JP3594287B2

JP3594287B2 - Chlorophyll determination method

Info

Publication number: JP3594287B2
Application number: JP24933998A
Authority: JP
Inventors: 淑郎五十嵐; 俊昌名越; 時喜雄大戸; 直広野田
Original assignee: Fuji Electric Holdings Ltd
Current assignee: Fuji Electric Co Ltd
Priority date: 1998-09-03
Filing date: 1998-09-03
Publication date: 2004-11-24
Anticipated expiration: 2018-09-03
Also published as: JP2000074841A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、環境水中に広く存在する植物や植物性プランクトンの葉緑素に含まれるクロロフィルの定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
緑色色素クロロフィルは、地球上の生物に不可欠な有機物や酸素を供給する植物の光合成の中で、重要な役割を演じている。クロロフィルが太陽光を吸収することから始まる光合成電子伝達系は、人工光合成を目指す多くの研究者によってその過程が解明されつつある。光合成は、クロロフィルにより太陽からの光エネルギーを効率良く化学エネルギーに変換する。
【０００３】
植物に由来するクロロフィルは、環境評価の重要な指標となる。例えば、環境水中のクロロフィル濃度は、水中の全窒素や全リン濃度および生体有機態炭素量を示す。そのため、クロロフィルの簡便かつ高感度・高精度な分析法の開発が強く望まれている。これまで、クロロフィルの定量は、主に、吸光光度法あるいは蛍光光度法などの分析法により行われていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記吸光光度法あるいは蛍光光度法においては、フェオフィチン等のクロロフィル分解生成物を分離しなければならない。従って、繁雑な操作を必要とした。また、これらの従来法では光源が必要であるため、光源の光量変動や、蛍光法では励起波長と蛍光波長の受光部での分離精度など、感度の面で高感度化に限界があった。
【０００５】
この発明は、従来の分析法の上述したような欠点を解決するためになされたもので、本発明の課題は、光源を用いない方法によりクロロフィルを簡便かつ高感度・高精度に分析できるクロロフィル定量方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前述の課題を解決するため、請求項１の発明では、クロロフィルを抽出した試料液に、アセトニトリルと水酸化ナトリウムをそれぞれ所定の濃度となるように添加した後、過酸化水素を添加しクロロフィルを酸化して生じる化学発光の化学発光強度を測定し、クロロフィル濃度と化学発光強度との相関について予め測定された検量結果に基づいて、試料液中のクロロフィル濃度を定量することとし、請求項２ないし７の発明では、さらに具体的かつ最適な方法を特定する。
【０００７】
例えば、アセトン中に抽出した試料液に、アセトニトリルと水酸化ナトリウムを、好ましくはそれぞれ３０〜５０ｖｏｌ％、２．５×１０^−４〜５．０×１０^−４Ｍ（Ｍｏｌ／ｌ）となるように添加した後、過酸化水素を好ましくは０．１〜０．２Ｍ（Ｍｏｌ／ｌ）となるように添加し、クロロフィルを酸化して生じる化学発光量から試料液中のクロロフィル濃度を定量することとした。その際、試料中の水分量を好ましくは７〜１２ｖｏｌ％とすることによって最大発光量が得られるようにする。また、クロロフィルの化学発光強度は、過酸化水素添加直後に生じる発光ピークの高さとする。
【０００８】
上記のような溶液中での化学発光反応を利用する化学発光分析法の最大の特徴は、簡便な装置で高い感度が得られることである。しかし、化学発光分析法を他の高感度な発光法である蛍光分析法や汎用されている吸光光度法と比較すると、分析法としての利用頻度にかなりの差があるのが実状である。これは、既存の化学発光反応が選択性に欠けるとともに、利用できる化学発光反応系の絶対数が少ないことに起因している。
【０００９】
この発明は、クロロフィルが、アセトニトリルと水酸化ナトリウム存在下で過酸化水素で酸化すると強い化学発光が生じること、に着目してなされたもので、上記各数値限定の範囲は、クロロフィル定量法として最適な範囲を示す。
【００１０】
上記化学発光分析法によれば、励起光源を必要としないため簡便な装置で測定ができる。また、吸光光度法、蛍光分析に比べ高感度となる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
図面に基づき、本発明の実施の形態について以下にのべる。
【００１２】
（実施例１：前処理条件の最適化）
クロロフィルａを発光基質とする反応系の検討を行ったところ、アセトニトリルと水酸化ナトリウム存在下、過酸化水素添加（０．１３Ｍ）によりクロロフィルａを酸化すると強い化学発光が得られることを見い出した。図１にクロロフィルａより得られた化学発光シグナルを示す。図１中（ａ）のチャートは、クロロフィルａの濃度が０ｎｇ／ｍＬの時の化学発光シグナルの経時変化を示す。（ｂ）のチャートは、クロロフィルａの濃度が１８ｎｇ／ｍＬ（３×１０^−８Ｍ）の時のシグナルの経時変化を示すもので、反応開始後、約１分間以内に鋭いピークが認められた（チャート速度５ｍｍ／ｍｉｎ）。
アセトニトリルと水酸化ナトリウム共存下、クロロフィルを過酸化水素により酸化することで得られる化学発光（クロロフィル化学発光）の各因子（アセトニトリル濃度、水酸化ナトリウム濃度、過酸化水素濃度、水分率）の最適条件の設定を下記のように行った。
【００１３】
先ず、アセトンと混合させる極性溶媒の種類について検討した。表１は、［クロロフィルａ］＝３×１０^−８Ｍ、［ＮａＯＨ］＝４．３×１０^−４Ｍ、［Ｈ_２Ｏ_２］＝０．１３Ｍとしたときの種々の極性溶媒３４ｖｏｌ％におけるクロロフィルａの化学発光強度を比較したものである。
【００１４】
【表１】

この結果から明らかなように、アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）を用いた場合のみ、特異的に強い化学発光が得られた。これは、図２の反応スキームに示されるように、反応系に添加されたアセトニトリルは、過酸化水素と反応しＯ_２ ⁻の生成を導き、他の極性溶媒を用いた場合には殆どＯ_２ ⁻の生成がないために、化学発光に際が生じたものと考えられる。
反応系におけるアセトニトリルの濃度を変化させた時の影響を図３に示す。図３において、クロロフィルａ濃度は３×１０^−８Ｍ，過酸化水素濃度は０．１３Ｍ，水酸化ナトリウム濃度は４．３×１０^−４Ｍである。最大レベルの化学発光強度は、アセトニトリルが３０〜５０ｖｏｌ％のほぼ平坦領域として観測された。
【００１５】
反応系における過酸化水素濃度の影響を図４に示す。図４において、クロロフィルａ濃度は３×１０^−８Ｍ，水酸化ナトリウム濃度は４．３×１０^−４Ｍ，アセトニトリルは３４ｖｏｌ％である。化学発光強度は過酸化水素濃度０．１Ｍまで急激に増加し、０．１〜０．２Ｍの領域（極大点０．１３Ｍ）で最大発光強度が観測された。極大値以上の濃度では発光強度の減少が見られた。
【００１６】
図５に水酸化ナトリウム濃度を変化させた時の化学発光強度の影響を示す。図５において、クロロフィルａ濃度は３×１０^−８Ｍ，過酸化水素濃度は０．１３Ｍ，アセトニトリルは３４ｖｏｌ％である。水酸化ナトリウム濃度は２．５×１０^−４〜５×１０^−４Ｍの間で化学発光量は最大となり、この時の反応系のｐＨは１１程度である。水酸化物イオンは図２に示したようにアセトニトリルとＨ_２Ｏ_２の反応により生じたＨＯＯからＯ_２ ⁻を導いている。５×１０^−４Ｍ以上では溶液の白濁が観測され、５×１０^−４Ｍ以上での化学発光強度の減少はアセトン−アセトニトリル溶媒における水酸化ナトリウムの塩析による影響と考えられる。
【００１７】
反応系における水分率の影響を検討した結果を図６に示す。図６において、クロロフィルａ濃度は３×１０^−８Ｍ，過酸化水素濃度は０．１３Ｍ，水酸化ナトリウム濃度は４．３×１０^−４Ｍ，アセトニトリルは３４ｖｏｌ％である。反応溶液中の水の量が増加するに従って、化学発光シグナルが急増し、７〜１２ｖｏｌ％で発光量のピークが見られた。
以上の結果をまとめると、極性溶媒としてアセトニトリルを用い、アセトニトリル３０〜５０ｖｏｌ％、水酸化ナトリウム濃度２．５×１０^−４〜５×１０^−４Ｍ、水分量７〜１２ｖｏｌ％、過酸化水素濃度０．１〜０．２Ｍとなるように、クロロフィルのアセトン抽出試料に添加することによって、クロロフィルの最大化学発光量が得られる。
クロロフィルと化学的構造が似ており、かつ自然界に広く分布するものに、ポルフィリンがある。本発明の反応のクロロフィル特異性を調べるため、クロロフィルで最大化学発光量の得られる条件で種々のポルフィリン化合物による化学発光の検討を行った。
【００１８】
種々のポルフィリン類、クロロフィル類により得られた化学発光強度の結果を表２に示す。また、検討を行ったポルフィリン化合物の構造を図７に示す。
【００１９】
【表２】

最大の化学発光強度は、クロロフィルａおよびｂにより得られた。クロロフィルａの中心金属イオンであるマグネシウムの脱離したフェオフィチンａとさらにフィトール基の解離したフェオフォルバイドａでは弱い化学発光が観測された。ポルフィン環を有した化合物はいずれも強い化学発光を示さなかった。また、テトラピロール鎖からなるビリルビンも非常に弱い化学発光強度を示しただけであった。しかし、コプロ−、ウロポルフィリンでは微弱発光が長時間（２時間以上）観測された。
【００２０】
表２に示されているように今回、使用された合成ポルフィリンＴＰＰ（ｔｅｔｒａｐｈｅｎｙｌｐｏｒｐｈｉｎｅ）、ＴＣＰＰ（５，１０，１５，２０−ｔｅｔｒａｋｉｓ（４−ｃａｒｂｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｏｒｐｈｉｎｅ）、ＴＨＰＰ（５，１０，１５，２０−ｔｅｔｒａｋｉｓ（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｏｒｐｈｉｎｅ）、ＴＭＰｙＰ（５，１０，１５，２０−ｔｅｔｒａｋｉｓ（１−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ−４−ｙｌ）ｐｏｒｐｈｉｎｅ）、ＴＳＰＰ（５，１０，１５，２０−ｔｅｔｒａｋｉｓ（４−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｏｒｐｈｉｎｅ）、Ｍｇ−ＴＳＰＰでは、殆ど化学発光が観測されなかった。クロロフィル類縁体であるクロリンｅ_６とその亜鉛錯体であるＺｎ−クロリンｅ_６は比較的大きな化学発光を示した。
【００２１】
図８にクロロフィルａの化学発光スペクトルを示す。図８において、過酸化水素濃度は０．１３Ｍ，水酸化ナトリウム濃度は４．３×１０^−４Ｍ，アセトニトリルは３４ｖｏｌ％である。得られた化学発光スペクトルの極大波長はよく知られた蛍光スペクトルの極大波長６８０ｎｍと異なり、化学発光スペクトルでは３０ｎｍ〜５０ｎｍブルーシフトしている。また、発光スペクトル全体の形状も異なる。このことより、本反応系で生じた励起生成物（発光体）はクロロフィル自身ではなく反応生成物、つまりクロロフィル分解物であることが予測できる。
【００２２】
図９にクロロフィルｂの化学発光スペクトルを示す。図９において、過酸化水素濃度は０．１３Ｍ，水酸化ナトリウム濃度は４．３×１０^−４Ｍ，アセトニトリルは３４ｖｏｌ％である。クロリン環の第３位にアルデヒド基を持つクロロフィルｂは、アルデヒドの電子吸引性により１８ｐ電子系の電子移動が抑制されている。そのため、クロロフィルａとは異なった分光特性を持っている。クロロフィルｂでも、蛍光スペクトルと化学発光スペクトルの間で大きな違いが観測された。したがって、クロロフィルｂにおいても発光化学種はクロロフィルｂの分解生成物であることが推定される。
【００２３】
以上のことから、この化学発光反応がポルフィリン類縁体の中でクロロフィルに特異的である理由として、３つのことが上げられる。１つは、クロロフィルがクロリン環骨格を有しているためである。図１０にクロリン環とポルフィン環の構造式を示したが、クロリン環はポルフィン環と比較して二重結合が一つ少ないため、共鳴系の広がりが小さく、共鳴安定性がポルフィン環に比べて低く分解し易い。そのためＯ_２ ⁻の付加反応による１，２−ジオキセタン誘導体（１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）が生成しやすい。
【００２４】
２つ目は、クロロフィルの中心金属であるマグネシウムにより発光体の蛍光強度および蛍光量子収率が増加するためである。一般にポルフィリン化合物は、マグネシウムや亜鉛などの閉殻反磁性金属イオンと錯形成すると剛直性が増し、励起状態が安定化され蛍光強度の増加が観測される。クロロフィルａとフェオフィチンａの蛍光量子収率を比較しても約３倍、クロロフィルａが大きな値を持つ。
【００２５】
最後に、３つ目として、マグネシウムの正電荷の影響が考えられる。中心原子部分の正電荷の強さとクロロフィルと酸素分子の相互作用の大きさには相関性があることが知られている。本反応系で生成しているＯ_２ ⁻との反応性もＯ_２と同様にＭｇ（ＩＩ）錯体であるクロロフィルが大きくなり反応速度が大きくなったと考えられる。実際に、クロロフィルａとフェオフィチンａとの化学発光シグナルを比較すると極大ピークの出現時間が異なっている（クロロフィル０．５ｍｉｎ、フェオフィチン１ｍｉｎ、表２の条件）。
【００２６】
（実施例２：クロロフィル定量手順）
上記新しい特異的な化学発光系に基づいて、環境水中の超微量クロロフィルの定量を行うための手順を次に述べる。
【００２７】
湖水、河川水、海水等の環境試料水０．５〜３ｄｍ^３をガラス繊維フィルターでろ過する。フィルター上のアオコ等の残留物を１０ｍｌアセトンで粉砕し抽出する。その後、遠心分離（２０００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ）により浮遊物を除去し、上澄み液をクロロフィルを含む試料とする。その後、化学発光用ガラス製試験管にクロロフィルを含む試料２５０ｌを注入し、アセトニトリル１６０ｌ、５ｘ１０^−３ＭＮａＯＨ水溶液４０ｌを入れ化学発光装置のセルホルダーにセットする。アセトニトリルで３Ｍに調製した過酸化水素２０ｌを注入し反応を開始させ、注入して数秒後に現れる化学発光シグナルを測定する。
【００２８】
なお、クロロフィルａ、ｂをそれぞれ測定する時は、ペーパーあるいは薄層クロマトグラフィーにより分離後測定する。本操作では分離中に起こる変性の少ないＣ_１８修飾シリカを固定相とする逆相薄層クロマトグラフィーで分離を行った。展開溶媒としては、メタノール−石油ベンジン溶媒系（８：２）が適する。
【００２９】
クロロフィル化学発光系に金属イオンおよび蛍光物質を共存させた時の影響を検討した。結果を表３に示す。
【００３０】
【表３】

本反応系ではアセトニトリルと過酸化水素が反応しＯ_２ ⁻が生成する。そのため、多くの化学発光系（ルミノールＣＬ、ルシゲニンＣＬなど）に見られるような金属イオンによる触媒作用は見られなかった。鉄（ＩＩ）によるフェントン反応や他の遷移金属イオンと過酸化水素の反応による大きな影響は観測されなかったが、多少の化学発光強度の減少が観測された。しかし、アセトニトリルが反応系に３４ｖｏｌ％存在しており図２の反応が進行するため大きな妨害にはならなかった。金属イオンについては、環境水のろ過により完全な除去が可能である。
【００３１】
蛍光物質の影響はｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、９，１０−ｄｉｐｈｅｎｙｌａｎｔｈｒａｃｅｎｅ、９，１０−ｂｉｓ（ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｎｙｌ）− ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ、において見られなかった。ＲｈｏｒｄａｍｉｎｅＢでは同条件においてキサンテン系色素による化学発光が進むため発光強度の増加が見られた。ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎなどの蛍光物質による発光が見られなかったことより本反応系が色素増感発光ではないことがわかる。
【００３２】
クロロフィルａ、ｂ標準溶液により得られた検量線を図１１，図１２に示す。図１１，図１２において、光電子増倍管の印加電圧は、８００Ｖとした。最適条件下でクロロフィルａ、ｂの検量線を作成した結果、それぞれ０．９０ｎｇ／ｍｌ〜９．０ｇ／ｍｌ、０．７２ｎｇ／ｍｌ〜９．０ｇ／ｍｌの範囲で良好な直線が得られた。相関係数は０．９９９であった。クロロフィルａ濃度１８ｎｇ／ｍｌにおける相対標準偏差は２．５２％（８回測定）であった。
【００３３】
前記手順と、上記検量線に基づいて、実際の測定対象とする例えば環境水中のクロロフィル濃度を、簡便かつ高精度に定量することができる。
【００３４】
【発明の効果】
上記のとおり、請求項１ないし７の発明によれば、クロロフィルを抽出した試料液に、アセトニトリルと水酸化ナトリウムをそれぞれ所定の濃度となるように添加した後、過酸化水素を添加しクロロフィルを酸化して生じる化学発光の化学発光強度を測定し、クロロフィル濃度と化学発光強度との相関について予め測定された検量結果に基づいて、試料液中のクロロフィル濃度を定量することとしたので、従来のように、光源を用いることなく、簡便かつ高感度・高精度にクロロフィルの濃度を定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】クロロフィルａの化学発光信号を示す図である。
【図２】アセトニトリル中におけるＯ_２ ⁻ラジカルの生成反応スキームを示す図である。
【図３】クロロフィルの化学発光強度に対するアセトニトリル濃度の影響を示す図である。
【図４】クロロフィルの化学発光強度に対する過酸化水素濃度の影響を示す図である。
【図５】クロロフィルの化学発光強度に対する水酸化ナトリウム濃度の影響を示す図である。
【図６】クロロフィルの化学発光強度に対する水分量の影響を示す図である。
【図７】この発明の実施例で用いたポルフィリン化合物の化学構造を示す図である。
【図８】クロロフィルａの化学発光スペクトルを示す図である。
【図９】クロロフィルｂの化学発光スペクトルを示す図である。
【図１０】クロリン環とポルフィン環の共鳴状態の違いを示す図である。
【図１１】クロロフィルａの検量線を示す図である。
【図１２】クロロフィルｂの検量線を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for quantifying chlorophyll contained in chlorophyll of plants and phytoplankton widely existing in environmental water.
[0002]
[Prior art]
The green pigment chlorophyll plays an important role in the photosynthesis of plants that supply organic matter and oxygen that are essential for terrestrial organisms. The process of photosynthetic electron transport, which begins with the absorption of sunlight by chlorophyll, is being elucidated by many researchers aiming at artificial photosynthesis. In photosynthesis, chlorophyll efficiently converts light energy from the sun into chemical energy.
[0003]
Chlorophyll derived from plants is an important indicator for environmental assessment. For example, the concentration of chlorophyll in environmental water indicates the concentration of total nitrogen and total phosphorus in water and the amount of biological organic carbon. Therefore, development of a simple, high-sensitivity, high-precision analysis method for chlorophyll is strongly desired. Heretofore, quantification of chlorophyll has been mainly performed by an analytical method such as an absorption spectrophotometry or a fluorescence photometry.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
In the absorptiometry or the fluorometry, chlorophyll decomposition products such as pheophytin must be separated. Therefore, complicated operations were required. In addition, since these conventional methods require a light source, there has been a limit to increasing the sensitivity in terms of sensitivity, such as fluctuations in the light amount of the light source, and the separation accuracy of the excitation wavelength and the fluorescence wavelength at the light receiving unit in the fluorescence method.
[0005]
The present invention has been made in order to solve the above-mentioned drawbacks of the conventional analysis method, and an object of the present invention is to provide a method for chlorophyll quantification which can easily and highly sensitively and accurately analyze chlorophyll by a method without using a light source. It is to provide a method.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problems, in the invention of claim 1, acetonitrile and sodium hydroxide are added to a sample solution from which chlorophyll has been extracted so as to have respective predetermined concentrations, and then hydrogen peroxide is added to oxidize chlorophyll. Measuring the chemiluminescence intensity of the chemiluminescence generated by the measurement, and quantifying the chlorophyll concentration in the sample solution based on a calibration result previously measured for a correlation between the chlorophyll concentration and the chemiluminescence intensity. In the invention, a more specific and optimal method is specified.
[0007]
For example, acetonitrile and sodium hydroxide are preferably added to a sample solution extracted in acetone, preferably in an amount of 30 to 50 vol% and 2.5 × 10 ^{−4 to} 5.0 × 10 ⁻⁴ M (Mol / l). And then adding hydrogen peroxide, preferably in an amount of 0.1 to 0.2 M (Mol / l), and quantifying the chlorophyll concentration in the sample solution from the amount of chemiluminescence generated by oxidizing chlorophyll. And At this time, the maximum light emission amount is obtained by adjusting the amount of water in the sample to preferably 7 to 12 vol%. In addition, the chemiluminescence intensity of chlorophyll is defined as the height of a luminescence peak generated immediately after the addition of hydrogen peroxide.
[0008]
The greatest feature of the chemiluminescence analysis method utilizing a chemiluminescence reaction in a solution as described above is that high sensitivity can be obtained with a simple apparatus. However, when the chemiluminescence analysis method is compared with other highly sensitive luminescence methods, such as a fluorescence analysis method and a commonly used absorptiometry method, there is a substantial difference in the frequency of use as an analysis method. This is because existing chemiluminescent reactions lack selectivity and the available absolute number of chemiluminescent reaction systems is small.
[0009]
The present invention has been made with a focus on the fact that chlorophyll generates strong chemiluminescence when oxidized with hydrogen peroxide in the presence of acetonitrile and sodium hydroxide. Range.
[0010]
According to the above chemiluminescence analysis method, the measurement can be performed with a simple device because an excitation light source is not required. In addition, the sensitivity is higher than that of the absorption spectrophotometry and the fluorescence analysis.
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings.
[0012]
(Example 1: optimization of pretreatment conditions)
When a reaction system using chlorophyll a as a luminescent substrate was examined, it was found that strong chemiluminescence was obtained by oxidizing chlorophyll a by adding hydrogen peroxide (0.13 M) in the presence of acetonitrile and sodium hydroxide. FIG. 1 shows a chemiluminescence signal obtained from chlorophyll a. The chart (a) in FIG. 1 shows the change over time of the chemiluminescence signal when the concentration of chlorophyll a is 0 ng / mL. The chart in (b) shows the time-dependent change of the signal when the concentration of chlorophyll a was 18 ng / mL (3 × 10 ⁻⁸ M), and a sharp peak was recognized within about 1 minute after the start of the reaction. (Chart speed 5 mm / min).
Optimal conditions for each factor (acetonitrile concentration, sodium hydroxide concentration, hydrogen peroxide concentration, moisture content) of chemiluminescence (chlorophyll chemiluminescence) obtained by oxidizing chlorophyll with hydrogen peroxide in the presence of acetonitrile and sodium hydroxide Was set as follows.
[0013]
First, the types of polar solvents to be mixed with acetone were examined. Table 1 shows that, when [chlorophyll a] = 3 × 10 ⁻⁸ M, [NaOH] = 4.3 × 10 ⁻⁴ M, and [H ₂ O ₂ ] = 0.13 M, at 34 vol% of various polar solvents. It is a comparison of the chemiluminescence intensity of chlorophyll a.
[0014]
[Table 1]

As is clear from the results, specifically strong chemiluminescence was obtained only when acetonitrile was used. This is because, as shown in the reaction scheme of FIG. 2, acetonitrile was added to the reaction system is reacted with hydrogen peroxide O ₂ ^- leads to production of, almost O ₂ in the case of using other polar solvents ^- for generation which no, it is considered to be caused when the chemiluminescence.
FIG. 3 shows the effect of changing the concentration of acetonitrile in the reaction system. In FIG. 3, the concentration of chlorophyll a is 3 × 10 ⁻⁸ M, the concentration of hydrogen peroxide is 0.13 M, and the concentration of sodium hydroxide is 4.3 × 10 ⁻⁴ M. The maximum level of the chemiluminescence intensity was observed as a substantially flat region of 30 to 50 vol% acetonitrile.
[0015]
FIG. 4 shows the effect of the concentration of hydrogen peroxide in the reaction system. In FIG. 4, chlorophyll a concentration is 3 × 10 ⁻⁸ M, sodium hydroxide concentration is 4.3 × 10 ⁻⁴ M, and acetonitrile is 34 vol%. The chemiluminescence intensity sharply increased to a hydrogen peroxide concentration of 0.1 M, and the maximum luminescence intensity was observed in a region of 0.1 to 0.2 M (maximum point 0.13 M). At a concentration higher than the maximum value, a decrease in emission intensity was observed.
[0016]
FIG. 5 shows the effect of the chemiluminescence intensity when the sodium hydroxide concentration was changed. In FIG. 5, the concentration of chlorophyll a is 3 × 10 ⁻⁸ M, the concentration of hydrogen peroxide is 0.13 M, and the concentration of acetonitrile is 34 vol%. When the sodium hydroxide concentration is between 2.5 × 10 ^{−4 and} 5 × 10 ⁻⁴ M, the amount of chemiluminescence becomes maximum, and the pH of the reaction system at this time is about 11. As shown in FIG. 2, the hydroxide ion leads O ₂ ⁻ from HOO generated by the reaction between acetonitrile and H ₂ O ₂ . At 5 × 10 ⁻⁴ M or higher, cloudiness of the solution was observed, and at 5 × 10 ⁻⁴ M or higher, the decrease in chemiluminescence intensity was considered to be due to the salting out of sodium hydroxide in an acetone-acetonitrile solvent.
[0017]
FIG. 6 shows the result of examining the effect of the water content in the reaction system. In FIG. 6, the concentration of chlorophyll a is 3 × 10 ⁻⁸ M, the concentration of hydrogen peroxide is 0.13 M, the concentration of sodium hydroxide is 4.3 × 10 ⁻⁴ M, and the concentration of acetonitrile is 34 vol%. As the amount of water in the reaction solution increased, the chemiluminescence signal sharply increased, and a peak in the amount of luminescence was observed at 7 to 12 vol%.
To summarize the above results, acetonitrile was used as a polar solvent, acetonitrile 30 to 50 vol%, sodium hydroxide concentration 2.5 × 10 ^{−4 to} 5 × 10 ⁻⁴ M, water content 7 to 12 vol%, hydrogen peroxide concentration The maximum amount of chlorophyll chemiluminescence can be obtained by adding it to an acetone-extracted sample of chlorophyll so as to be 0.1-0.2M.
Porphyrins are similar in chemical structure to chlorophyll and are widely distributed in nature. In order to investigate the chlorophyll specificity of the reaction of the present invention, chemiluminescence by various porphyrin compounds was examined under the condition that the maximum chemiluminescence amount was obtained with chlorophyll.
[0018]
Table 2 shows the results of chemiluminescence intensity obtained with various porphyrins and chlorophylls. FIG. 7 shows the structure of the porphyrin compound studied.
[0019]
[Table 2]

Maximum chemiluminescence intensity was obtained with chlorophyll a and b. Weak chemiluminescence was observed for pheophytin a from which magnesium, which is the central metal ion of chlorophyll a, was eliminated, and pheophorbide a, from which a phytol group was further dissociated. None of the compounds having a porphine ring showed strong chemiluminescence. In addition, bilirubin composed of a tetrapyrrole chain only showed a very weak chemiluminescence intensity. However, faint luminescence was observed for copro- and uroporphyrin for a long time (2 hours or more).
[0020]
As shown in Table 2, the synthetic porphyrin TPP (tetraphenylporphine), TCPP (5,10,15,20-tetrakis (4-carboxyphenyl) porphine), THPP (5,10,15,20-) used herein were used. tetrakis (4-hydroxyphenyl) porphine), TMPyP (5,10,15,20-tetrakis (1-methylpyridinium-4-yl) porphine), TSPP (5,10,15,20-tetrakis (4-sulfophenyl) porphine) And Mg-TSPP, almost no chemiluminescence was observed. The chlorin e ₆ chlorophyll analogs thereof such zinc complex Zn- chlorin e ₆ showed a relatively large chemiluminescence.
[0021]
FIG. 8 shows a chemiluminescence spectrum of chlorophyll a. In FIG. 8, the concentration of hydrogen peroxide is 0.13 M, the concentration of sodium hydroxide is 4.3 × 10 ⁻⁴ M, and the concentration of acetonitrile is 34 vol%. The maximum wavelength of the obtained chemiluminescence spectrum is different from the well-known maximum wavelength of fluorescence spectrum of 680 nm, and the chemiluminescence spectrum has a blue shift of 30 nm to 50 nm. Also, the shape of the entire emission spectrum is different. From this, it can be predicted that the excitation product (luminous body) generated in the present reaction system is not chlorophyll itself but a reaction product, that is, a chlorophyll decomposition product.
[0022]
FIG. 9 shows a chemiluminescence spectrum of chlorophyll b. In FIG. 9, the concentration of hydrogen peroxide is 0.13 M, the concentration of sodium hydroxide is 4.3 × 10 ⁻⁴ M, and the concentration of acetonitrile is 34 vol%. In chlorophyll b having an aldehyde group at the third position of the chlorin ring, electron transfer of the 18p electron system is suppressed due to the electron withdrawing property of the aldehyde. Therefore, it has different spectral characteristics from chlorophyll a. Also for chlorophyll b, a large difference was observed between the fluorescence spectrum and the chemiluminescence spectrum. Therefore, it is presumed that the luminescent species of chlorophyll b is also a decomposition product of chlorophyll b.
[0023]
From the above, there are three reasons why this chemiluminescent reaction is specific to chlorophyll among porphyrin analogs. One is that chlorophyll has a chlorin ring skeleton. FIG. 10 shows the structural formulas of the chlorin ring and the porphine ring. Since the chlorin ring has one less double bond than the porphine ring, the resonance system has a small spread, and the resonance stability is lower than that of the porphine ring. Low and easy to disassemble. Therefore, a 1,2-dioxetane derivative (1,2-dioxetane derivative) is easily generated by the addition reaction of O ₂ ⁻ .
[0024]
The second is that magnesium, which is the central metal of chlorophyll, increases the fluorescence intensity and the fluorescence quantum yield of the luminous body. Generally, when a porphyrin compound forms a complex with a closed-shell diamagnetic metal ion such as magnesium or zinc, rigidity increases, an excited state is stabilized, and an increase in fluorescence intensity is observed. Even when comparing the fluorescence quantum yields of chlorophyll a and pheophytin a, chlorophyll a has a large value about three times.
[0025]
Finally, the third possibility is the influence of the positive charge of magnesium. It is known that there is a correlation between the intensity of the positive charge at the central atom and the magnitude of the interaction between chlorophyll and oxygen molecules. It is considered that the reactivity with O ₂ ⁻ generated in the present reaction system also increased the chlorophyll, which is an Mg (II) complex, similarly to O _2, and the reaction rate increased. Actually, when the chemiluminescence signals of chlorophyll a and pheophytin a are compared, the appearance time of the maximum peak is different (chlorophyll 0.5 min, pheophytin 1 min, conditions in Table 2).
[0026]
(Example 2: Chlorophyll determination procedure)
The procedure for quantifying ultra-trace chlorophyll in environmental water based on the new specific chemiluminescence system is described below.
[0027]
0.5 to 3 dm ³ of environmental sample water such as lake water, river water and sea water is filtered with a glass fiber filter. The residue, such as blue-green algae, on the filter is crushed and extracted with 10 ml of acetone. Thereafter, suspended matter is removed by centrifugation (2000 rpm, 15 min), and the supernatant is used as a sample containing chlorophyll. Thereafter, 250 l of a sample containing chlorophyll is poured into a glass test tube for chemiluminescence, and 160 l of acetonitrile and 40 l of a 5 × 10 ⁻³ M aqueous NaOH solution are put into a cell holder of the chemiluminescence device. The reaction is started by injecting 20 l of hydrogen peroxide adjusted to 3M with acetonitrile, and the chemiluminescence signal appearing a few seconds after the injection is measured.
[0028]
When each of chlorophylls a and b is measured, it is measured after separation by paper or thin layer chromatography. In this operation, separation was carried out by reversed-phase thin-layer chromatography using _C18- modified silica, which hardly changes during separation, as a stationary phase. As a developing solvent, a methanol-petroleum benzene solvent system (8: 2) is suitable.
[0029]
The effect of coexisting metal ions and fluorescent substances in the chlorophyll chemiluminescence system was investigated. Table 3 shows the results.
[0030]
[Table 3]

In this reaction system, acetonitrile and hydrogen peroxide react to generate O ₂ ⁻ . Therefore, no catalytic action by metal ions as seen in many chemiluminescent systems (luminol CL, lucigenin CL, etc.) was not observed. No significant effect was observed due to the Fenton reaction by iron (II) or the reaction of other transition metal ions with hydrogen peroxide, but a slight decrease in chemiluminescence intensity was observed. However, 34 vol% of acetonitrile was present in the reaction system, and the reaction of FIG. Metal ions can be completely removed by filtration of environmental water.
[0031]
The effect of the fluorescent substance was not seen in fluorescein, 9,10-diphenyllanthracene, and 9,10-bis (phenylethylynyl) -anthracene. In Rhordamine B, chemiluminescence by the xanthene-based dye proceeds under the same conditions, so that an increase in luminescence intensity was observed. No emission by a fluorescent substance such as fluorescein was observed, indicating that this reaction system was not dye-sensitized emission.
[0032]
The calibration curves obtained with the chlorophyll a and b standard solutions are shown in FIGS. 11 and 12, the applied voltage of the photomultiplier tube was 800 V. As a result of preparing calibration curves of chlorophylls a and b under optimal conditions, good straight lines were obtained in the ranges of 0.90 ng / ml to 9.0 g / ml and 0.72 ng / ml to 9.0 g / ml, respectively. was gotten. The correlation coefficient was 0.999. The relative standard deviation at a chlorophyll a concentration of 18 ng / ml was 2.52% (measured eight times).
[0033]
Based on the procedure and the calibration curve, the chlorophyll concentration in, for example, environmental water as an actual measurement target can be determined simply and with high accuracy.
[0034]
【The invention's effect】
As described above, according to the first to seventh aspects of the present invention, acetonitrile and sodium hydroxide are added to a sample solution from which chlorophyll has been extracted to a predetermined concentration, and then hydrogen peroxide is added to oxidize chlorophyll. The chemiluminescence intensity of the resulting chemiluminescence was measured, and the chlorophyll concentration in the sample solution was determined based on the calibration result previously measured for the correlation between the chlorophyll concentration and the chemiluminescence intensity. In addition, the chlorophyll concentration can be determined simply and with high sensitivity and high accuracy without using a light source.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a chemiluminescence signal of chlorophyll a.
It is a diagram illustrating a generation reaction scheme radicals ^- O ₂ in FIG. 2 in acetonitrile.
FIG. 3 is a diagram showing the effect of acetonitrile concentration on the chemiluminescence intensity of chlorophyll.
FIG. 4 is a graph showing the effect of the concentration of hydrogen peroxide on the chemiluminescence intensity of chlorophyll.
FIG. 5 is a graph showing the effect of sodium hydroxide concentration on the chemiluminescence intensity of chlorophyll.
FIG. 6 is a diagram showing the influence of the amount of water on the chemiluminescence intensity of chlorophyll.
FIG. 7 is a diagram showing a chemical structure of a porphyrin compound used in an example of the present invention.
FIG. 8 is a diagram showing a chemiluminescence spectrum of chlorophyll a.
FIG. 9 is a diagram showing a chemiluminescence spectrum of chlorophyll b.
FIG. 10 is a diagram showing a difference between resonance states of a chlorin ring and a porphine ring.
FIG. 11 is a diagram showing a calibration curve of chlorophyll a.
FIG. 12 is a diagram showing a calibration curve of chlorophyll b.

Claims

Acetonitrile and sodium hydroxide were added to the sample solution from which chlorophyll had been extracted to a predetermined concentration, respectively. A chlorophyll concentration in a sample liquid based on a calibration result previously measured for a correlation between the chlorophyll and the chemiluminescence intensity.

The method according to claim 1, wherein chlorophyll is extracted into acetone.

3. The method according to claim 2, wherein acetonitrile is added so that the concentration of acetonitrile in the sample solution is 30 to 50 vol%.

3. The method according to claim 2, wherein sodium hydroxide is added so that the concentration of sodium hydroxide in the sample solution is 2.5 × 10 ^{−4 to} 5.0 × 10 ⁻⁴ M. Method.

3. The method according to claim 2, wherein hydrogen peroxide is added so that the concentration of hydrogen peroxide in the sample solution is 0.1 to 0.2M.

6. The chlorophyll quantification method according to claim 2, wherein the water content of the sample solution in the acetone-acetonitrile mixed solvent is adjusted to be 7 to 12 vol%.

7. The chlorophyll determination method according to claim 1, wherein the chemiluminescence intensity of chlorophyll is a height of a luminescence peak generated immediately after addition of hydrogen peroxide.