JP3580615B2 - Urine particulate analysis reagent and particulate analysis method using the reagent - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、尿中有形成分分析用試薬及びその試薬を用いた有形成分分析方法に関し、より詳細には、フローサイトメトリーを応用した尿中の有形成分の光学的分析方法に用いられる試薬及びその分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
腎・尿路系の感染症、炎症性病変、変性病変、結石症、腫瘍などの疾患では、それぞれの疾患に応じて、尿中に種々の有形成分が出現する。有形成分としては、赤血球、白血球、上皮細胞、円柱、細菌、真菌、結晶、粘液糸などが挙げられる。尿中のこれらの成分を分析することは腎・尿路系の疾患の早期発見や異常部位の推定をする上で特に重要である。例えば、赤血球の測定は、腎臓の糸球体から尿道に至る経路における出血の有無を判定する上で重要であり、白血球の出現は、腎盂腎炎などの腎疾患の疑いが考えられ、炎症、感染症を早期発見することができる。また、円柱や赤血球の形態を調べることにより、その由来部位を推定することもできる。
【０００３】
従来より尿中の有形成分の分析は、顕微鏡により目視検査が広く行われている。まず、尿を遠心分離して濃縮し、その沈渣物を場合によっては染色後、顕微鏡スライド上に積載し、顕微鏡下で分類・計数を行うものである。
また近年では、フラットシースフローと画像処理技術とを組み合わせた自動測定装置が開発されている。これは、シース液を外層とし、きわめて偏平な流れに調節された尿試料液をビデオカメラで撮影し、この静止画面を画像処理することにより、試料液中の有形成分の像を切り出して表示するものである。その表示を検査技師が見ながら有形成分を判別し、分類処理が行われる。
【０００４】
さらに、尿中の有形成分を自動分類、計数するものとして、特開平４−３３７４５９号公報では、フローサイトメトリーを応用した尿中の細胞分析用試薬およびその方法が開示されている。その試薬は、蛍光染料、浸透圧補償剤及び緩衝剤を含み、種々の蛍光染料、浸透圧補償剤、緩衝剤が開示され、実施例には、蛍光染料としてニュートラルレッド、オーラミンＯを使用した試薬が記載されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところで尿検体は、採取後時間が経過するとともに有形成分の変性、細菌数の増加などの変化が起きるため、採取後なるべく早いうちに検査することが望まれる。
顕微鏡による目視検査では、尿検体の遠心、濃縮等の前処理に手間や時間がかかる上、鏡検作業は検査技師にとって大きな負担になる。また、観察細胞数が少ないため検査精度が低い。
【０００６】
一方、画像処理技術を利用した自動測定装置においては、鏡検作業に比べれば負担が軽減される点では有利であるものの、有形成分の判別は検査技師が行わなければならず、処理速度も遅いため検体数の多い場合には必ずしも満足できるものではない。
また、目視検査、画像処理による自動測定装置のいずれの方法においても、有形成分の判別には熟練を要する。
【０００７】
特開平４−３３７４５９号公報のフローサイトメトリーを尿分析に応用した方法では、迅速に測定が行える点で有利であるが、さらに検討を重ねた結果、以下の問題点があることが判明した。
【０００８】
（１） 尿中に結晶が出現すると赤血球との弁別が困難になる。
（２） 無晶性塩類が多数出現した検体は、他の細胞成分の分類が困難になる。
（３） 特開平４−３３７４５９号公報の実施例に示されたｐＨ８．５のオーラミンＯ含有試薬では、ヘモグロビンや蛋白を含む尿検体を測定すると、ヘモグロビンや蛋白が染料と結合し、微小沈殿物となって析出して測定ができなくなることがある。
（４） （３）はｐＨを酸性にすることによって解決することができるが、染色性が悪くなり、酵母様真菌が出現すると赤血球との弁別が困難になる。
【０００９】
（５） 尿をフローサイトメータで分析するときには、尿中に存在する有形成分の量が少ないことから希釈倍率を低く抑えなければならないが、希釈倍率を低くすると、尿中にビタミン類や抗生物質のような薬剤等の蛍光を発する物質が排泄される場合には、尿自身の背後蛍光（バックグラウンドノイズ）が無視できなくなり、有形成分の蛍光信号強度が得られない場合がある。また、ニュートラルレッドを使用した場合には、細胞と結合していない染料による背後蛍光の影響が大きい。
【００１０】
本発明は、上記の問題点に鑑みなされたもので、尿中の有形成分の分析をより精度よく行うことを目的する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、（ｉ） ｐＨを５．０〜９．０に保つための緩衝剤、（ｉｉ）浸透圧を１００ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜６００ｍＯｓｍ／Ｋｇに保つための浸透圧補償剤、（ｉｉｉ） 縮合ベンゼン誘導体系の第１染、（ｉｖ）損傷を受けた細胞を染色しうる第２蛍光染料、及び（ｖ） キレート剤を含有することからなる尿中有形成分分析用試薬が提供される。
【００１２】
また、別の観点から本発明によれば、（ｉ） ｐＨを５．０〜９．０に保つための緩衝剤、（ｉｉ）浸透圧を１００ｍＯｓｍ／Ｋｇ〜６００ｍＯｓｍ／Ｋｇに保つための浸透圧補償剤、（ｉｉｉ） 赤色波長で励起可能な染料、及び（ｉｖ）キレート剤を含有することからなる尿中有形成分分析用試薬が提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明における測定対象とする尿中の有形成分は、特に、赤血球、白血球、上皮細胞、円柱、細菌、酵母様真菌などが挙げられる。
本発明の分析用試薬における緩衝剤は、安定した蛍光強度が得られるように測定試料のｐＨを一定の範囲に保つために用いられる。ｐＨは、赤血球の溶血を抑制するためにｐＨ５．０〜９．０の範囲に調整される。なお、尿中の結晶成分のうち、特に無晶性塩類は、種々の水溶液、例えば、生理食塩水、希塩酸、希酢酸、水酸化カリウム水溶液等で希釈することによって溶解することが可能である。しかしながら、尿中の結晶成分は、酸性及びアルカリ性で析出するものがそれぞれある。従って、中性付近であれば、酸性及びアルカリ性で析出する無晶性塩をさらに迅速に溶解できるのでｐＨ６．５〜７．５が好ましく、ｐＨ６．８〜７．２がより好ましい。緩衝剤としては、従来公知のものを使用することができる。例えば、トリス及びＭＥＳ， Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ， ＡＤＡ， ＰＩＰＥＳ， ＡＣＥＳ， ＭＯＰＳＯ， ＢＥＳ， ＭＯＰＳ， ＴＥＳ， ＨＥＰＥＳ， ＤＩＰＳＯ， ＴＡＰＳＯ， ＰＯＰＳＯ， ＨＥＰＰＳＯ， ＥＰＰＳ， Ｔｒｉｃｉｎｅ， Ｂｉｃｉｎｅ， ＴＡＰＳのようなグッド緩衝剤等を挙げることができる。中でも、ＨＥＰＥＳが好ましい。濃度は、用いる緩衝剤の緩衝能に応じて、尿検体を希釈したときにｐＨがある一定の範囲内になる濃度で用いられる。通常、２０〜５００ｍＭ、好ましくは５０〜２００ｍＭである。
【００１４】
浸透圧補償剤は、赤血球溶血を防ぐ目的と安定した蛍光強度を得るために加える。尿の浸透圧は、５０〜１３００ｍＯｓｍ／ｋｇと広範囲にわたって分布している。分析用試薬の浸透圧が低すぎると赤血球の溶血が早期に進行してしまい、逆に高すぎると細胞の損傷が大きくなるので浸透圧は、１００〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇが好ましく、１５０〜５００ｍＯｓｍ／ｋｇより好ましい。浸透圧補償剤としては、無機塩類やプロピオン酸塩等の有機塩類、糖類などが用いられる。無機塩類としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム等、プロピオン酸塩としては、プロピオン酸ナトリウム、プロピオン酸カリウム、プロピオン酸アンモニウム等、他の有機塩類としてはシュウ酸塩、酢酸塩等、糖類としては、ソルビトール、グルコース、マンニトール等が挙げられる。
【００１５】
第１染料としては、下記に示したような縮合ベンゼン誘導体が使用できる。
【００１６】
【化９】
〔式中、Ａは−Ｏ−，−Ｓ−又は−Ｃ（ＣＨ３ ）２ −、Ｒは低級アルキル基、Ｘはハロゲン、Ｙは−ＣＨ＝又は−ＮＨ−、ｎは０又は１、Ｂは、
【００１８】
【化１０】
（式中ＡとＲは上記と同義である）
又は２つの低級アルコキシ基もしくは１つのジ低級アルキルアミノ基（この低級アルキルはシアノ基で置換されていてもよい）で置換されたフェニル基である。〕。
上記低級アルキル基としては、炭素数１〜６のアルキル基を意味し、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。Ｘのハロゲン原子としてはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられる。また、Ｂにおける２つの低級アルコキシ基で置換されたフェニル基とは、２つのＣ１−３ アルコキシ基、好ましくはＣ１−２ アルコキシ基、例えばメトキシ基、エトキシ基で置換されたフェニル基をいう。具体的には、２，６−ジメトキシフェニル基、２，６−ジエトキシフェニル基が挙げられる。また、Ｂにおけるジ低級アルキルアミノ基（該低級アルキル基はシアノ基で置換されていてもよい）で置換されたフェニル基とは、Ｃ１−３ アルキルアミノ基、好ましくはＣ１−２ アルキルアミノ基で置換されたフェニル基をいう。ここで、該アルキル基はシアノ基で置換されていてもよく、例えばメチル、エチル、シアノメチル、シアノエチル等を含む。好ましいジ低級アルキルアミノ基（該低級アルキルはシアノ基で置換されていてもよい）で置換されたフェニル基としては、４−ジメチルアミノフェニル基、４−ジエチルアミノフェニル基、４−（シアノエチルメチルアミノ）フェニル基などが挙げられる。
【００２０】
このような縮合ベンゼン誘導体の具体例としては、
【００２１】
【化１１】
【化１２】
が挙げられる。上記の縮合ベンゼン誘導体のうち、ＮＫ−シリーズは日本感光色素研究所（株）より入手することができる。なかでもオキサカルボシアニン系色素であるＤｉＯＣｎ（３）（ｎ＝１〜６）が好ましく、ＤｉＯＣ６（３）がより好ましい。なお、第１染料としては、これらに限定されるものではなく、ｐＨ５．０〜９．０、好ましくは、ｐＨ６．５〜７．５に最適染色ｐＨを有細胞膜に結合するもので、尿中の成分、例えば、蛋白と結合して沈殿物を生じないものであれば使用することができる。第１染料の濃度は、最終濃度（測定試料中の濃度）が１〜３０ｐｐｍとなる範囲で用いられ、５〜２０ｐｐｍが好適である。
【００２４】
第２蛍光染料としては、損傷を受けた細胞を染色しうる染料、例えばＥＢ（エチジウムブロマイド）又はＰＩ（プロピジウムアイオダイド）が用いられる。好適には、ＥＢが用いられる。第２蛍光染料の濃度は、最終濃度が１〜１００ｐｐｍの範囲で用いられ、３０〜６０ｐｐｍが好適である。
【００２５】
上記第１及び第２蛍光染料を組み合わせて用いる場合には、励起光源として青色波長を有する光を用いることができる。
【００２６】
また、本発明においては、上記第１及び第２蛍光染料を組み合わせて用いる代わりに、赤色波長で励起可能な染料を用いることができる。使用可能な染料としては、以下の化合物からなる群のうち、１種又は２種以上の染料を組み合わせて用いることができる。この場合の赤色波長で励起可能な染料の濃度は、最終濃度が１〜３００ｐｐｍの範囲で用いられ、５〜１００ｐｐｍ が好適である。
【００２７】
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
なお、上記の染料のうち、ＮＫ−シリーズは日本感光色素研究所（株）から入手することができ、Ｏｘａｚｉｎｅ ４， Ｏｘａｚｉｎｅ ７５０ ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ， Ｏｘａｚｉｎｅ ７２０ はＥｘｃｉｔｏｎ， Ｉｎｃ． から、Ｃａｐｒｉ Ｂｌｕｅ ＧＯＮは東京化成工業（株）から、Ｂａｓｉｃ Ｇｒｅｅｎ， Ｉｏｄｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ Ｅ． Ｍｅｒｃｋ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ から、Ｎｉｌｅ Ｂｌｕｅ Ｃｈｌｏｒｉｄｅはナカライテスク（株）から、Ｒｈｏｄｎｉｌｅ Ｂｌｕｅ はＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．，から、Ｃａｐｒｉ Ｂｌｕｅ ＢＢ はＣｈｒｏｍａ Ｇｅｓｅｌｌｓｈａｆｔ Ｓｃｈｍｉｄ ＆ Ｃｏ． からそれぞれ入手することができる。
【００３４】
キレート剤は、尿中に出現する無晶性塩類（例えば、リン酸アンモニウム・マグネシウム、炭酸カルシウム）を溶解するために用いる。脱カルシウム，脱マグネシウム剤であればとくに種類の限定はない。例えば、ＥＤＴＡ塩，ＣｙＤＴＡ， ＤＨＥＧ， ＤＰＴＡ−ＯＨ， ＥＤＤＡ， ＥＤＤＰ， ＧＥＤＴＡ， ＨＤＴＡ， ＨＩＤＡ， Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ， ＮＴＡ， ＮＴＰ， ＮＴＰＯ， ＥＤＤＰＯ等が挙げられる。好適には、ＥＤＴＡ塩，ＣｙＤＴＡ， ＧＥＤＴＡが用いられる。濃度は、０．０５〜５Ｗ／Ｗ％の範囲で使用することができ、好適には０．１〜１Ｗ／Ｗ％であるなお、ここでいう脱カルシウム，脱マグネシウム剤とは、カルシウム，マグネシウムイオンと結合して、水溶性の化合物を形成するものを意味する。
【００３５】
本発明の試薬は、緩衝剤、浸透圧補償剤、染料及びキレート剤の１液構成としてもよいが、染料を含有する染色液と、緩衝剤、浸透圧補償剤及びキレート剤を含有する希釈液との２液の形態であってもよい。染色液と希釈液との２液構成とする場合には、染料は水溶液中で不安定なものが多いため、染色液として染料と水溶性有機溶媒に溶解させることで保存安定性を高めることができる。さらに、染色液には、これら染料の安定化剤を加えてもよい。この場合の使用可能な水溶性有機溶媒としては、低級アルカノール、低級アルキレングリコールまたは低級アルキレングリコールモノ低級アルキルエーテルが好ましい。例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテルなどを使用することができる。中でもエチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコールが好ましく、尿中の細胞への影響や粘性などを考慮するとエチレングリコールがもっとも好ましい。また、希釈液には、長期保存中の細菌の繁殖を防止するために抗菌剤を添加してもよい。用いる抗菌剤の種類は特に制限されず、トリアジン系抗菌剤、ＢＩＴ（ベンツイソチアゾロン）のようなチアゾール系抗菌剤、ＰＴＯ（ピリチオン）のようなピリジン系抗菌剤などが使用可能であるが、測定系に悪影響を与えない濃度で添加するのがよい。上記安定化剤や抗菌剤は、１液構成の試薬に添加してもよい。
【００３６】
また、本発明の試薬の電気伝導度を１〜１０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは４〜７ｍＳ／ｃｍの範囲に調整すると、電気抵抗信号を測定して円柱を検出するのに好都合である。電離度の大きな緩衝剤や浸透圧補償剤では、上記の範囲に電気伝導度を調整すると浸透圧が低くなってしまい、尿中の赤血球が溶血するおそれがあるが、緩衝剤を有機酸系にするか、浸透圧補償剤を有機塩類または非電解質（例えば糖類）にするか、もしくはそれらを適宜組み合わせると、電気伝導度の上昇を抑えつつ、浸透圧を上昇させることができるので好ましい。
【００３７】
本発明の試薬を用いて、尿中の有形成分を分析するにあたっては、原尿を本発明の試薬に混合する。成分（ｉ） 〜（ｖ） 又は成分（Ｉ） 〜（ＩＶ）を含有する一液構成の試薬においては、原尿と混合することによって、２〜２０倍に希釈されるとともに、尿中に含まれる有形成分が染色されることとなる。なお、原尿の希釈倍率としては、２〜１６倍程度、特に４〜１０倍程度が好ましい。この際、尿中に含まれている無晶性塩類を短時間で溶解させるために、上記試薬を予め３０〜４０℃、好ましくは３３〜３７℃で加温しておくことが好ましい。原尿との混合は、室温から４０℃の範囲で、好ましくは３３〜３７℃で、５〜６０秒間、好ましくは１０〜３０秒間行うことが好ましい。また、本発明の試薬が、染色液と希釈液とからなる２液構成の試薬の場合には、染色液と希釈液と予め混合したのち原尿を加えるか、または尿と希釈液で混合した後染色液を加える。２液構成の場合、尿の最終の希釈倍率が４〜１０倍となることが好ましい。また、無晶性塩類を短時間で溶解させるために、希釈液を予め３０〜４０℃、好ましくは３３〜３７℃で加温しておくことが好ましい。
【００３８】
上記試薬と混合された尿は、尿試料としてフローセルに流す。フローセルに流された尿試料に励起光を照射し、尿試料中の有形成分からの前方散乱光と蛍光強度を測定する。これにより、尿中に含有されている有形成分の分析をすることができる。また、円柱を測定する際には、尿試料の電気抵抗信号強度（体積情報）も測定すると、検出感度が高まるので好都合である。従って、本発明の尿分析方法では、電気抵抗信号と光学的情報を測定できるフローサイトメータを使用するのが好ましい。本発明においては好適に用いられるフローサイトメータとしては、図６に示す装置が挙げられる。
【００３９】
まず、弁１及び２を所定時間開けることにより、廃液チャンバからの陰圧により吸引ノズル３から試料液が弁１及び２に満たされる。シリンジ４が一定流量で液を押し出すことにより、試料用ノズル６から試料液が吐出されると同時に、弁８を開けることによりフローセル５のチャンバー７にシース液が供給される。これによって試料は図６に示されるように、チャンバー７の内径にしたがって細く絞られシースフローを形成し、オリフィス１１を通過する。オリフィス１１の形状は内径の一辺が１００〜３００μｍの角柱形状をし、材質は光学硝子（石英硝子も含む）でできている。このようにシースフローを形成することによって粒子を１個ずつオリフィス１１の中心を一列に整列して流すことができる。オリフィス１１を通過した試料液とシース液とはチャンバー２５に設けた回収管１４を通って排出される。
【００４０】
電極１３はチャンバー２５の内部に設けられた白金製でプラス電極とし、電極１２はチャンバー７の内部に設けられたステンレス製でマイナス電極としている。この電極１２及び１３間の電気抵抗は、シース液の抵抗率（電気伝導度）、オリフィスの孔寸法（孔断面積）と孔長、試料液の抵抗率、試料液の流れている時の径によって決まる。
【００４１】
電源１５は直流定電流源で電極１２及び１３間に供給している。電極１２及び１３間に定電流を流すことにより、電極１２及び１３間の電気抵抗と電流値により決まる直流電圧が発生する。粒子がオリフィス１１を通過すると、オリフィス１１の両端の電気抵抗が変化する。よって、粒子がオリフィス１１を通過している間のみ電極１２及び１３間に発生する電圧が大きくなる。しかも、オリフィス１１を通過する粒子の大きさに比例して、パルス状の電圧が発生するため、この分の電圧のみ大きくなり、この電圧が前記直流電圧に重畳され、電極１２及び１３間に現れる。従って、これをアンプ１６で検出することにより、抵抗信号２９が出力されることとなる。
【００４２】
オリフィス１１のほぼ中心のサンプル流２６へレーザ１７から発振したレーザ光がコンデンサレンズ１８で楕円状に絞られて照射される。レーザ光の形状は試料の流れの方向には血球粒子径と同程度、例えば１０μｍ前後と狭く、試料の流れ方向及び照射光軸方向と直交する方向の形状は、血球粒子径より十分広く、例えば１５０〜３００μｍ程度である。サンプル流２６に照射されたレーザ光で細胞（有形物）に当たらずそのままフローセル５を透過した透過光はビームストッパ１９で遮光される。細胞（有形物）に照射され、狭い角度で発せられる前方散乱光及び前方蛍光はコレクターレンズ２０により集光され、遮光板３０のピンホール２１を通過する。そして、ダイクロイックミラー２２に到達する。散乱光より長波長の蛍光はそのまま高率でダイクロイックミラー２２を透過し、フィルター２３でさらに散乱光が除かれた後にフォトマルチプライヤーチューブ（ＰＭＴ）２４で検出され、電気信号２７に変換されて出力される。散乱光はダイクロイックミラー２２で反射されフォトダイオード３１で受光されて電気信号２８に変換されて出力される。
【００４３】
本発明の尿中有形成分分析用試薬によれば、該試薬と尿を混合することにより、無晶性塩類は溶解し、分類に好適なように尿中の有形成分が染色されることとなる。
【００４４】
一般に尿沈渣でよく観察される無晶性塩類は、リン酸塩と尿酸塩がほとんどで、リン酸塩のほとんどがカルシウム塩であるため、キレート剤を添加することによりカルシウム塩と水溶性のキレート化合物を作り溶解する。また、尿酸塩は、希釈及び加温により溶解する。これらの無晶性塩類は、健常人の尿でも認められるため、臨床的意義は低い。したがって、他の臨床的に意義のある有形成分（赤血球、白血球、細菌、酵母様真菌、円柱など）を精度よく検出するためには、無晶性塩類は溶解しておく必要がある。しかし、大きな結晶やシュウ酸カルシウムなどはキレート剤の添加や加温処理によっても溶解速度が遅く、フローサイトメータで測定するまでに完全には溶解しない。また、シスチン、ロイシン、チロジン、コレステリン、２，８ＤＨＡのような病的結晶は、これらの操作によっても溶解しにくい。このため、残った結晶が赤血球領域にオーバーラップし、赤血球を正確に測定できなくなることがある。そこで、これらの結晶が、他の有形成分の測定に影響を与えないようにするため、特に赤血球を強く染色する必要がある。
【００４５】
ところで、尿中の有形成分が示す蛍光強度は、有形成分によって弱いものから強いものまで広範囲にわたる。例えば、赤血球は白血球の蛍光強度に比べて非常に弱い。血液中の白血球を測定する場合には、白血球が強く染色されるため、非常に弱い蛍光強度しか示さない赤血球や背後蛍光についてはそれほど考慮する必要がなかった。しかし、尿中の有形成分を分析するにあたっては、赤血球のような蛍光強度の弱いものまで検出する必要があり、そのためには血液中の白血球を測定する場合よりも検出器（ＰＭＴ）感度を上げる必要がある。ところが、検出器感度を上げると、尿自身の背後蛍光や、細胞と結合していない蛍光染料による背後蛍光の影響を受け、赤血球の蛍光信号強度が得られず測定できない場合があった。
【００４６】
本発明者は、検討を重ねた結果、赤血球の細胞膜も染色する蛍光染料、たとえばＤｉＯＣｎ（３）（ｎ＝１〜６）を使用することにより解決できることを見出した。
第１染料、特に、ＤｉＯＣｎ（３）（ｎ＝１〜６）は、イオン結合により、あらゆる細胞膜、核、顆粒と結合する。これに対し、特開平４−３３７４５９号の実施例で示されたようなオーラミンＯは、細胞中のＲＮＡと結合する。このため、オーラミンＯは、赤血球の細胞膜をほとんど染めず、結晶及び酵母様真菌などの他の有形成分が示す蛍光強度と同じくらいで、これらの有形成分が同一試料に存在する場合には弁別が困難であった。しかし、ＤｉＯＣｎ（３）（ｎ＝１〜６）を使用することにより、あらゆる細胞膜に染料が結合及び吸着し、赤血球の染色性と酵母様真菌の染色性が同時に向上し、蛍光強度の差によって結晶、赤血球、酵母様真菌の弁別が可能となる。一方白血球は、赤血球に比べて非常に強く染色される。また、染色性が向上することによって蛍光強度も増大するため、背後蛍光があっても影響が小さくなる。
【００４７】
第２蛍光染料としては、細胞の中でも損傷を受けた細胞を染める染料として知られているものを用いる。第１染料は、白血球を染めることはできるが、損傷を受けた白血球の染色性は生きた白血球と比較して悪く、集団化した細菌の蛍光信号強度と同じくらいで、これらの有形成分が同一試料中に存在した場合には弁別が困難であった。この欠点を補う染料として、ＥＢのような損傷を受けた細胞を染める染料が使用可能であることが判明した。第２蛍光染料を使用することによって、損傷を受けた白血球は細菌よりも強く染色され、細菌の判別ができるようになった。
【００４８】
また、本発明者らは、本発明で使用することができる赤色波長で励起可能な染料は、１種類でも前述と同様の結果が得られることを見いだした。
【００４９】
さらに、本発明の試薬の電気伝導度を上記の範囲に設定することによって、円柱の検出が容易になる。つまり、精度良く円柱を検出するためには、前方散乱光と電気抵抗信号を測定するのが好ましい。特開平４−３３７４５９号公報では、円柱の検出を前方散乱光と前方蛍光とを測定することによって行っている。この方法では、円柱以外の有形成分が同時に出現するような検体では、必ずしも精度よく円柱を検出しているとはいえなかった。つまり、一部の硝子円柱と粘液糸は、ともに蛍光強度が弱く、長さも似かよっているので、弁別が困難なことがあった。そこで、前方散乱光と前方蛍光を測定するとともに、さらに電気抵抗信号を測定し、散乱光のパルス幅（長さ情報を反映）と抵抗波高値（体積情報を反映）との測定パラメータとを組み合わせることによって硝子円柱と粘液糸を精度よく検出できるようになる。また、封入物を含む円柱については、散乱光パルス幅と蛍光パルス幅とを組み合わせることによって検出することができる。
【００５０】
【実施例】
本発明の尿中有形成分分析用試薬及びその試薬を用いた細胞分析方法の実施例を説明する。
【００５１】
実施例１
以下の処方により希釈液及び染色液を調製した。
【００５２】
【００５３】
尿４００μｌを上記希釈液１１６０μｌで希釈したのち、上記染色液４０μｌ加え（希釈倍率４倍）、３５℃，１０秒間染色し、アルゴンレーザを光源とするフローサイトメータで前方散乱光と前方蛍光及び電気抵抗信号を測定した。なお、蛍光は側方（９０°）蛍光を測定してもよい。図１及び図２に、酵母様真菌、白血球及び赤血球の出現した検体を用いて前方散乱光と前方蛍光とを測定したスキャッタグラムを示す。図１及び図２から明らかなように、上記実施例の試薬を用いた場合には、酵母様真菌、白血球及び赤血球が良好に分類されていることがわかる。なお、本発明の試薬を用いて、尿中の有形成分を測定した時のスキャッタグラムの模式図を図３に示す。
【００５４】
また、上記実施例の試薬を用いて背後蛍光のある検体を測定した場合においても、細胞が強く染色されるため、背後蛍光の影響をうけることなく測定をすることが可能であった。
さらに、電気抵抗信号を測定すると、散乱光パルス幅と抵抗波高値との関係から、円柱（硝子円柱及び封入物を含んだ円柱）、粘液糸、上皮細胞等の比較的大型の有形成分をとらえ分類することが可能であった。スキャッタグラムの模式図を図４に示す。さらに、円柱の内、顆粒、赤血球、白血球等を含む円柱が出現した場合には、蛍光パルス幅と散乱光パルス幅とを組み合わせることにより、より確実に円柱を測定することが可能であった。スキャッタグラムの模式図を図５に示す。
【００５５】
実施例２
プロピオン酸ナトリウムを２１０ｍＯｓｍ／ｋｇになる量に加え、電気伝導度は７ｍＳ／ｃｍであった以外、実施例１と同じ組成の試薬を用い、同じ操作を繰り返した。
結果は、実施例１と同様であった。
【００５６】
実施例３
プロピオン酸ナトリウムを３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ になる量に加え、電気伝導度は１０ｍＳ／ｃｍであった以外、実施例１と同じ組成の試薬を用い、同じ操作を繰り返した。
結果は、実施例１と同様であった。
【００５７】
実施例４
以下の処方により希釈液及び染色液を調製した。
【００５９】
尿４００μｌを上記希釈液１１８４μｌで希釈したのち、上記染色液１６μｌ加え、３５℃，５０秒間染色し、赤色半導体レーザを光源とするフローサイトメータで前方散乱光と前方蛍光とを測定した。
結果は、実施例１と同様であった。
【００６０】
【００６１】
尿４００μｌを上記希釈液１１６０μｌで希釈したのち、上記染色液４０μｌ加え（希釈倍率４倍）、３５℃，１０秒間染色し、アルゴンレーザを光源とするフローサイトメータで前方散乱光と前方蛍光及び電気抵抗信号を測定した。図７及び図８に、前方散乱光と前方蛍光とを測定したスキャッタグラムを示す。図７及び図８から明らかなように、上記比較例の試薬を用いた場合には、酵母様真菌及び赤血球の染色性が悪く、これらを弁別することができなかった。
【００６２】
また、上記比較例の試薬を用いて背後蛍光のある検体を測定した場合には、図９及び図１０に示したように、背後蛍光の影響をうけ、特に一部に全く測定をすることができない領域が発現し、分析ができなかった。
【００６３】
さらに、上記実施例１の前方散乱光と前方蛍光とを測定する際には、比較例１を測定する際の約１６．６％の検出器感度で測定を行っており、より感度の低い検出器を用いた場合にも、酵母様真菌、白血球及び赤血球が良好に分類されることが確認された。つまり、比較例１においては、赤血球の蛍光は非常に弱いために検出器感度を上げる必要があるが、本実施例の場合には、赤血球も強く染色されるために、より低い検出器感度を使用することができる。従って、背後蛍光が無視できる程度にまで検出器感度を低下して測定することが可能となった。
【００６４】
【発明の効果】
本発明の尿中有形成分分析用試薬及びその試薬を用いた細胞分析方法によれば、
（１） 赤血球の染色性が向上し、結晶との分離が可能となった。
（２） 尿中に出現する種々の有形成分の染色性が向上するため、尿自身の背後蛍光の影響を無視できる程度まで蛍光検出用のフォトマル（ＰＭＴ）感度を下げることができるようになった。
（３） 尿中に同時に多種の有形成分が出現しても、より精度よく弁別できるようになった。
（４） 円柱の弁別能力を向上させることができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の尿中有形成分分析用試薬を用いて尿中の有形成分を染色した際の前方散乱光と前方蛍光とを測定したスキャッタグラムを示す。
【図２】図１の拡大図である。
【図３】本発明の尿中有形成分分析用試薬を用いて尿中の有形成分を染色した際の前方散乱光と前方蛍光とを測定した場合のスキャッタグラムの模式図である。
【図４】本発明の尿中有形成分分析用試薬を用いて尿中の有形成分を染色した後に測定した電気抵抗信号の散乱光パルス幅と抵抗波高値との関係を示すスキャッタグラムの模式図である。
【図５】本発明の尿中有形成分分析用試薬を用いて尿中の有形成分を染色した後に測定した電気抵抗信号の散乱光パルス幅と蛍光パルス幅との関係を示すスキャッタグラムの模式図である。
【図６】本発明の尿中有形成分分析用試薬を用いて尿中の有形成分を測定する場合に好適に用いられるフローサイトメータを示す概略模式図である。
【図７】オーラミンＯを含む尿中有形成分分析用試薬を用いて尿中の有形成分を染色した際の前方散乱光強度と前方蛍光強度とを測定したスキャッタグラムを示す。
【図８】図７の拡大図である。
【図９】オーラミンＯを含む尿中有形成分分析用試薬を用いて背後蛍光のある尿中の有形成分を染色した際の前方散乱光強度と前方蛍光強度とを測定したスキャッタグラムを示す。
【図１０】図９の拡大図である。
【符号の説明】
ＷＢＣ 白血球
ＲＢＣ 赤血球
ＹＥＡＳＴ 酵母様真菌[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a reagent for analyzing urine particles and a method for analyzing particles using the reagent, and more particularly, to a method for optically analyzing urine particles by applying flow cytometry. The present invention relates to a reagent and an analysis method thereof.
[0002]
[Prior art]
In diseases such as renal and urinary tract infections, inflammatory lesions, degenerative lesions, calculi, and tumors, various components appear in the urine depending on the respective diseases. Examples of the formed components include erythrocytes, leukocytes, epithelial cells, casts, bacteria, fungi, crystals, and mucus threads. Analyzing these components in urine is particularly important for early detection of kidney and urinary tract diseases and estimation of abnormal sites. For example, the measurement of red blood cells is important in determining the presence or absence of bleeding in the path from the glomeruli of the kidney to the urethra, and the appearance of white blood cells may be suspected of renal disease such as pyelonephritis, inflammation, infectious disease Can be detected early. Further, by examining the morphology of the column and the erythrocyte, the origin thereof can be estimated.
[0003]
2. Description of the Related Art Conventionally, visual analysis using a microscope has been widely performed for the analysis of particles in urine. First, urine is centrifuged and concentrated, and the sediment is optionally stained, mounted on a microscope slide, and classified and counted under a microscope.
In recent years, an automatic measuring device that combines a flat sheath flow and an image processing technique has been developed. In this method, the urine sample liquid adjusted to an extremely flat flow is photographed with a video camera using the sheath liquid as the outer layer, and the image of this stationary screen is cut out to display the image of the formed material in the sample liquid. Is what you do. While the display technician looks at the display, the formed part is determined, and a classification process is performed.
[0004]
Furthermore, as an apparatus for automatically classifying and counting urine particles, Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-33759 discloses a reagent for analyzing cells in urine using flow cytometry and a method therefor. The reagents include a fluorescent dye, an osmotic pressure compensating agent, and a buffer, and various fluorescent dyes, osmotic pressure compensating agents, and buffering agents are disclosed. Examples include reagents using neutral red and auramine O as the fluorescent dye. Is described.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
By the way, the urine sample undergoes changes such as denaturation of the formed material and increase in the number of bacteria as time elapses after the collection, and therefore it is desired to test the urine sample as soon as possible after collection.
In a visual inspection using a microscope, pretreatment such as centrifugation and concentration of a urine sample takes time and effort, and the microscopic work puts a heavy burden on a laboratory technician. In addition, the inspection accuracy is low because the number of observed cells is small.
[0006]
On the other hand, an automatic measurement device using image processing technology is advantageous in that the burden is reduced as compared with the microscopic inspection work, but the inspection technician has to determine the material formation, and the processing speed is also high. It is not always satisfactory when the number of specimens is large because it is slow.
In both methods of visual inspection and automatic measurement by image processing, discrimination of borne material requires skill.
[0007]
The method in which flow cytometry described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-337559 is applied to urine analysis is advantageous in that measurement can be performed quickly, but as a result of further studies, it has been found that there are the following problems.
[0008]
(1) When crystals appear in urine, it is difficult to discriminate them from red blood cells.
(2) In a specimen in which a large number of amorphous salts appear, it is difficult to classify other cell components.
(3) When a urine sample containing hemoglobin and protein is measured using a reagent containing auramine O having a pH of 8.5 shown in Examples of Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-337559, hemoglobin and protein are bound to a dye, and fine precipitates are formed. In some cases, precipitation occurs and measurement cannot be performed.
(4) Although (3) can be solved by making the pH acidic, staining becomes poor, and when yeast-like fungi appear, it becomes difficult to discriminate from erythrocytes.
[0009]
(5) When urine is analyzed with a flow cytometer, the dilution rate must be kept low because the amount of formed components present in the urine is small. However, when the dilution rate is lowered, vitamins and antibiotics are contained in the urine. When a substance that emits fluorescence such as a drug such as a substance is excreted, the fluorescence behind the urine itself (background noise) cannot be ignored, and the intensity of the formed fluorescence signal may not be obtained. When neutral red is used, the effect of the background fluorescence due to the dye not binding to the cells is large.
[0010]
The present invention has been made in view of the above-described problems, and has as its object to perform the analysis of formed components in urine with higher accuracy.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
According to the present invention, (i) a buffering agent for maintaining the pH at 5.0 to 9.0, (ii) an osmotic pressure compensating agent for maintaining the osmotic pressure at 100 mOsm / Kg to 600 mOsm / Kg, (iii) A reagent for analyzing urinary particles comprising a first dye of a condensed benzene derivative system, (iv) a second fluorescent dye capable of staining damaged cells, and (v) a chelating agent is provided. .
[0012]
Further, according to the present invention from another viewpoint, (i) a buffer for keeping the pH at 5.0 to 9.0, and (ii) an osmotic pressure for keeping the osmotic pressure at 100 mOsm / Kg to 600 mOsm / Kg. A reagent for analyzing urinary particles is provided, which comprises a compensating agent, (iii) a dye capable of being excited at a red wavelength, and (iv) a chelating agent.
[0013]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The urinary particles to be measured in the present invention include, in particular, red blood cells, white blood cells, epithelial cells, casts, bacteria, yeast-like fungi, and the like.
The buffer in the analysis reagent of the present invention is used to maintain the pH of the measurement sample within a certain range so as to obtain a stable fluorescence intensity. The pH is adjusted to a range of pH 5.0 to 9.0 to suppress erythrocyte hemolysis. Among the crystalline components in urine, amorphous salts can be dissolved by diluting them with various aqueous solutions, for example, physiological saline, dilute hydrochloric acid, dilute acetic acid, potassium hydroxide aqueous solution and the like. However, some of the urine crystal components are precipitated by acidity and alkalinity. Therefore, when the pH is around neutral, the amorphous salt that precipitates under acidic and alkaline conditions can be more rapidly dissolved, so that pH 6.5 to 7.5 is preferable, and pH 6.8 to 7.2 is more preferable. As the buffer, a conventionally known buffer can be used. For example, Good buffer agents such as Tris and MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, Tricine, Bicine, and TAPS. be able to. Among them, HEPES is preferable. The concentration is used at a concentration at which the pH falls within a certain range when the urine sample is diluted, depending on the buffer capacity of the buffer used. Usually, it is 20 to 500 mM, preferably 50 to 200 mM.
[0014]
The osmotic pressure compensating agent is added for the purpose of preventing erythrocyte hemolysis and for obtaining a stable fluorescence intensity. Urine osmotic pressure is distributed over a wide range of 50-1300 mOsm / kg. If the osmotic pressure of the analytical reagent is too low, hemolysis of erythrocytes will progress early, and if it is too high, cell damage will increase, so the osmotic pressure is preferably 100 to 600 mOsm / kg, and 150 to 500 mOsm / kg. More preferred. As the osmotic pressure compensating agent, inorganic salts, organic salts such as propionate, and saccharides are used. As inorganic salts, sodium chloride, potassium chloride, lithium chloride, etc .; as propionates, sodium propionate, potassium propionate, ammonium propionate, etc .; as other organic salts, oxalates, acetates, etc., as saccharides. Include sorbitol, glucose, mannitol and the like.
[0015]
As the first dye, the following condensed benzene derivatives can be used.
[0016]
Embedded image
[Wherein A is -O-, -S- or -C (CH 3 ) 2 -, R is a lower alkyl group, X is a halogen, Y is -CH = or -NH-, n is 0 or 1, B is
[0018]
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(Where A and R are as defined above)
Or a phenyl group substituted with two lower alkoxy groups or one di-lower alkylamino group (the lower alkyl may be substituted with a cyano group). ].
The lower alkyl group means an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and includes, for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, isobutyl, pentyl, hexyl and the like. Examples of the halogen atom for X include fluorine, chlorine, bromine, and iodine. A phenyl group substituted with two lower alkoxy groups in B is defined as two C 1-3 An alkoxy group, preferably C 1-2 An phenyl group substituted by an alkoxy group, for example, a methoxy group or an ethoxy group. Specific examples include a 2,6-dimethoxyphenyl group and a 2,6-diethoxyphenyl group. Further, the phenyl group substituted by a di-lower alkylamino group (the lower alkyl group may be substituted by a cyano group) in B is a group represented by C 1-3 An alkylamino group, preferably C 1-2 Refers to a phenyl group substituted with an alkylamino group. Here, the alkyl group may be substituted with a cyano group, and includes, for example, methyl, ethyl, cyanomethyl, cyanoethyl and the like. Preferred phenyl groups substituted with a di-lower alkylamino group (the lower alkyl may be substituted with a cyano group) include a 4-dimethylaminophenyl group, a 4-diethylaminophenyl group and a 4- (cyanoethylmethylamino) group. And a phenyl group.
[0020]
Specific examples of such a condensed benzene derivative include:
[0021]
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Is mentioned. Among the above-mentioned condensed benzene derivatives, the NK-series can be obtained from Japan Photographic Dye Laboratories. Among them, DiOCn (3) (n = 1 to 6), which is an oxacarbocyanine dye, is preferred, and DiOC6 (3) is more preferred. The first dye is not limited to these, but binds to the cell membrane at an optimum staining pH of pH 5.0 to 9.0, preferably pH 6.5 to 7.5, and is used in urine. , For example, those that do not form a precipitate upon binding to a protein can be used. The concentration of the first dye is used in a range where the final concentration (the concentration in the measurement sample) is 1 to 30 ppm, and preferably 5 to 20 ppm.
[0024]
As the second fluorescent dye, a dye capable of staining damaged cells, for example, EB (ethidium bromide) or PI (propidium iodide) is used. Preferably, EB is used. As the concentration of the second fluorescent dye, the final concentration is used in the range of 1 to 100 ppm, and preferably 30 to 60 ppm.
[0025]
When the first and second fluorescent dyes are used in combination, light having a blue wavelength can be used as the excitation light source.
[0026]
Further, in the present invention, instead of using the first and second fluorescent dyes in combination, a dye that can be excited at a red wavelength can be used. As the dye that can be used, one or more dyes can be used in combination from the group consisting of the following compounds. In this case, the concentration of the dye which can be excited at the red wavelength is used in a final concentration of 1 to 300 ppm, and preferably 5 to 100 ppm.
[0027]
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Among the above dyes, the NK-series can be obtained from Japan Photosensitive Dye Laboratories, Inc., and Oxazine 4,
[0034]
Chelating agents are used to dissolve amorphous salts (eg, ammonium magnesium phosphate, calcium carbonate) that appear in urine. There is no particular limitation on the type of calcium-removing or magnesium-removing agent. Examples include EDTA salt, CyDTA, DHEG, DPTA-OH, EDDA, EDDP, GEDTA, HDTA, HIDA, Methyl-EDTA, NTA, NTP, NTPO, EDDPO, and the like. Preferably, EDTA salt, CyDTA, GEDTA is used. The concentration can be used in the range of 0.05 to 5 W / W%, preferably 0.1 to 1 W / W%. The decalcifying and demagnesizing agents mentioned here are calcium and magnesium. It means a compound that binds to an ion to form a water-soluble compound.
[0035]
The reagent of the present invention may have a one-part composition of a buffer, an osmotic pressure compensating agent, a dye and a chelating agent, but a dyeing solution containing a dye and a diluting solution containing a buffer, an osmotic pressure compensating agent and a chelating agent And two liquid forms. In the case of a two-liquid composition of a dyeing solution and a diluting solution, the dye is often unstable in an aqueous solution. Therefore, it is possible to enhance the storage stability by dissolving the dye in a dye and a water-soluble organic solvent. it can. Further, a stabilizer for these dyes may be added to the dyeing solution. As a water-soluble organic solvent that can be used in this case, a lower alkanol, a lower alkylene glycol or a lower alkylene glycol mono-lower alkyl ether is preferable. For example, methanol, ethanol, n-propanol, ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, ethylene glycol monomethyl ether, ethylene glycol monoethyl ether, and the like can be used. Among them, ethylene glycol, diethylene glycol, and triethylene glycol are preferable, and ethylene glycol is most preferable in consideration of effects on cells in urine and viscosity. In addition, an antimicrobial agent may be added to the diluent to prevent the growth of bacteria during long-term storage. The kind of the antibacterial agent to be used is not particularly limited, and a triazine antibacterial agent, a thiazole antibacterial agent such as BIT (benzisothiazolone), a pyridine antibacterial agent such as PTO (pyrithione) and the like can be used. Should be added at a concentration that does not adversely affect the water content. The stabilizer and antibacterial agent may be added to a one-component reagent.
[0036]
Adjusting the electrical conductivity of the reagent of the present invention to a range of 1 to 10 mS / cm, preferably 4 to 7 mS / cm, is convenient for detecting a cylinder by measuring an electric resistance signal. With a buffer or osmotic pressure compensator with a high degree of ionization, adjusting the electrical conductivity to the above range will lower the osmotic pressure and may cause red blood cells in the urine to lyse. Alternatively, it is preferable to use an organic salt or a non-electrolyte (for example, a saccharide) as the osmotic pressure compensating agent, or to appropriately combine them, because it is possible to increase the osmotic pressure while suppressing an increase in electric conductivity.
[0037]
When urine is analyzed using the reagent of the present invention, raw urine is mixed with the reagent of the present invention. A one-part reagent containing the components (i) to (v) or the components (I) to (IV) is diluted 2 to 20 times by mixing with raw urine and contained in urine. The formed components are dyed. The dilution ratio of the raw urine is preferably about 2 to 16 times, particularly preferably about 4 to 10 times. At this time, in order to dissolve the amorphous salts contained in urine in a short time, it is preferable that the reagent is previously heated at 30 to 40 ° C, preferably 33 to 37 ° C. The mixing with the raw urine is preferably performed at room temperature to 40 ° C, preferably at 33 to 37 ° C, for 5 to 60 seconds, preferably for 10 to 30 seconds. In the case where the reagent of the present invention is a two-component reagent consisting of a staining solution and a diluting solution, the urine is added after mixing the staining solution and the diluting solution in advance, or mixed with the urine and the diluting solution. Post-staining solution is added. In the case of a two-liquid configuration, the final dilution ratio of urine is preferably 4 to 10 times. Further, in order to dissolve the amorphous salts in a short time, it is preferable that the diluting solution is previously heated at 30 to 40 ° C, preferably 33 to 37 ° C.
[0038]
The urine mixed with the reagent flows into a flow cell as a urine sample. The urine sample that has flowed through the flow cell is irradiated with excitation light, and the forward scattered light and the fluorescence intensity from the formed components in the urine sample are measured. As a result, it is possible to analyze the material components contained in urine. When measuring the cylinder, it is convenient to measure the electric resistance signal intensity (volume information) of the urine sample, since the detection sensitivity is increased. Therefore, in the urine analysis method of the present invention, it is preferable to use a flow cytometer capable of measuring an electric resistance signal and optical information. FIG. 6 shows an example of a flow cytometer that is suitably used in the present invention.
[0039]
First, by opening the valves 1 and 2 for a predetermined time, the sample liquid is filled in the valves 1 and 2 from the suction nozzle 3 by the negative pressure from the waste liquid chamber. When the syringe 4 pushes out the liquid at a constant flow rate, the sample liquid is discharged from the sample nozzle 6, and at the same time, the sheath liquid is supplied to the
[0040]
The
[0041]
The
[0042]
The laser beam oscillated from the
[0043]
According to the urine particle analysis reagent of the present invention, by mixing the reagent with urine, the amorphous salts are dissolved, and the urine particle is stained as suitable for classification. It becomes.
[0044]
In general, amorphous salts commonly observed in urine sediment are mostly phosphate and urate, and most of phosphates are calcium salts. Therefore, calcium salts and water-soluble chelates can be added by adding a chelating agent. Make and dissolve the compound. Urate is dissolved by dilution and heating. Since these amorphous salts are also found in urine of healthy people, their clinical significance is low. Therefore, in order to accurately detect other clinically significant formed components (red blood cells, white blood cells, bacteria, yeast-like fungi, casts, etc.), the amorphous salts need to be dissolved. However, the dissolution rate of large crystals, calcium oxalate, and the like is low even by the addition of a chelating agent or heating treatment, and the crystals do not completely dissolve before measurement with a flow cytometer. In addition, pathological crystals such as cystine, leucine, tyrosine, cholesterin, and 2,8DHA are hardly dissolved by these operations. For this reason, the remaining crystals may overlap the red blood cell region, making it impossible to accurately measure red blood cells. Therefore, in order to prevent these crystals from affecting the measurement of other particles, it is necessary to particularly strongly stain red blood cells.
[0045]
By the way, the fluorescence intensity indicated by the material components in urine ranges from weak to strong depending on the material components. For example, red blood cells are very weak compared to the fluorescence intensity of white blood cells. When measuring leukocytes in blood, since leukocytes are strongly stained, it was not necessary to consider red blood cells showing only a very weak fluorescence intensity or background fluorescence. However, when analyzing particles in urine, it is necessary to detect even those with low fluorescence intensity, such as red blood cells, which requires a higher detector (PMT) sensitivity than measuring white blood cells in blood. I need to raise it. However, when the detector sensitivity is increased, there is a case where the measurement cannot be performed because the fluorescence signal intensity of red blood cells cannot be obtained due to the influence of the fluorescence behind the urine itself and the fluorescence behind the fluorescent dye not bound to the cells.
[0046]
As a result of repeated studies, the present inventors have found that the problem can be solved by using a fluorescent dye that also stains the cell membrane of red blood cells, for example, DiOCn (3) (n = 1 to 6).
The first dye, especially DiOCn (3) (n = 1 to 6), binds to all cell membranes, nuclei, and granules by ionic bonding. On the other hand, auramine O as shown in the example of JP-A-4-333759 binds to RNA in cells. For this reason, auramine O scarcely stains the cell membrane of erythrocytes and has a fluorescence intensity similar to that of other components such as crystals and yeast-like fungi, and when these components are present in the same sample, Discrimination was difficult. However, by using DiOCn (3) (n = 1 to 6), the dye is bound and adsorbed to all cell membranes, and the erythrocyte staining property and the yeast-like fungus staining property are improved at the same time. Crystals, red blood cells, and yeast-like fungi can be discriminated. Leukocytes, on the other hand, stain much more strongly than red blood cells. In addition, since the fluorescence intensity is increased by improving the staining property, the influence of the background fluorescence is reduced.
[0047]
As the second fluorescent dye, a dye known to dye damaged cells among cells is used. The first dye can stain leukocytes, but damaged leukocytes stain poorly compared to live leukocytes, and have the same fluorescent signal intensity as the population of bacteria. Discrimination was difficult when present in the same sample. It has been found that dyes that stain damaged cells, such as EB, can be used as dyes to compensate for this drawback. By using the second fluorescent dye, the damaged leukocytes stained stronger than the bacteria, and the bacteria could be distinguished.
[0048]
The present inventors have also found that one kind of dye capable of being excited at a red wavelength that can be used in the present invention can obtain the same results as described above.
[0049]
Further, by setting the electric conductivity of the reagent of the present invention within the above range, the detection of the cylinder is facilitated. That is, in order to accurately detect the cylinder, it is preferable to measure the forward scattered light and the electric resistance signal. In Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 4-337559, a cylinder is detected by measuring forward scattered light and forward fluorescence. In this method, it was not always possible to accurately detect a cylinder in a specimen in which a material other than a cylinder appeared simultaneously. In other words, some of the glass cylinders and the mucus threads have weak fluorescence intensity and similar lengths, so that discrimination was sometimes difficult. Therefore, while measuring forward scattered light and forward fluorescence, and further measuring an electric resistance signal, the measurement parameters of the pulse width of the scattered light (reflecting the length information) and the resistance peak value (reflecting the volume information) are combined. Thereby, the glass cylinder and the mucus thread can be detected with high accuracy. In addition, the cylinder containing the inclusion can be detected by combining the scattered light pulse width and the fluorescent pulse width.
[0050]
【Example】
An embodiment of the reagent for analyzing urinary particles of the present invention and a cell analysis method using the reagent will be described.
[0051]
Example 1
A diluent and a staining solution were prepared according to the following formulation.
[0052]
[0053]
After diluting 400 μl of urine with 1160 μl of the above diluent, add 40 μl of the above staining solution (dilution factor: 4 times), stain at 35 ° C. for 10 seconds, and forward scatter light, forward fluorescence and electricity with a flow cytometer using an argon laser as a light source. The resistance signal was measured. In addition, you may measure a side (90 degree) fluorescence as fluorescence. 1 and 2 show scattergrams obtained by measuring forward scattered light and forward fluorescence using a sample in which yeast-like fungi, white blood cells and red blood cells have appeared. As is clear from FIGS. 1 and 2, when the reagent of the above example was used, it was found that yeast-like fungi, leukocytes and erythrocytes were well classified. FIG. 3 shows a schematic diagram of a scattergram when the formed components in urine were measured using the reagent of the present invention.
[0054]
Also, when a sample having background fluorescence was measured using the reagent of the above example, the cells could be strongly stained, so that the measurement could be performed without being affected by the background fluorescence.
Furthermore, when the electrical resistance signal is measured, relatively large tangible components such as cylinders (cylinders containing glass cylinders and inclusions), mucus threads, epithelial cells, etc. are determined from the relationship between the scattered light pulse width and the resistance peak value. It was possible to catch and classify. FIG. 4 shows a schematic diagram of the scattergram. Furthermore, when a column including granules, red blood cells, white blood cells, etc. appeared in the column, it was possible to measure the column more reliably by combining the fluorescence pulse width and the scattered light pulse width. FIG. 5 shows a schematic diagram of the scattergram.
[0055]
Example 2
The same operation was repeated using a reagent having the same composition as in Example 1 except that sodium propionate was added in an amount of 210 mOsm / kg and the electric conductivity was 7 mS / cm.
The results were the same as in Example 1.
[0056]
Example 3
The same operation was repeated using a reagent having the same composition as in Example 1 except that sodium propionate was added in an amount of 310 mOsm / kg and the electric conductivity was 10 mS / cm.
The results were the same as in Example 1.
[0057]
Example 4
A diluent and a staining solution were prepared according to the following formulation.
[0059]
After 400 μl of urine was diluted with 1184 μl of the above diluent, 16 μl of the above-mentioned staining solution was added, and the mixture was stained at 35 ° C. for 50 seconds, and forward scattered light and forward fluorescence were measured with a flow cytometer using a red semiconductor laser as a light source.
The results were the same as in Example 1.
[0060]
[0061]
After diluting 400 μl of urine with 1160 μl of the above diluent, add 40 μl of the above staining solution (dilution factor: 4 times), stain at 35 ° C. for 10 seconds, and forward scatter light, forward fluorescence and electricity with a flow cytometer using an argon laser as a light source. The resistance signal was measured. 7 and 8 show scattergrams obtained by measuring forward scattered light and forward fluorescence. As is clear from FIGS. 7 and 8, when the reagents of the above comparative examples were used, the staining properties of yeast-like fungi and erythrocytes were poor, and these could not be discriminated.
[0062]
When a sample having background fluorescence was measured using the reagent of the above comparative example, as shown in FIG. 9 and FIG. An impossible region was expressed and analysis was not possible.
[0063]
Further, when measuring the forward scattered light and the forward fluorescence in Example 1 above, the measurement was performed at a detector sensitivity of about 16.6% as compared with the measurement in Comparative Example 1, and the detection with lower sensitivity was performed. It was confirmed that the yeast-like fungi, leukocytes and erythrocytes were well classified even when a vessel was used. In other words, in Comparative Example 1, the fluorescence of the red blood cells is very weak, so that it is necessary to increase the detector sensitivity. However, in the case of this example, the red blood cells are also stained strongly, so that a lower detector sensitivity is required. Can be used. Therefore, it has become possible to reduce the detector sensitivity to such an extent that the background fluorescence can be ignored and to perform measurement.
[0064]
【The invention's effect】
According to the reagent for analyzing particles in urine of the present invention and the cell analysis method using the reagent,
(1) Staining property of erythrocytes was improved, and separation from crystals became possible.
(2) To improve the dyeability of various particles formed in urine, the sensitivity of photomultiplier (PMT) for fluorescence detection can be reduced to such an extent that the influence of the fluorescence behind urine itself can be ignored. became.
(3) Even if various kinds of formed components appear in urine at the same time, it is possible to discriminate more accurately.
(4) The ability to discriminate cylinders was improved.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a scattergram of measured forward scattered light and forward fluorescence when urine particles are stained using the urine particle analysis reagent of the present invention.
FIG. 2 is an enlarged view of FIG.
FIG. 3 is a schematic diagram of a scattergram when forward scattered light and forward fluorescence are measured when urine particles are stained using the urine particle analysis reagent of the present invention.
FIG. 4 is a scattergram showing the relationship between the scattered light pulse width and the resistance peak value of the electrical resistance signal measured after staining the urinary particles using the urine particle analysis reagent of the present invention. It is a schematic diagram.
FIG. 5 is a scattergram showing the relationship between the scattered light pulse width and the fluorescent pulse width of the electrical resistance signal measured after staining the urinary particles using the urine particle analysis reagent of the present invention. It is a schematic diagram.
FIG. 6 is a schematic diagram showing a flow cytometer suitably used when measuring urinary particles using the urine particle analysis reagent of the present invention.
FIG. 7 is a scattergram showing the measured forward scattered light intensity and forward fluorescence intensity when urine particles were stained using a urine particle analysis reagent containing auramine O.
FIG. 8 is an enlarged view of FIG. 7;
FIG. 9 shows a scattergram of the intensity of forward scattered light and the intensity of forward fluorescence when the components in urine having fluorescence behind are stained using a reagent for analyzing particles in urine containing auramine O. .
FIG. 10 is an enlarged view of FIG. 9;
[Explanation of symbols]
WBC white blood cells
RBC red blood cells
YEAST yeast-like fungus
Claims (17)
(ii)浸透圧を100mOsm/Kg〜600mOsm/Kgに保つための浸透圧補償剤、
(iii) 縮合ベンゼン誘導体系の第１染料、
(iv)損傷を受けた細胞を染色しうる第２蛍光染料、及び
(v) キレート剤
を含有することからなる、尿中の赤血球と酵母様真菌を弁別可能にする尿中有形成分分析用試薬。(i) a buffer for maintaining the pH at 5.0 to 9.0,
(ii) an osmotic pressure compensator for keeping the osmotic pressure at 100 mOsm / Kg to 600 mOsm / Kg,
(iii) a condensed benzene derivative-based first dye,
(iv) a second fluorescent dye capable of staining damaged cells; and
(v) A reagent for analyzing urinary particles, which comprises a chelating agent and enables discrimination between red blood cells and yeast-like fungi in urine.
(ii)(ii) 浸透圧をOsmotic pressure 100mOsm/Kg100mOsm / Kg 〜~ 600mOsm/Kg600mOsm / Kg に保つための浸透圧補償剤、Osmotic pressure compensating agent to keep the
(iii) (iii) 縮合ベンゼン誘導体系の第１染料、A first dye based on a condensed benzene derivative,
(iv)(iv) 損傷を受けた細胞を染色しうる第２蛍光染料、及びA second fluorescent dye capable of staining damaged cells, and
(v) (v) キレート剤Chelating agent
を含有することからなり、Consisting of
電気伝導度が１〜Electric conductivity is 1 10mS10mS ／/ cmcm に調整されている、尿中有形成分分析用試薬。A reagent for the analysis of urinary particles, which is adjusted to:
又は２つの低級アルコキシ基もしくは１つのジ低級アルキルアミノ基（この低級アルキルはシアノ基で置換されていてもよい）で置換されたフェニル基である。〕
から選ばれたものである請求項１又は２に記載の試薬。The first dye has the following formula
Or a phenyl group substituted with two lower alkoxy groups or one di-lower alkylamino group (the lower alkyl may be substituted with a cyano group). ]
The reagent according to claim 1, which is selected from the group consisting of:
（ｂ）緩衝剤、浸透圧補償剤及びキレート剤とを含有する希釈液
との２液の形態である請求項１〜５のいずれか１つに記載の試薬。6. A two-liquid form comprising (a) a dyeing solution containing a first dye and a second fluorescent dye, and (b) a diluting solution containing a buffer, an osmotic pressure compensating agent and a chelating agent. The reagent according to any one of the above.
(II)浸透圧を100mOsm/Kg〜600mOsm/Kgに保つための浸透圧補償剤、
(III) 赤色波長で励起可能な染料、
(IV)キレート剤
を含有することからなる、尿中の赤血球と酵母様真菌を弁別可能にする尿中有形成分分析用試薬。(I) a buffer for keeping the pH at 5.0 to 9.0,
(II) an osmotic pressure compensator for keeping the osmotic pressure at 100 mOsm / Kg to 600 mOsm / Kg,
(III) a dye capable of being excited at a red wavelength,
(IV) A reagent for analyzing urinary particles, which comprises a chelating agent and enables discrimination between red blood cells and yeast-like fungi in urine.
(II)(II) 浸透圧をOsmotic pressure 100mOsm/Kg100mOsm / Kg 〜~ 600mOsm/Kg600mOsm / Kg に保つための浸透圧補償剤、Osmotic pressure compensating agent to keep the
(III) (III) 赤色波長で励起可能な染料、Dyes that can be excited at red wavelengths,
(IV)(IV) キレート剤Chelating agent
を含有することからなり、Consisting of
電気伝導度が１〜Electric conductivity is 1 10mS10mS ／/ cmcm に調整されている、尿中有形成分分析用試薬。A reagent for the analysis of urinary particles, which is adjusted to:
（ｂ）緩衝剤、浸透圧補償剤及びキレート剤とを含有する希釈液
との２液の形態である請求項１０〜１３のいずれか１つに記載の試薬。14. A liquid solution comprising: (a) a dye solution containing a dye excitable at a red wavelength; and (b) a diluent solution containing a buffer, an osmotic pressure compensating agent and a chelating agent. The reagent according to any one of the above.
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