JP3638657B2

JP3638657B2 - DNA repair enzyme

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Publication number: JP3638657B2
Application number: JP09413795A
Authority: JP
Inventors: 明安井
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 1995-03-29
Filing date: 1995-03-29
Publication date: 2005-04-13
Anticipated expiration: 2020-04-13
Also published as: JPH08266275A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はＤＮＡ修復酵素に関する。より具体的には、本発明は紫外線によって誘発されるＤＮＡの損傷の修復に関与する酵素活性を有する蛋白質に関する。また、本発明は、かかる蛋白質をコードするＤＮＡ、およびかかる蛋白質の製造方法に関する。
【０００２】
【背景技術】
進化を通じて、紫外線（ＵＶ）は生物に対して多大な影響を及ぼし、ＵＶ誘発ＤＮＡ損傷の修復は生命を維持する上で重要であった。最も重要な有毒で突然変異誘発性のＵＶ光化学反応物は、シクロブタンピリミジンダイマー（ＣＰＤ）と（６−４）光化学反応物［（６−４）ＰＰ］である。これらの光化学反応物を除去する数種の解決手段が確認されている。酵素的光回復（ＰＨＲ）は、多くの微生物および高等真核細胞で使用されており、可視光のエネルギーによるフォトリアーゼを介して特異的にＣＰＤをモノマー形にもどす機構である。また、（６−４）ＰＰに作用する光回復酵素は、昆虫に存在することが知られている（Todo et al.,１９９３，Nature, ３６１，３７１−３７４）。
【０００３】
また、細菌ミクロコッカスルテウス（Micrococcus luteus）およびＴ４ファージ感染大腸菌（Escherichia coli）では、ピリミジンダイマー・ＤＮＡグリコシラーゼ／エンドヌクレアーゼ（Ｔ４endo）がＣＰＤの生じる部位での塩基除去修復を開始することによりＣＰＤを特異的に認識し、そしてＣＰＤを除去することが知られている。ＤＮＡ由来の主要な上記２種のＵＶ光化学反応物を除去できる多機能経路は、現実には、シクロブタンダイマーより遥かに効率よく（６−４）ＰＰを修復するヌクレオチド除去修復である（例えば et al.,１９８５；Szymkowski et al.,１９９３，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，９０，９８２３−９８２７）。ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）は、多くの細菌酵母およびヒトを含む種々の原核細胞および真核細胞で発見されている。
【０００４】
３０を超える糸状菌ニュウロスポラクラッサ（Neurospora crassa）の突然変異誘発剤感受性変異株からは、ヒト細胞の色素性乾皮症（ＸＰ）または酵母サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＲＡＤ３エピスタシス群に類するＮＥＲ欠失突然変異株は発見されていない。
【０００５】
ところが、ＵＶに対してだけでなく化学突然変異誘発剤に対しても感受性の異常な表現型を有するｍｕｓ−１８変異細胞が見い出されている（Ishii et al.,１９９１，Mol. Gen. Genet., ２２８，３３−３９）。ＵＶ照射による突然変異細胞のＤＮＡで生じるＣＰＤは、液体に１８時間保持した後でさえも修復されないまま残る（同上）。
【０００６】
本発明者らは、独自に、ｍｕｓ−１８変異細胞はおそらくＴ４ｅｎｄｏのような酵素をコードする遺伝子中のＣＰＤ修復機構中に欠陥があるものと考えた。このような遺伝子はＮＥＲ欠失大腸菌のＵＶ感受性を補足する可能性がある。そこで、本発明者らは、ニュウロスポラクラッサ（N. Crassa）のｃＤＮＡ発現ライブラリーを、３種のＣＰＤ修復経路（ＮＥＲ、ＰＨＲおよび組換え）のすべてを欠失している大腸菌（E. coli）に導入し、新たなＤＮＡ修復酵素が存在する可能性を検討してきた。その結果、Ｎ . ｃｒａｓｓａのｍｕｓ−１８変異株における欠失遺伝子がＣＰＤ部位と（６−４）ＰＰ部位の双方に特異的なエンドヌクレアーゼをコード化することを見い出した。
【０００７】
他方、組換え技術によって製造されたＴ４エンドヌクレアーゼはＣＰＤのみに選択的に作用するものであるが、その活性を利用して、日焼け止めクリームなどに混ぜ、皮膚ガンを予防するクリームへの用途も開発されている。
【０００８】
以上のような背景を考慮すれば、ＣＰＤと（６−４）ＰＰとの双方の除去修復に寄与しうる酵素を提供できれば、さらに有効なクリーム剤等の開発に資することができるであろう。
【０００９】
【発明の構成】
本発明は、上記のように、Ｎ . ｃｒａｓｓａの特定の遺伝子が、損傷を受けたＤＮＡのＣＰＤ部位にも（６−４）ＰＰ部位にも作用するエンドヌクレアーゼをコード化することを発見し、さらにかかる遺伝子の単離および発現に成功することによつて完成した。
【００１０】
従って、本発明によれば、紫外線によってＤＮＡ中のＴＴ配列およびＴＣ配列からそれぞれ誘発されたシクロブタン型ダイマー（ＣＰＤ）および（６−４）結合生成物（または「光反応物」）［（６−４）ＰＰ］を、特異的に認識し、そしてそれらの５′側で切断することのできる酵素活性を有する蛋白質が提供される。
【００１１】
より具体的には、前記蛋白質は、後述する配列表の配列番号：１のＤＮＡ配列がコード化する蛋白質またはその誘導体である。本発明の文脈上誘導体という用語は、遺伝的および／または化学的性質の変性によって得られ、本発明の目的に沿う活性が保存されているすべての蛋白質を意味する。遺伝的および／または化学的性質の変性は、１つまたはそれ以上の残基のいずれかの突然変異、置換、欠失、付加及び／又は修飾をも意味すると理解することができる。そのような誘導体としては、例えば特に蛋白質が作用する部位への親和性を向上する目的、その生産量の増加または精製の容易化の目的、プロテアーゼへの耐性の向上または細胞膜貫通の促進の目的、その他の目的に資するように変性されたものを挙げることができる。
【００１２】
従って、本発明の蛋白質は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質それ自体およびそれから上述の少なくとも１つの目的に沿って誘導された蛋白質である。当業者は、配列番号：２のアミノ酸配列に基づき、それ自体既知のペプチド合成法により、各種誘導体を容易に製造できるであろう。また、必要な蛋白質をコードするヌクレオチド配列を適当な宿主で発現させ、必要があれば、その後さらに化学的または酵素的修飾を行って、所望の蛋白質を製造できる。
【００１３】
本発明はまた、遺伝子組換え法による前記蛋白質の製造方法も提供する。より具体的には、前記蛋白質のいずれか１種をコードするＤＮＡを発現できる状態で含む宿主細胞を、栄養培地で培養し、前記ＤＮＡの発現によって産生した蛋白質を採取する工程を含んでなる方法が提供される。
【００１４】
「ＤＮＡを発現できる状態」とは、目的のＤＮＡが自律複製できるベクターに組み込まれ、しかもそれを発現させるシグナルの制御下に置かれたような状態をいう。ここでいう、シグナルとは、プロモーター、ターミネーター、分泌のためのリーダー配列等を包含するが、これらは用いる宿主細胞の種類に従って任意に選ぶことができる。
【００１５】
さらに、前記ＤＮＡはベクタープラスミドの一部を形成することができ、こうして構築されたベクタープラスミドも本発明の一態様である。
【００１６】
ベクターは自律複製性又は組込み複製性であることができる。さらに具体的には、自律複製性のベクターは選ばれた宿主における自律複製の配列を用いて製造することができる。組込みベクターについては、例えば宿主ゲノムのある領域と相同の配列を用いることにより製造することができ、相同的組み換えによるベクタープラスミドの組込みを可能にする。組換え技法による本発明の蛋白質の製造に用いることができる宿主は真核細胞または原核細胞である。適した真核宿主として動物細胞、酵母または細菌を挙げることができる。特に挙げることができる酵母はサッカロミセス（Saccharomyces）またはクルイベロミセス（Kluyveromyces）属等に属する酵母である。挙げることができる動物細胞は細胞ＣＯＳ、ＣＨＯ、Ｃ１２７などである。菌の中でさらに特定するとアスペルギルス（Aspergillus）またはトリコデルマ種（Trichoderma）属等に属するものを挙げることができる。原核細胞としては、大腸菌（E. coli）、バシルス（Bacillus）等を用いるのが好ましい。
【００１７】
こうして、本発明の蛋白質は大量生産することが可能である。
【００１８】
本発明の実体およびその作用効果の理解をより容易にするため、以下に、配列番号：１で示される本発明のＤＮＡを例に添付図面を参照しながらさらに説明を加える。
【００１９】
大腸菌ＳＹ２株のＵＶ感受性を補足するＮｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａｃＤＮＡライブラリーからの遺伝子のクローニング
野生型Ｎ . ｃｒａｓｓａのｃＤＮＡライブラリーを修復欠失Ｅ . ｃｏｌｉＳＹ２株に導入し、プラスミド（ｐＵＶＧ３１）を含むＵＶ耐性形質転換体を得る。このプラスミドは、ＳＹ２だけでなく、他のＥ . ｃｏｌｉ宿主のＵＶ耐性を向上させた（図１）。ｐＵＶＧ３１中の２.４ｋｂインサートのヌクレオチド配列を決定する。開始コドンは前記ｃＤＮＡの５′側に配置されるゲノムフラグメントの配列決定によって確認された（アクセス番号：Ｄ１１３９２）。前記配置は１９６８塩基の読み取り枠（ＯＲＦ）を含む。堆定アミノ酸配列は、既に報告されているＴ４ｅｎｄｏを始めとするＤＮＡ修復酵素のいずれとも異なる７４,４２１Ｍｒの蛋白質である（図２、配列番号：２）。
【００２０】
酵母レッド変異株およびヒト色素性乾皮症細胞系におけるＵＶ感受性の部分補足
他の生物体でのクローン化遺伝子によるＵＶ感受性の補足性をみるために、酵母プロモーターの後に導入し、各種のＤＮＡ修復に欠陥のあるサッカロマイセスセレビシエを形質転換した。ＮＥＲ遺伝子、ｒａｄ１およびｒａｄ２に欠陥のある２種の変異株、ならびに複製後修復欠失ｒａｄ１８株を導入プラスミドによってＵＶ耐性細胞に変換したが、野生型株のＵＶ感受性ではそのトランスフォーメーションによってＵＶ耐性をわずかに増大しただけである（図３のａ）。同様に前記ｃＤＮＡを有するヒト色素性乾皮症を補足するグループＡ（ＸＰＡ）細胞は、ヘラ（Hela）細胞のほぼ半分までＵＶ耐性を獲得した（図３のｂ）。ＨｅＬａ細胞のＵＶ耐性は、前記プラスミドの導入によって影響を受けなかった。従って、クローン化遺伝子は多様な種に由来するＤＮＡ修復欠失細胞の耐性を高める。このことは、前記ＯＲＦが細胞の他の蛋白質と独立して作用して、ＵＶ損傷の修復を開始するファクターをコードすることを示唆している。
【００２１】
クローン化遺伝子とｍｕｓ−１８変異との関係
クローン化された遺伝子とＮ . ｃｒａｓｓａのｍｕｓ−１８変異との関係を調べた。Ｎ . ｃｒａｓｓａのゲノムライブラリーに由来する全ｃＤＮＡ領域にわたるＤＮＡを単離し、このゲノムフラグメントをｍｕｓ−１８変異細胞に導入した。２種の形質転換体はＵＶに対して同じ耐性を示した（図４）。さらに、我々は反復誘導点突然変異誘発（repeat-enduced point mutation：ＲＩＰ）を使用して野生型株のｍｕｓ−１８遺伝子を不活化した。ＲＩＰは重複ＤＮＡ配列を減数分裂前（premeiotically）に不活化するようなＮ . ｃｒａｓｓａの一般的な応答を利用する（Selker et al，１９８７，Cell, ５１，７４１−７５２；Selker and Garrett，１９８８，Proc. Natl. Acad. Sci USA，８５，６８７０−６８７４）。野生型細胞とクローン化ゲノム遺伝子で形質転換した野生型細胞との間の交雑からの２つの子孫はｍｕｓ−１８変異株と同様なＵＶ感受性を示した（図５）。これらのクローン中では内因性遺伝子と導入ｍｕｓ−１８遺伝子のどちらもＲＩＰによって不活化されたことを示す。最後に、野生型とｍｕｓ−１８変異株のゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション分析は、変異株ゲノムに欠失を含む変化を示す（図６）。これらの結果から、前記クローン化された遺伝子はＮ . ｃｒａｓｓａ変異株ｍｕｓ−１８中で欠失しているものとの結論を出した。我々はクローン化された遺伝子をｍｕｓ−１８遺伝子と称する。
【００２２】
Ｅ . ｃｏｌｉからのｍｕｓ−１８蛋白質の精製
８個のアミノ酸残基をコードする標識（tag）を３′末端でｍｕｓ−１８遺伝子に融合させ、修復欠失ＳＹ２宿主細胞で発現させた。この組換え遺伝子は前記宿主に標識をもたない遺伝子と同等のＵＶ耐性を付与した。組換え蛋白質を、標識に対する抗体を利用し、そしてＵＶ照射プラスミドに対するニック（切断）活性を指標に精製した。クローン化ｃＤＮＡのＯＲＦにおける堆定アミノ酸配列は連続するヒスチジン配列を数ケ所含んでる。従って、まず、細胞抽出物をＮｉ²⁺ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）アガロースカラムにかけた。次いで、ホスホセルロース、さらにヘパリンセファロースのアフィニティークロマトグラフィーで精製した。ＵＶ照射プラスミドに対してニック活性を有する画分のＳＤＳ−ゲル電気泳動を図７のａとｂに示す。ベクタープラスミドで形質転換された細胞由来の同様な溶離画分は、このような活性を示さなかった（図７のａ）。ゲル電気泳動から判断すると、最終的な画分は９５％を超える純度であった。ＦＬＡＧに対する抗体は図７のｃに示される約７４ＫＤの精製蛋白質を認識した。こうして、ｍｕｓ−１８だけの遺伝子産物がＵＶ照射ＤＮＡにニックを導入するものと判断した。精製蛋白質はＵＶ照射プラスミドに対するニック反応に際してＭｇ⁺⁺だけでなくＡＴＰも必要とする（図７のｄ）。
【００２３】
ＵＶ照射プラスミドおよび合成オリゴヌクレオチドにおける精製ｍｕｓ−１８蛋白質の基質およびニック活性部位の決定
ｍｕｓ−１８蛋白質（Ｍｕｓ−１８）によって切断（ニック）されるヌクレオチド配列を同定する目的で、Ｍｕｓ−１８により線状化プラスミドを処理した。このプラスミドがＵＶを照射されている場合に限って前記蛋白質はニック（切れ目）を導入した（図８）。Ｍｕｓ−１８によるＵＶ照射ＤＮＡの処理によってＴＣ、ＴＴ、ＣＣおよびＣＴ配列において異なる濃度のＤＮＡバンドを形成した。図８のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）でのＤＮＡフラグメントの移動速度を見ると、Ｍｕｓ−１８により生成したものは、配列マーカーより遅く移動している。矢印ａおよびｂによって示されるＴＣおよびＴＴ配列のバンドの位置は、ＰＡＧＥの上部におけるジピリミジン配列マーカーの最初のヌクレオチド配列付近にあり、そしてｃおよびｄにより示されるＰＡＧＥの下部における二番目のヌクレオチドより後ろにある。これは、化学的な塩基の分解で得られた３′リン酸を有するＤＮＡとは対照的に、Ｍｕｓ−１８は前記ジピリミジンの５′に隣接した部位でＤＮＡを切断し、３′−ＯＨを放出させることを意味する。
【００２４】
Ｍｕｓ−１８によって切断されたＤＮＡの損傷を同定し、損傷を受けた部位へどのようにニック（切れ目）が導入されるかを分析するために、ＴＣとＴＴの２種のジピリミジン配列だけを含む５４ｍｅｒの合成オリゴヌクレオチドをｉｎｖｉｔｒｏアッセイで使用した。標識プラスミドで得られた上記結果を考慮すると、ＮｓｉＩおよびＮｌａＩＩＩの２種の制限酵素に対する開裂部位が、それぞれＴＣおよびＴＴ配列の５′に隣接した位置に導入されている。５′または３′末端で標識されそしてその相補オリゴヌクレオチドとアニールするこのオリゴヌクレオチドが、ＵＶ照射後Ｍｕｓ−１８に対する基質として使用された。５′末端標識ＤＮＡ（Ｍｕｓ−１８によりＴＣまたはＴＴ部位にニックを入れた）は、Ｔ４ｅｎｄｏで開裂したものより早く泳動した（図９のｂ、レーン１および２）。（６−４）ＰＰまたはＣＰＤに対するフォトリアーゼを用いるＰＨＲは、それぞれＴＣ（レーン３）またはＴＴ（レーン５）におけるバンドを殆ど消失するが、Ｔ４ｅｎｄｏによって生成したバンドはＣＰＤに対するフォトリアーゼを用いるＰＨＲによって完全に消失した（レーン６）。Ｍｕｓ−１８で切断された３′末端標識ＤＮＡは、Ｔ４ｅｎｄｏで切断されたものよりわずかに遅く泳動した（図９のｃ、レーン１および２）。これは５′末端標識ＤＮＡを用いて得られたものに相当し、Ｍｕｓ−１８がＴ４ｅｎｄｏで切断された部位の５′部位で単一のニックを導入することを示す。
【００２５】
図９のｄは、ＴＣまたはＴＴ配列でＭｕｓ−１８により切断された５′末端ＤＮＡが、ＮｓｉＩまたはＮｌａＩＩＩによる消化後に生じたものと、それぞれ同じ位置まで泳動した（レーン１〜３）。切断されたＤＮＡはｄｄＴＴＰと共に末端デオキシトランスフェラーゼに対する基質として働き、追加のヌクレオチドをもたらし（レーン４〜６）、３′ＯＨ末端の存在を示す。３′標識されそしてＭｕｓ−１８切断ＤＮＡフラグメントの移動度も前記制限酵素により生成されたものと同じであった（図９のｃ、レーン１〜３）。ウシ腸フォスファターゼ（ＣＩＰ）により切断されたＤＮＡの後処理はすべてのＤＮＡの移動をわずかに遅らせた。Ｍｕｓ−１８により切断されたＤＮＡの５′末端にリン酸が存在することを示す。
【００２６】
Ｎ . ｃｒａｓｓａＵＶ感受性変異株におけるｍｕｓ−１８遺伝子と突然変異
上述のように、Ｎ . ｃｒａｓｓａ由来のｃＤＮＡライブラリーとＵＶ感受性Ｅ . ｃｏｌｉの補足性により、新規な真核ＤＮＡ修復遺伝子が単離された。ｍｕｓ−１８遺伝子は高度に親水性のカルボキシ末端を有する蛋白質をコード化する。特に興味深いのは、図２の下線を引いた太字で示される配列４ｘＬｙｓ−２ｘＧｌｙ−２ｘ（ＬｙｓＡｒｇ）である。この配列は、ＤＮＡと密接に相互作用するペプチドであるプロタミンのカルボキシ末端で見い出された配列［ニジマスのプロタミンＩＡにおける６ｘＡｒｇ−２ｘＧｌｙ−４ｘＡｒｇ（Ando and Watanabe,１９６９，Int. J. Protein Res.,１，２２１−２２４）］に類似する。この配列中に各種の欠失を伴うｍｕｓ−１８遺伝子は、Ｅ . ｃｏｌｉＳＹ２宿主細胞のＵＶ感受性の補足活性に影響を及ぼし、遺伝子産物の酵素的機能においてその配列が重要な役割を担うことを示唆する。
【００２７】
Ｎ . ｃｒａｓｓａのｍｕｓ−１８変異株における変異を以下の３種の方法で同定した。一つは、野生型遺伝子（ＲＩＰ）の導入によるｍｕｓ−１８株におけるＵＶ感受性の補足性であり、もう一つは、野生型ＤＮＡと変異ゲノムＤＮＡを用いるサザン分析の比較である。サザン分析から、その変異はｍｕｓ−１８遺伝子を含有するゲノムフラグメントの一部に欠失を伴うことがわかる。
【００２８】
精製Ｍｕｓ−１８により生じるニック
ｍｕｓ−１８遺伝子は、ＣＰＤと（６−４）ＰＰの両者に対してニック活性を有する蛋白質をコード化する。Ｍｕｓ−１８は、ＵＶ誘発ＣＰＤおよび（６−４）ＰＰに隣接した５′位にニックを導入し、損傷を有するＤＮＡ鎖の一本鎖の破壊をもたらすことを示す（図１０）。Ｍｕｓ−１８の基質はＴＴ、ＴＣ、ＣＣおよびＣＴ配列において生じたピリミジンダイマー類を包含する。図８に示されるニックバンドの強度変化は、ＵＶによる損傷の程度の相違および／またはＭｕｓ−１８による修復の選択性の相違に起因すると思われる。高ＵＶ用量（３ｋＪ／ｍ²）をそれぞれ前記プラスミドおよびオリゴヌクレオチドに照射するとＴＣ配列において比較的多量の（６−４）ＰＰを生成する。ＤＮＡに低用量のＵＶ照射を行った後、前記蛋白質によってＴＴ部位が優先的に切断される。前記蛋白質によるＵＶ誘導ダイマー類間のニック活性の優先性は確認していないが、ＣＰＤと（６−４）ＰＰ間で前記蛋白質による認識に差があるものと思われる。チミン−チミンダイマーにおけるニックの導入のためには、種々の鎖長の合成ＤＮＡを用いた分析から判断すると、Ｍｕｓ−１８は（６−４）ＰＰに対するよりも損傷に対してより長いフランキング配列を必要とする。これは、Ｍｕｓ−１８は異なる化学構造をもつ各種のＵＶ誘導ダイマーをどの程度まで認識するか、ということが次の解明すべき問題点となることを示唆する。
【００２９】
ｍｕｓ−１８遺伝子による宿主細胞におけるＵＶ感受性の補足
Ｍｕｓ−１８の研究から生じる他の興味ある問題点は、どの程度のニック部位が細胞中でその後処理されるかにある。大腸菌、酵母およびヒト細胞に導入されたｍｕｓ−１８遺伝は、これらの宿主細胞のＵＶ生存率を同じように高める。この点で、Ｍｕｓ−１８は、酵母ｒａｄ突然変異体およびヒトＸＰ細胞にＵＶ耐性を付与しうるＴ４ｅｎｄｏと似ている（Valerie et al.,１９８６，Mole. Cell. Biol.，６，３５５９−３５６２）。各種の修復欠失宿主細胞におけるＵＶ感受性補足は、ほんの部分的であって、野生型細胞のＵＶ耐性には到達しなかった。酵母細胞では、完全なＮＥＲ活性を有する複製後修復欠損ｒａｄ１８変異株、ならびに２種のＮＥＲ変異株（ｒａｄ１およびｒａｄ２）［これらはそれぞれＤＮＡ損傷の５′および３′位におけるニック活性を欠いている（Bardwell et al.,１９９４，Science，265，２０８２−２０８５；Harrington and Lieber,１９９４，Genes Dev., ８，１３４４−１３５５）］は、ｍｕｓ−１８遺伝子によって同じ程度にＵＶ耐性を高める（図３）。これらの結果は、これらの生物における切断機構と独立した修復経路によってさらに処理されることを示唆する。
【００３０】
Ｍｕｓ−１８の役割とその分布
本発明者らが分析した限りでは、ＵＶ誘発損傷以外のＤＮＡ損傷部にＭｕｓ−１８がニックを導入するとの根拠は得られなかった。これはＵＶに選択的な感受性であるｍｕｓ−１８変異株の表現型とよく一致する。Ｎ . ｃｒａｓｓａは存在するとしてもＵＶ損傷に対して非常に効率の悪いＮＥＲはもたない。（Ishi et al.,１９９１，Mol. Gen. Genet.，２２８，３３−３９）。従って、この生物体では、ｍｕｓ−１８遺伝子がＵＶ誘発損傷、特に（６−４）ＰＰに対するＮＥＲに代って働く可能性がある（下記参照）。最近、ＮＥＲの完全に欠失したスキゾサッカロマイセスポンベ（Schizosaccharomyces pombe）は、ＤＮＡ中のＣＰＤおよび（６−４）光化学反応物の相当な修復能を依然として維持していることが報告された（MaCready et al.,１９９３，Mol. Microbiol.，１０，８８５−８９０）。より最近になって、Ｓ. ｐｏｍｂｅの細胞抽出物の酵素活性がＭｕｓ−１８と同様な様式でＴＴおよびＴＣダイマーにニックを導入することが報告された（Bowman et al.,１９９４，Nucleic Acids Res.，２２，３０２６−３０３２）。非常に効率よくＣＰＤフォトリアーゼ活性を獲得するＮ . ｃｒａｓｓａ（Yajima et al.,１９９１，Nucleic Acids Res.，１９，５３５９−５３６２；Eker et al.,１９９４，Photochem. Photobiol.，６０，１２５−１３３）とは対照的に、Ｓ . ｐｏｍｂｅはそのような活性をまったくもたない（Yasui et al.,１９８９，Mutat. Res.，２１７，３−１０）ので、Ｍｕｓ−１８の相同蛋白質はＵＶ誘発ＣＰＤの修復をサポートする可能性がある。従って、Ｍｕｓ−１８とその相同蛋白質は進化上密接な関係を有する生物Ｎ. ｃｒａｓｓａとＳ . ｐｏｍｂｅのＵＶ誘発ＤＮＡ損傷の除去またはＰＨＲの欠損をそれぞれ償うものと思われる。同様な酵素が他の生物にも分布している可能性はある。
【００３１】
ここに、ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａのＵＶダイマーエンドヌクレアーゼと命名したｍｕｓ−１８の精製蛋白質は、Ｔ４エンドヌクレアーゼが哺乳類細胞に残存するＣＰＤの分析に使用されるように、細胞のＵＶ損傷を同定する道具としても有用であろう。すべてのピリミジンダイマーまたはＣＰＤフォトリアーゼとの組み合わせ使用によって、未修復（６−４）ＰＰを同定することもできる。
【００３２】
【実施例】
材料および方法
菌株および細胞系
発現のために、Ｎ. ｃｒａｓｓａのｃＤＮＡを、Ｅ . ｃｏｌｉＳＹ２株（ＪＭ１０７ △ｐｈｒ：：Ｃｍ^r △ｕｖｒＡ：：Ｋｍ^r △ｒｅｃＡ：：Ｙｅｔ^r）（Yasuhira and Yasui,１９９２，J. Biol. Chem.，２６７，２５６４４−２５６４７）へのクローニングに使用した。ＳＹ１株（△ｐｈｒ：：Ｃｍ^r △ｕｖｒＡ：：Ｋｍ^r）、ＫＹ２９（△ｐｈｒ：：Ｃｍ^r △ｒｅｃＡ：：Ｔｅｔ^r）およびＫＹ２０（△ｐｈｒ：：Ｃｍ^r）も、クローン化遺伝子で形質転換した。ＫＹ２０およびＫＹ２９は、K. Yamamoto 博士（東北大理学部）より得た。使用した酵母サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）は、ＧＲＦ１８（野生型、ｌｅｕ２）、ｙａ１０３１（ｒａｄ１ｌｅｕ２）、ｙａ２−２（ｒａｄ２ｌｅｕ２）およびｙａ１８−１（ｒａｄ１８ｌｅｕ２）であった。これらの菌株はＧＲＦ（Dr. G. R. Fink，マサチューセッツ工科大学より得た）以外は、本発明者らによって樹立された。ＸＰＡ細胞系、ＸＰ１２ＲＯＳＶは、Dr. K. Tanaka（大坂大学細胞工学センター：田中亀代次博士）より得た。
【００３３】
ｃＤＮＡおよびゲノムのライブラリー
ラムダＺＡＰ（Orbach et al.,１９９０，J. Biol. Chem.，２６５，１０９８１−１０９８７）に構築されたＮ . ｃｒａｓｓａのｃＤＮＡライブラリーは、Dr. M. S. Sachs上記文献を参照のことより入手した。Ｅ . ｃｏｌｉ用発現ライブラリーにｉｎｖｉｔｒｏ切断によって転換した。ゲノムライブラリーは、λ ＥＭＢＬ３にＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡを導入することにより野生型Ｎ . ｃｒａｓｓａから作製した。
【００３４】
Ｎ . ｃｒａｓｓａｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのクローニングおよび配列決定
ＳＹ２細胞における相補性によるフォトリアーゼ遺伝子の単離方法（Yasuhiraおよび Yasui,１９９２，J. Biol. Chem.，２６７，２５６４４−２５６４７）を改良して使用した。既述すれば、ｃＤＮＡライブラリーで形質転換したＳＹ２細胞の一昼夜培養物１００μｌを、４種の抗生物質（アンピシリン、カナマイシン、クロムフェニコールおよびテトラサイクリン）を含むＬＢプレート上で０.１Ｊ／ｍ²の用量でＵＶ照射し、一昼夜インキュベートした。生存しているコロニーを、抗生物質添加ＬＢ培地中に集め、さらに培養した。細胞懸濁液をＬＢプレートに塗布し、さらなるＵＶ照射に供した。３度の選択後、数個の生存コロニーを、ＵＶ耐性について試験した。
【００３５】
クローン化ｃＤＮＡプローブでゲノムライブラリーをスクリーニングし、クローン化ｃＤＮＡの全配列を含む４.７ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントを単離した。２４２２ｂｐを含む完全ｃＤＮＡとＯＲＦの上流配列を含む１ｋｂ鎖長にゲノムフラグメントのヌクレオチド配列を決定した。
【００３６】
大腸菌、酵母およびヒトＸＰＡ細胞系におけるクローン化遺伝子の発現のためのプラスミドの構築およびトランスフォーメーション
Ｅ . ｃｏｌｉでのｍｕｓ−１８遺伝子の発現のために、前記クローン化ｃＤＮＡ由来のコーディング配列をｐＫＫ２３３−２（Pharmacia）のｔａｃプロモーターの後に導入した。
【００３７】
酵母でのｍｕｓ−１８遺伝子の発現のために、ＬＥＵ２選択マーカーを有するｐＫＴ１０プラスミド（Dr. M. Nakafuku，東京大学）のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターの後に導入した。酵母細胞を Hinnen et al（１９７８）Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ７５，１９２９−１９３３に記載の方法で形質転換した。
【００３８】
ヒトの細胞で発現するために、ｐｃＤＮＡＩ（INVITROGEN）のＣＭＶプロモーターの後に導入した。Ｇ４１８耐性マーカーを担持するプラスミドと一緒にＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（GIBCOBRL）によって細胞をトランスフェクションした。選択はＧ４１８（WAKO）を用いて行った。各種用量でのＵＶ照射後のコロニー形成能を形質転換された大腸菌、酵母およびヒト細胞について測定した。データは、最低２回の独立した実験の平均値によった。ｍｕｓ−１８遺伝子産物の精製用として、８個のアミノ酸残基の標識［ＦＬＡＧ（KODAK）］を停止コドンの前のコーディング配列の末端へＰＣＲによって結合した。前記標識を有するｃＤＮＡをｐＫＫＥＮＳ［ｐＫＫ２２３−３（Pharmacia）の誘導体］のｔａｃプロモーターの後に導入し、ｐＫｍｕｓ−１８ＦＬＡＧを得た。
【００３９】
Ｎ．ｃｒａｓｓａのトランスフェクションおよび反復誘発点突然変異（ＲＩＰ）
全ｍｕｓ−１８遺伝子を担持する４.５ｋｂのＥｃｏＲＩゲノムＤＮＡフラグメントを、ハイグロマイシン耐性マーカー（ＨｙｇＢ）と結合し、ｍｕｓ−１８変異細胞に導入した。通常、数コピーのＤＮＡがＮ．ｃｒａｓｓａのゲノム中へ組込まれる。反復誘発点突然変異（ＲＩＰ）によりｍｕｓ−１８遺伝子を不活化するために、２つのｍｕｓ−１８遺伝子をもつＮ . ｃｒａｓｓａ野生型株を逆の接合型を有する野生型株と交雑させた。既に報告されている方法（Selker and Garrett,１９８８，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，８５，６８７０−６８７４）を使用した。
【００４０】
Ｎ．ｃｒａｓｓａの野生型株のおよびｍｕｓ−１８変異株のＤＮＡのサザン分析
野生型株およびｍｕｓ−１８変異株由来のゲノムＤＮＡを常法により単離し、制限酵素で消化し、そしてニトロセルロースフィルター上にブロットした。ＤＮＡプローブを、ＥｃｏＲＩで消化することにより全ｍｕｓ−１８遺伝子を含有するクローン化ゲノムＤＮＡから調製した。ハイブリダイゼーションは非放射性ＤＮＡ標識化と検出キット（Boehringer）を用い、製造業者の説明書に従って行った。
【００４１】
大腸菌宿主細胞からのｍｕｓ−１８遺伝子産物の精製
ＰＫｍｕｓ−１８ＦＬＡＧまたはベクタープラスミドを含むＳＹ２細胞を、カルベニシリンを強化したＬＢ培地１ｌ中のＯＤが０.５になるまで増殖させた。３７℃で５時間１ｍＭのＩＰＩＧで発現を誘導した後、細胞を音波処理緩衝液（３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄、１ｍｇ／ｍｌのリゾチームおよび１ｍＭのＰＭＳＦ、ｐＨ８.０）２０ｍｌ中に集め、０℃で５分間音波処理して崩壊させた。細胞残滓を遠心（４℃、２０分間４３０００×ｇ）により除去した。粗抽出物を３ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロース（Qiagen）カラムにかけ、０.３ＭのＮａＣｌを含有する１５ｍＭのイミダゾールから溶出する画分を集めた。この画分をバッファーＡ（５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ７.５および１ｍＭのＥＤＴＡ）で希釈しＮａＣｌ濃度を０.２Ｍに調節し、次いで０.２ＭＮａＣｌ−バッファーＡで平衡化したホスホ−セルロースカラム（ベッド容積１.５ｍｌ）にのせた。Ｍｕｓ−１８は０.３５ＭＮａＣｌ−バッファーＡで溶離した。次に、その画分を予め０.２ＭＮａＣｌ−バッファーＡで平衡化したヘパリンセファロースカラム（ベッド容積０.３ｍｌ）にのせた。ｍｕｓ−１８−ＦＬＡＧ蛋白質は、０.４ＭＮａＣｌ−バッファーＡで溶離した。９７％均等性を有するｍｕｓ−１８−ＦＬＡＧ蛋白質７２μｇが得られた（図７のａ）。この精製蛋白質を−２０℃において２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、０.５ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、２００μｇ／ｍｌのＢＳＡおよび４０％グリセロール中で保存し、特記しない限り、この溶液をすべての実験で使用した。
【００４２】
プラスミド切断アッセイおよび精製Ｍｕｓ−１８の単位の定義
閉環プラスミドＤＮＡを０.２μｇ／μｌのＤＮＡ濃度で０.１ｋＪ／ｍ²または１ｋＪ／ｍ²のＵＶ照射を行い、これらをそれぞれ標準アッセイまたは単位の定義に使用した。３７℃で３０分間、前記ｍｕｓ−１８含有画分を総量１０μｌの至適反応緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７.９、０.１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＤＴＴおよび１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ）中０.１μｇのＤＮＡと混合した。反応を１０分間６５℃で加熱することにより停止し、０.７５％アガロースゲルで分析した。ｍｕｓ−１８ニック活性の１単位は、１００μｌの反応容積中で３７℃にて６０分以内にＵＶ照射ｃｃＤＮＡ（１ｋＪ／ｍ²）をｏｃＤＮＡへ変換するのに必要な量として定義した。精製Ｍｕｓ−１８の比活性は１μｇ当り７８０単位であった。Ｔ４ｅｎｄｏでは、２０ｍＭのＥＤＴＡを含むがＭｇＣｌ₂を含まないＭｕｓ−１８に使用した緩衝液を使用した。
【００４３】
プラスミドＤＮＡおよび合成オリゴヌクレオチドを基質として使用する除去アッセイおよびニック部位の決定
ＣＰＤに対するアナシスティスニデュランス（Anacystis nidulans）フォトリアーゼ（Eker et al.,１９９０，J. Biol. Chem., ２６５，８００９−８０１５）および（６−４）ＰＰに対するドロソフィラメラノガスター（Drosophila melanogaster）フォトリアーゼ（Todo et al.,１９９３，Nature, ３６１，３７１−３７４）は、それぞれ Dr. A. P. M. Eker および Dr. Todo から入手した。Ｔ４ｅｎｄｏは、Dr. K. Valerie および Dr. K. de Riel から入手したｔａｃプロモーターの後にｄｅｎＶ遺伝子をもつ大腸菌から精製した。ＰＨＲは、室温で１.５時間１０ｃｍからの蛍光を用いる透明チュ−ブで行った。Ｍｕｓ−１８蛋白質およびＴ４ｅｎｄｏは１時間３７℃で使用した。図８に示されるニック部位の分析のために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドをＸｂａＩで消化し、脱リン酸化し、次いでγ−³²ｐ−ＡＴＰで標識した。標識されたＤＮＡをＳａｃＩで消化し、ＰＡＧＥ後５％の中和ゲルから単離した。ＤＮＡの半分に３ＫＪ／ｍ²のＵＶ（２５４ｎｍ、５Ｊ／ｍ²ｓ）を照射し、次いでＭｕｓ−１８で処理した。マキサム・ギルバート法（Maxam and Gilbert,１９７７，Methods Enzymol.，６５，４９９−５６０）後、塩基の化学的破壊を標識されたＤＮＡの別の半分に行った。
【００４４】
２種のジピリミジン配列（下線部）を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：３）
５′−ＧＴＡＴＡＣＡＣＡＣＡＣＧＴＡＴＧＣＡＴＣＡＴＧＴＴＡＴＡＣＧＣＡＣＡＣＣＡＣＡＧＴＧＣＡＴＡＣＡＣＡＴＡＴＡＧＣ−３′
を合成し、１５％アクリルアミドゲルを用いるＰＡＧＥで精製した。５′または３′部位を、それぞれポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）を用いるγ−³²ｐ−ＡＴＰまたはターミナルデオキシトランスフェラーゼ（TdT，Boehringer)を用いるα−³²ｐ−ｄｄＡＴＰで標識した。
【００４５】
適正な大きさのＤＮＡを再度ＰＡＧＥ（１５％ゲル）で精製し、相補鎖にアニールさせた。ＵＶ照射（３ｋＪ／ｍ²）後、Ｍｕｓ−１８で処理し、制限酵素で消化した未照射ＤＮＡと共にＰＡＧＥ（１５％ゲル）で分析した。ＴｄＴまたはウシ腸フォスファターゼ（宝酒造）を使用して、それぞれコールドｄｄＴＴＰを有する３′末端にヌクレオチドを加えるかまたはニツクＤＮＡの５′未満のリン酸を除去した。実験では、１０ｆｍｏｌのＤＮＡに対して３５ｕ（単位）のＭｕｓ−１８を常に使用した。配列およびニツク部位を、ＰＡＧＥ後、ＢＡＳ２０００ Image Analyzer（富士フィルム）によって分析した。
【００４６】
【発明の効果】
皮膚ガンの予防や治療の目的で使用しうる新規ＤＮＡ修復酵素およびその製造方法が提供される。本酵素の具体的な使用態様としては、日焼け止めクリームなどに混合使用すること等が期待される。
【００４７】
【表１】

【００４８】
【表２】

【００４９】
【表３】

【００５０】
【表４】

【００５１】
【表５】

【図面の簡単な説明】
【図１】Ｎ．ｃｒａｓｓａからクローン化されたｃＤＮＡの発現により各種大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株におけるＵＶ耐性の向上を示すグラフである。ＵＶ照射後のベクタープラスミド（白ぬき印）またはｐＵＶＧ３１（黒ぬり印）で形質転換したＥ . ＣｏｌｉＳＹ２（ｐｈｒｕｖｒＡｒｅｃＡ）株（三角印）、ＳＹ１（ｐｈｒｕｖｒＡ）株（四角印）、ＫＹ２９（ｐｈｒｒｅｃＡ）株（逆三角印）およびＫＹ２０（ｐｈｒ）（丸印）の生存曲線。
【図２】クローン化された遺伝子の堆定アミノ酸配列を一文字表記で示す。１９８６ｂｐＯＲＦから堆定される堆定アミノ酸配列が示される。下線を引いた太字のアミノ酸配列は、プロタミンで見い出されたものと同一の配列を示す。
【図３】酵母とヒト細胞系の生存曲線を示すグラフである。ａはサッカロマイセスセレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＵＶ照射後に、ベクタープラスミドｐＫＴ１０−ＬＥＵ２（黒ぬり印）またはそのベクター中にクローン化したｃＤＮＡを有するプラスミド（白ぬき印）で形質転換したＧＲＦ１８（野生型）株（逆三角印）、ｙａ１０３１（ｒａｄ１）株（丸印）、ｙａ２−２（ｒａｄ２）株（三角印）およびｙａ１８−１（ｒａｄ１８）株（四角印）。
ｂはベクターｐｃＤＮＡ（白ぬき印）またはそのベクターのＣＭＶプロモーターの後にクローン化したｃＤＮＡを有するプラスミドで形質転換したＸＰＡ細胞系。ＵＶ耐性レベルは、白ぬき三角印による前記ベクタープラスミドで形質転換したヘラ（ＨｅＬａ）細胞に関して示す。
【図４】ＵＶ生存性に対するＮ . ｃｒａｓｓａのｍｕｓ−１８変異株または野生型細胞へのクローン化遺伝子導入の影響を示すグラフである。クローン化ｃＤＮＡをカバーするＮ . ｃｒａｓｓａのゲノムフラグメントの導入によるｍｕｓ−１８変異株のＵＶ感受性の相補性を表す。クローン化されたゲノム遺伝子は、ハイグロマイシン耐性マーカー（ｈｙｇＢ）を担持するｐＵＶＥＥ１誘導体のトランスフェクションまたはｈｙｇＢを担持するプラスミドｐＣＳＮ４４とｐＵＶＥＥ１の同時トランスフェクションによって導入された。前者（黒ぬり四角印）または後者（黒ぬり逆三角印）の方法によって得られたハイグロマイシン耐性形質転換体、ならびに野生型（白ぬき丸印）細胞およびｍｕｓ−１８変異株（印ぬき三角印）細胞のＵＶ感受性を示す。
【図５】ＵＶ生存性に対するＮ . ｃｒａｓｓａのｍｕｓ−１８変異株または野生型細胞へのクローン化遺伝子導入の影響を示すグラフである。ＲＩＰによって不活化されたｍｕｓ−１８遺伝子を有する細胞のＵＶ感受性を示す。野生型細胞を、ｐＵＶＥＥ１で形質転換した細胞と交雑した。交雑から得られた、２種の子孫を試験した。野生形（白ぬき丸印）細胞、ｐＵＶＥＥ１で形質転換された野生型（黒ぬり四角印）、ｍｕｓ−１８変異株（白ぬき三角印）および２種の子孫（黒ぬり逆三角印）のＵＶ感受性を示す。
【図６】図４と図５に関連するｍｕｓ−１８変異細胞におけるゲノムＤＮＡの転位を示すものであり、サザンハイブリダイゼーションの結果を示すゲル電気泳動図である。前記クローン化遺伝子をカバーするＥｃｏＲＩ（レーン１および２）およびＨｉｎｄＩＩＩ（レーン３および４）で消化したゲノムＤＮＡに対する野生型（レーン１および３）およびｍｕｓ−１８変異株（レーン２および４）から、それぞれ調製したゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションである。
【図７】Ｅ . ｃｏｌｉ形質転換体由来のｍｕｓ−１８遺伝子産物の精製の各段階におけるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）による分析結果を示す図に代わる写真である（ａ）。ｂはニック活性分析による同図に代わる写真である。
Ｅ . ｃｏｌｉ形質転換体由来のｍｕｓ−１８遺伝子産物のＦＬＡＧに対する抗体を用いた精製画分の各段階におけるウェスタンブロットの結果を示す電気泳動図に代わる写真である（ｃ）。
図中のＶおよびＭは、それぞれベクタープラスミドおよびｍｕｓ−１８遺伝子を含む細胞抽出物由来の画分を示す。粗抽出物からの上澄（Ｓ）またはＮｉ−ＮＴＡ（Ｎ）、フォスフォセルロース（Ｐ）およびヘパリンセファロース（Ｈ）カラム由来のＭについてのニック活性を有する画分およびＶについての同画分の分析結果である。
ｄは、Ｍｕｓ−１８のフォスフォセルロース画分におけるニック活性のＭｇ⁺⁺依存性を示す電気泳動図に代わる写真である。この反応混合物中には、ＡＴＰは含まれていない。
【図８】Ｍｕｓ−１８のニック活性に対する基質の決定を示すための電気泳動（ＰＡＧＥ）図に代わる写真である。Ｍｕｓ−１８で処理した５′末端標識プラスミド（ＵＶ照射または未照射）のＰＡＧＥである。一試行実験のＰＡＧＥはパネルの左側から右側に示されている。ａ、ｂ、ｃおよびｄについては、発明の詳細な説明を参照されたい。
【図９】基質決定およびＭｕｓ−１８により導入されたニックの性質を示す電気泳動（ＰＡＧＥ）図に代わる写真である。ａは、２種のジピリミジン配列を含有する合成オリゴヌクレオチドＮＮ３の構造である。ＮｓｉＩとＮｌａＩＩＩ酵素の認識配列およびニック部位を、それぞれ下線および矢印によって示す。上部にはヌクレオチドの数を示している。ｂはＰＨＲと共にそしてＰＨＲを伴わずＭｕｓ−１８（Ｍｕｓ）またはＴ４ｅｎｄｏ（Ｔ４）で切断した５′標識ＮＮ３のＰＡＧＥ分析結果を示す。相補性オリゴマーとアニールさせたＮＮ３をＵＶ照射し、そしてＭｕｓ−１８（レーン１）またはＴ４ｅｎｄ（レーン２）で処理した。ＵＶ照射しそしてアニール化したＤＮＡを（６−４）フォトリアーゼ（レーン３およびレーン４）またはＣＰＤフォトリアーゼ（レーン５およびレーン６）で光回復させ、次いでＭｕｓ−１８（レーン３およびレーン５）またはＴ４ｅｎｄ（レーン４およびレーン６）で処理した。ｃはＭｕｓ−１８またはＴ４ｅｎｄｏで切断した３′末端標識ＮＮ３のＰＡＧＥ分析結果を示す。ＵＶ照射後、ＤＮＡをＭｕｓ−１８（レーン１）またはＴ４ｅｎｄｏ（レーン２）で処理した。ｄはＭｕｓ−１８または制限酵素で切断した５′末端標識ＮＮ３のＰＡＧＥ分析結果を示す。ＵＶ照射ＤＮＡをＭｕｓ−１８（レーン２）で切断し、ｄｄＴＴＰの存在下でＴｄＴで処理した（レーン５）。ＰＡＧＥにおける移動度を比較する目的で、未損傷ＤＮＡをＮｓｉＩ（レーン１）またはＮｌａＩＩＩ（レーン３）で消化し、そしてｄｄＴＴＰを組み入れたもの（それぞれ、レーン４およびレーン６）である。ｅはｍｕｓ−１８蛋白質で切断した３′標識ＮＮ３のＰＡＧＥ分析結果である。ＵＶ照射ＤＮＡをｍｕｓ−１８蛋白質（レーン２）で、次いでＣＩＰ（レーン５）で処理した。移動度を比較する目的で、未損傷ＤＮＡをＮｓｉＩ（レーン１）またはＮｌａＩＩＩ（レーン３）で処理し、次いで脱リン酸化した（それぞれレーン４およびレーン６）。
【図１０】ＵＶ誘発ピリミジンダイマーにおけるＭｕｓ−１８で誘導される除去モデルを示す概念図である。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a DNA repair enzyme. More specifically, the present invention relates to a protein having an enzyme activity involved in repairing DNA damage induced by ultraviolet rays. The present invention also relates to DNA encoding such a protein and a method for producing such a protein.
[0002]
[Background]
Through evolution, ultraviolet light (UV) has a profound impact on organisms, and repair of UV-induced DNA damage has been important in maintaining life. The most important toxic and mutagenic UV photochemical reactants are cyclobutane pyrimidine dimer (CPD) and (6-4) photochemical reactant [(6-4) PP]. Several solutions for removing these photochemical reactants have been identified. Enzymatic photorecovery (PHR) is used in many microorganisms and higher eukaryotic cells, and is a mechanism that specifically returns CPD to the monomer form via photolyase by the energy of visible light. In addition, it is known that (6-4) photoreactive enzymes that act on PP exist in insects (Todo et al., 1993,Nature,361371-374).
[0003]
In addition, the bacteria Micrococcus luteus (Micrococcus luteus) And T4 phage infected E. coli (Escherichia coli), It is known that pyrimidine dimer DNA glycosylase / endonuclease (T4endo) specifically recognizes and removes CPD by initiating base excision repair at the site where CPD occurs. A multifunctional pathway that can remove the two major UV photochemical reactants from DNA is actually a nucleotide excision repair that repairs (6-4) PP much more efficiently than cyclobutane dimers (eg et al ., 1985; Szymkowski et al., 1993,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90, 9823-9827). Nucleotide excision repair (NER) has been found in a variety of prokaryotic and eukaryotic cells, including many bacterial yeasts and humans.
[0004]
More than 30 filamentous fungi Neurospora classa (Neurospora crassa) Mutagenic agent sensitive mutants include xeroderma pigmentosum (XP) or yeast Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) NER deletion mutants similar to the RAD3 epistasis group have not been found.
[0005]
However, it has an unusual phenotype that is sensitive not only to UV but also to chemical mutagens.mus-18 mutant cells have been found (Ishii et al., 1991,Mol. Gen. Genet.,22833-39). CPD produced in DNA of mutant cells by UV irradiation remains unrepaired even after 18 hours in liquid (Id.).
[0006]
The inventors independentlymus-18 mutant cells were probably defective in the CPD repair machinery in genes encoding enzymes such as T4endo. Such genes may complement the UV sensitivity of NER-deficient E. coli. Therefore, the present inventors have made a neurospora classa (N. Crassa) CDNA expression library of E. coli lacking all three CPD repair pathways (NER, PHR and recombinant) (E. coli), And the possibility that a new DNA repair enzyme exists has been studied. as a result,N . crassaofmusIt was found that the deleted gene in the -18 mutant encodes an endonuclease specific for both the CPD site and the (6-4) PP site.
[0007]
On the other hand, T4 endonuclease produced by recombinant technology selectively acts only on CPD, but its activity can be used to mix with sunscreen creams to prevent skin cancer. Has been developed.
[0008]
Considering the above background, if an enzyme that can contribute to the removal and repair of both CPD and (6-4) PP can be provided, it will contribute to the development of a more effective cream.
[0009]
[Structure of the invention]
As described above, the present inventionN . crassaIs found to encode an endonuclease that acts on both the CPD and (6-4) PP sites of damaged DNA, and also succeeds in the isolation and expression of such genes Was completed.
[0010]
Thus, according to the present invention, cyclobutane dimer (CPD) and (6-4) binding products (or “photoreactants”) [(6- 4) PP] is specifically recognized, and a protein having an enzymatic activity capable of cleaving on the 5 ′ side thereof is provided.
[0011]
More specifically, the protein is a protein encoded by the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing described later or a derivative thereof. The term derivative in the context of the present invention means any protein obtained by genetic and / or chemical modification and conserving activity for the purposes of the present invention. Genetic and / or chemical alterations can be understood to mean mutations, substitutions, deletions, additions and / or modifications of any one or more residues. Examples of such derivatives include, in particular, the purpose of improving affinity to a site where a protein acts, the purpose of increasing the production amount or facilitating purification, the purpose of improving resistance to proteases or promoting cell membrane penetration, The thing modified | denatured so that it may contribute to the other objective can be mentioned.
[0012]
Therefore, the protein of the present invention is a protein itself consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a protein derived therefrom for at least one purpose described above. Those skilled in the art will be able to easily produce various derivatives by peptide synthesis methods known per se based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In addition, a nucleotide sequence encoding a necessary protein can be expressed in an appropriate host, and if necessary, further chemical or enzymatic modification can be performed thereafter to produce a desired protein.
[0013]
The present invention also provides a method for producing the protein by a genetic recombination method. More specifically, a method comprising a step of culturing a host cell containing a DNA encoding any one of the proteins in a state capable of expressing the protein in a nutrient medium, and collecting the protein produced by the expression of the DNA. Is provided.
[0014]
The “state in which DNA can be expressed” refers to a state in which the target DNA is incorporated into a vector capable of autonomous replication and is placed under the control of a signal for expressing it. Here, the signal includes a promoter, a terminator, a leader sequence for secretion, etc., and these can be arbitrarily selected according to the type of host cell to be used.
[0015]
Furthermore, the DNA can form a part of a vector plasmid, and the vector plasmid thus constructed is also an embodiment of the present invention.
[0016]
The vector can be autonomously replicating or integrated replicating. More specifically, an autonomously replicating vector can be produced using an autonomously replicating sequence in a selected host. An integration vector can be produced, for example, by using a sequence homologous to a certain region of the host genome, and enables integration of a vector plasmid by homologous recombination. Hosts that can be used to produce the proteins of the invention by recombinant techniques are eukaryotic cells or prokaryotic cells. Suitable eukaryotic hosts can include animal cells, yeast or bacteria. The yeast that can be mentioned in particular is Saccharomyces (Saccharomyces) Or Kluyveromyces (Kluyveromyces) Yeast belonging to the genus and the like. Animal cells that can be mentioned are the cells COS, CHO, C127 and the like. More specific among the fungi Aspergillus (Aspergillus) Or Trichoderma species (Trichoderma) The thing which belongs to a genus etc. can be mentioned. Prokaryotic cells include E. coli (E. coli), Bacillus (BacillusEtc.) are preferred.
[0017]
Thus, the protein of the present invention can be mass-produced.
[0018]
In order to make it easier to understand the substance of the present invention and its action and effects, the DNA of the present invention represented by SEQ ID NO: 1 will be described below as an example with reference to the accompanying drawings.
[0019]
Neurospora supplements the UV sensitivity of E. coli strain SY2. crassa Cloning genes from cDNA libraries
Wild typeN . crassaRepair deletion of cDNA libraryE . coli It introduce | transduces into SY2 strain | stump | stock, and obtains the UV resistant transformant containing a plasmid (pUVG31). This plasmid is not only SY2, but also otherE . coliThe UV resistance of the host was improved (FIG. 1). The nucleotide sequence of the 2.4 kb insert in pUVG31 is determined. The start codon was confirmed by sequencing a genomic fragment located 5 'of the cDNA (access number: D11392). The arrangement includes a 1968 base open reading frame (ORF). The deposited amino acid sequence is a 74,421 Mr protein that is different from any of the DNA repair enzymes including T4endo that have already been reported (FIG. 2, SEQ ID NO: 2).
[0020]
Partial supplementation of UV sensitivity in yeast red mutants and human xeroderma pigmentosum cell lines
In order to see the complementation of UV sensitivity by cloned genes in other organisms, Saccharomyces cerevisiae defective in various DNA repairs was transformed after the yeast promoter. NER gene,rad1 andrad2 mutants defective in 2, and post-replication repair deletionradEighteen strains were converted to UV resistant cells with the introduced plasmid, but the UV sensitivity of the wild type strain only slightly increased UV resistance due to its transformation (a in FIG. 3). Similarly, group A (XPA) cells supplementing human xeroderma pigmentosum with the cDNA acquired UV resistance to almost half of the Hera cells (FIG. 3b). The UV resistance of HeLa cells was not affected by the introduction of the plasmid. Thus, cloned genes increase the resistance of DNA repair deficient cells derived from various species. This suggests that the ORF encodes a factor that acts independently of other proteins in the cell to initiate UV damage repair.
[0021]
Relationship between cloned gene and mus-18 mutation
With cloned genesN . crassaThe relationship with the mus-18 mutation was investigated.N . crassaDNA across the entire cDNA region from a genomic library ofmusIt introduced into -18 mutant cells. The two transformants showed the same resistance to UV (Figure 4). In addition, we use repeat-enduced point mutation (RIP)musThe -18 gene was inactivated. RIP may inactivate overlapping DNA sequences premeioticallyN . crassa(Selker et al, 1987,Cell,51, 741-752; Selker and Garrett, 1988,Proc. Natl. Acad. Sci USA,85, 6870-6874). Two offspring from a cross between a wild type cell and a wild type cell transformed with a cloned genomic gene aremusIt showed the same UV sensitivity as that of the -18 mutant (FIG. 5). In these clones, endogenous genes and transfermusBoth of the -18 genes are inactivated by RIP. Finally, with the wild typemusSouthern hybridization analysis of the genomic DNA of the -18 mutant shows changes that include deletions in the mutant genome (Figure 6). From these results, the cloned gene isN . crassaMutant strainmusWe concluded that it was deleted in -18. We have cloned genesmusIt is called -18 gene.
[0022]
E . Purification of mus-18 protein from E. coli
A tag encoding 8 amino acid residues at the 3 'endmusIt was fused to the -18 gene and expressed in repair-deficient SY2 host cells. This recombinant gene conferred UV resistance equivalent to that of the gene having no marker in the host. The recombinant protein was purified using an antibody against the label and nick (cleavage) activity against the UV-irradiated plasmid as an indicator. The deposited amino acid sequence in the ORF of the cloned cDNA contains several consecutive histidine sequences. Therefore, first, the cell extract is treated with Ni.²⁺A nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) agarose column was applied. Subsequently, it was purified by affinity chromatography of phosphocellulose and further heparin sepharose. SDS-gel electrophoresis of the fraction having nick activity against the UV-irradiated plasmid is shown in FIGS. Similar elution fractions from cells transformed with the vector plasmid did not show such activity (Fig. 7a). Judging from gel electrophoresis, the final fraction was more than 95% pure. The antibody against FLAG recognized the purified protein of about 74 KD shown in FIG. Thus,musIt was determined that only -18 gene products would introduce nicks into UV irradiated DNA. The purified protein is converted into Mg during the nick reaction to UV irradiated plasmid.⁺⁺Not only ATP is required (Fig. 7d).
[0023]
Determination of substrate and nick active sites of purified mus-18 protein in UV irradiated plasmids and synthetic oligonucleotides
musThe linearized plasmid was treated with Mus-18 for the purpose of identifying nucleotide sequences that are cleaved (nicked) by the -18 protein (Mus-18). The protein introduced nicks (cuts) only when this plasmid was irradiated with UV (FIG. 8). Treatment of UV irradiated DNA with Mus-18 formed different concentrations of DNA bands in the TC, TT, CC and CT sequences. When the migration rate of the DNA fragment in the polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) of FIG. 8 is seen, what was produced | generated by Mus-18 is moving slower than a sequence marker. The position of the TC and TT sequence bands indicated by arrows a and b are near the first nucleotide sequence of the dipyrimidine sequence marker at the top of the PAGE and after the second nucleotide at the bottom of the PAGE indicated by c and d. It is in. This is because Mus-18 cleaves DNA at a site adjacent to 5 'of the dipyrimidine, in contrast to DNA having 3' phosphate obtained by chemical base degradation. It means releasing.
[0024]
Include only two TC and TT dipyrimidine sequences to identify damage to DNA cleaved by Mus-18 and analyze how nicks are introduced into the damaged site 54mer synthetic oligonucleotidein vitroUsed in the assay. Considering the above results obtained with the labeled plasmid,NsiI andNlaCleavage sites for the two restriction enzymes of III are introduced at positions 5 'adjacent to the TC and TT sequences, respectively. This oligonucleotide labeled at the 5 'or 3' end and annealed with its complementary oligonucleotide was used as a substrate for Mus-18 after UV irradiation. 5 ′ end-labeled DNA (nicked at TC or TT site with Mus-18) migrated faster than that cleaved with T4endo (FIG. 9b, lanes 1 and 2). (6-4) PHR using photolyase for PP or CPD almost disappears the band in TC (lane 3) or TT (lane 5), respectively, but the band generated by T4endo is due to PHR using photolyase for CPD. Completely disappeared (lane 6). The 3 ′ end-labeled DNA cleaved with Mus-18 migrated slightly later than that cleaved with T4endo (FIG. 9c, lanes 1 and 2). This corresponds to that obtained using 5 'end-labeled DNA, indicating that Mus-18 introduces a single nick at the 5' site of the site cleaved with T4endo.
[0025]
FIG. 9d shows that the 5 ′ end DNA cleaved by Mus-18 at the TC or TT sequence isNsiI orNlaElectrophoresed to the same position as that generated after digestion with III (lanes 1 to 3). The cleaved DNA serves as a substrate for terminal deoxytransferase with ddTTP, resulting in additional nucleotides (lanes 4-6), indicating the presence of a 3'OH end. The mobility of the 3′-labeled and Mus-18-cleaved DNA fragment was also the same as that produced by the restriction enzyme (FIG. 9c, lanes 1-3). Post-treatment of DNA cleaved with calf intestinal phosphatase (CIP) slightly delayed the movement of all DNA. It shows that phosphate is present at the 5 'end of DNA cleaved by Mus-18.
[0026]
N . crassa Mus-18 gene and mutation in UV-sensitive mutants
As mentioned above,N . crassaCDNA library and UV sensitivityE . coliA novel eukaryotic DNA repair gene was isolated due to its complementation.musThe -18 gene encodes a protein with a highly hydrophilic carboxy terminus. Of particular interest is the sequence 4xLys-2xGly-2x (Lys Arg), shown in bold underlined in FIG. This sequence is the sequence found at the carboxy terminus of protamine, a peptide that interacts closely with DNA [6xArg-2xGly-4xArg in rainbow trout protamine IA (Ando and Watanabe, 1969,Int. J. Protein Res.,1, 221-224)]. With various deletions in this sequencemusThe -18 gene isE . coli It affects the UV-sensitive supplementary activity of SY2 host cells, suggesting that the sequence plays an important role in the enzymatic function of the gene product.
[0027]
N . crassaofmusMutations in the −18 mutant strain were identified by the following three methods. One is due to the introduction of wild-type gene (RIP)musComplementation of UV sensitivity in strain -18, and the other is a comparison of Southern analysis using wild type DNA and mutant genomic DNA. From the Southern analysis, the mutation ismusIt can be seen that a portion of the genomic fragment containing the -18 gene is accompanied by a deletion.
[0028]
Nick caused by purified Mus-18
musThe -18 gene encodes a protein having nick activity for both CPD and (6-4) PP. Mus-18 is shown to introduce a nick at position 5 'adjacent to UV-induced CPD and (6-4) PP, resulting in single strand breakage of the damaged DNA strand (Figure 10). Mus-18 substrates include pyrimidine dimers generated in the TT, TC, CC and CT sequences. The change in the intensity of the nick band shown in FIG. 8 seems to be due to the difference in the degree of damage by UV and / or the selectivity of repair by Mus-18. High UV dose (3 kJ / m²) To the plasmid and oligonucleotide, respectively, produces a relatively large amount of (6-4) PP in the TC sequence. After irradiating DNA with a low dose of UV, the protein preferentially cleaves the TT site. Although the priority of nick activity between UV-induced dimers by the protein has not been confirmed, it seems that there is a difference in recognition by the protein between CPD and (6-4) PP. Due to the introduction of nicks in the thymine-thymine dimer, Mus-18 is a longer flanking sequence for damage than for (6-4) PP, as judged from analysis with synthetic DNA of various chain lengths. Need. This suggests that the extent to which Mus-18 recognizes various UV-derived dimers having different chemical structures is the next problem to be solved.
[0029]
Supplementation of UV sensitivity in host cells by the mus-18 gene
Another interesting problem arising from the Mus-18 study is how much nick sites are subsequently processed in the cell. Introduced into E. coli, yeast and human cellsmus-18 inheritance similarly increases the UV viability of these host cells. In this respect, Mus-18 is similar to T4endo which can confer UV resistance to yeast rad mutants and human XP cells (Valerie et al., 1986).Mole. Cell. Biol.,6, 3559-3562). UV sensitivity supplementation in various repair-deficient host cells was only partial and did not reach the UV resistance of wild type cells. In yeast cells, post-replication repair-deficient rad18 mutants with full NER activity and two NER mutants (rad1 and rad2) [these lack nick activity at positions 5 'and 3' of DNA damage, respectively. (Bardwell et al., 1994,Science,265, 2082-2085; Harrington and Lieber, 1994,Genes Dev.,8, 1344-1355)]musThe −18 gene increases UV resistance to the same extent (FIG. 3). These results suggest that they are further processed by repair pathways independent of the cleavage mechanism in these organisms.
[0030]
The role and distribution of Mus-18
As long as the present inventors analyzed, there was no evidence that Mus-18 introduced nicks into DNA damage sites other than UV-induced damage. This is a selective sensitivity to UVmusIt closely matches the phenotype of the -18 mutant.N . crassaEven if present, it has no very inefficient NER against UV damage. (Ishi et al., 1991,Mol. Gen. Genet.,22833-39). So in this organism,musThe -18 gene may act in place of UV-induced damage, particularly NER against (6-4) PP (see below). Recently, Schizosaccharomyces pombe (a complete deletion of NER)Schizosaccharomyces pombe) Has been reported to still maintain considerable repair capacity of CPD and (6-4) photochemical reactants in DNA (MaCready et al., 1993,Mol. Microbiol.,10, 885-890). More recently,S.pombeHave been reported to introduce nicks into TT and TC dimers in a manner similar to Mus-18 (Bowman et al., 1994,Nucleic Acids Res.,22, 3026-3032). Acquire CPD photolyase activity very efficientlyN . crassa(Yajima et al., 1991,Nucleic Acids Res.,19, 5359-5362; Eker et al., 1994,Photochem. Photobiol.,60, 125-133),S . pombeHas no such activity (Yasui et al., 1989,Mutat. Res.,217, 3-10), Mus-18 homologous proteins may support UV-induced CPD repair. Therefore, Mus-18 and its homologous proteins are closely related in evolution.N.crassaWhenS . pombeIt seems to compensate for the removal of UV-induced DNA damage or PHR deficiency, respectively. Similar enzymes may be distributed in other organisms.
[0031]
here,NeurosporaNamed as UV dimer endonucleasemusThe purified protein of -18 would also be useful as a tool to identify cellular UV damage, such that T4 endonuclease is used to analyze CPD remaining in mammalian cells. Unrepaired (6-4) PP can also be identified by use in combination with all pyrimidine dimers or CPD photolyases.
[0032]
【Example】
Materials and methods
Strains and cell lines
For expression,N.crassaCDNA ofE . coli SY2 strain (JM107 Δphr :: Cm^r △ uvr A :: Km^r Δrec A :: Yet^r) (Yasuhira and Yasui, 1992,J. Biol. Chem.,267, 25644-25647). SY1 strain (Δphr :: Cm^r △ uvrA :: Km^r), KY29 (Δphr :: Cm^r Δrec A :: Tet^r) And KY20 (Δphr :: Cm^r) Was also transformed with the cloned gene. KY20 and KY29 were obtained from Dr. K. Yamamoto (Tohoku University Faculty of Science). Yeast Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Were GRF18 (wild type, leu2), ya1031 (rad1 leu2), ya2-2 (rad2 leu2) and ya18-1 (rad18 leu2). These strains were established by the inventors except GRF (obtained from Dr. G.R.Fink, Massachusetts Institute of Technology). The XPA cell line, XP12ROSV, was obtained from Dr. K. Tanaka (Osaka University Cell Engineering Center: Dr. Kajiro Tanaka).
[0033]
cDNA and genomic libraries
Lambda ZAP (Orbach et al., 1990,J. Biol. Chem.,265, 10981-10987)N . crassaThe cDNA library of Dr. M. S. Sachs was obtained by referring to the above literature.E . coliFor expression libraryin vitroConverted by cutting. Genomic library is available at λ EMBL3Eco Wild type by introducing RI digested DNAN . crassaMade from.
[0034]
N . crassa Cloning and sequencing of cDNA and genomic DNA
Isolation method of photolyase gene by complementation in SY2 cells (Yasuhira and Yasui, 1992,J. Biol. Chem.,267, 25644-25647) were used. As described above, 100 μl of an overnight culture of SY2 cells transformed with a cDNA library was transferred to 0.1 J / m on an LB plate containing four antibiotics (ampicillin, kanamycin, chromium phenicol and tetracycline).²Were irradiated with UV and incubated overnight. Surviving colonies were collected in LB medium supplemented with antibiotics and further cultured. The cell suspension was applied to an LB plate and subjected to further UV irradiation. After 3 selections, several surviving colonies were tested for UV resistance.
[0035]
Screening genomic library with cloned cDNA probe, 4.7 kb containing the entire sequence of cloned cDNAEco The RI fragment was isolated. The nucleotide sequence of the genomic fragment was determined to a 1 kb chain length including the complete cDNA containing 2422 bp and the upstream sequence of ORF.
[0036]
Construction and transformation of plasmids for expression of cloned genes in E. coli, yeast and human XPA cell lines
E . coliInmusFor the expression of the -18 gene, the coding sequence derived from the cloned cDNA was changed to pKK233-2 (Pharmacia).tacIt was introduced after the promoter.
[0037]
In yeastmusFor expression of the -18 gene, it was introduced after the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) promoter of the pKT10 plasmid (Dr. M. Nakafuku, University of Tokyo) having a LEU2 selection marker. Yeast cells were treated with Hinnen et al (1978).Proc. Natl. Acad. Sci. USA,75, 1929-1933.
[0038]
For expression in human cells, it was introduced after the CMV promoter of pcDNAI (INVITROGEN). Cells were transfected with Lipofectin (GIBCOBRL) along with a plasmid carrying a G418 resistance marker. Selection was performed using G418 (WAKO). Colony forming ability after UV irradiation at various doses was measured for transformed E. coli, yeast and human cells. Data were from the average of at least two independent experiments.musFor purification of the -18 gene product, a tag of 8 amino acid residues [FLAG (KODAK)] was ligated by PCR to the end of the coding sequence before the stop codon. The cDNA having the above-mentioned label is obtained by pKKENS [pKK223-3 (Pharmacia) derivative].tacIt was introduced after the promoter to obtain pKmus-18FLAG.
[0039]
N. crassa transfection and repetitive point mutation (RIP)
allmus4.5kb carrying the -18 geneEco Ligating the RI genomic DNA fragment with a hygromycin resistance marker (HygB);musIt introduced into -18 mutant cells. Usually several copies of DNAN.crassaIntegrated into the genome. By repetitive induction point mutation (RIP)musTo inactivate the -18 gene,musHas -18 geneN . crassaWild type strains were crossed with wild type strains having the opposite mating type. Already reported methods (Selker and Garrett, 1988,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,856870-6874).
[0040]
N. Southern analysis of the DNA of the wild-type strain of crussa and the mus-18 mutant
Wild type strains andmusGenomic DNA from the -18 mutant was isolated by conventional methods, digested with restriction enzymes, and blotted onto nitrocellulose filters. DNA probeEco All by digestion with RImusPrepared from cloned genomic DNA containing the -18 gene. Hybridization was performed using non-radioactive DNA labeling and detection kit (Boehringer) according to the manufacturer's instructions.
[0041]
Purification of mus-18 gene product from E. coli host cells
SY2 cells containing PKmus-18FLAG or vector plasmid were grown until the OD in 1 liter of LB medium enriched with carbenicillin was 0.5. After inducing expression with 1 mM IPIG for 5 hours at 37 ° C., the cells were sonicated with buffer (300 mM NaCl, 50 mM NaH.₂PO_FourCollected in 20 ml of 1 mg / ml lysozyme and 1 mM PMSF, pH 8.0 and disrupted by sonication at 0 ° C. for 5 minutes. Cell debris was removed by centrifugation (4 ° C., 20 minutes, 43000 × g). The crude extract was applied to a 3 ml Ni-NTA agarose (Qiagen) column and fractions eluting from 15 mM imidazole containing 0.3 M NaCl were collected. This fraction was diluted with buffer A (50 mM Tris HCl, pH 7.5 and 1 mM EDTA), the NaCl concentration was adjusted to 0.2 M, and then a phospho-cellulose column equilibrated with 0.2 M NaCl-buffer A ( The bed volume was 1.5 ml). Mus-18 was eluted with 0.35M NaCl-buffer A. Next, the fraction was applied to a heparin sepharose column (bed volume 0.3 ml) previously equilibrated with 0.2 M NaCl-buffer A.musThe -18-FLAG protein was eluted with 0.4 M NaCl-buffer A. 97% uniformitymus72 μg of -18-FLAG protein was obtained (a in FIG. 7). This purified protein is stored at −20 ° C. in 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 mM EDTA, 200 mM NaCl, 1 mM DTT, 200 μg / ml BSA and 40% glycerol unless otherwise specified. This solution was used in all experiments.
[0042]
Definition of units of plasmid cleavage assay and purified Mus-18
The closed circular plasmid DNA was 0.1 kJ / m at a DNA concentration of 0.2 μg / μl.²Or 1 kJ / m²Were used to define standard assays or units, respectively. 30 minutes at 37 ° CmusThe fraction containing -18 was diluted to a total volume of 10 μl of optimal reaction buffer (50 mM Tris HCl, pH 7.9, 0.1 M NaCl, 20 mM MgCl₂Mixed with 0.1 μg of DNA in 1 mM DTT and 100 μg / ml BSA). The reaction was stopped by heating at 65 ° C. for 10 minutes and analyzed on a 0.75% agarose gel.musOne unit of -18 nick activity is UV-irradiated cDNA (1 kJ / m within 60 minutes at 37 ° C. in a reaction volume of 100 μl.²) Was defined as the amount required to convert to ocDNA. The specific activity of purified Mus-18 was 780 units per μg. T4endo contains 20 mM EDTA but MgCl₂The buffer used for Mus-18, which did not contain any of the above, was used.
[0043]
Removal assay and nick site determination using plasmid DNA and synthetic oligonucleotides as substrates
Anasis Nidurance for CPD (Anacystis nidulans) Photolyase (Eker et al., 1990,J. Biol. Chem.,265, 8009-8015) and (6-4) PP Drosophila melanogaster (Drosophila melanogaster) Photolyase (Todo et al., 1993)Nature,361371-374) were obtained from Dr. A. P. M. Eker and Dr. Todo, respectively. T4endo was obtained from Dr. K. Valerie and Dr. K. de RieltacPurified from E. coli with the den V gene after the promoter. PHR was performed in a transparent tube using fluorescence from 10 cm for 1.5 hours at room temperature. Mus-18 protein and T4endo were used for 1 hour at 37 ° C. For analysis of the nick site shown in FIG. 8, the pBluescript plasmid wasXbaDigested with I, dephosphorylated, then γ-³²Labeled with p-ATP. Labeled DNASa cDigested with I and isolated from 5% neutralization gel after PAGE. 3KJ / m for half of DNA²UV (254 nm, 5 J / m²s) was irradiated and then treated with Mus-18. Maxam and Gilbert (1977,Methods Enzymol.,65, 499-560), then chemical destruction of the base was performed on another half of the labeled DNA.
[0044]
Oligonucleotide having two dipyrimidine sequences (underlined) (SEQ ID NO: 3)
5'-GTA TAC ACA CAC GTA TGC ATC ATGTTA TAC GCA CAC CAC AGT GCA TAC ACA TAT AGC-3 '
Was purified by PAGE using 15% acrylamide gel. The 5 ′ or 3 ′ site is γ− using polynucleotide kinase (Takara Shuzo), respectively.³²α- using p-ATP or terminal deoxytransferase (TdT, Boehringer)³²Labeled with p-ddATP.
[0045]
The correct size DNA was purified again by PAGE (15% gel) and annealed to the complementary strand. UV irradiation (3kJ / m²) And then analyzed by PAGE (15% gel) with unirradiated DNA treated with Mus-18 and digested with restriction enzymes. TdT or bovine intestinal phosphatase (Takara Shuzo) was used to add nucleotides at the 3 'end with cold ddTTP, respectively, or remove less than 5' phosphate of the nick DNA. In the experiment, 35 u (unit) of Mus-18 was always used for 10 fmol of DNA. Sequences and nick sites were analyzed by BAS 2000 Image Analyzer (Fuji Film) after PAGE.
[0046]
【The invention's effect】
A novel DNA repair enzyme that can be used for the purpose of preventing or treating skin cancer and a method for producing the same are provided. As a specific usage mode of this enzyme, it is expected to be used in a sunscreen cream or the like.
[0047]
[Table 1]

[0048]
[Table 2]

[0049]
[Table 3]

[0050]
[Table 4]

[0051]
[Table 5]

[Brief description of the drawings]
[Figure 1]N.crassaThe expression of cDNA cloned fromE.coliIt is a graph which shows the improvement of UV tolerance in a strain. Transformed with a vector plasmid (white marker) or pUVG31 (black marker) after UV irradiationE . Coli Survival curves of SY2 (phr uvrA recA) strain (triangle), SY1 (phr uvrA) strain (square), KY29 (phr recA) strain (reverse triangle) and KY20 (phr) (circle).
FIG. 2 shows the amino acid sequence of the cloned gene in single letter code. The deposited amino acid sequence deposited from the 1986 bp ORF is shown. The underlined bold amino acid sequence shows the same sequence as that found with protamine.
FIG. 3 is a graph showing the survival curves of yeast and human cell lines. a is Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiaeGRF18 (wild type) strain (inverted triangle) transformed with vector plasmid pKT10-LEU2 (black marker) or a plasmid having cDNA cloned in the vector (inverted triangle symbol), ya1031 (Rad1) strain (circle mark), ya2-2 (rad2) strain (triangle mark) and ya18-1 (rad18) strain (square mark).
b is an XPA cell line transformed with a vector pcDNA (open symbol) or a plasmid having a cDNA cloned after the CMV promoter of the vector. UV resistance levels are indicated for the HeLa cells transformed with the vector plasmid by open triangles.
FIG. 4 vs. UV viabilityN . crassaofmusIt is a graph which shows the influence of the cloning gene transfer to a -18 mutant or a wild type cell. Cover the cloned cDNAN . crassa2 represents the UV-sensitive complementation of the mus-18 mutant by introduction of the genomic fragment. The cloned genomic gene was introduced by transfection of a pUVEE1 derivative carrying a hygromycin resistance marker (hyg B) or by co-transfection of plasmids pCSN44 and pUVEE1 carrying hyg B. Hygromycin-resistant transformants obtained by the former method (blackening square mark) or the latter (blackening inverted triangle mark) method, and wild type (whitening circle mark) cells andmusIt shows the UV sensitivity of -18 mutant cells (marked triangles).
FIG. 5 against UV viabilityN . crassaofmusIt is a graph which shows the influence of the cloning gene transfer to a -18 mutant or a wild type cell. Inactivated by RIPmusShows the UV sensitivity of cells with the -18 gene. Wild type cells were crossed with cells transformed with pUVEE1. Two offspring obtained from the cross were tested. Wild-type (white circle) cells, wild-type transformed with pUVEE1 (black squares),musThe UV sensitivity of the −18 mutant (white triangle) and two offspring (black triangle) is shown.
6 is related to FIG. 4 and FIG.musIt is a gel electrophoretic diagram which shows the transposition of the genomic DNA in a -18 mutant cell, and shows the result of Southern hybridization. Covers the cloned geneEco RI (lanes 1 and 2) andHindWild type (lanes 1 and 3) and genomic DNA digested with III (lanes 3 and 4) andmusSouthern hybridization of genomic DNA prepared from each of the −18 mutants (lanes 2 and 4).
[Fig. 7]E . coliDerived from transformantsmusIt is a photograph replacing a figure which shows the analysis result by the sodium dodecyl sulfate (SDS) polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in each step of refinement | purification of a -18 gene product (a). b is a photograph replacing the figure by nick activity analysis.
E . coliDerived from transformantsmusIt is a photograph instead of an electropherogram showing the result of Western blotting at each stage of a purified fraction using an antibody against -18 gene product FLAG (c).
V and M in the figure are vector plasmid andmusA fraction derived from a cell extract containing the -18 gene is shown. The supernatant from the crude extract (S) or the fraction with nick activity for M and the same fraction for V from Ni-NTA (N), phosphocellulose (P) and heparin sepharose (H) columns It is an analysis result.
d is the nick-active Mg in the phosphocellulose fraction of Mus-18.⁺⁺It is a photograph replacing an electrophoretic diagram showing dependency. This reaction mixture does not contain ATP.
FIG. 8 is a photograph replacing an electrophoretic (PAGE) diagram to show substrate determination for Mus-18 nick activity. PAGE of 5 'end labeled plasmid (UV irradiated or unirradiated) treated with Mus-18. The PAGE for one trial is shown from left to right on the panel. See a detailed description of the invention for a, b, c and d.
FIG. 9 is a photograph replacing an electrophoretic (PAGE) diagram showing substrate determination and the nature of a nick introduced by Mus-18. a is the structure of a synthetic oligonucleotide NN3 containing two dipyrimidine sequences.NsiI andNlaThe recognition sequence and nick site of the III enzyme are indicated by underline and arrow, respectively. The number of nucleotides is shown at the top. b shows the results of PAGE analysis of 5'-labeled NN3 cleaved with Mus-18 (Mus) or T4endo (T4) with and without PHR. NN3 annealed with complementary oligomers was UV irradiated and treated with Mus-18 (lane 1) or T4end (lane 2). UV irradiated and annealed DNA was photorecovered with (6-4) photolyase (lane 3 and lane 4) or CPD photolyase (lane 5 and lane 6) and then Mus-18 (lane 3 and lane 5) Alternatively, it was treated with T4end (lane 4 and lane 6). c shows the results of PAGE analysis of 3 ′ end-labeled NN3 cleaved with Mus-18 or T4endo. After UV irradiation, the DNA was treated with Mus-18 (lane 1) or T4endo (lane 2). d shows the PAGE analysis result of 5'-end labeled NN3 cleaved with Mus-18 or restriction enzyme. UV irradiated DNA was cut with Mus-18 (lane 2) and treated with TdT in the presence of ddTTP (lane 5). For the purpose of comparing mobility in PAGE,NsiI (lane 1) orNlaDigested with III (lane 3) and incorporated with ddTTP (lane 4 and lane 6, respectively). e ismusIt is a PAGE analysis result of 3 'label NN3 cut | disconnected with -18 protein. UV irradiated DNA was treated with mus-18 protein (lane 2) and then with CIP (lane 5). For the purpose of comparing mobility, intact DNANsiI (lane 1) orNlaTreatment with III (lane 3) followed by dephosphorylation (lane 4 and lane 6 respectively).
FIG. 10 is a conceptual diagram showing a Mus-18-induced removal model in UV-induced pyrimidine dimers.

Claims

(A) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and (b) one or several amino acid residues are substituted, deleted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Cyclobutane-type dimers (or CPD) and (6-4) photochemical reactants (or (6-4) PP) consisting of amino acid sequences and induced by UV light from TT and TC sequences in DNA, respectively, in DNA A protein selected from the group consisting of proteins having a nick activity that can specifically recognize and cleave them on the 5 'side.

A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.

A DNA encoding the protein according to claim 1 or 2.

A vector plasmid in which the DNA according to claim 3 is introduced into an expression vector.

The method for producing a protein according to claim 1 or 2, wherein a host cell containing the DNA according to claim 3 in a state capable of expressing the DNA is cultured in a nutrient medium, and the protein produced by the expression of the DNA is collected. .