JP3603966B2 - Nucleic acid - Google Patents

Description

【０００７】
〔式中Ｘ'は抗体可変部位をコードする塩基配列を含有する核酸、Ｙは線状ファージコートタンパク質III又はVIIIをコードする塩基配列を含有し、かつその最後に終止コドンが存在する核酸、ＺはプロテインＡ、プロテインＧ若しくはこれらのＦｃ結合ドメインをコードする塩基配列を含有する核酸、ｍは１又は０であり、ｍが１のとき一般式（化１）の核酸は抗体可変部位と線状ファージコートタンパク質III又はVIIIとを含有する融合ポリペプチドをコードし、ｍが０のとき一般式（化１）の核酸は抗体可変部位とプロテインＡ、プロテインＧ若しくはこれらのＦｃ結合ドメインとを含有する融合ポリペプチドをコードしている〕
【０００８】
本発明者らは式（化１）で表される遺伝子を創製し、該遺伝子に抗体可変部位をコードする遺伝子を組込み、該抗体可変部位をファージ表面発現能を有するポリペプチドとの融合タンパク質の形でファージ表面に発現させれば、該ファージ提示抗体のアフィニティーが簡便に測定でき、高アフィニティー抗体可変部位の選抜が効率よく行えること、また、該抗体可変部位をＦｃ結合能を有するポリペプチドとの融合タンパク質の形で発現させれば、該タンパク質は、Ｆｃを含有する分子と複合体を形成し、該複合体は多価の抗体価を示すこと、極めて安定であること等より、高アビディティーな人工抗体として免疫学的使用に有用であることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
本発明の遺伝子は抗体可変部位をコードする遺伝子の組込部位を含有する遺伝子（以下、Ｘ遺伝子と称す）の下流に、ファージ表面発現能を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有する遺伝子（以下、Ｙ遺伝子と称す）、更に下流にＦｃ結合能を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有する遺伝子（以下、Ｚ遺伝子と称す）が並んで構成される。ここでいう抗体可変部位とは天然、あるいは人工のあらゆる抗体可変部位、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖをいうが、後述の方法でアフィニティー能を測定する場合はＦｖを選択するのが好ましい。
【００１０】
またファージ表面発現能を有するポリペプチドとしては線状ファージコートタンパク質ＩＩＩ （以下、ｃｐＩＩＩ と略す）や同ＶＩＩＩ（以下、ｃｐＶＩＩＩと略す）あるいはそれぞれの一部などが挙げられるが、抗体可変部位と融合ポリペプチドの形で発現され、ファージ粒子の表面に抗体可変部位が提示されるものであれば特に限定されない。更にＦｃ結合能を有するポリペプチドとは、例えばプロテインＡ、プロテインＧがあり、これらのＦｃ結合ドメイン、あるいはＦｃ結合ドメイン様構造体を用いても良い。Ｆｃ結合ドメイン、あるいはＦｃ結合ドメイン様構造体を用いる場合、ドメイン数は通常１〜５の範囲で選択される。これらの遺伝子の配列に関してはＸ遺伝子に組込まれた抗体可変部位の読取り枠に続く形で、Ｙ遺伝子がコードするポリペプチドの読取り枠がつながり、Ｙ遺伝子がコードしているポリペプチドの最後に終止コドンが存在する。またＸ遺伝子とＹ遺伝子の境界には制限酵素サイトが存在し、またＹ遺伝子とＺ遺伝子との境界にも制限酵素サイトが存在する。この２つの制限酵素サイトは、同じ制限酵素サイトであっても良いし、違う制限酵素サイトでも良いが、切断後生じる末端、すなわちＸ遺伝子末端とＺ遺伝子末端が接続可能であれば良い。更にＺ遺伝子は、Ｘ遺伝子に組込まれた抗体可変部位の読取り枠に続く形で、Ｚ遺伝子がコードするポリペプチドの読取り枠がつながり、Ｚ遺伝子がコードするポリペプチドの最後に終止コドンが存在するようにつながっている。
【００１１】
本発明の遺伝子はベクターに組込まれて使用される。本発明で使用されるベクターとしては、例えばファージミドベクターを基本骨格として、プロモーターの下流にＸ−Ｙ−Ｚ遺伝子が組込まれたベクター、ファージミドベクターを基本骨格としてプロモーターの下流にＸ−Ｙ遺伝子が組込まれたベクター、ファージミドベクターを基本骨格として、プロモーターの下流にＸ−Ｚ遺伝子が組込まれたベクターがあり、これらを組合せて使用することができる。
【００１２】
前述の様にＸ遺伝子は、天然、又は人工の抗体可変部位をコードする遺伝子を組込むことができる。抗体可変部位をコードする遺伝子が組込まれたＸ遺伝子を以下Ｘ′遺伝子と称する。同様に、抗体可変部位をコードする遺伝子が組込まれたＸ−Ｙ−Ｚ遺伝子、Ｘ−Ｙ遺伝子、Ｘ−Ｚ遺伝子をそれぞれＸ′−Ｙ−Ｚ遺伝子、Ｘ′−Ｙ遺伝子、Ｘ′─Ｚ遺伝子と称する、なお、本明細書において抗体可変部位とは抗体の可変部位を分子中に含有するポリペプチドを意味する。
【００１３】
抗体可変部位をコードする遺伝子、例えばＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖをコードする遺伝子が組込まれたＸ′−Ｙ−Ｚ遺伝子を含有するファージミドベクターを保持する大腸菌にヘルパーファージを感染させると線状ファージが形成される。この時、ベクター上のＸ′−Ｙ遺伝子より、抗体可変部位がつながったファージコートタンパク質が発現し、ファージ表面に組込まれる。すなわち、この線状ファージ表面に、Ｘ′−Ｙ遺伝子にコードされた抗体可変部位を含むポリペプチドが提示されることになる。目的とする抗原結合能を有する抗体可変部位を提示したファージ粒子は、目的とする抗原を固定化した担体によるアフィニティースクリーニングで容易に選択することができる。この時、抗体可変部位を含むポリペプチドがＦｖフラグメントの形であれば、ファージ粒子を界面活性剤Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム（以下、サルコシルと略する）を含む溶液で洗浄することにより、ファージの感染性を損うことなしに、ＦｖフラグメントのＶ_Ｈ ドメインとＶ_Ｌ ドメインを解離することができる。すなわち、この洗浄の条件によって、ファージ表面上で提示されている抗原結合能を持ったＦｖフラグメントの数を調整することができる。
このことにより、ファージ表面に存在する抗体の価数を調整でき、同価数でアフィニティーの高い抗体分子を提示しているファージ粒子を選抜することができる。この洗浄の条件は、例えば、表面プラズモン共鳴を利用したＢＩＡコアシステム（ファルマシア社）を利用して、抗原を固定化したセンサーチップに、様々な処理をしたファージ液を投入することにより決定することができる。
【００１４】
得られたファージ粒子を再度大腸菌に感染させることにより、目的抗体分子をコードする遺伝子を含むプラスミドを回収することができる。回収されたプラスミドは、制限酵素消化をしてＹ遺伝子を遊離させ、セルフライゲーションさせることによりＸ′−Ｚ遺伝子によりコードされる融合ポリペプチドを発現する形に変換できる。
変換されたプラスミドベクターを大腸菌に導入して培養することにより、Ｘ′−Ｚ遺伝子によりコードされる融合ポリペプチドを大量に生産することができる。このポリペプチドは、Ｆｃ結合能を持つことより、例えばＩｇＧを結合した樹脂を用いることにより容易に精製できる。又は、抗原を固定化した樹脂を用いても良い。
【００１５】
この様にして得られた抗体可変部位とＦｃ結合能を有するポリペプチドが融合したポリペプチドを、Ｆｃを含有する分子、例えばヒトＩｇＧと混合することにより、複合体が形成される。例えばＦｃ結合能を有するポリペプチドが、配列表の配列番号２で表される遺伝子がコードするプロテインＡ由来のＦｃ結合ドメイン様の５８アミノ酸残基からなるＦｃ結合能を持つドメイン構造を含むポリペプチド（配列表の配列番号４）の場合、１つのＦｃを含有する分子に対し、２ヵ所で結合することができる〔ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） 、第７８巻、第４７１〜４９０頁（１９７７）、モレキュラー イムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ） 、第１７巻、第１５６３〜１５７３頁（１９８０）、ジ エンボ ジャーナル（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ） 、第４巻、第１０７５〜１０８０頁（１９８５）、プロテイン エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、第１巻、第２号、第１０２〜１１３頁（１９８７）〕。したがって、該Ｆｃ結合ドメインを含有する融合ポリペプチドは、例えばＩｇＧ１分子に対して２分子の融合ポリペプチドが付加した複合体を形成する。すなわち２価の抗体価を持つ分子を創製することができる。得られた複合体は、２価であるために抗体としてのアビディティーが高く、Ｆｃフラグメントを含むために抗Ｆｃフラグメント抗体を用いることで容易に検出でき、広くＥＬＩＳＡ等にも適用できる。
【００１６】
更に、Ｆｃ結合能を有するポリペプチドの数を倍加させると、更に安定な抗体価数の高い複合体が形成される。すなわち、例えば配列表の配列番号３で表される遺伝子がコードするプロテインＡのＦｃ結合ドメイン様構造２個を含むポリペプチドを含有する融合ポリペプチドは、例えばヒトＩｇＧと、巨大分子を形成することなく、意外にもＩｇＧ２分子と融合ポリペプチド３分子の安定な複合体を形成する。この複合体は極めて安定であり、かつ３価の高い抗体価を有し、かつ抗Ｆｃフラグメント抗体で検出でき、該複合体もＥＬＩＳＡ等の適用に極めて有用な人工抗体である。
【００１７】
以上述べてきたような機能を持つ、本発明の遺伝子を含むベクターの例として、本発明者らが作製したプラスミドｐＭ１３Ｆｖがある。
【００１８】
プラスミドｐＭ１３Ｆｖの遺伝子配列に関する概略図を図１に示す。
図１中で本発明の遺伝子は、Ｘ遺伝子に相当する部分は ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ間であり、Ｙ遺伝子はＳａｌＩ−ＳａｌＩ間、Ｚ遺伝子はＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ間に相当する。このＸ−Ｙ−Ｚに相当する ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩサイト間の遺伝子配列も配列表の配列番号５に示す。
【００１９】
プラスミドｐＭ１３Ｆｖは、一般的なファージミドベクターであるプラスミドｐＴＺ１９Ｒ（ファルマシア社）の ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩサイト間に本発明の遺伝子Ｘ−Ｙ−Ｚが挿入されている。ベクター由来プロモーターの下流にあるＸ遺伝子は、まず、ＳＤ配列（シャイン−ダルガルノの配列）に続いて１つ目の読取り枠があり、分泌シグナルペプチドとＶ_Ｈ フラグメント様ポリペプチドの融合ポリペプチドがコードされている。
更に、その下流に再度ＳＤ配列があり、分泌シグナルペプチドＶ_Ｌ フラグメント様ポリペプチドがコードされている２つ目の読取り枠が続く。Ｖ_Ｌ 遺伝子の３′末端部分に制限酵素ＳａｌＩサイトが存在し（配列番号５の塩基番号８９１−８９６）、Ｖ_Ｌ 遺伝子の読取り枠に続く形で、ΔｃｐＩＩＩ ポリペプチドをコードする遺伝子（配列番号１）を含有するＹ遺伝子がつながっている。
すなわち、２つ目の読取り枠は、分泌シグナルペプチド、Ｖ_Ｌ フラグメント様ポリペプチド、ΔｃｐＩＩＩ ポリペプチドの融合ポリペプチドをコードする。Ｙ遺伝子は、Ｙ遺伝子がコードするΔｃｐＩＩＩ ポリペプチド遺伝子の更に下流にある制限酵素ＳａｌＩサイト（配列番号５の塩基番号１５５５−１５６０）でＺ遺伝子とつながっている。Ｚ遺伝子は、プロテインＡのＦｃ結合ドメイン様構造２個を含むポリペプチドをコードする遺伝子（配列番号３）を含有する遺伝子である。
【００２０】
このような構造のｐＭ１３Ｆｖは制限酵素ＳａｌＩで完全消化するとＹ遺伝子が切り出され、Ｙ遺伝子を除いた後にセルフライゲーションさせれば、Ｘ遺伝子とＺ遺伝子はＳａｌＩサイトにて連結される。
この時、Ｚ遺伝子がコードするプロテインＡのＦｃ結合ドメイン様構造２個を含むポリペプチドは、Ｘ遺伝子の２つ目の読取り枠に続く形で連結される。すなわち、プラスミドｐＭ１３Ｆｖを制限酵素ＳａｌＩで消化してＹ遺伝子を除いた後、本発明の遺伝子がコードする２つ目の読取り枠は、分泌シグナルペプチド、Ｖ_Ｌ フラグメント様ポリペプチド、プロテインＡのＦｃ結合ドメイン様構造２個を含むポリペプチドの融合ポリペプチドをコードする。
【００２１】
このプラスミドｐＭ１３Ｆｖにおいて、Ｘ遺伝子に相当する部分には、ニワトリ卵白リゾチーム（以下、ＨＥＬと略す）に対するモノクローナル抗体由来のＦｖ遺伝子が挿入されているため、厳密に言えば本発明でいうＸ′遺伝子であるが、実際には、Ｆｖ遺伝子を容易に置換できるように制限酵素サイトが存在するため、挿入されているＦｖ遺伝子を単なるスペーサー配列と考えればＸ遺伝子とすることができる。すなわち、先に示した配列表の配列番号５で示した塩基配列中塩基番号１１５−１２０に存在するＰｓｔＩサイトと塩基番号４３８−４４４に存在するＢｓｔＥＩＩサイトでプラスミドｐＭ１３Ｆｖを切断して挿入されていたＶ_Ｈ 遺伝子を取り除き、読取り枠が合うように調製した任意のＶ_Ｈ 遺伝子を挿入できる。読取り枠が合うようなＰｓｔＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片は、ＤＮＡ合成機を用いて合成したＤＮＡでも良いし、あるいは、従来から用いられている方法により、ＰｓｔＩサイトあるいはＢｓｔＥＩＩサイトを含むように合成したＶ_Ｈ 遺伝子増幅用プライマーを用いてＰＣＲ法により得たＤＮＡ断片をＰｓｔＩ、ＢｓｔＥＩＩで消化して得たＤＮＡ断片でも良い。同様にしてＶ_Ｌ 遺伝子も配列表の配列番号５で示した塩基配列中塩基番号５８３−５８８に存在するＳａｃＩサイトと塩基番号８９１−８９６に存在するＳａｌＩサイト間でＶ_Ｌ 遺伝子をコードするＤＮＡ断片と置換することができる。ただしこのプラスミドｐＭ１３Ｆｖの場合は、Ｙ遺伝子とＺ遺伝子間にもＳａｌＩサイトがあるために、ＳａｌＩ消化は部分分解をしてベクターを調製する。
【００２２】
このプラスミドｐＭ１３Ｆｖの構築方法を簡単に説明する。ＨＥＬに対するモノクローナル抗体Ｄ１．３由来のＦｖフラグメントをコードするプラスミドｐＳＷ１Ｖ_Ｈ Ｄ１．３Ｖ_Ｋ Ｄ１．３〔ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー、第２ １３巻、第６１７〜６１９頁（１９９０）〕はグレッグ ウインター（Ｇｒｅｇ Ｗｉｎｔｅｒ）博士（ケンブリッジ、ＵＫ）より譲渡を受けた。ただし、譲渡を受けたプラスミドは、文献記載の配列と多少異なっていた。このプラスミドｐＳＷ１Ｖ_Ｈ Ｄ１．３Ｖ_Ｋ Ｄ１．３は、プラスミドｐＵＣ１９の ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ間にＦｖフラグメントをコードする遺伝子が挿入されている。この ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ挿入断片の配列を配列表の配列番号６に示す。
【００２３】
このプラスミドｐＳＷ１Ｖ_Ｈ Ｄ１．３Ｖ_Ｋ Ｄ１．３のＶ_Ｈ 遺伝子を含む ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ断片を、ｐＴＺ１９Ｒ（ファルマシア社）の ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩサイトに挿入してプラスミドＴ１９ＶＨを構築する。また、Ｖ_Ｌ 遺伝子を含むＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＴＺ１８Ｒ（ファルマシア社）のＳｍａＩ、ＥｃｏＲＩサイトに挿入してプラスミドＴ１８ＶＬを構築する。このプラスミドＴ１８ＶＬを鋳型として、配列表の配列番号７で示した制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列とＳａｌＩ認識配列を持つプライマーＶＬ３′ＳａｌＩと、配列表の配列番号８で示したプライマーＵＰＭＣＳを用いてＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅後、 ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ消化をしてＤＮＡ断片を得る。これをプラスミドｐＴＺ１８Ｒの ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩサイトに挿入してプラスミドＴ１８ＶＬＳを得る。このプラスミドＴ１８ＶＬＳの、Ｖ_Ｌ 遺伝子を含むＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩ断片を先に構築したプラスミドＴ１９ＶＨのＳｍａＩ、ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、プラスミドＴ１９ＶＨＶＬＳを得る。次に、プラスミドｐＥＺＺ１８（ファルマシア社）を鋳型として、配列表の配列番号９で示したプライマーＰｒｏＡ５′と、配列番号１０で示したプライマーＰｒｏＡ３′を用いてＰＣＲ法により、プロテインＡのＦｃ結合ドメイン様構造２個を含むポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡを増幅する。このＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＲＩで消化した後、プラスミドｐＴＺ１８ＲのＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩサイトに挿入してプラスミドＴ１８ＰＡを得る。このプラスミドＴ１８ＰＡのプロテインＡのＦｃ結合ドメイン様構造２個を含むポリペプチドをコードする遺伝子を含むＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、プラスミドＴ１９ＶＨＶＬＳのＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、プラスミドｐＦｖ−ＰＰを得る。次にプラスミドＭ１３ｍｐ１８を鋳型として、配列表の配列番号１１で示したプライマーｃｐＩＩＩ ５′−１と配列番号１２で示したプライマーｃｐＩＩＩ ３′を用いてＰＣＲ法により、ｃｐＩＩＩ のＣ末端側ポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡを増幅する。このＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩで消化した後、プラスミドｐＦｖ−ＰＰのＳａｌＩサイトに挿入する。この時、プラスミドｐＦｖ−ＰＰのＶ_Ｌ 遺伝子に続いて、プライマーｃｐＩＩＩ ５′−１由来配列がつながった向きに挿入されたプラスミドがｐＭ１３Ｆｖである。この様にして構築したプラスミドｐＭ１３Ｆｖを導入した大腸菌ＪＭ１０９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＭ１３Ｆｖと命名、表示され工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３６９８として寄託されている。
【００２４】
本発明の遺伝子を用いることにより、以下のことが可能となる。
まず、本発明の遺伝子は、ファージミドベクターに組込まれて使用される。そして本発明のＸ遺伝子に、Ｙ遺伝子がある状態で抗体可変部位をコードする遺伝子を挿入すれば、抗体可変部位をその表面に提示した、いわゆるファージ提示抗体ライブラリーを構築することができる。抗体遺伝子の取得方法としては、従来から用いられている方法に従って、ヒトを含む動物あるいはそれら由来の培養細胞などから得た、抗体のｍＲＮＡを含むＲＮＡを原料として、ｃＤＮＡを合成した後ＰＣＲ法によって天然の抗体可変部位を含む遺伝子を増幅させることができる。これを本発明の遺伝子に抗体可変部位が発現するように組込めば良い。あるいは、合成ＤＮＡを用いて、色々な種類のアミノ酸をコードするように作製した合成的な抗体可変部位をコードする遺伝子を用いてもよい。この場合、抗体可変部位の中でも特にアミノ酸の置換が多く、抗原と直接作用している超可変領域に変異を多く導入すると効果が期待できる。
【００２５】
このように構築した抗体可変部位を提示したファージ提示抗体ライブラリーから目的の抗原結合能を持つ抗体分子を提示しているファージを選択する場合、Ｘ′遺伝子がＦｖフラグメントを発現するように調製された場合非常に有用である。なぜならば、本発明者らは鋭意努力の結果、ファージ表面に発現している抗原結合能を有するＦｖ分子の数を制御する方法を見出したからである。Ｆｖフラグメントがその抗原結合能を示すのは、Ｖ_Ｈ フラグメントとＶ_Ｌ フラグメントが結合してＦｖフラグメントとして存在している場合であり、Ｖ_Ｈ フラグメント、あるいはＶ_Ｌ フラグメント単独ではその結合能は非常に低くなってしまう。
【００２６】
この性質を利用して、ファージ表面に発現しているＦｖフラグメントをＶ_Ｈ フラグメントとＶ_Ｌ フラグメントに解離させることにより、ファージ表面に複数個存在する抗原結合能を有するＦｖ分子の数を１分子程度にすることができる。これは、界面活性剤サルコシルを用いた穏やかな洗浄処理による工程で実施可能であり、かつ該工程はファージ粒子の感染性に何ら影響を与えない。ファージミドベクターを用いてそのファージ粒子に抗体分子を提示させる場合、その抗体分子の個数を制御できない。ファージ表面に２分子以上の抗体分子が存在すると、その抗体分子のアフィニティーが低くても、全体としてのアビディティーが高くなり、抗原を用いたアフィニティースクリーニングの際、あたかも高アフィニティーであるかのようにふるまう。この時、ファージ粒子の感染性を損うことなく、Ｆｖ分子の数を１分子程度に制御できれば、高アフィニティーの抗体分子を提示したファージ粒子を得ることが期待できる。Ｖ_Ｈ フラグメントとＶ_Ｌ フラグメントが共有結合でつながっているｓｃＦｖや、Ｆａｂを提示したファージ提示抗体ライブラリーでは、このような制御をすることは難しい。また、得られたＦｖ分子を提示しているファージ粒子からＦｖフラグメントをコードしている遺伝子を回収し、ｓｃＦｖフラグメントやＦａｂフラグメントに変換することは容易である。すなわち、得られたファージミド粒子を大腸菌に感染させ、プラスミドを回収する。このプラスミドから、目的のＶ_Ｈ 遺伝子とＶ_Ｌ 遺伝子を取り出し、ｓｃＦｖフラグメントや、Ｆａｂフラグメントの形で発現できるように構築したプラスミドに入れ直せば良い。
【００２７】
目的の抗体可変部位を提示したファージ粒子が得られた後、用いた本発明の遺伝子がＸ′−Ｙ−Ｚの場合、実用上有用な形に変換するのは容易である。すなわち、得られたファージミド粒子を大腸菌に感染させて、プラスミドを回収する。その後前述の通り、Ｙ遺伝子を取り除き、Ｘ′−Ｚの形に変換すれば、プラスミドは抗体可変部位を含むポリペプチドとＺ遺伝子がコードするＦｃ結合能を有するポリペプチドとの融合ポリペプチドを発現する形に変換される。
【００２８】
この抗体可変部位を含むポリペプチドと、Ｆｃ結合能を有するポリペプチドの融合ポリペプチドは、非常に有用である。すなわち、まず第１に、精製が容易である。例えば、Ｆｃを含む、ポリペプチドあるいはタンパク質を固定化した樹脂を用いて、培養物から融合ポリペプチドを回収することができる。第２に、この融合ポリペプチドを、Ｆｃを含むポリペプチドあるいはタンパク質、例えばヒトＩｇＧなどと混合することにより、安定な多価の抗体複合体を形成する。多価であるために、抗原との結合安定性は、１価である時よりも高く、ＥＬＩＳＡやウェスタンブロッティング等の使用に用いる場合有用である。また、混合するＦｃを含むポリペプチドの性質により検出も容易となり有用である。このような融合ポリペプチドを作製するための本発明の遺伝子Ｘ′−Ｚの使用の際には、Ｘ′遺伝子がコードする抗体可変部位を含むポリペプチドは、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆａｂフラグメントなどどのようなものも有効である。
【００２９】
また、本発明の遺伝子を用いることにより、ポリクローナル人工抗体を作製することもできる。すなわち、抗体可変部位をコードする遺伝子のライブラリーを作製し、次にＸ遺伝子に組込み、Ｘ′−Ｙ−Ｚ遺伝子ライブラリーを作製する。次に、Ｘ′−Ｙ遺伝子ライブラリーでファージを形質転換し、抗原結合性を有するＸ′−Ｙ遺伝子群を選抜する。次に選抜されたＸ′遺伝子群を有するＸ′−Ｚ遺伝子群を発現させることにより、ポリクローナル人工抗体を作製することができる。該ポリクローナル人工抗体も抗原精製、抗原測定、診断等の分野で有用である。
【００３０】
以上詳細に説明したように、本発明の遺伝子を用いることにより、抗原に対して特異的な抗体分子の中でも特にアフィニティーの高い抗体分子を選択し、更にアビディティーの高い人工抗体を提供することが可能となった。
【００３１】
【実施例】
次に実施例を示すが、これらは本発明を限定するものではない。
【００３２】
実施例１ 発現プラスミドの構築
ＨＥＬに対するモノクローナル抗体Ｄ１．３由来のＦｖフラグメントをコードするプラスミドｐＳＷｌＶ_Ｈ Ｄ１．３Ｖ_Ｋ Ｄ１．３は、グレッグ ウインター博士（ケンブリッジ、ＵＫ）より譲渡を受けた。ただし、譲渡を受けたプラスミドは文献記載の配列と多少異なっていた。このプラスミドｐＳＷｌＶ_Ｈ Ｄ１．３Ｖ_Ｋ Ｄ１．３はｐＵＣ１９の ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ間にＦｖフラグメントをコードする遺伝子が挿入されている。この ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ挿入断片の配列を配列番号６に示す。
【００３３】
（１−１） プラスミドｐＦｖ−ＰＰ、ｐＦｖ−Ｐの構築
プラスミドｐＳＷ１Ｖ_Ｈ Ｄ１．３Ｖ _ＫＤ１．３を制限酵素 ＨｉｎｄＩＩＩとＳｍａＩで消化しアガロースゲル電気泳動により分離後、Ｖ_Ｈ 遺伝子を含む約４７０ｂｐのＤＮＡ断片を抽出精製した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＴＺ１９Ｒ（ファルマシア社）の ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩサイトに挿入し、プラスミドＴ１９ＶＨを得た。また、プラスミドｐＳＷ１Ｖ_Ｈ Ｄ１．３Ｖ_Ｋ Ｄ１．３を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｍａＩで消化しアガロースゲル電気泳動により分離後、Ｖ_Ｌ 遺伝子を含む約４５０ｂｐのＤＮＡ断片を抽出精製した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＴＺ１８Ｒ（ファルマシア社）のＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩサイトに挿入し、プラスミドＴ１８ＶＬを得た。このプラスミドＴ１８ＶＬを鋳型として、配列表の配列番号７に示した制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列と、ＳａｌＩ認識配列を持つプライマーＶＬ３′ＳａｌＩと配列番号８に示したｐＴＺ１８Ｒ由来配列であるプライマーＵＰＭＣＳを用いてＰＣＲを行い、増幅してきたＤＮＡを制限酵素 ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化した。これをアガロースゲル電気泳動により分離後 ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ断片を抽出精製した。
このＤＮＡ断片をプラスミドｐＴＺ１８Ｒの ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、プラスミドＴ１８ＶＬＳを得た。このプラスミドＴ１８ＶＬＳはＶ_ｌ 遺伝子の３′末端側に制限酵素ＳａｌＩ認識配列を持つ。
このプラスミドＴ１８ＶＬＳを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩで消化しアガロースゲル電気泳動により分離後、Ｖ_Ｌ 遺伝子を含む約４３０ｂｐのＤＮＡ断片を抽出精製した。このＤＮＡ断片を先に構築したＶ_Ｈ 遺伝子を持つプラスミドＴ１９ＶＨのＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩサイトに挿入し、プラスミドＴ１９ＶＨＶＬＳを得た。このプラスミドＴ１９ＶＨＶＬＳはｐＴＺ１９Ｒｌａｃプロモーターの下流に、Ｖ_Ｈ 遺伝子、Ｖ_Ｌ 遺伝子を持つ。
【００３４】
次にプラスミドｐＥＺＺ１８（ファルマシア社）を鋳型として、配列表の配列番号９に示した、制限酵素ＳａｌＩ認識配列を持つプライマーＰｒｏＡ５′と、配列番号１０に示した、制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列を持つプライマーＰｒｏＡ３′を用いてＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅した。
増幅してきた、プロテインＡのＦｃ結合ドメイン様構造２個を含むポリペプチドをコードする遺伝子（配列番号３）を含むＤＮＡを、制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＲＩで消化しアガロースゲル電気泳動を行い約３９０ｂｐのＤＮＡ断片を抽出精製した。このＤＮＡ断片をｐＴＺ１８ＲＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩサイトに導入しプラスミドＴ１８ＰＡを得た。次にこのプラスミドＴ１８ＰＡを制限酵素ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩで消化しアガロースゲル電気泳動を行い、約３９０ｂｐのＤＮＡ断片を抽出精製した。
【００３５】
このＤＮＡ断片を先に得たプラスミドＴ１９ＶＨＶＬＳのＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、プラスミドｐＦｖ−ＰＰを構築した。
このプラスミドｐＦｖ−ＰＰは、Ｖ_Ｈ フラグメントと、Ｖ_Ｌ フラグメントのＣ末端にプロテインＡのＦｃ結合ドメイン様構造（配列番号４の５８アミノ酸残基）２個を含む融合ポリペプチドをコードする。このプラスミドｐＦｖ−ＰＰを制限酵素ＭｌｕＩで消化し、遊離する約１７０ｂｐのＤＮＡ断片を除いた後セルフライゲーションさせ、プラスミドｐＦｖ−Ｐを得た。このプラスミドｐＦｖ−ＰはＶ_Ｈ フラグメントと、Ｖ_Ｌ フラグメントのＣ末端に配列表の配列番号２で示す遺伝子がコードするプロテインＡのＦｃ結合ドメイン様構造１個を含む融合ポリペプチドをコードする。
【００３６】
（１−２） プラスミドｐＭ１３Ｆｖの構築
プラスミドＭ１３ｍｐ１８（宝酒造社）を鋳型として、配列表の配列番号１１で示した、制限酵素ＳａｌＩ認識配列を持つプライマーｃｐＩＩＩ ５′−１と、配列番号１２で示した、制限酵素ＳａｌＩ認識配列とＮｈｅＩ認識配列を持つプライマーｃｐＩＩＩ ３′を用いてＰＣＲを行い、ｃｐＩＩＩ のＣ末端側ポリペプチドをコードするＤＮＡを増幅させた。このＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩで消化後アガロースゲル電気泳動を行い、約６５０ｂｐのＤＮＡ断片を抽出精製した。このＤＮＡ断片を実施例（１−１） で得たプラスミドｐＦｖ−ＰＰのＳａｌＩサイトに挿入した。得られたプラスミドのうち、Ｖ_Ｌ 遺伝子に続いてプライマーｃｐＩＩＩ ５′−１由来の配列がつながった向きに挿入されたプラスミドをプラスミドｐＭ１３Ｆｖとした。
【００３７】
このプラスミドｐＭ１３Ｆｖは、Ｖ_Ｈ フラグメントと、Ｖ_Ｌ フラグメントのＣ末端に配列表の配列番号１で示した遺伝子がコードする、ｃｐＩＩＩ のＣ末端側のポリペプチド（ΔｃｐＩＩＩ）がつながった融合ポリペプチドとを発現するように構築されている。
更にこのプラスミドｐＭ１３Ｆｖの ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩに挿入されたＤＮＡ断片の概略図を図１に示し、塩基配列を配列表の配列番号５に示す。このプラスミドｐＭ１３Ｆｖは、制限酵素ＳａｌＩで消化後セルフライゲーションを行うことにより容易に実施例（１−１） で構築したプラスミドｐＦｖ−ＰＰの形にすることができる。このプラスミドｐＭ１３Ｆｖを導入した大腸菌ＪＭ１０９ をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＭ１３Ｆｖと命名表示し、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３６９８として寄託した。
【００３８】
同様にして、プラスミドＭ１３ｍｐ１８を鋳型として、配列表の配列番号１３で示した、制限酵素ＳａｌＩ認識配列を持つプライマーｃｐＩＩＩ ５′−２と、先に用いたプライマーｃｐＩＩＩ ３′を用いてＰＣＲを行い、増幅してきたＤＮＡをＳａｌＩ消化後プラスミドｐＦｖ−ＰＰのＳａｌＩサイトに挿入し、プラスミドｐＭ１３ΔＦｖを構築した。このプラスミドｐＭ１３ΔＦｖは、ｐＭ１３Ｆｖとほぼ同じ遺伝子配列を持っているが、プライマーｃｐＩＩＩ ５′−２の配列の中に終止コドンが含まれているために、Ｖ_Ｌ 遺伝子とΔｃｐＩＩＩ 遺伝子の間で読取り枠中に終止コドンが出現する。
したがって、ｐＭ１３ΔＦｖは、Ｖ_Ｈ フラグメントと、Ｖ_Ｌ フラグメントのみとを発現するように構築されている。
【００３９】
実施例２ ファージ表面へのＦｖフラグメントの発現とその性質の解析
（２−１） Ｆｖ提示ファージ粒子の調製
実施例（１−２） で得たプラスミドｐＭ１３Ｆｖを用いて大腸菌ＢＭＨ７１−１８を形質転換し、大腸菌ＢＭＨ７１−１８／ｐＭ１３Ｆｖを得た。
コントロールとして、ｐＭ１３ΔＦｖを用いて大腸菌ＢＭＨ７１−１８を形質転換した大腸菌ＢＭＨ７１−１８／ｐＭ１３ΔＦｖを用いた。
これら２種の大腸菌を２×ＴＹ培地（１．６％バクトトリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％ＮａＣｌ）に接種し、３０℃で一晩振とう培養した。
この培養物４ｍｌを１２ｍｌの２×ＴＹ培地に接種し、３０℃で１時間培養した。２ｍｌのＭ１３Ｋ０７ファージ液（１×１０^１２ｐｆｕ／ｍｌ）を加えた後、培養液を３０℃で更に１時間培養した。この培養液を３ｍｌずつ７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する５００ｍｌの２×ＴＹ培地６本に接種し、３０℃で２４時間培養した。同様にしてＭ１３Ｋ０７ファージをプラスミドを持たない大腸菌ＢＭＨ７１−１８を宿主として、調製した。それぞれ培養物より遠心分離により菌体を除き上清を得た。
【００４０】
３リットルの培養液上清に、１リットルのＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％のポリエチレングリコール６，０００及び２．５ＭのＮａＣｌ）を加え、得られた混合物を４℃で一晩静置した。ファージを遠心分離にかけてペレットを生成した。沈殿物を３等分し、各ペレットを３種の異なった方法で調製した。すなわち、第１に、３００ｍｌのＴＥ（１０ｍＭのトリス・塩酸緩衝液、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）に室温にて１時間、第２に、３００ｍｌのＴＥＳ（０．１％のサルコシルを含有するＴＥ）に室温にて１時間、そして第３に、３００ｍｌのＴＥＳに室温にて１８時間、溶解、回転させた。この３種類の処理をしたファージ液に１００ｍｌのＰＥＣ／ＮａＣｌを添加することによって、ファージを再度沈殿させた。４℃で一晩回転することによって、沈殿物をＮＥＴ（１０ｍＭのトリス・塩酸緩衝液、ｐＨ８．０、０．１ＭのＮａＣｌ、及び１ｍＭのＥＤＴＡ）に溶解させた。ファージを１７０，０００×ｇで３時間遠心分離して集め、ＮＥＴに溶解した。最後に、ファージの精製を、濃度勾配ＣｓＣｌ超遠心法を用いて、３６，０００ｒｐｍ で１時間遠心分離することによって行った。ファージのバンドを集め、ＮＥＴに対して透析してファージ液を得た。大腸菌ＢＭＨ７１−１８／ｐＭ１３Ｆｖより得られたファージをＭ１３Ｆｖ、大腸菌ＢＭＨ７１−１８／ｐＭ１３ΔＦｖより得られたファージをＭ１３ΔＦｖと命名した。このように調製した３種類のファージ液、Ｍ１３Ｆｖ、Ｍ１３ΔＦ、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７をそれぞれ先に述べた３種類の処理後精製したものについて以下の分析を行った。
【００４１】
（２−２） ファージ並びにファージミドの感染性の測定
実施例（２−１） で得た３種類のファージ（Ｍ１３Ｆｖ、Ｍ１３ΔＦｖ、Ｍ１３Ｋ０７）を３種類の処理（無処理、サルコシル洗浄１時間、サルコシル洗浄１８時間）したファージ溶液のコロニー形成能とプラーク形成能を測定した。すなわちこれらファージ溶液をＮＥＴを用いて適当に段階希釈した。このファージ溶液１００μｌに、対数増殖期（Ｏ．Ｄ．_６００ ＝０．８）の大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社）培養液５００μｌを加えて室温にて４５分間放置した。このうち１００μｌを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２×ＴＹ培地プレートに直接塗りつけて、３７℃で一晩保温して出現したコロニー数を数えた。また別に１００μｌを５０℃に保温しておいた４ｍｌのソフトアガー（２×ＴＹ培地に０．６５％となるように寒天を溶かしたもの）に混ぜて２×ＴＹ培地プレートに広げて固化させた。これを３７℃で一晩保温して出現したプラーク数を数えた。この結果を表１に示す。すなわち表１は得られたファージ溶液のコロニー形成能とプラーク形成能を比較した表である。
【００４２】
【表１】

【００４３】
ビリオン中のｆｄＤＮＡの、２６０ｎｍでのリン酸基１個当りのモル吸光係数は、６７５０であることが測定されている。Ｍ１３Ｋ０７のＤＮＡの長さは６．４ｋｂであり、Ｍ１３Ｆｖ並びにＭ１３ΔＦｖのＤＮＡの長さは４．８ｋｂであるので、１Ｏ．Ｄ．_２８０ ユニット（以下ＤＵと略す）のファージは、Ｍ１３Ｋ０７については約１．３×１０^１３個のファージ粒子に、またＭ１３Ｆｖ並びにＭ１３ΔＦｖについては約１．８×１０^１３個のファージ粒子に対応するはずである。サルコシル処理を行わなかったサンプルの結果から、Ｍ１３Ｋ０７は０．２５ＰＦＵ／ファージ粒子であり、Ｍ１３Ｆｖ並びにＭ１３ΔＦｖは０．０６ＣＦＵ／ファージ粒子程度であることが示された。Ｍ１３Ｆｖ並びにＭ１３ΔＦｖに感染した細菌によって形成されたプラークは、ヘルパーファージから誘導されたと考えられ、調製物中の約１０％のファージがヘルパーファージであることが示唆された。これらの３種のファージ粒子の感染性は、０．１％サルコシル溶液を用いた１時間の処理（穏やかな洗浄）によっても、１８時間の処理（十分な洗浄）によっても、全く損なわれることがなかった。
【００４４】
（２−３） ファージ表面に発現されたＦｖフラグメントの分析
実施例（２−１） で調製したＭ１３Ｆｖ、Ｍ１３ΔＦｖ、及びＭ１３Ｋ０７それぞれ３種類の処理後調製したファージ１１．２ＤＵを、５％ＳＤＳ、１％β−メルカプトエタノールを含む、１０ｍＭトリス−アセテート緩衝液（ｐＨ５．４）１ｍｌに溶解し、２４時間室温にてかくはんした。１ＮのＮａＯＨで中和した後、最終濃度０．１ＭとなるようにＭｇＣｌ_２ を加えた。２０℃にて１５０，０００×ｇ１２時間遠心分離後上清を取出し、２分間沸騰させた。等容量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル緩衝液を加え、そのうち１５μｌ（０．０７５ＤＵ相当）を１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。泳動後セミドライブロッターを用いてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ミリポア社）にブロッティングした。この膜を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に浸し室温で１時間保温することによりブロッキングした。一次抗体として抗Ｄ１．３Ｆｖフラグメントウサギ抗体（Ｄ１．３Ｆｖをウサギに免疫して得られた血清をＤ１．３Ｆｖ固定化カラムで精製したもの、以下抗Ｄ１．３抗体と略す）を０．０５％トゥイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝液（以下ＰＢＳ／Ｔと略す）に加えたものに浸して室温で４時間保温した後ＰＢＳ／Ｔで３回洗浄した。検出に当っては、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた抗ウサギＩｇＧロバ抗体を用いたＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（アマシャム社）を用いた。その結果を図２に示す。すなわち図２は線状ファージＭ１３Ｆｖ、Ｍ１３ΔＦｖ、及びＭ１３Ｋ０７を界面活性剤サルコシルを含む溶液で処理した場合に、ファージコートタンパク質に残存するＦｖフラグメント由来ポリペプチドの量を比較した図である。
【００４５】
Ｍ１３ΔＦｖ中のＦｖフラグメントがＭ１３ファージの表面に吸着するとは考えられないものの、ウェスタン・ブロッティングでは、Ｖ_Ｈ フラグメントとサイズが対応するバンドが現れた。しかし、ファージを０．１％のサルコシル溶液で１時間洗浄したところ、このバンドは完全に消えた。一方、Ｍ１３Ｆｖの場合には、２本のバンド、すなわち、Ｖ_Ｈ フラグメントと対応する１本の太いバンドと、Ｖ_Ｌ フラグメントをΔｃｐＩＩＩ と融合させたものに対応するもう一本のバンドが、明らかに検出された。ファージを０．１％のサルコシル溶液で１時間洗浄した場合にも、Ｖ_Ｈ に対応するバンドが弱くなったものの、双方のバンドとも残存した。ファージを１８時間にわたって十分に洗浄すると、Ｖ_Ｈ の方のバンドは完全に消えたものの、Ｖ_Ｌ フラグメントをΔｃｐＩＩＩ と融合させたものの方は、量が減少することもなくファージ上に残存した。
以上述べてきたごとく、Ｖ_Ｈ フラグメント並びにＶ_Ｌ フラグメントの双方は、会合した形状でファージ表面上に発現され、また、サルコシル溶液を用いた処理によって、Ｖ_Ｈ フラグメントのみがファージ表面から除去される。
【００４６】
次にファージＭ１３Ｆｖ表面に発現されたＦｖフラグメントを定量するために、それぞれ０．０７５ＤＵのファージと濃度既知のＤ１．３Ｆｖフラグメントも同様にしてウェスタンブロッティングによって分析した。その結果を図３に示す。すなわち図３は、線状ファージＭ１３Ｆｖ表面に発現しているＦｖフラグメント由来ポリペプチドの量を比較した図である。
サルコシル溶液による１時間の洗浄後のＭ１３Ｆｖファージ上に発現されたＶ_Ｈ のバンドの強度は、Ｆｖフラグメント１ｎｇに対応するようであった。
各レーンに、０．０７５ＤＵのファージから調製した全タンパク質を加えた。Ｆｖフラグメントの分子質量は２４．７ｋＤａ であるので、１ｎｇのＦｖフラグメントは２．４×１０^１０個の分子に対応する。このことから、０．１％のサルコシル溶液で１時間処理したＭ１３Ｆｖファージを調製する際には、約２％のファージがＦｖ分子を発現することが示唆された。しかし、Ｖ_Ｈ フラグメントの一部は、サルコシル溶液を用いた洗浄によって、ファージ表面から除去されていたはずである。
実際、Ｍ１３Ｆｖファージを洗浄を行わずに調製した際のＶ_Ｈ のバンドの強度は、１時間の洗浄を行ったサンプルの場合のＶ_Ｈ のバンドの強度より数倍高かった。洗浄を行わずにＭ１３ΔＦｖを調製した場合について示したのと同様にして、遊離Ｖ_Ｈ フラグメントがこの分画に非特異的に混入したおそれもあるので、Ｆｖフラグメントの正確な量を推定することは難しい。また、ファージ粒子からタンパク質を調製する過程でも、実質的な量のタンパク質の損失が生じたはずである。したがって、Ｆｖ分子を発現するＭ１３Ｆｖの本当の率は、上記の推定よりはるかに高いはずである。
以上述べてきたごとく、Ｍ１３Ｆｖファージはその表面上にＦｖ分子を実際に発現しており、また、Ｍ１３Ｆｖファージのうち、Ｆｖ分子を表面上に発現するものの率は、５％以上であると推定される。
【００４７】
（２−４） ファージ表面に発現されたＦｖフラグメントの抗原結合性の分析
ファージ表面に発現されたＦｖフラグメントの抗原結合性を表面プラズモン共鳴を利用したＢＩＡコアシステム（ＢＩＡ ｃｏｒｅ ｓｙｓｔｅｍ ；ファルマシア社）によって調べた。ＨＥＬあるいは、抗Ｄ１．３抗体を、製造業者の指示に従って、バイオセンサーのチップの支持体に、アミン結合法によって化学的に結合させた。実験はすべて、ＨＢＳ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．５％トゥイーン２０）を用いて、３０℃で、５μｌ／分の流速にて実施した。
【００４８】
実施例（２−１） で得た９種類のファージ液をいずれもＨＢＳに対して透析した後、５種類の濃度（３．７、１．８、０．９、０．４５、０．２３ＤＵ／ｍｌ）に希釈して、２０μｌをＨＥＬ固定化センサーチップに投入した。その結果を図４〜図１２に示す。すなわち図４〜図１２はサルコシル処理が、無処理、１時間洗浄、１８時間洗浄がそれぞれ図４〜図６、図７〜図９、図１０〜図１２に対応し、縦軸は共鳴単位（ＲＵ）、横軸は時間（秒）を示す。また、同様にして濃度３．７ＤＵ／ｍｌのファージ２０μｌを投入した後に、抗Ｍ１３ファージウサギ抗体（Ｍ１３ファージをウサギに免疫して得られた血清をＭ１３ファージ固定化カラムで精製したもの、以下抗Ｍ１３抗体と略す）を更に投入してシグナルを増幅した。この結果を図１３に示す。すなわち図１３は、ファージをＨＥＬ固定化センサーチップに投入後、抗Ｍ１３抗体を更に投入した時の表面プラズモン共鳴センサーの結果を示した図であり、縦軸は共鳴単位（ＲＵ）、横軸は時間（秒）を示す。また、ファージ表面にＤ１．３Ｆｖフラグメント由来ポリペプチドが存在しているかを調べるために、抗Ｄ１．３Ｆｖ抗体を固定化したセンサーチップに、濃度３．７ＤＵ／ｍｌのファージ液２０μｌを投入した。その結果を図１４に示す。すなわち図１４は、ファージを抗Ｄ１．３抗体固定化センサーチップに投入した時の表面プラズマモン共鳴センサーの結果を示した図であり、縦軸は共鳴単位（ＲＵ）、横軸は時間（秒）を示す。
【００４９】
以上図４〜図１４に示した結果をまとめる。
図４、図５で示した通り、Ｍ１３Ｋ０７も、Ｍ１３ΔＦｖも、ＨＥＬとは結合しなかった。ベースラインの移動は、サンプルの状態、すなわち、溶質、ｐＨ、及び／又はイオン強度の違いに起因するものであると考えられる。結合によっては生じた共鳴単位（ＲＵ）は、３．７ＤＵ／ｍｌのファージ溶液について２００ＲＵ程度で、あまり高くなったものの、Ｍ１３ＦｖはＨＥＬと明らかに結合した（図６）。解離曲線の形状から判断すると、ファージの一部がＨＥＬから迅速に解離する一方（Ｋ_ｏｆｆ ＝３×１０^−２Ｓ^−１）、残りのファージはほとんど解離しないようであった（Ｋ_ｏｆｆ ＝１×１０^−３Ｓ^−１）。このことによって、これらのファージが異なった形状のファージを包含するものであることが示唆された。すなわち、表面上にＦｖ分子を１つのみ発現するファージと、ファージ粒子１つの表面上に複数のＦｖ分子を発現するファージとがあるのではないかと予測された。これは、サルコシル溶液で１時間にわたり洗浄を行ったＭ１３Ｆｖ調製物で得られた結果によって裏付けられた（図９）。図９に示された通り、サルコシルで１時間洗浄したＭ１３ＦｖファージがＨＥＬから解離する際の曲線は、単一の抗原結合部位を有するファージ抗体について予測される、単純なパターンとなった（Ｋ_ｏｆｆ ＝３×１０^−２Ｓ^−１）。サルコシル溶液で十分に洗浄したＭ１３Ｆｖは、ＨＥＬ結合活性を完全に消失した（図１２）。
【００５０】
センサーチップ上のＨＥＬに結合したファージ抗体を、抗Ｍ１３抗体を投入することによって直接検出した。図１３からは、抗Ｍ１３抗体の投入によって、サルコシルによる洗浄を行わなかったＭ１３Ｆｖの場合にはＲＵが増大し、サルコシル溶液で洗浄を行うとＲＵが低減し、そして十分に洗浄すると、ＨＥＬに結合したファージがバックグラウンドのレベルまで消失することが示唆された。こうした結果から、表面上にＦｖフラグメントを発現するファージがＨＥＬに結合することが、直接的に立証された。サルコシル溶液を用いた洗浄がＨＥＬとの結合活性に及ぼす影響は、ファージ表面からＶ_Ｈ フラグメントが除去されることに起因するものであると考えられる。すなわち図１４に示すように、Ｍ１３Ｆｖの抗Ｄ１．３抗体分子への結合が、サルコシル溶液を用いた洗浄によって大きく影響されることはなかった。抗Ｄ１．３抗体はＶ_Ｈ フラグメントのみならずＶ_Ｌ フラグメントにも結合するので、これらの結果からは、サルコシルでの洗浄によってファージ表面から除去されたのがＶ_Ｈ フラグメントのみであって、ΔｃｐＩＩＩ と融合したＶ_Ｌ フラグメントは、サルコシルによる洗浄後もファージの表面に吸着したままであることが示唆される。ＢＩＡコアシステムを用いた分析の結果は、実施例（２−３） で得られたウェスタン・ブロッティングの結果と完全に合致するものである。
【００５１】
以上述べてきたごとくＭ１３Ｆｖファージの一部は、ファージ粒子１つの表面上に２つ以上のＦｖ分子を発現するものであり、また、サルコシル溶液を用いて穏やかに洗浄することによって、ファージ表面に提示された抗体の結合価を制御し、また、解離の際の速度論的性状を制御することができるとの結論に達した。
【００５２】
実施例３ Ｆｃ結合ドメイン様構造を含むポリペプチドに融合させさＦｖフラグメントを用いた、結合性の高い人工抗体の作製
（３−１） Ｆｃ結合ドメイン様構造を含むポリペプチドに融合させさＦｖフラグメントの調製
実施例（１−１） で構築したプラスミドｐＦｖ−Ｐ、プラスミドｐＦｖ−ＰＰとプラスミドｐＳＷ１Ｖ_Ｈ Ｄ１．３Ｖ_Ｋ Ｄ１．３を用いてそれぞれ大腸菌ＢＭＨ７１−１８を形質転換して、大腸菌ＢＭＨ７１−１８／ ｐＳＷ１Ｖ_Ｈ Ｄ１．３Ｖ _Ｋ Ｄ１．３、大腸菌ＢＭＨ７１−１８／ｐＦｖ−ＰＰ、大腸菌ＢＭＨ７１−１８／ｐＦｖ−Ｐ を得た。これら３種類の大腸菌を１００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．１％グルコースを含む２×ＴＹ培地に接種し、３０℃で一晩振とう培養した。この培養物１０ｍｌを１リットルの１００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．１％グルコースを含む２×ＴＹ培地に接種し３０℃で振とう培養した（各２リットル）。培養液の濁度が分光光度計でＯ．Ｄ．_６００ ＝０．８となったところで最終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加し、更に３０℃で３６時間振とう培養した。それぞれの培養物より遠心分離により菌体を除き上清を得た。
得られた上清それぞれ２リットルをペリコンカセット（ミリポア社）を用い、０．４５μｍのフィルターでろ過した。更に分画分子量１万のフィルターで濃縮後、結合用緩衝液〔１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０、１４０ｍＭ−ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）〕に置換した。
【００５３】
この濃縮液からＦｖフラグメントの精製には、ＨＥＬをリアクチ−ゲル（Ｒｅａｃｔｉ−Ｇｅｌ、ピアス社）に固定化したアフィニティーゲルを、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰの精製にはＩｇＧセファロース６ＦＦ（ファルマシア社）を用いた。
すなわち、濃縮液２００ｍｌに対し１０ｍｌのそれぞれのアフィニティーゲルを加えた。混合物を４℃にて２４時間ゆっくりと回転させ、結合用緩衝液で５回洗浄した。ゲルをカラムに充てんし、アフィニティーゲルに結合したＦｖフラグメント等を、５０ｍＭのグリシン・塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）、及び１５０ｍＭのＮａＣｌで溶出させた。溶出液を１Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）ですばやく中和し、２００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４℃にて２晩透析した。大腸菌ＢＭＨ７１−１８／ ｐＳＷ１Ｖ_Ｈ Ｄ１．３Ｖ _Ｋ Ｄ１．３、大腸菌ＢＭＨ７１−１８／ｐＦｖ−ＰＰ、大腸菌ＢＭＨ７１−１８／ｐＦｖ−Ｐ 培養物から得られたＦｖフラグメント由来ポリペプチドをＦｖ、Ｆｖ−ＰＰ、Ｆｖ−Ｐと命名し、以下の分析に用いた。
【００５４】
まず得られたＦｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰの一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後、クマシ−ブリリアントブルーＲ２５０により染色して検出した。その結果を図１５に示す。すなわち図１５は、アフィニティー樹脂により精製されたＦｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した図である。図１５に示されるとおり、Ｖ_Ｈ 部分とＶ_Ｌ 部分はいずれの場合もモル比１：１で会合してＦｖ形状をなしている。また、アフィニティークロマトグラフィーの結果から、プロテインＡから誘導された部分が、ＩｇＧ結合活性を有していることが示された。
【００５５】
（３−２） Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰのＦｖ部分の物理的特性の分析
Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、及びＦｖ−ＰＰがＨＥＬと結合する際の会合定数（Ｋ_Ａ ）及び会合エンタルピー（ΔＨ）を、マイクロカル社製のオメガ（ＯＭＥＧＡ）滴定熱量計を使用した熱量測定によって測定した（これをＤＴＣ分析と称する）。
すなわち、熱量測定装置は、１００μｌの投入用シリンジを使用して、２分間隔で２４回の投入を次々と行うよう、自動的に作動させた。
１５秒の間に、１．３６ｍｌのサンプル溶液の入った熱量測定装置のセルに、５μｌのＨＥＬ溶液を加えた。熱量測定を行うのに先立って、Ｏ．Ｄ．_２８０ を測定することによってＨＥＬの濃度を正確に測定し、０．０２０２８ｍＭに固定した。熱量計のセル中のＦｖ、Ｆｖ−Ｐ、及びＦｖ−ＰＰの濃度は０．０１ｍＭ程度に調整し、ＤＴＣ分析のデータから正確に計算した。熱量計を使用した結合実験は、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）及び２００ｍＭのＮａＣｌ中で、３０℃にて実施した。
【００５６】
得られたデータから、ΔＧ及び−ＴΔＳの値も計算した。表２及び表３にデータをまとめて示す。すなわち表２及び表３は、ＦｖフラグメントのＨＥＬとの結合に関する熱力学的、動的学的パラメーターを示した表である。
【００５７】
【表２】

【００５８】
【表３】

【００５９】
Ｆｖ─Ｐ及びＦｖ−ＰＰのＫ_Ａ の値は、ＦｖのＫ_Ａ の値よりわずかに小さい。こうした違いは、これらの融合タンパク質を分析する際にエンタルピーの項がわずかに減少したことに由来するようである。次にＦｖ、Ｆｖ−Ｐ、及びＦｖ−ＰＰがＨＥＬと反応する際のＫ_ｏｎ を、ストップト・フロー装置（モデルＳＦ．１７ＭＶ、アプライド・フォト・フィジック社）を使用した蛍光消光法によって測定した。ＨＥＬの濃度を、６μＭから１６μＭまで２μＭずつ上昇させ、Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、及びＦｖ−ＰＰの濃度は１μＭに固定した。
次に、５０μｌの各溶液を、１：１の容量比で混合した。励起光の波長は２８０ｎｍとし、３２０ｎｍ以上の波長の蛍光を検出した。実験は３０℃にて１３回行い、データの平均値を更なる分析に使用した。アプライド・フォト・フィジック社によって提供されたソフトウェアのマニュアルの説明に従って、非線形回帰解析を行い、見掛上の反応速度（Ｋ_ａｐｐ ） を測定した。
【００６０】
この方法では、偽一次条件が仮定されており、次式（数１）：
【００６１】
【数１】
Ｋ_ａｐｐ ＝ Ｋ_ｏｎ〔Ａ〕_０ ＋ Ｋ_ｏｆｆ
【００６２】
が有効であると想定されている。式中の〔Ａ〕_０ はＨＥＬの初期濃度に対応する。実験的には、抗体に対してＨＥＬがはるかに過剰となるような条件下でＨＥＬの濃度を変化させ、Ｋ_ａｐｐ の値を各濃度で測定した。Ｋ_ｏｎは、〔Ａ〕_０ に対するＫ_ａｐｐ のグラフの勾配の値から計算した。Ｋ_ｏｆｆ は、〔Ａ〕_０ が０に等しい場合のＫ_ａｐｐ の値であるが、Ｋ_ｏｆｆ の実際の値は、この方法で実験的に測定するには小さすぎた。そこで、Ｋ_ｏｆｆ はＫ_ｏｎ／Ｋ_Ａ から計算した。Ｋ_Ａ は上述のようにしてＤＴＣによって測定した。表３に、３種の分子についてのＫ_ｏｎ並びにＫ_ｏｆｆ の値を示す。表３に示される通り分子が大きいほど、Ｋ_ｏｎの値が小さく、Ｋ_ｏｆｆ の値が大きかったものの、これらの分子を比較した場合には、Ｋ_ｏｎ並びにＫ_ｏｆｆ についてのこの違いは大きいとはいえなかった。
以上述べてきたように、ＤＴＣ分析とストップト・フロー分析の結果をまとめると、Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、及びＦｖ−ＰＰのいずれにおいても、Ｆｖ部分の物理的特性は実質的に同一であった。
【００６３】
（３−３） ＩｇＧとＦｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰ複合体の分析
Ｆｖ−Ｐ及びＦｖ−ＰＰがヒトＩｇＧと会合する際の熱力学的パラメーターを、ＤＴＣによって測定した。まず、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰ、及びＨＥＬを用いた結合実験で得られたデータに基づいて、熱量計のセル中のＦｖ−Ｐの濃度を０．０１００ｍＭに調整し、Ｆｖ−ＰＰの濃度を０．００５０ｍＭに調整した。２００μｌのシリンジ中のヒトＩｇＧ（シグマ社、＃Ｉ−４５０６）の濃度は、０．０４ｍＭ程度に調整した。１２．５μｌのＩｇＧ溶液を、１．３６ｍｌのＦｖ−ＰあるいはＦｖ−ＰＰの溶液の入った熱量計のセルに２３回投入した。ＩｇＧの濃度は、ＤＴＣ分析で得られたデータから計算した。
【００６４】
ＤＴＣ分析の結果をＦｖ−Ｐについては図１６に、Ｆｖ−ＰＰについては図１７に示した。すなわち図１６及び図１７は、それぞれＦｖ−Ｐ及びＦｖ−ＰＰとヒトＩｇＧとの結合に関するＤＴＣ分析結果を示した図であり、縦軸は熱量（抽入物ｋｃａｌ／モル及びμｃａｌ／秒）、横軸は投入番号及び時間（秒）を示す。そこから計算された熱力学的パラメーターを表４及び表５に示す。すなわち表４及び表５は、Ｆｖ−ＰとＦｖ−ＰＰのヒトＩｇＧとの結合に関する熱力学的パラメーターを示した表である。
【００６５】
【表４】

【００６６】
【表５】

【００６７】
Ｆｖ−ＰＰのＩｇＧに対する親和性はＦｖ−Ｐより約１０倍高く、これは主にエントロピーの項に由来するもののようであった。とはいえ、図１６、図１７における変曲点での反応物質の濃度のモル比から判定すると、ＩｇＧ分子１個が最大で２個のＦｖ−Ｐ分子と、そして２個のＩｇＧ分子が最大で２個のＦｖ−ＰＰ分子と結合しうるので、Ｆｖ−Ｐ及びＦｖ−ＰＰのいずれのプロテインＡドメインも、Ｆｖ結合活性を有するものである。プロテインＡドメインの安定性、及びＦｃ部分の物理的接近可能性に差がある可能性もある。Ｆｖ−ＰＰとＩｇＧの組合せでは、飽和点に達した後に異常な熱の吸着が観察された（図１７）。逐次滴定実験では、モル比が急激に、すなわち、ＩｇＧに対してＦｖ−ＰＰが過剰な条件から、ＩｇＧの方が過剰な条件へと変化する。この熱の吸着から、Ｆｖ−ＰＰに対してＩｇＧが過剰に存在する場合に、複合体が再編成されていることが示唆される。
【００６８】
Ｆｖ−ＰあるいはＦｖ−ＰＰとＩｇＧとの間に形成される複合体の分子形状を、ＨＰＬＣによって更に調べた。
２種のＨＰＬＣ用カラム、Ｇ３０００ＳＷ及びＧ２０００ＳＷ（東ソー社）を直列につないだ。作業はすべて室温にて行い、ランニング緩衝液として２００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。１５μｌの５μＭヒトＩｇＧ溶液、又は１５μｌの１０μＭ Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、あるいはＦｖ−ＰＰ溶液を、まず装置に投入した。複合体の形状の分析に際しては、Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、あるいはＦｖ−ＰＰ（最終濃度はいずれの場合も１０μＭ）をヒトＩｇＧ（最終濃度、５μＭ）と混合し、室温で１時間インキュベートしてから、１５μｌの混合物をＨＰＬＣ装置に投入した。２４５ｎｍでの吸収を監視した。その結果を図１８に示す。すなわち図１８はＦｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰ及びこれらのＩｇＧ混合物のＨＰＬＣによる結果を示した図であり、縦軸はＯ．Ｄ．_２４５ 、横軸は時間（分）を示す。
【００６９】
予想分子質量は以下の通りであった。
Ｖ_Ｈ ドメイン、１２，８３１Ｄａ；Ｖ_Ｌ ドメイン、１１，８７７Ｄａ；プロテインＡのドメイン１個と融合したＶ_Ｌ ドメイン、１９，３４１Ｄａ；プロテインＡのドメイン２個と融合したＶ_Ｌ ドメイン、２５，９６３Ｄａ；ヒトＩｇＧ、１４６，０００Ｄａ（平均値）。
Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、及びＦｖ−ＰＰの溶出曲線からは、いずれの場合にもＶ_Ｈ ドメインとＶ_Ｌ ドメインが互いに緊密に会合していることを示された。ヒトＩｇＧの溶出曲線には、大きなピークが１つと小さなピークが１つ含まれていた。小さい方のピークはＩｇＧの二量体と対応する。
予想どおり、ＦｖとＩｇＧの混合物の溶出曲線は、ＩｇＧとＦｖのそれぞれ別の溶出曲線を単に合せたものであり、これらの２種の分子の間に相互作用が起きていないことが示された。Ｆｖ−ＰをＩｇＧと混合した場合には、ＩｇＧのピークのやや前に、新たな物質のピーク（図１８中、分画Ａ）が溶出した。
Ｆｖ−ＰとＩｇＧの分画の物質が減少していることや、分子量から判断して、分画Ａは、１個のＩｇＧ分子と２個のＦｖ−Ｐ分子から構成される複合体〔（Ｆｖ−Ｐ）_２ ＩｇＧ複合体と称する〕に対応する。
【００７０】
Ｆｖ−ＰＰをＩｇＧと混合した場合には、新たな小さいピークと大きなピーク（図１８中、分画Ｂ）が現れた。Ｆｖ−ＰとＩｇＧの場合と同様に、分画Ｂは、２個のＩｇＧ分子と３個のＦｖ−ＰＰ分子の複合体〔（Ｆｖ−ＰＰ）_３ （ＩｇＧ）_２ 複合体と称する〕に対応している。
【００７１】
この（Ｆｖ−ＰＰ）_３ （ＩｇＧ）_２ 複合体は、混合物中のＦｖ−ＰＰとＩｇＧ濃度を１０倍低減させた場合にも、選択的に形成した。また、溶出曲線から判断して、この（Ｆｖ−ＰＰ）_３ （ＩｇＧ）_２ 複合体は、（Ｆｖ−Ｐ）_２ ＩｇＧ複合体と比べて更に安定なようであった。ＩｇＧの大半は複合体中に見いだされ、複合体を形成していないＦｖ−ＰＰ分子の溶出曲線は極めてシャープで、図１８中分画Ｂを分取後同じ条件でクロマトグラフィーにかけた場合のＦｖ−ＰＰの溶出曲線とほぼ同一であった。
【００７２】
これら分画Ａ、Ｂが新たな複合体を形成していることを確認するために、変性条件下のＨＰＬＣにより更に分析した。すなわち、吸収のピークを示した分画（図１８中分画Ａ及びＢ）を分取し、凍結乾燥した。これらを５Ｍグアニジン−塩酸に溶解した後、同じカラムで変性条件下でＨＰＬＣ分析をした。ランニング緩衝液としては、５Ｍグアニジン−塩酸を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。コントロールとして、ＩｇＧとＦｖ−Ｐの混合物、並びにＩｇＧとＦｖ−ＰＰの混合物（それぞれ２種の成分のモル比は１：２）も分析した。
【００７３】
その結果を図１９に示す。すなわち図１９は、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰとＩｇＧ複合体（それぞれ図１８中の分画Ａ、Ｂ）の変性条件下のＨＰＬＣによる分析結果を示した図であり、縦軸はＯ．Ｄ．_２４５ 、横軸は時間（分）を示す。図１９に示されたとおり、分画Ａの複合体は、モル比１：２：２でＩｇＧ、Ｖ_Ｌ −プロテインＡＦｃ結合ドメイン１個、及びＶ_Ｈ に分かれた。また分画Ｂの複合体は、モル比２：３：３のＩｇＧ、Ｖ_Ｌ −プロテインＡＦｃ結合ドメイン２個及びＶ_Ｈ を生じた。
【００７４】
以上述べてきたごとく、ＩｇＧ分子を加えると、Ｆｖ−Ｐ分子並びにＦｖ−ＰＰ分子が、複数の抗原結合部位を有する複合体を生ずる。
【００７５】
（３−４） Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰとＩｇＧ分子複合体の物理特性の分析
Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰ、あるいはそれらとＩｇＧ複合体の、固体支持体に結合させておいたＨＥＬとの複合体のＫ_ｏｎ及びＫ_ｏｆｆ を、ＢＩＡコアシステムを使用して測定した。２００μｇ／ｍｌのＨＥＬ溶液３５μｌを、製造業者の指示に従って、バイオセンサーチップ上の支持体にアミン結合法によって化学的に結合させた。実験はすべて、５μｌ／分の流速で、ＨＢＳ中、３０℃にて実施した。まず、ヒトＩｇＧを含有する（モル比２：１）、あるいは含有しない１００ｎＭ、５０ｎＭ、及び２５ｎＭの抗体（Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、あるいはＦｖ−ＰＰ）溶液２０μｌを、バイオセンサーチップ中に投入し、その後ＨＢＳで洗浄し、そして最後に、チップを１００ｍＭの塩酸で再生した。ヒトＩｇＧの混合条件は、希釈緩衝液としてＨＢＳを使用した以外は、実施例（３−３） で示したＨＰＬＣによる分析の場合と同一とした。
【００７６】
その結果を図２０に示す。すなわち図２０は、ＩｇＧを加えた場合と加えない場合について、ＨＥＬのＦｖ、Ｆｖ−Ｐ、及びＦｖ−ＰＰとの会合、並びに生じた複合体の解離を、ＢＩＡコアシステムを使用して分析した際に得られた共鳴センサーの結果を示す図であり、縦軸は共鳴単位（ＲＵ）、横軸は時間（秒）を示す。これらのデータに基づいて、Ｋ_ｏｎ及びＫ_ｏｆｆ の値を計算した。その結果を表６に示す。すなわち表６は、ＢＩＡコアシステムにより測定したＦｖフラグメントとＨＥＬの結合に関する動力学的パラメーターを示した表である。
【００７７】
【表６】

【００７８】
Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、及びＦｖ−ＰＰは、ＩｇＧ分子を加えなかった場合、ＢＩＡコアで測定したＫ_ｏｎ及びＫ_ｏｆｆ の値が、いずれも、実施例（３−２） で示したＤＴＣ並びにストップト・フロー装置で測定した値より１０倍程度小さかった。こうした見掛上の差は、おそらく、複合体の形成条件の違いに起因するものである。すなわち、ＢＩＡコアシステムの場合には、ＨＥＬは固体支持体に化学的に結合されているのに対し、ＤＴＣ及びストップト・フロー分析の場合には、反応物質は溶液中で遊離していた。こうした違いにもかかわらず、全体としての親和性を反映していると考えられるＫ_Ａ の値は、互いにほぼ同一であった。Ｋ_ｏｆｆ の値は、Ｆｖ−ＰとＩｇＧの組合せの場合を除き、いずれの場合にも、総じて抗体の濃度が低いほど小さかった。こうした現象は、ＢＩＡコアシステムを用いた分析に特有のもののようである。固体支持体上に形成した複合体の安定性は、バイオセンサーチップ上の固体支持体に結合させた抗原の物理的条件に左右されるようであった。すなわち抗体の接近可能性は、チップ上で等しく達成されたわけではなかったのである。真のＫ_ｏｆｆ は、理想的には、濃度をゼロとした地点で測定すべきである。したがって、測定値はすべて、経験的な予測値であると考えるべきである。
【００７９】
Ｆｖの場合、ＩｇＧを加えても、Ｋ_ｏｎにもＫ_ｏｆｆ にも何ら変化が生じなかった。Ｆｖ−Ｐの場合、ＩｇＧを加えると、Ｋ_ｏｎの値は半分となり、Ｋ_ｏｆｆ の値が３分の１となった。しかし、Ｆｖ−Ｐの濃度が低い場合、Ｋ_ｏｆｆ の値は上昇した。この現象は、（Ｆｖ−Ｐ）_２ ＩｇＧ複合体が不安定で、その結果、濃度が低いと解離してしまうことに起因すると考えられる。Ｆｖ−ＰＰの場合、ＩｇＧを加えたことがＫ_ｏｆｆ の減少に及ぼす正の効果が更に明りょうとなった。すなわち、測定を行ったすべての抗体濃度で、Ｋ_ｏｆｆ の値が３．５倍低かったのである。ＢＩＡコア分析で観察された、（Ｆｖ−Ｐ）_２ ＩｇＧ複合体と（Ｆｖ−ＰＰ）_３ （ＩｇＧ）_２ 複合体の間の安定性についてのこの違いは、実施例（３−３） で示したＨＰＬＣ及びＤＴＣによる分析での結果と符合するものである。このように、（Ｆｖ−ＰＰ）_３ （ＩｇＧ）_２ 複合体は、抗原との結合性に関して安定、かつ多価性であると考えられる。
【００８０】
（３−５） Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰとＩｇＧ分子複合体を用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した１００μｇ／ｍｌ ＨＥＬを９６穴プレート（スミコンマルチプレート；スミトモベークライト社）に５０μｌずつ入れ、プレートを４０℃に一晩保った。上清を除去した後、１００μｌの１％ＢＳＡを加え、室温に１時間保った。プレートをＰＢＳ／Ｔで３回洗浄し、各ウェルに、５０μｌの一次抗体溶液を加えた。この一次抗体溶液は、ヒトＩｇＧを含有する、あるいは含有しない抗体（Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰ）、あるいはヒトＩｇＧのみを段階希釈したものである。
【００８１】
ヒトＩｇＧの混合条件は、希釈緩衝液としてＰＢＳ／Ｔを使用した以外は、実施例（３−３） で示したＨＰＬＣによる分析の場合と同一とした。
このプレートを室温で４時間保温した。溶液を取除いた後、ＰＢＳ／Ｔで３回洗浄した。二次抗体として、抗Ｄ１．３抗体をＰＢＳ／Ｔで希釈したものを５０μｌ加えた。室温に４時間保温した後、プレートをＰＢＳ／Ｔで３回洗浄した。三次抗体として、ＰＢＳ／Ｔで希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた抗ウサギＩｇＧロバ由来抗体、５０μｌを加え、室温で４時間保温した。
ＰＢＳ／Ｔで４回洗浄した後、０．０４％のｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤＡ）、０．０２％のＨ_２ Ｏ_２ 、４８．５ｍＭのクエン酸塩、及びＮａ⁻ リン酸（ｐＨ５．０）からなる染色用溶液５０μｌを加えた。染色反応を暗室内で室温にて２０分間進行させ、５０μｌの２Ｍ硫酸を加えることにより停止させた。４９２ｎｍでの吸光度を、タイターテック（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ） 〔マルチスカン（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ）、ＭＣＣ社〕によって測定した。その結果を図２１に示す。すなわち図２１はヒトＩｇＧのみのもの（×）と、Ｆｖ（白丸）、Ｆｖ−Ｐ（白四角）、Ｆｖ−ＰＰ（白三角）とＦｖにヒトＩｇＧを加えたもの（黒丸）、Ｆｖ−ＰにヒトＩｇＧを加えたもの（黒四角）、Ｆｖ−ＰＰにヒトＩｇＧを加えたもの（黒三角）を一次抗体として抗Ｄ１．３抗体により検出したＥＬＩＳＡの結果を示した図であり、縦軸はＯ．Ｄ．_４９２ 、横軸は一次抗体濃度（μＭ）を示す。
【００８２】
また同様にして、二次抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた抗ヒトＩｇＧＦｃフラグメントヤギ抗体（カッペル社、以下抗ヒトＦｃ抗体と略す）に変えて二次抗体の洗浄後発色させた。この場合、ＨＥＬに結合した一次抗体中にヒトＩｇＧが含まれているかを調べることとなる。
その結果を図２２に示す。すなわち図２２は、図２１と同様のものを一次抗体として抗ヒトＦｃ抗体により検出したＥＬＩＳＡの結果を示した図であり、縦軸はＯ．Ｄ．_４９２ 、横軸は一次抗体濃度（μＭ）を示す。
【００８３】
これらＥＬＩＳＡの結果は、プロテインＡから誘導した部分が、第１のヒトＩｇＧ分子ばかりでなく、第２及び第３の抗体にも結合した可能性があったので、得られたデータの解釈は多少複雑なものとなった。しかし、いずれの場合にも、Ｆｖ−Ｐ並びにＦｖ−ＰＰを単独で使用した場合より、Ｆｖ−ＰとＩｇＧとの混合物、並びにＦｖ−ＰＰとＩｇＧとの混合物を用いた場合の方が検出の感度が高いことは明らかであった。更に、等しいＯ．Ｄ．_４９２ の値を示す第１抗体の濃度を比較したところ、Ｆｖ−ＰＰとＩｇＧとの混合物を用いた場合の検出の感度は、Ｆｖを単独で用いた場合の検出の感度より一桁以上高かった。
【００８４】
図２２に示すように、第２抗体として抗Ｆｃ抗体を使用したＥＬＩＳＡでは、ＩｇＧを加えた場合に感度が上昇することが明らかに観察された。ＩｇＧを加えなかった場合には、Ｆｖ−ＰもＦｖ−ＰＰもシグナルを示さなかったのである。以上述べてきたごとく、Ｆｖ−Ｐ並びにＦｖ−ＰＰをＩｇＧと混合したものは、ＥＬＩＳＡに用いる反応物質として有用である。
【００８５】
（３−６） Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰとＩｇＧ分子複合体を用いたウェスタンブロッティング
０．５μｇ、０．２５μｇ、０．１２５μｇ、０．０６２５μｇのＨＥＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、セミドライブロッターを用いてＰＶＤＦ膜にブロッティングした。この膜を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ／Ｔに室温で１時間浸してブロッキングした。一次抗体としてＰＢＳ／Ｔで希釈した１０ｍＭのＦｖ、Ｆｖ−ＰあるいはＦｖ−ＰＰを使用した。室温で４時間保温後ＰＢＳ／Ｔで３回洗浄した。抗Ｄ１．３抗体を含有するＰＢＳ／Ｔに浸し、室温に４時間保ち、そしてＰＢＳ／Ｔで３回洗浄した。この膜を、更に、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた抗ウサギＩｇＧ抗体を含むＰＢＳ／Ｔに浸し、室温に４時間保った。ＰＢＳ／Ｔで５回洗浄した後、ＥＬＣウェスタン ブロッティングシステム（アマシャム社）を用いて検出した。
【００８６】
その結果を図２３に示す。すなわち図２３は、Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰを一次抗体として抗Ｄ１．３抗体により検出したＨＥＬ〔０．５μｇ（１） 、０．２５μｇ（２） 、０．１２５μｇ（３） 、０．０６２５μｇ（４） 〕のウェスタン ブロッティングの結果を示した図である。
【００８７】
また同様にして、Ｆｖ−ＰあるいはＦｖ−ＰＰとヒトＩｇＧ複合体を一次抗体としてウェスタン ブロッティングをした。
すなわち、実施例（３−３） で示したＨＰＬＣの分析で用いた複合体をＰＢＳ／Ｔで１０００倍希釈したもの（Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰ濃度として１０ｎＭ）を一次抗体として用いた。
二次抗体として、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた抗ヒトＦｃ抗体を用いた。
二次抗体洗浄後ＥＣＬウェスタン ブロッティングシステムを用いて検出した。その結果を図２４に示す。すなわち図２４は、Ｆｖ−ＰあるいはＦｖ−ＰＰとヒトＩｇＧ複合体を一次抗体として、抗ヒトＦｃ抗体により検出したＨＥＬ〔０．５μｇ（１） 、０．２５μｇ（２） 、０．１２５μｇ（３） 、０．０６２５μｇ（４） 〕のウェスタン ブロッティングの結果を示した図である。
【００８８】
これらウェスタン ブロッティングの結果をまとめると、第２抗体として抗Ｄ１．３抗体を使用した場合、Ｆｖ−Ｐ並びにＦｖ−ＰＰはＦｖより強い信号を示した。第２抗体として抗Ｆｃ抗体を使用した場合、Ｆｖ−ＰあるいはＦｖ−ＰＰのＩｇＧとの複合体は、予想どおり、更に強い信号を示した。
【００８９】
【発明の効果】
本発明により提供される遺伝子を用いることにより、目的抗原に対して高アフィニティーの抗体分子をコードする遺伝子の選抜が容易となり、選抜された高アフィニティー抗体を含有するモノクローナル型の多価人工抗体の製造方法も提供される。目的抗原に対してアフィニティーを示す抗体分子をコードする遺伝子群を用いれば、ポリクローナル型の多価人工抗体の作製も容易であり、これらの多価人工抗体は、抗原精製、抗原測定、診断等の分野で有用である。
【００９０】
【配列表】
【００９１】

【００９２】

【００９３】

【００９４】

【００９５】

【００９６】

【００９７】

【００９８】

【００９９】

【０１００】

【０１０１】

【０１０２】

【０１０３】

【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＭ１３ＦｖのＨｉｎｄ ＩＩＩ−ＥｃｏＲ Ｉ挿入断片とその付近の概略図。
【図２】線状ファージＭ１３Ｆｖ、Ｍ１３ΔＦｖ、Ｍ１３Ｋ０７をサルコシル処理した時にファージコートタンパク質に残存するＦｖフラグメント由来ポリペプチドを比較した図。
【図３】線状ファージＭ１３Ｆｖ表面に発現されているＦｖフラグメント由来ポリペプチドを比較定量した図。
【図４】ファージＭ１３Ｋ０７サルコシル無処理でＨＥＬ固定化センサーチップに投入した時の表面プラズモン共鳴センサー分析結果を示した図。
【図５】ファージＭ１３ΔＦｖをサルコシル無処理でＨＥＬ固定化センサーチップに投入した時の表面プラズモン共鳴センサー分析結果を示した図。
【図６】ファージＭ１３Ｆｖをサルコシル無処理でＨＥＬ固定化センサーチップに投入した時の表面プラズモン共鳴センサー分析結果を示した図。
【図７】ファージＭ１３Ｋ０７をサルコシル１時間処理でＨＥＬ固定化センサーチップに投入した時の表面プラズモン共鳴センサー分析結果を示した図。
【図８】ファージＭ１３ΔＦｖをサルコシル１時間処理でＨＥＬ固定化センサーチップに投入した時の表面プラズモン共鳴センサー分析結果を示した図。
【図９】ファージＭ１３Ｆｖをサルコシル１時間処理でＨＥＬ固定化センサーチップに投入した時の表面プラズモン共鳴センサー分析結果を示した図。
【図１０】ファージＭ１３Ｋ０７をサルコシル１８時間処理でＨＥＬ固定化センサーチップに投入した時の表面プラズモン共鳴センサー分析結果を示した図。
【図１１】ファージＭ１３ΔＦｖをサルコシル１８時間処理でＨＥＬ固定化センサーチップに投入した時の表面プラズモン共鳴センサー分析結果を示した図。
【図１２】ファージＭ１３Ｆｖをサルコシル１８時間処理でＨＥＬ固定化センサーチップに投入した時の表面プラズモン共鳴センサー分析結果を示した図。
【図１３】ファージをＨＥＬ固定化センサーチップに投入後、抗Ｍ１３ファージ抗体をさらに投入した時の表面プラズモン共鳴センサー分析結果を示した図。
【図１４】ファージを抗Ｄ１．３抗体固定化センサーチップに投入した時の表面プラズモン共鳴センサー分析結果を示した図。
【図１５】アフィニティ樹脂により精製されたＦｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示した図。
【図１６】Ｆｖ−ＰとヒトＩｇＧとの結合に関するＤＴＣ分析結果を示した図。
【図１７】Ｆｖ−ＰＰとヒトＩｇＧとの結合に関するＤＴＣ分析結果を示した図。
【図１８】Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰ及びこれらのＩｇＧ混合物のＨＰＬＣによる分析結果を示した図。
【図１９】Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰとＩｇＧ複合体の変性条件下ＨＰＬＣによる分析結果を示した図。
【図２０】Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰとそれらにヒトＩｇＧを加えたものを、ＨＥＬ固定化センサーチップに投入した時の表面プラズモン共鳴センサー分析結果を示した図。
【図２１】Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰとそれらにヒトＩｇＧを加えたものを一次抗体として抗Ｄ１．３抗体により検出したＥＬＩＳＡの結果を示した図。
【図２２】Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰとそれらにヒトＩｇＧを加えたものを一次抗体として抗ヒトＦｃ抗体により検出したＥＬＩＳＡの結果を示した図。
【図２３】Ｆｖ、Ｆｖ−Ｐ、Ｆｖ−ＰＰを一次抗体として、抗Ｄ１．３抗体により検出したウエスタンブロッティングの結果を示した図。
【図２４】Ｆｖ−ＰあるいはＦｖ−ＰＰとヒトＩｇＧ複合体を一次抗体として抗ヒトＦｃ抗体により検出したウエスタンブロッティングの結果を示した図。[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to a novel gene, and more particularly, to a gene useful for selection of a high affinity antibody, production of an artificial antibody molecule, and the like.
[0002]
[Prior art]
The antigen specificity of the antibody is determined in the V region (V_H, V_L) Is determined by the amino acid sequence. An antibody library has been prepared in which Escherichia coli expresses a Fab or Fv portion containing the variable region of this antibody. That is, V derived from mouse and human_HAnd V_LThe gene was amplified by PCR (polymerase chain reaction) and then integrated into an Escherichia coli expression vector and expressed [Science, Vol. 246, pp. 1275-21281 (1989), Nature] 341, 544-546 (1989), Journal of Molecular Biology, 213, 617-619 (1990), Nature, 347, 483-485. (1990), Science, Vol. 240, pp. 1038-1041 (1988), and Vol. 240, pp. 1041-1043 (1988)].
Furthermore, in order to efficiently screen for recombinants that express an antibody molecule that reacts with the antigen of interest, a so-called phage-displayed antibody library in which the antibody molecule is expressed in the form of a fusion protein with a coat protein of a linear phage is also available. Vol. 89, pp. 3576-3580 (1992), Vol. 89, Procedings of the National Academy of Sciences of the USA (Procedings of the National Academy of Sciences of the USA). 4457-4461 (1992), ibid., Volume 88, 7978-7982 (1991), ibid., 88, 4363-4366 (1991), Journal of Molecular Biology, 227, 381-388 (1992), 226, 889-896 (1992), 222, 581-597 (1991), Nature, 352, 624-628 (1992). 1991), 348, 522-554 (1990); 349, 293-299 (1991)].
[0003]
In this phage-displayed antibody library, phage particles can be directly screened with a resin or the like on which an antigen is immobilized, since the polypeptide derived from the antibody molecule is present on the phage surface, and the phage particles can be proliferated by infecting E. coli again. The phage particles used in the present specification also include phagemid particles. Therefore, not only can a large number of clones be screened in a short time, but also the gene encoding the target antibody molecule can be easily recovered. As a method of recovering the antibody molecule from the obtained gene encoding the target antibody molecule, the gene encoding the phage coat protein is removed by restriction enzyme digestion, and only the antibody molecule can be expressed. In addition, by introducing an amber mutation between the antibody gene and the phage coat protein gene and changing the type of Escherichia coli, a vector capable of selectively expressing the antibody molecule or the fusion protein of the antibody molecule and the coat protein has been constructed. I have.
Also, by purifying the expressed antibody molecule or fusing a short peptide chain to the antibody molecule for use, and using an antibody against the peptide chain, the antibody can be purified or detected. A protein that is expressed as a protein and detected by its enzymatic activity has also been developed [Bio / Technology, Vol. 11, pp. 601 to 605 (1993), and Vol. , Pp. 1128-1132 (1992), Gene, Vol. 122, pp. 361-365 (1992)].
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
When referring to the affinity between an antibody and an antigen, there are intrinsic affinities called affinity and functional affinities called avidity. The former is the strength of the bond formed at the binding site between the antibody and the antigen, that is, the affinity determined by hydrogen bonding, hydrophobic bonding, van der Waals force, etc., and the latter is not only the affinity but also the strength. , The total affinity when the valency of the antibody and antigen binding sites is multivalent. When an antibody molecule is actually used in an immunization experiment, it is necessary that the affinity is strong and specific, but a molecule having a higher valence is more useful in practice and an antibody molecule having a lower affinity is required. However, the higher the valence, the stronger the affinity as a whole.
In vectors used in phage-displayed antibody libraries and the like, antibody molecules are Fab fragments or single-chain Fv fragments [V_H, V_LThe fragments are joined by a spacer consisting of several amino acid residues to form a single-chain polypeptide (hereinafter abbreviated as scFv)]. However, it is unknown how many antibody molecules are displayed on one phage particle, and no method for controlling the number is shown. Also, there is no disclosure of a method for increasing the avidity of the obtained antibody molecule to a practically useful form.
An object of the present invention is to provide a method of controlling the number of molecules having a displayed antibody function in a phage-displayed antibody expression system and selecting a high-affinity antibody molecule. It is an object of the present invention to provide a gene which can provide a method for preparing an artificial antibody which has high avidity by providing the binding property and can detect an antigen with high sensitivity.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In general, the present invention is represented by the following general formula (Formula 1).Nucleic acidAbout.
[0006]
Embedded image

[0007]
[Wherein X ′ is a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding an antibody variable site, and Y is a nucleotide sequence containing a linear phage coat protein III or VIII.And a stop codon at the end, Z is a nucleic acid containing a base sequence encoding protein A, protein G or their Fc binding domain, m is 1 or 0, and when m is 1, the nucleic acid of the general formula (Formula 1) is an antibody variable Encodes a fusion polypeptide containing a site and a filamentous phage coat protein III or VIII, and when m is 0, the nucleic acid of the general formula (Formula 1) has an antibody variable site and protein A, protein G or their Fc binding domains Encoding a fusion polypeptide containing
[0008]
The present inventors have created a gene represented by the formula (Chemical Formula 1), incorporated a gene encoding an antibody variable site into the gene, and converted the antibody variable site into a fusion protein with a polypeptide capable of expressing a phage surface. When expressed on the phage surface in a form, the affinity of the phage-displayed antibody can be easily measured, the high-affinity antibody variable site can be efficiently selected, and the antibody variable site can be expressed as a polypeptide having Fc binding ability. When expressed in the form of a fusion protein, the protein forms a complex with an Fc-containing molecule, and the complex exhibits a high avidity because of exhibiting a multivalent antibody titer and being extremely stable. The present inventors have found that they are useful for immunological use as tea artificial antibodies, and have completed the present invention.
[0009]
The gene of the present invention is a gene containing a gene encoding a polypeptide capable of expressing phage surface (hereinafter referred to as X gene) downstream of a gene containing an integration site of a gene encoding an antibody variable site (hereinafter referred to as X gene). , Y gene), and further downstream, a gene containing a gene encoding a polypeptide having Fc binding ability (hereinafter, referred to as Z gene). The antibody variable site herein refers to any natural or artificial antibody variable site, Fab, scFv, or Fv. When affinity property is measured by a method described later, it is preferable to select Fv.
[0010]
Examples of the polypeptide having the ability to express phage surface include linear phage coat protein III (hereinafter abbreviated as cpIII) and VIII (hereinafter abbreviated as cpVIII) or a part thereof. There is no particular limitation as long as it is expressed in the form of a polypeptide and an antibody variable site is displayed on the surface of a phage particle. Further, the polypeptide having Fc binding ability includes, for example, protein A and protein G, and these Fc binding domains or Fc binding domain-like structures may be used. When using an Fc-binding domain or an Fc-binding domain-like structure, the number of domains is usually selected in the range of 1 to 5. Regarding the sequence of these genes, the open reading frame of the polypeptide encoded by the Y gene is connected to the open reading frame of the antibody variable site incorporated in the X gene, and the terminating sequence ends at the end of the polypeptide encoded by the Y gene. There are codons. A restriction enzyme site exists at the boundary between the X gene and the Y gene, and a restriction enzyme site also exists at the boundary between the Y gene and the Z gene. These two restriction enzyme sites may be the same restriction enzyme site or different restriction enzyme sites, but it is only necessary that the terminal generated after cleavage, that is, the X gene terminal and the Z gene terminal can be connected. Further, the Z gene is linked to the open reading frame of the polypeptide encoded by the Z gene in a form following the open reading frame of the antibody variable site incorporated in the X gene, and has a stop codon at the end of the polypeptide encoded by the Z gene. It is connected as follows.
[0011]
The gene of the present invention is used by integrating it into a vector. Examples of the vector used in the present invention include a phagemid vector as a basic skeleton and a vector in which an XYZ gene is incorporated downstream of a promoter, and a phagemid vector as a basic skeleton in which an XY gene is incorporated downstream of a promoter. There is a vector in which the XZ gene has been incorporated downstream of the promoter using the vector and the phagemid vector as the basic skeleton, and these can be used in combination.
[0012]
As described above, the X gene can incorporate a gene encoding a natural or artificial antibody variable site. The X gene into which the gene encoding the antibody variable site has been incorporated is hereinafter referred to as X 'gene. Similarly, the XYZ gene, the XY gene, and the XZ gene into which the gene encoding the antibody variable site has been incorporated are referred to as the X'-YZ gene, the X'-Y gene, and the X'Z The variable region of the antibody, which is referred to as a gene in the present specification, means a polypeptide containing the variable region of the antibody in the molecule.
[0013]
When helper phage is infected with helper phage, Escherichia coli carrying a phagemid vector containing a X'-YZ gene into which a gene encoding an antibody variable site, for example, a gene encoding Fv, Fab or scFv has been incorporated, forms a linear phage. Is done. At this time, a phage coat protein linked to an antibody variable site is expressed from the X′-Y gene on the vector, and is integrated on the phage surface. That is, the polypeptide containing the antibody variable site encoded by the X'-Y gene is displayed on the surface of the filamentous phage. Phage particles displaying antibody variable sites having the desired antigen-binding ability can be easily selected by affinity screening using a carrier on which the desired antigen is immobilized. At this time, if the polypeptide containing the antibody variable site is in the form of an Fv fragment, the phage particles are washed with a solution containing a surfactant, sodium N-lauroyl sarcosine (hereinafter abbreviated as sarkosyl), thereby infecting the phage. Without compromising the Vv of the Fv fragment_HDomain and V_LDomains can be dissociated. That is, the number of Fv fragments having the antigen-binding ability displayed on the phage surface can be adjusted by the washing conditions.
Thereby, the valency of the antibody present on the phage surface can be adjusted, and phage particles presenting the antibody molecule having the same valency and high affinity can be selected. The washing conditions are determined by, for example, using a BIA core system (Pharmacia) utilizing surface plasmon resonance and injecting variously treated phage solutions into a sensor chip on which an antigen is immobilized. Can be.
[0014]
By infecting Escherichia coli with the obtained phage particles again, a plasmid containing the gene encoding the target antibody molecule can be recovered. The recovered plasmid can be converted to a form that expresses the fusion polypeptide encoded by the X′-Z gene by restriction enzyme digestion to release the Y gene and self ligation.
By introducing the transformed plasmid vector into Escherichia coli and culturing it, a large amount of the fusion polypeptide encoded by the X'-Z gene can be produced. Since this polypeptide has Fc binding ability, it can be easily purified, for example, by using an IgG-bound resin. Alternatively, a resin to which an antigen is immobilized may be used.
[0015]
A complex is formed by mixing the thus obtained polypeptide in which the antibody variable site and the polypeptide having Fc binding ability are fused with a molecule containing Fc, for example, human IgG. For example, the polypeptide having Fc binding ability is a polypeptide comprising a domain structure having Fc binding ability consisting of 58 amino acid residues, such as a protein A-derived Fc binding domain, encoded by the gene represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. In the case of (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), one Fc-containing molecule can be bound in two places [European Journal of Biochemistry, Vol. 78, Nos. 471-490] P. (1977), Molecular Immunology, Vol. 17, p. 1563-1573 (1980), The Embo Journal, The Vol. 4, p. Rotein Engineering (Protein Engineering), Vol. 1, No. 2, pp. 102-113 (1987)]. Therefore, the fusion polypeptide containing the Fc binding domain forms, for example, a complex in which two fusion polypeptides are added to an IgG1 molecule. That is, a molecule having a bivalent antibody titer can be created. The resulting complex has high avidity as an antibody because it is divalent, and can be easily detected by using an anti-Fc fragment antibody because it contains an Fc fragment, and can be widely applied to ELISA and the like.
[0016]
Further, when the number of polypeptides having Fc binding ability is doubled, a more stable complex having a high antibody valency is formed. That is, for example, a fusion polypeptide containing a polypeptide containing two Fc binding domain-like structures of protein A encoded by the gene represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing forms a macromolecule with, for example, human IgG. Rather, it unexpectedly forms a stable complex of two IgG2 molecules and three fusion polypeptide molecules. This complex is extremely stable, has a high trivalent antibody titer, and can be detected with an anti-Fc fragment antibody. The complex is also an artificial antibody that is extremely useful for applications such as ELISA.
[0017]
As an example of a vector containing the gene of the present invention having the functions described above, there is a plasmid pM13Fv prepared by the present inventors.
[0018]
A schematic diagram of the gene sequence of plasmid pM13Fv is shown in FIG.
In FIG. 1, in the gene of the present invention, the portion corresponding to the X gene is between HindIII and SalI, the Y gene is between SalI and SalI, and the Z gene is between SalI and EcoRI. The gene sequence between the HindIII and EcoRI sites corresponding to this XYZ is also shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
[0019]
Plasmid pM13Fv has the gene XYZ of the present invention inserted between the HindIII and EcoRI sites of plasmid pTZ19R (Pharmacia), which is a common phagemid vector. The X gene downstream of the vector-derived promoter has a first open reading frame following the SD sequence (Shine-Dalgarno sequence), secretory signal peptide and V_HA fusion polypeptide of the fragment-like polypeptide is encoded.
Furthermore, there is again an SD sequence downstream thereof, and the secretory signal peptide V_LA second open reading frame encoding a fragment-like polypeptide follows. V_LA restriction enzyme SalI site was present at the 3 'end of the gene (base Nos. 891-896 of SEQ ID NO: 5)._LFollowing the open reading frame of the gene is a Y gene containing the gene encoding the ΔcpIII polypeptide (SEQ ID NO: 1).
That is, the second reading frame contains the secretory signal peptide, V_LA fragment-like polypeptide encodes a fusion polypeptide of the ΔcpIII polypeptide. The Y gene is connected to the Z gene at a restriction enzyme SalI site (base numbers 1555 to 1560 in SEQ ID NO: 5) further downstream of the ΔcpIII polypeptide gene encoded by the Y gene. The Z gene is a gene containing a gene (SEQ ID NO: 3) encoding a polypeptide containing two Fc-binding domain-like structures of protein A.
[0020]
When pM13Fv having such a structure is completely digested with the restriction enzyme SalI, the Y gene is cut out, and if the Y gene is removed and self-ligated, the X gene and the Z gene are linked at the SalI site.
At this time, a polypeptide containing two Fc binding domain-like structures of protein A encoded by the Z gene is linked in a manner following the second open reading frame of the X gene. That is, after digestion of the plasmid pM13Fv with the restriction enzyme SalI to remove the Y gene, the second open reading frame encoded by the gene of the present invention contains a secretory signal peptide, V_LIt encodes a fragment-like polypeptide, a fusion polypeptide of a polypeptide comprising two Fc binding domain-like structures of protein A.
[0021]
In this plasmid pM13Fv, a Fv gene derived from a monoclonal antibody against chicken egg white lysozyme (hereinafter abbreviated as HEL) is inserted into a portion corresponding to the X gene. However, in fact, since there is a restriction enzyme site so that the Fv gene can be easily replaced, the X gene can be used assuming that the inserted Fv gene is simply a spacer sequence. That is, the plasmid pM13Fv was cut and inserted at the PstI site existing at base numbers 115 to 120 and the BstEII site existing at base numbers 438 to 444 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 in the above sequence listing. V_HAny Vs prepared by removing the gene and aligning the reading frame_HGenes can be inserted. The PstI-BstEII fragment that matches the reading frame may be a DNA synthesized using a DNA synthesizer, or a Vst synthesized to include a PstI site or a BstEII site by a conventionally used method._HIt may be a DNA fragment obtained by digesting a DNA fragment obtained by PCR using gene amplification primers with PstI and BstEII. Similarly, V_LThe gene also has a V between the SacI site present at base numbers 583-588 and the SalI site present at base numbers 891-896 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 in the sequence listing._LIt can be replaced with a DNA fragment encoding the gene. However, in the case of this plasmid pM13Fv, since there is also a SalI site between the Y gene and the Z gene, the SalI digestion is partially digested to prepare a vector.
[0022]
The construction method of this plasmid pM13Fv will be briefly described. Plasmid pSW1V encoding Fv fragment from monoclonal antibody D1.3 against HEL_HD1.3V_KD1.3 (Journal of Molecular Biology, Vol. 13, pp. 617-619 (1990)) was assigned by Dr. Greg Winter (Cambridge, UK). However, the transferred plasmid was slightly different from the sequence described in the literature. This plasmid pSW1V_HD1.3V_KD1.3 has a gene encoding an Fv fragment inserted between HindIII-EcoRI of plasmid pUC19. The sequence of this HindIII-EcoRI insertion fragment is shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
[0023]
This plasmid pSW1V_HD1.3V_KV of D1.3_HA HindIII-SmaI fragment containing the gene is inserted into the HindIII and SmaI sites of pTZ19R (Pharmacia) to construct a plasmid T19VH. Also, V_LThe SmaI-EcoRI fragment containing the gene is inserted into the SmaI and EcoRI sites of pTZ18R (Pharmacia) to construct a plasmid T18VL. Using this plasmid T18VL as a template, a primer VL3'SalI having a restriction enzyme EcoRI recognition sequence and a SalI recognition sequence represented by SEQ ID NO: 7 in the sequence listing, and a primer UPMCS represented by SEQ ID NO: 8 in the sequence listing by PCR method. After amplifying the DNA, the DNA is digested with HindIII and EcoRI to obtain a DNA fragment. This is inserted into the HindIII and EcoRI sites of plasmid pTZ18R to obtain plasmid T18VLS. V of this plasmid T18VLS_LThe SmaI-EcoRI fragment containing the gene is inserted into the SmaI and EcoRI sites of the previously constructed plasmid T19VH to obtain the plasmid T19VHVLS. Next, using the plasmid pEZZ18 (Pharmacia) as a template and the primer ProA5 'shown in SEQ ID NO: 9 and the primer ProA3' shown in SEQ ID NO: 10, the Fc-binding domain of protein A A DNA containing a gene encoding a polypeptide containing two structures is amplified. This DNA is digested with restriction enzymes SalI and EcoRI, and inserted into the SalI and EcoRI sites of plasmid pTZ18R to obtain plasmid T18PA. A SalI-EcoRI fragment containing a gene encoding a polypeptide containing two Fc-binding domain-like structures of protein A of plasmid T18PA is inserted into the SalI and EcoRI sites of plasmid T19VHVLS to obtain plasmid pFv-PP. Next, using the plasmid M13mp18 as a template and the primer cpIII 5'-1 shown in SEQ ID NO: 11 and the primer cpIII 3 'shown in SEQ ID NO: 12 as a template, the C-terminal polypeptide of cpIII was encoded by PCR. DNA containing the gene to be amplified is amplified. After digesting this DNA with the restriction enzyme SalI, it is inserted into the SalI site of the plasmid pFv-PP. At this time, the V of plasmid pFv-PP_LFollowing the gene, the plasmid into which the sequence derived from the primer cpIII 5′-1 was inserted is pM13Fv. Escherichia coli JM109 into which the plasmid pM13Fv thus constructed has been introduced has been named and designated Escherichia coli JM109 / pM13Fv, and has been deposited with the National Institute of Bioscience and Human Technology as FERM P-13698.
[0024]
The use of the gene of the present invention enables the following.
First, the gene of the present invention is used by being incorporated into a phagemid vector. If a gene encoding an antibody variable site is inserted into the X gene of the present invention in the presence of the Y gene, a so-called phage-displayed antibody library in which the antibody variable site is displayed on its surface can be constructed. As a method for obtaining the antibody gene, according to a conventionally used method, cDNA is synthesized from RNA containing antibody mRNA obtained from animals including humans or cultured cells derived therefrom, and then PCR is performed. Genes containing natural antibody variable sites can be amplified. This may be incorporated into the gene of the present invention so that the antibody variable site is expressed. Alternatively, a gene encoding a synthetic antibody variable site prepared so as to encode various kinds of amino acids using synthetic DNA may be used. In this case, the effect can be expected by introducing a large number of mutations into the hypervariable region which directly acts on the antigen, particularly because the amino acid substitution is particularly large among the antibody variable sites.
[0025]
When a phage displaying an antibody molecule having the desired antigen-binding ability is selected from the phage-displayed antibody library displaying the antibody variable sites thus constructed, the X 'gene is prepared so as to express the Fv fragment. Very useful if you have. This is because the present inventors have found, as a result of earnest efforts, a method for controlling the number of Fv molecules having antigen-binding ability expressed on the phage surface. The Fv fragment exhibits its antigen binding ability_HFragment and V_LWhen the fragments are combined and exist as an Fv fragment,_HFragment or V_LThe binding ability of the fragment alone is very low.
[0026]
By utilizing this property, the Fv fragment expressed on the phage surface can be converted to V_HFragment and V_LBy dissociating the fragments into fragments, the number of antigen-binding Fv molecules that exist on the phage surface can be reduced to about one. This can be done in a step with a mild washing treatment with the detergent sarkosyl, and this step has no effect on the infectivity of the phage particles. When an antibody molecule is displayed on a phage particle using a phagemid vector, the number of the antibody molecules cannot be controlled. When two or more antibody molecules are present on the phage surface, even if the affinity of the antibody molecule is low, the overall avidity is high, and in the case of affinity screening using an antigen, it is as if the affinity is high. act. At this time, if the number of Fv molecules can be controlled to about one without impairing the infectivity of the phage particles, a phage particle displaying a high affinity antibody molecule can be expected. V_HFragment and V_LSuch control is difficult in scFv in which the fragments are connected by a covalent bond or in a phage-displayed antibody library displaying Fab. Further, it is easy to recover the gene encoding the Fv fragment from the obtained phage particles displaying the Fv molecule, and to convert the gene into a scFv fragment or a Fab fragment. That is, Escherichia coli is infected with the obtained phagemid particles, and the plasmid is recovered. From this plasmid, the desired V_HGenes and V_LThe gene may be taken out and put back into a plasmid constructed so that it can be expressed in the form of scFv fragment or Fab fragment.
[0027]
After the phage particles displaying the desired antibody variable site are obtained, when the gene of the present invention used is X'-YZ, it can be easily converted to a practically useful form. That is, Escherichia coli is infected with the obtained phagemid particles, and the plasmid is recovered. Thereafter, as described above, when the Y gene is removed and converted into the X'-Z form, the plasmid expresses a fusion polypeptide of the polypeptide containing the antibody variable site and the polypeptide having Fc binding ability encoded by the Z gene. Is converted to
[0028]
The fusion polypeptide of the polypeptide containing the antibody variable site and the polypeptide having Fc binding ability is very useful. That is, first of all, purification is easy. For example, a fusion polypeptide can be recovered from a culture using a resin on which a polypeptide or protein containing Fc is immobilized. Second, a stable multivalent antibody complex is formed by mixing the fusion polypeptide with a polypeptide or protein containing Fc, such as human IgG. Since it is polyvalent, the binding stability to the antigen is higher than that when it is monovalent, and it is useful when used for ELISA, Western blotting or the like. In addition, detection is facilitated and useful due to the properties of the polypeptide containing Fc to be mixed. When using the gene X'-Z of the present invention to prepare such a fusion polypeptide, the polypeptide containing the antibody variable site encoded by the X 'gene may be an Fv fragment, scFv fragment, Fab fragment, or the like. Anything is valid.
[0029]
In addition, a polyclonal artificial antibody can be prepared by using the gene of the present invention. That is, a library of genes encoding antibody variable sites is prepared, and then incorporated into the X gene to prepare an X'-YZ gene library. Next, a phage is transformed with the X'-Y gene library, and a group of X'-Y genes having antigen binding properties is selected. Next, a polyclonal artificial antibody can be prepared by expressing the X'-Z gene group having the selected X 'gene group. The polyclonal artificial antibody is also useful in fields such as antigen purification, antigen measurement, and diagnosis.
[0030]
As described in detail above, by using the gene of the present invention, it is possible to select an antibody molecule having a particularly high affinity among antigen-specific antibody molecules, and to provide an artificial antibody having a higher avidity. It has become possible.
[0031]
【Example】
Next, examples are shown, but these do not limit the present invention.
[0032]
Example 1 Construction of expression plasmid
Plasmid pSWIV encoding the Fv fragment from monoclonal antibody D1.3 against HEL_HD1.3V_KD1.3 was assigned by Dr. Greg Winter (Cambridge, UK). However, the transferred plasmid was slightly different from the sequence described in the literature. This plasmid pSWlV_HD1.3V_KD1.3 has a gene encoding an Fv fragment inserted between HindIII and EcoRI of pUC19. The sequence of this HindIII-EcoRI insert is shown in SEQ ID NO: 6.
[0033]
(1-1) Construction of plasmids pFv-PP and pFv-P
Plasmid pSW1V_HD1.3V_KD1.3 was digested with restriction enzymes HindIII and SmaI and separated by agarose gel electrophoresis._HA DNA fragment of about 470 bp containing the gene was extracted and purified. This DNA fragment was inserted into the HindIII and SmaI sites of plasmid pTZ19R (Pharmacia) to obtain plasmid T19VH. In addition, plasmid pSW1V_HD1.3V_KD1.3 was digested with restriction enzymes EcoRI and SmaI and separated by agarose gel electrophoresis._LA DNA fragment of about 450 bp containing the gene was extracted and purified. This DNA fragment was inserted into the EcoRI and SmaI sites of plasmid pTZ18R (Pharmacia) to obtain plasmid T18VL. Using this plasmid T18VL as a template, PCR was performed using a restriction enzyme EcoRI recognition sequence shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing, a primer VL3'SalI having a SalI recognition sequence and a primer UPMCS which is a sequence derived from pTZ18R shown in SEQ ID NO: 8. The amplified DNA was digested with restriction enzymes HindIII and EcoRI. This was separated by agarose gel electrophoresis, and HindIII and EcoRI fragments were extracted and purified.
This DNA fragment was inserted into the HindIII and EcoRI sites of plasmid pTZ18R to obtain plasmid T18VLS. This plasmid T18VLS_lIt has a restriction enzyme SalI recognition sequence at the 3 'end of the gene.
This plasmid T18VLS was digested with restriction enzymes EcoRI and SmaI and separated by agarose gel electrophoresis._LA DNA fragment of about 430 bp containing the gene was extracted and purified. This DNA fragment was used to construct V_HThe gene was inserted into the EcoRI and SmaI sites of the plasmid T19VH having the gene to obtain the plasmid T19VHVLS. This plasmid, T19VHVLS, contains the VTZ downstream of the pTZ19Rlac promoter._HGene, V_LIt has a gene.
[0034]
Next, using plasmid pEZZ18 (Pharmacia) as a template, a primer ProA5 ′ having a restriction enzyme SalI recognition sequence shown in SEQ ID NO: 9 of the sequence listing and a primer ProA3 having a restriction enzyme EcoRI recognition sequence shown in SEQ ID NO: 10 'Was used to amplify DNA by the PCR method.
The amplified DNA containing the gene encoding the polypeptide containing two Fc binding domain-like structures of protein A (SEQ ID NO: 3) was digested with restriction enzymes SalI and EcoRI, subjected to agarose gel electrophoresis, and subjected to approximately 390 bp DNA. The fragment was extracted and purified. This DNA fragment was introduced into pTZ18RSalI and EcoRI sites to obtain a plasmid T18PA. Next, this plasmid T18PA was digested with restriction enzymes SalI and EcoRI and subjected to agarose gel electrophoresis to extract and purify a DNA fragment of about 390 bp.
[0035]
This DNA fragment was inserted into the SalI and EcoRI sites of the previously obtained plasmid T19VHVLS to construct a plasmid pFv-PP.
This plasmid pFv-PP_HFragment and V_LEncodes a fusion polypeptide containing two protein A Fc binding domain-like structures (58 amino acid residues of SEQ ID NO: 4) at the C-terminus of the fragment. This plasmid pFv-PP was digested with a restriction enzyme MluI to remove a free DNA fragment of about 170 bp, followed by self ligation to obtain a plasmid pFv-P. This plasmid pFv-P_HFragment and V_LA fusion polypeptide containing one Fc-binding domain-like structure of protein A encoded by the gene represented by SEQ ID NO: 2 at the C-terminus of the fragment is encoded.
[0036]
(1-2) Construction of plasmid pM13Fv
Using plasmid M13mp18 (Takara Shuzo) as a template, a primer cpIII 5'-1 having a restriction enzyme SalI recognition sequence shown in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing, and a restriction enzyme SalI recognition sequence and NheI recognition shown in SEQ ID NO: 12 PCR was performed using the primer cpIII 3 'having a sequence to amplify DNA encoding the C-terminal polypeptide of cpIII. This DNA was digested with a restriction enzyme SalI and subjected to agarose gel electrophoresis to extract and purify a DNA fragment of about 650 bp. This DNA fragment was inserted into the SalI site of the plasmid pFv-PP obtained in Example (1-1). Of the plasmids obtained, V_LA plasmid in which a sequence derived from the primer cpIII 5′-1 was inserted after the gene in the connected direction was designated as plasmid pM13Fv.
[0037]
This plasmid pM13Fv_HFragment and V_LIt is constructed to express a fusion polypeptide in which a polypeptide (ΔcpIII) on the C-terminal side of cpIII, which is encoded by the gene represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, is connected to the C-terminal of the fragment.
Further, FIG. 1 shows a schematic diagram of a DNA fragment inserted into HindIII-EcoRI of this plasmid pM13Fv, and its nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO: 5 in the sequence listing. The plasmid pM13Fv can be easily converted into the plasmid pFv-PP constructed in Example (1-1) by performing self-ligation after digestion with the restriction enzyme SalI. Escherichia coli JM109 into which the plasmid pM13Fv was introduced was designated as Escherichia coli JM109 / pM13Fv and deposited with the National Institute of Bioscience and Human Technology as FERM P-13698.
[0038]
Similarly, PCR was performed using plasmid M13mp18 as a template, primer cpIII 5′-2 having a restriction enzyme SalI recognition sequence shown in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing, and primer cpIII 3 ′ used previously, The amplified DNA was digested with SalI, and inserted into the SalI site of plasmid pFv-PP to construct plasmid pM13ΔFv. This plasmid pM13ΔFv has almost the same gene sequence as pM13Fv, but contains a termination codon in the sequence of the primer cpIII 5′-2._LA stop codon appears in the open reading frame between the gene and the ΔcpIII gene.
Therefore, pM13ΔFv is V_HFragment and V_LIt is constructed to express only the fragment.
[0039]
Example 2 Expression of Fv fragment on phage surface and analysis of its properties
(2-1) Preparation of Fv-displaying phage particles
Escherichia coli BMH71-18 was transformed using the plasmid pM13Fv obtained in Example (1-2) to obtain Escherichia coli BMH71-18 / pM13Fv.
As a control, E. coli BMH71-18 / pM13ΔFv obtained by transforming E. coli BMH71-18 using pM13ΔFv was used.
These two types of Escherichia coli were inoculated into 2 × TY medium (1.6% bactotryptone, 1% yeast extract, 0.5% NaCl) and cultured with shaking at 30 ° C. overnight.
4 ml of this culture was inoculated into 12 ml of 2 × TY medium and cultured at 30 ° C. for 1 hour. 2 ml of M13K07 phage solution (1 × 10¹²(pfu / ml), the culture was incubated at 30 ° C. for an additional hour. This culture solution was inoculated in 3 ml portions into 6 500 ml 2 × TY media containing 70 μg / ml kanamycin, and cultured at 30 ° C. for 24 hours. Similarly, M13K07 phage was prepared using Escherichia coli BMH71-18 having no plasmid as a host. The cells were removed from each culture by centrifugation to obtain a supernatant.
[0040]
To 3 liters of culture supernatant, 1 liter of PEG / NaCl (20% polyethylene glycol 6,000 and 2.5 M NaCl) was added and the resulting mixture was allowed to stand at 4 ° C. overnight. The phage was centrifuged to produce a pellet. The precipitate was divided into three equal parts and each pellet was prepared in three different ways. First, 300 ml of TE (10 mM Tris / HCl buffer, pH 8.0, 1 mM EDTA) at room temperature for 1 hour, and secondly, 300 ml of TES (containing 0.1% sarkosyl). TE) for 1 hour at room temperature, and thirdly, in 300 ml TES for 18 hours at room temperature and spun. Phage was precipitated again by adding 100 ml of PEC / NaCl to the phage solution treated with these three types. The precipitate was dissolved in NET (10 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0, 0.1 M NaCl, and 1 mM EDTA) by spinning at 4 ° C. overnight. Phage were collected by centrifugation at 170,000 xg for 3 hours and dissolved in NET. Finally, purification of the phage was performed by centrifuging at 36,000 rpm for 1 hour using gradient CsCl ultracentrifugation. The phage band was collected and dialyzed against NET to obtain a phage solution. A phage obtained from Escherichia coli BMH71-18 / pM13Fv was named M13Fv, and a phage obtained from Escherichia coli BMH71-18 / pM13ΔFv was named M13ΔFv. The following analysis was performed on the three kinds of phage solutions thus prepared, M13Fv, M13ΔF, and helper phage M13K07, each of which was purified after the above-mentioned three kinds of treatments.
[0041]
(2-2) Measurement of infectivity of phage and phagemid
Colony-forming ability and plaque formation of a phage solution obtained by treating three kinds of phages (M13Fv, M13ΔFv, M13K07) obtained in Example (2-1) with three kinds (no treatment, sarcosyl washing for 1 hour, sarkosyl washing for 18 hours) Noh was measured. That is, these phage solutions were appropriately serially diluted using NET. 100 μl of this phage solution was added to the logarithmic growth phase (OD₆₀₀  = 0.8) of Escherichia coli XLI-Blue (Stratagene) and left at room temperature for 45 minutes. Of these, 100 μl was directly spread on a 2 × TY medium plate containing 50 μg / ml ampicillin, incubated at 37 ° C. overnight, and the number of colonies that appeared was counted. Separately, 100 μl was mixed with 4 ml of soft agar (agar dissolved in 2 × TY medium to 0.65% agar) kept at 50 ° C., spread on a 2 × TY medium plate, and solidified. . This was kept at 37 ° C. overnight, and the number of plaques appeared was counted. Table 1 shows the results. That is, Table 1 compares the colony forming ability and plaque forming ability of the obtained phage solution.
[0042]
[Table 1]

[0043]
The molar extinction coefficient per phosphate group at 260 nm of fdDNA in virions has been determined to be 6750. The length of the DNA of M13K07 is 6.4 kb, and the length of the DNA of M13Fv and M13ΔFv is 4.8 kb. D.₂₈₀  The phage of the unit (hereinafter abbreviated as DU) is about 1.3 × 10 3 for M13K07.^ThirteenPhage particles and about 1.8 × 10 for M13Fv and M13ΔFv.^ThirteenPhage particles. The results of the sample not subjected to the sarcosyl treatment showed that M13K07 was 0.25 PFU / phage particle, and M13Fv and M13ΔFv were about 0.06 CFU / phage particle. Plaques formed by bacteria infected with M13Fv as well as M13ΔFv appeared to have been derived from helper phage, suggesting that about 10% of the phage in the preparation were helper phage. The infectivity of these three phage particles can be totally impaired by treatment with 0.1% sarkosyl solution for 1 hour (gentle washing) or 18 hours (sufficient washing). Did not.
[0044]
(2-3) Analysis of Fv fragment expressed on phage surface
Phage 11.2DU prepared after each of the three treatments of M13Fv, M13ΔFv, and M13K07 prepared in Example (2-1) were combined with 10% Tris-acetate buffer containing 5% SDS and 1% β-mercaptoethanol ( (pH 5.4) dissolved in 1 ml and stirred for 24 hours at room temperature. After neutralization with 1N NaOH, MgCl was added to a final concentration of 0.1M.₂  Was added. After centrifugation at 150,000 × g for 12 hours at 20 ° C., the supernatant was taken out and boiled for 2 minutes. An equal volume of sample buffer for SDS-PAGE was added, and 15 μl (equivalent to 0.075 DU) was subjected to 16% SDS-PAGE. After the electrophoresis, blotting was performed on a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (Millipore) using a semi-dry blotter. This membrane was blocked by immersing it in 1% bovine serum albumin (BSA) and keeping it at room temperature for 1 hour. As a primary antibody, an anti-D1.3Fv fragment rabbit antibody (a serum obtained by immunizing a rabbit with D1.3Fv and purified by a D1.3Fv-immobilized column, hereinafter abbreviated as anti-D1.3 antibody) is 0.05%. The cells were immersed in a phosphate buffer solution containing Tween 20 (hereinafter abbreviated as PBS / T), kept at room temperature for 4 hours, and then washed three times with PBS / T. For detection, an ECL western blotting detection system (Amersham) using an anti-rabbit IgG donkey antibody conjugated to horseradish peroxidase was used. The result is shown in FIG. That is, FIG. 2 is a diagram comparing the amounts of Fv fragment-derived polypeptides remaining in the phage coat protein when the linear phages M13Fv, M13ΔFv, and M13K07 were treated with a solution containing the surfactant sarkosyl.
[0045]
Although the Fv fragment in M13ΔFv is not expected to adsorb to the surface of M13 phage, Western blotting shows that_HA band corresponding to the fragment and size appeared. However, when the phage was washed with a 0.1% sarkosyl solution for 1 hour, this band completely disappeared. On the other hand, in the case of M13Fv, two bands, ie, V_HOne thick band corresponding to the fragment and V_LAnother band corresponding to the fusion of the fragment with ΔcpIII was clearly detected. When the phage was washed with a 0.1% sarkosyl solution for 1 hour,_HAlthough the band corresponding to was weakened, both bands remained. When the phage is thoroughly washed for 18 hours, V_HBand disappeared completely, but V_LThe fusion of the fragment with ΔcpIII remained on the phage without loss in quantity.
As described above, V_HFragment and V_LBoth fragments are expressed on the phage surface in an associated form, and by treatment with sarkosyl solution,_HOnly the fragments are removed from the phage surface.
[0046]
Next, in order to quantify the Fv fragments expressed on the surface of the phage M13Fv, 0.075 DU of phage and a D1.3 Fv fragment of known concentration were also analyzed by Western blotting in the same manner. The result is shown in FIG. That is, FIG. 3 is a diagram comparing the amounts of Fv fragment-derived polypeptides expressed on the surface of the filamentous phage M13Fv.
V expressed on M13Fv phage after 1 hour wash with sarkosyl solution_HBand appeared to correspond to 1 ng of Fv fragment.
To each lane, total protein prepared from 0.075 DU of phage was added. Since the molecular mass of the Fv fragment is 24.7 kDa, 1 ng of the Fv fragment is 2.4 × 10¹⁰Corresponding to one molecule. This suggests that about 2% of the phages express Fv molecules when preparing M13Fv phages treated with a 0.1% sarkosyl solution for 1 hour. But V_HSome of the fragments would have been removed from the phage surface by washing with sarkosyl solution.
In fact, the V when preparing M13Fv phage without washing_HThe intensity of the band of V was V in the case of the sample washed for 1 hour._HSeveral times higher than the band intensity. In the same manner as described for the case where M13ΔFv was prepared without washing, free V_HIt is difficult to estimate the exact amount of Fv fragment, as the fragment may have non-specifically contaminated this fraction. Also, the process of preparing the protein from the phage particles would have caused a substantial loss of protein. Therefore, the true rate of M13Fv expressing Fv molecules should be much higher than the above estimate.
As described above, the M13Fv phage actually expresses the Fv molecule on its surface, and the ratio of the M13Fv phage that expresses the Fv molecule on the surface is estimated to be 5% or more. You.
[0047]
(2-4) Analysis of antigen binding property of Fv fragment expressed on phage surface
The antigen-binding property of the Fv fragment expressed on the phage surface was examined by a BIA core system (BIA core system; Pharmacia) using surface plasmon resonance. HEL or anti-D1.3 antibody was chemically coupled to the biosensor chip support according to the manufacturer's instructions by the amine coupling method. All experiments were performed with HBS (10 mM HEPES, pH 7.4, 3.4 mM EDTA, 150 mM NaCl, and 0.5% Tween 20) at 30 ° C. at a flow rate of 5 μl / min.
[0048]
After dialyzing all nine phage solutions obtained in Example (2-1) against HBS, five concentrations (3.7, 1.8, 0.9, 0.45, 0.23 DU) were obtained. / Ml), and 20 μl was poured into the HEL-immobilized sensor chip. The results are shown in FIGS. That is, FIGS. 4 to 12 correspond to FIGS. 4 to 6, FIGS. 7 to 9, and FIGS. RU), and the horizontal axis indicates time (seconds). Similarly, after injecting 20 μl of a phage having a concentration of 3.7 DU / ml, an anti-M13 phage rabbit antibody (a serum obtained by immunizing a rabbit with M13 phage and purified by an M13 phage-immobilized column; M13 antibody) to further amplify the signal. The result is shown in FIG. That is, FIG. 13 is a diagram showing the results of the surface plasmon resonance sensor when the phage was loaded on the HEL-immobilized sensor chip and then the anti-M13 antibody was further loaded, where the vertical axis represents the resonance unit (RU) and the horizontal axis represents the Indicates time (seconds). Further, in order to examine whether a polypeptide derived from the D1.3Fv fragment was present on the surface of the phage, 20 μl of a phage solution having a concentration of 3.7 DU / ml was injected into a sensor chip on which an anti-D1.3Fv antibody was immobilized. FIG. 14 shows the result. That is, FIG. 14 is a diagram showing the results of a surface plasmamon resonance sensor when phages were injected into an anti-D1.3 antibody-immobilized sensor chip. ).
[0049]
The results shown in FIGS. 4 to 14 are summarized above.
As shown in FIGS. 4 and 5, neither M13K07 nor M13ΔFv bound to HEL. The shift of the baseline may be due to differences in the state of the sample, ie, solute, pH, and / or ionic strength. The resonance unit (RU) generated by the binding was about 200 RU for the 3.7 DU / ml phage solution, which was much higher, but M13Fv clearly bound to HEL (FIG. 6). Judging from the shape of the dissociation curve, part of the phage rapidly dissociated from HEL (K_off= 3 × 10^-2S^-1), The remaining phage appeared to dissociate very little (K_off= 1 × 10^-3S^-1). This suggested that these phages contained different forms of phage. That is, it was predicted that there might be a phage expressing only one Fv molecule on the surface and a phage expressing a plurality of Fv molecules on one phage particle surface. This was supported by the results obtained with the M13Fv preparation that was washed with the sarkosyl solution for 1 hour (FIG. 9). As shown in FIG. 9, the curve for dissociating M13Fv phage washed with sarkosyl for 1 hour from HEL resulted in a simple pattern expected for phage antibodies with a single antigen binding site (K_off= 3 × 10^-2S^-1). M13Fv thoroughly washed with sarkosyl solution completely abolished HEL binding activity (FIG. 12).
[0050]
Phage antibodies bound to HEL on the sensor chip were detected directly by loading anti-M13 antibody. From FIG. 13, it can be seen from FIG. 13 that the addition of the anti-M13 antibody increases RU in the case of M13Fv not washed with sarkosyl, decreases RU when washed with sarkosyl solution, and binds to HEL when washed sufficiently. It was suggested that the phage disappeared to the background level. These results directly demonstrated that phage expressing Fv fragments on the surface bind to HEL. The effect of washing with sarkosyl solution on HEL binding activity was determined by_HIt is thought to be due to the fragment being removed. That is, as shown in FIG. 14, the binding of M13Fv to the anti-D1.3 antibody molecule was not significantly affected by washing with the sarkosyl solution. Anti-D1.3 antibody is V_HNot only fragments but V_LThese results indicate that the sarcosyl washes removed from the phage surface as they also bind to the fragment._HFragment only, V fused to ΔcpIII_LIt is suggested that the fragment remains adsorbed on the surface of the phage after washing with sarkosyl. The results of the analysis using the BIA core system completely agree with the results of the Western blotting obtained in Example (2-3).
[0051]
As described above, a part of the M13Fv phage expresses two or more Fv molecules on one phage particle surface, and is displayed on the phage surface by gently washing with a sarkosyl solution. It was concluded that it was possible to control the valency and the kinetic properties of the dissociated antibodies.
[0052]
Example 3 Preparation of Artificial Antibody with High Binding Using Fv Fragment Fused to Polypeptide Containing Fc Binding Domain-Like Structure
(3-1) Preparation of Fv fragment fused to polypeptide containing Fc binding domain-like structure
Plasmid pFv-P, plasmid pFv-PP and plasmid pSW1V constructed in Example (1-1)_HD1.3V_KD1.3 was used to transform E. coli BMH71-18, and E. coli BMH71-18 / pSW1V was transformed._HD1.3V_KD1.3, E. coli BMH71-18 / pFv-PP, and E. coli BMH71-18 / pFv-P were obtained. These three types of Escherichia coli were inoculated into a 2 × TY medium containing 100 μg / ml ampicillin and 0.1% glucose, and cultured with shaking at 30 ° C. overnight. 10 ml of this culture was inoculated into 1 liter of 2 × TY medium containing 100 μg / ml ampicillin and 0.1% glucose, and cultured with shaking at 30 ° C. (2 liters each). The turbidity of the culture was measured at O.O. D.₆₀₀  = 0.8, IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) was added to a final concentration of 1 mM, followed by shaking culture at 30 ° C. for 36 hours. The cells were removed from each culture by centrifugation to obtain a supernatant.
Two liters of each of the obtained supernatants was filtered through a 0.45 μm filter using a Pellicon cassette (Millipore). After concentration with a filter having a molecular weight cutoff of 10,000, the mixture was replaced with a binding buffer [10 mM Tris-HCl buffer pH 8.0, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride)].
[0053]
To purify the Fv fragment from this concentrate, an affinity gel obtained by immobilizing HEL on Reacti-Gel (Pierce) was used. For purification of Fv-P and Fv-PP, IgG Sepharose 6FF (Pharmacia) was used. Was used.
That is, 10 ml of each affinity gel was added to 200 ml of the concentrated solution. The mixture was gently spun at 4 ° C. for 24 hours and washed 5 times with binding buffer. The gel was packed in a column, and the Fv fragments and the like bound to the affinity gel were eluted with 50 mM glycine / HCl buffer (pH 2.5) and 150 mM NaCl. The eluate was quickly neutralized with 1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) and dialyzed against 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 200 mM NaCl at 4 ° C. overnight. E. coli BMH71-18 / pSW1V_HD1.3V_KD1.3, Escherichia coli BMH71-18 / pFv-PP, Fv fragment-derived polypeptides obtained from Escherichia coli BMH71-18 / pFv-P cultures were named Fv, Fv-PP, Fv-P, and were used in the following analyses. Using.
[0054]
First, a part of the obtained Fv, Fv-P, and Fv-PP was separated by SDS-PAGE, and then stained and detected with Coomassie brilliant blue R250. The result is shown in FIG. That is, FIG. 15 is a diagram showing the results of SDS-PAGE of Fv, Fv-P, and Fv-PP purified by the affinity resin. As shown in FIG._HPart and V_LThe moieties are in each case associated in a molar ratio of 1: 1 to form the Fv shape. In addition, the results of the affinity chromatography showed that the portion derived from protein A had IgG binding activity.
[0055]
(3-2) Analysis of physical characteristics of Fv portion of Fv, Fv-P, Fv-PP
Fv, Fv-P and Fv-PP associate with HEL for association constant (K_A) And association enthalpy (ΔH) were measured by calorimetry using an OMEGA titration calorimeter from Microcal (referred to as DTC analysis).
That is, the calorimeter was automatically operated using a 100 μl syringe for injection so as to perform 24 injections one after another at 2-minute intervals.
During 15 seconds, 5 μl of the HEL solution was added to the cell of the calorimeter containing 1.36 ml of the sample solution. Prior to performing the calorimetry, the O.D. D.₂₈₀  The HEL concentration was accurately measured by measuring and fixed at 0.02028 mM. The concentration of Fv, Fv-P, and Fv-PP in the calorimeter cell was adjusted to about 0.01 mM, and was accurately calculated from the data of DTC analysis. Binding experiments using a calorimeter were performed at 30 ° C. in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) and 200 mM NaCl.
[0056]
From the obtained data, the values of ΔG and −TΔS were also calculated. Tables 2 and 3 summarize the data. That is, Tables 2 and 3 show thermodynamic and kinetic parameters relating to the binding of the Fv fragment to HEL.
[0057]
[Table 2]

[0058]
[Table 3]

[0059]
K of Fv 及 び P and Fv-PP_AIs the K of Fv_ASlightly smaller than the value of. These differences appear to be due to a slight reduction in the enthalpy term when analyzing these fusion proteins. Next, Fv, Fv-P, and Kv when Fv-PP reacts with HEL_on  Was measured by a fluorescence quenching method using a stopped flow apparatus (model SF.17MV, Applied Photophysics). The concentration of HEL was increased by 2 μM from 6 μM to 16 μM, and the concentrations of Fv, Fv-P and Fv-PP were fixed at 1 μM.
Next, 50 μl of each solution was mixed at a 1: 1 volume ratio. The wavelength of the excitation light was 280 nm, and fluorescence having a wavelength of 320 nm or more was detected. The experiment was performed 13 times at 30 ° C., and the average value of the data was used for further analysis. A non-linear regression analysis was performed as described in the software manual provided by Applied Photo Physics, and the apparent reaction rate (K_app) Was measured.
[0060]
In this method, a false first-order condition is assumed, and the following equation (Equation 1):
[0061]
(Equation 1)
K_app  = K_on[A]₀    + K_off
[0062]
Is assumed to be valid. [A] in the formula₀  Corresponds to the initial concentration of HEL. Experimentally, changing the concentration of HEL under conditions such that the HEL is_appWas measured at each concentration. K_onIs [A]₀  K for_appCalculated from the slope value of the graph in FIG. K_offIs [A]₀  K when is equal to 0_app, But K_offWas too small to measure experimentally with this method. So K_offIs K_on/ K_ACalculated from K_AWas measured by DTC as described above. Table 3 shows the K for the three molecules._onAnd K_offShows the value of As shown in Table 3, the larger the molecule, the more the K_onIs small and K_offIs large, but when these molecules are compared, K_onAnd K_offThis difference was not great.
As described above, when the results of the DTC analysis and the stopped flow analysis are summarized, the physical characteristics of the Fv portion were substantially the same in all of Fv, Fv-P, and Fv-PP. .
[0063]
(3-3) Analysis of IgG and Fv-P, Fv-PP complex
Thermodynamic parameters of Fv-P and Fv-PP associating with human IgG were measured by DTC. First, based on the data obtained in the binding experiment using Fv-P, Fv-PP, and HEL, the concentration of Fv-P in the calorimeter cell was adjusted to 0.0100 mM, and the concentration of Fv-PP was adjusted. Was adjusted to 0.0050 mM. The concentration of human IgG (Sigma, # I-4506) in a 200 μl syringe was adjusted to about 0.04 mM. 12.5 μl of the IgG solution was put into a calorimeter cell containing 1.36 ml of Fv-P or Fv-PP solution 23 times. IgG concentrations were calculated from the data obtained by DTC analysis.
[0064]
The results of the DTC analysis are shown in FIG. 16 for Fv-P and in FIG. 17 for Fv-PP. That is, FIG. 16 and FIG. 17 are diagrams showing the results of DTC analysis on the binding between Fv-P and Fv-PP and human IgG, respectively, in which the vertical axis represents the calorific value (extracts kcal / mol and μcal / sec) The horizontal axis indicates the input number and the time (second). The thermodynamic parameters calculated therefrom are shown in Tables 4 and 5. That is, Tables 4 and 5 are tables showing thermodynamic parameters relating to binding between Fv-P and Fv-PP to human IgG.
[0065]
[Table 4]

[0066]
[Table 5]

[0067]
The affinity of Fv-PP for IgG was about 10-fold higher than Fv-P, which appeared to be mainly from the entropy term. However, judging from the molar ratio of the concentration of the reactant at the inflection point in FIGS. 16 and 17, one IgG molecule has a maximum of two Fv-P molecules, and two IgG molecules have a maximum of two IgG molecules. Can bind to two Fv-PP molecules, so that the protein A domains of both Fv-P and Fv-PP have Fv-binding activity. There may be differences in the stability of the protein A domain and the physical accessibility of the Fc portion. In the combination of Fv-PP and IgG, abnormal heat adsorption was observed after reaching the saturation point (FIG. 17). In the sequential titration experiment, the molar ratio changes abruptly, that is, from a condition in which Fv-PP is excessive with respect to IgG, to a condition in which IgG is excessive. This heat adsorption suggests that the complex is rearranged when IgG is present in excess relative to Fv-PP.
[0068]
The molecular form of Fv-P or the complex formed between Fv-PP and IgG was further investigated by HPLC.
Two types of HPLC columns, G3000SW and G2000SW (Tosoh Corporation), were connected in series. All operations were performed at room temperature, and a 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 200 mM NaCl was used as a running buffer. 15 μl of a 5 μM human IgG solution or 15 μl of a 10 μM Fv, Fv-P or Fv-PP solution was first loaded into the instrument. When analyzing the shape of the complex, Fv, Fv-P, or Fv-PP (final concentration in each case 10 μM) was mixed with human IgG (final concentration 5 μM) and incubated for 1 hour at room temperature. , 15 μl of the mixture was charged to the HPLC apparatus. The absorption at 245 nm was monitored. FIG. 18 shows the result. 18 shows the results of Fv, Fv-P, Fv-PP and their IgG mixtures by HPLC. D.₂₄₅  The horizontal axis indicates time (minutes).
[0069]
The expected molecular mass was as follows.
V_HDomain, 12,831 Da; V_LDomain, 11,877 Da; V fused to one domain of protein A_LDomain, 19,341 Da; V fused to two protein A domains_LDomain, 25,963 Da; human IgG, 146,000 Da (average).
From the elution curves of Fv, Fv-P, and Fv-PP, V_HDomain and V_LThe domains were shown to be closely associated with each other. The elution curve for human IgG contained one large peak and one small peak. The smaller peak corresponds to the IgG dimer.
As expected, the elution curve for the mixture of Fv and IgG was a simple combination of the different elution curves for IgG and Fv, demonstrating that no interaction occurred between these two molecules. . When Fv-P was mixed with IgG, a new substance peak (fraction A in FIG. 18) eluted slightly before the IgG peak.
Judging from the fact that the substances in the fractions of Fv-P and IgG are reduced and from the molecular weight, fraction A is a complex composed of one IgG molecule and two Fv-P molecules [( Fv-P)₂  IgG complex].
[0070]
When Fv-PP was mixed with IgG, a new small peak and a large peak (fraction B in FIG. 18) appeared. As in the case of Fv-P and IgG, fraction B is a complex of two IgG molecules and three Fv-PP molecules [(Fv-PP)₃  (IgG)₂  (Referred to as a complex).
[0071]
This (Fv-PP)₃  (IgG)₂  The complex also formed selectively when the Fv-PP and IgG concentrations in the mixture were reduced by a factor of 10. Also, judging from the elution curve, this (Fv-PP)₃  (IgG)₂  The complex is (Fv-P)₂  It appeared to be more stable compared to the IgG conjugate. Most of IgG is found in the complex, and the elution curve of uncomplexed Fv-PP molecule is extremely sharp, and Fv when fraction B in FIG. 18 is fractionated and chromatographed under the same conditions. It was almost the same as the elution curve of -PP.
[0072]
The fractions A and B were further analyzed by HPLC under denaturing conditions to confirm that they formed a new complex. That is, fractions showing the peak of absorption (fractions A and B in FIG. 18) were collected and freeze-dried. After these were dissolved in 5M guanidine-hydrochloric acid, HPLC analysis was carried out under the same column under denaturing conditions. As a running buffer, a 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 5 M guanidine-hydrochloric acid was used. As a control, a mixture of IgG and Fv-P and a mixture of IgG and Fv-PP (each having a molar ratio of two components of 1: 2) were also analyzed.
[0073]
FIG. 19 shows the result. That is, FIG. 19 is a diagram showing the results of HPLC analysis of Fv-P, Fv-PP and an IgG complex (fractions A and B in FIG. 18, respectively) under denaturing conditions. D.₂₄₅  The horizontal axis indicates time (minutes). As shown in FIG. 19, the complex of Fraction A was IgG, V at a molar ratio of 1: 2: 2._LOne protein AFc binding domain and V_HDivided into In addition, the complex of fraction B was prepared using IgG,_L-Two protein AFc binding domains and V_HOccurred.
[0074]
As described above, when an IgG molecule is added, the Fv-P molecule and the Fv-PP molecule form a complex having a plurality of antigen-binding sites.
[0075]
(3-4) Analysis of physical properties of Fv-P, Fv-PP and IgG molecule complex
K of Fv, Fv-P, Fv-PP, or a complex thereof and IgG complex thereof with HEL bound to a solid support_onAnd K_offWas measured using a BIA core system. 35 μl of a 200 μg / ml HEL solution was chemically coupled to the support on the biosensor chip by the amine coupling method according to the manufacturer's instructions. All experiments were performed at 30 ° C. in HBS at a flow rate of 5 μl / min. First, 20 μl of a 100 nM, 50 nM, and 25 nM antibody (Fv, Fv-P, or Fv-PP) solution containing (with a molar ratio of 2: 1) or not containing human IgG is put into a biosensor chip, Afterwards it was washed with HBS and finally the chip was regenerated with 100 mM hydrochloric acid. The mixing conditions of human IgG were the same as in the case of the analysis by HPLC shown in Example (3-3), except that HBS was used as the dilution buffer.
[0076]
FIG. 20 shows the result. That is, FIG. 20 shows that the association of HEL with Fv, Fv-P, and Fv-PP, and the dissociation of the resulting complex, with and without the addition of IgG, were analyzed using the BIA core system. It is a figure which shows the result of the resonance sensor obtained at this time, a vertical axis | shaft shows a resonance unit (RU), and a horizontal axis | shaft shows time (second). Based on these data, K_onAnd K_offWas calculated. Table 6 shows the results. That is, Table 6 is a table showing the kinetic parameters relating to the binding between the Fv fragment and HEL measured by the BIA core system.
[0077]
[Table 6]

[0078]
Fv, Fv-P, and Fv-PP were determined by the KIA measured in the BIA core when no IgG molecule was added._onAnd K_offAre about 10 times smaller than the values measured by the DTC and the stopped flow apparatus shown in Example (3-2). These apparent differences are probably due to differences in complex formation conditions. That is, in the case of the BIA core system, HEL was chemically bound to the solid support, whereas in the case of DTC and stopped flow analysis, the reactants were free in solution. Despite these differences, K is thought to reflect the overall affinity_AWere almost identical to each other. K_offIn all cases, except for the combination of Fv-P and IgG, the value of was lower as the antibody concentration was lower. These phenomena seem to be peculiar to the analysis using the BIA core system. The stability of the complex formed on the solid support appeared to depend on the physical conditions of the antigen bound to the solid support on the biosensor chip. That is, antibody accessibility was not equally achieved on the chip. True K_offShould ideally be measured at zero concentration. Therefore, all measurements should be considered empirical predictions.
[0079]
In the case of Fv, even if IgG is added, K_onAlso K_offNothing changed. In the case of Fv-P, adding IgG results in K_onIs halved and K_offBecame 1/3. However, when the concentration of Fv-P is low, K_offHas risen. This phenomenon is (Fv-P)₂  It is considered that the IgG complex is unstable and, as a result, dissociates at a low concentration. In the case of Fv-PP, the addition of IgG is_offThe positive effect on the decrease in clarity was further clarified. That is, at all antibody concentrations at which measurements were taken, K_offWas 3.5 times lower. (Fv-P) observed in BIA core analysis₂  IgG complex and (Fv-PP)₃  (IgG)₂  This difference in stability between the conjugates is consistent with the results of the HPLC and DTC analyzes described in Example (3-3). Thus, (Fv-PP)₃  (IgG)₂  The complex is considered stable and multivalent with respect to binding to the antigen.
[0080]
(3-5) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using Fv-P, Fv-PP and IgG molecule complex
50 μl of 100 μg / ml HEL dissolved in 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) was placed in a 96-well plate (Sumicon Multiplate; Sumitomo Bakelite), and the plate was kept at 40 ° C. overnight. After removing the supernatant, 100 μl of 1% BSA was added and kept at room temperature for 1 hour. Plates were washed three times with PBS / T and 50 μl of primary antibody solution was added to each well. This primary antibody solution is obtained by serially diluting an antibody (Fv, Fv-P, Fv-PP) containing or not containing human IgG, or only human IgG.
[0081]
The mixing conditions of human IgG were the same as in the case of the analysis by HPLC shown in Example (3-3), except that PBS / T was used as the dilution buffer.
The plate was kept at room temperature for 4 hours. After removing the solution, the plate was washed three times with PBS / T. As a secondary antibody, 50 μl of anti-D1.3 antibody diluted with PBS / T was added. After incubating at room temperature for 4 hours, the plate was washed three times with PBS / T. As a tertiary antibody, 50 μl of an anti-rabbit IgG donkey-derived antibody conjugated with horseradish peroxidase diluted with PBS / T was added, and incubated at room temperature for 4 hours.
After washing four times with PBS / T, 0.04% o-phenylenediamine (OPDA), 0.02% H₂  O₂  , 48.5 mM citrate, and Na⁻50 μl of a staining solution consisting of phosphoric acid (pH 5.0) was added. The staining reaction was allowed to proceed for 20 minutes at room temperature in a dark room and stopped by adding 50 μl of 2M sulfuric acid. The absorbance at 492 nm was measured by Titertek (Multiscan, MCC). FIG. 21 shows the result. That is, FIG. 21 shows the results of human IgG only (x), Fv (open circles), Fv-P (open squares), Fv-PP (open triangles) and Fv plus human IgG (filled circles), Fv-P FIG. 10 shows the results of ELISA in which human IgG was added (solid squares) to Fv-PP and human IgG was added to Fv-PP (solid triangles) as the primary antibody, using an anti-D1.3 antibody. Is O. D.₄₉₂  The horizontal axis indicates the concentration of the primary antibody (μM).
[0082]
Similarly, the secondary antibody was changed to a horseradish peroxidase-conjugated anti-human IgG Fc fragment goat antibody (Kappel, hereinafter abbreviated as anti-human Fc antibody), and the secondary antibody was washed and then developed. In this case, it is checked whether human IgG is contained in the primary antibody bound to HEL.
The result is shown in FIG. That is, FIG. 22 is a diagram showing the results of ELISA in which the same antibody as in FIG. 21 was detected as a primary antibody using an anti-human Fc antibody, and the vertical axis represents O.D. D.₄₉₂  The horizontal axis indicates the concentration of the primary antibody (μM).
[0083]
These ELISA results indicate that the protein A-derived portion may have bound not only the first human IgG molecule, but also the second and third antibodies, so the interpretation of the data obtained is somewhat It became complicated. However, in each case, the detection of the mixture using Fv-P and IgG and the mixture of Fv-PP and IgG was better than the case where Fv-P and Fv-PP were used alone. Clearly, the sensitivity was high. Furthermore, equal O.D. D.₄₉₂  When the concentration of the first antibody showing the value of Fv-PP was compared, the detection sensitivity when using a mixture of Fv-PP and IgG was at least one order of magnitude higher than the detection sensitivity when using Fv alone.
[0084]
As shown in FIG. 22, in the ELISA using an anti-Fc antibody as the second antibody, it was clearly observed that the sensitivity was increased when IgG was added. When no IgG was added, neither Fv-P nor Fv-PP showed a signal. As described above, a mixture of Fv-P and Fv-PP with IgG is useful as a reactant used for ELISA.
[0085]
(3-6) Western blotting using Fv-P, Fv-PP and IgG molecule complex
After 0.5 μg, 0.25 μg, 0.125 μg, and 0.0625 μg of HEL were subjected to SDS-PAGE, they were blotted on a PVDF membrane using a semi-dry blotter. The membrane was blocked by immersion in PBS / T containing 1% BSA at room temperature for 1 hour. As the primary antibody, 10 mM Fv, Fv-P or Fv-PP diluted with PBS / T was used. After keeping it at room temperature for 4 hours, it was washed three times with PBS / T. Dipped in PBS / T containing anti-D1.3 antibody, kept at room temperature for 4 hours, and washed three times with PBS / T. This membrane was further immersed in PBS / T containing an anti-rabbit IgG antibody conjugated to horseradish peroxidase and kept at room temperature for 4 hours. After washing 5 times with PBS / T, detection was performed using an ELC western blotting system (Amersham).
[0086]
FIG. 23 shows the result. That is, FIG. 23 shows that HEL detected using Fv, Fv-P, and Fv-PP as primary antibodies with an anti-D1.3 antibody [0.5 μg (1), 0.25 μg (2), 0.125 μg (3), 0 0.0625 μg (4)] of the Western blotting.
[0087]
Similarly, Western blotting was performed using Fv-P or Fv-PP and a human IgG complex as a primary antibody.
That is, the complex used in the HPLC analysis shown in Example (3-3) diluted 1000-fold with PBS / T (Fn-P, Fn-PP concentration: 10 nM) was used as the primary antibody.
As a secondary antibody, an anti-human Fc antibody conjugated to horseradish peroxidase was used.
After secondary antibody washing, detection was performed using an ECL western blotting system. FIG. 24 shows the result. That is, FIG. 24 shows that HEL [0.5 μg (1), 0.25 μg (2), 0.125 μg (3) detected with an anti-human Fc antibody using Fv-P or Fv-PP and a human IgG complex as a primary antibody. ) And 0.0625 μg (4)] of Western blotting.
[0088]
Summarizing the results of these Western blots, Fv-P and Fv-PP showed stronger signals than Fv when anti-D1.3 antibody was used as the second antibody. When an anti-Fc antibody was used as the second antibody, Fv-P or a complex of Fv-PP with IgG showed a stronger signal as expected.
[0089]
【The invention's effect】
By using the gene provided by the present invention, it becomes easy to select a gene encoding an antibody molecule having high affinity for the target antigen, and production of a monoclonal polyvalent artificial antibody containing the selected high affinity antibody A method is also provided. The use of genes encoding antibody molecules exhibiting affinity for the target antigen makes it easy to prepare polyclonal polyvalent artificial antibodies, and these polyvalent artificial antibodies can be used for antigen purification, antigen measurement, diagnosis, etc. Useful in the field.
[0090]
[Sequence list]
[0091]

[0092]

[0093]

[0094]

[0095]

[0096]

[0097]

[0098]

[0099]

[0100]

[0101]

[0102]

[0103]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram of a Hind III-EcoRI insert of PM13Fv and the vicinity thereof.
FIG. 2 is a diagram comparing the Fv fragment-derived polypeptides remaining in the phage coat protein when the filamentous phages M13Fv, M13ΔFv, and M13K07 are treated with sarkosyl.
FIG. 3 shows comparative quantification of Fv fragment-derived polypeptide expressed on the surface of filamentous phage M13Fv.
FIG. 4 is a diagram showing the results of surface plasmon resonance sensor analysis when the phage M13K07 sarcosyl was not treated and injected into a HEL-immobilized sensor chip.
FIG. 5 is a diagram showing the results of analysis of a surface plasmon resonance sensor when phage M13ΔFv was introduced into a HEL-immobilized sensor chip without treatment with sarkosyl.
FIG. 6 is a view showing the results of surface plasmon resonance sensor analysis when phage M13Fv was introduced into a HEL-immobilized sensor chip without treatment with sarkosyl.
FIG. 7 is a diagram showing the results of surface plasmon resonance sensor analysis when phage M13K07 was injected into a HEL-immobilized sensor chip by sarkosyl treatment for 1 hour.
FIG. 8 is a diagram showing the results of surface plasmon resonance sensor analysis when phage M13ΔFv was injected into a HEL-immobilized sensor chip by sarkosyl treatment for 1 hour.
FIG. 9 is a diagram showing the results of surface plasmon resonance sensor analysis when phage M13Fv was injected into a HEL-immobilized sensor chip by sarkosyl treatment for 1 hour.
FIG. 10 is a diagram showing the results of surface plasmon resonance sensor analysis when phage M13K07 was injected into a HEL-immobilized sensor chip by treatment with sarkosyl for 18 hours.
FIG. 11 is a diagram showing the results of surface plasmon resonance sensor analysis when phage M13ΔFv was injected into a HEL-immobilized sensor chip by sarkosyl treatment for 18 hours.
FIG. 12 is a view showing the results of surface plasmon resonance sensor analysis when phage M13Fv was injected into a HEL-immobilized sensor chip after treatment with sarkosyl for 18 hours.
FIG. 13 is a diagram showing the results of surface plasmon resonance sensor analysis when an anti-M13 phage antibody was further injected after phage was injected into a HEL-immobilized sensor chip.
FIG. 14 is a view showing the results of analysis of a surface plasmon resonance sensor when phages were loaded on an anti-D1.3 antibody-immobilized sensor chip.
FIG. 15 is a view showing the results of SDS-PAGE analysis of Fv, Fv-P, and Fv-PP purified by an affinity resin.
FIG. 16 shows the results of DTC analysis on the binding between Fv-P and human IgG.
FIG. 17 shows the results of DTC analysis on the binding between Fv-PP and human IgG.
FIG. 18 is a view showing the results of HPLC analysis of Fv, Fv-P, Fv-PP, and an IgG mixture thereof.
FIG. 19 shows the results of HPLC analysis of Fv-P, Fv-PP and an IgG complex under denaturing conditions.
FIG. 20 is a diagram showing the results of surface plasmon resonance sensor analysis when Fv, Fv-P, Fv-PP, and those obtained by adding human IgG thereto, were loaded into a HEL-immobilized sensor chip.
FIG. 21 is a diagram showing the results of ELISA in which Fv, Fv-P, Fv-PP, and those obtained by adding human IgG thereto, were detected as primary antibodies using an anti-D1.3 antibody.
FIG. 22 is a diagram showing the results of ELISA in which Fv, Fv-P, Fv-PP, and those obtained by adding human IgG to them, were detected as primary antibodies using an anti-human Fc antibody.
FIG. 23 is a diagram showing the results of Western blotting detected with an anti-D1.3 antibody using Fv, Fv-P, and Fv-PP as primary antibodies.
FIG. 24 is a view showing the results of Western blotting in which Fv-P or Fv-PP and a human IgG complex were used as primary antibodies and detected by an anti-human Fc antibody.

Claims (3)

A nucleic acid represented by the following general formula (Formula 1).

[Wherein X ′ is a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding an antibody variable site, Y is a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding a linear phage coat protein III or VIII , and a termination codon is present at the end thereof , Z Is a nucleic acid containing a base sequence encoding protein A, protein G or an Fc binding domain thereof, m is 1 or 0, and when m is 1, the nucleic acid of the general formula (Formula 1) is linear with the antibody variable site. Encodes a fusion polypeptide containing phage coat protein III or VIII, and when m is 0, the nucleic acid of general formula (1) contains an antibody variable site and protein A, protein G or their Fc binding domains. Encodes a fusion polypeptide) Formula 1 nucleic acid according to claim 1 Z Te odor is a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding the Fc binding domain of protein A. In the general formula (Formula 1), Y is a nucleic acid containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and Z is a nucleic acid containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 in the sequence listing The nucleic acid according to claim 1, which is:

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