JP3632242B2

JP3632242B2 - Process for producing palatinose and trehalulose

Info

Publication number: JP3632242B2
Application number: JP16138895A
Authority: JP
Inventors: 幸蔵山田; 隆之清藤; 正江橋; 佳秀川村; 正晃篠永; 文雄宮澤
Original assignee: 富士紡績株式会社; 新三井製糖株式会社
Priority date: 1995-06-05
Filing date: 1995-06-05
Publication date: 2005-03-23
Anticipated expiration: 2020-03-23
Also published as: JPH08322585A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、固定化α−グルコシルトランスフェラーゼを用いて、蔗糖からパラチノースおよびトレハルロースを効率良く製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
パラチノース（別名：イソマルチュロース）およびトレハルロースは、グルコースとフラクトースが、それぞれα−１，６およびα−１，１で結合した甘味を有する非う蝕性の二糖類であり、近年、低う蝕原性甘味料として広く使用されている。
【０００３】
従来より、パラチノースおよびトレハルロースは、グルコースとフラクトースがα−１，２で結合している蔗糖が、プロタミノバクター（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、エルヴィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属等の微生物に含有されるα−グルコシルトランスフェラーゼと呼ばれる糖転移酵素と接触することによって生成されることが特開平３−１８０１７２号、特開平４−１６９１９０号、特開平５−１３０８８６号公報等で開示されている。また、パラチノースおよびトレハルロースを工業的に製造するには、２０〜６０％の蔗糖の水溶液に、α−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物を加えて攪拌し、温度１５〜３０℃、ｐＨ６付近に管理しながら２０時間程度反応させた後、反応液から微生物を遠心分離法等にて除去し、イオン交換樹脂等により精製し得られることも知られている。しかし係る製造工程において、反応液中から微生物を除去することは、微生物と反応液の比重差が少なく、微生物のサイズも小さいことから能率が悪く、工業的には不適当である。この様な問題を解決するために、例えば特公昭６０−９７９７号公報には、α−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物を、アルギン酸カルシウムやポリアクリルアミド、寒天等のゲルに包括したものや、α−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物の全細胞または破砕細胞の成分を、ＤＥＡＥ−セルロースや骨炭といった水不溶性の担体に吸着し、必要に応じてグルタルアルデヒドで架橋させたものを用いることが開示されており、特公昭５８−３６９５９号公報には、α−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物を、アルギン酸カルシウムゲルに包括させて粒状化し、この粒状化物にポリエチレンイミンを浸透させた後、グルタルアルデヒドで架橋させたものを用いることが開示されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上述の従来技術において、特公昭６０−９７９７号公報記載の固定化α−グルコシルトランスフェラーゼのうち、アルギン酸カルシウムゲル等に微生物を包括させたものや、特公昭５８−３６９５９号公報に記載の固定化α−グルコシルトランスフェラーゼは、蔗糖溶液のｐＨが５．８以上のときや、粗精製の蔗糖に含まれるナトリウムイオン等との接触により、アルギン酸カルシウムが水溶性のアルギン酸ナトリウムに変換されて溶出し、ゲルの物理的強度が低下してしまうという欠点があった。この欠点は蔗糖溶液にカルシウム塩を添加することにより改善できるが、反応液に脱塩処理を施さなければならないという問題が新たに発生する。また、α−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物を包括固定させる方法は、固定化量が低い上、糖転移反応の活性を持つα−グルコシルトランスフェラーゼの高次構造の変化と、蔗糖溶液との接触が包括されることにより妨げられる立体的な障害を伴い、活性が低くなってしまうという欠点がある。更に、固定化したα−グルコシルトランスフェラーゼが失活した場合、ゲル担体を再生して繰り返し使用することができないという大きな欠点を抱えていた。
【０００５】
このような欠点を解決する有力な手段としては、特公昭６０−９７９７号公報にＤＥＡＥ−セルロース等の水不溶性の担体にα−グルコシルトランスフェラーゼを固定化する方法が開示されている。この方法であれば、固定化量を多くすることができ、α−グルコシルトランスフェラーゼの高次構造が変化しにくく、α−グルコシルトランスフェラーゼが担体の表面に固定化されるため蔗糖溶液との接触も阻害しない。しかも失活した固定化α−グルコシルトランスフェラーゼを熱アルカリ処理し、未使用の新たなα−グルコシルトランスフェラーゼを固定化することで、担体を容易に再生させることができる。しかしこの方法で得た固定化α−グルコシルトランスフェラーゼは、活性の持続性が極端に悪く、初期活性や再生について満足のいくものではない。
【０００６】
このような観点から、物理的強度に優れ、再生が可能な水不溶性の担体にα−グルコシルトランスフェラーゼを固定化したもので、初期活性に優れ、活性の持続性が良好で、再生による繰り返し使用ができる担体に固定化したα−グルコシルトランスフェラーゼを用いて、パラチノースおよびトレハルロースを製造する方法の開発が強く要望されていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述の課題を解決すべく鋭意研究の結果、粒状多孔質キトサンに、脂肪族ポリアルコールのジグリシジルエーテルとフェニルグリシジルエーテルを反応させた酵素固定化担体にα−グルコシルトランスフェラーゼを固定化させることにより、優れた初期活性と良好な活性持続性が得られ、しかも失活した際、熱アルカリ処理した後に、再度α−グルコシルトランスフェラーゼを固定化することによって、再生が可能で繰り返し使用ができることを見出し、本発明に到達した。
【０００８】
即ち、本発明は、粒状多孔質キトサンに脂肪族ポリアルコールのジグリシジルエーテルとフェニルグリシジルエーテルを反応させて得られた酵素固定化用担体に、α−グルコシルトランスフェラーゼを固定化し、ここで得られた固定化α−グルコシルトランスフェラーゼに蔗糖溶液を接触させることを特徴とするパラチノースおよびトレハルロースの製造方法を提供するものである。
【０００９】
本発明に用いる、粒状多孔質キトサンに脂肪族ボリアルコールのジグリシジルエーテルとフェニルグリシジルエーテルを反応させた酵素固定化用担体は、出願人が先に特願平７−３９１７２号で出願した酵素固定化用担体の製造方法で製造することができる。
【００１０】
即ち、（Ａ）平均分子量が１０，０００〜２３０，０００の低分子量キトサンを蟻酸、酢酸、乳酸等の有機酸や塩酸、硝酸等の無機酸の酸性水溶液に溶解し、該キトサン酸性溶解液を塩基性溶液中に落下せしめて得た粒状多孔質キトサンに、脂肪族ボリアルコールのジグリシジルエーテルを反応させて架橋粒状多孔質キトサンとし、次いで界面活性剤を用いて水中にフェニルグリシジルエーテルを懸濁し、該架橋粒状多孔質キトサンに残存するアミノ基を主体に反応させた後、充分に水洗するか、または、（Ｂ）上述と同様で得た粒状多孔質キトサンに、極性溶剤中でフェニルグリシジルエーテルを反応させ、次いで脂肪族ポリアルコールのジグリシジルエーテルを、該粒状多孔質キトサンに残存するアミノ基を主体に反応させた後、充分に水洗して酵素固定化用担体を得る。
【００１１】
ここで用いる脂肪族ポリアルコールのジグリシジルエーテルとしては、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル等のポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル、ジプロピレングリコールジグリシジルエーテル等のポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル、またはグリセロールポリグリシジルエーテル等が挙げられる。
【００１２】
ここで使用されるフェニルグリシジルエーテルの量は、後に固定化するα−グルコシルトランスフェラーゼの優れた性能を発揮させるために、（Ａ）の場合は架橋粒状多孔質キトサン１Ｌに対し２０〜２００ｇ、好ましくは３５〜２００ｇ、（Ｂ）の場合は粒状多孔質キトサン１Ｌに対し５０〜２００ｇ、好ましくは７５〜２００ｇである。
【００１３】
（Ａ）に用いる界面活性剤としては、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤が挙げられる。しかし架橋粒状キトサンのアミノ基とイオン的な反発ないしは吸着が起こらない、一般に使用されている非イオン性界面活性剤が好ましい。
【００１４】
（Ｂ）に用いる極性溶剤としては、ジオキサン、エタノール、イソプロピルアルコール等の極性溶剤が挙げられ、これらの中から選択し使用される。
【００１５】
次に、このようにして得られた酵素固定化用担体にα−グルコシルトランスフェラーゼを固定化して、固定化α−グルコシルトランスフェラーゼを得る。固定化する方法としては通常の手法を採用することができる。例えば酵素固定化用担体をα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する溶液中で数時間処理し、酵素固定化用担体にα−グルコシルトランスフェラーゼを吸着させて、残留している該溶液を除去し水洗する方法，または水洗後に架橋剤溶液中で数時間処理して、酵素固定化用担体とα−グルコシルトランスフェラーゼを架橋し、残留している該溶液を除去して水洗する方法，或いは酵素固定化用担体を架橋剤溶液中で数時間処理して、架橋剤の官能基の一部と酵素固定化用担体を結合させ、残留している該溶液を除去して水洗した後、α−グルコシルトランスフェラーゼを含有する溶液中で数時間処理して、酵素固定化用担体と結合している架橋剤の未反応の官能基部分にα−グルコシルトランスフェラーゼを結合させ、残留している該溶液を除去して水洗する方法等が採用されるが、架橋剤を用いる方法が特に好ましい。
【００１６】
上述の固定化方法で用いられる架橋剤としては、酵素固定化用担体に導入された２種のグリシジルエーテルが反応していない残存アミノ基と、α−グルコシルトランスフェラーゼの有するアミノ基とを架橋する化合物、即ちイソシアネート基やエポキシ基、アルデヒド基、カルボニル基といった官能基を２個以上備えた化合物であれば良く、具体的にはヘキサメチレンジイソシアネート、エチレングリコールジグリシジルエーテル、グルタルアルデヒド等が挙げられる。
【００１７】
グルタルアルデヒドを用いた反応は、通常０．１〜１０％、好ましくは０．５〜５％のグルタルアルデヒド溶液を、酵素固定化用担体１容量に対して０．１〜１０倍容量、好ましくは０．５〜２倍容量加え、室温にて１０分〜２４時間、好ましくは３０分〜４時間処理して架橋させる。
【００１８】
上述の固定化方法で用いられるα−グルコシルトランスフェラーゼは、蔗糖からパラチノースおよびトレハルロースを生成する糖転移活性を持つものであれば特別限定されるものではなく、例えばプロタミノバクター（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属やセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、エルヴィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属等の微生物を含有する培養液を、ホモジナイザーによって破砕して得た未精製のα−グルコシルトランスフェラーゼや、これを液体クロマトグラフィー等の手法によって、不純物を除いた精製α−グルコシルトランスフェラーゼが挙げられるが、工業的には操作が簡便な未精製のα−グルコシルトランスフェラーゼを用いることが好ましい。
【００１９】
次に上述で得た固定化α−グルコシルトランスフェラーゼを、蔗糖溶液に接触させるが、その方法については特別限定されるものではなく、例えば蔗糖溶液の入った攪拌設備のある容器に固定化α−グルコシルトランスフェラーゼを添加し一定時間攪拌処理する方法や、固定化α−グルコシルトランスフェラーゼをカラムに充填し、このカラムに蔗糖溶液を通液させる方法等が挙げられる。工業的には連続処理が可能な後者の方法が好ましい。この場合に用いられる蔗糖溶液の濃度は１〜６０％、好ましくは２０〜６０％、ｐＨは４〜８、好ましくは５〜７、温度は５〜６０℃、好ましくは１５〜４０℃、通液速度（空間速度）は０．１〜５．０ｈｒ^−１、好ましくは０．２〜２．０ｈｒ^−１で処理する。この様な方法で固定化α−グルコシルトランスフェラーゼに蔗糖溶液を接触させることにより、所望のパラチノースおよびトレハルロースを含有するシロップが得られる。得られたシロップは必要に応じて中和処理、脱塩処理、結晶化処理、イオン交換樹脂を用いた通常の液体クロマトグラフィー処理等により、パラチノースとトレハルロースの混合製品や高純度のパラチノース製品、及び高純度のトレハルロース製品といった製品を得ることができる。
【００２０】
ここで使用する固定化α−グルコシルトランスフェラーゼは、蔗糖溶液との接触により、徐々に糖転移活性が低下していく。そこで使用限界以下に低下した場合は、通常の担体結合法による固定化酵素の再生方法により、酵素固定化用担体を繰り返し使用することができる。即ち使用限界以下に活性が低下した固定化α−グルコシルトランスフェラーゼ１容量に対し０．１〜５Ｎ、好ましくは０．５〜１Ｎの水酸化ナトリウム溶液を０．５〜１０倍容量加え、４０〜９０℃、好ましくは６０〜８０℃に加温し、１０分〜２４時間、好ましくは３０分〜４時間処理して、固定化されているα−グルコシルトランスフェラーゼを分解し、水洗除去した後、再度上述の如く新たなα−グルコシルトランスフェラーゼを固定化する。
【００２１】
本発明は、酵素固定化用担体として粒状多孔質キトサンに、脂肪族ポリアルコールのジグリシジルエーテルとフェニルグリシジルエーテルを反応させて得られたものを用いることにより、物理的強度と初期活性に優れ、活性の持続性が良好で、再生による繰り返し使用が可能な担体を用いた固定化α−グルコシルトランスフェラーゼを得ることができる。しかも、ここで得られた固定化α−グルコシルトランスフェラーゼを用いることによって、反応液の脱塩処理が不要となり、連続的に高い生産性をもって蔗糖からパラチノースおよびトレハルロースを製造することができる。
【００２２】
【実施例】
以下に、本発明を実施例をあげて具体的に説明するが、本発明は、この範囲に限定されるものではない。なお、パラチノースおよびトレハルロースの定量は次の方法により行った。
【００２３】
パラチノースおよびトレハルロースの定量方法
反応溶液を次に示す高速液体クロマトグラフ操作条件で注入し、高速液体クロマトグラムを得、パラチノースおよびトレハルロースのピークと内部標準物質のピークとの面積比から算出した。
〈高速液体クロマトグラフ操作条件〉
カラム：ＥＲＣ−ＮＨ１１７１６×２００ｍｍ（エルマ光学社製）
移動層：アセトニトリル８０：水２０
流速：１ｍｌ／分
検出器：示差屈折計
感度：８〜１６×１０^−５（ＲＩＵＦＳ）
注入量：２０μｌ
【００２４】
（実施例１）
脱アセチル化度７９％、平均分子量４６，０００のキトサン２１０ｇを３．５％酢酸水溶液２，７９０ｇに溶解した。該キトサン酸性溶液を７％水酸化ナトリウム、２０％エタノール、７３％水によりなる凝固溶液中に落下し、キトサンを粒状多孔質に凝固再生後、中性になるまで十分水洗し、平均粒径１ｍｍの粒状多孔質キトサン３，０００ｍｌ（湿潤）を得た。得られた粒状多孔質キトサンの１，５００ｍｌに水１，５００ｍｌとエチレングリコールジグリシジルエーテル７．５ｇを加えて８０℃で１時間反応させた。反応終了後、十分水洗し架橋粒状多孔質キトサン１，４７０ｍｌを得た。
【００２５】
次に表１に示した配合で所定量のフェニルグリシジルエーテルと非イオン性界面活性剤、商品名ニューポールＰＥ６４（三洋化成工業（株）製）を水１００ｍｌに加え、夫々攪拌機で十分攪拌して懸濁液を得た。
次いで架橋粒状多孔質キトサン各１００ｍｌを該懸濁液１００ｍｌに加え、７０℃で４時間攪拌し反応させた。反応終了後、反応残液を除去し水で十分に洗浄し、酵素固定化用担体（担体Ａ〜Ｇ）各９７ｍｌを得た。
【００２６】
【表１】

【００２７】
蔗糖３０ｇ、ペプトン１０ｇ、肉エキス３ｇ、酵母エキス５ｇ、リン酸水素２ナトリウム・１２水２ｇおよび塩化ナトリウム３ｇを水に溶解して１Ｌとし、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６．５〜７．０に調製した培地１５Ｌを３０Ｌのジャーファーメンターに入れて殺菌し、プロタミノバクター・ルブルム（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒｒｕｂｒｕｍ）ＣＢＳ５７４．７７を接種して、温度２８℃、通気量１３．０Ｌ／ｍｉｎ，攪拌速度３５０ｒ．ｐ．ｍで１６時間培養してα−グルコシルトランスフェラーゼ活性の高い培養液を得た。遠心分離してα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物菌体のスラリー３．６Ｌを得た後、該スラリーの全量をホモジナイザーで粉砕処理し、プロタミノバクター・ルブルム由来のα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する酵素溶液３．３Ｌを得た。
【００２８】
担体Ａ〜Ｇをそれぞれ２５ｍｌ秤量し３．０％のグルタルアルデヒド水溶液２０ｍｌに加えて２５℃で２時間処理した後、水洗し、未反応のグルタルアルデヒドを十分除去した。ついでグルタルアルデヒド処理した各酵素固定化用担体をプロタミノバクター・ルブルム由来のα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する酵素溶液各８８ｍｌに、温度２５℃にて３時間攪拌した後、水洗して固定化α−グルコシルトランスフェラーゼＡ^＊〜Ｇ^＊夫々２５ｍｌを得た。
【００２９】
ここで得られた固定化αグルコシルトランスフェラーゼＡ^＊〜Ｇ^＊夫々２０ｍｌを直径１０ｍｍ×高さ３０ｃｍのカラムに充填し、これの夫々に、ｐＨ５．６の４２％蔗糖（グラニュー糖）水溶液を、２５℃に調製してポンプにより１２．６ｍｌ／ｈｒの流速でカラム上部より供給し、カラム下部から出てくる反応溶液を初期より一定間隔でサンプリングして、反応液中のパラチノースおよびトレハルロースの含有量を測定し、パラチノースおよびトレハルロースの含有量が反応初期の半分になるまでこの反応を行った。このときまでに要した日数を半減期とすると共に、半減期までに生成したパラチノースおよびトレハルロースの総計を、測定した含有量から算出した。
【００３０】
更にここで半減期に達した固定化α−グルコシルトランスフェラーゼＡ^＊〜Ｇ^＊に、夫々０．５Ｎの水酸化ナトリウム溶液１００ｍｌを加え、７０℃に加温して４時間処理した後、再度同様の固定化方法で未使用のα−グルコシルトランスフェラーゼを夫々固定化した。これらを再度上述のカラムに充填し、上述の蔗糖溶液を供給し、カラム下部から出てくる初期の反応溶液をサンプリングして、反応溶液中のパラチノースおよびトレハルロースの含有量を測定した。ここで測定したパラチノースおよびトレハルロースの含有量が再生固定化の前の初期の含有量と較べた割合を再生率として算出した。その結果を表２示す。
【００３１】
【表２】

【００３２】
表２から明らかなように、本発明の方法は、パラチノースおよびトレハルロースの生成量が多く、固定化α−グルコシルトランスフェラーゼの活性の持続性や再生処理も極めて良好であり、蔗糖溶液からパラチノースおよびトレハルロースを効率良く生産できた。
【００３３】
（実施例２）
実施例１で得られた粒状多孔質キトサンを１，５００ｍｌ秤量し、含有する水をイソプロピルアルコールで十分に置換除去した。表３に示した如く、所定量のフェニルグリシジルエーテルを夫々イソプロピルアルコール１００ｍｌに加えて溶解し、該溶解液に粒状多孔質キトサン各１００ｍｌを加え、７０℃で４時間反応させた。
【００３４】
反応終了後、反応残液を除去しイソプロピルアルコールで洗浄後、水洗した。次いで夫々水１００ｍｌにエチレングリコールジグリシジルエーテル０．５ｇを加えて溶解し、該溶解液に、フェニルグリシジルエーテルを所定量反応させた粒状多孔質キトサンを入れ、８０℃で２時間反応させた。反応終了後、十分水洗し酵素固定化用担体（担体Ｈ〜Ｍ）各９７ｍｌを得た。
【００３５】
【表３】

【００３６】
担体Ｈ〜Ｍを夫々２５ｍｌ秤量し３．０％のグルタルアルデヒド水溶液２０ｍｌに加えて２５℃で２時間処理した後、水洗し、未反応のグルタルアルデヒドを十分除去した。ついでグルタルアルデヒド処理した各酵素固定化用担体を、実施例１で得たプロタミノバクター・ルブルム（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒｒｕｂｒｕｍ）ＣＢＳ５７４．７７由来のα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する酵素溶液各８８ｍｌに、温度２５℃にて３時間攪拌した後、水洗して固定化α−グルコシルトランスフェラーゼＨ^＊〜Ｍ^＊夫々２５ｍｌを得た。
【００３７】
ここで得られた固定化α−グルコシルトランスフェラーゼＨ^＊〜Ｍ^＊夫々２０ｍｌを直径１０ｍｍ×高さ３０ｃｍのカラムに充填し、これの夫々に、実施例１と同様の方法でｐＨ５．６の４２％蔗糖水溶液を通液し、実施例１と同様の方法で半減期、半減期までに生成したパラチノースおよびトレハルロースの総計を測定または算出した。更にここで半減期に達した固定化α−グルコシルトランスフェラーゼＨ^＊〜Ｍ^＊を、実施例１と同様の方法で水酸化ナトリウム溶液処理後、再度未使用のα−グルコシルトランスフェラーゼを夫々固定化し、再度上述のカラムに充填して上述の蔗糖溶液を供給し、反応溶液をサンプリングして再生率を算出した。その結果を表４示す。
【００３８】
【表４】

【００３９】
表４から明らかなように、本発明の方法は、パラチノースおよびトレハルロースの生成量が多く、固定化α−グルコシルトランスフェラーゼの活性の持続性や再生処理も極めて良好であり、蔗糖溶液からパラチノースおよびトレハルロースを効率良く生産できた。
【００４０】
（実施例３）
（１）蔗糖３７５ｇ、ペプトン１５０ｇ、肉エキス４５ｇ、酵母エキス７５ｇ、リン酸水素２ナトリウム・１２水３０ｇおよび塩化ナトリウム４５ｇからなるｐＨ７の培地１５Ｌを３０Ｌのジャーファーメンターに入れて殺菌し、セラチア・ブリムチカ（Ｓｅｒｒａｔｉａｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）ＡＴＣＣ１５９２８を接種して、温度２８℃、通気量７．５Ｌ／ｍｉｎ，攪拌速度４００ｒ．ｐ．ｍで１６時間培養してα−グルコシルトランスフェラーゼ活性の高い培養液を得、遠心分離してα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物菌体のスラリー２．５Ｌを得た。次に該スラリーの全量をホモジナイザー処理してセラチア・ブリムチカ由来のα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する酵素溶液２．３Ｌを得た（酵素液１）。
【００４１】
（２）蔗糖６０ｇ、ペプトン１０ｇ、肉エキス１ｇ、酵母エキス１ｇ、リン酸水素２ナトリウム・１２水２ｇおよび塩化ナトリウム３ｇを水に溶解して１Ｌとし、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６．５〜７．０に調製した培地をジャーファーメンターに入れて殺菌し、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＭＸ−２３２を接種して、温度２８℃、通気量０．２５Ｌ／ｍｉｎ，攪拌速度４６０ｒ．ｐ．ｍで４８時間培養してα−グルコシルトランスフェラーゼ活性の高い培養液を得、遠心分離してα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物菌体のスラリー０．２０Ｌを得た。次に該スラリーの全量をホモジナイザー処理してアグロバクテリウム・ラジオバクター由来のα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する酵素溶液０．１８Ｌを得た（酵素液２）。
【００４２】
（３）蔗糖１００ｇ、ペプトン１０ｇ、肉エキス３ｇ、酵母エキス５ｇ、リン酸水素２ナトリウム・１２水２ｇおよび塩化ナトリウム３ｇを水に溶解して１Ｌとし、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６．５〜７．０に調製した培地をジャーファーメンターに入れて殺菌し、シュードモナス・メソアシドフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍｅｓｏａｃｉｄｏｐｈｉｌａ）ＭＸ−４５を接種して、温度２８℃、通気量１．２Ｌ／ｍｉｎ，攪拌速度４３０ｒ．ｐ．ｍで６０時間培養してα−グルコシルトランスフェラーゼ活性の高い培養液を得、遠心分離してα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物菌体のスラリー０．１５Ｌを得た。次に該スラリーの全量をホモジナイザー処理してシュードモナス・メソアシドフィラ由来のα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する酵素溶液０．１４Ｌを得た（酵素液３）。
【００４３】
（４）蔗糖５０ｇ、コーンスチープリカー３０ｇ、酵母エキス５ｇ、リン酸水素２ナトリウム・１２水２ｇおよび塩化ナトリウム３ｇを水に溶解して１Ｌとし、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６．５〜７．０に調製した培地をジャーファーメンターに入れて殺菌し、クレブシェラ・テリゲナ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｔｅｒｒｉｇｅｎａ）ＡＴＣＣ３３２５７を接種して、温度２８℃、通気量１．０Ｌ／ｍｉｎ，攪拌速度１４０ｒ．ｐ．ｍで２４時間培養してα−グルコシルトランスフェラーゼ活性の高い培養液を得、遠心分離してα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物菌体のスラリー０．２５Ｌを得た。次に該スラリーの全量をホモジナイザー処理してクレブシェラ・テリゲナ由来のα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する酵素溶液０．２０Ｌを得た（酵素液４）。
【００４４】
実施例１で得られた酵素固定化用担体Ｄと実施例２で得られた酵素固定化用担体Ｊを夫々２５ｍｌ秤量し、これらを上述の方法で得た酵素液１〜４夫々１００ｍｌに加え、室温で２時間攪拌し後、吸着後の残留酵素液を除去した。次いで２．５％グルタルアルデヒド水溶液各２５０ｍｌに入れ１時間処理後、充分に水洗して固定化α−グルコシルトランスフェラーゼＤ１，Ｄ２，Ｄ３，Ｄ４およびＪ１，Ｊ２，Ｊ３，Ｊ４夫々２５ｍｌを得た。
【００４５】
ここで得られた固定化α−グルコシルトランスフェラーゼＤ１〜Ｄ４、Ｊ１〜Ｊ４夫々２０ｍｌを直径１０ｍｍ×高さ３０ｃｍのカラムに充填し、これの夫々に、実施例１と同様の方法でｐＨ５．６の４２％蔗糖水溶液を通液し、実施例１と同様の方法で半減期、半減期までに生成したパラチノースおよびトレハルロースの総計を測定または算出した。更にここで半減期に達した固定化α−グルコシルトランスフェラーゼＤ１〜Ｄ４、Ｊ１〜Ｊ４を、実施例１と同様の方法で水酸化ナトリウム溶液処理後、再度未使用のα−グルコシルトランスフェラーゼを夫々固定化し、再度上述のカラムに充填して上述の蔗糖溶液を供給し、反応溶液をサンプリングして再生率を算出した。その結果を表５示す。
【００４６】
【表５】

【００４７】
表５から明らかなように、本発明の方法で得られた固定化α−グルコシルトランスフェラーゼはいずれの微生物由来のα−グルコシルトランスフェラーゼに対しても、パラチノースおよびトレハルロースの生成量が多く、活性の持続性や再生処理も極めて良好であり、蔗糖溶液からパラチノースおよびトレハルロースを効率良く生産できた。
【００４８】
（比較例１）
実施例１と同様の酵素固定化用担体の製造方法において、フェニルグリシジルエーテルを反応させなかったもの（担体Ｏ）と、ＤＥＡＥ−セルロース（担体Ｐ）を用い、実施例１で得られた酵素液を実施例１と同様の方法で固定化し、固定化α−グルコシルトランスフェラーゼＯ^＊、Ｐ^＊を得た。
【００４９】
得られた固定化α−グルコシルトランスフェラーゼＯ^＊、Ｐ^＊夫々２０ｍｌを直径１０ｍｍ×高さ３０ｃｍのカラムに充填し、これらの夫々に、実施例１と同様の方法でｐＨ５．６の４２％蔗糖水溶液を通液し、実施例１と同様の方法で半減期、半減期までに生成したパラチノースおよびトレハルロースの総計を測定または算出した。更に、ここで半減期に達した固定化α−グルコシルトランスフェラーゼＯ^＊、Ｐ^＊を、実施例１と同様の方法で水酸化ナトリウム溶液処理後、再度未使用のα−グルコシルトランスフェラーゼを夫々固定化し、再度上述のカラムに充填して上述の蔗糖溶液を供給し、反応溶液をサンプリングして再生率を算出した。その結果を表６示す。
【００５０】
【表６】

【００５１】
表６から明らかなように、固定化α−グルコシルトランスフェラーゼＯ^＊、Ｐ^＊を用いた本発明以外の方法は、パラチノースおよびトレハルロースの生産性が実施例１，２と比較して低く、活性の持続性や再生処理も劣るものであった。
【００５２】
（比較例２）
蔗糖３０ｇ、ペプトン１０ｇ、肉エキス３ｇ、酵母エキス５ｇ、リン酸水素２ナトリウム・１２水２ｇおよび塩化ナトリウム３ｇに水を溶解して１Ｌとし、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６．５〜７．０に調製した培地１５Ｌを３０Ｌのジャーファーメンターに入れて殺菌し、プロタミノバクター・ルブルム（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒｒｕｂｒｕｍ）ＣＢＳ５７４７７を接種して、温度２８℃、通気量１３．０Ｌ／ｍｉｎ，攪拌速度３５０ｒ．ｐ．ｍで１６時間培養してα−グルコシルトランスフェラーゼ活性の高い培養液を得た。遠心分離してα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物菌体のスラリー３．６Ｌを得た後、該スラリーの全量をホモジナイザーで粉砕処理し、プロタミノバクター・ルブルム由来のα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する酵素溶液３．３Ｌを得た。
【００５３】
ここで得たα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物菌体の破砕物溶液２．５Ｌを、２．５Ｌの４％アルギン酸ナトリウム水溶液と混合し、直径０．６ｍｍの細孔を多数有するダイスを取り付けた円筒形の押し出し機に入れ、空気圧をかけて混合溶液を細孔より下方へ押し出した。押し出し機の下方には、０．１５Ｍ塩化カルシウム溶液１０Ｌを入れた２０Ｌ容の容器を置き、攪拌機によって溶液を攪拌しておき、上方から落下する混合溶液の液滴を受けた。１０分で混合溶液を押し出し、そのまま塩化カルシウム溶液を２時間攪拌して、微生物菌体破砕物含有アルギン酸ゲル４ｋｇを得た。
【００５４】
次に３０％ポリエチレンイミン２７０ｇを約３Ｌの水で希釈してから、希塩酸で中和してｐＨ５．５に調製し、総量を４ｋｇとした後、先に調製した微生物菌体破砕物含有アルギン酸ゲル４ｋｇを投入し、１０分間ゆるやかに攪拌した後、瀘過してゲルを回収し、０．５％グルタルアルデヒド溶液１０Ｌにゲルを加えて３０分間攪拌後、水洗してアルギン酸ゲルに微生物菌体破砕物が包括された固定化α−グルコシルトランスフェラーゼ３．３ｋｇを得た。
【００５５】
これを実施例１と同様の方法でＰＨ５．６の４２％蔗糖水溶液を通液し、実施例１と同様の方法で半減期，半減期までに生成したパラチノースおよびトレハルロースの総計を測定または算出したところ、半減期が２１０日，半減期までに生成したパラチノースおよびトレハルロースの総計は１２．５ｋｇであった。
【００５６】
この様に従来技術の方法は、本発明の方法に較べると、パラチノースおよびトレハルロースの生産性が低く、活性の持続性も劣るものであった。また、この固定化方法では再生ができない為、失活した固定化α−グルコシルトランスフェラーゼは廃棄せざるを得なかった。
【００５７】
【発明の効果】
本発明の方法は、物理的強度に優れた粒状多孔質キトサンに脂肪族ポリアルコールのジグリシジルエーテルとフェニルグリシジルエーテルを反応させて得られた酵素固定化用担体を用い、これにα−グルコシルトランスフェラーゼを固定化させることにより、初期活性と活性の持続性に優れ、再生による繰り返し使用が可能な固定化α−グルコシルトランスフェラーゼが得られ、該固定化−αグルコシルトランスフェラーゼに蔗糖溶液を接触させることによって、パラチノースおよびトレハルロースを効率良く生産することができるという優れた効果を発揮する。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a method for efficiently producing palatinose and trehalulose from sucrose using an immobilized α-glucosyltransferase.
[0002]
[Prior art]
Palatinose (also known as isomaltulose) and trehalulose are non-cariogenic disaccharides having a sweetness in which glucose and fructose are combined at α-1,6 and α-1,1, respectively. Widely used as a cariogenic sweetener.
[0003]
Conventionally, in palatinose and trehalulose, sucrose in which glucose and fructose are bound at α-1,2 is represented by Protaminobacter genus, Serratia genus, Erwinia genus, Klebsiella (Klebsiella). Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-180172, Japanese Patent Application Laid-Open No. HEI 3-180172, and Japanese Patent Application Laid-Open No. HEI 3-180172, which are produced by contact with a glycosyltransferase called α-glucosyltransferase contained in microorganisms such as the genus Pseudomonas, No. 4-169190, JP-A-5-130886, and the like. Further, in order to industrially produce palatinose and trehalulose, a microorganism containing α-glucosyltransferase is added to an aqueous solution of 20 to 60% sucrose and stirred, and the temperature is controlled at 15 to 30 ° C. and around pH 6. It is also known that after reacting for about 20 hours, microorganisms can be removed from the reaction solution by centrifugation or the like and purified with an ion exchange resin or the like. However, in such a production process, removing microorganisms from the reaction solution is not industrially appropriate because the efficiency is poor because the difference in specific gravity between the microorganism and the reaction solution is small and the size of the microorganism is small. In order to solve such problems, for example, Japanese Patent Publication No. 60-9797 discloses that a microorganism containing α-glucosyltransferase is included in a gel such as calcium alginate, polyacrylamide, agar, or α-glucosyl. It is disclosed that a component of whole cells or disrupted cells of a microorganism containing a transferase is adsorbed on a water-insoluble carrier such as DEAE-cellulose or bone charcoal and cross-linked with glutaraldehyde if necessary. In JP-A-58-36959, a microorganism containing α-glucosyltransferase is granulated by encapsulating it in a calcium alginate gel, and the granulated product is infiltrated with polyethyleneimine and then crosslinked with glutaraldehyde. It is disclosed.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Among the above-mentioned conventional techniques, among the immobilized α-glucosyltransferases described in Japanese Patent Publication No. 60-9797, those in which microorganisms are included in calcium alginate gel or the like, or the immobilized α-form described in Japanese Patent Publication No. 58-36959. -Glucosyltransferase is eluted when calcium alginate is converted to water-soluble sodium alginate when the pH of the sucrose solution is 5.8 or higher or by contact with sodium ions contained in the crude sucrose. There was a drawback that the physical strength was lowered. This drawback can be improved by adding calcium salt to the sucrose solution, but a new problem arises that the reaction solution must be desalted. In addition, the method of comprehensively immobilizing microorganisms containing α-glucosyltransferase includes a low amount of immobilization, a change in the higher-order structure of α-glucosyltransferase having an activity of transglycosylation, and contact with a sucrose solution. This is accompanied by a steric hindrance that is hindered by the fact that the activity is reduced. Furthermore, when the immobilized α-glucosyltransferase is inactivated, the gel carrier cannot be regenerated and used repeatedly.
[0005]
As an effective means for solving such drawbacks, Japanese Patent Publication No. 60-9797 discloses a method of immobilizing α-glucosyltransferase on a water-insoluble carrier such as DEAE-cellulose. With this method, the amount of immobilization can be increased, the higher-order structure of α-glucosyltransferase hardly changes, and α-glucosyltransferase is immobilized on the surface of the carrier, so that contact with the sucrose solution is also inhibited. do not do. Moreover, the carrier can be easily regenerated by subjecting the inactivated immobilized α-glucosyltransferase to hot alkali treatment and immobilizing a new unused α-glucosyltransferase. However, the immobilized α-glucosyltransferase obtained by this method has extremely poor activity persistence and is not satisfactory in terms of initial activity and regeneration.
[0006]
From this point of view, α-glucosyltransferase is immobilized on a water-insoluble carrier that is excellent in physical strength and can be regenerated, has excellent initial activity, good durability of activity, and can be used repeatedly by regeneration. There has been a strong demand for the development of a method for producing palatinose and trehalulose using α-glucosyltransferase immobilized on a possible carrier.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
As a result of diligent research to solve the above-mentioned problems, the present inventors have added α-glucosyltransferase to an enzyme-immobilized carrier obtained by reacting a granular porous chitosan with an aliphatic polyalcohol diglycidyl ether and phenylglycidyl ether. By immobilizing, excellent initial activity and good activity persistence are obtained, and when deactivated, after heat-alkali treatment, α-glucosyltransferase is immobilized again so that it can be regenerated and used repeatedly The present invention has been found.
[0008]
That is, the present invention was obtained by immobilizing α-glucosyltransferase on an enzyme immobilization support obtained by reacting diglycidyl ether of aliphatic polyalcohol and phenylglycidyl ether with granular porous chitosan. The present invention provides a method for producing palatinose and trehalulose characterized by bringing a sucrose solution into contact with an immobilized α-glucosyltransferase.
[0009]
The carrier for immobilization of enzymes obtained by reacting diglycidyl ether and aliphatic glycidyl ether of aliphatic polyalcohol with granular porous chitosan used in the present invention is the enzyme immobilization previously filed by the applicant in Japanese Patent Application No. 7-39172. It can be manufactured by the manufacturing method of the chemical carrier.
[0010]
That is, (A) Low molecular weight chitosan having an average molecular weight of 10,000 to 230,000 is dissolved in an acidic aqueous solution of an organic acid such as formic acid, acetic acid or lactic acid, or an inorganic acid such as hydrochloric acid or nitric acid, and the chitosan acidic solution is dissolved. The granular porous chitosan obtained by dropping it into a basic solution is reacted with diglycidyl ether of aliphatic polyalcohol to form crosslinked granular porous chitosan, and then phenyl glycidyl ether is suspended in water using a surfactant. The amino group remaining in the crosslinked granular porous chitosan is mainly reacted, and then sufficiently washed with water, or (B) the granular porous chitosan obtained in the same manner as described above, and phenyl glycidyl ether in a polar solvent. And then reacting the aliphatic polyalcohol diglycidyl ether mainly with the amino groups remaining in the granular porous chitosan, Obtaining a carrier for enzyme immobilization and washing.
[0011]
As the diglycidyl ether of the aliphatic polyalcohol used here, polyethylene glycol diglycidyl ether such as ethylene glycol diglycidyl ether and diethylene glycol diglycidyl ether, polypropylene glycol diglycidyl such as propylene glycol diglycidyl ether and dipropylene glycol diglycidyl ether Ether, glycerol polyglycidyl ether, etc. are mentioned.
[0012]
In the case of (A), the amount of phenylglycidyl ether used here is 20 to 200 g with respect to 1 L of crosslinked granular porous chitosan, preferably in order to exhibit the excellent performance of α-glucosyltransferase to be immobilized later. In the case of 35-200g and (B), it is 50-200g with respect to 1L of granular porous chitosan, Preferably it is 75-200g.
[0013]
Examples of the surfactant used in (A) include a cationic surfactant, an anionic surfactant, and a nonionic surfactant. However, a generally used nonionic surfactant that does not cause ionic repulsion or adsorption with the amino group of the crosslinked granular chitosan is preferred.
[0014]
Examples of the polar solvent used in (B) include polar solvents such as dioxane, ethanol, isopropyl alcohol, and the like.
[0015]
Next, α-glucosyltransferase is immobilized on the enzyme immobilization carrier thus obtained to obtain immobilized α-glucosyltransferase. As a method of immobilization, a normal method can be adopted. For example, a method of treating an enzyme immobilization carrier in a solution containing α-glucosyltransferase for several hours, adsorbing α-glucosyltransferase to the enzyme immobilization carrier, removing the remaining solution, and washing with water, Alternatively, after washing with water, treatment in a crosslinking agent solution for several hours to crosslink the enzyme immobilization support and α-glucosyltransferase, remove the remaining solution and wash with water, or crosslink the enzyme immobilization support. A solution containing α-glucosyltransferase after treatment in an agent solution for several hours to bind a part of the functional group of the cross-linking agent to the enzyme immobilization carrier, remove the remaining solution and wash with water. The α-glucosyltransferase is bound to the unreacted functional group portion of the cross-linking agent bound to the enzyme immobilization support for several hours, and the remaining solution is removed. Although the method of removing and washing with water etc. is employ | adopted, the method using a crosslinking agent is especially preferable.
[0016]
As a crosslinking agent used in the above-mentioned immobilization method, a compound that crosslinks a residual amino group that is not reacted with two kinds of glycidyl ethers introduced into a carrier for enzyme immobilization and an amino group of α-glucosyltransferase. That is, any compound having two or more functional groups such as an isocyanate group, an epoxy group, an aldehyde group, and a carbonyl group may be used. Specific examples include hexamethylene diisocyanate, ethylene glycol diglycidyl ether, and glutaraldehyde.
[0017]
The reaction using glutaraldehyde is usually 0.1 to 10%, preferably 0.5 to 5% of a glutaraldehyde solution in an amount of 0.1 to 10 times the volume of the enzyme immobilization carrier, preferably 0.5 to 2 times the volume is added, and crosslinking is performed at room temperature for 10 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 4 hours.
[0018]
The α-glucosyltransferase used in the above-described immobilization method is not particularly limited as long as it has a transglycosylation activity for producing palatinose and trehalulose from sucrose. For example, the genus Protaminobacter or Serratia An unpurified culture solution obtained by disrupting a culture solution containing microorganisms such as (Serratia) genus, Erwinia genus, Klebsiella genus, Pseudomonas genus, Agrobacterium genus, etc. with a homogenizer α-Glucosyltransferase and purified α-glucosyltransferase from which impurities are removed by a technique such as liquid chromatography can be mentioned. However, it is preferable to use an unpurified α-glucosyltransferase which is simple.
[0019]
Next, the immobilized α-glucosyltransferase obtained above is brought into contact with the sucrose solution, but the method is not particularly limited. For example, the immobilized α-glucosyl is immobilized in a container having a stirring facility containing the sucrose solution. Examples thereof include a method of adding a transferase and stirring for a certain time, a method of filling an immobilized α-glucosyltransferase into a column, and passing a sucrose solution through the column. Industrially, the latter method capable of continuous treatment is preferred. The concentration of the sucrose solution used in this case is 1 to 60%, preferably 20 to 60%, pH is 4 to 8, preferably 5 to 7, temperature is 5 to 60 ° C., preferably 15 to 40 ° C. Velocity (space velocity) is 0.1 to 5.0 hr ^-1 , Preferably 0.2 to 2.0 hr ^-1 Process with. By contacting the sucrose solution with the immobilized α-glucosyltransferase in such a manner, a syrup containing the desired palatinose and trehalulose can be obtained. The obtained syrup is subjected to neutralization treatment, desalting treatment, crystallization treatment, normal liquid chromatography treatment using an ion exchange resin, etc., as necessary, and a mixed product of palatinose and trehalulose, a high-purity palatinose product, and Products such as high purity trehalulose products can be obtained.
[0020]
The immobilized α-glucosyltransferase used here gradually decreases in sugar transfer activity due to contact with the sucrose solution. Therefore, when the concentration falls below the limit of use, the enzyme immobilization carrier can be repeatedly used by the method for regenerating the immobilized enzyme by the usual carrier binding method. That is, 0.1 to 5N, preferably 0.5 to 1N sodium hydroxide solution is added in an amount of 0.5 to 10 times the volume of the immobilized α-glucosyltransferase whose activity has dropped below the use limit, and 40 to 90. C., preferably 60 to 80.degree. C., treated for 10 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 4 hours to decompose the immobilized .alpha.-glucosyltransferase, washed with water, and then washed again. A new α-glucosyltransferase is immobilized as shown in FIG.
[0021]
The present invention is excellent in physical strength and initial activity by using a granular porous chitosan obtained by reacting an aliphatic polyalcohol diglycidyl ether and phenylglycidyl ether as a carrier for enzyme immobilization, An immobilized α-glucosyltransferase using a carrier that has good activity persistence and can be used repeatedly by regeneration can be obtained. Moreover, by using the immobilized α-glucosyltransferase obtained here, the desalting treatment of the reaction solution is unnecessary, and palatinose and trehalulose can be produced from sucrose with high productivity continuously.
[0022]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but the present invention is not limited to this range. The palatinose and trehalulose were quantified by the following method.
[0023]
Determination of palatinose and trehalulose
The reaction solution was injected under the following high performance liquid chromatograph operating conditions to obtain a high performance liquid chromatogram, which was calculated from the area ratio of the peaks of palatinose and trehalulose to the peak of the internal standard substance.
<High-performance liquid chromatograph operating conditions>
Column: ERC-NH1171 6 × 200 mm (manufactured by Elma Optics)
Moving bed: acetonitrile 80: water 20
Flow rate: 1 ml / min
Detector: Differential refractometer
Sensitivity: 8-16x10 ^-5 (RIUFS)
Injection volume: 20 μl
[0024]
(Example 1)
210 g of chitosan having a deacetylation degree of 79% and an average molecular weight of 46,000 was dissolved in 2,790 g of a 3.5% aqueous acetic acid solution. The acidic solution of chitosan is dropped into a coagulation solution composed of 7% sodium hydroxide, 20% ethanol, 73% water, chitosan is coagulated into granular porous material, washed thoroughly with water until neutral, and an average particle diameter of 1 mm. 3,000 ml (wet) of granular porous chitosan was obtained. To 1,500 ml of the obtained granular porous chitosan, 1,500 ml of water and 7.5 g of ethylene glycol diglycidyl ether were added and reacted at 80 ° C. for 1 hour. After completion of the reaction, it was sufficiently washed with water to obtain 1,470 ml of crosslinked granular porous chitosan.
[0025]
Next, a predetermined amount of phenylglycidyl ether and a nonionic surfactant, trade name New Pole PE64 (manufactured by Sanyo Chemical Industries Co., Ltd.) are added to 100 ml of water with the composition shown in Table 1, and each is sufficiently stirred with a stirrer. A suspension was obtained.
Subsequently, 100 ml of each of the crosslinked granular porous chitosan was added to 100 ml of the suspension, and the mixture was stirred at 70 ° C. for 4 hours to be reacted. After completion of the reaction, the reaction residue was removed and washed thoroughly with water to obtain 97 ml of each enzyme immobilization carrier (carriers A to G).
[0026]
[Table 1]

[0027]
30 g of sucrose, 10 g of peptone, 3 g of meat extract, 5 g of yeast extract, 2 g of disodium hydrogen phosphate and 12 g of water and 3 g of sodium chloride are dissolved in water to make 1 L, and adjusted to pH 6.5 to 7.0 with sodium hydroxide solution 15 L of the medium was sterilized in a 30 L jar fermenter, inoculated with Protaminobacter rubrum CBS 574.77, temperature 28 ° C., aeration rate 13.0 L / min, stirring speed 350 r. p. Cultured at m for 16 hours to obtain a culture solution with high α-glucosyltransferase activity. After centrifuging to obtain 3.6 L of a microbial cell slurry containing α-glucosyltransferase, the whole amount of the slurry is pulverized with a homogenizer, and contains α-glucosyltransferase derived from Protaminobacter rubrum 3.3 L of enzyme solution was obtained.
[0028]
25 ml of each of Carriers A to G was weighed and added to 20 ml of a 3.0% aqueous glutaraldehyde solution, treated at 25 ° C. for 2 hours, and then washed with water to sufficiently remove unreacted glutaraldehyde. Next, each enzyme immobilization carrier treated with glutaraldehyde was stirred in each 88 ml of an enzyme solution containing α-glucosyltransferase derived from Protaminobacter rubrum at a temperature of 25 ° C. for 3 hours, washed with water and immobilized α -Glucosyltransferase A ^* ~ G ^* 25 ml of each was obtained.
[0029]
Immobilized α-glucosyltransferase A obtained here ^* ~ G ^* Each 20 ml was packed in a column of 10 mm in diameter and 30 cm in height, and each of them was adjusted to a pH 5.6 42% sucrose (granulated sugar) solution at 25 ° C. and pumped at a flow rate of 12.6 ml / hr. Supply from the top of the column, sample the reaction solution coming out from the bottom of the column at regular intervals from the beginning, measure the content of palatinose and trehalulose in the reaction solution, and reduce the content of palatinose and trehalulose to half of the initial reaction. This reaction was carried out until The number of days required until this time was defined as the half-life, and the total amount of palatinose and trehalulose produced by the half-life was calculated from the measured content.
[0030]
Furthermore, the immobilized α-glucosyltransferase A which has reached its half-life here ^* ~ G ^* Then, 100 ml of 0.5N sodium hydroxide solution was added, heated to 70 ° C. and treated for 4 hours, and then unused α-glucosyltransferase was immobilized again by the same immobilization method. These were filled again into the above-mentioned column, the above-mentioned sucrose solution was supplied, the initial reaction solution coming out from the lower part of the column was sampled, and the contents of palatinose and trehalulose in the reaction solution were measured. The proportion of the content of palatinose and trehalulose measured here compared with the initial content before regeneration immobilization was calculated as the regeneration rate. The results are shown in Table 2.
[0031]
[Table 2]

[0032]
As is apparent from Table 2, the method of the present invention produces a large amount of palatinose and trehalulose, has a very good sustainability of the activity of the immobilized α-glucosyltransferase and the regeneration treatment, and palatinose and trehalulose from the sucrose solution. We were able to produce efficiently.
[0033]
(Example 2)
1,500 ml of the granular porous chitosan obtained in Example 1 was weighed, and the contained water was sufficiently replaced with isopropyl alcohol. As shown in Table 3, a predetermined amount of phenylglycidyl ether was added and dissolved in 100 ml of isopropyl alcohol, 100 ml of granular porous chitosan was added to the solution, and the mixture was reacted at 70 ° C. for 4 hours.
[0034]
After completion of the reaction, the reaction residue was removed, washed with isopropyl alcohol, and then washed with water. Next, 0.5 g of ethylene glycol diglycidyl ether was dissolved in 100 ml of water, and granular porous chitosan obtained by reacting a predetermined amount of phenylglycidyl ether was added to the solution, followed by reaction at 80 ° C. for 2 hours. After completion of the reaction, it was sufficiently washed with water to obtain 97 ml of enzyme immobilization carriers (carriers HM).
[0035]
[Table 3]

[0036]
25 ml of each of the carriers H to M was weighed and added to 20 ml of a 3.0% aqueous glutaraldehyde solution, treated at 25 ° C. for 2 hours, and then washed with water to sufficiently remove unreacted glutaraldehyde. Subsequently, each enzyme immobilization support treated with glutaraldehyde was added to each 88 ml of an enzyme solution containing α-glucosyltransferase derived from Protaminobacter rubrum CBS574.77 obtained in Example 1 at a temperature of 25 ° C. The mixture was stirred for 3 hours, washed with water and immobilized α-glucosyltransferase H. ^* ~ M ^* 25 ml of each was obtained.
[0037]
Immobilized α-glucosyltransferase H obtained here ^* ~ M ^* Each 20 ml was packed in a column of 10 mm in diameter and 30 cm in height, and each of them was passed through a 42% sucrose aqueous solution of pH 5.6 in the same manner as in Example 1, and halved in the same manner as in Example 1. The total amount of palatinose and trehalulose produced by the period and half-life was measured or calculated. Furthermore, the immobilized α-glucosyltransferase H that has reached its half-life here ^* ~ M ^* After the treatment with sodium hydroxide solution in the same manner as in Example 1, each of the unused α-glucosyltransferases was immobilized again, filled in the above-mentioned column again, supplied with the above-mentioned sucrose solution, and the reaction solution was sampled. Thus, the regeneration rate was calculated. The results are shown in Table 4.
[0038]
[Table 4]

[0039]
As can be seen from Table 4, the method of the present invention produces a large amount of palatinose and trehalulose, has a very good sustainability of the activity of the immobilized α-glucosyltransferase and the regeneration treatment, and palatinose and trehalulose from the sucrose solution. We were able to produce efficiently.
[0040]
(Example 3)
(1) sucrose 375 g, peptone 150 g, meat extract 45 g, yeast extract 75 g, disodium hydrogenphosphate, 12 water 30 g and sodium chloride 45 g in a 30 L jar fermenter and sterilized, Serratia Inoculated with Serratia plymutica ATCC15928, temperature 28 ° C., aeration rate 7.5 L / min, stirring speed 400 r. p. After culturing at m for 16 hours, a culture solution having high α-glucosyltransferase activity was obtained, and centrifuged to obtain 2.5 L of a microbial cell slurry containing α-glucosyltransferase. Next, the whole amount of the slurry was homogenized to obtain 2.3 L of an enzyme solution containing α-glucosyltransferase derived from Serratia brimtica (enzyme solution 1).
[0041]
(2) 60 g of sucrose, 10 g of peptone, 1 g of meat extract, 1 g of yeast extract, 2 g of disodium hydrogen phosphate and 12 g of water and 3 g of sodium chloride are dissolved in water to make 1 L, and pH 6.5-7. The medium prepared at 0 was placed in a jar fermenter, sterilized, inoculated with Agrobacterium radiobacter MX-232, temperature 28 ° C., aeration rate 0.25 L / min, stirring speed 460 r. p. After culturing for 48 hours at m, a culture solution having high α-glucosyltransferase activity was obtained, and centrifuged to obtain 0.20 L of a microbial cell slurry containing α-glucosyltransferase. Next, the whole amount of the slurry was homogenized to obtain 0.18 L of an enzyme solution containing α-glucosyltransferase derived from Agrobacterium radiobacter (enzyme solution 2).
[0042]
(3) 100 g of sucrose, 10 g of peptone, 3 g of meat extract, 5 g of yeast extract, 2 g of disodium hydrogen phosphate, 12 g of water and 3 g of sodium chloride are dissolved in water to make 1 L, and the pH is 6.5 to 7. The medium prepared at 0 was placed in a jar fermenter, sterilized, and inoculated with Pseudomonas mesoacidophila MX-45, temperature 28 ° C., aeration rate 1.2 L / min, stirring rate 430 r. p. After culturing at m for 60 hours, a culture solution having high α-glucosyltransferase activity was obtained, and centrifuged to obtain 0.15 L of a microbial cell slurry containing α-glucosyltransferase. Next, the whole amount of the slurry was homogenized to obtain 0.14 L of an enzyme solution containing α-glucosyltransferase derived from Pseudomonas mesoacidophila (enzyme solution 3).
[0043]
(4) 50 g of sucrose, 30 g of corn steep liquor, 5 g of yeast extract, 2 g of disodium hydrogen phosphate and 12 g of water and 3 g of sodium chloride are dissolved in water to make 1 L, and the pH is adjusted to 6.5 to 7.0 with a sodium hydroxide solution. The prepared medium was put in a jar fermenter and sterilized, inoculated with Klebsiella terigena ATCC 33257, temperature 28 ° C., aeration rate 1.0 L / min, stirring speed 140 r. p. After culturing at m for 24 hours, a culture solution having high α-glucosyltransferase activity was obtained, and centrifuged to obtain 0.25 L of a microbial cell slurry containing α-glucosyltransferase. Next, the whole amount of the slurry was homogenized to obtain 0.20 L of an enzyme solution containing α-glucosyltransferase derived from Klebsiella terigena (enzyme solution 4).
[0044]
25 ml each of the enzyme immobilization carrier D obtained in Example 1 and the enzyme immobilization carrier J obtained in Example 2 were weighed and added to 100 ml of each of the enzyme solutions 1 to 4 obtained by the above method. After stirring for 2 hours at room temperature, the residual enzyme solution after adsorption was removed. Subsequently, each was put in 250 ml of 2.5% glutaraldehyde aqueous solution, treated for 1 hour, and then washed thoroughly with water to obtain 25 ml of immobilized α-glucosyltransferases D1, D2, D3, D4 and J1, J2, J3, J4.
[0045]
20 ml each of the immobilized α-glucosyltransferases D1 to D4 and J1 to J4 obtained here were packed in a column having a diameter of 10 mm and a height of 30 cm, and each of them was adjusted to pH 5.6 in the same manner as in Example 1. A 42% sucrose aqueous solution was passed, and the total amount of palatinose and trehalulose produced up to the half-life and half-life was measured or calculated in the same manner as in Example 1. Further, the immobilized α-glucosyltransferases D1 to D4 and J1 to J4 that have reached the half-life here are treated with sodium hydroxide solution in the same manner as in Example 1, and then again unused α-glucosyltransferase is immobilized. The above-mentioned column was filled again, the above-mentioned sucrose solution was supplied, the reaction solution was sampled, and the regeneration rate was calculated. The results are shown in Table 5.
[0046]
[Table 5]

[0047]
As is apparent from Table 5, the immobilized α-glucosyltransferase obtained by the method of the present invention has a higher production amount of palatinose and trehalulose than the α-glucosyltransferase derived from any microorganism, and has sustained activity. And the regeneration treatment was extremely good, and palatinose and trehalulose could be efficiently produced from the sucrose solution.
[0048]
(Comparative Example 1)
In the same method for producing an enzyme immobilization carrier as in Example 1, the enzyme solution obtained in Example 1 was prepared by using a non-reacted phenylglycidyl ether (carrier O) and DEAE-cellulose (carrier P). Was immobilized in the same manner as in Example 1, and immobilized α-glucosyltransferase O was immobilized. ^* , P ^* Got.
[0049]
Obtained immobilized α-glucosyltransferase O ^* , P ^* 20 ml of each was packed in a column having a diameter of 10 mm and a height of 30 cm, each of which was passed through a 42% sucrose aqueous solution of pH 5.6 in the same manner as in Example 1, and halved in the same manner as in Example 1. The total amount of palatinose and trehalulose produced by the period and half life was measured or calculated. Furthermore, the immobilized α-glucosyltransferase O that has reached its half-life here. ^* , P ^* After the treatment with sodium hydroxide solution in the same manner as in Example 1, each of the unused α-glucosyltransferases was immobilized again, filled in the above-mentioned column again, supplied with the above-mentioned sucrose solution, and the reaction solution was sampled. Thus, the regeneration rate was calculated. The results are shown in Table 6.
[0050]
[Table 6]

[0051]
As apparent from Table 6, immobilized α-glucosyltransferase O ^* , P ^* In the method other than the present invention using, the productivity of palatinose and trehalulose was lower than those of Examples 1 and 2, and the sustainability of the activity and the regeneration treatment were also inferior.
[0052]
(Comparative Example 2)
Dissolve water in 30 g of sucrose, 10 g of peptone, 3 g of meat extract, 5 g of yeast extract, 2 g of disodium hydrogen phosphate / 12 water and 3 g of sodium chloride to make 1 L, and adjust to pH 6.5-7.0 with sodium hydroxide solution 15 L of the culture medium was put into a 30 L jar fermenter, sterilized, and inoculated with Protaminobacter rubrum CBS57477, temperature 28 ° C., aeration rate 13.0 L / min, stirring speed 350 r. p. Cultured at m for 16 hours to obtain a culture solution with high α-glucosyltransferase activity. After centrifuging to obtain 3.6 L of a microbial cell slurry containing α-glucosyltransferase, the whole amount of the slurry is pulverized with a homogenizer, and contains α-glucosyltransferase derived from Protaminobacter rubrum 3.3 L of enzyme solution was obtained.
[0053]
2.5 L of the microbial cell disruption solution containing α-glucosyltransferase obtained here was mixed with 2.5 L of 4% sodium alginate aqueous solution, and a die having many pores having a diameter of 0.6 mm was attached. The mixture solution was put into a cylindrical extruder and air pressure was applied to push the mixed solution downward from the pores. A 20 L container containing 10 L of a 0.15 M calcium chloride solution was placed below the extruder, and the solution was stirred with a stirrer, and droplets of the mixed solution falling from above were received. The mixed solution was pushed out in 10 minutes, and the calcium chloride solution was stirred as it was for 2 hours to obtain 4 kg of alginate gel containing microbial cell disruption.
[0054]
Next, 270 g of 30% polyethyleneimine was diluted with about 3 L of water, neutralized with dilute hydrochloric acid to adjust to pH 5.5, the total amount was 4 kg, and the microbial cell disruption-containing alginate gel prepared earlier was then prepared. 4kg was added and stirred gently for 10 minutes, then filtered to collect the gel, added to 10L of 0.5% glutaraldehyde solution, stirred for 30 minutes, washed with water, and crushed microbial cells into alginate gel 3.3 kg of immobilized α-glucosyltransferase containing the product was obtained.
[0055]
This was passed through a 42% sucrose aqueous solution of PH 5.6 in the same manner as in Example 1, and the total amount of palatinose and trehalulose produced up to half-life and half-life was measured or calculated in the same manner as in Example 1. However, the total amount of palatinose and trehalulose produced by the half-life was 210 days and the half-life was 12.5 kg.
[0056]
As described above, the method of the prior art has low productivity of palatinose and trehalulose and inferior activity sustainability as compared with the method of the present invention. Further, since this method cannot be regenerated, the inactivated immobilized α-glucosyltransferase had to be discarded.
[0057]
【The invention's effect】
The method of the present invention uses an enzyme immobilization carrier obtained by reacting an aliphatic polyalcohol diglycidyl ether and phenylglycidyl ether with granular porous chitosan having excellent physical strength, and α-glucosyltransferase is used for this. Is immobilized α-glucosyltransferase that is excellent in initial activity and durability of activity and can be repeatedly used by regeneration, and by contacting the immobilized α-glucosyltransferase with a sucrose solution, It exhibits an excellent effect that palatinose and trehalulose can be produced efficiently.

Claims

Α-Glucosyltransferase is immobilized on an enzyme immobilization support obtained by reacting diglycidyl ether and phenylglycidyl ether of an aliphatic polyalcohol with granular porous chitosan, and the immobilized α-glucosyltransferase obtained here A method for producing palatinose and trehalulose, comprising contacting a sucrose solution with a sucrose solution.