JP3629298B2

JP3629298B2 - Drug sensitivity prediction method

Info

Publication number: JP3629298B2
Application number: JP11451395A
Authority: JP
Inventors: 広志江口; 恵美子望月; 慎治小林; 健治細田; 護清木; 正孝白木; 仁小林
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1994-09-09
Filing date: 1995-05-12
Publication date: 2005-03-16
Anticipated expiration: 2020-03-16
Also published as: JPH08126500A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビタミンＤレセプターの遺伝子多型を測定することにより、ビタミンＤ_３製剤に対する感受性を予測する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、西洋医学においては、疾患や患者の症状に応じて薬の投与がなされていたが、患者個人個人における、薬に対する反応性の違いに関しては“体質”として片付けられ、個人個人の薬剤感受性（薬剤反応性）に応じた薬剤投与をすることは困難であった。
【０００３】
疾患やその治療法がますます複雑になっている現在、治療による薬剤感受性の判定と患者個人個人の体質に応じた適切な薬の投与は、治療を有効に行うためにもますます必要になってきている。
【０００４】
近年、遺伝子解析の進歩に伴い、薬剤に対する個人個人の反応性の違いが、ある遺伝子型によって分類されるという報告がいくつかなされた。
【０００５】
Carmena R.らは、家族性高コレステロール血症患者におけるlovastatin（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤）の治療効果がアポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）の遺伝子型によって異なることを報告した（Metabolism Vol. ４２，No. ７，ｐ８９５（１９９３））。
【０００６】
また、Watanabe J. らは、インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の高コレステロール血症患者に対するプラバスタチン（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤）の効果がアポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）の遺伝子型によって異なることを報告した（Diabetes Res Clin Pract Vol.２０，No. １，ｐ２１（１９９３））。
【０００７】
さらに、Okuguchi F. らも、インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の高脂血症患者に対するプラバスタチン（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤）の効果がアポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）の遺伝子型によって異なることを報告した（J Jpn Atheroscler Soc Col.２２，No. ３，ｐ１２４（１９９４））。
【０００８】
しかし、ビタミンＤ類薬剤のビタミンＤ内分泌系関与疾患患者に対する治療における薬剤感受性に関する報告はこれまでになされていない。
【０００９】
ビタミンＤ製剤は、現在多くの疾患の治療に用いられている。その作用は大きく２つに分類され、１つはＣａ代謝の調節、そしてもう１つは免疫調節である。
【００１０】
前者に関連する疾患として、骨軟化症、クル症、腎性骨異栄養症、骨粗鬆症等がある。また、後者に関する疾患として乾癬、アトピー、癌、自己免疫疾患等が挙げられる。
【００１１】
しかしながら、現在のところビタミンＤの薬剤を用いて前述の各疾患を治療する際に事前に薬剤感受性を判定する手段は報告されていない。ビタミンＤの治療は長期を要するため、高感受性の患者、低感受性の患者を分類しうれば、無用の治療を避けることができるので、治療前の効果判定は非常に有用である。
【００１２】
ビタミンＤ類に応答する遺伝子の転写調節因子として同定されているビタミンＤ受容体（ビタミンＤレセプター）に関しては、ビタミンＤ類に対する応答能とビタミンＤレセプター遺伝子多型Ｂｓｍ−１との関係が Morrison N. A. らによって報告されている（ＷＯ９４／０３６３３）。上記報告では、ビタミンＤ類（カルシトリオール）に対する応答性を血中オステオカルシンの短期間（〜１２日間）での変化によりみており、ビタミンＤ類を投与すると血中オステオカルシン濃度が高くなるといっている。一方 Morrison N. A. らの報告（Proc. Natl. Acad.Sci. USA ８９，ｐ６６６５（１９９２）及びNature３６７，ｐ２８４（１９９４））によると血中オステオカルシン濃度が高い群が骨密度の低い群になっている。このことは、ビタミンＤ類（カルシトリオール）を投与したときに血中オステオカルシン濃度がより上昇する群が骨密度が高い群であるというＷＯ９４／０３６３３の報告と合わせて考えた場合、以下のような矛盾が生じる。つまり、骨密度の高い群はビタミンＤ類（カルシトリオール）を投与することにより血中オステオカルシン濃度が骨密度の低い群に近づくということになってしまう。このように、真の薬剤治療感受性の判定方法に関しては、不明であった。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
上記観点から、本発明者らはビタミンＤ類の薬剤感受性を判定することを可能とする最適の遺伝子型多型の分類方式を見出すべく研究し、驚くべきことにＡｐａＩ切断によるＡ−ａ型分類がビタミンＤ類の薬剤感受性の判定に有用であることを見出し、本発明に到達した。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、日本人を被験者とし、そのビタミンＤレセプター遺伝子のイントロン８におけるＡｐａＩＲＦＬＰを解析することを特徴とする、ビタミンＤ_３製剤による骨粗鬆症または乾癬の治療効果を予測する方法である。
【００１５】
また、本発明はビタミンＤレセプター遺伝子のイントロン８におけるＡｐａＩＲＦＬＰ部位を含む遺伝子断片のＰＣＲ増幅に用いることができる、フォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーペアである。
【００１６】
さらに、本発明は上記プライマーペア、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、および制限酵素ＡｐａＩを含んでなる遺伝子型測定キットである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明は、日本人を被験者とし、そのビタミンＤレセプター遺伝子のイントロン８におけるＡｐａＩＲＦＬＰを解析することを特徴とする、ビタミンＤ_３製剤による骨粗鬆症または乾癬の治療効果を予測する方法である。
【００１８】
本発明の対象薬剤および対象疾患の例としては、アルファカルシドール製剤による骨粗鬆症の治療や、タカルシトール製剤による乾癬の治療が挙げられる。
【００１９】
また、ビタミンＤレセプター遺伝子のイントロン８におけるＡｐａＩＲＦＬＰの解析方法としては、制限酵素ＡｐａＩで切断されない遺伝子型をＡ型と、同部位において切断される遺伝子型をａ型とし、それら組合せで決定される遺伝子多型ＡＡ、Ａａ、およびａａのいずれであるかを判定する手法を挙げることができる。
【００２０】
また、ビタミンＤレセプター遺伝子のイントロン８におけるＡｐａＩＲＦＬＰの解析方法の一例としては、ＡｐａＩＲＦＬＰ部位より５’−端側に存在する少なくとも１５塩基からなるオリゴヌクレオチドと、３’−端側に存在する少なくとも１５塩基からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーとして遺伝子断片を増幅し、それを制限酵素ＡｐａＩで消化し、反応生成物を電気泳動にかけてその泳動像から遺伝子多型を判断する方法が挙げられる。
【００２１】
ここで、アルファカルシドール製剤による骨粗鬆症の治療効果を予測する場合には、遺伝子型Ａａおよびａａを薬剤感受性型と分類し、ＡＡを薬剤低感受性型と分類する。なかでも遺伝子型ａａが薬剤高感受性型である。
【００２２】
また、タカルシトール製剤による乾癬の治療効果を予測する場合には、遺伝子型ａａを薬剤高感受性型と分類する。
【００２３】
一方、ビタミンＤレセプター遺伝子のイントロン８におけるＡｐａＩＲＦＬＰ部位を含む遺伝子断片のＰＣＲ増幅に用いることができる本発明のプライマーペアは、当該遺伝子の配列は既知であることから、当業者であればＰＣＲに関する技術常識に基づいて容易に設計、調製することができる。
【００２４】
また、本発明の遺伝子型測定キットには、例えば反応緩衝液をさらに含んでいてもよい。
【００２５】
本発明に用いるビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）のゲノムＤＮＡは第１２番染色体上にあることがわかっているが、本発明においてはＤＮＡ増幅法を用いるので、第１２番染色体上にあるかどうかは直接発明の実施に関係しない。ＶＤＲゲノムＤＮＡの観察しようとする領域を含む増幅領域の端部に特異的なプライマーを塩基配列のデータから設計することができ、それによりＶＤＲゲノムＤＮＡが第１２番染色体にあるかどうかを知らなくても特異的に増幅できるからである。
【００２６】
ゲノムＤＮＡのエクソン７、エクソン８およびエクソン９の塩基配列は、Andrew R.Baker et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.８５，pp３２９４〜３２９８，May,１９８８で開示されており、エクソン８とエクソン９間のイントロン部にはＢｓｍＩおよびＡｐａＩの切断部位の存在する遺伝子型が存在することが判っている。したがって、該イントロン部のＡｐａＩの制限酵素部位を含有するようなＤＮＡ断片が得られるようにプライマーを形成し、遺伝子増幅を行う。
【００２７】
上記プライマーは少なくとも１５塩基の長さ、好ましくは少なくとも２０塩基の長さのオリゴヌクレオチドである。
【００２８】
ゲノムＤＮＡの遺伝子多型測定を行う生体試料の採取源には特に限定はないが、血球成分が採取しやすく、これで十分である。
【００２９】
以下、本発明における遺伝子多型測定に用いることができる標準的なＤＮＡ抽出操作、遺伝子増幅操作、制限酵素切断操作および電気泳動操作、並びに骨密度の測定法の一例について説明する。
（１）ゲノムＤＮＡを用いた多型分析
（ａ）標準的ＤＮＡ抽出操作
１．全血０．５ｍｌ（２Ｎａ−ＥＤＴＡ抗凝固剤使用）を１．５ｍｌ容のマイクロ遠心管に入れる。
２．溶解液を０．５ｍｌ加えて、チューブを数回軽く、逆さにして液を混ぜる。
（下記の混合操作はこれに従う）
溶解液例：１×ＳＳＣ（１リットル中にＮａＣｌ１７５．３ｇ、クエン酸ナトリウム８８．２ｇを含む１０ＭＮａＯＨでｐＨ７．０に調製した２０×ＳＳＣを２０倍に稀釈したもの）
３．遠心（１０，０００ｇ、２０秒、４℃）した後、黒っぽいペレットが流出しないように上清を除く。
４．溶解液を１ｍｌ加えて、マイクロチューブミキサーにて攪拌する（ＭＴ−３６０では、スピード７、３０秒）
５．遠心（１０，０００ｇ、２０秒、４℃）した後、上清を除く。
６．ステップ４〜５を１回繰り返す。
７．酵素反応液２００μｌとタンパク分解酵素１０μｌを加えて混合する。
【００３０】
酵素反応液例：０．０４ＭＤＴＴ（ジチオスレイトール）、０．２ＭＮａＯＡｃ（酢酸ナトリウム）および０．４％ＳＤＳの混合液
蛋白分解酵素液例：１０ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫ（Proteinase K）
８．３７℃で１時間保温する（途中２〜３回軽く振り混ぜる）。
９．ヨウ化ナトリウム溶液を３００μｌ加えて混合する。
１０．イソプロピルアルコールを０．５ｍｌ加えて、白い線状のＤＮＡが完全に見えてくるまで混合する。
１１．遠心（１０，０００ｇ、１０分、室温）した後、上清をゆっくり除く。容器を濾紙の上に逆さに置く等の方法で、器壁に残った溶液を充分に除く。
１２．洗浄液（Ａ）を１ｍｌ加えて混合する。沈澱が器壁から剥がれる程度に十分混合する。
【００３１】
洗浄液（Ａ）例：７０％ＥｔＯＨ
１３．遠心（１０，０００ｇ、５分間、室温）後上清を除く。
１４．洗浄液（Ｂ）を１ｍｌ加えて混合する。沈澱が器壁から剥がれる程度に充分混合する。
【００３２】
洗浄液（Ｂ）例：８０％ＥｔＯＨ
１５．遠心（１０，０００ｇ、５分間、室温）後上清を除く。
１６．ＤＮＡ沈澱を軽く減圧乾燥する。（乾燥しすぎるとＤＮＡが溶けにくいので、乾燥時間は３分間以内にする。）
（ｂ）標準的遺伝子増幅操作
遺伝子増幅法についてはいくつかの原理が知られているが、ここではポリメレース・チェイン・リアクション法（ＰＣＲ法）を標準的なものとして記載する。
【００３３】
反応液組成：５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０、２５℃）、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂ 、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、１５μＭフォワードプライマー（Forward Primer）、１５μＭリバースプライマー（Riverse Primer）、１ｍｇ／ＬゲノムＤＮＡ、１ユニットＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、全容積５０μｌ
反応サイクル：９４℃、１分；６４℃、１分；７２℃、１分を１サイクルとし、４０サイクル実施。
【００３４】
ＡｐａＩ切断用プライマーとしては、オリゴヌクレオチド（１）としてエクソン７にハイブリダイズする下記プライマーＡ（３０塩基）とオリゴヌクレオチド（２）としてエクソン９にハイブリダイズする下記プライマーＢ（３０塩基）を用いる。
【００３５】
ＡｐａＩ用プライマー：
プライマーＡ：５’−ＣＡＡＣＣＡＡＧＡＣＴＡＣＡＡＧＴＡＣＣＧＣＧＴＣＡＧＴＧＡ−３’
プライマーＢ：５’−ＡＡＧＧＧＧＴＴＡＧＧＴＴＧＧＡＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＡＴＧ−３’
（ｃ）標準的制限酵素切断操作
ＡｐａＩ用反応液組成：１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）：７ｍＭＭｇＣｌ_２、１０ｍＭＮａＣｌ、７ｍＭ２−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）
ＡｐａＩを１０ユニット／２０μｌ反応液の濃度で加え、３７℃、３時間インキュベートする。
【００３６】
（ｄ）標準的電気泳動操作
電気泳動用緩衝液は、０．５×ＴＢＥである。但し、５×ＴＢＥは１リットル中Ｔｒｉｓベース５４ｇ、ホウ酸２７．５ｇおよびＥＤＴＡ１ｍＭを含有し、ｐＨ８．０に調整してある。上記緩衝液を用いて、１％アガロースゲル［Seakem GTA Agarose（FMC Bio Products）使用］（０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド含有）を使用して、電圧１００Ｖで３０分間泳動する。その後ＵＶランプでＤＮＡのバンドを観察する。
【００３７】
プライマーＡ、プライマーＢを用いて増幅したＤＮＡフラグメントをＡｐａＩにより切断した断片の場合、電気泳動により、２．１Ｋｂにバンドが表れる場合を遺伝子型ＡＡ、０．４７Ｋｂと１．６３Ｋｂにバンドが表れる遺伝子型をａａ、３本一緒に表われる場合を遺伝子型Ａａと判定できる。
（２）骨密度の測定方法
骨密度の測定は、ＤＥＸＡ（Dual Energy X-ray Absorptiometry）法に基づいて、腰椎骨について行う。ＤＥＸＡ法に用いる装置として、例えばＤＰＸ−Ｌ［Lunar Rad. Co.（Madison,WI）］を用いて行う。
【００３８】
なおビタミンＤ_３製剤としては、以下のものが例示される。
カルシポトリオール（Calcipotriol）
２２−オキサカルシトリオール（oxacalcitriol）
１，２３，２５（ＯＨ）_３−２４−オキソＤ_３
１α，２５Ｒ，２６（ＯＨ）_３−２２−エンＤ_３
１α，２５（ＯＨ）_２−２０−エピ−２２−オキサ−２４,２６,２７−トリホモ（trihomo）Ｄ_３
１α，２５（ＯＨ）_２−２２,２４−ジエン−２４,２６,２７−トリホモ（trihomo）Ｄ_３１α，２５（ＯＨ）_２−１６−エン−２３−インＤ_３
２β−（３−ヒドロキシプロポキシ）−１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３
１α，２５（ＯＨ）_２−２３,２４−ジノル−２２,２５−インター−ｍ−フェニレン−Ｄ_３
１α，２５（ＯＨ）_２−２２−エン−Ｄ_３
１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３
１α，２５（ＯＨ）_２−２６，２７−Ｆ_６−Ｄ_３
１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３−２４,２４,２４,２６,２６,２６,２７,２７,２７−ｄ_８
１α，２３Ｓ，２５（ＯＨ）_３Ｄ_３
１α，２４Ｒ，２５（ＯＨ）_３Ｄ_３
２５（ＯＨ）−２３−イン−Ｄ_３
２５（ＯＨ）−２６，２７−Ｆ_６−２３−イン−Ｄ_３
２４Ｒ，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３
２５（ＯＨ）−１６−エン−２３−イン−Ｄ_３
２４−ノル−１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３
１α，１１β，２５（ＯＨ）_３Ｄ_３
ビタミンＤ_３
２５（ＯＨ）Ｄ_３
１α（ＯＨ）Ｄ_３
１α，２４Ｓ（ＯＨ）2 −２２−エン−２６，２７−デヒドロ−Ｄ_３
９（１１）−デヒドロ−１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３
１１β−メトキシ−１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３
１α（ＯＨ）２５−オキソ−２６,２７−ジメチル−２５−ホスファ−２６,２７−ジオキサ−Ｄ_３
２２（ｍ−ヒドロキシフェニル）−２３,２４,２５,２６,２７−ペンタノル−１α（ＯＨ）Ｄ_３
２２−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−２３,２４,２５,２６,２７−ペンタノル−１α（ＯＨ）Ｄ_３
２５Ｓ，２６（ＯＨ）_２Ｄ_３
１α，２５Ｓ，２６（ＯＨ）_３Ｄ_３
１α，２５（ＯＨ）_２−１６−エン−２３−イン−２６，２７−Ｆ_６−Ｄ_３
２５（ＯＨ）−１６−エン−２３−イン−２６，２７−Ｆ_６−Ｄ_３
１α，２５（ＯＨ）_２−２４ａ−ホモ−Ｄ_３
１α，２５（ＯＨ）_２−２４ａ−ジホモ−Ｄ_３
２２−オキサ−１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３
２２（ｍ（ジメチルヒドロキシメチル）フェニル）−ペンタノル−１α(ＯＨ)_２Ｄ_３
１α，２５（ＯＨ）_２−２３−エン−Ｄ_３
２５（ＯＨ）−２３−エン−Ｄ_３
１α，２５（ＯＨ）_２−１６，２３−ジエン−Ｄ_３
１４−エピ−１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３
１４−エピ−１α，２５（ＯＨ）_２プレ−Ｄ_３
１β，２５（ＯＨ）_２−３−エピ−Ｄ_３
１α，２５（ＯＨ）_２−３−エピ−Ｄ_３
１β，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３
１α，２５（ＯＨ）_２−１６−エン−Ｄ_３
２５（ＯＨ）−１６−エン−Ｄ_３
２５（ＯＨ）−１６，２３−ジエン−Ｄ_３
（２２Ｓ）−１α，２５（ＯＨ）_２−２２，２３−ジエン−Ｄ_３
（２２Ｒ）−１α，２５（ＯＨ）_２−２２，２３−ジエン−Ｄ_３
１４−エピ−２５（ＯＨ）Ｄ_３
１４−エピ−２５（ＯＨ）−プレ−Ｄ_３
α−Ｆｅ（ＣＯ）_３−２５（ＯＨ）−５，６−トランス−Ｄ_３
α−Ｆｅ（ＣＯ）_３−２５（ＯＨ）Ｄ_３
β−Ｆｅ（ＣＯ）_３−２５（ＯＨ）Ｄ_３
β−Ｆｅ（ＣＯ）_３−２５（ＯＨ）−５，６−トランス−Ｄ_３
Ｃｏ2 （ＣＯ）_６−１α，２５（ＯＨ）_２−６，７−デヒドロ−プレ−Ｄ_３
１α，２５（ＯＨ）_２−トランス−タキステロール（tachysterol）
１α，２４Ｓ（ＯＨ）_２Ｄ_３
１α，２４Ｒ（ＯＨ）_２Ｄ_３
１α，２５Ｓ，２６（ＯＨ）_３−２２−エン−Ｄ_３
１α，２５（ＯＨ）_２−２３−イン−Ｄ_３
１α−Ｆ−２５（ＯＨ）−１６−エン−２３−イン−２６，２７−Ｆ_６−Ｄ_３
【００３９】
【実施例】
［実施例１］
日本人乾癬患者８名について標準的操作法に従い各人の遺伝子を判定した。なお、比較のために制限酵素ＡｐａＩの代わりに制限酵素ＢｓｍＩを用いて、Ｂ−ｂ型分類もおこなった。ＢｓｍＩによる切断操作の反応液組成は５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍＭＤＴＴ（ｐＨ７．９）であり、ＢｓｍＩを５ユニット／２０μ１反応液の濃度で添加し、６５℃で３時間インキュベートする。
【００４０】
該遺伝子型と感受性（高感受性、低感受性）との相関は以下の通りである。
【００４１】
なお薬剤感受性については、乾癬患者の疾患皮膚部位に１，２４Ｒ（ＯＨ）_２Ｄ_３製剤（ボンアルファ（登録商標）、帝人製、一般名：タカルシトール）を塗布し、著効を示したもの（２週間内で治癒）を高感受性、そうでないものを低感受性とした。
【００４２】
【表１】

【００４３】
上記結果はＡ−ａ遺伝子型分類によりビタミンＤ類薬剤に対する低感受性群を特異性１００％、感度８３．３％で予測できることを示す。なお、ＡＡは低感受性であった。
【００４４】
【表２】

【００４５】
上記結果はカイ２乗ｐ値からも判定されるようにＢｓｍ遺伝子型分類が有用でないことを示している。
【００４６】
［実施例２］
日本人骨粗鬆症患者２２例において、カルシウム製剤を投与し（２００ｍｇ／日）、１年後の骨密度を初期骨密度と比較し、骨密度が上昇したもの（ＢＭＤ１年後／ＢＭＤ初期＞１）を高感受性、骨密度が下降（ＢＭＤ１年後／ＢＭＤ初期≦１）したものを低感受性とした。同時に、上記患者から採血を行い、各人の遺伝子型を判定した。なお、比較のために制限酵素Ａｐａｌの代わりに制限酵素ＢｓｍＩを用いて、Ｂ−ｂ型分類もおこなった。ＢｓｍＩによる切断操作の反応液組成は５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍＭＤＴＴ（ｐＨ７．９）であり、ＢｓｍＩを５ユニット／２０μ１反応液の濃度で添加し、６５℃で３時間インキュベートする。
【００４７】
該遺伝子型と高感受性の割合との相関は以下の通りである。
【００４８】
【表３】

【００４９】
上記結果は、Ａ−ａ遺伝子型分類により薬剤感受性を判定するに際し、カルシウム製剤を用いた骨粗鬆症の治療において遺伝型ａが増加するにつれ、高感受性の割合は増加しており、以上の結果から遺伝型ａが高感受性であることを明らかに示している。
【００５０】
なお、Ｂ−ｂ遺伝型分類（ＢＢ、Ｂｂ、ｂｂ）において、高感受性の割合はＢＢでは出現せず、さらにＢｂ、ｂｂでも高感受性の割合は増加しておらず、この結果よりＢｓｍ遺伝子型分類は有用でないことが明らかである。
【００５１】
［実施例３］
無作為に選んだ日本人骨粗鬆症患者３１名を対象として、１α，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３製剤（ワンアルファ（登録商標）、帝人製、一般名：アルファカルシドール）を経口投与（０．５〜１．０μｇ／ｄａｙ）し、３〜６ケ月後の骨密度（ＢＭＤ）を初期の骨密度と比較し、骨密度の変化率（ＢＭＤ（治療後）／ＢＭＤ（治療前））を求めた。また、同時に採血を行い、各人のビタミンＤレセプターのＡｐａＩ遺伝子型を判定した。
【００５２】
なお、比較のため、非投与群３３名についても、骨密度測定、遺伝子型解析を行った。
【００５３】
ＡｐａＩ遺伝子型と、骨密度増加群、減少群の割合との関係を図１に示す。
【００５４】
上記結果は、ビタミンＤレセプターのＡｐａＩ遺伝子分類により、薬剤感受性を判定するに際し、ビタミンＤ類の経口投与による骨粗鬆症治療において、Ａａ型およびａａ型の骨密度上昇群が約７５％であり、ビタミンＤ薬剤感受性群であることを示している（図１）。すなわち、上記遺伝子型の患者の中に高感受性患者の数が多いこと（高頻度）を示している。
【００５５】
また、ビタミンＤレセプターのＡｐａＩ遺伝子分類により、薬剤感受性を判定するに際し、ビタミンＤ類の経口投与による骨粗鬆症治療において、ａａ型の骨密度上昇率が高く、高感受性であることを示している（図２）。これは、感受性の強さについてこの遺伝子型の患者は高いことを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】遺伝子型と高薬剤感受性者の頻度との関係を表す図である。
【図２】遺伝子型と薬剤感受性の程度との関係を表す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention, by measuring the genetic polymorphism of the vitamin D receptor, relates to a method for predicting susceptibility to vitamin D ₃ formulations.
[0002]
[Prior art]
Traditionally, in Western medicine, drugs have been administered according to the disease or patient's symptoms, but the differences in responsiveness to drugs in individual patients are categorized as “constitution”, and drug sensitivity ( It was difficult to administer drugs according to drug reactivity.
[0003]
With the increasing complexity of diseases and their treatments, the determination of drug sensitivity by treatment and the administration of appropriate drugs according to the individual constitution of patients are becoming increasingly necessary for effective treatment. It is coming.
[0004]
In recent years, with the progress of genetic analysis, there have been some reports that differences in individual responsiveness to drugs are classified by a certain genotype.
[0005]
Carmena R. et al. Reported that the therapeutic effect of lovastatin (HMG-CoA reductase inhibitor) in patients with familial hypercholesterolemia depends on the genotype of apolipoprotein E (ApoE) (Metabolism Vol. 42, No. 7, p 895 (1993)).
[0006]
Watanabe J. et al. Also reported that the effect of pravastatin (HMG-CoA reductase inhibitor) on hypercholesterolemia patients with non-insulin dependent diabetes mellitus (NIDDM) depends on the genotype of apolipoprotein E (ApoE). (Diabetes Res Clin Pract Vol. 20, No. 1, p21 (1993)).
[0007]
Furthermore, Okuguchi F. et al. Also reported that the effect of pravastatin (HMG-CoA reductase inhibitor) on hyperlipidemic patients with non-insulin dependent diabetes mellitus (NIDDM) differs depending on the genotype of apolipoprotein E (ApoE). (J Jpn Atheroscler Soc Col. 22, No. 3, p124 (1994)).
[0008]
However, there have been no reports on drug sensitivity in the treatment of vitamin D-type drugs for patients with diseases related to vitamin D endocrine system.
[0009]
Vitamin D preparations are currently used for the treatment of many diseases. Its action can be broadly classified into two, one is the regulation of Ca metabolism and the other is immune regulation.
[0010]
Examples of the diseases related to the former include osteomalacia, cleosis, renal osteodystrophy, osteoporosis and the like. Moreover, psoriasis, atopy, cancer, an autoimmune disease etc. are mentioned as a disease regarding the latter.
[0011]
However, at present, no means has been reported for determining drug sensitivity in advance when treating each of the aforementioned diseases using vitamin D drugs. Since treatment with vitamin D requires a long period of time, unnecessary treatment can be avoided if high sensitivity patients and low sensitivity patients are classified. Therefore, determination of the effect before treatment is very useful.
[0012]
Regarding the vitamin D receptor (vitamin D receptor) that has been identified as a transcriptional regulator of genes that respond to vitamin Ds, the relationship between the ability to respond to vitamin Ds and the vitamin D receptor gene polymorphism Bsm-1 is Morrison NA (WO 94/03633). In the above report, responsiveness to vitamin Ds (calcitriol) is observed by changes in blood osteocalcin in a short period (˜12 days), and it is said that blood osteocalcin concentration increases when vitamin Ds are administered. On the other hand, according to a report by Morrison NA et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, p6665 (1992) and Nature 367, p284 (1994)), the group with high blood osteocalcin concentration is a group with low bone density. When this is considered together with the report of WO 94/03633 that the group in which the blood osteocalcin concentration is higher when the vitamin Ds (calcitriol) is administered is a group with high bone density, A contradiction arises. In other words, a group with high bone density will have a blood osteocalcin concentration approaching a group with low bone density by administering vitamin Ds (calcitriol). Thus, the method for determining the true drug treatment sensitivity was unknown.
[0013]
[Problems to be solved by the invention]
From the above viewpoint, the present inventors have studied to find an optimal genotype polymorphism classification system that makes it possible to determine the drug sensitivity of vitamin Ds, and surprisingly, Aa type classification by ApaI cleavage. Has been found useful for determining the drug sensitivity of vitamin Ds, and the present invention has been achieved.
[0014]
[Means for Solving the Problems]
The present invention, Japanese and subject its analyzing ApaI RFLP in the vitamin D receptor gene intron 8, wherein a method of predicting the therapeutic effect of osteoporosis or psoriasis Vitamin D ₃ formulations.
[0015]
In addition, the present invention is a primer pair consisting of a forward primer and a reverse primer that can be used for PCR amplification of a gene fragment containing an ApaI RFLP site in intron 8 of the vitamin D receptor gene.
[0016]
Furthermore, the present invention is a genotyping kit comprising the above primer pair, a thermostable DNA polymerase, and the restriction enzyme ApaI.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention, Japanese and subject its analyzing ApaI RFLP in the vitamin D receptor gene intron 8, wherein a method of predicting the therapeutic effect of osteoporosis or psoriasis Vitamin D ₃ formulations.
[0018]
Examples of the target drug and target disease of the present invention include treatment of osteoporosis with an alphacalcidol formulation and treatment of psoriasis with a tacalcitol formulation.
[0019]
In addition, as a method for analyzing ApaI RFLP in intron 8 of the vitamin D receptor gene, the genotype that is not cleaved by the restriction enzyme ApaI is designated as A type, and the genotype that is cleaved at the same site is designated as a type. A method for determining whether the gene polymorphism is AA, Aa, or aa can be given.
[0020]
In addition, as an example of a method for analyzing ApaI RFLP in intron 8 of the vitamin D receptor gene, an oligonucleotide consisting of at least 15 bases present on the 5′-end side from the ApaI RFLP site and at least existing on the 3′-end side Examples include a method of amplifying a gene fragment using an oligonucleotide consisting of 15 bases as a primer, digesting it with a restriction enzyme ApaI, subjecting the reaction product to electrophoresis, and judging the gene polymorphism from the electrophoresis image.
[0021]
Here, when predicting the therapeutic effect of osteoporosis by the alphacalcidol preparation, genotypes Aa and aa are classified as drug-sensitive types, and AA is classified as a drug-insensitive type. Among these, genotype aa is a drug-sensitive type.
[0022]
Moreover, when predicting the therapeutic effect of psoriasis by a tacalcitol preparation, genotype aa is classified as a drug-sensitive type.
[0023]
On the other hand, the primer pair of the present invention that can be used for PCR amplification of a gene fragment containing the ApaI RFLP site in intron 8 of the vitamin D receptor gene is known to those skilled in the art because the sequence of the gene is known. It can be easily designed and prepared based on common general technical knowledge.
[0024]
Moreover, the genotyping kit of the present invention may further contain, for example, a reaction buffer.
[0025]
Although it is known that the genomic DNA of the vitamin D receptor (VDR) used in the present invention is on chromosome 12, since the DNA amplification method is used in the present invention, it is directly determined whether it is on chromosome 12. It does not relate to the implementation of the invention. Primers specific to the end of the amplification region including the region to be observed of the VDR genomic DNA can be designed from the nucleotide sequence data, so that it is not necessary to know whether the VDR genomic DNA is on chromosome 12. This is because it can be specifically amplified.
[0026]
The base sequences of exon 7, exon 8 and exon 9 of genomic DNA are disclosed in Andrew R. Baker et. Al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 85, pp 3294-3298, May, 1988. In addition, it is known that a genotype having a cleavage site of BsmI and ApaI exists in the intron between exon 8 and exon 9. Therefore, a primer is formed so as to obtain a DNA fragment containing the ApaI restriction enzyme site of the intron, and gene amplification is performed.
[0027]
The primer is an oligonucleotide of at least 15 bases in length, preferably at least 20 bases in length.
[0028]
There are no particular limitations on the collection source of the biological sample for performing genetic polymorphism measurement of genomic DNA, but it is easy to collect blood cell components, which is sufficient.
[0029]
Hereinafter, an example of a standard DNA extraction operation, gene amplification operation, restriction enzyme cleavage operation and electrophoresis operation, and bone density measurement method that can be used for gene polymorphism measurement in the present invention will be described.
(1) Polymorphism analysis using genomic DNA (a) Standard DNA extraction procedure Place 0.5 ml of whole blood (using 2Na-EDTA anticoagulant) into a 1.5 ml microcentrifuge tube.
2. Add 0.5 ml of the lysate and gently mix the solution by inverting the tube several times.
(The following mixing operation follows this)
Example of lysate: 1 × SSC (20 × SSC prepared to pH 7.0 with 10M NaOH containing 175.3 g of NaCl and 88.2 g of sodium citrate in 1 liter diluted 20 times)
3. After centrifugation (10,000 g, 20 seconds, 4 ° C.), the supernatant is removed so that the dark pellet does not flow out.
4). Add 1 ml of lysate and stir with a microtube mixer (MT-360, speed 7, 30 seconds)
5. After centrifugation (10,000 g, 20 seconds, 4 ° C.), the supernatant is removed.
6). Repeat steps 4-5 once.
7). Add 200 μl of enzyme reaction solution and 10 μl of proteolytic enzyme and mix.
[0030]
Example of enzyme reaction solution: 0.04M DTT (dithiothreitol), 0.2M NaOAc (sodium acetate) and 0.4% SDS mixed solution Proteolytic enzyme solution example: 10 mg / ml proteinase K (Proteinase K)
8. Incubate at 37 ° C for 1 hour (lightly shake 2 to 3 times in the middle).
9. Add 300 μl of sodium iodide solution and mix.
10. Add 0.5 ml of isopropyl alcohol and mix until white linear DNA is completely visible.
11. After centrifugation (10,000 g, 10 minutes, room temperature), the supernatant is slowly removed. Thoroughly remove the solution remaining on the vessel wall, such as by placing the container upside down on the filter paper.
12 Add 1 ml of washing solution (A) and mix. Mix well enough to allow the precipitate to peel off the vessel wall.
[0031]
Cleaning liquid (A) Example: 70% EtOH
13. After centrifugation (10,000 g, 5 minutes, room temperature), the supernatant is removed.
14 Add 1 ml of washing solution (B) and mix. Mix well enough to allow the precipitate to peel off the vessel wall.
[0032]
Cleaning solution (B) Example: 80% EtOH
15. After centrifugation (10,000 g, 5 minutes, room temperature), the supernatant is removed.
16. The DNA precipitate is lightly dried under reduced pressure. (Drying time should be 3 minutes or less because DNA is difficult to dissolve if dried too much.)
(B) Standard Gene Amplification Operation Several principles are known for the gene amplification method. Here, the polymerase chain reaction method (PCR method) is described as a standard method.
[0033]
Reaction solution composition: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9.0, 25 ° C.), 0.1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl ₂ , 0.2 mM dNTPs, 15 μM forward primer, 15 μM reverse primer (Riverse Primer), 1 mg / L genomic DNA, 1 unit Taq DNA polymerase, total volume 50 μl
Reaction cycle: 94 ° C., 1 minute; 64 ° C., 1 minute; 72 ° C., 1 minute is one cycle, 40 cycles.
[0034]
As the ApaI cleavage primer, the following primer A (30 bases) hybridizing to exon 7 as oligonucleotide (1) and the following primer B (30 bases) hybridizing to exon 9 as oligonucleotide (2) are used.
[0035]
ApaI primers:
Primer A: 5′-CAACCAAGACTTACAAGTACCGCGTCAGGTGA-3 ′
Primer B: 5′-AAGGGGTTAGGTTGGACAGGGAGAGAGATG-3 ′
(C) Standard restriction enzyme cleavage operation Reaction solution composition for ApaI: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5): 7 mM MgCl ₂ , 10 mM NaCl, 7 mM 2-mercaptoethanol, 100 μg / ml BSA (bovine serum albumin)
ApaI is added at a concentration of 10 units / 20 μl reaction and incubated at 37 ° C. for 3 hours.
[0036]
(D) Standard electrophoresis operation The buffer for electrophoresis is 0.5 × TBE. However, 5 × TBE contains 54 g of Tris base, 27.5 g of boric acid and 1 mM of EDTA in 1 liter, and is adjusted to pH 8.0. Electrophoresis is carried out for 30 minutes at a voltage of 100 V using a 1% agarose gel (using Seakem GTA Agarose (FMC Bio Products)) (containing 0.5 μg / ml ethidium bromide) using the above buffer. Thereafter, the DNA band is observed with a UV lamp.
[0037]
In the case of a fragment obtained by cleaving a DNA fragment amplified using Primer A and Primer B with ApaI, a gene appears to have a band at 2.1 Kb by electrophoresis, and a band appears at 0.47 Kb and 1.63 Kb A case in which three types appear together, aa, can be determined as genotype Aa.
(2) Bone density measurement method Bone density is measured for lumbar vertebrae based on the DEXA (Dual Energy X-ray Absorptiometry) method. As an apparatus used for the DEXA method, for example, DPX-L [Lunar Rad. Co. (Madison, WI)] is used.
[0038]
Note Vitamins D ₃ formulation, are exemplified as follows.
Calcipotriol
22-oxacalcitriol
1,23,25 (OH) ₃ -24-oxoD ₃
1α, 25R, 26 (OH) ₃ -22-ene D ₃
1α, 25 (OH) ₂ -20-epi-22-oxa-24,26,27-trihomo D ₃
1α, 25 _(OH) 2 -22,24- diene -24,26,27- Torihomo _{(trihomo) D 3 1α, 25} (OH) 2 -16- _{-ene-23-yne-D 3}
2β- (3-hydroxypropoxy) -1α, 25 (OH) ₂ D ₃
1α, 25 (OH) ₂ -23,24-dinol-22,25-inter-m-phenylene-D ₃
1α, 25 (OH) ₂ -22-ene-D ₃
1α, 25 (OH) ₂ D ₃
1α, 25 (OH) ₂ -26, 27-F ₆ -D ₃
1α, 25 (OH) ₂ D ₃ -24,24,24,26,26,26,27,27,27-d ₈
1α, 23S, 25 (OH) ₃ D ₃
1α, 24R, 25 (OH) ₃ D ₃
25 (OH) -23-in-D ₃
_{25 (OH) -26,27-F 6} -23- Inn -D ₃
24R, 25 (OH) ₂ D ₃
25 (OH) -16--ene-23-yne--D ₃
24-nor-1α, 25 (OH) ₂ D ₃
1α, 11β, 25 (OH) ₃ D ₃
Vitamin D ₃
25 (OH) D ₃
1α (OH) D ₃
1α, 24S (OH) 2 -22-ene-26,27-dehydro-D ₃
9 (11) -dehydro-1α, 25 (OH) ₂ D ₃
11β-methoxy-1α, 25 (OH) ₂ D ₃
1α (OH) 25-oxo-26,27-dimethyl-25-phospha-26,27-dioxa-D ₃
22 (m-hydroxyphenyl) -23,24,25,26,27-pentanol-1α (OH) D ₃
22- (p-hydroxyphenyl) -23,24,25,26,27-pentanol-1α (OH) D ₃
25S, 26 (OH) ₂ D ₃
1α, 25S, 26 (OH) ₃ D ₃
1α, 25 (OH) ₂ -16-ene-23-in-26, 27-F ₆ -D ₃
25 (OH) _{-16--ene-23-yne--26,27-F} 6 -D ₃
1α, 25 (OH) ₂ -24a-homo-D ₃
1α, 25 (OH) ₂ -24a-dihomo-D ₃
22-Oxa-1α, 25 (OH) ₂ D ₃
22 (m (dimethylhydroxymethyl) phenyl) -pentanol-1α (OH) ₂ D ₃
1α, 25 (OH) ₂ -23-ene-D ₃
25 (OH) -23-ene-D ₃
1α, 25 (OH) ₂ -16,23-diene-D ₃
14-epi-1α, 25 (OH) ₂ D ₃
14-epi-1α, 25 (OH) ₂ pre-D ₃
1β, 25 (OH) ₂ -3-epi-D ₃
1α, 25 (OH) ₂ -3-epi-D ₃
1β, 25 (OH) ₂ D ₃
1α, 25 (OH) ₂ 16-ene-D ₃
25 (OH) -16-ene-D ₃
25 (OH) -16,23-diene-D ₃
(22S) -1α, 25 (OH) ₂ -22,23-diene-D ₃
(22R) -1α, 25 (OH) ₂ -22,23-diene-D ₃
14-epi-25 (OH) D ₃
14-epi-25 (OH) -pre-D ₃
α-Fe (CO) ₃ -25 (OH) -5,6-trans-D ₃
α-Fe (CO) ₃ -25 (OH) D ₃
β-Fe (CO) ₃ -25 (OH) D ₃
β-Fe (CO) ₃ -25 (OH) -5,6-trans-D ₃
_{_{Co2 (CO) 6 -1α, 25}} (OH) 2 -6,7- dehydro - Pre -D ₃
1α, 25 (OH) ₂ -trans-tachysterol
1α, 24S (OH) ₂ D ₃
1α, 24R (OH) ₂ D ₃
1α, 25S, 26 (OH) ₃ -22-ene-D ₃
1α, 25 (OH) ₂ -23-in-D ₃
1α-F-25 (OH) -16-ene-23-in-26, 27-F ₆ -D ₃
[0039]
【Example】
[Example 1]
Each of the eight Japanese patients with psoriasis was determined according to standard procedures. For comparison, Bb type classification was also performed using the restriction enzyme BsmI instead of the restriction enzyme ApaI. The composition of the reaction solution for the cleavage operation with BsmI was 50 mM NaCl, 10 mM, Tris-HCl, 10 mM MgCl ₂ , 1 mM DTT (pH 7.9), and BsmI was added at a concentration of 5 units / 20 μ1 reaction solution, and 3 at 65 ° C. Incubate for hours.
[0040]
The correlation between the genotype and sensitivity (high sensitivity, low sensitivity) is as follows.
[0041]
As for drug sensitivity, 1,24R (OH) ₂ D ₃ preparation (Bon Alpha (registered trademark), manufactured by Teijin, general name: tacalcitol) was applied to the diseased skin site of psoriasis patients, and showed remarkable effects ( Healing within 2 weeks was considered highly sensitive, and others were considered less sensitive.
[0042]
[Table 1]

[0043]
The above results indicate that the low sensitivity group for vitamin D drugs can be predicted with 100% specificity and 83.3% sensitivity by Aa genotyping. AA was less sensitive.
[0044]
[Table 2]

[0045]
The above results indicate that the Bsm genotype classification is not useful as determined from the chi-square p-value.
[0046]
[Example 2]
In 22 Japanese osteoporosis patients, a calcium preparation was administered (200 mg / day), and the bone density after 1 year was compared with the initial bone density, and the bone density increased (after 1 BMD / early BMD> 1) High sensitivity and a decrease in bone density (after 1 BMD / initial BMD ≦ 1) were regarded as low sensitivity. At the same time, blood was collected from the patient and the genotype of each person was determined. For comparison, Bb type classification was also performed using the restriction enzyme BsmI instead of the restriction enzyme Apal. The composition of the reaction solution for the cutting operation with BsmI is 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCL, 10 mM MgCl ₂ , 1 mM DTT (pH 7.9), and BsmI is added at a concentration of 5 units / 20 μ1 reaction solution at 65 ° C. for 3 hours. Incubate.
[0047]
The correlation between the genotype and the high sensitivity ratio is as follows.
[0048]
[Table 3]

[0049]
The above results indicate that when determining drug susceptibility by Aa genotyping, the rate of hypersensitivity increases as genotype a increases in the treatment of osteoporosis using calcium preparations. It clearly shows that type a is highly sensitive.
[0050]
In the BB genotype classification (BB, Bb, bb), the ratio of high sensitivity does not appear in BB, and the ratio of high sensitivity does not increase in Bb, bb. Clearly the classification is not useful.
[0051]
[Example 3]
Oral administration of 1α, 25 (OH) ₂ D ₃ formulation (One Alpha (registered trademark), manufactured by Teijin, generic name: alphacalcidol) for 31 randomly selected Japanese osteoporosis patients The bone density (BMD) after 3 to 6 months was compared with the initial bone density, and the change rate of the bone density (BMD (after treatment) / BMD (before treatment)) was obtained. . At the same time, blood was collected to determine the ApaI genotype of each person's vitamin D receptor.
[0052]
For comparison, bone density measurement and genotype analysis were also performed for 33 non-administration groups.
[0053]
FIG. 1 shows the relationship between the ApaI genotype and the proportion of the bone density increasing group and the decreasing group.
[0054]
The above results show that in the treatment of osteoporosis by oral administration of vitamin Ds, the Aa type and aa type bone density increase groups are about 75% in determining the drug sensitivity according to the ApaI gene classification of vitamin D receptors. It shows that it is a drug sensitive group (FIG. 1). That is, it shows that there are many highly sensitive patients among the genotype patients (high frequency).
[0055]
In addition, when determining drug susceptibility based on the ApaI gene classification of vitamin D receptor, it shows that the aa-type bone density increase rate is high and highly sensitive in the treatment of osteoporosis by oral administration of vitamin Ds (Fig. 2). This indicates that patients with this genotype are highly sensitive.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the relationship between genotype and the frequency of highly drug sensitive individuals.
FIG. 2 is a diagram showing the relationship between genotype and the degree of drug sensitivity.

Claims

How Japanese and subject, wherein the analyzing the ApaI RFLP in intron 8 of the vitamin D receptor gene, to predict the therapeutic effect of osteoporosis or psoriasis Vitamin D ₃ formulations.

A method for predicting an osteoporosis therapeutic effect of an alphacalcidol preparation, characterized by analyzing ApaI RFLP in intron 8 of a vitamin D receptor gene in a Japanese subject.

A method for predicting the therapeutic effect of psoriasis by a tacalcitol preparation, characterized by analyzing ApaI RFLP in intron 8 of the vitamin D receptor gene in a Japanese subject.

A method for analyzing ApaI RFLP in intron 8 of the vitamin D receptor gene is a gene polymorphism AA, Aa, and aa determined by a combination of genotype A that is not cleaved with restriction enzyme ApaI and genotype a that is cleaved at the same site The prediction method according to any one of claims 1 to 3, wherein it is determined which one of the two.

A method for analyzing ApaI RFLP in intron 8 of the vitamin D receptor gene is an oligonucleotide consisting of at least 15 bases present at the 5′-end side from the ApaI RFLP site and an oligonucleotide consisting of at least 15 bases located at the 3′-end side. The gene fragment is amplified using nucleotide as a primer, digested with the restriction enzyme ApaI, and the reaction product is subjected to electrophoresis to determine the gene polymorphism from the electrophoresis image. The prediction method described.

The prediction method according to claim 4 or 5, wherein the therapeutic effect of osteoporosis by an alphacalcidol preparation is predicted, wherein genotypes Aa and aa are classified as drug-sensitive types, and AA is classified as a drug-insensitive type.

Furthermore, the prediction method according to claim 6, wherein genotype aa is classified as a drug-sensitive type.

The method for predicting the therapeutic effect of psoriasis by a tacalcitol preparation, wherein the genotype aa is classified as a drug-sensitive type.