JP3640278B2

JP3640278B2 - Assay apparatus and assay method using the same

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Publication number: JP3640278B2
Application number: JP35464696A
Authority: JP
Inventors: 田辺　　敏雄; 智子河原; 信雄八田; 恵司弥生
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1996-12-20
Filing date: 1996-12-20
Publication date: 2005-04-20
Anticipated expiration: 2016-12-20
Also published as: JPH10185920A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は液体状の試料、特に微量の液体状の生体試料を簡便に採取し、該試料中の特定物質（分析対象物質）を生物学的親和性を利用して、短時間に測定できる簡易アッセイ装置およびそれを用いた測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、臨床診断の分野において、家庭、診療室、診療所等での使用に適し、使用者の熟練や手間をほとんど必要としない免疫反応を測定原理とした簡易アッセイ装置が普及してきている。
【０００３】
その一つの形態はクロマト法アッセイ装置である（特公平７−１８８７６、特公平７−７８５０３、特公平７−３６０１７、特公平６−２７７３８、特開平１−２４４３７０号公報などに開示されている。）。たとえば、アッセイ形式がサンドイッチ形式の典型例としては、液体が毛管現象で移動することができる多孔性のシート状ストリップの一部に、分析対象物質に特異的に反応する抗体が固定化されており、その上流に金コロイドなどの着色粒子で標識された分析対象物質に特異的な抗体（標識抗体）がストリップ上に固定されていない状態で配置（塗布・乾燥等により配置）されているクロマト法アッセイ装置があり、これに標識抗体の上流から液体試料を添加すると、試料はストリップ中の毛管を伝わって浸透し標識抗体を溶解し、さらに、標識抗体とともにストリップの抗体を固定化した部位を通過してストリップの下流に移動して、試料中に分析対象物質が存在する場合には、溶解した標識抗体と反応し、ついでストリップに固定化された抗体に「分析対象物質−標識抗体」複合体として捕獲される。未反応の標識抗体は下流に移動してしまうため、分析対象物質が存在する場合にだけストリップの抗体を固定化した部分に金コロイドによる着色が観察される。
【０００４】
もう一つの形態はフロースルー法アッセイ装置である（特公平７−３４０１６、特公平７−１１３６３７、特開平３−１１８４７３、特開平１−２４７６８号公報などに開示されている。）。この装置は、分析対象物質に特異的に反応する抗体が固定化されていて液体が通過できる毛管を有する多孔性のメンブレンとその下面で毛管が連絡して接触している吸水用部品より構成される。メンブレンの上面から液体試料を添加すると、メンブレンを通過して吸水用部品に吸収され、その時、試料中に分析対象物質が存在する場合には、分析対象物質はメンブレンに固定化された抗体上に捕獲される。その後、西洋ワサビなどの酵素で標識した分析対象物質に特異的な抗体（標識抗体）を添加し、メンブレンに固定化された抗体上に捕獲された分析対象物質と反応させサンドイッチ複合体を形成させる。さらに、洗浄液でメンブレンの毛管中にある未反応の標識抗体を吸水用部品に吸収させた後、標識酵素により発色する基質液を添加することにより、メンブレンの抗体を固定化した部分に着色が観察される。
【０００５】
ところで、液体状の生体試料中の物質を測定して診断を行う場合、その物質がある濃度以上あるいはある濃度以下であることをもって判断する。一方、これらの簡易アッセイ装置を用いた判定はストリップあるいはメンブレンに着色が観察されるか否かで行われ、着色が観察されるか否かは、添加した試料中の分析対象物質の絶対量で決まる。従って、生体試料中の分析対象物質の濃度に対応した正確な判定をするためには、スポイトやピペットなどを用いて一定の液量の試料を正確に装置に添加する必要がある。クロマト法の場合には抗体を固定化した部分より下流のストリップの面積を調節したり、吸水用の部材をストリップの端に付けることにより、試料を正確な液量で添加しなくとも抗体を固定化した部分を通過する試料液量をある程度調節できるが、ストリップや取り付けた吸収用部材を濡らすのに十分な比較的多量の試料を添加しなければならない。
【０００６】
ところが、乳癌などでみられる異常乳頭分泌液や皮膚からの浸出液あるいは指先を直接刺棘して得られる血液などは微量しか採取できない。そのため、使用者はキャピラリーなどの特別な用具を使用して注意深く試料を扱わなければならず、正確な量の取り扱いには熟練を要した。従って、これらの試料を前記従来の簡易アッセイ装置に適用するのは難しかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、使用者が特別な注意を払わなくても簡便で正確に一定量の試料を採取して試験ができる簡易アッセイ装置を提供することを目的とする。また、本発明はこの様な簡易アッセイ装置を使用したアッセイ方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明を完成した。すなわち、本発明は
【０００９】
（１）生物学的親和性を利用したクロマト法あるいはフロースルー法に基づくアッセイ装置であって、液体状の試料に接触させることにより一定量の液体試料を採取できる第一の部材と、試料を採取した第一の部材を組み込むことにより試料を受けとることのできる第二の部材から構成され、試料を採取する時には第一の部材と第二の部材は毛細管で連結していないアッセイ装置、
【００１０】
（２）第一の部材によって採取される液体状試料量が５０μｌ以下である上記（１）に記載のアッセイ装置、
（３）第一の部材が、液体状試料を採取し保持するための平面、溝、くぼみまたは穴構造を有する上記（１）又は（２）に記載のアッセイ装置、
【００１１】
（４）第一の部材が、吸収により液体状試料を採取するための吸水性材料を構成部品として有する上記（１）又は（２）に記載のアッセイ装置、
（５）吸水性材料が、繊維マトリクス、多孔性膜、濾紙、ガラス繊維濾紙、焼結体のいずれかである上記（４）に記載のアッセイ装置、
（６）吸水性材料が濾紙である上記（４）に記載のアッセイ装置、
【００１２】
（７）クロマト法に基づくアッセイ装置であって、第二の部材は少なくとも分析対象物質あるいは分析対象物質と生物学的親和性により結合する物質が固定化された部位を有するクロマトグラフィー用基材を有し、第一の部材を第二の部材に組み込むことにより、該クロマトグラフィー用基材の分析対象物質あるいは分析対象物質と生物学的親和性により結合する物質が固定化された部位あるいはその上流から試料を該クロマトグラフィー用基材に浸透させることが可能になり、かつ、浸透した試料を該クロマトグラフィー用基材中を毛管現象によって下流に移動させることにより分析対象物質を測定する上記（１）から（６）のいずれかに記載のアッセイ装置、
【００１３】
（８）クロマト法に基づくアッセイ装置であって、第二の部材のクロマトグラフィー用基材上で、第一の部材を組み込む部位より上流の部位に、クロマトグラフィー用基材中を試料を移動させるための展開液を添加するための部位が設けられている上記（７）に記載のアッセイ装置、
【００１４】
（９）クロマト法に基づくアッセイ装置であって、第二の部材のクロマトグラフィー用基材が、分析対象物質あるいは分析対象物質と生物学的親和性により結合する物質が固定化された部位を有する部分（Ａ）と展開液を添加する部分（Ｂ）の少なくとも２つに分かれており、第一の部材が組み込まれるまでは部分（Ａ）と部分（Ｂ）は毛細管でつながっておらず液体の移動はできないが、第一の部材を組み込むことにより液体の移動が可能になる上記（７）又は（８）に記載のアッセイ装置、
【００１５】
（１０）クロマト法に基づくアッセイ装置であって、第二の部材のクロマトグラフィー用基材中を試料を移動させるための展開液を、第二の部材に組み込んだ第一の部材を介して添加する上記（７）に記載のアッセイ装置、
【００１６】
（１１）フロースルー法に基づくアッセイ装置であって、第二の部材は少なくとも分析対象物質あるいは分析対象物質と生物学的親和性により結合する物質が固定された多孔性メンブレンとその下面に接している吸水用部品を有し、第一の部材を第二の部材に組み込むことにより試料を該メンブレン上面から該メンブレン中に浸透させることができ、毛管現象によって該メンブレンを通過させ吸水用部品に吸収させることにより分析対象物質を測定する上記（１）から（６）のいずれかに記載のアッセイ装置、
【００１７】
（１２）フロースルー法に基づくアッセイ装置であって、第二の部材は少なくとも吸水用部品を有し、第一の部材が分析対象物質あるいは分析対象物質と生物学的親和性により結合する物質が固定された多孔性メンブレンを構成部品として有し、第一の部材を第二の部材に組み込むことにより第一の部材の多孔性メンブレンは第二の部材の吸水用部品と毛細管で繋がる上記（１）から（６）のいずれかに記載のアッセイ装置、
【００１８】
（１３）分析対象物質あるいは分析対象物質と生物学的親和性により結合する物質を固定するクロマトグラフィー用基材あるいは多孔性メンブレンが、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、濾紙、ガラス繊維濾紙のいずれかからなる上記（７）から（１２）いずれかに記載のアッセイ装置、
（１４）生物学的親和性が免疫反応に基づく親和性である上記（１）から（１３）いずれかに記載のアッセイ装置、
【００１９】
（１５）クロマトグラフィー用基材あるいは多孔性メンブレンに固定化された物質が抗体または抗体断片であり、信号を得るための標識を結合した物質（標識結合体）として標識抗体を用い、クロマトグラフィー用基材あるいは多孔性メンブレン上にサンドイッチ複合体を作ることにより信号を得る上記（７）から（１４）のいずれかに記載のアッセイ装置、
（１６）信号を得るための標識が金属コロイド、非金属コロイドまたは着色ラテックス粒子であり、試料中の分析対象物質の検出あるいはその濃度測定を視覚的にあるいは色差計で行なうことができる上記（１５）に記載のアッセイ装置、
【００２０】
（１７）上記（１）から（１６）のいずれかに記載のアッセイ装置を使用して、液体状の試料中の分析対象物質を測定する方法、
（１８）試料をクロマトグラフィー用基材中で展開させるあるいは多孔性メンブレンを通過して吸水用部品に吸収させるために、試料以外に別に用意した展開液を用いる上記（１７）に記載の方法、
【００２１】
（１９）展開液が標識物質を含有する溶液である上記（１８）に記載の方法、
（２０）試料が乳頭分泌液、皮膚からの浸出液、又は血液である上記（１７）から（１９）のいずれかに記載の方法、
（２１）分析対象物質が乳頭分泌液中のＣＥＡ、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、ヘモグロビンのいずれかである上記（１７）から（２０）のいずれかに記載の方法、
（２２）乳癌検診用の上記（１）から（１６）のいずれかに記載のアッセイ装置、
に関する。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明において、クロマト法に基づくアッセイ装置とは、その特定部位に分析対象物質あるいは分析対象物質に結合する物質が固定化されたクロマトグラフィー用基材中を毛管現象により試料を移動させ、試料中の分析対象物質、標識をつけたこれと結合することができる物質あるいは標識をつけた分析対象物質の該特定部位での捕獲を検出することにより試料のアッセイを行なう装置をいう。なお、この検出は、該特定部位で直接行なうことができるが、場合によってはその下流において行なうこともできる。
又、フロースルー法に基づくアッセイ装置とは、分析対象物質あるいは分析対象物質に結合する物質が固定化された多孔性メンブレンの上面から下面に試料を通過させ、試料中の分析対象物質、標識をつけたこれと結合することができる物質あるいは標識をつけた分析対象物質の該メンブレンでの捕獲を検出することにより試料のアッセイを行なう装置をいう。
【００２３】
生物学的親和性としては、抗原−抗体相互作用やハプテン−抗体相互作用のような免疫反応に基づく親和性や、糖蛋白質を含む糖−レクチン相互作用、ホルモンなどの生理活性物質−レセプター相互作用、相補的な核酸オリゴマー間の相互作用などが挙げられる。特に好ましくは免疫反応に基づく親和性である。以下、免疫反応に基づく親和性を利用したアッセイ装置を例にとり説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２４】
測定形式としては、例えばＰ．ＴＩＪＳＳＥＮの「エンザイムイムノアッセイ（生化学実験方法１１、東京化学同人、１９８９年）」２９７〜３１４ページに記載されるような抗体あるいは抗原を固定化した固相を用いる種々の公知の形式を用いることができる。
【００２５】
その代表例としては、「従来の技術」の項で説明したサンドイッチ形式がある。
また、結合阻害形式あるいは競合形式も用いることができる。クロマト法による結合阻害形式の例としては、液体が毛管現象で移動することができる多孔性のシート状ストリップの特定部位に、測定対象である抗原が固定化されており、その上流に金コロイドなどの着色粒子で標識された標識抗体がストリップ上に固定されていない状態で配置（塗布・乾燥等により配置）されている。標識抗体の上流から液体状試料（液体試料）を添加すると、試料はストリップ中の毛管を伝わって標識抗体を溶解し、さらに、ストリップの抗原を固定化した部位を通過して下流に移動する。試料中に抗原が存在するとき、標識抗体は試料中の抗原と先に反応するので、ストリップに固定化した抗原とは反応できない。そのため抗原固定化部位に着色は観察されず、抗原固定化部位の下流に着色が観察される。試料中に抗原が存在しないときには、標識抗体は固定化した抗原に捕獲されるため、抗原固定化部位に着色が観察され、抗原固定化部位の下流には着色が観察されない。
【００２６】
クロマト法による競合形式の例としては、多孔性のシート状ストリップの特定部位に測定対象である抗原に対する抗体が固定化されており、その上流に金コロイドなどの着色粒子で標識された標識抗原がストリップ上に固定されていない状態で配置（塗布・乾燥等により配置）されている。標識抗原の上流から液体試料を添加すると、試料はストリップ中の毛管を伝わって標識抗原を溶解し、さらに、ストリップの抗体を固定化した部位を通過して下流に移動する。試料中に抗原が存在するとき、固定化した抗体は試料中の抗原と反応し、標識抗原との反応は妨害される。従って、ストリップの抗体固定化部位に着色は観察されず、抗体固定化部位の下流に着色が観察される。試料中に抗原が存在しないときには、固定化した抗体に標識抗原が捕獲されるため、抗体固定化部位に着色が観察され、抗体固定化部位の下流には着色が観察されない。
【００２７】
また、試料中に存在する特定の抗原に対する抗体を検出する場合には、抗原を固定化した多孔性膜と標識した抗抗体を用いれば、抗体が存在すれば、抗原を固相化した部分に着色が観察される。
【００２８】
本発明において、液体状の試料としてあらゆる形態の溶液やコロイド溶液などが使用できる。好ましくは生体由来の試料、例えば血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液、羊水、乳、乳頭分泌液、涙、汗、皮膚からの浸出液、組織や細胞および便からの抽出液等が挙げられる。特に好ましくは、微量しか採取できない、乳頭分泌液、皮膚からの浸出液、皮膚を直接刺棘して得られる微量の血液などが挙げられる。
【００２９】
本発明のアッセイ装置は、液体状の試料に接触させるだけで一定量の試料を採取できる第一の部材を必須の構成要素として含んでいる。従って、使用者は一定量の試料を採取しアッセイ装置に添加するために、ピペットやスポイトなどの採取用具を使用して注意深く目盛りを読んで採取量の確認を行ったり、マイクロピペットなどの採取用具の目盛りを調節して採取量の設定を行ったりするような特別の操作を必要としない。この様な採取部材は微量の試料に対して特に有効である。微量の試料は試験管などの容器に移してから一定量採取しようとすると、その間に試料のロスがおこり、必要量を採取することができなくなってしまう。通常は容器に移し替えることなく、身体などの試料を採取する部分から直接簡易アッセイ装置に一定量採取することが要望され、本発明のアッセイ装置はそれに対応したものであるが、もちろん、試験管などの別の容器に取った試料にも適用できることは言うまでもない。
【００３０】
第一の部材に一定量の液体試料を採取する機能を保持させるためには種々の方法を用いることができ、そのために第一の部材は種々の材質のものを用いることができ、種々の形状にすることができる。身体などから直接採取するために指などで摘むための形状部分が付加されていて良い。例えば液状試料の界面現象による濡れを利用して固体表面に一定量採取する場合、採取部分が一定の表面積を持つ平面からなる形状、円や多角形などの適当な形のくぼみまたは穴（反対側まで突き抜けていて両端で開口していても、途中で行き止まりになっていても良い）を有する形状、適当な形の溝を有する形状などをもつプラスチック、金属、ガラス等の成形体を第一の部材とすることができる。
【００３１】
試料採取部分が平面である場合、この平面はクロマト法のストリップ（クロマトグラフィー用基材）あるいはフロースルー法のメンブレンの幅を超えない大きさとする。形態は円形、楕円形、正方形、長方形等のいずれでも良い。幅および長さは通常２〜３０ｍｍ、好ましくは３〜２０ｍｍ、より好ましくは４〜１５ｍｍである。試料採取部分がくぼみ又は穴である場合、その断面の幅はクロマト法のストリップあるいはフロースルー法のメンブレンの幅よりも小さいものとし、通常０．１〜１０ｍｍ、好ましくは０．２ｍｍ〜５ｍｍ、より好ましくは０．４ｍｍから３ｍｍであり、その深さは通常０．０５ｍｍ〜３０ｃｍ、好ましくは０．１ｍｍ〜２０ｃｍ、より好ましくは０．２ｍｍ〜１５ｃｍである。試料採取部分が溝の構造の場合、その溝は表面張力で液状試料を保持できる大きさであるが、溝の断面の形態は特に限定されない。溝の長さはクロマト法のストリップの幅を超えない長さが好ましく、溝の断面が長方形の形態では、溝の幅および深さは通常０．０５〜５ｍｍ、好ましくは０．１〜４ｍｍ、より好ましくは０．２〜３ｍｍである。
【００３２】
また、吸水性材料を構成部品として第一の部材を作製することができる。吸水性材料として、シリカ、チタニア、ジルコニア、セリアおよびアルミナ等のセラミック微粒子や有機高分子の微粒子、セルロースやその誘導体、デキストラン誘導体、アガロース誘導体、ポリメタクリル酸２−ヒドロキシエチル、ポリアクリル酸およびポリビニルアルコール−ポリアクリル酸複合体等の多孔質ゲル、多孔性構造を有する金属や無機材料あるいは有機材料の焼結体、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、酢酸セルロースなどのセルロース誘導体等の繊維マトリクスや多孔性膜、濾紙、ガラス繊維濾紙、布、綿等があげられる。微粒子はそれ自体が多孔性でなくとも、充填された状態では微粒子間に空隙が生じ、毛管現象により液体試料を採取できる。
【００３３】
これらの吸水性材料は、一定の厚みを持った薄い膜の形で使用することができる。液体試料を一定量吸収させるため、膜の体積は一定にしなければならないが、その吸水量は膜の空隙率、厚さ、ポアサイズ等の影響を受ける。クロマト法のストリップあるいはフロースルー法のメンブレンの幅よりも小さいものであるのが望ましい。形状は円形、楕円形、正方形、長方形等のいずれでも良い。膜の幅および長さは通常１〜３０ｍｍ、好ましくは２〜２０ｍｍ、より好ましくは３〜１５ｍｍである。また、厚さは通常０．０１〜５ｍｍ、好ましくは０．０２〜４ｍｍ、より好ましくは０．０５〜３ｍｍである。
【００３４】
これらの材料は濡れ特性を良くするために界面活性剤などで処理したり、牛血清アルブミンやカゼインなどで処理して試料中の分析対象物質が吸着しないようにしておくこともできる。また、試料が採取されたことを知らせるために水分によって色の変化する物質、例えば無水硫酸銅等を含浸させておくこともできる。これらの材料は、保持するためのプラスチック等でできた容器や支持体とともに使用することもできる。微粒子や多孔質ゲルは必要に応じ適当な水透過性の膜で挟むなどして保持することもできる。
【００３５】
本発明の第一の部材は、５０μｌを超える多量の試料を採取するためにも用いることができるが、５０μｌ以下の試料の採取に適しており、特に２０μｌ以下の試料の採取に有用である。試料の好適な採取量は０．１〜２０μｌであり、特に好ましい採取量は０．５〜１０μｌである。
【００３６】
第一の部材で採取した液体試料は、第一の部材を第二の部材に組み込むことにより、第二の部材のクロマトグラフィー用基材あるいは多孔性メンブレンに移すことが可能になる。第二の部材はクロマトグラフィー用基材あるいは多孔性メンブレンを含み、その他にそれを収納するケースなどから構成されていて良い。第一の部材と第二の部材は試料採取時には毛細管で連結しておらず、第一の部材から第二の部材に液体の移動はできないようになっていなければならない。第一の部材と第二の部材は完全に独立していてもよいし、同一のケースに納められてはいるが、第一の部材と第二の部材のクロマトグラフィー用基材あるいは多孔性メンブレンは毛細管で繋がっておらず分離していて、どちらか一方を動かして繋げる構造にしてもよい。
【００３７】
本発明の第二の部材がクロマト法による場合、第二の部材は毛管現象により試料や非固定化試薬を必要により展開液を用いて移動させることのできるクロマトグラフィー用基材を有し、少なくとも分析対象物質あるいは分析対象物質と生物学的親和性により結合する物質が該基材の特定部位に固定化されている。該基材の形状は一般的には長方形であるが、液体の展開を均一にするために切れ込みを入れたり、ジグザグの形状にしたりすることもできる。
【００３８】
クロマトグラフィー用基材としては、ペーパークロマトグラフィーに用いる織った繊維状物質、織ってない繊維状物質あるいは多孔性膜状物質や薄層クロマトグラフィーに用いる微粒子物質がある。より具体的にはシリカ、チタニア、ジルコニア、セリアおよびアルミナ等のセラミック微粒子や有機高分子の微粒子、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、ニトロセルロースや酢酸セルロースなどのセルロース誘導体等の繊維マトリクスや多孔性膜、濾紙、ガラス繊維濾紙紙、布、綿等があげられる。好ましくはナイロンやセルロース誘導体の多孔性膜や濾紙、ガラス繊維濾紙等であり、より好ましくはニトロセルロース膜、混合ニトロセルロースエステル（ニトロセルロースと酢酸セルロースの混合物）膜、ナイロン膜、濾紙である。多孔性膜や濾紙の有する細孔径は０．１μｍ以上、好ましくは１〜５０μｍ、より好ましくは１〜２０μｍである。また、強度を増大させるために水不透過性のプラスチック等で裏打して使用することもできる。
【００３９】
クロマトグラフィー用基材の寸法は感度、時間、試料の使用量を考慮して決定する必要がある。好ましい長さは、通常約２〜４０ｃｍ、好ましくは３〜２５ｃｍ、より好ましくは４〜２０ｃｍであるが、クロマトグラフィー用基材が検出部と標識物質添着部の間で分離している場合には、それぞれのクロマトグラフィー用基材の長さは前記寸法の半分程度が望ましい。また、幅は通常２〜３０ｍｍ、好ましくは３〜２０ｍｍ、より好ましくは４〜１０ｍｍである。
【００４０】
分析対象物質としては、抗原、ハプテン、糖蛋白質を含む糖、ホルモン等の生理活性物質、核酸オリゴマー等種々のものが挙げられ、又これと生物学的親和性により結合する抗体、レクチン、レセプター、核酸オリゴマー等も分析対象物質として挙げられる。即ち、これらは分析対象物質となりうるし、又、分析対象物質と生物学的親和性により結合する物質にもなりうる。分析対象物質と生物学的親和性により結合する物質のうち好ましいものは抗体である。抗体は、ＩｇＧ，ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＹ抗体のうちの１種または２種以上の混合物であってもよく、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のどちらでも使用できる。抗体はペプシンやパパイン等の酵素処理や還元等の化学処理により、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ’、Ｆａｂの様な抗体断片にして使用することもできる。抗体は周知の方法で、ウサギ、モルモット、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウマなどの哺乳動物や、ニワトリ、アヒル、ガチョウなどの鳥類に抗原や、ハプテン等を免役して得られるものや、細胞融合などの技術を用いて得られるものでよく、また、モノクローナル抗体はマウス腹水や培養上清等より得られるものであって良い。
【００４１】
抗体のクロマトグラフィー用基材への固定化は直接的または間接的に行われる。直接的固定化としては物理吸着を利用しても良いし、共有結合によって固定しても良い。一般にニトロセルロース膜、または混合ニトロセルロースエステル膜の場合、物理吸着で行うことができる。共有結合するための試薬としては一般的に臭化シアン、グルタルアルデヒドおよびカルボジイミド等が用いられるが、これらに限定されるものではない。間接的な固定化としては不溶性微粒子に抗体を結合させた後に多孔性膜やガラス繊維濾紙などに固定化する方法がある。微粒子への抗体の固定化には物理吸着、共有結合のいずれの方法も用いることができる。微粒子の粒径は多孔性膜に補足されるが移動できないサイズのものを使用して多孔性膜に固定化する。これらの粒子としては抗原抗体反応に使用されるものが種々知られており、本発明でもこれら公知の粒子が特に限定されずに使用できる。例えば、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体などの乳化重合法によって得られる有機高分子ラテックス粒子などの有機高分子物質の微粒子、ゼラチン、ベントナイト、アガロース、架橋デキストランなどの微粒子、シリカ、シリカ−アルミナ、アルミナなどの無機酸化物や無機酸化物にシランカップリング処理などで官能基を導入した無機粒子等が挙げられる。
【００４２】
抗体を固定化した後、クロマトグラフィー用基材は、試料中の妨害物質による干渉を防ぐために必要に応じて公知の方法でブロッキング処理を行うことができる。一般にブロッキング処理はウシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼイン、ゼラチン等の蛋白質、ツイーン２０、トリトンＸ−１００、ＳＤＳ等の界面活性剤、ポリビニルアルコール、エタノールアミンなどのうちの１つまたは２つ以上を組み合わせて行われる。ブロッキング処理を必要としないエタノールアミン基を導入した濾紙等も本発明では使用できる。
【００４３】
クロマトグラフィー用基材への分析対象物質あるいは分析対象物質と生物学的親和性により結合する物質の固定化には、いろいろな方法が使用可能である。例えば、マイクロシリンジ、調節ポンプ付きペン、シルクスクリーン印刷、グラビア印刷、転写プリント、インキ噴射印刷等いろいろな印刷技術が使用可能である。形態としては特に限定されないが、円形のスポットやクロマト方向に垂直にのびるラインとして固定化することができる。さらに、半定量を可能にするため複数の固定化部位を設けたりすることも可能である。さらに試料中の複数の分析対象物質を検出するために複数の物質を固定化することも可能である。
【００４４】
本発明のアッセイ装置を使用して試料中の分析対象物質を測定する際に、第一の部材は、第二の部材のクロマトグラフィー用基材の分析対象物質あるいは分析対象物質と生物学的親和性により結合する物質を固定化した部位あるいはその上流部位に、試料が第二の部材のクロマトグラフィー用基材に毛管現象により移動できるように組み込まれる。第二の部材のクロマトグラフィー用基材をケースに収納する場合は、クロマトグラフィー用基材の検出結果表示部分は直接観察できるようにケースに窓を設ける。クロマトグラフィー用基材の結果検出部分はサンドイッチ形式では分析対象物質あるいは分析対象物質と生物学的親和性により結合する物質を固定化した部位にあり、競合あるいは阻害形式の場合は分析対象物質あるいは分析対象物質と生物学的親和性により結合する物質を固定化した部位あるいはその下流に設ける。
【００４５】
第二の部材は分析対象物質あるいは分析対象物質と生物学的親和性により結合する物質を固定化した部位を有するクロマトグラフィー用基材やそれを納めるケース以外に、クロマトグラフィー用基材中を展開する液量を調節したり血液中から血球や特定の成分を除去するための部品等を含んで構成することもできる。例えばクロマトグラフィー用基材中を展開する液量を調節するため該クロマトグラフィー用基材の上流及び／又は下流側末端の先にあるいは上流及び／又は下流側末端部分の上側及び／又は下側に重ねて、毛管が連絡している状態で別の吸水性材料（吸水用部品）を繋げることもできる。
【００４６】
第一の部材による試料採取量が微量の場合、試料は第一の部材あるいは第二の部材のクロマトグラフィー用基材中の一部分に留まり、十分クロマトグラフィー用基材中を移動することができない。その場合は、試料を移動させるための展開液を別に使用する。展開液を添加するための部位は第二の部材の第一の部材を組み込む部位の上流に設置することができる。展開液を添加する部位はクロマトグラフィー用基材上でも、又、その上流側末端の先にあるいは上流側部分の上側に重ねて繋げた吸水用部品の部分でもよい。又、第一の部材を介して添加することもできる。更に、展開液を適当な容器に入れて、第一の部材あるいは第二の部材の構成部品の一つとして用いることもできる。
【００４７】
第一の部材の試料採取部分が濾紙や多孔性膜等の吸水性材料である場合、採取した試料を完全に移動させるために、第二の部材のクロマトグラフィー用基材を分析対象物質あるいは分析対象物質と生物学的親和性により結合する物質が固定化された部位を有する部分（Ａ）と展開液を添加する部分（Ｂ）の少なくとも２つに分け、部分（Ａ）と部分（Ｂ）が第一の部材を組み込むことにより毛細管でつながるようにするのが好ましい。部分（Ａ）および（Ｂ）に用いるクロマトグラフィー用基材は同一であっても異なっていても良い。
【００４８】
また、第一の部材から展開液を入れられる構造にし、第一の部材を介して第二の部材のクロマトグラフィー用基材に展開液を添加する方法も、採取した試料を完全に第二の部材のクロマトグラフィー用基材に移すことができるので好ましい。
【００４９】
展開液としては一般的に使用される緩衝液が使用できる。例えばリン酸、トリス−塩酸、酢酸、ホウ酸、炭酸、グッドの緩衝塩類を含む緩衝液などが使用でき、食塩などを添加して使用することもできる。また、生物学的親和性に基づく反応を制御したり、非特異的反応を抑制するために公知の添加剤も使用できる。例えば、抗原抗体反応の促進あるいは非特異反応の抑制のために牛血清アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどの蛋白質、ポリエチレングリコール、デキストラン、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の高分子化合物や、ツイーン２０、トリトンＸ−１００などの非イオン性界面活性剤や他のイオン性界面活性剤、デキストラン硫酸、ヘパリン、ポリスチレンスルホン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等のポリアニオンまたはその塩など、アジ化ナトリウム、チメロサール、ケーソンＣＧ、長鎖アルキル４級アンモニウム塩などの抗菌剤などを添加することもできる。
【００５０】
本発明のアッセイ装置がフロースルー法による場合、その一つの形態においては、第二の部材は分析対象物質あるいは分析対象物質と生物学的親和性により結合する物質が固定化された多孔性メンブレンとその下面に接している吸水用部品を含む。多孔性メンブレンとしては、例えば濾過用メンブレンとして使用されているメンブレンが使用でき、例えば前記クロマトグラフィー用基材として挙げた繊維マトリクス、多孔性膜、濾紙、ガラス繊維濾紙、布、綿等が挙げられる。又、吸水用部品としては、前記第一の部材で記載した吸水性材料を使用することができる。この形態のアッセイ装置を目視による判定に使用する場合は、分析対象物質あるいは分析対象物質と生物学的親和性により結合する物質が固定化される面積は繊維マトリクス、多孔性膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等の多孔性メンブレンの目で見える面積より小さいことが好ましいが、特に限定されるものではない。分析対象物質あるいは分析対象物質と生物学的親和性により結合する物質を固定化する方法およびブロッキング処理する方法はクロマト法と同様な方法を用いることができる。
【００５１】
試料を採取した第一の部材は第二の部材に組み込み、第一の部材の試料採取部分を第二の部材の分析対象物質あるいは分析対象物質と生物学的親和性により結合する物質が固定化した繊維マトリクス、多孔性膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等の多孔性メンブレンと接触させることにより、試料は第二の部材の多孔性メンブレンを通過して吸水用部品まで移動できるようになる。試料を移動させるために、第一の部材を介して展開液を添加することができる。展開液としてはクロマト法と同様な溶液を用いることができる。
【００５２】
フロースルー法の他の形態は、第一の部材の吸水性材料自体が分析対象物質あるいは分析対象物質と生物学的親和性により結合する物質が固定化した繊維マトリクス、多孔性膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等の多孔性メンブレンであるか又はこれを含んで構成され、第二の部材は吸水用部品を必須の要素として構成される。生物学的親和性に基づく反応は試料採取と同時に起こる。第一の部材を第二の部材に組み込み、繊維マトリクス、多孔性膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等の多孔性メンブレンを吸水用部品に接触させ、必要により第一の部材を介して展開液を添加することにより、試料は第二の部材の吸水用部品に吸収させることができる。
【００５３】
フロースルー法の場合にも、第二の部材は上記の分析対象物質あるいは分析対象物質と生物学的親和性により結合する物質が固定化した繊維マトリクス、多孔性膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等の多孔性メンブレンや吸水用部品の他に、必要に応じそれを納めるケース等とともに構成することができる。
【００５４】
フロースルー法の多孔性メンブレンは円形、楕円形、正方形、長方形等いずれの形態でも使用できる。幅および長さあるいは径は通常２〜１００ｍｍ、好ましくは３〜８０ｍｍ、より好ましくは４〜５０ｍｍである。吸水用部品は多孔性メンブレンより大きく、多孔性メンブレンの全面が接触する面積を有することが好ましく、また、試料又は試料及び展開液を完全に吸収するために十分な体積を有することが好ましい。吸水用部品の吸水能力は通常０．１〜５０ｍＬ、好ましくは通常０．３〜２０ｍＬである。
【００５５】
本発明のアッセイ装置は、サンドイッチ形式や結合阻害形式あるいは競合形式で試料中の分析対象物質を測定するが、分析対象物質あるいは分析対象物質と生物学的親和性により結合する物質と任意の手段により信号を取り出せる物質（標識）を結合した標識結合体を用いる。標識としては、ラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質、有色又は着色粒子などがある。肉眼での色調観察、色差計を用いた色濃度の測定、発光強度や蛍光強度の測定などが可能であるが、特別な装置を使用せずに肉眼によって結果を知るためには、発色基質との反応によって着色を得ることのできる酵素やそのまま着色が観察できる有色又は着色粒子による標識が好ましい。
【００５６】
酵素としては、アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ等があり、例えば石川栄治らの「酵素免疫測定法第３版（医学書院、１９８７年）」に記載されるような公知の方法により標識結合体を調製することができる。また、それぞれの酵素に対応する発色基質も公知のものが使用でき、場合によっては第二の部材の構成部品に含浸させておくこともできるし、あるいは後から添加することもできる。また、発色反応の前に多孔性メンブレンやクロマトグラフィー用基材中に残留する酵素結合体を除くために洗浄液などを添加することもできる。
【００５７】
有色又は着色粒子としては金、銀、白金、プラチナ、銅のような金属コロイド、酸化鉄のような金属酸化物コロイド、硫黄、セレン、テルルなどの非金属コロイド、顔料粒子、ラテックス粒子を染色したもの、リポソームなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。有色又は着色粒子が毛管現象によりクロマトグラフィー用基材を移動したり濾過用メンブレンを通過するためには、粒子径が毛管より小さい必要があり、平均粒径は１μｍ以下、とくに０．５μｍ以下であることが好ましい。有色又は着色粒子に分析対象物質あるいは分析対象物質と生物学的親和性により結合する物質を結合するには、物理吸着や化学結合などの公知の方法が使用できる。例えば、金コロイドに抗体を結合した金コロイド標識抗体は、金コロイド溶液に抗体を加えて物理吸着させた後、牛血清アルブミン溶液を添加して金コロイドの抗体未結合表面をブロックすることにより調製される。
【００５８】
標識結合体は、第二の部材の構成部品に含まれる試薬としてクロマトグラフィー用基材や多孔性メンブレンに塗布・乾燥等により配置させることもできるし、標識結合体液として後から添加することもできる。また、前記展開液に加えて使用することもでき、標識結合体液を別に単独で用意するより、展開液に加えて用いる方が好ましい。標識結合体を塗布・乾燥等により配置する場合、分析対象物質あるいは分析対象物質と生物学的親和性により結合する物質を固定化したクロマトグラフィー用基材や多孔性メンブレンに含浸又は塗布・乾燥により配置させても良いし、別途作成した標識結合体含有物をクロマトグラフィー用基材や多孔性メンブレンに毛細管で繋がるようにして配置しても良い。また、液体試料や展開液などにふれたときの再溶解性を好くするために、あらかじめサッカロース、マルトース、ラクトース等の糖類、マンニトール等の糖アルコールをクロマトグラフィー用基材又は多孔性メンブレンにコーティングしておくことも可能である。標識結合体を配置するためには、マイクロシリンジ、調節ポンプ付きペン、シルクスクリーン印刷、グラビア印刷、転写プリント、インキ噴射印刷等いろいろな印刷技術が使用可能である。
【００５９】
なお、分析対象物質が酵素や酵素活性物質である場合には、標識結合体を必要としない場合がある。例えば、ヘモグロビンはペルオキシダーゼ活性を有しており、酵素活性を阻害しない固定化された抗ヘモグロビン抗体に捕獲されたヘモグロビンは、ジアミノベンジジンやテトラメチルベンジジン等と過酸化水素よりなる発色液を使用して検出できる。本発明のアッセイ装置はこのような場合に使用するものも含まれる。
【００６０】
本発明のアッセイ装置には、測定操作が完全に行われたことを確認するための公知の機能を付与することができる。例えば、標識抗体がマウス抗体の場合にクロマトグラフィー用基材上の分析対象物質を検出する部位の下流に抗マウス抗体を固定化しておくと、操作が完全に行われた場合には、その部分に信号を得られる。また、溶液が展開する末端の部位あるいは吸収されて濡れた先端の部分に水と接触すると発色が出る無水金属塩などを含浸させておくと、測定操作完了時に発色が観察できる。
【００６１】
本発明のアッセイ装置は尿や静脈より採取した血液、血清、血漿等を試料としても使用できるが、特に有用なのは微量にしか採取できない乳頭分泌液や皮膚を刺棘して得られる微量の血液、皮膚からの浸出液等である。中でも近年乳癌は増加傾向にあり、触診などでも判らない場合もあり、簡便なスクリーニング方法が求められていた。乳癌では乳頭からの異常な分泌液が観察される場合があり、乳頭分泌液中のＣＥＡ（癌胎児性抗原）やＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原等が増加することが知られている。また、良性疾患でも乳頭分泌液が観察される場合があるが、乳癌の場合には血性である場合が多く、ヘモグロビンにより血性の有無が判定できる。本発明のアッセイ装置およびアッセイ方法は乳頭分泌液中のＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原、ヘモグロビンの検出に対して特に有用である。
【００６２】
本発明のアッセイ装置を用いる場合、第一の部材の平面、溝、くぼみまたは穴等の構造を有するかもしくは吸水性材料からなる試料採取部分を試料に直接接触させるだけで一定量の試料を採取でき、試料を採取した後第一の部材を第二の部材に組み込み、必要により展開液等を添加するだけで、試料中の分析対象物質の検出を容易に行なうことができ、本発明のアッセイ装置は極めて簡易なアッセイ装置である。特に、今までは簡易な装置で行なうことが非常に難しかった微量にしか採取できない試料の分析を、本発明の簡易なアッセイ装置を用いることにより容易に実施することができる。
【００６３】
以下に、具体的な簡易アッセイ装置の例を図によって説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６４】
図１はクロマト法による簡易アッセイ装置の一例の概略図である。簡易アッセイ装置は、試料採取部分として半円形の溝を有するプラスチック成形体１からなる第一の部材と構成部品をプラスチック製ケース２に納めた第二の部材からなる。プラスチック製ケース２は展開液添加口３、第１の部材を組み込み試料を添加する試料添加口４および判定窓５を有する。図２は図１で示した簡易アッセイ装置の第２の部材の側断面図である。クロマト用ストリップ６は両面テープ７でケース２に接着されている。クロマト用ストリップ６の最上流で展開液添加口３の直下と、最下流の位置には吸水用部品８、９を置き、ケースによって固定されている。クロマト用ストリップ６は判定窓５の直下に抗体を固定化した部位を有し、さらに展開液添加口３の下流で試料添加口４の上流の位置に金コロイド粒子標識抗体添着部１０を有する。試料を採取した第一の部材を試料添加口４に組み込むと、試料はクロマト用ストリップ６に吸収される。展開液添加口３から添加された展開液により金コロイド粒子標識抗体と試料がクロマトされる。試料に分析対象物質が含まれる場合、金コロイドの着色が判定窓５より観察できる。
【００６５】
図３はクロマト法による簡易アッセイ装置の別の一例の概略図である。第一の部材はプラスチック製の持ち手部分１１に吸水性材料１２からなる試料採取部分が接着されている。第二の部材は展開液添加口１４、第一の部材を組み込み試料を添加する試料添加口１５および判定窓１６を有するプラスチック製ケース１３に構成部品が納められている。図４は図３で示した簡易アッセイ装置の第二の部材の側断面図である。抗体固定化ストリップ１７と金コロイド粒子標識抗体ストリップ１８は両面テープ１１０でケース１３に接着されている。金コロイド粒子標識抗体ストリップの最上流で展開液添加口１４の直下と、抗体固定化ストリップの最下流の位置には吸水用部品１１１、１１２が置かれ、ケースによって固定されている。抗体固定化ストリップ１７は判定窓１６の直下に抗体を固定化した部位を有し、金コロイド粒子標識抗体ストリップ１８は展開液添加口１４の下流で試料添加口１５の上流の位置に金コロイド粒子標識抗体添着部１９を有する。金コロイド粒子標識抗体ストリップ１８と抗体固定化ストリップ１７は第一の部材が組み込まれた時、その吸水性材料１２がそれらと一部分重なって毛管で繋がるように分離して配置されている。試料を採取した第一の部材を試料添加口１５に組み込み、展開液添加口１４より展開液を添加すると、試料中に分析対象物質が存在する場合は、金コロイドの着色が判定窓１６より観察できる。
【００６６】
図５もクロマト法による簡易アッセイ装置の一例の概略図である。第一の部材は中空のプラスチック材料２１に吸水性材料２２を固定し、展開液添加口２１０を有する。第二の部材は第一の部材を組み込む試料添加口２４と判定窓２５を有するプラスチック製ケース２３に構成部品が納められている。図６は図５で示した簡易アッセイ装置の側断面図である。抗体固定化ストリップ２６は両面テープ２７でケース２３に固定されている。抗体固定化ストリップの最上流と最下流には吸水用部品２８、２９がケースによって固定されている。抗体固定化ストリップ２６は判定窓２５の直下に抗体を固定化した部分を有する。試料を採取した第一の部材は第二の部材の試料添加口２４に組み込まれる。金コロイド粒子標識抗体を含む展開液を第一の部材の展開液添加口２１０より添加すると、展開液とともに試料はクロマトされ、試料中に分析対象物質が含まれる場合は金コロイドの着色が判定窓２５より観察できる。
【００６７】
図７はフロースルー法による簡易アッセイ装置の一例の概略図である。第一の部材はシリンダー状のプラスチック成形体３１に円形の濾紙３２がはめ込まれている。第二の部材は第一の部材を組み込む開口部３３および空気抜き穴３６を有する。図８は図７で示した簡易アッセイ装置の側断面図である。第二の部材はプラスチック成形体３４に抗体固定化メンブレン３５を抗体が固定化された部分がプラスチック成形体の開口部３３の中心にくるように挿入し、さらに厚手の濾紙を重ねて作製した吸水用部品３７を挿入し、プラスチック成形体３４の開口部３３と抗体固定化メンブレン３５および抗体固定化メンブレン３５と吸水用部品３７が完全に密着し、展開液を開口部から添加しても周りに漏れずに抗体固定化メンブレン３５を通過して吸水用部品３７に吸収されるように下から蓋３８がしてある。試料を採取した第一の部材を開口部３３に組み込み、濾紙３２と抗体固定化メンブレン３５を密着させる。金コロイド粒子標識抗体を含む展開液標識抗体を第一の部材の展開液添加口３９から添加する。展開液を完全に吸収させた後、さらに洗浄液を加えて吸収させる。その後、第一の部材を取り除くと、試料中に分析対象物質が含まれる場合、抗体固定化メンブレン３５の抗体固定化部位に金コロイドの着色が観察できる。
【００６８】
図９はフロースルー法による簡易アッセイ装置の別の一例の概略図である。抗体固定化メンブレン４２を抗体を固定化した部分を中心に円形に切り抜いてシリンダー状のプラスチック成形体４１に固定し第一の部材とする。第二の部材は第一の部材を組み込む開口部４３および空気抜き穴４４を有する。図１０は図９で示した簡易アッセイ装置の第一および第二の部材の側断面図である。第一の部材はプラスチック成形体４５に厚手の濾紙を重ねて作製した吸水用部品４６を挿入し、プラスチック成形体４５の開口部に吸水用部品４６が完全に密着するように下から蓋４７がしてある。試料を採取した第一の部材を第二の部材に組み込み、抗体固定化メンブレン４２を吸水用部品４６に密着させる。金コロイド粒子標識抗体を含む展開液を第一の部材の開口部４８から添加し、展開液が完全に吸収されるまで待つ。さらに洗浄液を添加し吸収させる。試料に分析対象物が含まれる場合、抗体固定化部位に着色が観察できる。
【００６９】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７０】
実施例１クロマト法に用いる採取装置（第一の部材）の作製と試料採取量の測定
（１）プラスチック成形体による採取装置の作製
図１の１に示すように、先端が厚さ２ｍｍ、幅３ｍｍで半径１ｍｍの半円柱の溝を彫り込んだプラスチック成形体を作製し、採取装置とした。
（２）濾紙による採取装置の作製１
図３に示すように、東洋濾紙社製の濾紙Ｎｏ．５０を４×６ｍｍの長方形にカットし（図中の１２）、４×６ｍｍの底面有するプラスチック成形体１１の底面に両面テープで貼り付け、採取装置とした。
（３）濾紙による採取装置の作製２
図５および図６に示すように、ワットマン社製の濾紙３１ＥＴＣｈｒを４×６ｍｍの長方形にカットし（図中の２２）、外形６×８ｍｍのプラスチック成形体（高さは１０ｍｍ）２１に接着し、採取装置とした。
【００７１】
（４）試料採取量の測定
７％ＢＳＡ水溶液をパラフィルム上に滴下して液滴とし、試料採取装置（第一の部材）の試料採取部分を液滴に接触させた。接触させる前の重量と接触後の重量を測定し、その差から試料採取量を求めた。測定は１０回繰り返し再現性を求めた。なお（２）および（３）の採取装置では接触後の重量を量る前に濾紙に軽く押しつけ、余分な液を吸い取った。結果を表１に示す。使用した採取装置で採取量は異なるが、各採取装置とも良好な再現性が得られた。
【００７２】
【表１】

【００７３】
実施例２クロマト法によるＣＥＡ標準液および乳頭分泌液中ＣＥＡの測定１
（１）金コロイドの調製
濃度０．０１重量％の塩化金酸水溶液２００ｍｌを沸騰させ、これに濃度１重量％のクエン酸ナトリウム水溶液３ｍｌを加え、溶液の色が赤色に変わるまで加熱沸騰を行い、平均粒径２５ｎｍの金コロイド分散液を調製した。
【００７４】
（２）金コロイド粒子標識抗体の調製
上記の金コロイド分散液１０ｍｌに０．１Ｍ塩酸−炭酸カリウム緩衝液ｐＨ９．０を０．５ｍｌ加えてｐＨを調整し、これにウサギ抗ヒトＣＥＡ抗体を、金コロイド分散液１ｍｌあたり３０μｇとなるように加えて室温で１時間緩やかに振とうした。その後、その１０ｍｌに８重量％ＢＳＡを含む２ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ９．０を１．５ｍｌ加え、室温で３０分間緩やかに振とうした。さらに、この分散液を４℃で１０，０００ｒｐｍ１時間遠心して上清を除いた後、得られたペレットに濃度１重量％のＢＳＡを含む２ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．６を１０ｍｌ加えて再懸濁した。同様にして遠心操作をさらに２回繰り返した後、上記トリス−塩酸緩衝液にてＯＤ（５２０ｎｍ）＝２０になるように再懸濁して金コロイド粒子標識抗体を調製した。
【００７５】
（３）クロマト用ストリップの作製
５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２に溶解したマウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体（濃度１．２ｍｇ／ｍｌ）を５×５０ｍｍに切断したミリポア社製ニトロセルロースメンブレン（ハイフローメンブレン、マイラーバック）の図１で示す検出部位５に相当する位置に幅１ｍｍのライン状に添着し風乾した。その後、濃度５重量％カゼインを含む５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２に室温で２時間浸漬し、再び風乾した。さらに図２の１０の位置に相当する部位に５重量％のサッカロースを添加した（２）で調製した金コロイド粒子標識抗体液を５μｌずつ、乾燥させながら２回添着し、クロマト用ストリップを作製した。
【００７６】
（４）クロマト装置（第二の部材）の作製
第二の部材は図１に示すように、展開液添加口３、第一の部材を組み込み試料を添加する試料添加口４および判定窓５を有するポリエチレン製ケース２にその構成部品を納めて作製した。図２示すように、上記（３）で作製したクロマト用ストリップ６のマイラーバックの面を両面テープ７でケース２に接着し、その両端（展開液添加口３の直下と最下流の位置）に、ワットマン社製ガラス繊維濾紙ＧＦ／Ｄ５×８ｍｍを吸水用部品８，９として置き、ポリエチレン製ケースにより吸水用部品をクロマト用ストリップの上に固定しクロマト装置とした。
【００７７】
（５）測定
標準液として濃度０、２００、４００、１０００、３０００ｎｇ／ｍｌのＣＥＡと濃度１重量％のＢＳＡを含む５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２及び乳癌患者の乳頭分泌液をパラフィルム上に滴下して液滴とし、実施例１の（１）で示した採取装置（第一の部材）を用いて採取した。採取装置をクロマト装置（第二の部材）の試料添加口４に組み入れ、展開液として５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２を１００μｌ展開液添加口３から吸水用部品８の上に添加し、１０分後に判定を行った。結果は表２に示す。標準液のＣＥＡ濃度４００nｇ／ｍｌ以上で判定窓の中に金コロイドによる赤色のバンドが観察された。既知濃度の乳頭分泌液でもそれに対応する濃度で陽性・陰性が判定された。また、ＣＥＡ標準液を用いて５回測定し再現性を試験したが、表３に示すように良好な結果であった。
【００７８】
実施例３クロマト法によるＣＥＡ標準液および乳頭分泌液中ＣＥＡの測定２
（１）抗体固定化ストリップの作製
５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２に溶解したマウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体（濃度１．２ｍｇ／ｍｌ）を５×２６ｍｍに切断したミリポア社製ニトロセルロースメンブレン（ハイフローメンブレン、マイラーバック）の図３で示す検出部位１６に相当する位置に幅１ｍｍのライン状に添着し風乾した。その後、濃度５重量％カゼインを含む５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２に室温で２時間浸漬し、再び風乾して抗体固定化ストリップを作製した。
【００７９】
（２）金コロイド粒子標識抗体ストリップの作製
東洋濾紙社製の濾紙Ｎｏ．５０を５×２０ｍｍの大きさに切断し、濃度５重量％カゼインを含む５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２に室温で２時間浸漬したのち乾燥させた。さらに、図４の１９の位置に相当する部位に５重量％のサッカロースを添加した実施例２の（２）で調製した金コロイド粒子標識抗体液を５μｌずつ、乾燥させながら２回添着し、金コロイド粒子標識抗体ストリップを作製した
【００８０】
（３）クロマト装置（第二の部材）の作製
第二の部材は図３に示すように、展開液添加口１４、第一の部材を組み込み試料を添加する試料添加口１５および判定窓１６を有するポリエチレン製ケース１３にその構成部品を納めて作製した。図４に示すように、上記（１）で作製した抗体固定化ストリップ１７（マイラーバックの面）および（２）で作製した金コロイド粒子標識抗体ストリップ１８を両面テープ１１０でケース１３に接着し、実施例２と同様に展開液添加口１４の直下と最下流の位置に、ワットマン社製ガラス繊維濾紙ＧＦ／Ｄ５×８ｍｍを吸水用部品１１１，１１２として置き、ポリエチレン製ケースにより吸水用部品を抗体固定化ストリップおよび金コロイド粒子標識抗体ストリップの上に固定しクロマト装置とした。
【００８１】
（４）測定
標準液として濃度０、２００、４００、１０００、３０００ｎｇ／ｍｌのＣＥＡと濃度１重量％のＢＳＡを含む５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２及び乳癌患者の乳頭分泌液をパラフィルム上に滴下して液滴とし、実施例１の（２）で示した採取装置（第一の部材）の採取部分１２を接触させて採取した。軽く濾紙に押しつけて余分の水分を除いたのち、採取装置をクロマト装置（第二の部材）の試料添加口１５に組み入れ、採取装置の試料採取部分１２をクロマト装置のストリップ１７，１８とを密着させた。その後、展開液として５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２を１００μｌ展開液添加口１４から吸水用部品１１１の上に添加し、１０分後に判定を行った。結果は表２に示す。標準液のＣＥＡ濃度４００ｎｇ／ｍｌ以上で判定窓の中に金コロイドによる赤色のバンドが観察された。既知濃度の乳頭分泌液でもそれに対応する濃度で陽性・陰性が判定された。
【００８２】
【表２】

【００８３】
【表３】

【００８４】
実施例４クロマト法によるＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原の測定
（１）金コロイド粒子標識抗体を含む展開液の調製
実施例２の（１）の金コロイド分散液１０ｍｌに０．１Ｍ塩酸−炭酸カリウム緩衝液ｐＨ９．０を０．５ｍｌ加えてｐＨを調整し、これにマウス抗ＮＣＣ−ＳＴ−４３９モノクローナル抗体を、金コロイド分散液１ｍｌあたり４０μｇとなるように加えて室温で１時間緩やかに振とうした。その後、その１０ｍｌに８重量％ＢＳＡを含む２ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ９．０を１．５ｍｌ加え、室温で３０分間緩やかに振とうした。さらに、この分散液を４℃で１０，０００ｒｐｍ１時間遠心して上清を除いた後、得られたペレットに濃度１重量％のＢＳＡを含む２ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．６を１０ｍｌ加えて再懸濁した。同様にして遠心操作をさらに２回繰り返した後、上記トリス−塩酸緩衝液にてＯＤ（５２０ｎｍ）＝２０になるように再懸濁し、さらにＯＤ（５２０ｎｍ）＝５になるように５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２で希釈し、金コロイド粒子標識抗体を含む展開液を調製した。
【００８５】
（２）抗体固定化ストリップの作製
５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２に溶解したマウス抗ＮＣＣ−ＳＴ−４３９モノクローナル抗体（濃度５ｍｇ／ｍｌ）を５×３０ｍｍに切断したミリポア社製ニトロセルロースメンブレン（ハイフローメンブレン、マイラーバック）の図５で示す検出部位２５に相当する位置に幅１ｍｍのライン状に添着し風乾した。その後、濃度５重量％カゼインを含む５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２に室温で２時間浸漬し、再び風乾して抗体固定化ストリップを作製した。
【００８６】
（３）クロマト装置（第二の部材）の作製
図５で示すように、第一の部材を組み込み試料を添加する試料添加口２４および判定窓２５の２か所に開口部を持つプラスチックケース２３にその構成部品を納めて作製した。図６示すように、上記（２）で作製した抗体固定化ストリップ２６のマイラーバックの面を両面テープ２７でケース２３に接着し、その両端に、ワットマン社製ガラス繊維濾紙ＧＦ／Ｄ５×８ｍｍを吸水用部品２８，２９として置き、ポリエチレン製ケースにより吸水用部品を抗体固定化メンブレンの上に固定しクロマト装置とした。
【００８７】
（４）測定
ＮＣＣ−ＳＴ−４３９抗原濃度が既知の乳癌患者の乳頭分泌液をパラフィルム上に滴下して液滴とし、実施例１の（３）で示した採取装置（第一の部材）の採取部分２２を接触させて採取した。軽く濾紙に押しつけて余分の水分を除いたのち、採取装置をクロマト装置（第二の部材）の試料添加口２４に組み入れ、採取装置の試料採取部分とクロマト装置の吸水用部品２８を密着させた。５０ｍＭリン酸生理食塩水ｐＨ７．２からなる展開液を採取装置（第一の部材）の展開液添加口２１０から採取装置の試料採取部分に５０μｌ添加し、完全に吸収された後に、更に金コロイド粒子標識抗体を含む展開液を１００μｌ添加し、１０分後に判定を行った。結果は表４に示す。既知濃度の乳頭分泌液で濃度に対応して陽性・陰性が判定された。
【００８８】
【表４】

【００８９】
実施例５フロースルー法による乳頭分泌液中のヘモグロビンの測定
（１）採取装置（第一の部材）の作製
図７および図８に示すように、シリンダー状のプラスチック成形体３１に直径５．０ｍｍの円形に切り抜いたワットマン社製濾紙１７Ｃｈｒ（図中の３２）をはめ込み、採取装置とした。
【００９０】
（２）抗体固定化メンブレンの作製
濃度８ｍｇ／ｍｌのマウス抗ヒトヘモグロビン抗体を含む５０ｍＭのリン酸生理食塩水ｐＨ７．２をポール社製イムノダインイムノアフィニティーメンブレン（３μｍ）に０．５μｌドットし風乾した。その後メンブレンを濃度２．５重量％のカゼインナトリウムと濃度８重量％のサッカロースを含む５０ｍＭのリン酸生理食塩水ｐＨ７．２に室温２時間漬けた後、濾紙上にメンブレンを取り出し水分を吸い取り、乾燥して抗体固定化メンブレンを作製した。
【００９１】
（３）フロースルー装置（第二の部材）の作製
図７および図８に示すように、採取装置を取り付ける開口部３３と空気穴３６のあるプラスチック成形体３４に（２）で作製したメンブレン３５をメンブレンの抗体がドットされた部分がプラスチック成形体の開口部３３の中心にくるように挿入し、さらに厚手の濾紙を重ねて作製した吸水用部品３７を重ねて挿入し、プラスチック成形体の開口部とメンブレンおよびメンブレンと吸水用部品が完全に密着し、展開液を開口部から添加しても周りに漏れずにメンブレンを通過して吸水用部品に吸収されるように下から蓋３８をしてフロースルー装置とした。
【００９２】
（４）展開液の調製
０．１Ｍの尿素および濃度０．１重量％のツイーン２０を含む５０ｍＭのリン酸生理食塩水ｐＨ７．２を展開液とした。
【００９３】
（５）発色液の調製
濃度３ｍｇ／ｍｌになるようにテトラメチルベンジジンをジメチルホルムアミドに溶解し、その４ｍｌを９６ｍｌの０．０１２６重量％の過酸化水素を含む０．１Ｍ酢酸ナトリウムクエン酸緩衝液ｐＨ６．０に加えて良く混合し、発色液とした。
【００９４】
（６）測定
ヘモグロビンの有無が既知である乳癌患者の乳頭分泌液をパラフィルム上に滴下して液滴とし、採取装置の採取部分３２を接触させて採取した。軽く濾紙に押しつけて余分の水分を除いたのち、フロースルー装置の開口部３３に挿入して試料採取部分３２を抗体固定化メンブレン３５に押しつけた。その後、展開液を２００μｌ採取装置の開口部３９から添加し完全に展開液が吸収されるまで待った。これを３回繰り返した後、採取装置を取り外し、メンブレンの抗体をドットした部分に発色液を２００μｌ滴下して、３分後にメンブレンの着色を観察した。結果を表５に示す。ヘモグロビン陽性検体Ｉ、Ｊでは着色が観察されたが、陰性検体Ｋでは着色が観察されなかった。
【００９５】
【表５】

【００９６】
実施例６フロースルー法によるＣＥＡ標準液の測定
（１）抗体固定化メンブレンの作製
濃度２．４ｍｇ／ｍｌのマウス抗ＣＥＡ抗体を含む５０ｍＭのリン酸生理食塩水ｐＨ７．２をポール社製イムノダインイムノアフィニティーメンブレン（３μｍ）に０．５μｌドットし風乾した。その後メンブレンを濃度２．５重量％のカゼインナトリウムと濃度８重量％のサッカロースを含む５０ｍＭのリン酸生理食塩水ｐＨ７．２に室温２時間漬けた後、濾紙上にメンブレンを取り出し水分を吸い取り、乾燥して抗体固定化メンブレンを作製した。
【００９７】
（２）採取装置（第一の部材）の作製
図９および図１０に示すように、シリンダー状のプラスチック成形体４１に（１）で作製した抗体固定化メンブレンの抗体をドットした部分を中心に直径１ｃｍの円形に切り抜いたもの４２を接着剤で貼り付け、採取装置とした。
【００９８】
（３）第二の部材の作製
図９および図１０に示すように、採取装置を取り付ける開口部４３と空気穴４４のあるプラスチック成形体４５に厚手の濾紙を重ねて作製した吸水用部品４６を挿入し、プラスチック成形体の開口部に吸水用部品が完全に密着するように下から蓋４７をしてフロースルー装置とした。
【００９９】
（３）西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡ抗体液
東洋紡社製西洋ワサビペルオキシダーゼ２ｍｇを０．５ｍｌの蒸留水に溶解し、５０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム０．１ｍｌを加えて攪拌しながら室温で３０分間反応した。さらに２００ｍＭエチレングリコール０．１ｍｌを加えて３０分間反応した。反応液を１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に対して４℃で一夜透析した。４ｍｇのウサギ抗ＣＥＡ抗体を２００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）１ｍｌに溶解し、透析後の西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液を加えて、室温で攪拌しながら３時間反応させた。２００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．１ｍｌ加え、室温で撹拌しながら１時間反応した。５０ｍＭリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）を溶出液として、ウルトロゲルＡｃＡ４４を充填したゲル濾過カラム（２．６ｃｍ×９０ｃｍ）で分画し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡ抗体を得た。これを濃度１重量％の牛血清アルブミンを含む５０ｍＭのリン酸生理食塩水ｐＨ７．２に抗体濃度として０．５μｇ／ｍｌになるように希釈して、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡ抗体液とした。
【０１００】
（４）洗浄液および発色液の調製
実施例５と同一の展開液および発色液を洗浄液および発色液として使用した。
【０１０１】
（５）測定
ＣＥＡ標準液をパラフィルム上に滴下して液滴とし、採取装置の採取部分を接触させて採取した。軽く濾紙に押しつけて余分の水分を除いたのち、第二の部材の開口部に挿入して第二の部材の吸水用部品に押しつけた。その後西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡ抗体液を２００μｌ採取装置の開口部４８から添加し、完全に標識抗体液が吸収されるまで待った。その後、洗浄液を２００μｌ添加して再び完全に吸収されるまで待った。この洗浄操作を３回繰り返した後、発色液を２００μｌ滴下して、３分後にメンブレンの着色を観察した。結果を表６に示す。ＣＥＡ濃度２００ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で着色が観察された。
【０１０２】
【表６】

【０１０３】
【発明の効果】
本発明によれば、使用者は熟練や手間をほとんど必要とせずに、微量にしか採取できない生体試料中の分析対象物質を簡便に採取して再現性よく測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２で示したクロマト法による簡易アッセイ装置の概略図
【図２】図１で示した簡易アッセイ装置の第二の部材の側断面図
【図３】実施例３で示したクロマト法による簡易アッセイ装置の概略図
【図４】図３で示した簡易アッセイ装置の第二の部材の側断面図
【図５】実施例４で示したクロマト法による簡易アッセイ装置の概略図
【図６】図５で示した簡易アッセイ装置の第二の部材の側断面図
【図７】実施例５で示したフロースルー法による簡易アッセイ装置の概略図
【図８】図７で示した簡易アッセイ装置の第一および第二の部材の側断面図
【図９】実施例６で示したフロースルー法による簡易アッセイ装置の概略図
【図１０】図９で示した簡易アッセイ装置の第一および第二の部材の側断面図[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention can easily collect a liquid sample, particularly a small amount of a liquid biological sample, and can measure a specific substance (analyte) in the sample in a short time using biological affinity. The present invention relates to an assay device and a measurement method using the same.
[0002]
[Prior art]
In recent years, in the field of clinical diagnosis, simple assay devices based on the measurement principle of an immune reaction that are suitable for use in homes, clinics, clinics, etc. and require little user skill and effort have become widespread.
[0003]
One of the forms is a chromatographic assay device (disclosed in JP-B-7-18876, JP-B-7-78503, JP-B-7-36017, JP-B-6-27738, JP-A-1-244370, etc.). ). For example, as a typical example of a sandwich format, an antibody that specifically reacts with an analyte is immobilized on a part of a porous sheet-like strip through which liquid can move by capillary action. A chromatographic method in which an antibody specific to the analyte (labeled antibody) labeled with colored particles such as colloidal gold or the like is placed upstream (disposed by coating, drying, etc.) without being immobilized on the strip. There is an assay device, and when a liquid sample is added from upstream of the labeled antibody, the sample penetrates through the capillary in the strip to permeate and dissolve the labeled antibody, and further passes through the site where the strip antibody is immobilized together with the labeled antibody. If the analyte is present in the sample, it reacts with the dissolved labeled antibody and is then immobilized on the strip. The antibodies - are captured as "analyte-labeled antibody" complex. Since the unreacted labeled antibody moves downstream, coloration by colloidal gold is observed only in the portion where the antibody is immobilized on the strip only when the analyte is present.
[0004]
Another form is a flow-through assay device (disclosed in JP-B-7-34016, JP-B-7-1113637, JP-A-3-118473, JP-A-1-24768, etc.). This device is composed of a porous membrane having a capillary through which an antibody that reacts specifically with the analyte is immobilized and through which a liquid can pass, and a water-absorbing component in which the capillary is in contact with the lower surface of the membrane. The When a liquid sample is added from the upper surface of the membrane, it passes through the membrane and is absorbed by the water-absorbing parts. At that time, if the analyte is present in the sample, the analyte is placed on the antibody immobilized on the membrane. Be captured. Then, an antibody specific to the analyte to be labeled with an enzyme such as horseradish (labeled antibody) is added and reacted with the analyte to be captured on the antibody immobilized on the membrane to form a sandwich complex. . Furthermore, after the unreacted labeled antibody in the capillary tube of the membrane is absorbed by the water-absorbing parts with the washing solution, coloring is observed in the part where the antibody is immobilized on the membrane by adding a substrate solution that develops color with the labeled enzyme. Is done.
[0005]
By the way, when a diagnosis is performed by measuring a substance in a liquid biological sample, the determination is made based on whether the substance is above a certain concentration or below a certain concentration. On the other hand, the determination using these simple assay devices is performed based on whether or not coloring is observed on the strip or the membrane. Whether or not coloring is observed is determined by the absolute amount of the analyte in the added sample. Determined. Therefore, in order to make an accurate determination corresponding to the concentration of the substance to be analyzed in the biological sample, it is necessary to accurately add a sample of a certain liquid amount to the apparatus using a dropper or a pipette. In the case of the chromatographic method, the antibody can be fixed without adjusting the sample volume by adjusting the area of the strip downstream from the part where the antibody is immobilized, or by attaching a water absorption member to the end of the strip. Although the amount of sample liquid that passes through the section can be adjusted to some extent, a relatively large amount of sample sufficient to wet the strip and attached absorbent member must be added.
[0006]
However, only a very small amount of abnormal nipple discharge fluid seen in breast cancer, exudate from the skin, or blood obtained by directly piercing the fingertip can be collected. For this reason, the user must carefully handle the sample using a special tool such as a capillary, and it takes skill to handle an accurate amount. Therefore, it has been difficult to apply these samples to the conventional simple assay device.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a simple assay device that allows a user to collect and test a certain amount of sample simply and accurately without paying special attention. Another object of the present invention is to provide an assay method using such a simple assay device.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention have completed the present invention as a result of intensive studies to solve the above problems. That is, the present invention
[0009]
(1) An assay device based on a chromatographic method or a flow-through method using biological affinity, wherein a first member capable of collecting a certain amount of liquid sample by contacting the liquid sample, and the sample An assay device comprising a second member capable of receiving a sample by incorporating the collected first member, wherein the first member and the second member are not connected by a capillary when the sample is collected;
[0010]
(2) The assay device according to (1), wherein the amount of the liquid sample collected by the first member is 50 μl or less,
(3) The assay device according to (1) or (2) above, wherein the first member has a plane, groove, indentation or hole structure for collecting and holding a liquid sample,
[0011]
(4) The assay device according to (1) or (2), wherein the first member has a water-absorbing material for collecting a liquid sample by absorption as a component.
(5) The assay device according to (4) above, wherein the water-absorbing material is any one of a fiber matrix, a porous membrane, a filter paper, a glass fiber filter paper, and a sintered body,
(6) The assay device according to (4), wherein the water-absorbing material is filter paper,
[0012]
(7) An assay device based on a chromatographic method, wherein the second member is a chromatographic substrate having at least a substance to be analyzed or a part to which a substance that binds to the substance to be analyzed with biological affinity is immobilized. And the first member is incorporated into the second member, so that the substance to be analyzed or the substance that binds to the substance to be analyzed with biological affinity is immobilized on the chromatography substrate or upstream thereof. The sample can be permeated into the chromatographic base material, and the analyte is measured by moving the permeated sample downstream in the chromatographic base material by capillary action (1) ) To the assay device according to any one of (6),
[0013]
(8) An assay device based on a chromatographic method, wherein a sample is moved through a chromatography base material to a site upstream of a site where the first member is incorporated on the chromatography base material of the second member. The assay device according to (7) above, wherein a site for adding a developing solution for
[0014]
(9) An assay device based on a chromatographic method, wherein the chromatographic base material of the second member has a site to which an analyte or a substance that binds to the analyte with biological affinity is immobilized. It is divided into at least two parts, part (A) and part (B) to which the developing solution is added, and part (A) and part (B) are not connected by a capillary until the first member is assembled. The assay device according to (7) or (8) above, wherein the liquid cannot be moved but the liquid can be moved by incorporating the first member,
[0015]
(10) An assay device based on a chromatographic method, wherein a developing solution for moving a sample in the chromatography base material of the second member is added via the first member incorporated in the second member. The assay device according to (7) above,
[0016]
(11) An assay device based on a flow-through method, wherein the second member is in contact with a porous membrane on which at least a substance to be analyzed or a substance that binds to the substance to be analyzed with biological affinity is fixed and its lower surface. By incorporating the first member into the second member, the sample can permeate into the membrane from the upper surface of the membrane and pass through the membrane by capillarity to be absorbed by the water absorbing component. The assay device according to any one of (1) to (6), wherein the analyte is measured by
[0017]
(12) An assay device based on a flow-through method, wherein the second member has at least a water-absorbing component, and the first member is an analyte or a substance that binds to the analyte with biological affinity. The porous membrane of the first member is connected to the water-absorbing component of the second member by a capillary tube by incorporating the fixed porous membrane as a component and incorporating the first member into the second member (1 ) To the assay device according to any one of (6),
[0018]
(13) The chromatographic base material or porous membrane for immobilizing the analysis target substance or the substance that binds to the analysis target substance with biological affinity is selected from any of nitrocellulose membrane, nylon membrane, filter paper, and glass fiber filter paper. The assay device according to any one of (7) to (12),
(14) The assay device according to any one of (1) to (13), wherein the biological affinity is affinity based on an immune reaction,
[0019]
(15) The substance immobilized on the chromatographic substrate or porous membrane is an antibody or antibody fragment, and the labeled antibody is used as a substance (labeled conjugate) bound with a label for obtaining a signal. The assay device according to any one of (7) to (14) above, wherein a signal is obtained by forming a sandwich complex on a substrate or a porous membrane,
(16) The label for obtaining a signal is a metal colloid, a nonmetal colloid, or a colored latex particle, and the detection of the analyte substance in the sample or the concentration measurement thereof can be performed visually or with a color difference meter (15 ) Assay device according to
[0020]
(17) A method for measuring a substance to be analyzed in a liquid sample using the assay device according to any one of (1) to (16) above,
(18) The method according to (17) above, wherein a developing solution prepared separately from the sample is used in order to develop the sample in the chromatographic base material or pass through the porous membrane and absorb the water absorption component.
[0021]
(19) The method according to (18) above, wherein the developing solution is a solution containing a labeling substance,
(20) The method according to any one of (17) to (19) above, wherein the sample is nipple secretion, skin exudate, or blood,
(21) The method according to any one of (17) to (20) above, wherein the substance to be analyzed is any one of CEA, NCC-ST-439, and hemoglobin in the nipple secretion.
(22) The assay device according to any one of (1) to (16) above for breast cancer screening,
About.
[0022]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, an assay device based on a chromatographic method is a method in which a sample is moved by capillary action in a chromatographic substrate in which a substance to be analyzed or a substance that binds to the substance to be analyzed is immobilized at a specific site. This is a device for assaying a sample by detecting capture at a specific site of a substance to be analyzed, a substance capable of binding to this substance or a labeled substance or a substance to be labeled. This detection can be performed directly at the specific site, but in some cases, it can also be performed downstream thereof.
An assay device based on the flow-through method allows the sample to pass from the upper surface to the lower surface of the porous membrane on which the analysis target substance or the substance that binds to the analysis target is immobilized, and the analysis target substance and label in the sample are passed. This refers to an apparatus for assaying a sample by detecting capture of a substance capable of binding to the attached substance or a labeled analyte substance on the membrane.
[0023]
Biological affinity includes affinity based on immune reactions such as antigen-antibody interaction and hapten-antibody interaction, sugar-lectin interaction including glycoprotein, physiologically active substance such as hormone-receptor interaction And interactions between complementary nucleic acid oligomers. Particularly preferred is affinity based on an immune reaction. Hereinafter, an assay device using affinity based on an immune reaction will be described as an example, but the present invention is not limited to this.
[0024]
As a measurement format, for example, P.I. TIJSSEN's “Enzyme Immunoassay (Biochemical Experimental Method 11, Tokyo Kagaku Dojin, 1989)” pages 297 to 314 may be used in various known formats using a solid phase on which an antibody or antigen is immobilized. it can.
[0025]
A typical example is the sandwich format described in the section “Prior Art”.
Further, a binding inhibition format or a competition format can also be used. As an example of the binding inhibition format by the chromatographic method, the antigen to be measured is immobilized at a specific part of a porous sheet-like strip where the liquid can move by capillary action, and colloidal gold etc. The labeled antibody labeled with the colored particles is arranged (arranged by coating, drying, etc.) without being fixed on the strip. When a liquid sample (liquid sample) is added from upstream of the labeled antibody, the sample travels through the capillary in the strip to dissolve the labeled antibody, and further moves downstream through the site where the antigen of the strip is immobilized. When the antigen is present in the sample, the labeled antibody reacts with the antigen in the sample first, and thus cannot react with the antigen immobilized on the strip. Therefore, coloring is not observed at the antigen-immobilized site, but coloring is observed downstream of the antigen-immobilized site. When no antigen is present in the sample, the labeled antibody is captured by the immobilized antigen, so that coloring is observed at the antigen-immobilized site and no coloring is observed downstream of the antigen-immobilized site.
[0026]
As an example of a competitive format by the chromatographic method, an antibody against an antigen to be measured is immobilized at a specific part of a porous sheet-like strip, and a labeled antigen labeled with colored particles such as gold colloid is upstream of the antibody. It is arranged in a state where it is not fixed on the strip (arranged by coating, drying, etc.). When a liquid sample is added from upstream of the labeled antigen, the sample travels through the capillary in the strip to dissolve the labeled antigen, and further moves downstream through the site where the antibody of the strip is immobilized. When the antigen is present in the sample, the immobilized antibody reacts with the antigen in the sample and the reaction with the labeled antigen is hindered. Therefore, coloring is not observed at the antibody immobilization site of the strip, but coloring is observed downstream of the antibody immobilization site. When no antigen is present in the sample, since the labeled antigen is captured by the immobilized antibody, coloring is observed at the antibody immobilization site, and no coloring is observed downstream of the antibody immobilization site.
[0027]
In addition, when detecting an antibody against a specific antigen present in a sample, a porous membrane on which the antigen is immobilized and a labeled anti-antibody are used. Coloring is observed.
[0028]
In the present invention, any form of solution or colloidal solution can be used as the liquid sample. Preferably, biological samples such as blood, plasma, serum, urine, cerebrospinal fluid, saliva, amniotic fluid, milk, nipple discharge, tears, sweat, exudate from skin, extracts from tissues, cells and stool, etc. Can be mentioned. Particularly preferred are nipple secretions, exudates from the skin, trace amounts of blood obtained by directly piercing the skin, and the like that can be collected only in trace amounts.
[0029]
The assay device of the present invention includes a first member capable of collecting a certain amount of sample simply by contacting the liquid sample as an essential component. Therefore, in order to collect a certain amount of sample and add it to the assay device, the user carefully reads the scale using a collection tool such as a pipette or a dropper to check the collection volume, or collects a sample such as a micropipette. There is no need for special operations such as adjusting the scale and setting the sampling volume. Such a sampling member is particularly effective for a very small amount of sample. If a small amount of sample is transferred to a container such as a test tube and an attempt is made to collect a certain amount, the sample loses during that time, and the necessary amount cannot be collected. Usually, it is desired to collect a certain amount directly from a part for collecting a sample such as a body to a simple assay device without transferring to a container, and the assay device of the present invention is compatible with it. Needless to say, the present invention can be applied to a sample taken in another container.
[0030]
Various methods can be used to maintain the function of collecting a certain amount of liquid sample in the first member. For this purpose, the first member can be made of various materials and have various shapes. Can be. A shape portion for picking with a finger or the like may be added to collect directly from the body or the like. For example, when a certain amount is collected on the surface of a solid using wetting due to the interfacial phenomenon of a liquid sample, the shape of the collected part is a flat surface with a certain surface area, a hollow or hole of an appropriate shape such as a circle or polygon A plastic, metal, glass, or other molded body having a shape having a shape having a groove having an appropriate shape, etc. It can be a member.
[0031]
When the sample collection portion is a flat surface, the flat surface has a size not exceeding the width of the chromatographic strip (chromatographic substrate) or the flow-through membrane. The form may be any of a circle, an ellipse, a square, a rectangle, and the like. The width and length are usually 2 to 30 mm, preferably 3 to 20 mm, more preferably 4 to 15 mm. When the sample collection part is a depression or a hole, the width of the cross section is assumed to be smaller than the width of the chromatographic strip or the flow-through membrane, usually 0.1 to 10 mm, preferably 0.2 mm to 5 mm. Preferably it is 0.4 mm to 3 mm, The depth is 0.05 mm-30 cm normally, Preferably it is 0.1 mm-20 cm, More preferably, it is 0.2 mm-15 cm. When the sample collection portion has a groove structure, the groove has such a size that the liquid sample can be held by surface tension, but the cross-sectional shape of the groove is not particularly limited. The length of the groove is preferably not longer than the width of the chromatographic strip, and in the case where the groove has a rectangular cross section, the width and depth of the groove are usually 0.05 to 5 mm, preferably 0.1 to 4 mm, More preferably, it is 0.2-3 mm.
[0032]
Moreover, a 1st member can be produced by using a water absorbing material as a component. As water-absorbing materials, ceramic fine particles such as silica, titania, zirconia, ceria, and alumina, fine particles of organic polymer, cellulose and its derivatives, dextran derivatives, agarose derivatives, poly (2-hydroxyethyl methacrylate), polyacrylic acid and polyvinyl alcohol -Porous gels such as polyacrylic acid composites, sintered bodies of metals or inorganic or organic materials having a porous structure, celluloses such as polyurethane, polyester, polyethylene, polyvinyl chloride, polyvinylidene fluoride, nylon, and cellulose acetate Examples thereof include fiber matrices such as derivatives, porous membranes, filter paper, glass fiber filter paper, cloth, and cotton. Even if the microparticles themselves are not porous, voids are formed between the microparticles in the filled state, and a liquid sample can be collected by capillary action.
[0033]
These water-absorbing materials can be used in the form of a thin film having a certain thickness. In order to absorb a certain amount of liquid sample, the volume of the membrane must be constant, but the amount of water absorption is affected by the porosity, thickness, pore size, etc. of the membrane. The width is preferably smaller than the width of the chromatographic strip or the flow-through membrane. The shape may be any of a circle, an ellipse, a square, a rectangle, and the like. The width and length of the membrane are usually 1-30 mm, preferably 2-20 mm, more preferably 3-15 mm. Moreover, thickness is 0.01-5 mm normally, Preferably it is 0.02-4 mm, More preferably, it is 0.05-3 mm.
[0034]
These materials can be treated with a surfactant or the like in order to improve wettability, or treated with bovine serum albumin or casein so that the analyte in the sample is not adsorbed. Further, it is possible to impregnate a substance whose color changes with moisture, such as anhydrous copper sulfate, in order to notify that the sample has been collected. These materials can also be used with containers and supports made of plastic or the like for holding. The fine particles and the porous gel can be held by sandwiching them with an appropriate water-permeable membrane as required.
[0035]
The first member of the present invention can be used for collecting a large amount of sample exceeding 50 μl, but is suitable for collecting a sample of 50 μl or less, and particularly useful for collecting a sample of 20 μl or less. A suitable amount of sample is 0.1 to 20 μl, and a particularly preferable amount is 0.5 to 10 μl.
[0036]
The liquid sample collected by the first member can be transferred to the chromatographic substrate or porous membrane of the second member by incorporating the first member into the second member. The second member includes a chromatographic base material or a porous membrane, and may be composed of a case for housing it. The first member and the second member are not connected by a capillary tube at the time of sampling, and the liquid must not be able to move from the first member to the second member. The first member and the second member may be completely independent of each other, or are housed in the same case, but the chromatographic substrate or porous membrane of the first member and the second member May be separated from each other without being connected by a capillary tube, and may be connected by moving either one of them.
[0037]
When the second member of the present invention is based on a chromatographic method, the second member has a chromatographic base material capable of moving a sample or a non-immobilized reagent as necessary using a developing solution by capillary action, and at least An analysis target substance or a substance that binds to the analysis target substance with biological affinity is immobilized at a specific portion of the substrate. The shape of the substrate is generally rectangular, but it can be cut or zigzag shaped to make the liquid spread evenly.
[0038]
Examples of the substrate for chromatography include a woven fibrous material used for paper chromatography, a non-woven fibrous material, a porous membrane material, and a fine particle material used for thin layer chromatography. More specifically, ceramic fine particles such as silica, titania, zirconia, ceria and alumina, fine particles of organic polymer, polyurethane, polyester, polyethylene, polyvinyl chloride, polyvinylidene fluoride, nylon, cellulose derivatives such as nitrocellulose and cellulose acetate. Fiber matrix, porous membrane, filter paper, glass fiber filter paper, cloth, cotton and the like. Preferred are porous membranes of nylon or cellulose derivatives, filter papers, glass fiber filter papers, etc. More preferred are nitrocellulose membranes, mixed nitrocellulose ester (mixtures of nitrocellulose and cellulose acetate) membranes, nylon membranes, and filter papers. The pore diameter of the porous membrane or filter paper is 0.1 μm or more, preferably 1 to 50 μm, more preferably 1 to 20 μm. Further, it can be used by lining it with a water-impermeable plastic or the like in order to increase the strength.
[0039]
The dimensions of the chromatographic substrate need to be determined in consideration of sensitivity, time, and sample usage. The preferred length is usually about 2 to 40 cm, preferably 3 to 25 cm, more preferably 4 to 20 cm. However, when the chromatographic substrate is separated between the detection part and the labeling substance attaching part, The length of each of the chromatographic substrates is preferably about half of the above dimensions. Moreover, a width | variety is 2-30 mm normally, Preferably it is 3-20 mm, More preferably, it is 4-10 mm.
[0040]
Examples of substances to be analyzed include antigens, haptens, sugars including glycoproteins, physiologically active substances such as hormones, nucleic acid oligomers and the like, and antibodies, lectins, receptors, Nucleic acid oligomers and the like can also be cited as substances to be analyzed. In other words, these can be substances to be analyzed, and can also be substances that bind to the substance to be analyzed due to biological affinity. Of the substances that bind to the substance to be analyzed with biological affinity, preferred are antibodies. The antibody may be one or a mixture of two or more of IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, and IgY antibodies, and either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody can be used. The antibody is treated with F (ab ′) by chemical treatment such as enzyme treatment such as pepsin and papain and reduction. ₂ , Fab ′, Fab and other antibody fragments can also be used. Antibodies are well-known methods, such as rabbits, guinea pigs, mice, goats, sheep, horses and other mammals, chickens, ducks, geese and other birds, immunized with antigens, haptens, etc., cell fusion, etc. The monoclonal antibody may be obtained from mouse ascites, culture supernatant or the like.
[0041]
Immobilization of the antibody on the chromatographic substrate is performed directly or indirectly. For direct immobilization, physical adsorption may be used, or immobilization may be performed by covalent bonding. In general, in the case of a nitrocellulose membrane or a mixed nitrocellulose ester membrane, it can be carried out by physical adsorption. Generally, cyanogen bromide, glutaraldehyde, carbodiimide and the like are used as a reagent for covalent bonding, but are not limited thereto. Indirect immobilization includes a method in which an antibody is bound to insoluble fine particles and then immobilized on a porous membrane or glass fiber filter paper. For immobilization of the antibody on the microparticles, either physical adsorption or covalent bonding can be used. The particle size of the fine particles is captured by the porous membrane but cannot be moved, and is immobilized on the porous membrane. Various particles used for antigen-antibody reaction are known as these particles, and these known particles can be used in the present invention without any particular limitation. For example, organic polymers such as organic polymer latex particles obtained by emulsion polymerization methods such as polystyrene, styrene-butadiene copolymer, styrene-methacrylic acid copolymer, polyglycidyl methacrylate, acrolein-ethylene glycol dimethacrylate copolymer. Examples include fine particles of substances, fine particles such as gelatin, bentonite, agarose, and cross-linked dextran, inorganic oxides such as silica, silica-alumina, and alumina, and inorganic particles obtained by introducing functional groups into inorganic oxides by silane coupling treatment, and the like. .
[0042]
After immobilizing the antibody, the chromatographic substrate can be subjected to a blocking treatment by a known method as necessary in order to prevent interference by interfering substances in the sample. In general, blocking treatment is performed by combining one or more of proteins such as bovine serum albumin, skim milk, casein, gelatin, surfactants such as Tween 20, Triton X-100, SDS, polyvinyl alcohol, ethanolamine, and the like. Done. A filter paper or the like into which an ethanolamine group that does not require a blocking treatment is used can also be used in the present invention.
[0043]
Various methods can be used to immobilize the analyte to be analyzed or the substance that binds to the analyte with biological affinity on the chromatographic substrate. For example, various printing techniques such as a microsyringe, a pen with a control pump, silk screen printing, gravure printing, transfer printing, and ink jet printing can be used. Although it does not specifically limit as a form, It can fix as a circular spot and the line extended perpendicularly | vertically to the chromatographic direction. Furthermore, it is possible to provide a plurality of immobilization sites to enable semi-quantification. It is also possible to immobilize a plurality of substances in order to detect a plurality of substances to be analyzed in the sample.
[0044]
When the analyte in the sample is measured using the assay device of the present invention, the first member is biologically compatible with the analyte or analyte of the chromatography substrate of the second member. The sample is incorporated at the site where the substance that binds by sex is immobilized or upstream thereof so that the sample can move to the chromatographic base material of the second member by capillary action. When the chromatography base material of the second member is housed in the case, a window is provided in the case so that the detection result display portion of the chromatography base material can be directly observed. In the sandwich format, the result detection part of the chromatography substrate is located at the site where the analyte or the substance that binds to the analyte by biological affinity is immobilized, and in the competitive or inhibitory format, the analyte or analysis A substance that binds to the target substance due to biological affinity is provided at a site where the substance is immobilized or downstream thereof.
[0045]
The second member expands in the chromatography base material in addition to the base material for chromatography having a portion to which the analyte or the substance that binds to the analysis target substance with biological affinity is immobilized and the case for housing it. It can also be configured to include parts for adjusting the amount of liquid to be removed and for removing blood cells and specific components from the blood. For example, to adjust the amount of liquid developed in the chromatographic substrate, upstream of the chromatographic substrate and / or upstream of the downstream end, or above and / or below the upstream and / or downstream end portion. It is also possible to connect other water-absorbing materials (water-absorbing parts) while the capillaries are in contact with each other.
[0046]
When the amount of sample collected by the first member is very small, the sample remains in a portion of the first member or the second member in the chromatographic base material and cannot sufficiently move through the chromatographic base material. In that case, a developing solution for moving the sample is used separately. The part for adding the developing solution can be installed upstream of the part into which the first member of the second member is incorporated. The site to which the developing solution is added may be on the chromatographic substrate, or may be a part of the water-absorbing part that is connected to the tip of the upstream end or the upper part of the upstream side. Moreover, it can also add through a 1st member. Furthermore, a developing solution can be put into a suitable container and used as one of the components of the first member or the second member.
[0047]
If the sample collection part of the first member is a water-absorbing material such as filter paper or porous membrane, the chromatographic base material of the second member should be analyzed or analyzed to completely move the sample collected. The part (A) and the part (B) are divided into at least two parts, a part (A) having a part where a substance that binds to the target substance due to biological affinity is immobilized and a part (B) to which a developing solution is added. Are preferably connected by a capillary by incorporating the first member. The chromatographic substrates used for parts (A) and (B) may be the same or different.
[0048]
In addition, a method in which the developing solution can be put from the first member and the developing solution is added to the chromatography base material of the second member through the first member is also possible. Since it can transfer to the base material for chromatography of a member, it is preferred.
[0049]
A commonly used buffer solution can be used as the developing solution. For example, a buffer solution containing phosphoric acid, Tris-hydrochloric acid, acetic acid, boric acid, carbonic acid, Good's buffer salts, and the like can be used, and sodium chloride can also be added and used. In addition, known additives can be used to control a reaction based on biological affinity or to suppress a nonspecific reaction. For example, in order to promote antigen-antibody reaction or to suppress non-specific reaction, proteins such as bovine serum albumin, casein, gelatin, polymer compounds such as polyethylene glycol, dextran, methylcellulose, polyvinylpyrrolidone, Tween 20, Triton X-100 Nonionic surfactants such as, other ionic surfactants, polyanions such as dextran sulfate, heparin, polystyrene sulfonic acid, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, etc., sodium azide, thimerosal, caisson CG, long chain Antibacterial agents such as alkyl quaternary ammonium salts can also be added.
[0050]
When the assay device of the present invention is based on the flow-through method, in one form thereof, the second member is a porous membrane on which an analyte or a substance that binds to the analyte with biological affinity is immobilized. Includes water-absorbing parts in contact with the lower surface. As the porous membrane, for example, a membrane used as a membrane for filtration can be used, and examples thereof include a fiber matrix, a porous membrane, a filter paper, a glass fiber filter paper, a cloth, cotton and the like mentioned as the base material for chromatography. . Further, as the water absorbing component, the water absorbing material described in the first member can be used. When this type of assay device is used for visual judgment, the area to which the analyte or the substance that binds to the analyte by biological affinity is immobilized is a fiber matrix, porous membrane, filter paper, glass fiber It is preferably smaller than the visible area of a porous membrane such as filter paper, but is not particularly limited. A method similar to the chromatographic method can be used as a method for immobilizing an analysis target substance or a substance that binds to the analysis target substance with biological affinity and a blocking treatment.
[0051]
The first member from which the sample is collected is incorporated into the second member, and the sample collection portion of the first member is immobilized with the analyte to be analyzed or the substance that binds to the analyte with biological affinity. When the sample is brought into contact with a porous membrane such as a fiber matrix, a porous membrane, filter paper, or glass fiber filter paper, the sample can pass through the porous membrane of the second member to the water absorbing component. In order to move the sample, a developing solution can be added through the first member. As the developing solution, a solution similar to the chromatographic method can be used.
[0052]
Other forms of the flow-through method include: a fiber matrix, a porous membrane, filter paper, glass on which the water-absorbing material itself of the first member is immobilized, the substance to be analyzed or a substance that binds to the substance to be analyzed with biological affinity. It is a porous membrane such as a fiber filter paper or is configured to include this, and the second member is configured with a water absorbing component as an essential element. Reactions based on biological affinity occur simultaneously with sampling. The first member is incorporated into the second member, and a porous membrane such as a fiber matrix, porous membrane, filter paper, glass fiber filter paper, etc. is brought into contact with the water-absorbing component, and if necessary, a developing solution is added via the first member. By doing so, the sample can be absorbed by the water absorbing component of the second member.
[0053]
Even in the case of the flow-through method, the second member is made of a fiber matrix, porous membrane, filter paper, glass fiber filter paper, etc., to which the above-mentioned analysis target substance or a substance that binds to the target analysis substance with biological affinity is immobilized. In addition to the porous membrane and the water-absorbing component, it can be configured with a case for housing it as required.
[0054]
The porous membrane of the flow-through method can be used in any form such as a circle, an ellipse, a square, and a rectangle. The width, length or diameter is usually 2 to 100 mm, preferably 3 to 80 mm, more preferably 4 to 50 mm. The water-absorbing part is preferably larger than the porous membrane, has an area where the entire surface of the porous membrane contacts, and preferably has a volume sufficient to completely absorb the sample or the sample and the developing solution. The water absorption capacity of the water absorbing component is usually 0.1 to 50 mL, preferably 0.3 to 20 mL.
[0055]
The assay device of the present invention measures an analyte in a sample in a sandwich format, a binding inhibition format, or a competitive format, but by any means with an analyte or a substance that binds to the analyte with biological affinity. A labeled conjugate to which a substance (label) from which a signal can be extracted is bound is used. Labels include radioisotopes, enzymes, fluorescent materials, colored or colored particles. It is possible to observe the color tone with the naked eye, measure the color density using a color difference meter, measure the light emission intensity and fluorescence intensity, but in order to know the result with the naked eye without using a special device, The labeling with an enzyme capable of obtaining coloration by the above reaction or colored or colored particles with which the coloration can be observed as it is is preferable.
[0056]
Examples of the enzyme include alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, β-galactosidase, urease, glucose oxidase, and the like, for example, as described in “Enzyme Immunoassay 3rd Edition (Medical School, 1987)” by Eiji Ishikawa et al. A labeled conjugate can be prepared by a known method. In addition, known chromogenic substrates corresponding to the respective enzymes can be used, and in some cases, the components of the second member can be impregnated or added later. In addition, a washing solution or the like can be added to remove the enzyme conjugate remaining in the porous membrane or the chromatographic substrate before the color development reaction.
[0057]
As colored or colored particles, metal colloids such as gold, silver, platinum, platinum and copper, metal oxide colloids such as iron oxide, non-metal colloids such as sulfur, selenium and tellurium, pigment particles and latex particles are dyed. Examples thereof include liposomes, but are not limited thereto. In order for colored or colored particles to move through the chromatographic substrate or pass through the membrane for filtration by capillary action, the particle size must be smaller than the capillary, and the average particle size is 1 μm or less, especially 0.5 μm or less. Preferably there is. In order to bind a substance to be analyzed or a substance that binds to the analyte with biological affinity to colored or colored particles, a known method such as physical adsorption or chemical bonding can be used. For example, a colloidal gold-labeled antibody in which an antibody is bound to a colloidal gold is prepared by adding the antibody to a colloidal gold solution and physically adsorbing it, and then adding bovine serum albumin solution to block the surface of the colloidal gold that is not bound to the antibody. Is done.
[0058]
The labeled conjugate can be disposed on the chromatographic substrate or porous membrane as a reagent contained in the constituent parts of the second member by coating and drying, or can be added later as a labeled conjugate solution. . Moreover, it can also be used in addition to the developing solution, and it is preferable to use it in addition to the developing solution rather than separately preparing a labeled conjugate solution separately. When the labeled conjugate is placed by coating / drying, etc., it is impregnated or coated / dried on a chromatographic substrate or porous membrane on which an analyte or a substance that binds to the analyte by biological affinity is immobilized. Alternatively, the labeled conjugate-containing material prepared separately may be arranged so as to be connected to the chromatography substrate or the porous membrane with a capillary. In addition, in order to improve the re-solubility when touching a liquid sample or a developing solution, a saccharide such as saccharose, maltose, and lactose, and a sugar alcohol such as mannitol are coated on a chromatography substrate or a porous membrane in advance. It is also possible to keep it. Various printing techniques such as microsyringe, pen with adjusting pump, silk screen printing, gravure printing, transfer printing, and ink jet printing can be used to arrange the label assembly.
[0059]
In addition, when the substance to be analyzed is an enzyme or an enzyme active substance, a labeled conjugate may not be required. For example, hemoglobin has peroxidase activity, and hemoglobin captured by an immobilized anti-hemoglobin antibody that does not inhibit enzyme activity can be obtained using a coloring solution consisting of diaminobenzidine, tetramethylbenzidine, etc. and hydrogen peroxide. It can be detected. The assay device of the present invention includes those used in such cases.
[0060]
The assay device of the present invention can be provided with a known function for confirming that the measurement operation has been performed completely. For example, when the labeled antibody is a mouse antibody, if the anti-mouse antibody is immobilized downstream of the site for detecting the analyte on the chromatographic substrate, and the operation is completely performed, To get a signal. In addition, when the end portion where the solution develops or the absorbed and wet tip portion is impregnated with an anhydrous metal salt that produces color when it comes into contact with water, color development can be observed when the measurement operation is completed.
[0061]
The assay device of the present invention can also use blood, serum, plasma, etc. collected from urine and veins as samples, but particularly useful are nipple secretions that can be collected only in trace amounts and trace amounts of blood obtained by stabbing the skin, For example, exudate from the skin. In particular, breast cancer has been increasing in recent years, and there are cases where it cannot be understood even by palpation, and a simple screening method has been demanded. In breast cancer, abnormal secretion from the nipple may be observed, and it is known that CEA (carcinoembryonic antigen), NCC-ST-439 antigen, etc. in the nipple secretion increase. In addition, nipple secretion may be observed even in benign diseases, but in the case of breast cancer, it is often bloody, and the presence or absence of bloodiness can be determined by hemoglobin. The assay device and assay method of the present invention are particularly useful for the detection of CEA (carcinoembryonic antigen), NCC-ST-439 antigen, and hemoglobin in the nipple secretion.
[0062]
When using the assay device of the present invention, a certain amount of sample is collected simply by directly contacting a sample collection part having a structure such as a flat surface, groove, indentation or hole of the first member or made of a water-absorbing material. After the sample is collected, the analyte can be easily detected in the sample by incorporating the first member into the second member and adding a developing solution or the like if necessary. The device is a very simple assay device. In particular, analysis of a sample that can be collected only in a very small amount, which has been very difficult to perform with a simple device until now, can be easily performed by using the simple assay device of the present invention.
[0063]
Hereinafter, specific examples of simple assay devices will be described with reference to the drawings, but the present invention is not limited thereto.
[0064]
FIG. 1 is a schematic view of an example of a simple assay device using a chromatographic method. The simple assay device comprises a first member made of a plastic molded body 1 having a semicircular groove as a sample collection portion and a second member in which components are housed in a plastic case 2. The plastic case 2 has a developing solution addition port 3, a sample addition port 4 into which a first member is incorporated and a sample is added, and a determination window 5. FIG. 2 is a side sectional view of a second member of the simple assay device shown in FIG. The chromatographic strip 6 is bonded to the case 2 with a double-sided tape 7.

Water absorption parts

8 and 9 are placed in the uppermost stream of the chromatographic strip 6 directly below the developing solution addition port 3 and at the most downstream position, and fixed by a case. The chromatographic strip 6 has a portion where the antibody is immobilized immediately below the determination window 5, and further has a colloidal gold particle labeled antibody attachment portion 10 at a position downstream of the developing solution addition port 3 and upstream of the sample addition port 4. When the first member from which the sample has been collected is incorporated into the sample addition port 4, the sample is absorbed by the chromatographic strip 6. The colloidal gold particle labeled antibody and the sample are chromatographed by the developing solution added from the developing solution addition port 3. When the sample contains a substance to be analyzed, the color of the gold colloid can be observed from the determination window 5.
[0065]
FIG. 3 is a schematic view of another example of a simple assay device using a chromatographic method. In the first member, a sample collection portion made of a water-absorbing material 12 is bonded to a plastic handle portion 11. Components of the second member are housed in a plastic case 13 having a developing solution addition port 14, a sample addition port 15 in which the first member is incorporated and a sample is added, and a determination window 16. 4 is a side sectional view of a second member of the simple assay device shown in FIG. The antibody immobilization strip 17 and the gold colloid particle-labeled antibody strip 18 are bonded to the case 13 with a double-sided tape 110. Water-absorbing

parts

111 and 112 are placed at the most upstream of the colloidal gold particle-labeled antibody strip, directly below the developing solution addition port 14 and at the most downstream position of the antibody immobilization strip, and are fixed by a case. The antibody-immobilized strip 17 has a portion where the antibody is immobilized immediately below the determination window 16, and the colloidal gold particle-labeled antibody strip 18 is colloidal gold particles at a position downstream of the developing solution addition port 14 and upstream of the sample addition port 15. It has a labeled antibody attachment part 19. The colloidal gold particle-labeled antibody strip 18 and the antibody-immobilized strip 17 are arranged separately so that when the first member is incorporated, the water-absorbing material 12 partially overlaps them and is connected by a capillary. When the first member from which the sample has been collected is incorporated into the sample addition port 15 and the developing solution is added from the developing solution addition port 14, the color of the gold colloid is observed from the judgment window 16 when the analyte is present in the sample. it can.
[0066]
FIG. 5 is also a schematic view of an example of a simple assay device using a chromatographic method. The first member fixes the water absorbing material 22 to the hollow plastic material 21 and has a developing solution addition port 210. As for the second member, components are housed in a plastic case 23 having a sample addition port 24 for incorporating the first member and a determination window 25. 6 is a sectional side view of the simple assay device shown in FIG. The antibody immobilization strip 26 is fixed to the case 23 with a double-sided tape 27. Water-absorbing

parts

28 and 29 are fixed to the most upstream and the most downstream of the antibody immobilization strip by a case. The antibody immobilization strip 26 has a portion where an antibody is immobilized immediately below the determination window 25. The first member from which the sample is collected is incorporated into the sample addition port 24 of the second member. When a developing solution containing colloidal gold particle-labeled antibody is added from the developing solution addition port 210 of the first member, the sample is chromatographed together with the developing solution, and when the analyte is contained in the sample, the coloration of the colloidal gold indicates the judgment window. 25.
[0067]
FIG. 7 is a schematic view of an example of a simple assay device based on the flow-through method. In the first member, a circular filter paper 32 is fitted in a cylindrical plastic molded body 31. The second member has an opening 33 and an air vent hole 36 for incorporating the first member. FIG. 8 is a sectional side view of the simple assay device shown in FIG. The second member is a water-absorbing material prepared by inserting an antibody-immobilized membrane 35 into a plastic molded body 34 so that the portion where the antibody is immobilized is at the center of the opening 33 of the plastic molded body, and further stacking thick filter paper. The part 37 for insertion is inserted, and the opening 33 of the plastic molded body 34 and the antibody-immobilized membrane 35 and the antibody-immobilized membrane 35 and the water-absorbing part 37 are completely in close contact with each other. A lid 38 is provided from the bottom so as to pass through the antibody-immobilized membrane 35 and be absorbed by the water-absorbing component 37 without leaking. The first member from which the sample has been collected is incorporated into the opening 33, and the filter paper 32 and the antibody-immobilized membrane 35 are brought into close contact with each other. A developing solution labeled antibody containing colloidal gold particle labeled antibody is added from the developing solution addition port 39 of the first member. After the developing solution is completely absorbed, a washing solution is further added and absorbed. Thereafter, when the first member is removed, the coloration of the colloidal gold can be observed at the antibody-immobilized site of the antibody-immobilized membrane 35 when the analysis target substance is contained in the sample.
[0068]
FIG. 9 is a schematic view of another example of a simple assay device based on the flow-through method. The antibody-immobilized membrane 42 is cut out in a circular shape around the antibody-immobilized portion and fixed to a cylindrical plastic molded body 41 to form a first member. The second member has an opening 43 and an air vent hole 44 for incorporating the first member. 10 is a side sectional view of the first and second members of the simple assay device shown in FIG. The first member is a water-absorbing part 46 made by stacking thick filter paper on a plastic molded body 45, and a lid 47 is attached from below so that the water-absorbing part 46 is completely in contact with the opening of the plastic molded body 45. It is. The first member from which the sample is collected is incorporated into the second member, and the antibody-immobilized membrane 42 is brought into close contact with the water-absorbing component 46. A developing solution containing colloidal gold particle-labeled antibody is added from the opening 48 of the first member and waits until the developing solution is completely absorbed. Further, a washing solution is added and absorbed. When the sample contains an analyte, coloring can be observed at the antibody immobilization site.
[0069]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
[0070]
Example 1 Preparation of sampling device (first member) used for chromatographic method and measurement of sampling amount
(1) Production of sampling device using plastic molding
As shown in 1 of FIG. 1, a plastic molded body in which a semi-cylindrical groove having a tip of 2 mm in thickness, a width of 3 mm, and a radius of 1 mm was engraved was prepared and used as a sampling device.
(2) Production of sampling device with filter paper 1
As shown in FIG. 3, filter paper No. 1 manufactured by Toyo Roshi Kaisha, Ltd. 50 was cut into a 4 × 6 mm rectangle (12 in the figure) and attached to the bottom surface of a plastic molded body 11 having a 4 × 6 mm bottom surface with a double-sided tape to obtain a sampling device.
(3) Production of sampling device using filter paper 2
As shown in FIGS. 5 and 6, the Whatman filter paper 31ET Chr was cut into a 4 × 6 mm rectangle (22 in the figure) and adhered to a 6 × 8 mm plastic molded body (height 10 mm) 21 The sampling device was used.
[0071]
(4) Measurement of sampling volume
A 7% BSA aqueous solution was dropped on the parafilm to form droplets, and the sample collection portion of the sample collection device (first member) was brought into contact with the droplets. The weight before contact and the weight after contact were measured, and the amount of sample collected was determined from the difference. The measurement was repeated 10 times to obtain reproducibility. In the collection devices (2) and (3), before weighing after contact, the sample was lightly pressed against the filter paper to absorb excess liquid. The results are shown in Table 1. Although the collection amount was different depending on the collection device used, good reproducibility was obtained for each collection device.
[0072]
[Table 1]

[0073]
Example 2 Measurement of CEA in CEA standard solution and nipple secretion by chromatographic method 1
(1) Preparation of colloidal gold
200 ml of 0.01% by weight aqueous chloroauric acid solution is boiled, 3 ml of 1% by weight aqueous sodium citrate solution is added thereto, and heated to boiling until the color of the solution turns red. A colloidal dispersion was prepared.
[0074]
(2) Preparation of colloidal gold particle labeled antibody
Adjust the pH by adding 0.5 ml of 0.1M hydrochloric acid-potassium carbonate buffer pH 9.0 to 10 ml of the above colloidal gold dispersion, and add rabbit anti-human CEA antibody to 30 μg per 1 ml of the gold colloid dispersion. And gently shaken at room temperature for 1 hour. Thereafter, 1.5 ml of 2 mM borate buffer pH 9.0 containing 8 wt% BSA was added to 10 ml thereof, and gently shaken at room temperature for 30 minutes. Further, after centrifuging this dispersion at 10,000 rpm for 1 hour at 4 ° C. to remove the supernatant, 10 ml of 2 mM Tris-HCl buffer solution pH 7.6 containing 1% by weight of BSA was added to the obtained pellet and resuspended. It became cloudy. In the same manner, the centrifugation operation was further repeated twice, and then resuspended in the above-described Tris-HCl buffer solution so that OD (520 nm) = 20, thereby preparing a colloidal gold particle labeled antibody.
[0075]
(3) Preparation of chromatographic strip
A mouse anti-CEA monoclonal antibody (concentration 1.2 mg / ml) dissolved in 50 mM phosphate physiological saline pH 7.2 is cut into 5 × 50 mm and is shown in FIG. 1 of Millipore nitrocellulose membrane (high flow membrane, Mylar back). A 1 mm wide line was attached at a position corresponding to the detection site 5 and air-dried. Then, it was immersed in 50 mM phosphate physiological saline pH 7.2 containing 5 wt% casein at room temperature for 2 hours and air-dried again. Further, 5 μl of the colloidal gold particle labeled antibody solution prepared in (2) in which 5% by weight of saccharose was added to the position corresponding to the position 10 in FIG. 2 was added twice while drying, to prepare a chromatographic strip. .
[0076]
(4) Production of chromatographic apparatus (second member)
As shown in FIG. 1, the second member is produced by placing the components in a developing solution addition port 3, a sample addition port 4 into which the first member is incorporated and a sample addition port 4 and a judgment window 5. did. As shown in FIG. 2, the Mylar back surface of the chromatographic strip 6 prepared in the above (3) is adhered to the case 2 with the double-sided tape 7, and the both ends (directly below the developing solution addition port 3 and at the most downstream position). A glass fiber filter paper GF / D 5 × 8 mm manufactured by Whatman Co., Ltd. was placed as water-absorbing

parts

8 and 9, and the water-absorbing parts were fixed on a chromatographic strip with a polyethylene case to obtain a chromatographic apparatus.
[0077]
(5) Measurement
As standard solutions, 50 mM phosphate physiological saline pH 7.2 containing CEA at a concentration of 0, 200, 400, 1000, 3000 ng / ml and BSA at a concentration of 1% by weight and a nipple secretion from a breast cancer patient were dropped on parafilm. The droplets were collected using the collection device (first member) shown in (1) of Example 1. The sampling device is incorporated into the sample addition port 4 of the chromatographic device (second member), and 50 mM phosphate physiological saline pH 7.2 is added as a developing solution onto the water absorbing component 8 from the 100 μl developing solution addition port 3. Judgment was made after minutes. The results are shown in Table 2. When the CEA concentration of the standard solution was 400 ng / ml or more, a red band due to gold colloid was observed in the judgment window. Positive and negative were determined even at known concentrations of nipple secretions at corresponding concentrations. Further, the reproducibility was tested by measuring 5 times using the CEA standard solution. As shown in Table 3, the results were good.
[0078]
Example 3 Measurement of CEA in CEA standard solution and nipple secretion by chromatographic method 2
(1) Preparation of antibody-immobilized strip
A mouse anti-CEA monoclonal antibody (concentration 1.2 mg / ml) dissolved in 50 mM phosphate physiological saline pH 7.2 is cut to 5 × 26 mm and is shown in FIG. A 1 mm wide line was attached to the position corresponding to the detection site 16 and air-dried. After that, it was immersed in 50 mM phosphate physiological saline pH 7.2 containing 5% by weight of casein at room temperature for 2 hours and air-dried again to produce an antibody-immobilized strip.
[0079]
(2) Preparation of colloidal gold particle labeled antibody strip
Filter paper No. manufactured by Toyo Roshi Kaisha. 50 was cut into a size of 5 × 20 mm, dipped in 50 mM phosphate physiological saline pH 7.2 containing 5 wt% casein at room temperature for 2 hours, and then dried. Furthermore, 5 μl of the colloidal gold particle-labeled antibody solution prepared in Example 2 (2), to which 5% by weight of saccharose was added at the position corresponding to position 19 in FIG. Made colloidal particle labeled antibody strip
[0080]
(3) Production of chromatographic apparatus (second member)
As shown in FIG. 3, the second member is produced by housing the components in a developing solution addition port 14, a sample addition port 15 in which the first member is incorporated and a sample is added, and a polyethylene case 13 having a judgment window 16. did. As shown in FIG. 4, the antibody-immobilized strip 17 (mylar back surface) prepared in (1) above and the gold colloidal particle-labeled antibody strip 18 prepared in (2) were adhered to the case 13 with a double-sided tape 110, In the same manner as in Example 2, glass fiber filter paper GF / D 5 × 8 mm manufactured by Whatman Co., Ltd. is placed as the

water absorbing parts

111 and 112 at positions immediately below and downstream of the developing solution addition port 14, and the water absorbing parts are antibody-coated by a polyethylene case. The chromatographic apparatus was fixed on the immobilized strip and colloidal gold particle labeled antibody strip.
[0081]
(4) Measurement
As standard solutions, 50 mM phosphate physiological saline pH 7.2 containing CEA at a concentration of 0, 200, 400, 1000, 3000 ng / ml and BSA at a concentration of 1% by weight and a nipple secretion from a breast cancer patient were dropped on parafilm. The droplets were collected by contacting the collection portion 12 of the collection device (first member) shown in (2) of Example 1. Lightly press the filter paper to remove excess moisture, then incorporate the sampling device into the sample addition port 15 of the chromatographic device (second member), and closely attach the sample sampling portion 12 of the sampling device to the

strips

17 and 18 of the chromatographic device. I let you. Thereafter, 50 mM phosphate physiological saline pH 7.2 was added as a developing solution onto the water-absorbing component 111 from the 100 μl developing solution addition port 14, and the determination was made 10 minutes later. The results are shown in Table 2. When the CEA concentration of the standard solution was 400 ng / ml or more, a red band due to gold colloid was observed in the judgment window. Positive and negative were determined even at known concentrations of nipple secretions at corresponding concentrations.
[0082]
[Table 2]

[0083]
[Table 3]

[0084]
Example 4 Measurement of NCC-ST-439 antigen by chromatographic method
(1) Preparation of a developing solution containing colloidal gold particle labeled antibody
0.5 ml of 0.1M hydrochloric acid-potassium carbonate buffer pH 9.0 was added to 10 ml of the colloidal gold dispersion of Example 2 (1) to adjust pH, and mouse anti-NCC-ST-439 monoclonal antibody was added thereto. The mixture was added to 40 μg per 1 ml of colloidal gold dispersion and gently shaken at room temperature for 1 hour. Thereafter, 1.5 ml of 2 mM borate buffer pH 9.0 containing 8 wt% BSA was added to 10 ml thereof, and gently shaken at room temperature for 30 minutes. Further, after centrifuging this dispersion at 10,000 rpm for 1 hour at 4 ° C. to remove the supernatant, 10 ml of 2 mM Tris-HCl buffer solution pH 7.6 containing 1% by weight of BSA was added to the obtained pellet and resuspended. It became cloudy. Similarly, the centrifugation was repeated two more times, and then resuspended in the above-described Tris-HCl buffer so that OD (520 nm) = 20, and 50 mM phosphate physiological so that OD (520 nm) = 5. A developing solution containing gold colloid particle-labeled antibody was prepared by diluting with saline pH 7.2.
[0085]
(2) Preparation of antibody-immobilized strip
FIG. 5 of a Millipore nitrocellulose membrane (high flow membrane, Mylar back) obtained by cutting mouse anti-NCC-ST-439 monoclonal antibody (concentration 5 mg / ml) dissolved in 50 mM phosphate physiological saline pH 7.2 into 5 × 30 mm. Attached in a line shape having a width of 1 mm at a position corresponding to the detection site 25 shown in FIG. After that, it was immersed in 50 mM phosphate physiological saline pH 7.2 containing 5% by weight of casein at room temperature for 2 hours and air-dried again to produce an antibody-immobilized strip.
[0086]
(3) Production of chromatographic apparatus (second member)
As shown in FIG. 5, the first member was assembled and the components were placed in a plastic case 23 having openings at two locations, a sample addition port 24 for adding a sample and a determination window 25. As shown in FIG. 6, the Mylar back surface of the antibody-immobilized strip 26 prepared in (2) above was adhered to the case 23 with a double-sided tape 27, and at both ends, glass fiber filter paper GF / D 5 × 8 mm manufactured by Whatman. Were placed as water-absorbing

parts

28 and 29, and the water-absorbing parts were fixed on the antibody-immobilized membrane with a polyethylene case to obtain a chromatographic apparatus.
[0087]
(4) Measurement
The nipple secretion of a breast cancer patient whose NCC-ST-439 antigen concentration is known is dropped on a parafilm to form a droplet, and the collection portion 22 of the collection device (first member) shown in (3) of Example 1 is used. And collected. After removing excess water by lightly pressing on the filter paper, the sampling device was incorporated into the sample addition port 24 of the chromatographic device (second member), and the sample sampling portion of the sampling device and the water absorption component 28 of the chromatographic device were brought into close contact with each other. . 50 μl of a developing solution composed of 50 mM phosphate physiological saline pH 7.2 is added to the sample collecting part of the collecting device from the developing solution addition port 210 of the collecting device (first member), and after complete absorption, further colloidal gold 100 μl of a developing solution containing a particle-labeled antibody was added, and a determination was made 10 minutes later. The results are shown in Table 4. Positive or negative was determined corresponding to the concentration of nipple secretions of known concentration.
[0088]
[Table 4]

[0089]
Example 5 Measurement of hemoglobin in nipple secretion by flow-through method
(1) Production of sampling device (first member)
As shown in FIGS. 7 and 8, a Whatman filter paper 17Chr (32 in the figure) cut into a circular shape having a diameter of 5.0 mm was fitted into a cylindrical plastic molded body 31 to obtain a sampling device.
[0090]
(2) Preparation of antibody-immobilized membrane
0.5 μl of 50 mM phosphate physiological saline pH 7.2 containing a mouse anti-human hemoglobin antibody at a concentration of 8 mg / ml was placed on an immunodyne immunoaffinity membrane (3 μm) manufactured by Pall and air-dried. The membrane was then immersed in 50 mM phosphate physiological saline pH 7.2 containing sodium caseinate at a concentration of 2.5% by weight and sucrose at a concentration of 8% by weight for 2 hours at room temperature. Thus, an antibody-immobilized membrane was prepared.
[0091]
(3) Production of flow-through device (second member)
As shown in FIGS. 7 and 8, the membrane 35 produced in (2) is formed on a plastic molded body 34 having an opening 33 and an air hole 36 for attaching the sampling device. Insert the water-absorbing part 37, which is made of thick filter paper, and insert it so that it comes to the center of the opening 33, and the opening part of the plastic molded body, the membrane, the membrane, and the water-absorbing part are completely adhered. Even if the developing solution was added from the opening, the lid 38 was attached from the bottom so as to pass through the membrane without being leaked around, and to be absorbed by the water-absorbing component, thereby obtaining a flow-through device.
[0092]
(4) Preparation of developing solution
A developing solution was 50 mM phosphoric saline pH 7.2 containing 0.1 M urea and 0.1% by weight Tween 20.
[0093]
(5) Preparation of coloring solution
Tetramethylbenzidine is dissolved in dimethylformamide so as to have a concentration of 3 mg / ml, and 4 ml thereof can be added to 96 ml of 0.1 M sodium acetate citrate buffer pH 6.0 containing 0.0126 wt% hydrogen peroxide. The color solution was mixed.
[0094]
(6) Measurement
The nipple secretion from a breast cancer patient with known hemoglobin was dropped onto the parafilm to form a droplet, which was collected by contacting the collection portion 32 of the collection device. After lightly pressing on the filter paper to remove excess moisture, the sample collection portion 32 was pressed against the antibody-immobilized membrane 35 by being inserted into the opening 33 of the flow-through device. Thereafter, 200 μl of the developing solution was added from the opening 39 of the sampling device and waited until the developing solution was completely absorbed. After repeating this three times, the collecting device was removed, 200 μl of a coloring solution was dropped on the antibody-dotted portion of the membrane, and coloring of the membrane was observed after 3 minutes. The results are shown in Table 5. Although coloring was observed in the hemoglobin positive samples I and J, coloring was not observed in the negative sample K.
[0095]
[Table 5]

[0096]
Example 6 Measurement of CEA standard solution by flow-through method
(1) Preparation of antibody-immobilized membrane
0.5 μl of 50 mM phosphate physiological saline pH 7.2 containing mouse anti-CEA antibody at a concentration of 2.4 mg / ml was placed on an immunodyne immunoaffinity membrane (3 μm) manufactured by Pall and air-dried. The membrane was then immersed in 50 mM phosphate physiological saline pH 7.2 containing sodium caseinate at a concentration of 2.5% by weight and sucrose at a concentration of 8% by weight for 2 hours at room temperature. Thus, an antibody-immobilized membrane was prepared.
[0097]
(2) Production of sampling device (first member)
As shown in FIG. 9 and FIG. 10, a cylindrical plastic molded body 41, which is cut out in a circular shape with a diameter of 1 cm around the portion of the antibody-immobilized membrane prepared in (1) that is dotted with an antibody, is bonded with an adhesive. A pasting and collecting device was obtained.
[0098]
(3) Production of second member
As shown in FIGS. 9 and 10, a water-absorbing part 46 made by stacking thick filter paper on a plastic molded body 45 having an opening 43 and an air hole 44 for attaching a sampling device is inserted, and the opening of the plastic molded body is inserted. Then, a lid 47 was attached from the bottom so that the water-absorbing parts were completely in close contact with each other, thereby obtaining a flow-through device.
[0099]
(3) Horseradish peroxidase-labeled anti-CEA antibody solution
2 mg of horseradish peroxidase manufactured by Toyobo Co., Ltd. was dissolved in 0.5 ml of distilled water, and 0.1 ml of 50 mM sodium periodate was added and reacted at room temperature for 30 minutes with stirring. Further, 0.1 ml of 200 mM ethylene glycol was added and reacted for 30 minutes. The reaction solution was dialyzed overnight at 4 ° C. against 1 mM acetate buffer (pH 4.5). 4 mg of rabbit anti-CEA antibody was dissolved in 1 ml of 200 mM carbonate buffer (pH 9.5), horseradish peroxidase solution after dialysis was added, and the mixture was reacted at room temperature with stirring for 3 hours. 0.1 ml of 200 mM Tris-HCl buffer (pH 9.0) was added, and the mixture was reacted for 1 hour with stirring at room temperature. Fractionation was performed with a gel filtration column (2.6 cm × 90 cm) packed with Ultrogel AcA44 using 50 mM phosphate physiological saline (pH 7.4) as an eluent to obtain horseradish peroxidase-labeled anti-CEA antibody. This was diluted to a concentration of 0.5 μg / ml in 50 mM phosphate physiological saline pH 7.2 containing 1% by weight of bovine serum albumin to obtain a horseradish peroxidase-labeled anti-CEA antibody solution.
[0100]
(4) Preparation of cleaning solution and coloring solution
The same developing solution and coloring solution as in Example 5 were used as the washing solution and the coloring solution.
[0101]
(5) Measurement
The CEA standard solution was dropped on the parafilm to form droplets, which were collected by contacting the collection part of the collection device. After lightly pressing the filter paper to remove excess moisture, it was inserted into the opening of the second member and pressed against the water absorbing part of the second member. Thereafter, 200 μl of horseradish peroxidase-labeled anti-CEA antibody solution was added from the opening 48 of the collection device, and waited until the labeled antibody solution was completely absorbed. Thereafter, 200 μl of the washing solution was added and waited until it was completely absorbed again. After repeating this washing operation three times, 200 μl of a color developing solution was dropped, and coloring of the membrane was observed after 3 minutes. The results are shown in Table 6. Coloring was observed at a CEA concentration of 200 ng / ml or higher.
[0102]
[Table 6]

[0103]
【The invention's effect】
According to the present invention, a user can easily collect a substance to be analyzed in a biological sample that can be collected only in a trace amount and measure it with high reproducibility without requiring much skill and effort.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram of a simple assay device using the chromatographic method shown in Example 2;
FIG. 2 is a side sectional view of a second member of the simple assay device shown in FIG.
FIG. 3 is a schematic diagram of a simple assay device using the chromatographic method shown in Example 3.
4 is a side sectional view of a second member of the simple assay device shown in FIG.
FIG. 5 is a schematic diagram of a simple assay device using the chromatographic method shown in Example 4;
6 is a side sectional view of a second member of the simple assay device shown in FIG.
7 is a schematic diagram of a simple assay device based on the flow-through method shown in Example 5. FIG.
8 is a side sectional view of the first and second members of the simple assay device shown in FIG.
FIG. 9 is a schematic diagram of a simple assay device based on the flow-through method shown in Example 6;
10 is a side sectional view of the first and second members of the simple assay device shown in FIG.

Claims

An assay device based on a chromatographic or flow-through method using affinity based on immune reaction, which is a liquid sample that does not contain solids, and is a nipple secretion, exudate from the skin, or directly stabbing the skin A first member whose component is a fixed volume of water-absorbing material that can absorb and collect a certain amount of a liquid sample of 0.1 to 20 μl by contacting with a small amount of blood obtained, An assay device comprising a second member capable of receiving a sample by incorporating one member, and the first member and the second member are not connected by a capillary when the sample is collected.

The assay device according to claim 1, wherein the water-absorbing material is any one of a fiber matrix, a porous membrane, a filter paper, a glass fiber filter paper, and a sintered body.

The assay device according to claim 1, wherein the water-absorbing material is filter paper.

An assay device based on a chromatographic method, wherein the second member has a chromatographic substrate having at least a portion to which an analyte or a substance that binds to the analyte by affinity based on an immune reaction is immobilized. By incorporating the first member into the second member, the substance to be analyzed of the chromatography substrate or the substance that binds to the substance to be analyzed with affinity based on the immune reaction is immobilized from the upstream side. The analyte can be measured by allowing the sample to permeate the chromatographic substrate and moving the permeated sample downstream in the chromatographic substrate by capillary action. 4. The assay device according to any one of 3.

An assay device based on a chromatographic method for moving a sample through a chromatographic substrate to a site upstream of a site where the first member is incorporated on the chromatographic substrate of the second member The assay device according to claim 4, wherein a site for adding a liquid is provided.

An assay device based on a chromatographic method, wherein the chromatographic base material of the second member has a portion to which an analysis target substance or a substance that binds to the analysis target substance with affinity based on an immune reaction is immobilized ( A) and a part (B) to which a developing solution is added are divided into at least two parts. Until the first member is assembled, the part (A) and the part (B) are not connected by a capillary and the movement of the liquid is not 6. The assay device according to claim 4, wherein the liquid can be moved by incorporating the first member.

An assay device based on a chromatographic method, wherein a developing solution for moving a sample in a chromatography base material of a second member is added via a first member incorporated in the second member. 5. The assay device according to 4.

An assay device based on a flow-through method, wherein the second member is a porous membrane on which at least a substance to be analyzed or a substance that binds to the substance to be analyzed with affinity based on an immune reaction is fixed, and water absorption that is in contact with the lower surface thereof The sample can be penetrated into the membrane from the upper surface of the membrane by incorporating the first member into the second member, and the membrane can pass through the membrane and be absorbed by the water-absorbing component by capillary action. The assay device according to claim 1, wherein the substance to be analyzed is measured by the method.

An assay device based on a flow-through method, wherein the second member has at least a water-absorbing component, and the first member is fixed with an analyte or a substance that binds to the analyte with affinity based on an immune reaction. The porous membrane of the first member is connected to the water absorbing component of the second member by a capillary tube by incorporating the first porous member as a component and incorporating the first member into the second member. The assay device according to any one of the above.

Claims in which the base material for chromatography or the porous membrane for immobilizing the target substance to be analyzed or the substance that binds to the target substance with affinity based on the immune reaction consists of a nitrocellulose membrane, nylon membrane, filter paper, or glass fiber filter paper Item 10. The assay device according to any one of Items 4 to 9.

The substance immobilized on the chromatographic substrate or porous membrane is an antibody or antibody fragment, and a labeled antibody is used as a substance to which a label for obtaining a signal is bound, and the substance is immobilized on the chromatographic substrate or porous membrane. The assay device according to any one of claims 4 to 10, wherein the signal is obtained by making a sandwich complex.

The label for obtaining a signal is a metal colloid, a non-metal colloid, or a colored latex particle, and the analyte or the concentration of the analyte in the sample can be detected visually or with a color difference meter. Assay device.

13. A small amount of blood obtained by using the assay device according to any one of claims 1 to 12 and a liquid sample that does not contain solids, such as a nipple secretion, a skin exudate, or a stabbing directly on the skin. Method for measuring analytes in water.

The method according to claim 13, wherein a developing solution prepared separately from the sample is used in order to develop the sample in the chromatographic substrate or to pass through the porous membrane and be absorbed by the water absorbing component.

The method according to claim 14, wherein the developing solution is a solution containing a labeling substance.

The method according to claim 14 or 15, wherein the substance to be analyzed is any one of CEA, NCC-ST-439, and hemoglobin in the nipple secretion.

The assay device according to any one of claims 1 to 12, which is used for breast cancer screening.