JP3595966B2

JP3595966B2 - Method for preparing a new potent non-toxic lipopolysaccharide effective for prevention of endotoxemia or sepsis

Info

Publication number: JP3595966B2
Application number: JP29987997A
Authority: JP
Inventors: ブハドラランジャン; ナヤクアブヒジット; チャランバンドヨパジャイパタキ; バススマンタ
Original assignee: カウンシィルオブサイアンティフィックアンドインダストリアルリサーチ
Priority date: 1996-12-25
Filing date: 1997-10-31
Publication date: 2004-12-02
Anticipated expiration: 2017-10-31
Also published as: JPH10237104A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、内毒血症または敗血症の予防に有効な新規の効力のある非毒性リポ多糖体（ＬＰＳ）の調製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
二重かつ非対称に構成された膜である大腸菌、腸炎菌等のグラム陰性菌のいわゆる外膜は、優勢な成分としていくつかの蛋白質およびクラスｍａｃｒｏａｍｐｈｉｏｐｈｉｌｅｓ、リポ多糖体（ＬＰＳ）からなるが、こうした細菌の生存力は細胞外膜上のＬＰＳ配列によってのみ左右される蛋白質である。１個の細菌の細胞は、４．９μｍ２の面積を占める約３．６．１０６ＬＰＳ分子を含有する。このために、その相互作用は標的で容易である。本発明による方法で調製されているリポ多糖体は、生物活性物質であると共に、ヒト病原体を含むグラム陰性菌の内毒素との病態生理学的相互作用を予防するために有効である。このリポ多糖体は補助Ｎｏ．ＭＴＣＣ１９７９を有するＡｃｉｄｐｈｉｌｌｕｍ属に属する新しい細菌から調製される。尚、この新しい細菌は、ブダペスト条約に基づく微生物の寄託機関ＡＴＣＣ（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に１９９７年４月３０日付けで寄託されており、寄託番号ＡＴＣＣ５５９６３が付与されている。
【０００３】
グラム陰性病原体に感染すると、循環に放出されるＬＰＳは、ヒトなど宿主と多様な生理学的・病態生理学的相互作用を媒介し、特に生存の危険を来す。ヒトにおけるグラム陰性菌感染症のＬＰＳを原因とする病態生理学的疾患として、発熱（３８．６℃）、頻拍（９０拍／分）、頻呼吸（呼吸数＞２０回／分）、アシドーシス（ｐＨ７．３）、動脈低酸素血（ｐｐｏ＝７５ｍｍＨｇ）（１）が挙げられる。米国だけで毎年５０万人が敗血症に罹り、うち１７万５千人が死亡している（２）。人口がはるかに多いインドの事情はさらに深刻であることが予想されるため、敗血症の予測症例は高く、死亡率に対する影響は大きい。通常、敗血性ショックの発現を認める院内または集中治療室内の患者は、診断後７２時間以内に死亡することがある（３）。
【０００４】
網内細胞に対するＬＰＳ作用により産生されるメディエーターのなかには、インターロイキン６および８のほか、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターロイキン−１（ＩＬ−１）が含まれる。しかし、ＴＮＦαおよびＩＬ−１は敗血症の重要な因子である。
【０００５】
ヒトに対する敗血症の大きな影響を理解することにより、有効な抗敗血症薬の市場は、ニューヨークシティーのＯｐｐｅｎｈｅｕｎｅｒ＆Ｃｏ．Ｉｎｃのアナリストによると年間５億ドルになると考えられる（４）。急進展する市場は、現在可能性のある抗敗血症薬を開発中の２０社余りにとって大きな収入源になるとみられる。しかし、こうした利益を得る道は一直線というわけではない。
【０００６】
１９８０年代半ばに、カリフォルニア州エメリービルのＣｅｎｔｏｃｏｒ、ＸｏｍａおよびＣｈｉｒｏｎの３社が、敗血症の発生に重要な役割を果たす内毒素の毒性成分であるリピドＡに対するモノクローン抗体の開発を開始した。単球およびマクロファージの受容体に結合することにより、内毒素のリピドＡは、サイトカインとして知られる強力なメディエーターの放出を誘発する。敗血症を引き起こす前にリピドＡの過剰を（抑制する）抗体を使用するという考えは、製品を臨床試験用にしたＸｏｍａ社およびＣｈｉｒｏｎ社により利用されたが、これは失敗に終わった。しかし、モンタナ州ハミルトンのＲｉｈｉＩｍｍｕｎｅケミカル社は、グラム陰性型およびグラム陽性型の細菌との感染が認められるときに過剰に刺激されることのない宿主および免疫系に耐性のある良性のリピドＡを開発した。抗内毒素活性のためのもう一つの方法は、白血球に存在する自己蛋白質であって、内毒素に結合し、体そのものの活動に追随する殺菌性／浸透性増大蛋白質（ＢＰＩ）と呼ばれる物質の使用である。開発したのは、カリフォルニア州パロアイトのＩｎｃｙｔｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社であり、同剤はマウスにおいて優れた成績を示している。グラム陽性菌や真菌など敗血症を引き起こす病原体のシフトにより、現在の焦点はＴＮＦやＩＬ−１など免疫メディエーターに向けられている。
【０００７】
Ｓｙｎｅｒｇｅｎ社のＡｎｔｒｉｌ（ＩＬ−１の受容体拮抗薬）は単球により産生される蛋白質であり、好中球の受容体に結合することによりＩＬ−１の作用を抑制する効果があり、すでに罹患した患者において良好な結果が得られる。英国のＣｈｉｒｏｎ社やスイスのＨｏｆｆｍａｎｎ−ｌａ−Ｒｏｃｈｅ社など数社は、ＴＮＦ−結合抗体を用いた有望な成績が得られたため、現在、臨床試験が行われている。
【０００８】
しかし、抗ＴＮＦ受容体による方法は、敗血症患者における死亡率の増大が報告されているため、奏功しなかった（５）。しかしながら、抗サイトカインによる方法には依然として多くの擁護者がいるが、なかにはこの方法では同時に１種類の化学薬品だけしか誘発されないと不満を訴える擁護者もいる。それでも、１つの因子を制御することのより、他の効果を上昇させ、ＩＬ−１濃度が上昇するような免疫系において、ＴＮＦが充分な冗長度を有するものとなる。
【０００９】
敗血症に対するこのような効果的な治療には、ＴＮＦとＩＬ−１の両方に対して作用する多種類の作用物質が必要である、とカリフォルニア州立大学の細胞生物学者・エリクソンは述べている。メリーランド州ロックビルのＥｎｔｅｒＭｅｄ社は、「抗敗血症ワクチン」を用いてこの方向に進み、患者自身が免疫応答を備えるようにしている。ワクチンは脂質とコレステロールを材料とする小嚢に包まれたリピドＡからなり、開発の過程にある。したがって、「抗敗血小ワクチン」の方向において考え得る方法は、大腸菌のＬＰＳと免疫学的に交差反応するが、きわめて高い用量では致死率を示すことのない天然に生じる非毒性ＬＰＳを用いて試みられる。別の見方をすれば、これでグラム陰性菌の毒性ＬＰＳまたは内毒素により誘発される致命的なショックが予防される。
【００１０】
現状の技術において、以下に示すさまざまな標準的方法がある。
【００１１】
Ａ．１．トリクロロ酢酸による抽出。
【００１２】
三塩化酢酸（ＴＡＣ）による細胞の抽出が、組織学的に内毒素分離のための最初の方法である。これは高度に免疫原性のＬＰＳ蛋白質−りん脂質錯体である。
【００１３】
５倍の重量の氷冷水中に懸濁した細胞を４℃下に３時間、等量の０．５ＮＴＣＡで処理する。懸濁液を遠心分離し、上清を希釈水酸化ナトリウムで中和し、２倍の量の水で沈降させた錯体を透析し、遠心分離して細胞片を除去すると共に凍結乾燥する。
【００１４】
２．エチレングリコールによる抽出。
【００１５】
エチレングルコールにより、細胞から遊離多糖および／または全Ｏ−抗原錯体を選択的に抽出する。抽出条件はきわめて緩やかであり、抽出物質の変性または変異のリスクは低い。アセトンで乾燥させた細胞を、１０部の新鮮な蒸留ジエチレングリコールにより、室温で毎日数時間、攪拌して抽出する。抽出物を濾過し、透析すると共に遠心分離する。最後に−１０℃でアセトンを添加してＯ−抗原錯体を沈降させる。さらに、飽和した硫酸アンモノウムの１％水溶液で分画することにより精製を行う。この方法は時間がかかり、収率が低い。
【００１６】
３．加熱したフェノールによる抽出。
【００１７】
上述した２つの抽出法は有効であるが、１９６５年にＷＥＳＴＰＨＡＬとＪＡＮＮにより達成された分離法が最も多く用いられる。抽出された物質は蛋白質がわずかに含まれている。Ｓ＆Ｒ型のＬＰＳの抽出法としては充分であるが、Ｒ変異菌については不完全であることが多い。
【００１８】
４．ジメチルスルフォキシオド（ＤＭＳＯ）による抽出。
【００１９】
高温（＞６０℃）で蛋白質によりＬＰＳを抽出する。この抽出物から、蛋白質を含まないＬＰＳが、Ｏ−アセチル化により得ることができ、その後にクロロホルムで精製することができる。最後に、ＤＭＳＯ（室温でアセトン中２％）で脱アセチル化する。脱アセチル化時に一部のエステル結合脂肪酸をリピドＡから除去することが可能である。
【００２０】
５．フェノールクロロホルム石油エーテル（ＰＣＰ）による抽出。
【００２１】
フェノール水による方法では、Ｒ変異菌に存在する多量の疎水性内毒素が抽出されないことが多い。フェノールクロロホルム−石油エテール（２：５：８ｖ／ｖ／ｖ）の混合液に均質化された乾燥菌を遠心分離し、上清を採取する。気化により上清からクロロホルムおよび石油エーテルを除去する。水を滴下して加え、残ったフェノール中のＬＰＳを沈降させる。この沈降物を遠心分離した後、石油エーテルで洗浄し、さらに４時間、１０５，０００で超遠心分離により精製する。
【００２２】
Ｂ．電気透析
ＳおよびＲの両形態から分離した内毒素は通常、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ＋＋、Ｃａ＋＋など多くの一価陽イオンおよび二価陽イオンのほか、スペルミジン、スペルミン等の一部のポリアミンと結合している。これらの陽イオンはＬＰＳの溶解度および凝結に対して強力な影響を示す。ＬＰＳの電気透析が導入され、関連塩基で中和することにより塩に置換することができた。ＬＰＳのトリエチルアミン塩は水溶性がきわめて高い。この塩は超遠心分離において沈降されず、変性生物学的活性を示す。中和されていない電気透析ＬＰＳ調製液は長時間にわたって不安定となり、自己溶解により保存時に爆発する。
【００２３】
ガラクトースアミン感作されていないマウスにおいて、大腸菌の毒性ＬＰＳの致死量は８０μｇ／マウスであり、本発明による非毒性ＬＰＳの致死量は３０μｇ／マウスである。
【００２４】
Ｒ．ＳｐｈｅａｒｏｉｄｅｓやＲ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのＬＰＳなどその他の非毒性ＬＰＳは、新規に認められた用量よりも高い用量で発熱性であり致死的であることが報告された。
【００２５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ｃｏｐｐｅｒｍｉｎｅｓ地域の土壌から単離されたＡｃｉｄｐｈｉｌｌｕｍ属に属する新しい菌株から新規のリポ多糖体を調製する方法を提供することを主な目的とする。
【００２６】
また、本発明は、内毒素症を来す毒性ＬＰＳ作用を媒介する作用物質であるが、それ自体は非毒性作用物質としての新規のリポ多糖体を調製する方法を提供することを目的とする。
【００２７】
【課題を解決するための手段】
このように、本発明によれば、上述した内毒素ショックに有効な新規の非毒性リポ多糖体を調製するための方法であって、
１）標準条件下に通常の普通培地において補助ＭＴＣＣ１９７９を有するＡｃｉｄｐｈｉｌｌｕｍ属の細菌を増殖させるステップと、
２）周知の方法で細菌を分離した後、炭素および窒素源を除く同一の増殖培地で反復洗浄するステップと、
３）７０〜９０℃の温度下に親油性溶媒で細菌を抽出するステップと、
４）得られた物質を冷却し、繰り返し遠心分離するステップと、
５）ステップ（ｄ）から得られた上清を透析するステップと、
６）ステップ（ｅ）から得られた透析物質を凍結乾燥するステップと、
７）極性溶媒で凍結乾燥物質を処理し、リポ多糖体を沈降させるステップと、
８）リポ多糖体を濾過し、乾燥するステップと、
からなる方法が得られる。
【００２８】
細菌培養株は、グルコースおよび酵母抽出物を含有する合成培地において増殖させ、７２〜１２０時間にわたって３０〜３９℃の温度でインキュベートすることができる。
【００２９】
細胞の増殖後、約３０〜１０分間にわたり４０００〜１００００ｒｐｍの遠心分離で回収した後、グルコースと酵母抽出物を除く増殖に用いた同一の培地で洗浄する。
【００３０】
次に細菌の細胞を４炭素を超えない芳香族フェノールまたは脂肪族アルカノールなど加熱した親油性溶媒および水で処理する。さらに上記の混合液を６０〜１２０分間強く攪拌した。その後、混合液を氷で２〜１２℃の温度に冷却する。次にそれぞれ１５〜３０分間、４０００〜１００００ｒｐｍで遠心分離した。
【００３１】
上記の方法を３回繰り返す。すべての上清を２〜５日間、徹底的に透析した。この物質を沈降させ、濃度１．５％〜２．５％の溶液の形で２〜４℃の温度下に４〜６時間、１０５，０００〜１７０，０００ｒｐｍで超遠心分離にかけた。全体の方法で使用した水は発熱性がなく、環境からの汚染を回避するよう留意した。遠心分離を繰り返して行い、ほぼ精製されたＬＰＳを得た。次にこれをエタノールなど極性溶媒で処理し、２０〜４５分間、８５００〜１４０００ｒｐｍの速度で遠心分離により採取した沈降物を得た後、凍結乾燥して冷蔵庫に保存した。
【００３２】
本発明において調製される非毒性ＬＰＳ（ＮＴＬＰＳ）は、グラム陰性菌から以前に報告されたＮＴＬＰＳ源としてのＡｃｉｄｐｈｉｌｌｕｍの周知の菌株と異なるＡｃｉｄｐｈｉｌｌｕｍ菌からの他に類型をみないＬＰＳである（６）。
【００３３】
通常、リピドＡの基本構造は、鎖の長さが程度が異なる４〜８個のアシル鎖を有する。ＬＰＳの構造機能関連の比較研究（７）では、大腸菌の多様な変形が明らかにされており、それらの生物活性はいくつかの顕著な特徴を示した。より多くのβヒドロキシル化およびより少数の脂肪アシル鎖により、１０７の係数で生物活性が劇的に低下した。本発明により調製された非毒性ＬＰＳはβヒドロキシル化脂肪酸アシル鎖の割合が高く、その非毒性が原因とみられるミリスチン酸鎖であるが、ＮＴＬＰＳは大腸菌のＬＰＳと免疫学的に交差反応性である。
【００３４】
この非毒性ＬＰＳ（すなわちＭＴＣＣ１９７９株からのＧＳ１８ｈＬＰＳ）の組成は以下の通りである。
【００３５】

本発明による非毒性ＬＰＳは、電気泳動的に大腸菌のＬＰＳに比べて、低分子量の成分からなる。大腸菌との免疫学的交差反応性の程度が高いことは、構造的に大腸菌のＬＰＳときわめて緊密な関係のある物質であることを示す。
【００３６】
【発明の実施の形態】
以下、実施例により本発明について詳細に述べるが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
【００３７】
実施例１
ＭＴＣＣ１９７９の菌株を培養し、回収すると共に以下の条件下に７０ｎｍｓ（湿重量）、４ｇｍｓ（乾燥重量）を計量した。
【００３８】

本発明により精製されたリポ多糖体の非毒性の実験的所見。それぞれ５匹からなる２群のマウスについて、本発明により精製されたリポ多糖体と大腸菌のリポ多糖体を投与して生存率の試験を行った。
【００３９】
１群には生理的食塩水のみを注射し、別の１群にはＬＰＳを注射した。５日間に死亡例は認められなかった。５日目に両群に毒性ＬＰＳを注射した結果、生理的食塩水群は７２時間以内に死亡したが、非毒性リポ多糖体群は完全に生存し、死亡例は認められなかった。注射はすべてマウスに軽く麻酔した後に行った。
【００４０】
【発明の効果】
本発明による方法で調製されたＬＰＳすなわちリポ多糖体の毒性は、周知のＬＰＳに比べて１５０〜２００分の１であり、大腸菌のＬＰＳに比べて２００万分の１、Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓのＬＰＳに比べて１５０〜２００分の１である。この非毒性ＬＰＳは内毒血症に対する予防薬として有効である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for preparing a novel and potent non-toxic lipopolysaccharide (LPS) that is effective in preventing endotoxemia or sepsis.
[0002]
[Prior art]
The so-called outer membrane of gram-negative bacteria such as Escherichia coli and Enterococcus, which is a double and asymmetrically composed membrane, is composed of several proteins, macroamphiophiles and lipopolysaccharide (LPS) as predominant components. Is a protein that depends only on the LPS sequence on the extracellular membrane. One bacterial cell contains approximately 3.6.106 LPS molecules occupying an area of 4.9 μm 2. Because of this, the interaction is easy on the target. The lipopolysaccharide prepared by the method according to the present invention is a biologically active substance and is effective for preventing pathophysiological interactions with endotoxins of Gram-negative bacteria including human pathogens. This lipopolysaccharide has the auxiliary It is prepared from a new bacterium belonging to the genus Acidophilum having MTCC1979. This new bacterium has been deposited at the American Type Culture Collection (ATCC), a depositary organization of microorganisms based on the Budapest Treaty, on April 30, 1997, and has a deposit number of ATCC 55963.
[0003]
Upon infection with a gram-negative pathogen, LPS released into the circulation mediates a variety of physiological and pathophysiological interactions with the host, including humans, and poses a particular risk of survival. Pathophysiological diseases caused by LPS of gram-negative bacterial infection in humans include fever (38.6 ° C.), tachycardia (90 beats / min), tachypnea (respiratory rate> 20 times / min), acidosis ( pH 7.3) and arterial hypoxia (ppo = 75 mm Hg) (1). Every year in the United States alone, 500,000 people suffer from sepsis, of which 175,000 die (2). As the situation in India, which is much more populous, is expected to be even more severe, the predicted cases of sepsis are high and have a significant impact on mortality. Usually, patients in a hospital or intensive care unit with onset of septic shock may die within 72 hours after diagnosis (3).
[0004]
Among the mediators produced by LPS action on reticulum cells, in addition to interleukins 6 and 8, tumor necrosis factor (TNF) and interleukin-1 (IL-1) are included. However, TNFα and IL-1 are important factors in sepsis.
[0005]
With an understanding of the significant impact of sepsis on humans, a market for effective anti-sepsis drugs is available from Oppenheuner & Co. of New York City. According to Inc analysts, this could be $ 500 million a year (4). The fast-growing market is likely to be a significant source of revenue for more than 20 companies developing potential antiseptic drugs. But the path to these benefits is not straightforward.
[0006]
In the mid-1980's, three companies, Centocor, Xoma and Chiron, of Emeryville, California, began developing monoclonal antibodies against lipid A, a toxic component of endotoxin that plays a key role in the development of sepsis. By binding to monocyte and macrophage receptors, the endotoxin lipid A triggers the release of potent mediators known as cytokines. The idea of using antibodies to suppress (suppress) lipid A excess before causing sepsis was utilized by Xoma and Chiron, whose products were used for clinical trials, but failed. However, RhiImmune Chemical Company of Hamilton, Montana has developed a benign lipid A that is resistant to the host and immune system without overstimulation in the presence of infection with Gram-negative and Gram-positive bacteria. did. Another method for anti-endotoxin activity is a self-protein present in leukocytes, a substance called bactericidal / permeability-enhancing protein (BPI), which binds to endotoxin and follows the body's own activities. Use. Developed by Incyte Pharmaceuticals, Inc. of Palo Ait, CA, which has shown excellent performance in mice. The current focus is on immune mediators, such as TNF and IL-1, due to the shift in pathogens that cause sepsis, such as Gram-positive bacteria and fungi.
[0007]
Synergen's Antril (IL-1 receptor antagonist) is a protein produced by monocytes, has the effect of inhibiting the action of IL-1 by binding to the receptor on neutrophils, and Good results are obtained in patients who have undergone surgery. Several companies, such as Chiron in the UK and Hoffmann-la-Roche in Switzerland, are now undergoing clinical trials because of promising results with TNF-conjugated antibodies.
[0008]
However, the anti-TNF receptor approach has not been successful because of increased mortality reported in septic patients (5). However, while there are still many advocates of the anti-cytokine approach, some advocate that this method can only trigger one chemical at a time. Nevertheless, controlling one factor enhances the other effects and makes TNF sufficiently redundant in the immune system to increase IL-1 levels.
[0009]
Such an effective treatment for sepsis requires a variety of agents that act on both TNF and IL-1, says Ericsson, a cell biologist at California State University. EnterMed, Inc. of Rockville, Md., Uses an "antiseptic vaccine" in this direction to ensure that patients themselves have an immune response. The vaccine consists of lipid A wrapped in vesicles made of lipid and cholesterol and is in the process of development. Thus, a possible approach in the direction of "small antiseptic vaccine" is to use a naturally occurring non-toxic LPS that immunologically cross-reacts with LPS in E. coli but does not show mortality at very high doses. Tried. From another perspective, this prevents lethal shock induced by toxic LPS or endotoxin of Gram-negative bacteria.
[0010]
In the current state of the art, there are various standard methods described below.
[0011]
A. 1. Extraction with trichloroacetic acid.
[0012]
Extraction of cells with acetic acid trichloride (TAC) is the first method for histologically endotoxin isolation. It is a highly immunogenic LPS protein-phospholipid complex.
[0013]
Cells suspended in 5-fold weight of ice-cold water are treated with an equal volume of 0.5N TCA at 4 ° C. for 3 hours. The suspension is centrifuged, the supernatant is neutralized with dilute sodium hydroxide, the complex precipitated with two volumes of water is dialyzed, centrifuged to remove cell debris and lyophilized.
[0014]
2. Extraction with ethylene glycol.
[0015]
Ethylene glycol selectively extracts free polysaccharide and / or total O-antigen complex from cells. The extraction conditions are very mild and the risk of denaturation or mutation of the extract is low. Acetone-dried cells are extracted with 10 parts of freshly distilled diethylene glycol with stirring for several hours daily at room temperature. The extract is filtered, dialyzed and centrifuged. Finally, acetone is added at −10 ° C. to precipitate the O-antigen complex. Further purification is carried out by fractionation with a saturated 1% aqueous solution of ammonium sulfate. This method is time consuming and has low yields.
[0016]
3. Extraction with heated phenol.
[0017]
Although the two extraction methods described above are effective, the separation method achieved by WESTPHAL and JANN in 1965 is most often used. The extracted material contains a small amount of protein. Although sufficient for extracting S & R-type LPS, it is often incomplete for R mutants.
[0018]
4. Extraction with dimethylsulfoxide (DMSO).
[0019]
Extract LPS with protein at high temperature (> 60 ° C.). From this extract, protein-free LPS can be obtained by O-acetylation and subsequently purified with chloroform. Finally, deacetylation with DMSO (2% in acetone at room temperature). It is possible to remove some ester-linked fatty acids from lipid A during deacetylation.
[0020]
5. Extraction with phenol chloroform petroleum ether (PCP).
[0021]
In the method using phenol water, a large amount of hydrophobic endotoxin present in R mutant bacteria is often not extracted. The dried bacteria homogenized in a mixture of phenol chloroform-petroleum ether (2: 5: 8 v / v / v) are centrifuged, and the supernatant is collected. The chloroform and petroleum ether are removed from the supernatant by evaporation. Water is added dropwise to precipitate the remaining LPS in phenol. After centrifugation, the precipitate is washed with petroleum ether and further purified by ultracentrifugation at 105,000 for 10 hours.
[0022]
B. Endotoxin separated from both forms of electrodialysis S and R usually binds to many monovalent and divalent cations such as Na +, K +, Mg ++, Ca ++, and some polyamines such as spermidine and spermine. ing. These cations have a strong effect on the solubility and aggregation of LPS. Electrodialysis of LPS was introduced and could be replaced with salts by neutralization with the relevant base. The triethylamine salt of LPS has extremely high water solubility. This salt is not sedimented in ultracentrifugation and exhibits denatured biological activity. The non-neutralized electrodialysis LPS preparation becomes unstable for a long time and explodes during storage due to self-lysis.
[0023]
In mice not sensitized to galactoseamine, the lethal dose of E. coli toxic LPS is 80 μg / mouse, and the lethal dose of non-toxic LPS according to the present invention is 30 μg / mouse.
[0024]
R. Spheroides and R.S. Other non-toxic LPS, such as capsulatus LPS, have been reported to be pyrogenic and lethal at higher than newly observed doses.
[0025]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for preparing a novel lipopolysaccharide from a new strain belonging to the genus Acidophilum isolated from soil in the copper mines region.
[0026]
Another object of the present invention is to provide a method for preparing a novel lipopolysaccharide, which is an agent that mediates toxic LPS action that causes endotoxosis, but is itself a non-toxic agent. .
[0027]
[Means for Solving the Problems]
Thus, according to the present invention, there is provided a method for preparing a novel non-toxic lipopolysaccharide effective for endotoxin shock as described above,
1) growing a bacterium of the genus Acidophilum having supplementary MTCC 1979 in a normal medium under standard conditions;
2) isolating the bacteria in a known manner, followed by repeated washing with the same growth medium except for the carbon and nitrogen sources;
3) extracting the bacteria with a lipophilic solvent at a temperature of 70-90 ° C;
4) cooling the resulting material and repeatedly centrifuging;
5) dialysis of the supernatant obtained from step (d);
6) freeze-drying the dialysate obtained from step (e);
7) treating the lyophilized material with a polar solvent to precipitate lipopolysaccharide;
8) filtering and drying the lipopolysaccharide;
Is obtained.
[0028]
Bacterial cultures can be grown in a synthetic medium containing glucose and yeast extract and incubated at a temperature of 30-39 ° C. for 72-120 hours.
[0029]
After the cells are grown, they are collected by centrifugation at 4000 to 10000 rpm for about 30 to 10 minutes, and then washed with the same medium used for the growth except for glucose and yeast extract.
[0030]
The bacterial cells are then treated with a heated lipophilic solvent such as an aromatic phenol or aliphatic alkanol not exceeding 4 carbons and water. Further, the above mixture was vigorously stirred for 60 to 120 minutes. Thereafter, the mixture is cooled with ice to a temperature of 2-12 ° C. Next, each was centrifuged at 4000-10000 rpm for 15-30 minutes.
[0031]
Repeat the above method three times. All supernatants were extensively dialyzed for 2-5 days. This material was allowed to settle and ultracentrifuged at 105,000-170,000 rpm for 4-6 hours at a temperature of 2-4 ° C in the form of a 1.5% -2.5% solution. Care was taken to ensure that the water used in the entire process was not exothermic and did not contaminate the environment. Centrifugation was repeated to obtain almost purified LPS. Next, this was treated with a polar solvent such as ethanol, and a precipitate collected by centrifugation at a speed of 8500 to 14000 rpm for 20 to 45 minutes was obtained, freeze-dried and stored in a refrigerator.
[0032]
The non-toxic LPS (NTLPS) prepared in the present invention is an unparalleled LPS from an Acidophilum bacterium that differs from the known strain of Acidophilum as a source of NTLPS previously reported from Gram-negative bacteria (6). .
[0033]
Usually, the basic structure of lipid A has 4 to 8 acyl chains of varying chain length. Comparative studies on the structure-function relationship of LPS (7) have revealed various variants of E. coli, and their biological activity exhibited several salient features. More β-hydroxylation and fewer fatty acyl chains dramatically reduced biological activity by a factor of 107. The non-toxic LPS prepared according to the present invention is a myristic acid chain that has a high percentage of β-hydroxylated fatty acid acyl chains and is thought to be due to its non-toxicity, whereas NTLPS is immunologically cross-reactive with E. coli LPS. .
[0034]
The composition of this non-toxic LPS (ie, GS18h LPS from MTCC 1979 strain) is as follows.
[0035]

The non-toxic LPS according to the present invention is composed of components having a lower molecular weight electrophoretically than the LPS of E. coli. A high degree of immunological cross-reactivity with E. coli indicates that the substance is structurally very closely related to LPS of E. coli.
[0036]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples, but these do not limit the scope of the present invention.
[0037]
Example 1
The strain of MTCC 1979 was cultured, collected, and weighed at 70 nms (wet weight) and 4 gms (dry weight) under the following conditions.
[0038]

Non-toxic experimental findings of lipopolysaccharide purified according to the present invention. Two groups of 5 mice each were administered with the lipopolysaccharide purified according to the present invention and the lipopolysaccharide of Escherichia coli to test the survival rate.
[0039]
One group was injected with saline only and another group was injected with LPS. No deaths were found in 5 days. On day 5, both groups were injected with toxic LPS. As a result, the physiological saline group died within 72 hours, but the non-toxic lipopolysaccharide group completely survived, and no deaths were observed. All injections were performed after the mice were lightly anesthetized.
[0040]
【The invention's effect】
The toxicity of LPS or lipopolysaccharide prepared by the method according to the present invention is 150-200 times lower than that of known LPS, 1 / 200,000,000 lower than that of E. coli LPS, and R.E. It is 150-200 times lower than that of LPS of Sphaeroides. This non-toxic LPS is effective as a prophylactic against endotoxemia.

Claims

A method for preparing a non-toxic lipopolysaccharide, comprising:
(I) culturing a bacterium of the genus Acidophilium represented by Accession No. ATCC 55963 in a common medium;
(Ii) separating the cultured bacteria and repeatedly washing the separated bacteria;
(Iii) extracting the washed bacteria with a lipophilic solvent;
(Iv) cooling the extract obtained by the extraction, and repeatedly centrifuging the cooled substance;
(V) dialyzing the supernatant obtained by the centrifugation,
(Vi) freeze-drying the dialyzed substance;
(Vii) treating the lyophilized substance with a polar solvent to precipitate lipopolysaccharide;
(Viii) drying the precipitated lipopolysaccharide;
A method that includes

The method according to claim 1, wherein the normal medium contains hexose and a nitrogen source as carbon sources.

3. The method of claim 2, wherein said hexose comprises one or more of glucose and galactose.

3. The method of claim 2, wherein said nitrogen source comprises one or more of yeast extract, ammonium sulfate, and minerals.

The method of claim 4, wherein the mineral comprises one or more of dipotassium magnesium phosphate and potassium chloride.

3. The method of claim 2, wherein the step of repeatedly washing the separated bacteria is performed with a composition of a normal medium excluding the contents of the carbon source and the nitrogen source.

The method of claim 1, wherein said extracting is performed at a temperature between 70C and 90C.

The method according to claim 1, wherein the step of separating the bacteria is performed by high-speed centrifugation, membrane filtration, or long-term gravity sedimentation in addition to centrifugation.

9. The method according to claim 8, wherein the centrifugation is performed at 4,000 to 10,000 rpm.

The method of claim 1, wherein the lipophilic solvent comprises one or more of phenol, butanol, and water.

The method according to claim 1, wherein the freeze-drying step freeze-drys the dialysate by freeze-drying.

The method of claim 1, wherein the polar solvent is an aliphatic alkanol having up to 4 carbon atoms.

A lipopolysaccharide prepared by the method of claim 1.