JP3614514B2

JP3614514B2 - Method for quantifying cholesterol in high-density lipoprotein fraction and reagent kit for quantification

Info

Publication number: JP3614514B2
Application number: JP15495995A
Authority: JP
Inventors: 昌郁池田; 光正田畑; 功角山; 陽一橋口
Original assignee: 国際試薬株式会社
Priority date: 1995-06-21
Filing date: 1995-06-21
Publication date: 2005-01-26
Anticipated expiration: 2020-01-26
Also published as: WO1997000971A1; JPH09299A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）分画中のコレステロール（以下「ＨＤＬコレステロール」ともいう。）の定量方法及び定量用試薬キットに関し、とりわけ臨床検査の分野において、血清などの生体試料中のＨＤＬコレステロールの定量方法、及びＨＤＬコレステロール定量用試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液中のリポ蛋白はその比重により、カイロミクロン（比重＜１．００６）、超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ，比重１．００６〜１．０１９）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ，比重１．０１９〜１．０６３）、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ，比重１．０６３〜１．２１）などに分類され、これらのリポ蛋白の代謝に影響を与える疾患についての研究が進められてきた。中でもＨＤＬについては、その分画中の成分であるコレステロールが虚血性心疾患に密接に関係するとの１９７７年のＦｒａｍｉｎｇｈａｍの報告以来、急速に研究が進んでいる。
【０００３】
従来、ＨＤＬコレステロールの定量は沈殿分画法、超遠心法、電気泳動法などにより分離されたＨＤＬ分画について、その成分であるコレステロールが公知の方法にて測定されている。臨床検査での測定では、沈殿分画法がよく行われている。これは沈殿剤を用いてＨＤＬ以外のリポ蛋白分画を沈殿させ、それを遠心分離してＨＤＬ分画を得る。このときの沈殿剤としては、ポリアニオンと２価のカチオンとの組み合わせが良く用いられる。このようなポリアニオンにはポリエチレングリコール、リンタングステン酸、デキストラン硫酸などがあり、また２価のカチオンとしてはＭｇ、Ｍｎ、Ｃａ、Ｌｉ、Ｎｉなどが知られている。
【０００４】
次に、遠心分離により得られたＨＤＬ分画中のコレステロールを定量する公知の方法としては、酵素反応による測定が良く用いられる。なかでも、コレステロールエステラーゼ（ＣＥ）とコレステロールオキシダーゼ（ＣＯ）を用い、さらにペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）と色原体とを組み合わせて可視部領域で吸光度を測定する方法が良く知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このような従来の沈殿剤を用いる方法で、ＨＤＬ分画を分離するには、遠心分離の操作が必要となるため、臨床検査の日常業務で効率化のための自動分析装置を用いる場合には、直接利用できないという制約があった。そのためＨＤＬコレステロールを他の検査項目とマルチチャンネル化して測定するには支障があった。
【０００６】
本発明は、上述の課題を解決し、ＨＤＬコレステロールを効率良く測定することを目的とし、とりわけ臨床検査において自動分析装置を用いて測定できる有用な方法及びそのための試薬キットを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究した結果、ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画中のコレステロールに酵素を優先的に作用させる界面活性剤と、ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画中のコレスレロールに対する酵素による作用を抑制させる界面活性剤とを用いることにより、ＨＤＬ分画中のコレステロールが測定できることを見い出した。そして、さらに研究を重ねた結果、上述の目的が達成されることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、界面活性剤アシルポリオキシエチレンソルビタンエステルにより、ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画中のコレステロールに酵素を優先的に作用させて得られる反応生成物を反応系外に導き、次に界面活性剤アルキルポリオキシエチレンエーテルにより、ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画中の残存するコレステロールに対する酵素による作用を抑制させるとともに、ＨＤＬコレステロールに酵素を作用させて反応を進行させることを特徴とするＨＤＬコレステロールの定量方法に関するものである。
【０００９】
また、本発明は、界面活性剤アシルポリオキシエチレンソルビタンエステル及び酵素を含む第１試薬と、界面活性剤アルキルポリオキシエチレンエーテルを含む第２試薬とからなることを特徴とするＨＤＬコレステロール定量用試薬キットに関するものである。
【００１０】
本発明の試薬キットにおける、コレステロールに作用する酵素としては、コレステロールエステラーゼ（ＣＥ）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯ）などが例示される。リポ蛋白分画中には、コレステロールの他にコレステロールエステルも含まれているので、通常、コレステロールエステルを加水分解させてコレステロールに変換させるために、コレステロールエステラーゼ（ＣＥ）をコレステロールオキシダーゼ（ＣＯ）と共存させる。
【００１１】
本発明の試薬キットにおける第１試薬中の酵素は、例えばＣＥの場合には、１単位／ｍｌ〜１００単位／ｍｌ、好ましくは１単位／ｍｌ〜５０単位／ｍｌ、ＣＯの場合には、０．５単位／ｍｌ〜１００単位／ｍｌ、好ましくは１単位／ｍｌ〜５０単位／ｍｌとなるように配合するが、試料の種類などに応じて適宜決定される。
【００１２】
ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画であるＬＤＬ、ＶＬＤＬ、カイロミクロンなどに含まれるコレステロールに対して、上記酵素を優先的に作用させる界面活性剤アシルポリオキシエチレンソルビタンエステルは、通常Ｃ_ｎソルビタンＥ_ｘと略記される、親水性部分にポリオキシエチレンを持つ非イオン性界面活性剤であり、本発明の目的に適合するものであれば全て用いることができる。具体的な商品名としては、Ｔｗｅｅｎ２１（Ｃ_１２ソルビタンＥ_４）、Ｔｗｅｅｎ８１（Ｃ_１２ソルビタンＥ_５）、Ｔｗｅｅｎ２０（Ｃ_１２ソルビタンＥ_２０）、Ｔｗｅｅｎ４０（Ｃ_１６ソルビタンＥ_２０）、Ｔｗｅｅｎ６０（Ｃ_１８ソルビタンＥ_２０）、Ｔｗｅｅｎ８０（Ｃ_１８：１ソルビタンＥ_２０）、Ｅｍａｓｏｌ４１３０（Ｃ_１８ソルビタンＥ_ｘ）、Ｔｗｅｅｎ８５（Ｃ_１７：１ソルビタンＥ_２０）などが例示される。
【００１３】
本発明の試薬キットにおける第１試薬中の界面活性剤アシルポリオキシエチレンソルビタンエステルは、通常、反応液中において０．００１ｗ／ｖ％〜０．１ｗ／ｖ％、好ましくは０．００１ｗ／ｖ％〜０．０５ｗ／ｖ％となるように配合されるが、試料の種類などに応じて適宜決定される。
【００１４】
ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画中のコレステロールに対する上記酵素の作用を抑制させる界面活性剤アルキルポリオキシエチレンエーテルは、通常Ｃ_ｎＥ_ｘと略記される、親水性部分にポリオキシエチレンを持つ非イオン性界面活性剤であり、本発明の目的に適合するものであれば全て用いることができる。具体的な商品名としては、ＡｔｌａｓＧ２１２７（Ｃ_１２Ｅ_８）、Ｂｒｉｊ３６Ｔ（Ｃ_１２Ｅ_１０）、Ｎｏｐａｌｃａｌ６−Ｌ（Ｃ_１２Ｅ_１４）、Ｂｒｉｊ３５（Ｃ_１２Ｅ_２３）、ＥｍｕｌｏｇｐｈｅｎｅＢＣ７２０（Ｃ_１２Ｅ_９．８）、ＳｔｅｒｏｘＡＪ１００（Ｃ_１３Ｅ_９．５）、Ｂｒｉｊ５６（Ｃ_１６Ｅ_１０）、Ｂｒｉｊ５８（Ｃ_１６Ｅ_２０）、Ｂｒｉｊ７６（Ｃ_１８Ｅ_１０）、Ｂｒｉｊ９６（Ｃ_１８：１Ｅ_１０）、Ｂｒｉｊ７８（Ｃ_１８Ｅ_２０）、Ｂｒｉｊ９８（Ｃ_１８：１Ｅ_２９）などが例示される。
【００１５】
本発明の試薬キットにおける第２試薬中の界面活性剤アルキルポリオキシエチレンエーテルは、通常、反応液中において０．００１ｗ／ｖ％〜５ｗ／ｖ％、好ましくは０．０５ｗ／ｖ％〜２ｗ／ｖ％となり、また第１試薬中に配合される界面活性剤アシルポリオキシエチレンソルビタンエステルよりも高濃度となるように配合されるが、試料の種類などに応じて適宜決定される。
【００１６】
本発明の定量方法では、まずコレステロールに作用する酵素と、上記界面活性剤アシルポリオキシエチレンソルビタンエステルと、試料とを混合させる。すると、界面活性剤アシルポリオキシエチレンソルビタンエステルの存在により、反応液中に含まれる酵素が、ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画中のコレステロールに優先的に作用する。
【００１７】
酵素がＣＥとＣＯとの組合せからなる場合には、酵素の作用によりコレステロールの反応生成物として過酸化水素が生成する。本発明の定量方法においては、第２試薬中の界面活性剤アルキルポリオキシエチレンエーテルを反応系に混在させる前に、生成した反応生成物を反応系外に導く必要があり、例えば色原体が用いられる。色原体は、ニトロ基、アゾ基、カルボニル基、エチレン結合、シアン基などの発色団を含み、水酸基、アミノ基などの助色団を含まない有機化合物である。本発明において用いられ得る色原体としては、単独では発色能力が弱いが、上記助色団を含む有機化合物が共存することにより、発色能力が増強されるものが好ましい。反応生成物が過酸化水素である場合には、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の存在下で、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム塩（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）などの色原体と過酸化水素とを反応させて、無色の複合体を形成させ、過酸化水素を反応系外に導くことができる。
【００１８】
通常、ＰＯＤは、０．０１Ｕ／ｍｌ〜１０Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．５Ｕ／ｍｌ〜５Ｕ／ｍｌ、色原体の濃度は、０．００１ｗ／ｖ％〜１ｗ／ｖ％、好ましくは０．０１ｗ／ｖ％〜０．５ｗ／ｖ％とするが、試料の種類などに応じて適宜決定される。
【００１９】
次に、反応液中に、第２試薬中の界面活性剤アルキルポリオキシエチレンエーテルを混在させることによって、ＨＤＬ以外のリポ蛋白分画中の残存するコレステロールに対して、酵素の作用が抑制されるとともに、酵素がＨＤＬコレステロールに対して作用し、酵素の作用によりコレステロールの反応が進行する。
【００２０】
酵素がＣＥとＣＯとの組合せからなる場合には、この反応により過酸化水素が生成される。この過酸化水素は、ＰＯＤの存在下で、例えば４−アミノアンチピリンなどの助色団を含む有機化合物（０．００１ｗ／ｖ％〜０．１ｗ／ｖ％、好ましくは０．００１ｗ／ｖ％〜０．０５ｗ／ｖ％）と、色原体とを縮合反応させ、キノン色素を生成させる。なお、色原体としては、上述のＨＤＡＯＳ、ＴＯＯＳなどを挙げることができる。このキノン色素を比色測定することによって、ＨＤＬコレステロールが測定できる。比色測定は既知の方法により行うことができ、例えば自動分析装置を用いて行うことができる。
【００２１】
本発明方法における各反応、即ち第２試薬を反応系に混在させる前または混在させた後の各反応は、それぞれ通常、室温下で、１分間〜１０分間、好ましくは３分間〜７分間行なわれるが、特にこの条件に限定されるものではない。
【００２２】
本発明のＨＤＬコレステロール定量用試薬キットは、前述の界面活性剤アシルポリオキシエチレンソルビタンエステル及び酵素を含む第１試薬と、界面活性剤アルキルポリオキシエチレンエーテルを含む第２試薬とからなる。
【００２３】
第１試薬中の酵素には、例えばＣＥ、ＣＯなどを挙げることができる。また第１試薬中には、酵素の他に、通常例えば、酵素ＰＯＤ、さらにＨＤＡＯＳ、ＴＯＯＳなどの色原体が配合され得るが、これらの色原体と反応してキノン色素を生成するもの、例えば４−アミノアンチピリンなどは配合されない。
【００２４】
これに対して、第２試薬中には、当該界面活性剤の他に、通常、色原体と反応してキノン色素を生成するもの、例えば４−アミノアンチピリンなどが配合される。
【００２５】
なお、本発明の試薬キットは、遅くともＨＤＬコレステロールの定量測定時において、このように第１及び第２の二種類の試薬に分かれていれば良い。従って、一般に試薬キットとしての形態は、安定性などを考慮して三種類以上の試薬に分けておき、測定のため使用時において上記の第１及び第２の二種類の試薬に調製するようなものでも良い。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２７】
〔実施例１〕
界面活性剤アシルポリオキシエチレンソルビタンエステルとして商品名がＴｗｅｅｎ８５、また界面活性剤アルキルポリオキシエチレンエーテルとして商品名がＢｒｉｊ９８の界面活性剤をそれぞれ使用して、次の第１及び第２試薬を準備した。
【００２８】
〈第１試薬〉
１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１２ｍｇ／ｍｌのＨＤＡＯＳ、０．６単位／ｍｌのＰＯＤ、１０単位／ｍｌのＣＯ、１０単位／ｍｌのＣＥ、０．０１ｗ／ｖ％のＴｗｅｅｎ８５
【００２９】
〈第２試薬〉
１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１５ｍｇ／ｍｌの４−アミノアンチピリン、１．５ｗ／ｖ％のＢｒｉｊ９８
【００３０】
日立７１７０型自動分析装置を用いて、試料４μｌに第１試薬２５０μｌを加え、５分後に第２試薬５０μｌを加え、５分後に波長６００ｎｍ／７００ｎｍで測定した。試料としてＨＤＬコレステロール濃度が１５０ｍｇ／ｄｌの血清を１０段階に希釈したものを用いたところ、表１に示すように、良好な直線性が得られた。
【００３１】
【表１】

【００３２】
この実施例においては、第１試薬を添加した後に、遠心分離などの煩雑な操作を必要とせず、試料中に第２試薬を添加するだけで、試料中のＨＤＬコレステロールの量に対応して生成されたキノン色素の比色測定が行なわれる。
【００３３】
〔実施例２〕
実施例１と同様の試薬を用いて、同様に日立７１７０型自動分析装置で２０例のヒト血清を試料として測定し、標準液の測定からＨＤＬコレステロール値を求めた。そして同じ試料について市販製品〔商品名：ＨＤＬ−コレス（ＰＧ）、国際試薬社製〕を用いて測定した値と比較した。その結果、表２に示すように、良好な相関性が得られた。
【００３４】
【表２】

【００３５】
【発明の効果】
本発明のＨＤＬコレステロールの定量方法によれば、従来、沈殿分画法において必要とされていた遠心分離の操作が不要となるので、操作が簡略化され、多数の試料を短時間で、かつ容易に処理できる。しかも２種類の試薬を用いる方法に応用できるので、汎用型の自動分析装置を用いた連続的な測定が可能となり、ＨＤＬコレステロールを他の検査項目とマルチチャンネル化して測定することができる。また、試料を取り扱う上で、試料に直接手を触れる機会が著しく減少するので、ウイルス感染の危険性も減少する。さらに、微量の試料に対しても測定可能であるので、小児や老人など採血量に制限がある場合でも測定が可能となる。従って、本発明方法は、臨床検査の分野において極めて有用であり、臨床検査の日常業務における作業効率の向上に貢献することができる。
【００３６】
また、本発明のＨＤＬコレステロール定量用試薬キットは、本発明方法を実施するための試薬キットとしての効果を奏する。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a method for quantifying cholesterol in a high-density lipoprotein (HDL) fraction (hereinafter also referred to as “HDL cholesterol”) and a reagent kit for quantification, and particularly in the field of clinical examination, in a biological sample such as serum. The present invention relates to a method for quantifying HDL cholesterol and a reagent kit for quantifying HDL cholesterol.
[0002]
[Prior art]
Lipoproteins in the blood have a specific gravity of chylomicron (specific gravity <1.006), very low density lipoprotein (VLDL, specific gravity 1.006 to 1.019), low specific gravity lipoprotein (LDL, specific gravity 1.019 to 1.063) and high specific gravity lipoprotein (HDL, specific gravity 1.063 to 1.21), etc., and research on diseases affecting the metabolism of these lipoproteins has been advanced. Among them, HDL has been rapidly studied since the 1977 Framingham report that cholesterol, which is a component in the fraction, is closely related to ischemic heart disease.
[0003]
Conventionally, HDL cholesterol has been quantified by a known method of cholesterol content of HDL fractions separated by precipitation fractionation, ultracentrifugation, electrophoresis, or the like. For measurement in clinical tests, precipitation fractionation is often performed. In this method, a lipoprotein fraction other than HDL is precipitated using a precipitant, and centrifuged to obtain an HDL fraction. As a precipitant at this time, a combination of a polyanion and a divalent cation is often used. Such polyanions include polyethylene glycol, phosphotungstic acid, dextran sulfate and the like, and Mg, Mn, Ca, Li, Ni and the like are known as divalent cations.
[0004]
Next, as a known method for quantifying cholesterol in the HDL fraction obtained by centrifugation, measurement by enzyme reaction is often used. In particular, a method of measuring absorbance in the visible region using cholesterol esterase (CE) and cholesterol oxidase (CO) and further combining peroxidase (POD) and chromogen is well known.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
However, in order to separate the HDL fraction by the conventional method using a precipitant, it is necessary to perform a centrifugal operation. Therefore, when an automated analyzer is used for efficiency in daily clinical work. Has a restriction that it cannot be used directly. Therefore, it has been difficult to measure HDL cholesterol by making it multichannel with other test items.
[0006]
An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems and to provide a useful method that can be measured using an automatic analyzer in clinical examinations, and a reagent kit therefor, particularly for the purpose of efficiently measuring HDL cholesterol. To do.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
As a result of earnest research, the present inventors have found that a surfactant that preferentially acts an enzyme on cholesterol in a lipoprotein fraction other than HDL and an action by the enzyme on cholesrelol in a lipoprotein fraction other than HDL. It was found that cholesterol in the HDL fraction can be measured by using a surfactant to be suppressed. As a result of further research, the inventors have found that the above-described object is achieved, and have completed the present invention.
[0008]
That is, the present invention introduces a reaction product obtained by preferentially causing an enzyme to act on cholesterol in a lipoprotein fraction other than HDL by using a surfactant acyl polyoxyethylene sorbitan ester, HDL cholesterol characterized in that the surfactant alkylpolyoxyethylene ether suppresses the action of enzymes on residual cholesterol in lipoprotein fractions other than HDL and causes the reaction to proceed by causing the enzymes to act on HDL cholesterol. It relates to a method for quantitative determination.
[0009]
The present invention also comprises a reagent for quantifying HDL cholesterol, comprising a first reagent containing a surfactant acyl polyoxyethylene sorbitan ester and an enzyme, and a second reagent containing a surfactant alkyl polyoxyethylene ether. It relates to the kit.
[0010]
Examples of the enzyme that acts on cholesterol in the reagent kit of the present invention include cholesterol esterase (CE) and cholesterol oxidase (CO). Since the lipoprotein fraction contains cholesterol ester in addition to cholesterol, it usually coexists with cholesterol oxidase (CE) in order to hydrolyze the cholesterol ester and convert it to cholesterol. Let
[0011]
The enzyme in the first reagent in the reagent kit of the present invention is, for example, 1 unit / ml to 100 units / ml, preferably 1 unit / ml to 50 units / ml in the case of CE, and 0 in the case of CO. .5 unit / ml to 100 unit / ml, preferably 1 unit / ml to 50 unit / ml, but appropriately determined depending on the type of sample.
[0012]
LDL is a lipoprotein fractions other than HDL, VLDL, against cholesterol contained in such chylomicrons, surfactants acyl polyoxyethylene sorbitan esters exerting the enzyme is preferentially a normal C _n sorbitan E _x Any nonionic surfactant which is abbreviated and has polyoxyethylene in the hydrophilic portion and can be used as long as it meets the object of the present invention. Specific product names include Tween 21 (C ₁₂ sorbitan E ₄ ), Tween 81 (C ₁₂ sorbitan E ₅ ), Tween 20 (C ₁₂ sorbitan E ₂₀ ), Tween 40 (C ₁₆ sorbitan E ₂₀ ), Tween 60. (C ₁₈ sorbitan E ₂₀ ), Tween 80 (C _{18: 1} sorbitan E ₂₀ ), Emasol 4130 (C ₁₈ sorbitan E _x ), Tween 85 (C _{17: 1} sorbitan E ₂₀ ) and the like are exemplified.
[0013]
The surfactant acyl polyoxyethylene sorbitan ester in the first reagent in the reagent kit of the present invention is usually 0.001 w / v% to 0.1 w / v%, preferably 0.001 w / v% in the reaction solution. Although it mix | blends so that it may become -0.05w / v%, it determines suitably according to the kind etc. of a sample.
[0014]
Surfactant alkylpolyoxyethylene ether that suppresses the action of the above enzyme on cholesterol in lipoprotein fractions other than HDL is usually abbreviated as C _n E _x, and is nonionic having polyoxyethylene in the hydrophilic part. Any surfactant can be used as long as it is suitable for the purpose of the present invention. Specific trade _{_{_{names, Atlas G2127 (C 12 E 8}}} ), Brij36T (C 12 E 10), Nopalcal6-L (C 12 E 14), Brij35 (C 12 E 23), Emulogphene BC720 (C 12 E 9 _{_{_{.8), SteroxAJ100 (C 13 E}}} 9.5), Brij56 (C 16 E 10), Brij58 (C 16 E 20), Brij76 (C 18 E 10), Brij96 (C 18: 1 E 10), Brij78 ( C ₁₈ E ₂₀ ), Brij98 (C _{18: 1} E ₂₉ ) and the like are exemplified.
[0015]
The surfactant alkylpolyoxyethylene ether in the second reagent in the reagent kit of the present invention is usually 0.001 w / v% to 5 w / v%, preferably 0.05 w / v% to 2 w /% in the reaction solution. Although it is blended so as to be higher in concentration than the surfactant acylpolyoxyethylene sorbitan ester blended in the first reagent, it is appropriately determined according to the type of the sample.
[0016]
In the quantitative method of the present invention, an enzyme that acts on cholesterol, the surfactant acylpolyoxyethylene sorbitan ester, and a sample are first mixed. Then, due to the presence of the surfactant acyl polyoxyethylene sorbitan ester, the enzyme contained in the reaction solution acts preferentially on cholesterol in the lipoprotein fraction other than HDL.
[0017]
When the enzyme is a combination of CE and CO, hydrogen peroxide is generated as a reaction product of cholesterol by the action of the enzyme. In the quantification method of the present invention, before the surfactant alkylpolyoxyethylene ether in the second reagent is mixed in the reaction system, the generated reaction product must be led out of the reaction system. Used. A chromogen is an organic compound containing a chromophore such as a nitro group, an azo group, a carbonyl group, an ethylene bond, or a cyan group, and no auxiliary color group such as a hydroxyl group or an amino group. The chromogen that can be used in the present invention is weak in color development ability alone, but preferably has a color development ability enhanced by the coexistence of the organic compound containing the auxiliary color group. When the reaction product is hydrogen peroxide, N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline sodium salt (HDAOS), N-ethyl in the presence of peroxidase (POD) A chromogen such as-(2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-toluidine (TOOS) is reacted with hydrogen peroxide to form a colorless complex, and hydrogen peroxide is led out of the reaction system. be able to.
[0018]
Usually, POD is 0.01 U / ml to 10 U / ml, preferably 0.5 U / ml to 5 U / ml, and the concentration of chromogen is 0.001 w / v% to 1 w / v%, preferably 0.00. Although it is set to 01 w / v% to 0.5 w / v%, it is appropriately determined according to the type of the sample.
[0019]
Next, when the surfactant alkylpolyoxyethylene ether in the second reagent is mixed in the reaction solution, the action of the enzyme is suppressed on the remaining cholesterol in the lipoprotein fraction other than HDL. At the same time, the enzyme acts on HDL cholesterol, and the reaction of cholesterol proceeds by the action of the enzyme.
[0020]
When the enzyme is a combination of CE and CO, hydrogen peroxide is generated by this reaction. This hydrogen peroxide is an organic compound containing an auxiliary color group such as 4-aminoantipyrine in the presence of POD (0.001 w / v% to 0.1 w / v%, preferably 0.001 w / v% to 0.05 w / v%) and a chromogen are subjected to a condensation reaction to produce a quinone dye. Examples of the chromogen include the above-described HDAOS and TOOS. HDL cholesterol can be measured by colorimetric measurement of this quinone dye. The colorimetric measurement can be performed by a known method, for example, using an automatic analyzer.
[0021]
Each reaction in the method of the present invention, ie, each reaction before or after mixing the second reagent in the reaction system, is usually performed at room temperature for 1 minute to 10 minutes, preferably 3 minutes to 7 minutes. However, it is not particularly limited to this condition.
[0022]
The reagent kit for quantifying HDL cholesterol of the present invention comprises a first reagent containing the aforementioned surfactant acylpolyoxyethylene sorbitan ester and an enzyme, and a second reagent containing the surfactant alkylpolyoxyethylene ether.
[0023]
Examples of the enzyme in the first reagent include CE and CO. In the first reagent, in addition to the enzyme, chromogens such as the enzyme POD, HDAOS, TOOS, etc. can be usually mixed, but those that react with these chromogens to produce quinone dyes, For example, 4-aminoantipyrine is not blended.
[0024]
On the other hand, in the second reagent, in addition to the surfactant, a substance that reacts with the chromogen to produce a quinone dye, such as 4-aminoantipyrine, is usually blended.
[0025]
Note that the reagent kit of the present invention may be divided into the first and second types of reagents in this way at the time of quantitative measurement of HDL cholesterol at the latest. Therefore, in general, the reagent kit is divided into three or more kinds of reagents in consideration of stability and the like, and the first and second kinds of reagents are prepared at the time of use for measurement. Things can be used.
[0026]
【Example】
Hereinafter, examples will be given to describe the present invention in more detail, but the present invention is not limited thereto.
[0027]
[Example 1]
The following first and second reagents were prepared by using a surfactant having a trade name of Tween 85 as a surfactant acylpolyoxyethylene sorbitan ester and a surfactant having a trade name of Brij 98 as a surfactant alkylpolyoxyethylene ether, respectively. .
[0028]
<First reagent>
10 mM phosphate buffer (pH 7.0), 0.12 mg / ml HDAOS, 0.6 units / ml POD, 10 units / ml CO, 10 units / ml CE, 0.01 w / v% Tween85
[0029]
<Second reagent>
10 mM phosphate buffer (pH 7.0), 0.15 mg / ml 4-aminoantipyrine, 1.5 w / v% Brij98
[0030]
Using a Hitachi 7170 type automatic analyzer, 250 μl of the first reagent was added to 4 μl of the sample, 50 μl of the second reagent was added after 5 minutes, and measurement was performed at a wavelength of 600 nm / 700 nm after 5 minutes. When a sample having a HDL cholesterol concentration of 150 mg / dl diluted in 10 stages was used as a sample, good linearity was obtained as shown in Table 1.
[0031]
[Table 1]

[0032]
In this example, after adding the first reagent, no complicated operation such as centrifugation is required, and only the second reagent is added to the sample, so that it is generated corresponding to the amount of HDL cholesterol in the sample. A colorimetric measurement of the resulting quinone dye is performed.
[0033]
[Example 2]
Using the same reagents as in Example 1, 20 human sera were similarly measured using Hitachi 7170 automatic analyzer as a sample, and HDL cholesterol level was determined from the measurement of the standard solution. And it compared with the value measured using the commercial product [brand name: HDL-colles (PG), the international reagent company make] about the same sample. As a result, as shown in Table 2, a good correlation was obtained.
[0034]
[Table 2]

[0035]
【The invention's effect】
According to the method for quantifying HDL cholesterol of the present invention, the operation of centrifugation conventionally required in the precipitation fractionation method is not required, so that the operation is simplified and a large number of samples can be prepared in a short time and easily. Can be processed. In addition, since it can be applied to a method using two types of reagents, continuous measurement using a general-purpose automatic analyzer is possible, and HDL cholesterol can be measured in a multichannel manner with other test items. In addition, the risk of virus infection is also reduced because the opportunity to touch the sample directly when handling the sample is significantly reduced. Furthermore, since measurement is possible even for a very small amount of sample, measurement is possible even when the blood collection volume is limited, such as children and the elderly. Therefore, the method of the present invention is extremely useful in the field of clinical examination, and can contribute to the improvement of work efficiency in daily work of clinical examination.
[0036]
In addition, the reagent kit for quantifying HDL cholesterol of the present invention is effective as a reagent kit for carrying out the method of the present invention.

Claims

When measuring cholesterol in a specific lipoprotein fraction, after selecting a nonionic surfactant and erasing other lipoprotein fractions, a nonionic surfactant different from the nonionic surfactant is added. A method for measuring cholesterol in a specific lipoprotein fraction.

The method according to claim 1, wherein the other lipoprotein fraction is a lipoprotein fraction other than the high-density lipoprotein, and the selected nonionic surfactant is an acyl polyoxyethylene sorbitan ester.

The method according to claim 1 or 2, wherein the specific lipoprotein fraction is a high-density lipoprotein fraction and the different nonionic surfactant is an alkyl polyoxyethylene ether.

The cholesterol measuring kit containing the reagent used for the measuring method of any one of Claims 1-3.