation medium. be able to. The selection of an appropriate medium can be based on the choice of the expression host and / or the regulation of the expression construct. Such media are well known to those skilled in the art. The medium can contain additional components, if desired, that prefer the transformed expression host over other potentially contaminating microorganisms.
[0186]
Accordingly, the present invention also provides a method having a polypeptide having PDE_XIV activity, which method comprises the following steps: a) shown as any one of the sequences shown in the list of attached sequences Transforming the host cell with the nucleotide sequence or derivative, homologue, variant or fragment thereof, and b) culturing the transformed host cell under conditions suitable for expression of the polypeptide.
The present invention also provides a method comprising a polypeptide having PDE_XIV activity, which method comprises the following steps: a) a nucleotide sequence shown as any one of the sequences shown in the attached sequence list Alternatively, host cells transformed with a derivative, homologue, variant or fragment thereof are cultured under conditions suitable for expression of the polypeptide, and b) the polypeptide is recovered.
[0187]
The present invention also provides a method comprising a polypeptide having PDE_XIV activity, which method comprises the following steps: a) a nucleotide sequence shown as any one of the sequences shown in the attached sequence list Or a host cell transformed with a derivative, homologue, variant or fragment thereof, b) culturing the transformed host cell under conditions suitable for expression of the polypeptide, and c) recovering the polypeptide. To do.
[0188]
Ribozyme
Ribozymes are RNA molecules of enzymes that can catalyze the specific culture of RNA. The mechanism of ribozyme action involves sequence-specific hybridization of ribozyme molecules to complementary target RNA, followed by endonucleolytic cleavage. Engineered hammerhead motif ribozyme molecules that specifically and efficiently catalyze endonucleolytic cleavage of PDE RNA sequences are within the scope of the present invention.
[0189]
Specific ribozyme cleavage sites within any potential RNA target were first identified by scanning the target molecule for ribozyme cleavage sites containing the following sequences: GUA, GUU and GUC. Once identified, a short RNA sequence of 15-20 ribonucleotides corresponding to the region of the target gene containing the cleavage site can be evaluated for secondary structural features that render the oligonucleotide sequence inoperable. The suitability of candidate targets can also be assessed by testing the accessibility of hybridization with complementary oligonucleotides using ribonuclease protection assays.
[0190]
Both antisense RNA and DNA and ribozymes of the invention can be produced by any method known in the art for the synthesis of RNA molecules. These include techniques for chemical synthesis of oligonucleotides, such as solid phase phosphoramidite chemical synthesis. Alternatively, RNA molecules can be generated by in vitro or in vivo transcription of a DNA sequence encoding an antisense RNA molecule. Such DNA sequences can be incorporated into various vectors using an appropriate RNA polymerase promoter, such as T7 or SP6. Alternatively, antisense cDNA constructs that synthesize antisense RNA constitutively or inducibly can be introduced into cell lines, cells, or tissues.
[0191]
detection
The presence of a PDE polynucleotide coding sequence is detected by DNA-DNA or DNA-RNA hybridization using a probe, portion or fragment of the sequence shown as any one of the sequences shown in the attached sequence listing can do. Nucleic acid amplification-based assays involve the use of oligonucleotides or oligomers based on the PDE coding sequence to detect transformants containing PDE DNA or RNA. As used herein, “oligonucleotide” or “oligomer” means a nucleic acid sequence of at least about 10 and as many as about 60 nucleotides, preferably about 15-30 nucleotides, more preferably about 20-25 nucleotides. This can then be used as a probe or an amplimer. Preferably, the oligonucleotide is derived from the 3 'region of the nucleotide sequence shown as any one of the sequences shown in the attached sequence listing.
[0192]
Various protocols for detecting and measuring the expression of PDE polypeptides are known in the art, eg, using polyclonal or monoclonal antibodies specific for the protein. Examples include enzyme linked immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA) and fluorescence activated cell sorting (FACS). Although a two-site monoclonal-based immunoassay that utilizes monoclonal antibodies reactive against two non-interfering epitopes on a PDE polypeptide is preferred, a competitive binding assay can be used. These and other assays are described, among others, in the following literature: Hampton R et al., 1990, Serological Methods, A Laboratoy Manual, APS Press, St Paul MN, and Maddox DE et al., J. Exp.Med.158: 1211.
[0193]
A wide variety of labels and conjugation techniques are known in the art and can be used in various nucleic acid and amino acid assays. Means for producing labeled hybridized or PCR probes to detect PDE polynucleotide sequences include oligo-labeling, nick translation, end-labeling or PCR amplification using labeled nucleotides. Alternatively, the PDE coding sequence or any part thereof can be cloned into a vector for producing an mRNA probe. Such vectors are known in the art, are commercially available, and are used for the synthesis of RNA probes in vitro by the addition of appropriate RNA polymerases such as T7, T3 or SP6 and labeled nucleotides. can do.
[0194]
Numerous companies such as Pharmacia Biotech. (Piscataway, NJ), Promega (Madison, Wis.), And US Biochemical Corp. (Cleveland, Ohio) ) Provides commercial kits and protocols for these procedures. Suitable reporter molecules and labels include their radionuclides, enzymes, fluorescence, chemiluminescence, or chromogenic factors and substrates, cofactors, magnetic particles and others. Patents that teach the use of such labels are: US Pat. No. 3,817,837, US Pat. No. 3,850,752, US Pat. No. 3,939,350, US Pat. No. 3,996,345, US Pat. No. 4,277,437, US Pat. No. 4,275,149 and US Pat. No. 4,366,241. Alternatively, recombinant immunoglobulins can be produced as shown in US Pat. No. 4,816,567.
[0195]
Additional methods for quantifying the expression of specific molecules include nucleotide radiolabeling (Melby PC et al., 1993, J. Immunol. Methods 159: 235-44) or biotinylation (Duplaa C et al., Anal Biochem. Performing the assay in an ELISA format can accelerate the quantification of a large number of samples, where the oligomer in question is presented at various dilutions, and spectrophotometric or calorimetric responses give rapid quantification.
[0196]
The presence / absence of marker gene expression suggests that the gene of interest is also present, but its presence and expression should be confirmed. For example, if the PDE coding sequence is inserted within the marker gene sequence, recombinant cells containing the PDE coding region can be identified by the absence of marker gene function. Alternatively, the marker gene can be placed in tandem with the PDE coding sequence under the control of a signal promoter. Expression of the marker gene in response to induction or selection usually also indicates PDE expression.
[0197]
Alternatively, host cells that contain the PDE coding sequence and express the PDE coding region can be identified by various procedures known in the art. These procedures include, but are not limited to: DNA-DNA or DNA-RNA hybridisation and protein bioassay or immunoassay techniques, said techniques for detecting and / or quantifying nucleic acids or proteins Includes membrane based, solution based, or chip based technologies.
[0198]
antibody
The amino acid sequences of the present invention can also be used to generate antibodies against amino acid sequences according to standard techniques.
 Techniques well known in the art can be used for the production of antibodies against PDE_XIV polypeptides. Such antibodies include, but are not limited to: polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, Fab fragments and fragments produced by Fab expression libraries. Neutralizing antibodies, ie antibodies that inhibit the biological activity of the PDE polypeptide, are particularly preferred for diagnosis and therapy.
[0199]
In order to produce antibodies, various hosts, including goats, rabbits, rats, mice and others, can be treated with inhibitors or any portion, mutants, homologues, fragments or derivatives, or oligopeptides that retain immunogenicity. Immunization can be achieved by injection. Depending on the host species, various adjuvants can be used to increase the immunological response. Such adjuvants include, but are not limited to: Freund's adjuvants, mineral gels such as aluminum hydroxide, and surface active substances such as lysolecithin, pronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, Keyhole limpet hemocyanin, and dinitrophenol. BCG (Bacille Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum are potentially useful human adjuvants that can be used.
[0200]
Monoclonal antibodies against amino acid sequences can be produced by any technique that produces antibody molecules in a continuous cell line in culture. These techniques include, but are not limited to, the hybridoma technology first described by Koehler and Milstein (1975 Nature 256: 495-497), the human B cell hybridoma technology (Kosbor et al. (1983) ) Immunol. Today 4:72; Cote et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026-2030) and EB-hybridoma technology (Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc., pp. 77-96).
[0201]
Furthermore, techniques developed for the production of “chimeric antibodies”, techniques that splicing mouse antibody genes to human antibody genes to obtain molecules with appropriate antigen specificity and biological activity can be used (Morrison et al. al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851-6855; Neuberger et al. (1984) Nature 312: 604-608; Takeda et al. (1985) Nature 314: 452-454). Alternatively, techniques described for the production of single chain antibodies (US Pat. No. 4,946,779) can be adapted for the production of inhibitor specific single chain antibodies.
[0202]
Alternatively, antibodies can be produced by inducing production in vivo in a lymphocyte population or by screening a recombinant immunoglobulin library or panel of highly specific binding reagents described in the following literature: Can: Orlandi et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833-3837, and Winter G and Milstein C (1991) Nature 349: 293-299.
[0203]
 Antibody fragments that contain specific binding sites for PDE_XIV can also be generated. For example, such fragments include, but are not limited to: reduction of disulfide bridges of F (ab ') 2 and F (ab') 2 fragments that can be produced by pepsin digestion of antibody molecules. Fab fragments that can be generated by Alternatively, Fab expression libraries can be constructed for rapid and easy identification of monoclonal Fab fragments with the desired specificity (Huse WD et al. (1989) Science 256: 1275-1281). Another technique involves screening a phage display library, where, for example, phage express scFv fragments on the surface of a coat with a wide variety of complementarity determining regions (CDRs). This technique is well known in the art.
[0204]
 PDE_XIV specific antibodies are useful in diagnosing conditions and diseases associated with expression of PDE_XIV polypeptides. Various protocols for competitive binding or immunoradiometric assays using polyclonal or monoclonal antibodies with established specificity are well known in the art. Typically, such immunoassays involve the formation of complexes between the PDE_XIV polypeptide and its specific antibody (or similar PDE_XIV binding molecule) and the measurement of complex formation. A two-site monoclonal-based immunoassay that utilizes monoclonal antibodies reactive against two non-interfering epitopes on a specific PDE_XIV protein can also use a competitive binding assay. These assays are described in Maddox DE et al. (1983) J. Exp. Med. 158: 1211.
[0205]
Anti-PDE_XIV antibodies are useful in the diagnosis of inflammation, hematopoietic cell proliferation and symptoms associated with HIV infection and other disorders or diseases characterized by abnormal expression of PDE_XIV. Diagnostic assays for PDE_XIV include methods that utilize antibodies and labels to detect PDE_XIV polypeptides in human body fluids, cells, tissues, or secretions or extracts of such tissues. The polypeptides and antibodies of the present invention can be used with or without modification. Often, polypeptides and antibodies will be labeled by linking them to a reporter molecule either covalently or non-covalently. A wide variety of reporter molecules are known in the art.
[0206]
The antibody can be used in a method for detecting a polypeptide of the present invention present in a biological sample by a method comprising the following steps: (a) providing an antibody of the present invention, (b) A biological sample is incubated under conditions that allow formation of an antibody-antigen complex with the antibody, and (c) determines whether an antibody-antigen complex consisting of the antibody has formed.
Depending on the environment, suitable samples are extracts, tissues, tissues such as brain, breast, ovary, lung, colon, pancreas, testis, liver, muscle and bone tissue or neoplasia derived from such tissues Includes growth.
The antibodies of the invention can be bound to a solid support and / or packaged in a kit in a suitable container along with appropriate reagents, controls, instructions and others.
[0207]
Assay / Identification Methods
The present invention also relates to an assay for detecting the presence of PDE_XIV in a cell (eg, human cell) comprising the following steps: (a) any one DNA sequence of the sequences shown in the list of attached sequences Or reverse from RNA from such cells (eg, total RNA) using a pair of polymerase chain reaction primers that are specific for PDE_XIV as determined from the allelic variant. A transcriptase-polymerase chain reaction is performed and (b) assayed for the appearance of appropriately sized PCR (polymerase chain reaction) fragments, eg, by agarose gel electrophoresis.
[0208]
The invention also identifies factors (eg, compounds, other substances or compositions comprising them) that affect (eg, inhibit or otherwise modify) the activity of PDE_XIV and / or its expression. This method comprises contacting PDE_XIV or a nucleotide sequence encoding it with said factor and then measuring the activity of PDE_XIV and / or its expression.
[0209]
The invention also provides factors (eg, compounds, other substances or compositions comprising them) that selectively affect (eg, inhibit or otherwise modify) the activity of PDE_XIV and / or its expression. The method comprises contacting PDE_XIV or a nucleotide sequence encoding it with said factor and then measuring the activity of PDE_XIV and / or its expression.
[0210]
The present invention also includes factors (eg, compounds, other agents) that selectively affect (eg, inhibit or otherwise modify) the activity of PDE_XIVA1 or PDE_XIVA2 or PDE_XIVA3 or PDE_XIVA4 and / or their expression. Substance or a composition comprising them), the method comprising contacting the relevant PDE_XIV or the nucleotide sequence encoding it with said factor and then measuring the activity and / or expression of the relevant PDE_XIV Become.
[0211]
The invention also identifies factors (eg, compounds, other substances or compositions comprising them) that affect (eg, inhibit or otherwise modify) the activity of PDE_XIV and / or its expression. The method comprises: (a) a cell line incorporating a recombinant DNA comprising any one DNA sequence of the sequences shown in the attached sequence list or an allelic variant thereof, or (b) It consists in measuring the activity of PDE_XIV and / or its expression in a cell population or cell line that naturally expresses PDE_XIV in the presence of the factor or after addition of the factor. Preferably, it comprises measuring the activity of PDE_XIV by the aforementioned assay method.
[0212]
The invention also provides factors (eg, compounds, other substances or compositions comprising them) that selectively affect (eg, inhibit or otherwise modify) the activity of PDE_XIV and / or its expression. A) a cell line in which a recombinant DNA comprising any one DNA sequence of the sequences shown in the attached sequence list or an allelic variant thereof is incorporated, or (B) measuring the activity and / or expression of PDE_XIV in a cell population or cell line that naturally and selectively express PDE_XIV in the presence of the factor or after the addition of the factor. Preferably, it comprises measuring the activity of PDE_XIV by the aforementioned assay method.
[0213]
The invention also includes factors (eg, compounds, other substances) that selectively affect (eg, inhibit or otherwise modify) the activity and / or expression of PDE_XIVA1 or PDE_XIVA2 or PDE_XIVA3 or PDE_XIVA4. Or a composition comprising them), the method comprising (a) a recombinant DNA comprising any one respective DNA sequence of any of the sequences shown in the attached sequence list or an allelic variant thereof Or (b) a cell population or cell line that naturally and selectively express each PDE_XIV in the presence of the factor or after the addition of the factor and the activity of each PDE_XIV and And / or measuring its expression. Preferably, it comprises measuring the activity of PDE_XIV by the aforementioned assay method.
[0214]
The invention also provides for modulation of the activity of PDE_XIV (or a derivative, homologue, variant or fragment thereof) or expression of a nucleotide sequence encoding it (including derivatives, homologues, variants or fragments thereof), preferably A method for screening factors for specific modulation), comprising the following steps: a) preparing candidate factors; b) PDE_XIV (or a derivative, homologue, variant or fragment thereof) or A nucleotide sequence encoding (or a derivative, homologue, variant or fragment thereof) in combination with the candidate factor for a time sufficient to allow modulation under appropriate conditions, and c) PDE_XIV (Or derivatives, homologues, variants or fragments thereof) or Detecting the modulation of the candidate factor to the nucleotide sequence encoding it (or a derivative, homologue, variant or fragment thereof) and the candidate factor is PDE_XIV (or a derivative, homologue, variant or fragment thereof) Whether it modulates the activity of or the expression of the nucleotide sequence encoding it (or its derivatives, homologues, variants or fragments).
[0215]
The present invention also provides factors for the affinity of specific binding to PDE_XIV (or a derivative, homologue, variant or fragment thereof) or a nucleotide sequence encoding it (including derivatives, homologues, variants or fragments thereof). The method comprises the following steps: a) preparing a candidate factor, b) PDE_XIV (or a derivative, homologue, variant or fragment thereof) or a nucleotide sequence encoding it ( Or a derivative, homologue, variant or fragment thereof) with the candidate agent for a time sufficient to allow binding under appropriate conditions, and c) PDE_XIV (or a derivative, homologue thereof) Body, variant or fragment) or nucleotide sequence encoding it (or its derivation) Detection of binding of the candidate factor to a homologue, variant or fragment) and the candidate factor is PDE_XIV (or a derivative, homologue, variant or fragment thereof) or a nucleotide sequence encoding it (or its) Derivatives, homologues, variants or fragments).
[0216]
The present invention also provides a method for identifying a factor capable of modulating PDE_XIV, which method comprises the following steps: a) said factor as PDE_XIV (or a derivative, homologue, variant or fragment thereof) Or contacting the nucleotide sequence encoding it (or a derivative, homologue, variant or fragment thereof), b) incubating the mixture of step a) under conditions suitable for the hydrolysis of the cyclic nucleotide and the cyclic nucleotide, c PDE_XIV (or a derivative, homologue, variant or fragment thereof) that was incubated without using said compound))) determined the amount of hydrolysis of the cyclic nucleotides, and b) the amount of hydrolysis of the cyclic nucleotides of step c) Or the nucleotide sequence encoding it (or its derivatives, homologues, variants or Compared to the amount of hydrolysis of the cyclic nucleotide obtained using fragments), determining whether Thus the factors affecting the hydrolysis of cyclic nucleotides (e.g., stimulate or inhibit).
[0217]
Thus, in certain embodiments of the invention, modulators of phosphodiesterase activity using PDE_XIV or a variant, homologue, fragment or derivative thereof and / or a cell line expressing PDE_XIV or a variant, homologue, fragment or derivative thereof. Screening for antibodies, peptides, or other factors that act as, for example, organic or inorganic molecules, or for their expression, thereby identifying therapeutic agents that can modulate the level of cyclic nucleotides it can. For example, an anti-PDE_XIV antibody that can neutralize the activity of PDE_XIV can be used to inhibit the hydrolysis of PDE_XIV of cyclic nucleotides, thereby increasing the level of cyclic nucleotides.
[0218]
Alternatively, a peptide produced by combinatorial chemistry with a recombinantly expressed PDE_XIV or a variant, homologue, fragment or derivative thereof or a cell line expressing PDE_XIV or a variant, homologue, fragment or derivative thereof, or Organic library screening may be useful in identifying therapeutic agents that function by modulating the hydrolysis of the cyclic nucleotide PDE_XIV. Synthetic compounds, natural products, and other sources of potentially biologically active substances can be screened in a number of ways that would be routine to one of ordinary skill in the art.
[0219]
For example, a nucleotide sequence encoding the N-terminus of PDE_XIV can be expressed in a cell line that can be used to screen for allosteric modulators, agonists or antagonists of PDE_XIV activity. Alternatively, nucleotide sequences encoding the conserved catalytic domain of PDE_XIV can be expressed in cell lines and used to screen for inhibitors of cyclic nucleotide hydrolysis.
[0220]
 The ability of the test agent to interfere with PDE_XIV activity or cyclic nucleotide hydrolysis can be determined by measuring the level of PDE_XIV or cyclic nucleotide (Smith et al., 1993, Appl. Biochem. Biotechnol. 41 : 189-218, as disclosed). There are also commercially available immunoassay kits that measure cAMP and cGMP (eg, Amersham International, Arlington Heights, Ill., And DuPont, Boston, Mass.). The activity of PDE_XIV can also be monitored by measuring other responses, such as phosphorylation or dephosphorylation of other proteins using conventional techniques developed for these purposes.
[0221]
Accordingly, the present invention provides a method for identifying a compound capable of modulating the phosphodiesterase activity of a cyclic nucleotide of PDE_XIV, or a variant, homologue, fragment or derivative thereof, comprising the following steps: a) said Contacting the compound with PDE_XIV, or a variant, homologue, fragment or derivative thereof, b) incubating the mixture of step a) under conditions suitable for hydrolysis of the cyclic nucleotide and cyclic nucleotide, and c) hydrolyzing the cyclic nucleotide. Hydrolysis of cyclic nucleotides obtained using PDE_XIV, or variants, homologues, fragments or derivatives thereof, measuring the amount of degradation and d) incubating the amount of step c) without using said compound This makes it possible for the compound to add cyclic nucleotides. The decomposition to determine whether to stimulate or inhibit.
[0222]
In one embodiment of this method, the fragment can be from the N-terminal region of PDE_XIV and provides a method for identifying an allosteric modulator of PDE_XIV. In other embodiments of the invention, methods are provided that identify inhibitors of cyclic nucleotide hydrolysis, which can be from the carboxy-terminal region of PDE_XIV.
[0223]
PDE_XIV polypeptides, immunogenic fragments or oligopeptides can be used to screen for therapeutic compounds in any of a variety of drug screening techniques. Polypeptides used in such tests are free in solution and can be attached to a solid support and carried on the cell surface or located intracellularly. The disruption of the activity or formation of the binding complex between the PDE_XIV polypeptide and the agent being tested can be measured.
[0224]
Accordingly, the present invention relates to one or more compounds for modulation (preferably specific modulation, eg, specific binding affinity) of PDE_XIV or expression thereof, or a portion thereof, or a variant, homologue, fragment or derivative thereof. Wherein one or more compounds are prepared and a nucleotide sequence encoding PDE_XIV or a portion thereof or a variant, homologue, fragment or derivative thereof is associated with each of the plurality of compounds. Detect binding of PDE_XIV, or a portion thereof, or a variant, homologue, fragment or derivative thereof, for a sufficient amount of time to allow modulation under appropriate conditions, and for each of a plurality of compounds This will cause PDE_XIV or The nucleotide sequence encoding the same consists of identifying one or more compounds that modulate. In such assays, multiple compounds can be made by a combination of chemical techniques known in the art.
[0225]
Other techniques for screening drugs provide for high throughput screening of compounds with appropriate binding affinity for PDE_XIV polypeptides and are published in Geysen, European Patent Application No. 84/03564, issued September 13, 1984. Based on the method described in detail. In summary, a number of different small peptide test compounds are synthesized on a solid support, such as a plastic pin or some other surface. The test compound of the peptide is reacted with the PDE_XIV fragment and washed. The bound PDE_XIV is then detected, for example, by appropriately adopting methods well known in the art. Purified PDE_XIV is also coated directly onto the plate and used in the aforementioned drug screening techniques. Alternatively, non-neutralizing antibodies can be used to capture the peptide and immobilize it on a solid support.
[0226]
The invention also provides a competitive drug screening assay, in which neutralizing antibodies capable of binding PDE_XIV compete with test compounds for binding to PDE_XIV. In this method, antibodies can be used to detect the presence of peptides that share one or more antigenic determinants with PDE_XIV.
The assay method of the present invention can be a high throughput screen (HTS). In this regard, the technique of WO84 / 0356 can be employed for the PDE of the present invention.
[0227]
The teachings of US Pat. No. 5,738,985 can be employed in the assay method of the present invention.
The present invention also provides one or more factors identified by the assay and identification methods of the present invention.
The agent of the present invention can be, for example, an organic compound or an inorganic compound. An agent can be, for example, a nucleotide sequence that is antisense to all or a portion of the sequences shown in the accompanying sequence listing.
[0228]
The present invention further provides a pharmaceutical composition comprising an agent of the present invention (or a physiologically acceptable salt or pharmaceutically acceptable solvate thereof) or any of the foregoing for use as a medicament. provide.
The present invention also includes the putamen, caudate nucleus of the brain, occipital lobe of the brain, heart, ovary, pituitary gland, kidney, liver, small intestine, thymus, skeletal muscle, leukocyte region, dorsal root ganglion, uterus, cochlea, Provided is the use of factors that affect (eg, inhibit, modulate or act on) PDE_XIV activity in any one or more of the small intestine (duodenum), astrocytoma, and appendix.
[0229]
  Diagnosis
The present invention also provides a diagnostic composition for detecting a PDE_XIV nucleotide sequence. The diagnostic composition comprises any one of the sequences shown in the attached sequence listing or any variant, homologue, fragment or derivative thereof, or any one of the sequences shown in the list of attached sequences. Alternatively, it can comprise a sequence that can hybridize to a portion or an allelic variant thereof.
[0230]
In order to provide a basis for diagnosis of the disease, normal or standard values from the expression of the PDE_XIV polypeptide should be established. This is accomplished by combining bodily fluids or cell extracts from normal animal or human subjects with antibodies to PDE_XIV under conditions of complex formation well known in the art. . Quantify the amount of standard complex formation by comparing the amount of standard complex formation with a dilution series of a positive control that combines a known amount of antibody with a known concentration of purified PDE_XIV polypeptide. can do. A standard value obtained from a normal sample can then be compared to a value obtained from a sample from a subject potentially affected by a disorder or disease associated with expression of the PDE_XIV polypeptide. A bias between the standard value and the subject value establishes a disease state.
[0231]
   A PDE_XIV polynucleotide, or any portion thereof, can provide a reference for diagnostic and / or therapeutic compounds. For diagnostic purposes, PDE_XIV polynucleotide sequences can be used to detect and quantify gene expression in a condition, disorder or disease associated with PDE_XIV activity.
[0232]
 A polynucleotide sequence encoding PDE_XIV can be used to diagnose a disease resulting from expression of PDE_XIV. For example, polynucleotide sequences encoding PDE_XIV can be used in biopsy or autopsy or in biological fluids such as serum, synovial fluid or tumor biopsies to hybridize tissues or PCR assays to detect abnormal expression of PDE_XIV can do. Such qualitative or quantitative methods include Southern or Northern analysis, dot blot or other membrane based techniques; PCR techniques; dipstick, pin or chip techniques; and ELISA or many other sample formal techniques. Include. All of these techniques are well known in the art and are in fact the basis of many commercially available diagnostic kits.
[0233]
Such assays can be prepared for the efficacy of a particular therapeutic treatment regimen and used in animal studies, clinical trials, or in monitoring individual patient therapy. In order to provide a basis for the diagnosis of the disease, a normal or standard profile of PDE expression should be established. This is accomplished by combining bodily fluids or cell extracts taken from normal animal or human subjects with PDE_XIV or a portion thereof under conditions suitable for hybridization or amplification. Standard hybridization can be quantified by comparing values obtained from normal subjects to a positive control dilution series made in the same experiment using known amounts of purified PDE_XIV.
[0234]
Standard values obtained from normal samples can be compared to values obtained from samples from subjects potentially affected by disorders or diseases associated with expression of the PDE coding sequence. A bias between the standard value and the subject value establishes a disease state. If a disease is established, an existing therapeutic agent can be administered and a treatment profile or value generated. Finally, the assay can be repeated on a regular basis to assess whether the value is progressing towards or back to a normal or standard pattern. A continuous treatment profile can be used to demonstrate the efficacy of a treatment over a period of days or months.
[0235]
Thus, the present invention provides a PDE_XIV polypeptide, or a variant, homologue thereof, for producing an anti-PDE_XIV antibody capable of detecting or quantifying the level of PDE_XIV in a disease state using, for example, diagnostics. It relates to the use of fragments or derivatives.
In addition, the present invention provides diagnostic assays and kits for detecting PDE_XIV in cells and tissues that consist of purified PDE_XIV and anti-PDE_XIV antibodies that can be used as positive controls. Such antibodies may be used in solution-based, membrane-based, or tissue-based techniques to express or delete PDE_XIV protein or its mutants, homologues, fragments or derivatives. A disease state or symptom associated with can be detected.
[0236]
  probe
Another aspect of the invention is a nucleic acid hybridization or PCR probe capable of detecting polynucleotide sequences or closely related molecules, such as alleles, including genomic sequences encoding the PDE coding region. Is to provide. The specificity of the probe, eg whether the probe was derived from a highly conserved, conserved or non-conserved region or domain, and the stringency of hybridization or amplification (high, medium or low) Will determine whether to identify only the naturally occurring PDE coding sequence or the related sequence.
[0237]
Probes that detect the nucleic acid sequence concerned are selected from conserved or highly conserved nucleotide regions of members of the PDE family of cyclic nucleotides, such as the 3 ′ region, and such probes are a pool of degenerate probes. Can be used. In order to detect identical nucleic acid sequences, or where maximum specificity is desired, nucleic acid probes are selected from non-conserved nucleotide regions or unique regions of PDE polynucleotides. As used herein, the term “non-conserved nucleotide region” refers to a family member that is unique and related to the PDE coding sequences disclosed herein, eg, PDEs of known cyclic nucleotides. It means a nucleotide region that does not exist.
[0238]
PCR as described in US Pat. No. 4,683,195, US Pat. No. 4,800,195 and US Pat. No. 4,965,188 provides additional uses for oligonucleotides based on the PDE_XIV sequence. Such oligomers are generally chemically synthesized but can be generated enzymatically or produced from recombinant sources. Oligomers generally consist of two nucleotide sequences, one with a sense orientation (5 '→ 3') and one with an antisense orientation (3 '← 5'), which is specific gene or symptomatic Used under conditions optimized for identification. The same two oligomers can be used under low stringency conditions for the detection and / or quantification of DNA or RNA sequences closely related to a nested set of oligomers, or even a degenerate pool of oligomers .
[0239]
The PDE_XIV nucleic acid sequence can also be used to generate the previously described hybridizing probe for mapping of the endogenous genomic sequence. Well-known techniques can be used to map sequences to specific chromosomes or to specific regions of chromosomes. These include in situ hybridization to chromosome expansion (Verma et al. (1988) Human Chromsomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York City), flow-sorted chromosome preparations, or artificial chromosome constructs such as YACs , Including bacterial artificial chromosomes (BACs), bacterial PI constructs or single chromosomal cDNA libraries.
[0240]
In situ hybridization of chromosome preparations and physical mapping techniques, such as linkage analysis using established chromosomal markers, are of great value in extending genetic maps. Examples of genetic maps are found in Science (1995; 270: 410f and 1994; 265: 1981f). Often, even when the number or arm of a particular human chromosome is unknown, the placement of genes on the chromosomes of other mammalian species may reveal related markers. New sequences can be assigned to chromosomal arms or portions by physical mapping.
[0241]
This provides valuable information to researchers searching for disease genes using positional cloning or other gene discovery techniques. Once a disease or syndrome, such as telangiectasia ataxia (AT), is unambiguously localized by genetic linkage to a specific genomic region, such as linkage of AT to 11q22-23 (Gatti et al. 1988) Nature 336: 577-580), mapping of sequences to that region may represent genes or regulatory genes associated for further study. The nucleotide sequences of the present invention can also be used to detect differences in transposition, inversion, and others between normal, carrier or affected individuals.
[0242]
Medicine
The present invention also provides a pharmaceutical composition for treating an individual in need of treatment for PDE_XIV activity, wherein the composition affects (eg, inhibits) a therapeutically effective amount of said activity. ) A factor and a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, excipient or adjuvant.
Therefore, the present invention also provides a factor of the present invention (a factor capable of modulating the activity of the night sweat expression pattern of the present invention or the expression product thereof and / or the activity of the factor identified by the assay according to the present invention). Pharmaceutical compositions comprising are included. In this regard, and in human therapy, the agent of the present invention can be administered alone, but the agent is generally selected from pharmaceutical carriers, excipients selected for the intended route of administration and standard pharmaceutical practice. Or it may be administered mixed with a diluent.
[0243]
As an example, in the pharmaceutical composition of the present invention, the agent of the present invention can be mixed with one or more of any suitable binder, lubricant, suspending agent, coating agent, or solubilizer. .
Generally, a therapeutically effective daily oral or intravenous dose of an agent of the invention will be 0.01-50 mg / kg body weight of the subject to be treated, preferably 0.1-20 mg / kg. . The agent of the present invention can also be administered by intravenous infusion, and the dosage is 0.001 to 10 mg / kg / hour.
Factor tablets or capsules may be administered as appropriate, alone or twice or more at a time. The agent of the present invention can also be administered in the form of a sustained release formulation.
[0244]
Accordingly, the present invention also provides a method of treating said individual comprising administering an effective amount of a pharmaceutical composition of the present invention to an individual in need of treatment for PDE_XIV activity.
Typically, the physician will determine the actual dosage that is most appropriate for an individual patient, and the dosage will vary with the age, weight and response of the particular patient. The aforementioned dosages are typical of the average case. There can, of course, be individual instances where higher or lower dosage ranges are merited, and such cases are within the scope of this invention.
[0245]
Where appropriate, the pharmaceutical composition may be by inhalation, in the form of a suppository or pessary, typically in the form of a lotion, solution, cream, ointment or dusting powder, by the use of a skin patch, an excipient such as starch. Or in the form of tablets containing lactose, or alone or in the form of capsules or eggs mixed with excipients, or of elixirs, solutions or suspensions containing flavoring or coloring agents The form can be administered or the pharmaceutical composition can be injected parenterally, for example, intracavity, intravenously, intramuscularly or subcutaneously. For parenteral administration, the composition can best be used in the form of a sterile aqueous solution which contains other substances, for example, enough salts or monosaccharides to make the solution isotonic with blood. Can be contained. For buccal or sublingual administration, the compositions can be administered in the form of tablets or lozenges which can be formulated in conventional manner.
[0246]
For certain applications, preferably the composition is orally in the form of a tablet containing an excipient, such as starch or lactose, or alone or mixed with an excipient in the form of a capsule or egg. Alternatively, it can be administered in the form of an elixir, solution or suspension containing a flavoring or coloring agent.
For parenteral administration, the composition can best be used in the form of a sterile aqueous solution, which contains other substances, for example, enough salts or monosaccharides to make the solution isotonic with blood. can do.
For buccal or sublingual administration, the compositions can be administered in the form of tablets or lozenges which can be formulated in conventional manner.
[0247]
For oral, parenteral, buccal and sublingual administration to a subject (eg, patient), the daily dosage level of the factor of the invention is typically 10-500 mg (single or divided dose). ). Thus, by way of example, a tablet or capsule may suitably contain from 5 to 100 mg of active agent for administration alone or twice or more at a time. As indicated above, the physician will determine the actual dosage that will be most appropriate for an individual patient, and the dosage will vary with the age, weight and response of the particular patient. The aforementioned dosages are typical of the average case, but of course there may be individual cases where higher or lower dosage ranges are beneficial and such cases are within the scope of the present invention. It should be noted that entering.
[0248]
In certain applications, generally in humans, oral administration of the agents of the invention is the preferred route, most convenient, and in some cases, disadvantages associated with other routes of administration, such as intracavity (i. c.) The disadvantages associated with administration can be avoided. In cases where the receptor suffers from dysphagia or impaired absorption of the drug after oral administration, the drug can be administered parenterally, eg, sublingually or buccal.
For veterinary use, the agents of the present invention are typically administered as a suitably acceptable formulation in accordance with normal veterinary practice, and veterinary surgeons are given the most appropriate dosage for a particular animal. The regimen and route of administration will be determined. However, as in human therapy, the factors can be administered alone for veterinary therapy.
[0249]
Typically, a pharmaceutical composition—which can be for human or animal use—will comprise any one or more pharmaceutically acceptable diluents, carriers, excipients or adjuvants. . The choice of pharmaceutical carrier, excipient or diluent can be selected with regard to the intended route of administration and standard pharmaceutical practice. As indicated above, the pharmaceutical composition may be any suitable one or more binders, lubricants, suspending agents, coatings, as a carrier, excipient or diluent. A solubilizer can be included.
[0250]
In certain embodiments of the invention, the pharmaceutical composition will comprise one or more of the following components: factors screened by the assay of the invention; any of the sequences shown in the attached sequence listing Or a derivative, fragment, homologue or variant thereof, or an agent capable of interacting with a sequence capable of hybridizing to any one of the sequences shown in the attached sequence listing.
[0251]
   Oligonucleotide sequences, antisense RNA and DNA molecules and ribozymes that function to destabilize PDE_XIV mRNA or inhibit translation of PDE_XIV are included within the scope of the present invention. Such nucleotide sequences can be used in conditions where it is desirable to increase the level of cyclic nucleotides, such as inflammation.
 PDE_XIV antisense molecules can provide the basis for the treatment of various abnormal conditions, eg, with respect to increased PDE_XIV activity.
 Antisense molecules of PDE_XIV nucleic acids can be used to block the activity of PDE_XIV in conditions where it is desirable to increase the level of cyclic nucleotides.
[0252]
Expression vectors derived from retroviruses, adenoviruses, herpes or vaccinia viruses, or from various bacterial plasmids can be used to deliver recombinant PDE_XIV sense or antisense molecules to the targeted cell population. Methods that are well known to those skilled in the art can be used to construct recombinant vectors containing PDE_XIV. Alternatively, recombinant PDE_XIV can be delivered to target cells in liposomes.
[0253]
Full-length cDNA sequences and / or their regulators can be used to study the sense of gene function (Youssoufian H and HF Lodish 1993P, Mol. Cell. Biol. 13: 98-104) or antisense studies (Eguchi et al. (1991 ) Make PDE_XIV available to researchers as a tool in Ann. Rev. Biochem. 60: 631-652). CDNAs derived from genomic DNA or oligonucleotides designed from regulatory sequences can be used in vitro or in vivo to inhibit expression. Such techniques are now well known in the art and sense or antisense oligonucleotides or larger fragments can be designed from various locations along the coding or control region. Suitable oligonucleotides can be 20 nucleotides in length and can be used to isolate PDE_XIV sequences or closely related molecules from human libraries.
[0254]
Furthermore, in preferred conditions to block phosphodiesterase activity, the expression of PDE_XIV is modulated by transfecting cells or tissues with expression vectors that express high levels of PDE_XIV fragments, thereby increasing the level of cyclic nucleotides. Can be made. Such constructs can flood cells with non-translatable sense or antisense sequences. Even in the absence of integration into DNA, such vectors can continue to transcribe RNA molecules until all copies of the vector are disabled by endogenous nucleases. Such transient expression can last for a month or more with a non-replicating vector and can last longer if the appropriate replication factor is part of the vector system.
[0255]
By designing antisense sequences for the control regions of the PDE gene, such as promoters, enhancers, and introns, gene expression can be modified.
Oligonucleotides derived from the transcription start site, eg, -10 to +10 of the leader sequence, are preferred. Antisense RNA and DNA molecules can also be designed to block the translation of mRNA by preventing the transcript from binding to the ribosome. Similarly, inhibition can be achieved using the Hogeboom base pair method (also known as “triple helix” base pairing). Triple helix pairing weakens the ability of the double helix and opens it sufficiently for the binding of polymerases, transcription factors, or regulatory molecules.
[0256]
Accordingly, the present invention comprises an agent of the present invention (or a pharmaceutically acceptable salt or pharmaceutically acceptable solvate thereof) and a physiologically acceptable diluent, excipient or carrier. A pharmaceutical composition is provided.
The pharmaceutical composition can be used veterinarily (ie, animals) or humans.
Accordingly, the present invention also provides an effective amount of an inhibitor or antagonist of PDE_XIV protein (including antisense nucleic acid sequences) and a pharmaceutically acceptable diluent, carrier, excipient or adjuvant (combinations thereof). Inclusive).
[0257]
The present invention includes all or part of a PDE_XIV polynucleotide sequence, a PDE_XIV antisense molecule, a PDE_XIV polypeptide, a protein, a peptide or an organic modulator of PDE_XIV biological activity, such as an inhibitor, antagonist (including antibody) or agonist alone, Alternatively, it can comprise at least one other factor in combination with, for example, a stabilizing compound and includes but is not limited to saline, buffered saline, dextrose, and water. It relates to a pharmaceutical composition that can be administered in combination with any sterile, biocompatible pharmaceutical carrier.
[0258]
  References for general methods
In general, the techniques described herein are well known in the art and are specifically mentioned in the following literature: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989) and Ausubel et al., Short Protocols. in Molecular Biolgy (1999) 4th edition, John Wiley & Sons, Inc. PCR is described in US Pat. No. 4,683,195, US Pat. No. 4,800,195 and US Pat. No. 4,965,188.
[0259]
  Deposit
The following samples were collected from approved depositors (The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Scotland, United Kingdam, AB2 1RY) in accordance with the provisions of the Budabest Convention. Commissioned on May 18th:
E. coli pHS-PDE_XIVNCIMB No.NCIMB 40995
E. coli pMM-PDE_XIV NCIMB No.NCIMB40996
The following samples were collected in an approved depository (The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Scotland, United Kingdam, AB2 1RY) in accordance with the provisions of the Budabest Convention. Commissioned on the 9th of May:
NCIMB No. NCIMB 41027 is E. coli pHS-PDE_XIVhm.
[0260]
The invention also encompasses sequences that are derivable and / or expressible from those consignments and embodiments comprising them. The present invention also encompasses partial sequences that are derivable and / or expressible from their deposits and embodiments consisting thereof, wherein the partial sequence encodes an active enzyme site. The present invention also encompasses proteins comprising sequences that are derivable and / or expressible from the deposits and embodiments comprising them. The invention also encompasses proteins consisting of partial sequences that are inducible and / or expressible from the deposits and embodiments consisting thereof, wherein the partial sequences encode active enzyme sites.
The invention also encompasses sequences that are derivable and / or expressible from those consignments and embodiments comprising them.
[0261]
  Introduction to example sections and drawings
The present invention will now be described by way of example with reference to the accompanying drawings.
Figure 1 represents the image of a photograph,
Figure 2 shows the image of the photograph,
FIG. 3 represents the image of Table 1 and the photograph,
FIG. 4 represents the alignment of nucleotide sequences (where the human sequence is a truncated sequence)
FIG. 5 represents the protein sequence alignment (where the human sequence is a truncated sequence), and
FIG. 6 shows a graph.
[0262]
【Example】
Northern hybridization and probe preparation
Northern blots obtained from Clontech were prehybridized in ExpressHyb hybridization solution (Clontech) for 1 hour at 55 ° C. and then radiolabeled PDE_XIV fragment (50 μCi strictly according to manufacturer's instructions).³²DNA was labeled using P-dATP using the Megaprime random labeling system (Amersham) and added to fresh Expresshyb and allowed to hybridize overnight at 55 ° C. with gentle shaking. . The blots were then washed 3 times in 2 × SSC (150 mM NaCl, 30 mM sodium citrate) for 10 minutes each at room temperature and then 0.2 × SSC (15 mM NaCl, 3 mM citric acid for 20 minutes each at 55 ° C. Washed twice in sodium). The blot was then exposed to autoradiographic film.
[0263]
Polymerase chain reaction (PCR)
PCR was performed using standard reagents and conditions. Briefly, all reaction buffers and enzymes are available in kit format from Clontech (for rapid amplification of cDNA-terminated (RACE) reactions) or Life Technologies (for standard PCR). From Life technologies). Oligonucleotides were obtained from a commercial supplier (OSWEL DNA Service) and used at a concentration of 400 nM. Reactions were performed on an MJ Research PTC-200 thermal cycler using cycling parameters recommended by the manufacturer of the kit used.
[0264]
PDE _ XIV Identification
A clone (IMAGE clone id 1364394) was obtained as a stub culture in L-agar from Research Genetics (2130, Memorial Pkwy, SW Huntsville, AL 358801, USA). Bacteria from stub cultures were streaked on 37 mm L-agar plates in the presence of ampicillin at a concentration of 100 mg / ml.
[0265]
After overnight growth at 37 ° C., a single clone was picked using aseptic technique and placed in LB-broth containing ampicillin at a concentration of 100 mg / ml and shaken overnight at 220 ° C. (220 rpm). While growing. Plasmid DNA was isolated from bacteria using a standard commercially available miniprep kit (Qiagen ™) strictly following the manufacturer's instructions. The isolated DNA was then subjected to full-length sequencing using standard registered kits and reagents and an ABI (PE Applied Biosystems Incoporated) automated sequencer.
[0266]
PDE _ XIV Of the estimated total length cDNA Clone isolation
To facilitate the isolation of full-length cDNA for PDE_XIV containing the complete coding region and terminator circular nucleotide, the expression of PDE_XIV was measured using Northern hybridization in a region of tissue. As these data (FIGS. 1 and 2) show, messenger RNA (5.5 kb in length) that hybridizes to PDE_XIV is present in several tissues, which are murine brain, skeletal Particularly highly expressed in muscle and liver and at the following embryonic development stages: 10.5, 13.5, 15.5 days.
[0267]
PDE_XIV was isolated using a 13.5 day murine embryo cDNA library in a cDNA positive selection method (Gene Trappe, Life Technologies, Inc.). This method was performed as per manufacturer's instructions. Since the original EST sequence of clone 1364394 was reversed, the design of the selection oligonucleotide needs to be identical to the coding strand running from 5 'to 3', and this step leads to a successful cloning strategy. Because it was serious. The oligonucleotides used for selection and repair are detailed below.
[0268]
Oligo 1:
Selection 1 5'-GGT CAC AGA ACT GCC ACT ATG GTT AAA TGT-3 '
To isolate the human homologue of murine PDE_XIV, PCR primers were designed based on the known EST1364394 sequence (Primer 1 and Primer 2) and used to screen a panel of cDNA libraries. PCR performed using these primers (PCR was set up using standard cycling parameters and using reagents obtained from the PCR reagent system kit (Life Technologies) according to the manufacturer's instructions) A fragment of the expected size of 164 bp obtained from the HELA cell line cDNA library (Life Technologies, Inc.) was generated and a human clone was isolated using the same selection / repair oligonucleotide (Oligo 1) .
[0269]
Primer 1:
New PDE1 5'-ACC GCT CAG AGA TTT CAC AGC A-3 '
Primer 2:
New PDE2 5'-CCC GTC TGA CCC CTT AGT CGT A-3 '
Clones were selected for subsequent screening by colony PCR using the primers described above and the method described below.
[0270]
Using a sterile toothpick, a single colony was picked and added to a tube containing 25 μl of 1 * PCR supermix (Life Technologies, Inc.) and 200 nM primer. The tube was vortexed for 1 second and centrifuged at 14,000 × g for 2 seconds. The tube was then placed at 94 ° C. in a pre-warmed thermal cycler (MJ Research PTC-200 thermal cycler). PCR was performed using the following program: 1 cycle; 94 ° C., 1 minute, then 30 cycles: 94 ° C., 30 seconds, 55 ° C., 30 seconds, 72 ° C., 1 minute. The PCR product was then analyzed by gel electrophoresis according to standard methods.
[0271]
Analysis of the isolated murine clone was able to assemble a 2823 bp flanking sequence containing a 446 residue ORF. The full-length cDNA sequence of murine PDE_XIV is represented as SEQ ID NO: 7, and the translation of the largest open reading frame within this cDNA is represented as SEQ ID NO: 1. The coding region is represented as SEQ ID NO: 3.
[0272]
Analysis of the isolated human clone was able to assemble a 2992 bp flanking sequence containing an ORF of 288 residues. The full-length cDNA sequence of human PDE_XIV is represented as SEQ ID NO: 8, and the translation of the largest open reading frame within this cDNA is represented as SEQ ID NO: 3. The coding region is represented as SEQ ID NO: 4. This clone was used to screen a master RNA blot (Clontech) according to standard Northern blots to identify the tissue distribution for this cDNA.
[0273]
As the results show (see FIG. 3), transcripts are highly expressed in the putamen and caudate nucleus of the brain, and in the occipital lobe, heart, ovary, pituitary gland, kidney, liver, small intestine, thymus, and appendix bone Expressed in
Like all mammalian phosphodiesterases sequenced to date, PDE_XIV is a sequence of a conserved catalytic domain of approximately 250 amino acids in the carboxyl-terminal half of a protein believed to be essential for catalytic activity. Containing. This segment consists of amino acids 108-413 in SEQ ID NO: 1 and indicates the conservation of sequences with corresponding regions of other PDEs. As can be seen from the nucleotide alignment (see FIG. 4) and protein alignment (see FIG. 5), the human PDE_XIV clone is truncated at the 3 'end due to an immature stop codon at position 1102 bp.
[0274]
  PDE _ XIV Putative full-length human encoding cDNA Isolation of
A human fetal brain cDNA library was purchased from Life Technologies, Inc. (LTI). 2.5 × 10 9 c. In 100 ml Luria Broth (10 g trypsin, 5 g yeast extract, 5 g NaCl / liter) +100 μg / ml ampicillin c. f. u. Each cDNA library was inoculated. Each library was grown and prepared individually. Cultures are grown overnight at 30 ° C and Gene Trapper^TMPlasmid DNA was prepared as described in the protocol (LTI).
[0275]
Gene Trapper^TM Detailed methods for positive selection of cDNA clones using (LTI) are outlined in the kit protocol and were followed with the following exceptions. The single stranded cDNA library was combined with 20 ng of biotinylated capture oligonucleotide and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Eluted single-stranded DNA was prepared using capture oligonucleotides as primers for the DNA polymerase extension. The repaired cDNA library was electroporated into E. coli strain DH10B (LTI) according to the manufacturer's protocol.
[0276]
  Human PDE _ XIV Cloning, tissue distribution and sequence analysis
To facilitate the isolation of full-length cDNA, the expression profile of PDE_XIV was determined by Northern hybridization in a range of mouse tissues. This identifies a 5.0 bk transcript that is particularly highly expressed in mouse embryos at 13.5 days and in adult mouse heart, brain and liver. This transcript is also present at low levels in 8.5, 10.5, 15.5 day embryos and in adult skeletal muscle, kidney and lung.
[0277]
Transcripts were not detected in the spleen or testis. Based on the data, the full-length sequence was isolated using a 13.5 day embryo cDNA library (LTI) as a template according to the positive cDNA selection technique, Gene Trapper (LTI). This is achieved by using PDE_XIV specific oligonucleotides. PCR could be performed and a cDNA containing at least the EST fragment could be identified. Restriction endonuclease digestion identified a number of clones containing the 2885 bp insert, and analysis of the full-length sequence indicated that these clones encoded a 446 amino acid ORF with a predicted molecular weight of 51.3 kDa. It was done.
[0278]
In addition, full length human cDNA was isolated by Gene Trapper using the same specific capture oligonucleotide and human fetal brain cDNA library as template. Numerous clones containing a 2653 bp insert were isolated and complete sequence analysis identified a 450-residue ORF with a predicted molecular weight of 51.8 kDa. RNA master blots were probed using full length human cDNA. This identified that human PDE_XIV mRNA is highly expressed in the candidate nucleus, putamen and occipital lobe of the brain, and is expressed peripherally in the heart, ovary, pituitary, kidney, liver, small intestine and thymus It was done. Low levels were observed in skeletal muscle, colon, bladder, uterus, prostate, stomach, pituitary, and thymus. Transcripts were not observed in the testis, spleen, pancreas, peripheral leukocytes, lymph nodes, bone marrow, aorta or cerebellum.
[0279]
Comparison of the mouse and human PDE_XIV sequences shows that they have 91% amino acid identity. The predicted human ORF is extended by 4 amino acids, which is the result of the insertion of 5 amino acids at position 428 and the deletion of a single amino acid at position 441 of the mouse sequence. Furthermore, both cDNAs contain a single cAMP protein kinase phosphorylation site at serine 45. The phylogenetic alignment of the 230 amino acid catalytic domain of PDE_XIV (amino acids 172-420) with other PDE representatives shows that PDE_XIV has the highest homology (about 70% identity) to PDE7A. Indicates clustering.
[0280]
Further bioinformatic analysis shows that this domain shares 50% sequence identity with equivalent regions in the other nine known PDE subfamilies, thus indicating that PDE_XIV is the first in the PDE7 family. It can be shown that it can be representative of two.
 The PDE_XIV sequence contains two putative divalent cation binding motifs HXXXHX8-20D (amino acids 173-180, 213-270), which are considered essential for hydrolytic activity. This is therefore further evidence that PDE_XIV encodes a functional phosphodiesterase enzyme.
[0281]
  Phosphodiesterase assay on crude mammalian cell lysate
Both murine and human PDE_XIV cDNA were transfected into the mammalian COS7 cell line (ATCC) using Lipofectamine (Life Technologies, Inc.) and standard methods. COS7 cells were harvested 72 hours after transfection and PDE using the commercially available SPA (scintillation proximity assay) kit (Amersham) for cAMP SPA assay (Amersham) using the following phosphodiesterase activity: Assayed for activity. Lysis buffer (50 mM HEPES, pH 7.2, 1.92 mM MgCl₂The cell lysate was serially diluted in 50 mM KCl, 10 mM EGTA, 1 protease inhibitor tablet / 50 ml) to dilute the intrinsic inhibitory effect.
[0282]
To 25 ml of diluted crude lysate, 25 ml of buffer D (buffer C + BSA, 2 mg / ml) is added, followed by 500 nM cAMP substrate (20 μl [^ThreeH] 25 ml Buffer C (20 mM Tris / HCl pH 7.4), 5 mM MgCl containing cAMP (1 μM 4 μCi / ml) +423 μl cold cAMP, 10 μM / 5 ml)₂・ 6H₂O) was added. The reaction was incubated at 30 ° C. for 30 minutes. 50 μl of SPA beads were then added and immediately centrifuged at 2000 rpm for 5 minutes. Readings were collected on a Topcount (Wallac) scintillation counter.
As the results (FIG. 6) show, both human and murine PDE_XIV clones were 10 times more active than mock transformed controls.
[0283]
  Expression of phosphodiesterase in baculovirus.
   PDE_XIV was expressed in baculovirus when fused to the N-terminal FLAG tag. Details will be presented later.
  Phosphodiesterase cDNA Activity
  Using the cAMP scintillation proximity assay for purified expressed PDE_XIV with cAMP concentrations of 0-10 μM, the expressed PDE_XIV showed a strong cAMP activity of 0.08 μM (Hens derived from the kinetic curve). (Determined by (Hanes) plot). Studies have also shown that PDE_XIV has no activity against cGMP. Thus, PDE_XIV can be cAMP specific.
[0284]
  Study of phosphodiesterase inhibition
   PDE_XIV was found to be insensitive to the PDE inhibitor milrinone (Rolipram and Ariflo). However, inhibition of PDE_XIV activity was seen using dipyridamole and IBMX (with IC50 values of 10.72 μM and 9.32 μM, respectively). Data from these studies are presented in the table below.
[0285]
[Table 4]

[0286]
Expression of baculovirus
In the following study, it is demonstrated that baculovirus expression synthesis can be used to generate the PDE enzyme of the invention (abbreviated herein as PDE for short).
The following studies also demonstrate that when PDE is expressed in a baculovirus system, PDE exhibits cyclic nucleotide hydrolytic activity.
Using a baculovirus expression system based on the infection of the Autographa californica nuclear polynuclear disease virus (AcNPV) in Spodoptera frugiperda insect cells (Sf9 cells), the PDE enzyme Was generated.
[0287]
In these studies, the cDNA encoding PDE was cloned into the donor plasmid pFASTBAC-FLAG containing the mini-Tn7 transposable element. The recombinant plasmid was transformed into DH10BAC competent cells containing the parent bacmid bBON14272 (AcNPV infectious DNA) and a helper plasmid. The mini-Tn7 factor on the pFASTBAC donor can be translocated to the attTn7 binding site on the bacmid, thus introducing the PDE gene into the viral genome. Colonies containing recombinant bacmid are identified by disruption of the lacZ gene. The PDE / bacmid construct is then isolated and infected into insect cells (Sf9 cells), producing infectious recombinant baculovirus particles and expressing the recombinant PDE-FLAG fusion protein.
[0288]
The phosphodiesterase activity of the crude cell extract was measured.
Cells were harvested and extracts were prepared at 24, 48 and 72 hours after transfection.
As these results confirm, the PDE cDNA encodes a phosphodiesterase that can hydrolyze cAMP.
[0289]
The crude lysate material was purified by FPLC using a column (Eastman Kodak) containing agarose beads (M2 affinity gel) to which purified IgG1 monoclonal anti-FLAG antibody was bound by a hydrolyzable bond. This allows the recombinant material to be specifically retained on the column (since the recombinant material is fused to the FLAG epitope), but endogenous insect proteins are washed away in the eluate. The recombinant material is then washed away under low pH conditions.
[0290]
This purified material was more suitable for detailed enzyme and inhibitor studies. Western blotting and IgG1 monoclonal anti-FLAG by electrophoresis on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels after electrophoresis (SDS-PAGE) or unstained SDS-PAGE (containing recombinant PDE) on nitrocellulose membrane The purity of this material is assayed by analysis using epitope antibodies. Due to the interaction between the anti-FLAG antibody and the FLAG epitope fused to the PDE protein, the PDE-FLAG fusion protein is detected.
[0291]
Using commercially available SPA (Scintillation Proximity Assay) kit (Amersham-Amersham place, Little Chalfont, Bucks, HP79NA UK), the phosphodiesterase activity of purified PDE-FLAG fusion protein was measured using cAMP and / or cGMP. Assayed. Using this, it is possible to measure the PDE Km value for cAMP by measuring enzyme activity over a range of substrate concentrations, thereby calculating an approximate Vmax for the enzyme.
As these experimental results indicate, PDE cDNA encodes a phosphodiesterase capable of hydrolyzing cAMP.
In summary, among other things, the present invention provides the following facts and examples illustrate:
[0292]
1. New amino acid.
2. New nucleotide sequence.
3. Assay using the novel sequence.
4). A compound / composition identified by use of the assay.
5). An expression system consisting of the novel sequences or expressing them.
6). A method of treatment based on said novel sequence.
7). A pharmaceutical composition based on said novel sequence.
[0293]
All publications mentioned in the above specification are herein incorporated by reference. Various modifications and variations of the described methods and system of the invention will be apparent to those skilled in the art without departing from the scope and spirit of the invention. While the invention has been described in connection with specific preferred embodiments, it should be understood that the invention as claimed should not be unduly limited to such specific embodiments. Indeed, various modifications of the described modes for carrying out the invention which are obvious to those skilled in biochemistry and biotechnology or related fields are intended to be within the scope of the present invention.
[0294]
[Sequence Listing]
The following sequence is presented:
Sequence Listing: 1 = Murine amino acid sequence
Sequence Listing: 2 = murine coding nucleotide sequence
Sequence Listing: 3 = Truncate human amino acid sequence
Sequence Listing: 4 = truncated human coding nucleotide sequence
Sequence Listing: 5 = human amino acid sequence
Sequence Listing: 6 = human coding nucleotide sequence
Sequence Listing: 7 = murine cDNA sequence
Sequence Listing: 8 = Truncate human cDNA sequence
Sequence Listing: 9 = Formula I
(In the text above, it should be noted that references to Sequence Listing: 2 are equally applicable to Sequence Listing: 7. Also, references to Sequence Listing: 4 or Sequence Listing: 6 are equivalent to Sequence Listing: 8. Applicable.)
[0295]
[Table 5]

[0296]
[Table 6]

[0297]
[Table 7]

[0298]
[Table 8]

[0299]
[Table 9]

[0300]
[Table 10]

[0301]
[Table 11]

[0302]
[Table 12]

[0303]
[Table 13]

[0304]
[Table 14]

[0305]
[Table 15]

[0306]
[Table 16]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows³²FIG. 2 is an electrophoretogram showing a blot of murine MTN probed with P-labeled murine peptide, and is a drawing substitute photograph.
FIG. 2³²FIG. 4 is an electrophoretogram showing a blot of a murine embryo MTN probed with P-labeled murine peptide, and is a drawing-substituting photograph.
FIG. 3³²FIG. 5 is a master blot of human RNA probed with P-labeled human peptide.
FIG. 4 shows an alignment of murine and human PDE_XIV nucleotide sequences. The new array is PDE_XIV. Pupple: A gene computer group.
FIG. 5 shows an alignment of murine and human PDE_XIV nucleotide sequences. The new array is PDE_XIV. Pupple: A gene computer group.
FIG. 6 shows an alignment of murine and human PDE_XIV nucleotide sequences. The new array is PDE_XIV. Pupple: A gene computer group.
FIG. 7 shows an alignment of murine and human PDE_XIV nucleotide sequences. The new array is PDE_XIV. Pupple: A gene computer group.
FIG. 8 shows the alignment of murine and human PDE_XIV.
FIG. 9 is a graph showing the results of measuring cAMP hydrolyzing activity of murine and human PDE_XIV.

Claims (10)

A polypeptide capable of exhibiting phosphodiesterase activity having the following amino acid sequence:
(1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
(2) an amino acid sequence modified by addition, deletion and / or substitution of one to several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; and (3) against the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Amino acid sequences having at least 95% sequence homology;
A polypeptide comprising any one of the following. A polypeptide capable of exhibiting phosphodiesterase activity having the following amino acid sequence:
(1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
(2) an amino acid sequence modified by addition, deletion and / or substitution of one to several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3; and (3) against the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. Amino acid sequences having at least 95% sequence homology;
A polypeptide comprising any one of the following. A polypeptide capable of exhibiting phosphodiesterase activity having the following amino acid sequence:
(1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5;
(2) an amino acid sequence modified by addition, deletion and / or substitution of one to several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5; and (3) against the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5. Amino acid sequences having at least 95% sequence homology;
A polypeptide comprising any one of the following. An assay method for identifying a substance capable of affecting the activity of a polypeptide according to any one of claims 1-3.
The material contacted with said polypeptide; and measuring the activity of said polypeptide;
It comprises a, wherein the difference between the activity of said polypeptide in the presence of (a) the polypeptide activity and (b) the previous term substance in the absence of the substance, said substance said to affect activity of the polypeptide can be shown to be,
A method characterized by that.   The assay includes putamen, caudate nucleus of the brain, occipital lobe of the brain, heart, ovary, pituitary, kidney, liver, small intestine, skeletal muscle, leukocyte region, dorsal root ganglion, uterus, cochlea, small intestine (duodenum) 5. The assay method of claim 4, wherein the method is screening for factors that are useful in the treatment of disorders found in one or more of astrocytoma, astrocytoma, and appendix. The following steps:
(A) performing the method of claim 4 or 5;
(B) identifying one or more substances that affect the activity of the polypeptide; and (c) preparing the one or more substances;
A method comprising that.   A nucleic acid encoding the polypeptide according to any one of claims 1 to 3.   A vector comprising the nucleic acid according to claim 7.   A host cell transformed with the vector according to claim 8.   A gene construct comprising a gene encoding a polypeptide having the deposit number NCIMB40995, the deposit number NCIMB40996, or the deposit number NCIMB41027 and capable of exhibiting phosphodiesterase activity.

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