JP3594978B2

JP3594978B2 - Cancer cell proliferation method

Info

Publication number: JP3594978B2
Application number: JP18050493A
Authority: JP
Inventors: 俊和高野; 正博肥塚
Original assignee: Nitta Gelatin Inc
Current assignee: Nitta Gelatin Inc
Priority date: 1993-07-21
Filing date: 1993-07-21
Publication date: 2004-12-02
Anticipated expiration: 2019-12-02
Also published as: JPH0731470A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、癌細胞増殖方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌細胞を培養するために生体から癌細胞だけを取り出すことは困難であり、癌細胞に正常細胞が混入することが一般的である。取り出された細胞を体外培養して細胞数を増大させ、検査、試験などに利用したり、あるいは、体外培養の際に検査や試験を行ったりする。これらの場合、癌細胞に混在する正常細胞は癌細胞の増殖度を調べるのに妨げとなる。なぜなら、増殖度は細胞数の増加やコロニー形成や数などにより測定するため、混入し増殖した正常細胞がその測定値に大きな誤差を与えるからである。
【０００３】
正常細胞を除去するために、従来、軟寒天培養や無血清培養などで自然消滅させたり、物理的に除去したり、トリプシンなどの酵素で処理したり、免疫学的に分画したりする方法が提案された。これらの方法は、正常細胞を死滅させたり、あるいは、癌細胞を正常細胞から分離したりするものであり、正常細胞が混在する癌細胞を培養して選択的に増殖させるものではなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
癌細胞の増殖は間質系の正常細胞の産生した増殖因子（または成長因子）でその増殖が促されることがあるので、癌細胞を正常細胞の存在下で培養することが検討された。
正常細胞は、接着依存性（または足場依存性）を有するので、細胞を接着させるための培養基材が必要である。しかし、細胞を、コロナ放電処理したポリスチレン培養器など通常の培養基材に接着させて培養すると、正常細胞が癌細胞よりも優先的に増殖して培養基材全面に拡がり基材から癌細胞を巻きこんで剥離するので、癌細胞の培養を妨げる。
【０００５】
細胞の培養は、単に細胞数を増やすだけでは不十分であり、生体内においての増殖と同様にその細胞の特質を発揮させながら増殖させることが重要である。
この発明は、従来の癌細胞培養とは異なって、癌細胞に混在する正常細胞を殺さずにその増殖を停止あるいは抑制し、癌細胞だけをその特質を発揮させながら容易に選択的に増殖させる培養方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記課題を解決するために、水に合成高分子と細胞増殖因子を配合してなるコーティング液を支持基質に塗布し乾燥することにより得られる培養基材表面で、正常細胞が混在する癌細胞を培養し、癌細胞を選択的に増殖させる、癌細胞増殖方法であって、
前記合成高分子として、下限臨界共溶温度よりも低い温度では親水性を示し、下限臨界共溶温度以上では疎水性を示す感温性高分子を用い、
前記細胞増殖因子として、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ゼラチン、レクチン、接着性オリゴペプチドから選ばれる少なくとも１種の細胞増殖因子を用い、
前記培養を前記下限臨界共溶温度よりも高い温度で行うことによって培養時の培養基材表面に疎水性を付与する、
癌細胞増殖方法を提供する。
線維芽細胞などの正常細胞の増殖を停止または抑制し、かつ、癌細胞を増殖させるためには、癌細胞と正常細胞の増殖の違いを把握する必要がある。ここで癌細胞と正常細胞の増殖の違いを考えてみると、癌細胞は、正常細胞に比較すると、周辺を認識できずに接触阻止を失って増殖し、細胞配列の乱れ（クリスクロスまたは交差細胞配列とも言う）や重なり合い増殖（パイルド・アップ・グロース）を起こす。正常細胞は、規則的に配列し、培養基材の壁あるいは境界に当たれば必ず増殖を停止し、しかも、重なり合い増殖を起こさない。つまり、正常細胞は外部認識が正常であり、培養基材の表面性状の変化を認識するので、そのように認識した場合には癌細胞とは異なって増殖を停止することができる。この発明は、癌細胞と正常細胞のそのような相違点に着目し、両者の培養基材への認識差を生じさせる条件を見いだし、この条件を培養基材に持たせたことが特徴である。
【０００７】
細胞の培養基材への接着性は基材の表面性状が親水性であるほど良好になり、逆に疎水性だと低下する。基材表面が全体的に均一に親水性を持つ場合は癌細胞が生体内とは異なって平面的に増殖し、また、正常細胞が共存しているときには正常細胞が優先的に増殖する。
この発明で用いられる増殖因子は、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどに代表される細胞外マトリックスやゼラチン、レクチン、接着性オリゴペプチドなどが挙げられる。
【０００８】
この発明で用いられる合成高分子は、培養基材表面に上記細胞の非接着性（または疎水性）を付与し、正常細胞の伸展または増殖を抑制または停止するためのものであり、癌細胞や正常細胞を殺傷する毒性を持たないことが好ましい。好ましい合成高分子は、たとえば、感温性高分子、ポリスチレンのような疎水性を有する高分子であり、増殖因子と水中で混合された液を乾燥させることにより増殖因子と混ざり合った固体を生成するものが好ましい。感温性高分子は、ＬＣＳＴ（ＬｏｗｅｒＣｒｉｔｉｃａｌＳｏｌｕｔｉｏｎＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：下限臨界共溶温度、または、感温性高分子の水和と脱水和の転移温度）以上に昇温すると疎水性を示して水不溶性となり、それよりも低い温度に冷却すると親水性（水溶性）を示すという特性を持っている。感温性高分子としては、たとえば、ポリ−Ｎ−置換アクリルアミド誘導体、ポリ−Ｎ−置換メタクリルアミド誘導体、これらの共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール部分酢化物などが挙げられ、培養温度よりも低いＬＣＳＴを持っていることが好ましい。
【０００９】
この発明に用いる培養基材は、形状が限定されず、層、粒子、板、繊維、フレーク、スポンジ、マイクロビーズなどが可能であり、独立した固体でもよく、支持基質に付着した塗膜でもよい。支持基質は、たとえば、コロナ放電処理で親水性を付与したポリスチレンやポリエステル、その他の培養器などの親水性表面を持つ固体である。前記塗膜は、支持基質表面全体または一部に形成されうる。前記塗膜が支持基質表面の一部に形成される、たとえば、１または複数個のスポット状に形成されると、播種された正常細胞が塊を形成し、増殖した癌細胞と見分けがつきにくくなるという現象を防ぐことができ、好ましい。
【００１０】
前記培養基材は、たとえば、水に細胞増殖因子と合成高分子を配合してなる液を乾燥することにより作られる。該液は、増殖因子と合成高分子の水溶液であってもよい。前記塗膜は、前記液を支持基質に塗布して乾燥することにより形成されうる。
前記液は、合成高分子を増殖因子に対して１よりも大きい重量比、好ましくは５よりも大きい重量比、より好ましくは１３．３／１以下の重量比で含む。合成高分子を増殖因子に対して１以下の割合で含むと、基材表面では正常細胞が癌細胞よりも優先的に増殖するため、癌細胞を選択的に増殖させることができない。また、上記範囲の上限を上回ると基材表面が全体的に非接着性となって細胞が培養基材に付着せず培養できないおそれがある。
【００１１】
前記培養基材は、たとえば、下記▲１▼または▲２▼のやり方で作られうるが、その製造方法は特に限定されない。
▲１▼ 合成高分子を０．１２５ｗ／ｖ％以上、好ましくは０．２５〜１．５ｗ／ｖ％含み、合成高分子の増殖因子に対する重量比が上述の条件を満足するコーティング液を、２５℃以上、好ましくは２７〜２９℃で乾燥させる。このように低濃度で感温性高分子を含む液を２５℃未満の温度で乾燥させると、癌細胞を選択的に培養できる基材が得られない。高分子濃度０．１２５ｗ／ｖ％未満だと、乾燥温度をどのように設定しても癌細胞を選択的に培養できる基材が得られない。
【００１２】
▲２▼ 合成高分子を０．７５ｗ／ｖ％以上、好ましくは０．９〜２．０ｗ／ｖ％含み、合成高分子の増殖因子に対する重量比が上述の条件を満足するコーティング液をＬＣＳＴよりも低い温度、好ましくは１０〜２５℃で乾燥させる。高分子０．７５ｗ／ｖ％未満だと、上記▲１▼のやり方で培養基材を作る必要がある。高分子量が多すぎると細胞が基材に接着しないことがあるので上記上限値以下が好ましい。ＬＣＳＴよりも高い温度で乾燥させると、感温性高分子が凝集し、培養器から剥離し表面のコーティングが不均一になるおそれがある。
【００１３】
この発明で培養される癌細胞の種類は制限はなく、種々の癌細胞が可能である。この点は従来の方法とは異なる。癌細胞に混在する正常細胞も、線維芽細胞などいずれでも良く、制限はない。この点も従来の方法と異なる。この発明の方法は、細胞を接着させる対象として上記培養基材を用いること以外は従来の接着培養方法と同じやり方で行うことができる。培養に用いる液体培地や培養条件は、培養される細胞に応じて適宜設定すればよい。
【００１４】
この発明の方法を癌細胞傷害試験に適用する場合、癌細胞に接触させる薬剤は、制癌剤などである。癌細胞を薬剤に接触させてから上記培養基材に接着させて培養してもよいし、基材に接着させた癌細胞を薬剤の存在下で培養してもよい。基材への接着の前後で同じかまたは別の薬剤に接触させてもよい。
この発明の方法を用いると、癌細胞と正常細胞を識別することが可能である。たとえば、培養基材を支持基質である培養器表面に部分的に、スポット状に形成して培養を行うと、癌細胞は培養基材表面全体に増殖するのに正常細胞はそのスポット状部分には伸展せず増殖を停止するので、これによって識別することができる。
【００１５】
この発明の方法は、正常細胞が混入しやすい初代癌細胞の培養、臨床検体や形質転換した細胞を対象としてフォーカス形成による細胞の癌化能や悪性度の指標とする方法、単離した癌細胞を用いて抗癌剤（制癌剤）感受性試験や癌細胞に関連した酵素、細胞増殖因子、細胞外基質、腫瘍マーカーの研究、および、製品化、または、癌遺伝子、癌抑制遺伝子およびその産物の研究および製品化にも有用である。
【００１６】
この発明の方法によって培養された癌細胞は、たとえば、増殖因子と合成高分子のうちの一方または両方を選択的に溶解（分解して溶解する場合も含む）することにより、回収することも可能である。
【００１７】
【作用】
この発明によれば、実質的に合成高分子と細胞増殖因子からなる培養基材表面で、正常細胞が混在する癌細胞を培養するので、癌細胞が交差細胞配列や重なり合い増殖を起こす。しかも、正常細胞が混在する癌細胞を培養しても、正常細胞は合成高分子により伸展しなかったり増殖を停止または抑制されたりするのに対し、癌細胞はその合成高分子が混合されていても増殖する。このため、正常細胞が混在する癌細胞を選択的に増殖させることができる。
【００１８】
【実施例】
以下に、この発明の実施例と、この発明の範囲を外れた比較例とを示すが、この発明は下記実施例に限定されない。下記の製造例で作った合成高分子水溶液を以下の実施例と比較例で使用した。
（合成高分子水溶液の製造例）
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド５０ｇをベンゼン５００ｍｌに溶解し、２，２′−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）０．２ｇを重合開始剤として使用し、６０℃で１２時間、窒素気流中、攪拌下に重合を行って、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（以下、「ＰＮＩＰＡＡｍ」と言う）を製造した。この重合物はベンゼン中で沈殿するためデカンテーションした後、沈殿物をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、ジエチルエーテルを用いて沈殿精製を行った。得られたＰＮＩＰＡＡｍの１．０ｗ／ｖ％水溶液のＬＣＳＴ（濁度法による測定値）約３２℃であった。この水溶液をオートクレーブで滅菌処理し、ＬＣＳＴよりも低温にして再溶解し、０．２５、０．５、１．０、２．０および４．０ｗ／ｖ％の各水溶液を得た。
【００１９】
（実施例１Ａ）
０．３ｗ／ｖ％のコラーゲン水溶液（新田ゼラチン株式会社製品セルマトリックス・タイプＩ−Ｃ、ペプシン可溶化Ｉ型コラーゲン溶液）と１．０ｗ／ｖ％のＰＮＩＰＡＡｍ水溶液とを等量混合したものを４℃で１日間スターラーで攪拌してコーティング溶液を作った。このコーティング溶液は、ＰＮＩＰＡＡｍを０．５ｗ／ｖ％、コラーゲンを０．１５ｗ／ｖ％の濃度で含む。コーティング溶液を２８℃に保温し、同じ温度に保温した細胞培養用プラスチックディッシュ（２５０１０、岩城硝子株式会社製）に０．５ｍｌを注ぎ、ディッシュの表面全体をコーティング溶液で濡らした後、すぐに余剰液を吸い出して除去し、ディッシュを２８℃の恒温槽中に一晩入れて乾燥した。乾燥したディッシュはその表面にコラーゲンとＰＮＩＰＡＡｍを１：３．４の重量比で含む層を有する。乾燥したディッシュをウォームプレート（ＤＣ−ＭＰ１００ＤＭ、北里サプライ社製）上で３７℃に保温し、このディッシュに、３７℃に保温したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥ、日水製薬株式会社製、１０％牛胎仔血清含有）に４×１０^５細胞／ｍｌの割合で結腸癌株（ＤＬＤ−１）を懸濁した細胞懸濁液１ｍｌを播種した。この細胞懸濁液の入ったディッシュを空気／５％炭酸ガスインキュベーターに入れ３７℃で４日間培養した。培養４日後のディッシュ表面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１にその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００２０】
（比較例１Ａ）
実施例１Ａにおいて、コーティング溶液を１０℃に保温し、１０℃に保温したディッシュを用い、１０℃の恒温槽で乾燥したこと以外は実施例１Ａの操作を繰り返した。培養４日後のディッシュ表面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図３にその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００２１】
（実施例１Ｂ）
実施例１Ａにおいて、コーティング溶液を３０〜３４℃に保温し、３０〜３４℃に保温したディッシュを用い、３０〜３４℃の恒温槽で乾燥したこと以外は実施例１Ａの操作を繰り返した。培養４日後のディッシュ表面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図２にその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００２２】
図１〜３中、それぞれ、Ａは画面横全長６６４μｍで縦全長４３０μｍ、Ｂは画面横全長２６６６μｍで縦全長１７２７μｍである。図１〜３において、白い輪郭の黒い粒状の像が癌細胞である。
実施例１Ａと１Ｂでは、図１と２にそれぞれ見るように、個々の細胞が伸展せず球状に丸くなっている。比較例１Ａでは、図３にみるように、個々の細胞が丸くならずに多角形に伸展している。この現象は市販の培養器と同様に平面的な細胞伸展性である。なお、実施例１Ａ〜１Ｂも比較例１Ａも癌細胞特有の重なり合い増殖は示していた。
【００２３】
（実施例１Ｃ）
実施例１Ａにおいて、コーティング溶液のＰＮＩＰＡＡｍの濃度を１．０ｗ／ｖ％にしたこと、および、乾燥を１０℃で行ったこと以外は実施例１Ａの操作を繰り返した。培養４日後のディッシュ表面の様子を位相差顕微鏡で観察したところ、実施例１Ａと同様の結果が得られた。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００２４】
（実施例１Ｄ）
実施例１Ａにおいて、コーティング溶液のＰＮＩＰＡＡｍの濃度を２．０ｗ／ｖ％にしたこと、および、乾燥を１０℃で行ったこと以外は実施例１Ａの操作を繰り返した。培養４日後のディッシュ表面の様子を位相差顕微鏡で観察したところ、実施例１Ａと同様の結果が得られた。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００２５】
上記実施例１Ａ〜１Ｄと比較例１Ａの結果より、合成高分子として感温性高分子を用いると、コーティング溶液の乾燥温度によって培養基材の細胞に対する表面性状が変わり、細胞の伸展性、増殖形態に変化をもたらすことがわかる。
（実施例２Ａ〜２Ｃと比較例２Ａ〜２Ｃ）
実施例１Ａにおいて、コーティング溶液の乾燥温度を表１に示す温度に設定したこと、癌細胞株の代わりに生体から分離した癌細胞（表１参照）を含んだ外科手術材料を使用したこと以外は実施例１Ａの操作を繰り返した。培養６日後のディッシュ表面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図４〜９にその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００２６】
【表１】

図４〜９は、画面横全長６６４μｍで縦全長４３０μｍである。図４〜６では、島状の領域が癌細胞コロニーであり、一部は重なり増殖により厚いコロニー（黒い像）となっており、線維芽細胞は見られない。これに対し、図７〜９では、線維芽細胞（黒い細長い像）と配列が不規則でドーム状に増殖した癌細胞とが混在している。図７では左上から中央下部にかけてカギ状に占めている領域が正常細胞であり、その他の領域は癌細胞である。図８では左下から半島状に突き出している領域が正常細胞であり、その他の領域は癌細胞である。図９では、右上の丸い領域と中央下部の丸い領域が癌細胞であり、その他の領域は正常細胞である。実施例では、３検体とも癌細胞のみが増殖して線維芽細胞は増殖を示さないことが観察され、これらの実施例の培養基材が癌細胞の選択的培養に使用できることがわかる。
【００２７】
（実施例３Ａ）
０．３ｗ／ｖ％のコラーゲン水溶液（新田ゼラチン株式会社製品セルマトリックス・タイプＩ−Ｃ、ペプシン可溶化Ｉ型コラーゲン溶液）と２．０ｗ／ｖ％のＰＮＩＰＡＡｍ水溶液とを等量混合したものを４℃で１日間スターラーで攪拌してコーティング溶液を作った。このコーティング溶液は、ＰＮＩＰＡＡｍを１．０ｗ／ｖ％、コラーゲンを０．１５ｗ／ｖ％の濃度で含む。コーティング溶液を１０℃に保温し、同じ温度に保温した細胞培養用１２ウェル（ｗｅｌｌ）プレート（ＭＳ−８０１２０、スミトモベークライト株式会社製）に０．２５ｍｌ／ウェルの割合で表面全体を浸した後、すぐに余剰液を吸い出して、１０℃の恒温槽で２４時間乾燥した。乾燥したプレートは、そのウェル内面にコラーゲンとＰＮＩＰＡＡｍを１：６．７の重量比で含む層を有する。乾燥したプレートをウォームプレート（ＤＣ−ＭＰ１００ＤＭ、北里サプライ社製）上で３７℃に保温し、このプレートの各ウェルに、３７℃に保温したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥ、日水製薬株式会社製、１０％牛胎仔血清含有）に４×１０^５細胞／ｍｌの割合で肺癌細胞株（ＱＧ−５６）を懸濁した細胞懸濁液を、各ウェルの細胞数が５×１０^４個となるように播種した。この細胞懸濁液の入ったプレートを空気／５％炭酸ガスインキュベーターに入れ３７℃で５日間培養した。培養５日後のウェル内面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１０のＡにその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００２８】
他方、上記操作において、肺癌細胞株の代わりに線維芽細胞株（ＨＦＬ−１、正常細胞）を用いたこと以外は同様の操作を繰り返した。培養５日後のウェル内面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１０のＢにその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
（比較例３Ａ）
実施例３Ａにおいて、１．０ｗ／ｖ％のＰＮＩＰＡＡｍ水溶液を用いたこと、ＰＮＩＰＡＡｍを０．５ｗ／ｖ％、コラーゲンを０．１５ｗ／ｖ％の濃度で含むコーティング溶液を用いたこと以外は実施例３Ａの操作を繰り返した。培養５日後のウェル内面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１１のＡにその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００２９】
他方、上記操作において、肺癌細胞株の代わりに線維芽細胞株（ＨＦＬ−１、正常細胞）を用いたこと以外は同様の操作を繰り返した。培養５日後のウェル内面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１１のＢにその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
（実施例３Ｂ）
実施例３Ａにおいて、肺癌細胞株の代わりに、ＨＦＬ−１とＱＧ−５６を４：１の細胞数比で均一に混合した細胞群を用いたこと以外は実施例３Ａの操作を繰り返した。培養５日後のウェル内面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１２にその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００３０】
（比較例３Ｂ）
比較例３Ａにおいて、肺癌細胞株の代わりに、ＨＦＬ−１とＱＧ−５６を４：１の細胞数比で均一に混合した細胞群を用いたこと以外は比較例３Ａの操作を繰り返した。培養５日後のウェル内面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１３にその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００３１】
図１０〜１３中、画面横全長２６６６μｍで縦全長１７２７μｍである。図１０〜１３において、黒い粒状の像が癌細胞であり、黒い細長い像が線維芽細胞である。
比較例３Ａでは、図１１にみるように、癌細胞と線維芽細胞はそれぞれ市販の培養器に直接播種された場合と同様に培養器全体に平面的に偏平に増殖した。特に、線維芽細胞は密集した状態で平行した、規則的な配列を示している（細胞が流れるように配列している）。これに対し、実施例３Ａでは癌細胞が重なり合い増殖（パイルアップ、癌細胞の特徴の１つ）するのが認められ（図１０のＢ参照）、重なり合い増殖が培養器全体に拡がるが、線維芽細胞はほとんど増殖しなかった（図１０のＡ参照）。
【００３２】
実施例３Ｂでは、図１２にみるように、癌細胞は図の中央部に見るように多数集まって塊状になって増殖しているのに対し、線維芽細胞はごくわずかの基材に接着しているがほとんど増殖していない。このため、この発明によれば、癌細胞が正常細胞と共存していても癌細胞の選択的増殖が可能である。これに対し、比較例３Ｂでは、図１３にみるように、線維芽細胞が優先的に培養基材全体に増殖しており、癌細胞が平面的に伸展して部分的に増殖している。
【００３３】
上記実施例と比較例では、この発明の培養方法の効果をわかりやすく示すために細胞株を用いて培養を行ったが、次に、実際に初代培養を行った実施例と比較例を示す。
（実施例４Ａ）
この実施例では、生体から分離した直腸組織で外科手術材料を使用した。この材料では癌細胞と正常細胞とが共存している。３７℃に保温したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥ、日水製薬株式会社製、１０％牛胎仔血清含有）に４×１０^５細胞／ｍｌの割合で上記材料を酵素処理で分散して細胞懸濁液を得た。実施例３Ａにおいて、この細胞懸濁液を用いたこと以外は実施例３Ａの操作を繰り返した。培養５日後のディッシュ表面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１４にその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００３４】
（コントロール４Ａ）
実施例４Ａにおいて、ＰＮＩＰＡＡｍを含まず、コラーゲンを０．１５ｗ／ｖ％の濃度で含むコーティング溶液を作ったこと以外は実施例４Ａの操作を繰り返した。培養５日後のディッシュ表面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１５にその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００３５】
（比較例４Ａ）
実施例４Ａにおいて、コラーゲンを含まず、ＰＮＩＰＡＡｍを０．５ｗ／ｖ％の濃度で含むコーティング溶液を作ったこと以外は実施例４Ａの操作を繰り返した。しかし、癌細胞も線維芽細胞も接着しないので培養できなかった。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００３６】
（実施例４Ｂ）
生体から分離した肺組織の外科手術材料を使用したこと以外は実施例４Ａの操作を繰り返した。培養５日後のディッシュ表面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１６にその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
（コントロール４Ｂ）
実施例４Ｂにおいて、ＰＮＩＰＡＡｍを含まず、コラーゲンを０．１５ｗ／ｖ％の濃度で含むコーティング溶液を作ったこと以外は実施例４Ｂの操作を繰り返した。培養５日後のディッシュ表面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１７にその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００３７】
（実施例４Ｃ）
生体から摘出した肺組織の外科手術材料を使用したこと、および、乾燥を室温（２８℃±１℃）乾燥で行ったこと以外は実施例４Ａの操作を繰り返した。培養５日後のディッシュ表面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１８にその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００３８】
（コントロール４Ｃ）
実施例４Ｃにおいて、ＰＮＩＰＡＡｍを含まず、コラーゲンを０．１５ｗ／ｖ％の濃度で含むコーティング溶液を作ったこと以外は実施例４Ｃの操作を繰り返した。培養５日後のディッシュ表面の様子を位相差顕微鏡で観察した。図１９にその顕微鏡像を示す。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００３９】
図１４〜１９中、画面横全長６６４μｍで縦全長４３０μｍである。図１４、１６〜１９において、所々白くなっている黒い粒状の塊や真っ黒な大きな塊の像が癌細胞コロニーであり、黒い細長い像が線維芽細胞である。図１５では、左端の大きな丸い領域が癌細胞である。
図１４、１６および１８にみるように、この発明によれば、癌細胞は重なり合い増殖してコロニーを形成したのに対し、線維芽細胞は基材にごくわずかに接着しているが増殖が認められず、癌細胞が選択的に培養された。これに対し、図１５、１７および１９にみるように、比較例では、癌細胞（図１５の左端の丸い領域、図１７と１９の黒い領域）の周りに線維芽細胞が優先的に増殖して基材全体に拡がっていた。
【００４０】
（比較例５Ａ）
実施例３Ａにおいて、０．５ｗ／ｖ％のＰＮＩＰＡＡｍ水溶液を用いてＰＮＩＰＡＡｍを０．２５ｗ／ｖ％、コラーゲンを０．１５ｗ／ｖ％の濃度で含むコーティング溶液を作ったこと以外は実施例３Ａの操作を繰り返した。肺癌細胞株の代わりに線維芽細胞株（ＨＦＬ−１、正常細胞）を用いたこと以外は同じ操作を繰り返した。培養５日後、ＤＮＡ蛍光法で癌細胞と線維芽細胞のＤＮＡ量を測定した。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００４１】
（実施例５Ａ〜５Ｆおよび比較例５Ｂ）
比較例５Ａにおいて、コーティング溶液のＰＮＩＰＡＡｍ濃度または乾燥温度を表２に示すように変えたこと以外は比較例５Ａの操作を繰り返した。培養５日後、ＤＮＡ蛍光法で癌細胞と線維芽細胞のＤＮＡ量を測定した。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００４２】
【表２】

（コントロール５Ａ）
比較例５Ａにおいて、ＰＮＩＰＡＡｍを含まず、コラーゲンを０．１５ｗ／ｖ％の濃度で含むコーティング溶液を作ったこと以外は比較例５Ａの操作を繰り返した。肺癌細胞株の代わりに線維芽細胞株（ＨＦＬ−１、正常細胞）を用いたこと以外は同じ操作を繰り返した。培養５日後、ＤＮＡ蛍光法でＤＮＡ量を測定した。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００４３】
実施例５Ａ〜５Ｆと比較例５Ａ〜５Ｂの培養による癌細胞と線維芽細胞の増殖度を下式：
【００４４】
【数１】

【００４５】
【数２】

により求めた。増殖度１００％は、コラーゲン基材上での培養による増殖度と同じであることを意味する。結果を図２０〜２１に示した。
【００４６】
表２と図２０〜２１にみるように、感温性高分子濃度を高くするにつれて、正常細胞の増殖度は、癌細胞の増殖度に比べて大きく低下し、乾燥温度が高いとより大きく低下した。癌細胞の増殖度は乾燥温度の影響をほとんど受けない。
（実験１）
実施例４Ａと比較例４Ａで用いた各培養基材を使って、線維芽細胞株の培養実験を行った。乾燥したプレートをウォームプレート（ＤＣ−ＭＰ１００ＤＭ、北里サプライ社製）上で３７℃に保温し、このプレートの各ウェルに、３７℃に保温したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥ、日水製薬株式会社製、１０％牛胎仔血清含有）に４×１０^５細胞／ｍｌの割合で線維芽細胞株（ＮＢ−１）を懸濁した細胞懸濁液を、各ウェルの細胞数が７×１０^４個となるように播種した。この細胞懸濁液の入ったプレートを空気／５％炭酸ガスインキュベーターに入れ３７℃で６日間培養した。培養開始時、２日、４日、６日日後にそれぞれウェル内面に接着している細胞をエタノールで固定し、ＤＮＡ蛍光法で増殖度を測定した。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
【００４７】
線維芽細胞株をＨＦＬ−１およびＭＲＣ−５にそれぞれ変えて上記実験１を繰り返した。培養開始時、２日、４日、６日日後にそれぞれウェル内面に接着している細胞をエタノールで固定し、ＤＮＡ蛍光法で増殖度を測定した。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
実験１での測定結果を、実施例は図２２のＡのグラフに、比較例は図２２のＢのグラフに示した。
【００４８】
図２２にみるように、比較例４Ａの培養基材ではどの線維芽細胞も同様にどんどん増殖していくのに対し、実施例４Ａの培養基材では培養開始時の細胞数からほとんど増加していないかまたはわずかしか増加していないことから線維芽細胞の増殖が停止あるいは抑制されていることがわかる。顕微鏡観察により、線維芽細胞が死んでいないことを確認した。
【００４９】
（実施例６Ａ〜６Ｌ、比較例６Ａ〜６Ｆおよびコントロール６Ａ〜６Ｃ）
実施例３Ａにおいて、癌細胞株として表３に示すものを用いたこと、または、コーティング溶液のＰＮＩＰＡＡｍ濃度または乾燥温度を表３に示す数値に設定したこと以外は実施例３Ａの操作を繰り返した。培養５日後、ＤＮＡ蛍光法でＤＮＡ量を測定した。以上の操作を無菌的な条件下で行った。ＺＲ−７５−１は乳癌株、Ｃ−１は結腸癌株、Ａ−５４９は肺癌株である。
【００５０】
【表３】

実施例６Ａ〜６Ｌと比較例６Ａ〜６Ｆで培養された癌細胞の増殖度を上記数１に従って求め、結果を図２３に示した。
【００５１】
図２３にみるように、この発明の培養方法によれば、コラーゲン基材培養とほぼ同等かまたはわずかに低い増殖度で種々の癌細胞を増殖させることができる。
（実験２）
実施例３Ａで使用したコーティング溶液を市販の培養器に１マイクロリットルずつ、および、１０マイクロリットルずつ滴下し、培養器表面をコーティング溶液のスポットで部分的にコーティングし、１０℃および２８℃の各温度それぞれ乾燥したところ、表４の結果となった。
【００５２】
【表４】

ここで、分離層ありとは、円形のコーティング膜が白濁した内円と透明なその外周リング（同心円状）とを有することであり、分離層なしとは、コーティング膜が透明で均一な円形となっていることである。
【００５３】
内円部には細胞が接着し、それと同心円状の外周リング（外円部）には細胞が接着しないことから内円部はコラーゲンからなっており、外円部は合成高分子からなっていることがわかった。これらのことから、タイプＩコラゲナーゼ（ＴｙｐｅＩｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）のようなコラーゲンを溶かす酵素で内円部を溶かして細胞を回収する方法も考えられる。
【００５４】
（実験３）
実験２で使用したコーティング溶液において、コラーゲン濃度がそれぞれ０．００１５、０．０１５、０．１５ｗ／ｖ％の３種類設定し、実験２と同様にして滴下し、２８℃で乾燥させて、分離層を作り、顕微鏡下でマイクロメーターにより内円と外円の直径を測定した。結果は表５のとおりである。
【００５５】
【表５】

表４と５の結果は、この発明で使用する培養基材では癌細胞と正常細胞が接着しうる増殖因子主体とする部分が、合成高分子を主体とする部分で囲まれていて、正常細胞の増殖を抑制または停止させる境界が存在することを示している。
【００５６】
（実施例７Ａ〜７Ｃと比較例７Ａ〜７Ｂ）
実施例３Ａにおいて、ＰＮＩＰＡＡｍ濃度を表６に示す数値に変えたこと以外は実施例３Ａの操作を繰り返した。培養６日後、ウェル内面の様子を位相差顕微鏡で観察し、視野に占める細胞の面積を下記の基準で評価した。以上の操作を無菌的な条件下で行った。
◎…８０〜１００％
○…６０〜８０％
△…３０〜６０％
×…０〜３０％
結果を表６に示した。
【００５７】
【表６】

表６にみるように、乾燥温度が１０℃のときには、合成高分子濃度が０．７５〜２．０ｗ／ｖ％で癌細胞を選択的に増殖させることができる。
【００５８】
【発明の効果】
この発明の方法により、癌細胞の培養、特に初代癌細胞培養を行うと、癌細胞が生体内での増殖と同様にその特質を発揮しながら増殖し、また、癌細胞に混在する正常細胞の伸展や増殖は停止または抑制される。この発明によれば、正常細胞を殺傷する薬剤を使用したりそのような培養条件を設定したりする必要がない。この発明によれば、培養基材以外は一般の細胞培養と同じ条件、装置を用いて、癌細胞およびこれと共存する正常細胞の種類や量に関わらず、癌細胞を選択的に増殖させることができる。
【００５９】
この発明によれば、従来困難であった癌細胞と正常細胞の区別を簡便に行い、癌細胞を単独で培養可能であるため、癌細胞単独の実験、観察が可能である。また、癌細胞の単離による株化もより容易になる。
この発明の方法を用いて癌細胞傷害試験を行えば、培養試験成功率の向上が期待される。従来の初代癌細胞培養法では混入した正常細胞の影響が非常に大きいのでその影響を差し引いて試験データを解析していた。これに対し、この発明の方法を用いた細胞傷害試験データは、前記影響が少なくなるので、データそのものがより正確になり、また、前記影響を差し引いたとしても正確さが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１Ａで培養された癌細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図２】実施例１Ｂで培養された癌細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図３】比較例１Ａで培養された癌細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図４】実施例２Ａで培養された癌細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図５】実施例２Ｂで培養された癌細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図６】実施例２Ｃで培養された癌細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図７】比較例２Ａで培養された細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図８】比較例２Ｂで培養された細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図９】比較例２Ｃで培養された細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図１０】実施例３Ａで培養された細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図１１】比較例３Ａで培養された細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図１２】実施例３Ｂで培養された細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図１３】比較例３Ｂで培養された細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図１４】実施例４Ａで培養された癌細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図１５】コントロール４Ａで培養された細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図１６】実施例４Ｂで培養された癌細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図１７】コントロール４Ｂで培養された細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図１８】実施例４Ｃで培養された癌細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図１９】コントロール４Ｃで培養された細胞を示す位相差顕微鏡像である。
【図２０】コーティング液の合成高分子量に対する、癌細胞株と線維芽細胞株の増殖度を示すグラフである。
【図２１】コーティング液の合成高分子量に対する、癌細胞株と線維芽細胞株の増殖度を示すグラフである。
【図２２】線維芽細胞の培養日数による経時的増殖を示すグラフである。
【図２３】コーティング液の濃度と乾燥温度による癌細胞の増殖度の変化を示すグラフである。
【符号の説明】
ＱＧ−５６癌細胞株
ＨＦＬ−１線維芽細胞株
ＮＢ−１線維芽細胞株
ＭＲＣ−５線維芽細胞株
ＺＲ−７５−１乳癌株
Ｃ−１結腸癌株
Ａ−５４９肺癌株[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to a method for growing cancer cells.
[0002]
[Prior art]
It is difficult to remove only cancer cells from a living body in order to culture the cancer cells, and it is general that cancer cells are mixed with normal cells. The extracted cells are cultured in vitro to increase the number of cells, and are used for inspection and testing, or inspection and testing are performed during in vitro culture. In these cases, normal cells mixed with the cancer cells hinder the examination of the degree of proliferation of the cancer cells. This is because the proliferation degree is measured by an increase in the number of cells, the formation of colonies, the number of the cells, and the like, and contaminated and grown normal cells give a large error to the measured value.
[0003]
Conventionally, in order to remove normal cells, they are naturally eliminated by soft agar culture or serum-free culture, physically removed, treated with trypsin or other enzymes, or immunologically fractionated. Was suggested. These methods kill normal cells or separate cancer cells from normal cells, but do not selectively grow cancer cells mixed with normal cells by culturing them.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Since the growth of cancer cells may be promoted by growth factors (or growth factors) produced by normal cells of the stromal system, culturing cancer cells in the presence of normal cells was studied.
Since normal cells have an adhesion dependency (or anchorage dependency), a culture substrate for attaching the cells is required. However, when cells are adhered and cultured on a normal culture substrate such as a corona discharge-treated polystyrene incubator, normal cells grow more preferentially than cancer cells, spread over the entire culture substrate, and spread cancer cells from the substrate. It wraps around and detaches, hindering the culture of cancer cells.
[0005]
In culturing cells, simply increasing the number of cells is not sufficient, and it is important to grow cells while exhibiting the characteristics of the cells as in the case of growing in vivo.
The present invention, unlike conventional cancer cell cultures, stops or suppresses proliferation without killing normal cells mixed in cancer cells, and easily selectively grows cancer cells alone while exerting their characteristics. It is an object to provide a culture method.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present invention has been made in order to solve the above problems.Obtained by applying a coating solution composed of water and a synthetic polymer and cell growth factor to a support substrate and drying.Cultivate cancer cells mixed with normal cells on the culture substrate surface and selectively proliferate the cancer cells,Cancer cell proliferation methodAnd
As the synthetic polymer, a temperature-sensitive polymer showing hydrophilicity at a temperature lower than the lower critical solution temperature, and showing a hydrophobic property at a temperature higher than the lower critical solution temperature,
As the cell growth factor, collagen, laminin, fibronectin, vitronectin, proteoglycan, glycosaminoglycan, gelatin, lectin, using at least one cell growth factor selected from adhesive oligopeptides,
By imparting hydrophobicity to the culture substrate surface during culture by performing the culture at a temperature higher than the lower critical solution temperature,
Cancer cell proliferation methodI will provide a.
In order to stop or suppress the growth of normal cells such as fibroblasts and to grow cancer cells, it is necessary to understand the difference between the growth of cancer cells and that of normal cells. Considering the difference in growth between cancer cells and normal cells, cancer cells, when compared with normal cells, proliferate without recognition of their surroundings and lose contact inhibition, resulting in disordered cell arrangement (criscross or crossover). Cellular arrangement) and overlapping growth (piled up growth). Normal cells are regularly arranged and stop growing when they hit the wall or boundary of the culture substrate, and do not cause overlapping growth. In other words, normal cells have normal external recognition and recognize changes in the surface properties of the culture substrate, so that such recognition can stop proliferation differently from cancer cells. The present invention focuses on such a difference between cancer cells and normal cells, finds a condition that causes a recognition difference between the two culture substrates, and is characterized by having these conditions in the culture substrate. .
[0007]
The adhesiveness of the cells to the culture substrate becomes better as the surface properties of the substrate are more hydrophilic, and decreases when the surface properties of the substrate are more hydrophobic. When the surface of the base material has a uniform hydrophilic property as a whole, cancer cells proliferate planarly unlike in vivo, and when normal cells coexist, normal cells proliferate preferentially.
The growth factors used in the present invention include extracellular matrices represented by collagen, laminin, fibronectin, vitronectin, proteoglycans, glycosaminoglycans and the like, gelatin, lectins, adhesive oligopeptides and the like.
[0008]
The synthetic polymer used in the present invention is for imparting the non-adhesiveness (or hydrophobicity) of the cells to the surface of the culture substrate, and for suppressing or stopping the extension or proliferation of normal cells. It preferably has no toxicity to kill normal cells. Preferred synthetic polymers are, for example, temperature-sensitive polymers and polymers having hydrophobicity such as polystyrene, and a liquid mixed with growth factor and water is dried to produce a solid mixed with the growth factor. Are preferred. The temperature-sensitive polymer becomes hydrophobic and becomes water-insoluble when heated to a temperature higher than LCST (Lower Critical Solution Temperature: lower critical solution temperature or transition temperature between hydration and dehydration of the temperature-sensitive polymer). It has the property of exhibiting hydrophilicity (water solubility) when cooled to a lower temperature. Examples of the thermosensitive polymer include a poly-N-substituted acrylamide derivative, a poly-N-substituted methacrylamide derivative, a copolymer thereof, polyvinyl methyl ether, and a partially acetylated polyvinyl alcohol. Preferably also have a low LCST.
[0009]
The culture substrate used in the present invention is not limited in shape, and can be a layer, a particle, a plate, a fiber, a flake, a sponge, a microbead, or the like, and may be an independent solid or a coating film adhered to a support substrate. . The support substrate is, for example, a solid having a hydrophilic surface such as polystyrene or polyester imparted with hydrophilicity by corona discharge treatment, or another incubator. The coating may be formed on the entire surface or a part of the support substrate. When the coating film is formed on a part of the surface of the support substrate, for example, when it is formed in one or a plurality of spots, the seeded normal cells form clumps and are difficult to distinguish from proliferated cancer cells. This phenomenon can be prevented, which is preferable.
[0010]
The culture substrate is prepared, for example, by drying a liquid obtained by mixing a cell growth factor and a synthetic polymer in water. The liquid may be an aqueous solution of a growth factor and a synthetic polymer. The coating film may be formed by applying the liquid to a supporting substrate and drying the coating.
The liquid comprises a synthetic polymer in a weight ratio to the growth factor of greater than 1, preferably greater than 5, more preferably 13.3 / 1 or less. When the synthetic polymer is contained at a ratio of 1 or less with respect to the growth factor, the cancer cells cannot be selectively grown because the normal cells grow more preferentially than the cancer cells on the surface of the base material. On the other hand, if the value exceeds the upper limit of the above range, the surface of the substrate may be entirely non-adhesive, and the cells may not adhere to the culture substrate and cannot be cultured.
[0011]
The culture substrate can be produced, for example, by the following method (1) or (2), but the production method is not particularly limited.
{Circle around (1)} A coating solution containing the synthetic polymer in an amount of 0.125 w / v% or more, preferably 0.25 to 1.5 w / v%, and having a weight ratio of the synthetic polymer to the growth factor that satisfies the above-mentioned conditions is used as a coating solution. Dry at a temperature of at least 27 ° C, preferably at 27 to 29 ° C. If the liquid containing the thermosensitive polymer at such a low concentration is dried at a temperature of less than 25 ° C., a substrate on which cancer cells can be selectively cultured cannot be obtained. If the polymer concentration is less than 0.125 w / v%, a substrate on which cancer cells can be selectively cultured cannot be obtained regardless of the drying temperature.
[0012]
{Circle around (2)} A coating solution containing at least 0.75 w / v%, preferably 0.9 to 2.0 w / v% of the synthetic polymer and having a weight ratio of the synthetic polymer to the growth factor that satisfies the above conditions is determined by LCST. Dry at a low temperature, preferably 10-25 ° C. If the amount of the polymer is less than 0.75 w / v%, it is necessary to prepare a culture substrate in the manner described in (1) above. If the high molecular weight is too large, the cells may not adhere to the substrate, so that the above upper limit value is preferable. If the drying is performed at a temperature higher than the LCST, the temperature-sensitive polymer may agglomerate, peel off from the incubator, and the coating on the surface may become uneven.
[0013]
The type of cancer cells cultured in the present invention is not limited, and various cancer cells are possible. This is different from the conventional method. The normal cells mixed with the cancer cells may be any of fibroblasts and the like, and are not limited. This point is also different from the conventional method. The method of the present invention can be carried out in the same manner as the conventional adhesion culture method except that the above-mentioned culture substrate is used as an object to which cells are adhered. The liquid medium used for the culture and the culture conditions may be appropriately set according to the cells to be cultured.
[0014]
When the method of the present invention is applied to a cancer cell damage test, a drug to be brought into contact with a cancer cell is an anticancer drug or the like. The cancer cells may be brought into contact with the drug and then adhered to the culture substrate, followed by culture, or the cancer cells adhered to the substrate may be cultured in the presence of the drug. The same or another agent may be contacted before and after adhesion to the substrate.
Using the method of the present invention, it is possible to distinguish cancer cells from normal cells. For example, when a culture substrate is partially formed on the surface of an incubator serving as a support substrate in the form of spots and cultured, cancer cells grow on the entire surface of the culture substrate, while normal cells grow on the spot-shaped portion. Can be identified by this as it stops growing without expanding.
[0015]
The method of the present invention is a method of culturing primary cancer cells that are liable to be contaminated with normal cells, a method of using a clinical specimen or transformed cells as an indicator of the canceration ability or malignancy of cells by focus formation, isolated cancer cells Test for sensitivity to anticancer drugs (cancer drugs), research on enzymes, cell growth factors, extracellular matrix, tumor markers related to cancer cells, and commercialization, or research and products of oncogenes, tumor suppressor genes and their products It is also useful for conversion.
[0016]
Cancer cells cultured by the method of the present invention can be recovered, for example, by selectively lysing (including decomposing and lysing) one or both of a growth factor and a synthetic polymer. It is.
[0017]
[Action]
According to the present invention, cancer cells in which normal cells coexist are cultured on the surface of the culture substrate substantially composed of a synthetic polymer and a cell growth factor, so that the cancer cells cross each other or overlap and proliferate. Moreover, even when culturing cancer cells in which normal cells are mixed, normal cells do not spread or stop or are inhibited from growing due to the synthetic polymer, whereas cancer cells are mixed with the synthetic polymer. Also proliferate. Therefore, cancer cells in which normal cells are mixed can be selectively proliferated.
[0018]
【Example】
Hereinafter, examples of the present invention and comparative examples outside the scope of the present invention will be described, but the present invention is not limited to the following examples. The aqueous synthetic polymer solutions prepared in the following Production Examples were used in the following Examples and Comparative Examples.
(Production example of synthetic polymer aqueous solution)
50 g of N-isopropylacrylamide is dissolved in 500 ml of benzene, and 0.2 g of 2,2'-azobisisobutyronitrile (AIBN) is used as a polymerization initiator. Polymerization was performed to produce poly-N-isopropylacrylamide (hereinafter, referred to as “PNIPAAm”). This polymer was precipitated in benzene and decanted, and then the precipitate was dissolved in tetrahydrofuran (THF) and purified by precipitation using diethyl ether. The LCST (measured by a turbidity method) of a 1.0 w / v% aqueous solution of the obtained PNIPAAm was about 32 ° C. This aqueous solution was sterilized in an autoclave, and was redissolved at a lower temperature than the LCST to obtain 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, and 4.0 w / v% aqueous solutions.
[0019]
(Example 1A)
A solution prepared by mixing equal amounts of a 0.3 w / v% aqueous collagen solution (Cell Matrix Type IC, a product of Nitta Gelatin Co., pepsin solubilized type I collagen solution) and a 1.0 w / v% aqueous PNIPAAm solution. The coating solution was made by stirring with a stirrer at 4 ° C. for 1 day. This coating solution contains PNIPAAm at a concentration of 0.5 w / v% and collagen at a concentration of 0.15 w / v%. The coating solution was kept at 28 ° C., and 0.5 ml was poured into a plastic dish for cell culture (25010, manufactured by Iwaki Glass Co., Ltd.) kept at the same temperature. The liquid was sucked out and removed, and the dish was placed in a thermostat at 28 ° C. overnight and dried. The dried dish has on its surface a layer containing collagen and PNIPAAm in a weight ratio of 1: 3.4. The dried dish was kept at 37 ° C. on a warm plate (DC-MP100DM, manufactured by Kitasato Supply Co., Ltd.), and the dish was kept at 37 ° C. in a modified Dulbecco's modified Eagle's medium (DME, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., 10% 4 × 10 in fetal bovine serum⁵1 ml of a cell suspension in which a colon cancer cell line (DLD-1) was suspended at a rate of cells / ml was seeded. The dish containing the cell suspension was placed in an air / 5% CO 2 incubator and cultured at 37 ° C. for 4 days. The state of the dish surface after 4 days of culture was observed with a phase contrast microscope. FIG. 1 shows the microscope image. The above operation was performed under aseptic conditions.
[0020]
(Comparative Example 1A)
In Example 1A, the operation of Example 1A was repeated except that the coating solution was kept at 10 ° C. and dried in a 10 ° C. constant temperature bath using a dish kept at 10 ° C. The state of the dish surface after 4 days of culture was observed with a phase contrast microscope. FIG. 3 shows the microscope image. The above operation was performed under aseptic conditions.
[0021]
(Example 1B)
In Example 1A, the operation of Example 1A was repeated, except that the coating solution was kept at a temperature of 30 to 34 ° C, and the dish was kept at a temperature of 30 to 34 ° C and dried in a constant temperature bath of 30 to 34 ° C. The state of the dish surface after 4 days of culture was observed with a phase contrast microscope. FIG. 2 shows the microscope image. The above operation was performed under aseptic conditions.
[0022]
In FIGS. 1 to 3, A denotes a total screen width of 664 μm and a total length of 430 μm, and B denotes a total screen width of 2666 μm and a total length of 1727 μm. In FIGS. 1 to 3, a black granular image having a white outline is a cancer cell.
In Examples 1A and 1B, as seen in FIGS. 1 and 2, respectively, the individual cells are not extended and are spherically rounded. In Comparative Example 1A, as shown in FIG. 3, the individual cells are not rounded but extend in a polygonal shape. This phenomenon is a flat cell spreadability like a commercially available incubator. In addition, both Examples 1A and 1B and Comparative Example 1A showed overlapping growth specific to cancer cells.
[0023]
(Example 1C)
The procedure of Example 1A was repeated, except that the concentration of PNIPAAm in the coating solution was set to 1.0 w / v% and the drying was performed at 10 ° C. in Example 1A. When the state of the dish surface after 4 days of culture was observed with a phase contrast microscope, the same results as in Example 1A were obtained. The above operation was performed under aseptic conditions.
[0024]
(Example 1D)
The procedure of Example 1A was repeated, except that the concentration of PNIPAAm in the coating solution was set to 2.0 w / v% and the drying was performed at 10 ° C. in Example 1A. When the state of the dish surface after 4 days of culture was observed with a phase contrast microscope, the same results as in Example 1A were obtained. The above operation was performed under aseptic conditions.
[0025]
From the results of Examples 1A to 1D and Comparative Example 1A, when a temperature-sensitive polymer was used as the synthetic polymer, the surface properties of the culture substrate with respect to the cells changed depending on the drying temperature of the coating solution, and the extensibility and proliferation of the cells It turns out that it changes the form.
(Examples 2A to 2C and Comparative Examples 2A to 2C)
In Example 1A, except that the drying temperature of the coating solution was set to the temperature shown in Table 1, and that a surgical material containing cancer cells isolated from a living body (see Table 1) was used instead of the cancer cell line. The procedure of Example 1A was repeated. The state of the dish surface after 6 days of culture was observed with a phase contrast microscope. 4 to 9 show the microscope images. The above operation was performed under aseptic conditions.
[0026]
[Table 1]

FIGS. 4 to 9 show an overall screen length of 664 μm and an overall length of 430 μm. 4 to 6, the island-shaped region is a cancer cell colony, a part of the colony overlaps and forms a thick colony (black image) due to proliferation, and fibroblasts are not seen. On the other hand, in FIGS. 7 to 9, fibroblasts (black and elongated images) and cancer cells having irregular arrangement and growing in a dome shape are mixed. In FIG. 7, the area occupying a key from the upper left to the lower center is normal cells, and the other areas are cancer cells. In FIG. 8, the area projecting from the lower left in a peninsula shape is a normal cell, and the other area is a cancer cell. In FIG. 9, the upper right round region and the lower central round region are cancer cells, and the other regions are normal cells. In Examples, it was observed that only three cancer cells proliferated and fibroblasts did not show proliferation in all three samples, indicating that the culture substrate of these Examples can be used for selective culture of cancer cells.
[0027]
(Example 3A)
An equal volume mixture of 0.3 w / v% aqueous collagen solution (Nitta Gelatin Co., Ltd. cell matrix type IC, pepsin-solubilized type I collagen solution) and 2.0 w / v% PNIPAAm aqueous solution The coating solution was made by stirring with a stirrer at 4 ° C. for 1 day. This coating solution contains PNIPAAm at a concentration of 1.0 w / v% and collagen at a concentration of 0.15 w / v%. After keeping the coating solution at 10 ° C. and immersing the entire surface at a rate of 0.25 ml / well in a cell culture 12-well plate (MS-80120, manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) kept at the same temperature, Immediately, the excess liquid was sucked out and dried in a thermostat at 10 ° C. for 24 hours. The dried plate has a layer containing collagen and PNIPAAm at a weight ratio of 1: 6.7 on the inner surface of the well. The dried plate was kept at 37 ° C. on a warm plate (DC-MP100DM, manufactured by Kitasato Supply Co., Ltd.). 4 × 10 in 10% fetal calf serum)⁵A cell suspension in which a lung cancer cell line (QG-56) was suspended at a rate of cells / ml, the cell number in each well was 5 × 10⁴Seeded so as to be individual The plate containing the cell suspension was placed in an air / 5% CO 2 incubator and cultured at 37 ° C. for 5 days. The state of the inner surface of the well after 5 days of culture was observed with a phase contrast microscope. FIG. 10A shows the microscope image. The above operation was performed under aseptic conditions.
[0028]
On the other hand, the same operation was repeated except that a fibroblast cell line (HFL-1, a normal cell) was used instead of the lung cancer cell line in the above operation. The state of the inner surface of the well after 5 days of culture was observed with a phase contrast microscope. FIG. 10B shows a microscope image thereof. The above operation was performed under aseptic conditions.
(Comparative Example 3A)
Example 3A Example 3A except that a 1.0 w / v% aqueous solution of PNIPAAm was used, and a coating solution containing PNIPAAm at a concentration of 0.5 w / v% and collagen at a concentration of 0.15 w / v% was used. The operation of 3A was repeated. The state of the inner surface of the well after 5 days of culture was observed with a phase contrast microscope. FIG. 11A shows a microscope image thereof. The above operation was performed under aseptic conditions.
[0029]
On the other hand, the same operation was repeated except that a fibroblast cell line (HFL-1, a normal cell) was used instead of the lung cancer cell line in the above operation. The state of the inner surface of the well after 5 days of culture was observed with a phase contrast microscope. FIG. 11B shows a microscope image thereof. The above operation was performed under aseptic conditions.
(Example 3B)
The procedure of Example 3A was repeated, except that a cell group in which HFL-1 and QG-56 were uniformly mixed at a cell ratio of 4: 1 was used instead of the lung cancer cell line in Example 3A. The state of the inner surface of the well after 5 days of culture was observed with a phase contrast microscope. FIG. 12 shows the microscope image. The above operation was performed under aseptic conditions.
[0030]
(Comparative Example 3B)
In Comparative Example 3A, the procedure of Comparative Example 3A was repeated except that a cell group in which HFL-1 and QG-56 were uniformly mixed at a cell ratio of 4: 1 was used instead of the lung cancer cell line. The state of the inner surface of the well after 5 days of culture was observed with a phase contrast microscope. FIG. 13 shows the microscope image. The above operation was performed under aseptic conditions.
[0031]
In FIGS. 10 to 13, the screen has a total horizontal length of 2666 μm and a total vertical length of 1727 μm. In FIGS. 10 to 13, black granular images are cancer cells, and black elongated images are fibroblasts.
In Comparative Example 3A, as shown in FIG. 11, cancer cells and fibroblasts proliferated flat and flat over the entire incubator in the same manner as when each was directly seeded in a commercially available incubator. In particular, fibroblasts show a dense, parallel, regular array (cells are arranged to flow). On the other hand, in Example 3A, overlapping and growing of cancer cells (pile-up, one of the characteristics of cancer cells) was observed (see FIG. 10B), and overlapping and growing spread over the entire incubator. Cells hardly grew (see FIG. 10A).
[0032]
In Example 3B, as shown in FIG. 12, a large number of cancer cells aggregated and proliferated as shown in the center of the figure, whereas fibroblasts adhered to a very small number of substrates. But it has hardly grown. Therefore, according to the present invention, selective growth of cancer cells is possible even when the cancer cells coexist with normal cells. On the other hand, in Comparative Example 3B, as shown in FIG. 13, fibroblasts preferentially proliferate throughout the culture substrate, and cancer cells extend planarly and partially proliferate.
[0033]
In the above Examples and Comparative Examples, culturing was performed using cell lines in order to clearly show the effects of the culturing method of the present invention. Next, Examples and Comparative Examples in which primary culturing was actually performed will be described.
(Example 4A)
In this example, surgical material was used on rectal tissue separated from the body. In this material, cancer cells and normal cells coexist. 4 × 10 5 in Dulbecco's modified Eagle's medium (DME, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., containing 10% fetal calf serum) kept at 37 ° C.⁵The above material was dispersed by enzymatic treatment at a rate of cells / ml to obtain a cell suspension. The procedure of Example 3A was repeated, except that this cell suspension was used in Example 3A. The state of the dish surface after 5 days of culture was observed with a phase contrast microscope. FIG. 14 shows the microscope image. The above operation was performed under aseptic conditions.
[0034]
(Control 4A)
The procedure of Example 4A was repeated, except that a coating solution containing no collagen at a concentration of 0.15 w / v% was prepared without PNIPAAm. The state of the dish surface after 5 days of culture was observed with a phase contrast microscope. FIG. 15 shows the microscope image. The above operation was performed under aseptic conditions.
[0035]
(Comparative Example 4A)
The procedure of Example 4A was repeated except that a coating solution containing PNIPAAm at a concentration of 0.5 w / v% without collagen was prepared in Example 4A. However, the cells could not be cultured because neither the cancer cells nor the fibroblasts adhered. The above operation was performed under aseptic conditions.
[0036]
(Example 4B)
The procedure of Example 4A was repeated except that surgical material for lung tissue separated from the living body was used. The state of the dish surface after 5 days of culture was observed with a phase contrast microscope. FIG. 16 shows the microscope image. The above operation was performed under aseptic conditions.
(Control 4B)
Example 4B The procedure of Example 4B was repeated except that a coating solution containing PNIPAAm and containing collagen at a concentration of 0.15 w / v% was prepared. The state of the dish surface after 5 days of culture was observed with a phase contrast microscope. FIG. 17 shows the microscope image. The above operation was performed under aseptic conditions.
[0037]
(Example 4C)
The procedure of Example 4A was repeated, except that surgical materials for lung tissue extracted from the living body were used, and drying was performed at room temperature (28 ° C. ± 1 ° C.). The state of the dish surface after 5 days of culture was observed with a phase contrast microscope. FIG. 18 shows the microscope image. The above operation was performed under aseptic conditions.
[0038]
(Control 4C)
The procedure of Example 4C was repeated except that a coating solution containing no collagen and a concentration of 0.15 w / v% was prepared without PNIPAAm. The state of the dish surface after 5 days of culture was observed with a phase contrast microscope. FIG. 19 shows the microscope image. The above operation was performed under aseptic conditions.
[0039]
14 to 19, the total horizontal length of the screen is 664 μm and the total vertical length is 430 μm. 14 and 16 to 19, images of black granular masses and black large masses that are white in some places are cancer cell colonies, and black elongated images are fibroblasts. In FIG. 15, a large round area at the left end is a cancer cell.
As shown in FIGS. 14, 16 and 18, according to the present invention, cancer cells overlap and proliferate to form a colony, whereas fibroblasts adhere very slightly to the substrate but proliferate. However, the cancer cells were selectively cultured. In contrast, as shown in FIGS. 15, 17 and 19, in the comparative example, fibroblasts preferentially proliferated around the cancer cells (the rounded area at the left end in FIG. 15, and the black area in FIGS. 17 and 19). And spread throughout the substrate.
[0040]
(Comparative Example 5A)
In Example 3A, a coating solution containing PNIPAAm at a concentration of 0.25 w / v% and collagen at a concentration of 0.15 w / v% was prepared using a 0.5 w / v% PNIPAAm aqueous solution. The operation was repeated. The same operation was repeated except that a fibroblast cell line (HFL-1, a normal cell) was used instead of the lung cancer cell line. Five days after the culture, the DNA amounts of the cancer cells and fibroblasts were measured by the DNA fluorescence method. The above operation was performed under aseptic conditions.
[0041]
(Examples 5A to 5F and Comparative Example 5B)
The operation of Comparative Example 5A was repeated, except that the PNIPAAm concentration or the drying temperature of the coating solution was changed as shown in Table 2 in Comparative Example 5A. Five days after the culture, the DNA amounts of the cancer cells and fibroblasts were measured by the DNA fluorescence method. The above operation was performed under aseptic conditions.
[0042]
[Table 2]

(Control 5A)
The procedure of Comparative Example 5A was repeated, except that a coating solution containing no collagen and a concentration of 0.15 w / v% was prepared without PNIPAAm. The same operation was repeated except that a fibroblast cell line (HFL-1, a normal cell) was used instead of the lung cancer cell line. Five days after the culture, the amount of DNA was measured by a DNA fluorescence method. The above operation was performed under aseptic conditions.
[0043]
The degree of proliferation of cancer cells and fibroblasts obtained by culturing Examples 5A to 5F and Comparative Examples 5A to 5B is represented by the following formula:
[0044]
(Equation 1)

[0045]
(Equation 2)

Determined by The degree of proliferation of 100% means that the degree of proliferation is the same as that of the culture on the collagen substrate. The results are shown in FIGS.
[0046]
As shown in Table 2 and FIGS. 20 to 21, as the temperature-sensitive polymer concentration was increased, the growth rate of normal cells was significantly reduced as compared to the growth rate of cancer cells, and was significantly reduced at higher drying temperatures. did. The proliferation of cancer cells is hardly affected by the drying temperature.
(Experiment 1)
Using the respective culture substrates used in Example 4A and Comparative Example 4A, a fibroblast cell culture experiment was performed. The dried plate was kept at 37 ° C. on a warm plate (DC-MP100DM, manufactured by Kitasato Supply Co., Ltd.). 4 × 10 in 10% fetal calf serum)⁵A cell suspension in which a fibroblast cell line (NB-1) was suspended at a rate of cells / ml was used to prepare a cell number of 7 × 10⁴Seeded so as to be individual The plate containing the cell suspension was placed in an air / 5% CO 2 incubator and cultured at 37 ° C. for 6 days. At the start of the culture, 2 days, 4 days and 6 days later, the cells adhered to the inner surfaces of the wells were fixed with ethanol, and the degree of proliferation was measured by a DNA fluorescence method. The above operation was performed under aseptic conditions.
[0047]
Experiment 1 described above was repeated, except that the fibroblast cell lines were changed to HFL-1 and MRC-5, respectively. At the start of the culture, 2 days, 4 days and 6 days later, the cells adhered to the inner surfaces of the wells were fixed with ethanol, and the degree of proliferation was measured by a DNA fluorescence method. The above operation was performed under aseptic conditions.
The measurement results of Experiment 1 are shown in the graph of FIG. 22A for the example, and the graph of FIG.
[0048]
As shown in FIG. 22, all the fibroblasts similarly proliferate in the culture substrate of Comparative Example 4A, whereas the number of cells at the start of the culture in the culture substrate of Example 4A almost increases. The absence or only a slight increase indicates that the proliferation of fibroblasts has been stopped or suppressed. Microscopic observation confirmed that the fibroblasts were not dead.
[0049]
(Examples 6A to 6L, Comparative Examples 6A to 6F and Controls 6A to 6C)
The procedure of Example 3A was repeated, except that the one shown in Table 3 was used as the cancer cell line in Example 3A, or the PNIPAAm concentration or the drying temperature of the coating solution was set to the numerical values shown in Table 3. Five days after the culture, the amount of DNA was measured by a DNA fluorescence method. The above operation was performed under aseptic conditions. ZR-75-1 is a breast cancer strain, C-1 is a colon cancer strain, and A-549 is a lung cancer strain.
[0050]
[Table 3]

The degree of proliferation of the cancer cells cultured in Examples 6A to 6L and Comparative Examples 6A to 6F was determined according to the above equation 1, and the results are shown in FIG.
[0051]
As shown in FIG. 23, according to the culture method of the present invention, various types of cancer cells can be grown at a growth rate substantially equal to or slightly lower than that of collagen-based culture.
(Experiment 2)
The coating solution used in Example 3A was added dropwise to a commercially available incubator at a rate of 1 microliter or 10 microliters, and the surface of the incubator was partially coated with spots of the coating solution. Table 4 shows the results when each temperature was dried.
[0052]
[Table 4]

Here, “with a separating layer” means that the circular coating film has an inner circle in which the coating film becomes cloudy and a transparent outer peripheral ring (concentric circle), and “without the separating layer” means that the coating film has a transparent and uniform circular shape. It is becoming.
[0053]
Cells adhere to the inner circle, and cells do not adhere to the concentric outer ring (outer circle). Therefore, the inner circle is made of collagen, and the outer circle is made of synthetic polymer. I understand. From these facts, a method of dissolving the inner circle with an enzyme that dissolves collagen such as Type I collagenase (Type I collagenase) to recover the cells is also conceivable.
[0054]
(Experiment 3)
In the coating solution used in Experiment 2, three types of collagen concentrations of 0.0015, 0.015, and 0.15 w / v% were set, respectively, and the solution was dropped in the same manner as in Experiment 2, dried at 28 ° C., and separated. The layers were made and the diameters of the inner and outer circles were measured with a micrometer under a microscope. The results are as shown in Table 5.
[0055]
[Table 5]

The results in Tables 4 and 5 show that in the culture substrate used in the present invention, a portion mainly composed of a growth factor to which cancer cells and normal cells can adhere is surrounded by a portion mainly composed of a synthetic polymer. This indicates that there is a boundary that suppresses or stops the growth of E. coli.
[0056]
(Examples 7A to 7C and Comparative Examples 7A to 7B)
The procedure of Example 3A was repeated, except that the PNIPAAm concentration was changed to the values shown in Table 6 in Example 3A. Six days after the culture, the state of the inner surface of the well was observed with a phase contrast microscope, and the area of the cells in the visual field was evaluated according to the following criteria. The above operation was performed under aseptic conditions.
◎… 80-100%
○… 60-80%
△: 30-60%
×: 0 to 30%
The results are shown in Table 6.
[0057]
[Table 6]

As shown in Table 6, when the drying temperature is 10 ° C., the cancer cells can be selectively grown at a synthetic polymer concentration of 0.75 to 2.0 w / v%.
[0058]
【The invention's effect】
According to the method of the present invention, when culturing a cancer cell, particularly a primary cancer cell culture, the cancer cell proliferates while exhibiting its characteristics as well as the growth in a living body. Extension or proliferation is stopped or suppressed. According to the present invention, there is no need to use a drug that kills normal cells or set such culture conditions. According to the present invention, it is possible to selectively grow cancer cells regardless of the type or amount of cancer cells and normal cells coexisting therewith, using the same conditions and equipment as in general cell culture except for the culture substrate. Can be.
[0059]
According to the present invention, cancer cells and normal cells, which were conventionally difficult, can be easily distinguished and cancer cells can be cultured alone, so that experiments and observations of cancer cells alone are possible. In addition, it becomes easier to establish a cancer cell line by isolation.
If a cancer cell damage test is performed using the method of the present invention, an improvement in the success rate of the culture test is expected. In the conventional primary cancer cell culture method, the influence of the contaminated normal cells is very large, so the test data was analyzed by subtracting the influence. On the other hand, in the cytotoxicity test data using the method of the present invention, the influence is reduced, so that the data itself becomes more accurate, and even if the influence is subtracted, accuracy is expected.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a phase-contrast microscope image showing cancer cells cultured in Example 1A.
FIG. 2 is a phase contrast microscope image showing the cancer cells cultured in Example 1B.
FIG. 3 is a phase contrast microscope image showing the cancer cells cultured in Comparative Example 1A.
FIG. 4 is a phase contrast microscope image showing the cancer cells cultured in Example 2A.
FIG. 5 is a phase contrast microscope image showing the cancer cells cultured in Example 2B.
FIG. 6 is a phase contrast microscope image showing the cancer cells cultured in Example 2C.
FIG. 7 is a phase contrast microscope image showing cells cultured in Comparative Example 2A.
FIG. 8 is a phase contrast microscope image showing cells cultured in Comparative Example 2B.
FIG. 9 is a phase contrast microscope image showing cells cultured in Comparative Example 2C.
FIG. 10 is a phase contrast microscope image showing cells cultured in Example 3A.
FIG. 11 is a phase contrast microscope image showing cells cultured in Comparative Example 3A.
FIG. 12 is a phase contrast microscope image showing cells cultured in Example 3B.
FIG. 13 is a phase contrast micrograph showing cells cultured in Comparative Example 3B.
FIG. 14 is a phase contrast microscope image showing the cancer cells cultured in Example 4A.
FIG. 15 is a phase contrast microscope image showing cells cultured in Control 4A.
FIG. 16 is a phase contrast microscope image showing the cancer cells cultured in Example 4B.
FIG. 17 is a phase contrast microscope image showing cells cultured in Control 4B.
FIG. 18 is a phase contrast microscope image showing the cancer cells cultured in Example 4C.
FIG. 19 is a phase contrast microscope image showing cells cultured in Control 4C.
FIG. 20 is a graph showing the degree of proliferation of cancer cell lines and fibroblast cell lines with respect to the synthetic high molecular weight of the coating solution.
FIG. 21 is a graph showing the degree of proliferation of a cancer cell line and a fibroblast cell line with respect to the synthetic high molecular weight of a coating solution.
FIG. 22 is a graph showing the time-dependent growth of fibroblasts according to the number of culture days.
FIG. 23 is a graph showing a change in the proliferation of cancer cells depending on the concentration of the coating solution and the drying temperature.
[Explanation of symbols]
QG-56 cancer cell line
HFL-1 fibroblast cell line
NB-1 fibroblast cell line
MRC-5 fibroblast cell line
ZR-75-1 breast cancer strain
C-1 Colon cancer strain
A-549 Lung cancer strain

Claims

A cancer cell mixed with normal cells is cultured on the surface of a culture substrate obtained by applying a coating solution composed of water and a synthetic polymer and a cell growth factor to a support substrate, and drying. grown in, a cancer cell proliferation process,
As the synthetic polymer, a temperature-sensitive polymer showing hydrophilicity at a temperature lower than the lower critical solution temperature, and showing a hydrophobic property at a temperature higher than the lower critical solution temperature,
As the cell growth factor, collagen, laminin, fibronectin, vitronectin, proteoglycan, glycosaminoglycan, gelatin, lectin, using at least one cell growth factor selected from adhesive oligopeptides,
By imparting hydrophobicity to the culture substrate surface during culture by performing the culture at a temperature higher than the lower critical solution temperature,
Cancer cell proliferation method .

Coating solution comprises a synthetic polymer in a proportion of more than 0.125 W / v%, performed at 25 ° C. or higher temperature drying method according to claim 1.

Coating liquid contains a synthetic polymer in a proportion of more than 0.75w / v%, The method of claim 1.

The temperature-sensitive polymer is at least one selected from a poly-N-substituted acrylamide derivative, a poly-N-substituted methacrylamide derivative, a polymer thereof, polyvinyl methyl ether, and partially acetylated polyvinyl alcohol. 4. The method according to any one of 1 to 3.