JP3569290B2

JP3569290B2 - Taxol-like protein and method for producing the same

Info

Publication number: JP3569290B2
Application number: JP51351698A
Authority: JP
Inventors: ビュンドーハン; キュリム; サンタエクァク; ギリャンクェオン; ワンヘーヨーン
Original assignee: ビュンドーハン
Priority date: 1996-09-12
Filing date: 1996-09-12
Publication date: 2004-09-22
Anticipated expiration: 2016-09-12
Also published as: JP2001501188A; AU6946596A; WO1998011135A1

Description

発明の背景
技術分野
本発明は、新規のタキソール類似蛋白（"TALP"）及びその製造方法に関する。より具体的には、本発明はヒトの胎盤組織より単離されタキソール類似作用を有する新規の蛋白、その製造方法、並びに抗癌剤及び抗ウイルス剤としてのその新規の用途に関するものである。
背景技術
微小管は主にサイトソールに存在し、ヘテロダイマーとなるチューブリンサブユニット、すなわちα−チューブリン及びβ−チューブリンから成る蛋白であって、その形成時にGTP及び微小管付随蛋白（"MAPs"）を必要とすることが知られている（Olmsted,J.B.,1986,Ann.Rev.Cell Biol.,2:421−457;Chen,J.et al,1992,Nature,360:674−677;Brandt,R.and Lee,G.,1993,J.Biol.Chem.,268:3414−3419;Maekawa,S.et al.,1992,Eur.J.Biochem.,205:195−200）。
微小管は有糸分裂時に赤道板に配列された染色体を両極に導く分裂方錘糸の主要な成分であり、分裂間期に細胞の形状、運動性及び付着の維持、並びに細胞内輸送を含む多くの細胞作用において必要不可欠な役割を演じている（Shiff,P.B.and Horwitz,S.B.,1981,「抗癌化学療法剤における分子作用及び標的」の項の「チューブリン：化学療法剤の標的」,pp483−507,Academic Press,NY,USA;Glotz,J.S.et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,89:7026−7030;Rowinsky,E.K.et al.,1990,Nature,82:1247−1259）。それらはまた成長因子と細胞表面上の受容体の相互作用及びこれらの相互作用により誘導される膜通過性の増殖信号を調節することにおいても重要である。
一方、ビンブラスチン及びビンクリスチン等は微小管の形成を抑制することにより抗癌作用を有する。これに対して、イチイ（Taxus）属植物から単離されるジテルペノイドの一種であるタキソールは、固形癌、特に乳癌及び子宮癌等の治療劑として注目されている。これは微小管の形成を促進し，微小管の安定性を増加させることにより、微小管の解重合、微小管ネットワークの正常な動的再編成、及び細胞増殖を抑制して、最終的に抗癌活性を示す（Schiff,P.B.et al.,1979,Nature,277:665−667;Schiff,P.B.and Horwitz,S.B,1981,Biochemistry,20:3247−3252;Crossin,K.L.and Carney,D.H.,1981,Cell,27:341−350;Wilson,L.et al.,1985,Biochemistry,24:5254−5262;Wiernik,P.H.et al.,1987,Cancer Res.,47:2486−2493）。しかしながら、イチイ属植物は限られた地域にしかなく、その成長も遅いために、それから単離されるタキソールの量は当然限られている。さらに、タキソールの製造に必要な大量の植物体を伐採することにより環境破壊も問題となる。
発明の要約
本発明においては、ヒトの胎盤組織より単離されるタキソール類似蛋白（TALP）がin vitroでタキソールと同様の様式で微小管の形成を促進及び安定化させ、これが抗癌剤及び抗ウイルス剤の活性成分として利用できることが見出された。
従って本発明の主な目的は、哺乳動物の組織より単離されタキソール様の作用を持つ新規のタキソール類似蛋白（TALP）を提供することにある。
本発明の他の目的は哺乳動物の組織からTALPを調製する方法を提供することにある。
また、本発明の別の目的は抗癌剤及び抗ウイルス剤の活性成分としてのTALPの新規用途を提供することにある。
【図面の簡単な説明】
上記及び他の本発明の目的並びに特徴は、添付の図面と合わせて以下に述べる説明から明らかとなる：
図１は、ヒトの胎盤組織より単離されたTALPのSDS−PAGEパターンを示す写真である。
図２（Ａ）は、ヒトの胎盤組織よりTALPを精製する過程において得られた分画のSDS−PAGEパターンを示す写真である。
図２（Ｂ）は、図２（Ａ）に示されるSDS−PAGEに対応するウェスタンブロット分析を示す写真である。
図３は、微小管の重合に対するTALPの効果をGTP及びタキソールと比較して示すグラフである。
図４は、タキソールにより形成された微小管に対するTALPの効果を示すグラフである。
図５は、GTP、タキソール又はTALPにより形成された微小管に対するCa²⁺の効果を示すグラフである。
図６は、GTP、タキソール又はTALPにより形成された微小管に対する低温（４℃）の効果を示すグラフである。
図７（Ａ）は、GTP、タキソール又はTALPのそれぞれの存在下における微小管形成について、反応混合液を遠心分離して得られた上清及びペレットのSDS−PAGEパターンを示す写真である。
図７（Ｂ）は、種々の濃度のTALPの存在下における微小管形成について、反応混合液を遠心分離して得られた上清及びペレットのSDS−PAGEパターンを示す写真である。
図８は、ウイルスによる大腸菌の溶解におけるTALPの効果を示すグラフである。
図９は、TALP及びBSA（ウシ血清アルブミン）の波長走査の結果を示すグラフである。
図10（Ａ）は、αβ−チューブリン又はαβ_Ｓ−チューブリンとのTALPの結合を調べるための、共沈殿後のSDS−PAGEパターンを示す写真である。
図10（Ｂ）は、αβ−チューブリン又はα_Ｓβ_Ｓ−チューブリンとのTALPの結合を調べるための、共沈殿後のSDS−PAGEパターンを示す写真である。
図11（Ａ）は、チューブリン分子とのタウ蛋白及びMAP2の結合を調べるための、共沈殿後のSDS−PAGEパターンを示す写真である。
図11（Ｂ）は、図12（Ａ）に示すSDS−PAGEに対応する、タウ蛋白に対するモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析を示す写真である。
図11（Ｃ）は、図12（Ａ）に示すSDS−PAGEに対応する、MAP2に対するモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析を示す写真である。
図12（Ａ）は、GTPの存在下におけるタウ蛋白のイムノゴールドラベルの電子顕微鏡写真である。
図12（Ｂ）は、TALPの存在下におけるタウ蛋白のイムノゴールドラベルの電子顕微鏡写真である。
図13は、TALPによるHM7ヒト大腸癌細胞の増殖抑制を示すグラフである。
図14は、TALPによるHM7ヒト大腸癌細胞の細胞運動性抑制を示すグラフである。
発明の詳細な説明
TALPをヒト胎盤のような哺乳動物の組織より分離するために、組織をホモジナイズして遠心分離し上清を得た。このようにして得られた上清を陽イオン交換樹脂カラムにのせて、カラムを洗浄した。次いで、TALPを含む分画をカラムから溶出させた後にハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを行い、最終的に約35kDaのTALPが精製された。
MAPsはGTPの存在下でチューブリンの重合化を促進し、そうして重合した微小管はCa²⁺の存在下及び４℃以下の低温で解重合するが、一方、タキソールはGTPがなくてもチューブリンの重合化を促進し、それにより重合した微小管はCa²⁺及び４℃以下の低温による分解に対して耐性があり非常に安定化されていることが報告されている（Schiff,P.B.et al.,1979,Nature,277:665−667;Schiff,P.B.and Horwitz,S.B,1981,Biochemistry,20:3247−3252;Crossin,K.L.and Carney,D.H.,1981,Cell,27:341−350;Wilson,L.et al.,1985,Biochemistry,24:5254−5262;Wiernik,P.H.et al.,1987,Cancer Res.,47:2486−2493）。
これに関連して、哺乳動物組織より精製されたTALPの特性決定を行い、TALPはタキソールのようにGTPが無くてもチューブリンの重合化を促進し、それにより重合した微小管はCa²⁺及び４℃以下の低温により解重合されずタキソールの場合よりもはるかに良く安定化されることが分かった。このことは細胞増殖の抑制によるTALPの抗癌活性がタキソールのそれよりもはるかに高いことを示唆している。また、微小管の形成は微小管上へのTALPの直接結合によって起きるものであって、TALPのこの作用機作はタキソールと同様であることが明らかになった。
従って、本発明における‘TALP'は、GTP又はMAPsがなくてもチューブリンの重合化を促進する蛋白を意味し、そうして重合した微小管はCa²⁺及び４℃以下の低温に対して耐性を示し非常に安定化されている。
TALPはトリプシンによる分解で少なくとも７個のフラグメントとなり、その正確な数はトリプシンの特異活性、TALPの濃度、イオン強度、pH、温度及び培養時間のような要因に左右される。
タウ蛋白及びMAP2のようなMAPsはチューブリンのカルボキシル末端部分に結合することによりチューブリン重合化を促進する。TALPの場合は、MAP2とは異なり、タウ蛋白と競合的にチューブリンに結合し、このことはタウ蛋白イムノゴールドラベルを用いた電子顕微鏡写真でも見ることができる。従って、TALPはチューブリンに対するタウ蛋白の結合を競合的に抑制するため、アルツハイマー病の治療剤の開発に利用できると思われる。
TALPはin vitroでタキソールと同様に作用する。そこで、TALPがタキソールのような抗癌剤としての利用が可能かどうかを調べるために、剥離したNIH 3T3細胞の再生、HM7ヒト大腸癌細胞の増殖及びin vitroでの運動性、及び受精したクセノプス（南アフリカ蛙:Xenopus）の卵母細胞の細胞分裂に対するTALPの効果を調査した。また、ヒト大腸癌細胞をヌードマウスの脾臓に注入して、肝臓への転移に対するTALPの効果を調べた。その結果、TALPはタキソールのように細胞増殖を抑制すること、すなわち、剥離したNIH 3T3細胞の再生、HM7ヒト大腸癌細胞の増殖及びin vitroでの運動性、及び受精したクセノプス卵母細胞の細胞分裂をそれぞれ抑制することが見出された。同様にTALPはHM7の肝への転移も顕著に抑制することが明らかになった。従って、本発明のTALPは抗癌剤、抗転移剤及びアルツハイマー病の治療剤として利用できる。また、ウイルスによる大腸菌の溶解実験で、ウイルスをTALPで前処理することにより大腸菌溶解が起きなくなることが判明したが、これは本発明のTALPが抗ウイルス剤としても利用しうることを示唆している。
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。特に、本発明は蛋白の原料に関わらず本発明のTALPと同様の性質及び特徴を示す全ての蛋白に及ぶものであって、以下の実施例で述べるヒトの胎盤組織より単離した35kDa蛋白に限定されるものではない。
実施例１：ヒトの胎盤組織からのTALPの単離
ヒトの満期胎盤を0.154M NaCl溶液で数回洗浄して血液を完全に除去した。洗浄済み胎盤を小片に切断して、100gの胎盤に250mlの0.6Mリン酸バッファーＡ（0.6Mリン酸カリウム、1mM DTT、1mM EDTA、0.5mM PMSF、0.5μg/mlロイペプチン、10％グリセロール、pH7.0）を加え、Polytron（Kinemetica^TM、スイス）で２分間ホモジナイズして１時間氷浴中に放置してTALPの粗抽出物を得た。
上記で得られた抽出物を二重のチーズスロスで濾過し、30,000xgで30分間遠心して上清を得た。この上清を0.6Mリン酸バッファーＡで平衡化したホスホセルロースカラムにのせた。同バッファーでカラムを十分洗浄した後、続いて0.6Mから1.8Mのリン酸直線勾配でTALPを溶出させた。TALP活性の測定から、1.0Mから1.3Mのリン酸濃度範囲でTALPが溶出されていることを確認した。
TALPを含む活性分画を回収してグリセロール溶液（1mM DTT、1mM EDTA、0.5mM PMSF及び0.5μg/ml ロイペプチンを含む10％グリセロール溶液）で透析した。次いで遠心分離し、上清を0.35Mリン酸バッファーＡで平衡化したハイドロキシアパタイトカラムにのせた。同バッファーでカラムを洗浄した後、続いて0.35Mから0.55Mのリン酸直線勾配でTALPを溶出させた。TALP活性の測定から、0.43Mから0.48Mのリン酸濃度範囲でTALPが溶出されていることが分かった。
活性分画を回収してグリセロール溶液で３倍に希釈した後、上記と同じ手順でハイドロキシアパタイトカラムで分画化した。溶出された分画の12％SDS−PAGEから、35kDaの見かけの分子量に単一のバンドが見られることが分かった（図１参照）。
精製工程は全て４℃以下で行い、TALP活性は通常のチューブリン重合化を濁度で検視することにより測定した（Gaskin,F.et al.,1974,J.Mol.Biol.,89:737−758）。ハメルら又はアスネスらの方法（Hamel E.et al.,1981,Arch.Biochem.Biophys.,209:29−40;Asnes,C.F.and Wilson,L.,1979,Anal.Biochem.,98:64−73）により調製したチューブリンを最終濃度が1mg/mlになるように0.1M MES（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）バッファー（1mMEGTA及び1mM MgCl₂を含む0.1M MES、pH6.8）に加え、TALP含有溶液を加えて最終的な反応容量が250μｌになるようにした。反応混合液を37℃で30分間インキュベートし、350nmにおける吸光度の変化をGilford Model 2600分光光度計（Gilford,USA）でモニターした。
実施例２：ウェスタンブロット分析によるTALPの同定
TALPに対するポリクローナル抗体を調製するために、実施例１で精製したTALPを12％SDS−PAGEで分離し、分子量35kDaに対応する蛋白バンドを切断して当該蛋白を得た。得られた蛋白に同量のフロインド完全アジュバントを加えてよく混合し、1.5kgのオスうさぎの皮下及び下肢筋肉に別々に注射した。その後、一ヵ月毎に同量の蛋白を不完全アジュバントと混合して２回追加接種した（Harlow,E.and Lane,D.,1988,Antibodies:Laboratory Manuals.In:Immunization、pp53−137,Cold Spring Harbor Laboratory）。10日後、酵素結合抗体免疫アッセイ（ELISA）で抗体産生を確認した。次いで、上記ウサギから血清を採取し、プロテインＡ−セファロースアフィニティクロマトグラフィーによりポリクローナル抗体を精製した。こうして精製された抗体の濃度は4.0mg/mlであった。
上記で調製したポリクローナル抗体を用いてTALPの結合特異性を調べるために、ウェスタンブロット分析を行なった：ラムリ（Laemmli）の方法を改良した方法により、厚さ1.5mmの12％SDS−PAGEゲル（11x16cm）を調製した（Laemmli U.,1970,Nature,227:680−685）。次いで、蛋白溶液類、すなわち、実施例１でそれぞれ得られた胎盤ホモジネート、ホスホセルロースクロマトグラフィー溶出液、及び２次ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー溶出液を、スラブゲル電気泳動装置（Bio−Rad、USA）を用いてゲルの厚さ当り20mAの流動でSDS−PAGE分析した（図２（Ａ）参照）。続いて、分離された蛋白をニトロセルロース膜上に電気的に転写し、上記で調製したTALPに対するポリクローナル抗体を用いて免疫染色した。その結果、SDS−PAGEにのせた全てのサンプルに存在する35kDa蛋白がポリクローナル抗体によって強く検出され、さらに約32kDaの蛋白が同ポリクローナル抗体によって弱く検出されることが分かった（図２（Ｂ）参照）。図２（Ａ）及び図２（Ｂ）において、レーン１、２及び３はそれぞれ胎盤ホモジネート、ホスホセルロースクロマトグラフィー溶出液、及び２次ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー溶出液を示す。
このように上記で製造されたポリクローナル抗体はTALPに特異的に結合するために、組織及び細胞小器官中のTALPの検出及び定量に利用できることが分かった。
実施例３：チューブリン重合化におけるTALPの効果
実施例１に述べたのと同様の方法で、GTP、タキソール及びTALPのチューブリン重合化における効果を調べた。図３に示した通り、2mM GTPの存在下で（対照群）、チューブリン重合化は１ないし２分の遅延時間を示す典型的なシグモイド曲線型で起こり;0.5μM TALPの存在下では対照群の2.5倍の高さで双曲線型にチューブリン重合化が起こり、１μM TALPの存在下では対照群の2.5倍の重合化が起きた。これらはTALPが用量依存的にチューブリン重合化を促進することを示している。また、20μＭタキソールの存在下では、対照群より2.5倍のチューブリン重合化が起こり、この活性は0.5μM TALPのそれと同等である。このことはTALPがタキソールの約40倍の強度でチューブリン重合化を促進することを示している。さらに、TALPがタキソールと同様に、GTPが無くてもチューブリン重合化を促進することが明らかとなった。
実施例４：タキソールにより形成された微小管に対するTALPの効果
タキソールにより形成された微小管に対するTALPの効果を調べるために、実施例１に述べた重合化アッセイの反応溶液に10μＭタキソールを加えた。反応混合液に0.5μM TALPを加えると、TALPを加えていないものよりも２倍以上の高さのチューブリン重合化が起きた（図４参照）。
実施例５：チューブリン重合化におけるCa²⁺の効果
チューブリン重合化におけるCa²⁺の効果を調べるため、チューブリンをEGTAを含まない0.1M MESバッファー（pH6.8）に加え、GTP、タキソール又はTALPを加えて37℃で15分間、微小管を重合化させた。その後、反応混合液に4mM CaCl₂を加えて、GTP、タキソール又はTALPを加えて形成された微小管の解重合を測定した（図５参照）。図５に示すように、2mM GTPにより形成された微小管はほとんど全て解重合され、10μＭタキソールにより形成された微小管も30％が解重合されたが、0.5μM TALPにより形成された微小管は全く解重合されなかった。従って、TALPにより安定化された微小管はCa²⁺によって起きる解重合に対して耐性があることが明らかにされた。
実施例６：チューブリン重合化における低温（４℃）の効果
チューブリン重合化における低温の効果を調べるため、チューブリンを0.1M MESバッファー（pH6.8）に加えた。次いで、GTP、タキソール又はTALPを反応混合液に加えて、微小管の重合化を37℃で15分間行った。その後、反応溶液を４℃に冷却し、GTP、タキソール又はTALPを加えて形成された微小管の解重合を測定した（図６参照）。図６に示すように、10μＭタキソール及び0.5μM TALPにより形成された微小管はそれぞれ25％及び10％が解重合されたが、2mM GTPにより形成された微小管はほとんど全てが解重合された。従って、TALPにより安定化された微小管は低温（４℃）によって起きる解重合に対して、タキソールにより安定化された微小管と同様に耐性があることが明らかにされた。
実施例７：チューブリン及びTALPの共沈殿の同定
TALPがタキソールと同様の様式で微小管形成を促進するのかどうかを調べるために、ウシの脳から単離したチューブリンを0.1M MESバッファー（pH6.8）に0.4mg/mlの濃度で加えた。次いで、2mM GTP、10μＭタキソール又は４μM TALPを反応混合液に加えて37℃で30分間、微小管を重合化させた。反応混合液を20分間遠心分離し、得られた上清及びペレットを12％ SDS−PAGEで分析した（図７（Ａ）参照）。図７（Ａ）に見られるように、10μＭタキソール及び４μM TALPの存在下ではそれぞれ約20％及びほとんど全てのチューブリンが重合化されたが、2mM GTPの存在下ではほとんどのチューブリンが重合化されなかった。
また、TALPの濃度を変えてチューブリン重合化を調べた。その結果、微小管形成はTALP濃度が上昇するのに連れて増加したが（図７（Ｂ）参照）、これは図３の結果に一致している。図７（Ａ）及び図７（Ｂ）において、Ｓ及びＰはそれぞれ上清及びペレットを示す。図７（Ａ）及び図７（Ｂ）に示すように、TALPは上清中には存在せず、微小管と共に沈殿されていた。よって、TALPは微小管に直接結合することにより微小管の形成を促進することが示唆され、これはタキソールの作用と一致するものである。
実施例８：微小管の電子顕微鏡分析
実施例１のように微小管の重合化を吸光度測定によってモニターする場合、吸光度の増加は微小管の形成だけでなく、チューブリンの凝集によっても起こりうる。そこで、微小管形成によって濁度の変化がもたらされることを確認するために、電子顕微鏡でこの高分子の形態を調べた。チューブリンを0.1M MESバッファーに1mg/mlの濃度で加え、GTP、タキソール又はTALPを最終反応容量が250μｌになるように加えた。反応混合液を37℃で30分間インキュベートし、350nmでの吸光度の変化をモニターした。この時、吸光度の増加を示した反応溶液を固定してカーボンコーティング−グリッドにのせた後乾燥させた。次いでグリッドを１％ウラニルアセテートで５分間染色し、蒸留水で洗浄して乾燥させた。その後、電子顕微鏡（日立Ｈ−600、日本）を用いて加速電圧75kvで調べた。その結果、GTP、タキソール又はTALPを加えた反応溶液の全てで典型的な微小管が形成されていることが確認された。
実施例３ないし８の結果から、本発明のTALPはタキソールと同様にGTP又はMAPsが無くてもチューブリンの重合化を促進し、そうして重合化された微小管はCa²⁺及び４℃以下の低温によって起きる分解に対して耐性を持ちタキソールの場合よりもはるかに良好に安定化されていることが明らかになった。これは後述するような細胞増殖の抑制によるTALPの抗癌活性がタキソールに比べてはるかに高いことを示唆している。
実施例９:TALPによる細胞増殖の抑制
TALPはin vitroではタキソールと同様に作用する。そこで、タキソールのように抗癌剤としての利用が可能であるかどうかを調べるため、剥離したNIH 3T3細胞の再生、及び受精したクセノプスの卵母細胞の細胞分裂を対するTALPの効果を調べた。
実施例９−１：剥離したNIH 3T3細胞の再生の抑制
NIH 3T3細胞株（ATCC CRL 6442）をRPMI 1640培地で95％成長段階まで培養した。その後、滅菌したループで培養皿を掻いて細胞を剥離させ、TALPを培地に加えて、剥離したNIH 3T3細胞の再生に対するTALPの効果を観察した。その結果、TALP処理をしていない細胞は再生されたが、１μM TALPで処理した細胞は再生されなかった。従って、TALPはタキソールと同様に細胞増殖を抑制するために抗癌剤として利用しうることが分かった。
実施例９−２：受精したクセノプス卵母細胞の細胞分裂の抑制
２分割期のカエル受精卵の一方の細胞に微量注射器（Drummond Scientific、USA）を用いて対照としての生理食塩水又はTALPを微量注入した（Hiramoto,Y.,1962,Exp.Cell.Res.,27:416−426参照）。この時、微量注入容量が0.5％未満の誤差範囲になるように注意して調節した。1.2nmの受精卵の場合、全容積の半分を卵黄血小板が占めるものと仮定して、サイトソール容量を450nlとみなし、注入溶液の最終濃度を計算する際にこれを用いた。
その結果、対照細胞は速やかに増殖したが、TALPを注入した細胞は全く増殖しなかった。従って、TALPはタキソールのように細胞増殖を抑制するために、抗癌剤として利用しうることを確認した。
実施例10:TALPの抗ウイルス活性
TALPによるウイルス増殖の抑制効果を調べるため、P4ファージを含む溶液に0.22μｍアクロ−ディスクでろ過したアルブミン、TALP又はアルブミンとTALPの混合物を加え、ルリア培地（蒸留水100ml中、トリプトン1g、酵母抽出物0.5g及びNaCl 1g、pH7.5）を加えて最終容量100μｌとした。この反応混合物を37℃で30分インキュベートして、E.coli C117を加えてよく混合した。その後、0.7％アガロースを含むルリア培地4mlを混合液に加え、1.4％アガロースを含むルリア培地6mlが予め固定されているプレート中に注いだ。次いで、細胞を37℃で一晩培養して、溶解したプラークの数をカウントした（図８参照）。図８に示すように、アルブミンだけを加えた対照プレートでは平均58個のプラークが認められ;25μg/ml及び50μg/mlのTALPを加えたプレートではそれぞれ30％及び52％のプラーク減少が起こり、100μg/mlのTALPを加えたプレートではプラークが殆ど観察されなかった。また、アルブミンとTALPの混合物を加えたプレートはTALP単独処理のプレートと同様のパターンを示した。
従って、本発明のTALPは抗ウイルス活性を有するために、抗ウイルス剤としても利用しうることが分かった。
実施例11:TALPの波長走査
TALPの特性を調べるため。200nmから340nmまでの紫外線領域でTALP及びBSAの吸光度変化を測定した（図９参照）。図９において、実線と点線はそれぞれBSA及びTALPの吸光度の変化を示す。図９に見られるように、TALPは280nmの吸光度がBSAと比較すると相対的に低い値を示すことが分かり、これはTALPのアミノ酸組成が他の蛋白とは異なっていることを示唆している。
実施例12：αβ−チューブリン及びサブチリシンで切断処理したチューブリンとのTALPの結合
TALPがチューブリン分子のカルボキシル末端に結合するかどうかを調べるために、αβ_Ｓ−チューブリン及びα_Ｓβ_Ｓ−チューブリンを調製し、TALPを加えて微小管を形成させた後、共沈殿アッセイを行った。ホスホセルロースクロマトグラフィーにより単離したチューブリンを含まないMAPsを50mM MESバッファー（pH6.8）に0.4mg/mlの濃度で加え、タキソールを20μＭの最終濃度で加えて、37℃で30分間インキュベートした。次いで、αβ_Ｓ−チューブリン及びα_Ｓβ_Ｓ−チューブリンを調製するためにチューブリンを２％（w/w）サブチリシンでそれぞれ30分及び９時間切断して、PMSFを加えて蛋白分解反応を止めた。サブチリシンで切断されたチューブリンを0.4μM TALPの存在下又はTALP無しで37℃、30分間重合化させた後、20分間遠心分離した。得られた上清及びペレットを９％SDS−PAGEで分析した（図10（Ａ）及び図10（Ｂ）参照）。図10（Ａ）及び図10（Ｂ）において、Ｓ及びＰはそれぞれ上清及びペレットを示す。図10（Ａ）において、レーン１はαβ−チューブリン重合化を示し；レーン２はαβ_Ｓ−チューブリン重合化を示し；レーン３は0.4μM TALP存在下でのαβ−チューブリン重合化を示し；レーン４は0.4μM TALP存在下でのαβ_Ｓ−チューブリン重合化を示し；及びレーン５は0.4μM TALP存在下でのαβ−チューブリン及びαβ_Ｓ−チューブリン重合化をそれぞれ示す。図10（Ｂ）において、レーン１はαβ−チューブリン重合化を示し；レーン２はα_Ｓβ_Ｓ−チューブリン重合化を示し；レーン３は0.4μM TALP存在下でのαβ−チューブリン重合化を示し；レーン４は0.4μM TALP存在下でのα_Ｓβ_Ｓ−チューブリン重合化を示し；及びレーン５は0.4μM TALP存在下でのαβ−チューブリン及びα_Ｓβ_Ｓ−チューブリン重合化をそれぞれ示す。
図10（Ａ）及び図10（Ｂ）に示すように、TALPはαβ−チューブリン及びサブチリシンで切断されたチューブリンの重合化を誘導することが見出された。チューブリンを重合化する目的でαβ−チューブリン、αβ_Ｓ−チューブリン又はα_Ｓβ_Ｓ−チューブリンを含むチューブリン溶液にTALPを加えると、TALPはαβ−チューブリンとともに沈殿した。この結果は、完全なチューブリンへのTALPの結合親和性はサブチリシンで切断されたチューブリンのいずれに対するものよりも強く、TALPの高親和性結合部位はチューブリン分子のカルボキシル末端ドメインに存在することを示している。
実施例13：チューブリン重合化におけるタウ蛋白とTALPの競合
微小管形成を活性化するタウ蛋白及びMAPsはチューブリン分子のＣ−末端に結合することは良く知られている。図10（Ａ）及び図10（Ｂ）に見られるように、TALPもチューブリン分子のＣ−末端に結合する。これに関して、TALPが共存する場合のチューブリンに対するタウ蛋白とMAPsの結合様式を調べるために、MAPsを含むチューブリンを用いた微小管形成及び共沈殿を順次行った。
ウシの脳より得られたチューブリンを50mM MESバッファー（pH6.8）に0.4mg/mlの最終濃度になるように懸濁し、0.5、１、２又は４μM TALPを加えた後37℃で30分間、重合化させた。20分間遠心分離し、得られたペレットを懸濁して12％SDS−PAGEゲルにのせた（図11（Ａ）参照）。図11（Ａ）のゲルをニトロセルロース膜に転写して、免疫染色してタウ蛋白及びMAP2を検出した（図11（Ｂ）及び図11（Ｃ）参照）。図11（Ａ）、図11（Ｂ）及び図11（Ｃ）において、Ｓ及びＰはそれぞれ上清及びペレットを示す。
図11（Ｂ）に示すように、TALP共存時には、チューブリンに結合するタウ蛋白のレベルはTALP濃度の上昇に伴い直線的に減少し、高濃度のTALPの存在下では、タウ蛋白は全く結合せずTALPがタウ蛋白の代わりにチューブリンに結合した。しかしながら、図11（Ｃ）に示すように、TALP共存時に、チューブリンに結合するMAP2のレベルはTALP濃度の上昇に伴い直線的に増加した。
従って、TALPはチューブリン分子のＣ−末端に結合し、TALPとタウ蛋白はチューブリン分子の同一のＣ−末端に競合的に結合することが確認された。
実施例14：タウ蛋白とTALPの競合的結合の電子顕微鏡試験
チューブリンのＣ−末端へのTALPとタウ蛋白の競合的結合を調べるために、タウ蛋白に対するイムノゴールドラベルを行ない、走査電子顕微鏡（Hitachi H−600、日本）を用いて加速電圧75kvで調べた。チューブリン及びMAPsを含む反応混合液に2mM GTP及び４μM TALPをそれぞれ加えた。続いて、37℃で30分間重合化させ、26℃で３回、0.96％グルタルアルデヒドで架橋させて、ニッケル／フォームバーコーティングしたグリッド上に滴下して乾燥させた。イムノゴールドラベルをマウス抗−タウ蛋白及び12mm金粒子が結合した抗−マウスIgEを用いて行い、１％ウラニルアセテートで５分間染色し、蒸留水で洗浄して乾燥させた後、電子顕微鏡で調べた（図12（Ａ）及び図12（Ｂ）参照）。
図12（Ａ）及び図12（Ｂ）はそれぞれ2mM GTP及び４μM TALPの存在下でのタウ蛋白のイムノゴールドラベルを30,000倍に拡大した電子顕微鏡写真である。図12（Ａ）の挿入図は8,000倍に拡大された電子顕微鏡写真を示す。図12（Ａ）及び図12（Ｂ）に示すように、TALPにより安定化された微小管上の金粒子の数は通常の微小管と比較すると有意に減少していることがわかり、これは実施例13で述べたタウ蛋白に対する免疫染色の結果に合致している。
実施例15：ヒト大腸癌HM7細胞株の増殖抑制
TALPによるヒトの癌細胞の多数化抑制効果を調べるため、ヒト大腸癌LSI74Tに由来するHM7細胞株（Kuan S.F.et al.,Cancer Res.,47:5715−5724,1987;Kuan S.F.et al.,J.Biol.Chem.,264:19271−19277,1989参照）を96ウェルのミクロプレート上に10⁴細胞/200μｌの濃度で植え、４日間インキュベートした後、TALPを0.1、0.5、１及び２μＭの濃度で加えたが、この濃度は２μＭ未満の濃度ではTALPがHM7細胞に細胞毒性を示さなかったという実験データから選ばれている。その後さらに４日間インキュベートした後、MTT法で540nmにおける吸光度を測定して細胞数を計算した（図13参照）。
図13に示すように、HM7細胞の多数化に対する抑制率（％）は処理したTALPの濃度によって、それぞれ33.3％、45.8％、52.8％及び55.14％と測定され、ID₅₀は0.83μＭと推定された。従って、TALPは低濃度においてもヒトの癌細胞の増殖を抑制しうることが分かった。
実施例16:In vitro運動性アッセイ
TALPによるHM7細胞株における微小管形成の刺激及び安定化が細胞増殖の抑制をもたらすならば、HM7細胞の運動性も当然低減されると考えられる。そこで、その予想を立証するために、ポアサイズが８μｍで直径6.5mmのポリカーボネートフィルターの付いたトランスウエル細胞培養チャンバーを用いて以下のようにin vitro運動性アッセイを行った（Yoon et al.,BBRC,222:694−699,1996）。
すなわち、トランスウエル細胞培養チャンバーの上方区画に200μｌのHM7細胞懸濁液（2x10⁵細胞/200μｌ）を加え、下方区画には0.01、0.1及び１μＭのTALPとともに800μｌの細胞培養液を加えた。３日間培養した後、フィルターの上方領域に付着した細胞を脱脂綿で取り除き、フィルターをヘマトキシリンで染色してフィルターの下方領域に移動した細胞の数を100倍の顕微鏡下で計測した（図14参照）。図14に示すように、対照群の細胞数は41.33±3.32と測定され、0.01、0.1及び１μM TALPで処理した実験群ではそれぞれ26.13±6.05、21.33±2.5及び4.44±2.07であり、これらは細胞運動性をそれぞれ36.8％、48.4％及び89.3％抑制したことに対応する。
よって、TALPが１μＭ以下の低濃度でも効率よく細胞の運動性を抑制することが明らかになった。このことは、in vitro運動性アッセイは被試験細胞の細胞増殖性と運動性の両方を示すものであるため、TALPが癌転移抑制剤として利用できる可能性を示唆するものである。
実施例17:In vivo転移抑制試験
実施例15及び16で述べたTALPによる細胞増殖及び運動性に対する抑制効果が転移を有意に減少させる結果をもたらすのかどうかを立証するために、ヌードマウスを用いたin vivo試験を行った。
75cm²組織培養フラスコで培養したHM7細胞をトリプシンで数分間処理し、PBSで数回洗浄した後、血清無添加の培養液に10⁷細胞/mlの濃度に懸濁した。この懸濁液100μｌを４週齢のBALB/C/nu/nu無胸腺ヌードマウス（雌）の脾臓に注入し、この脾臓を１分後に切除した。その後、100μｌのTALP（50μg/100μｌ）を１日１回ずつ８日間、すなわち脾臓摘出から７日後まで、腹腔内に注射した。４週間後にマウスを屠殺して肝臓の重量と肝臓への転移が起きた病巣の数を測定した。対照としては、TALPの代わりに100μｌの滅菌食塩水を注射した。
対照群の肝臓重量は平均5.05gと測定され、これはTALP処置群の平均1.388gという値の3.7倍に相当する。また、対照群の病巣の数を測定しTALP処置群では73個であったため82.8％減少したことを意味する。従って、TALPは抗癌剤と抗転移剤の二つのの役割を演じることが分かった。
以上に明確に説明及び立証したように、本発明は新規のタキソール類似蛋白（TALP）、その製造方法、並びに抗癌剤及び抗ウイルス剤としてのその用途を提供する。本発明のTALPはタキソールと同様に、GTPがなくてもチューブリン重合化を促進し、これにより重合化された微小管はCa²⁺や４℃以下の低温によって起きる分解に対して耐性が有り、非常に安定化されている。さらに、本発明のTALPは細胞増殖、剥離したNIH 3T3細胞の再生、HM7ヒト大腸癌細胞の増殖及びin vitroでの運動性、受精したクセノプス卵母細胞の細胞分裂、並びにウイルスによる大腸菌の溶解を抑制する。 Background of the Invention
Technical field
The present invention relates to a novel taxol-like protein ("TALP") and a method for producing the same. More specifically, the present invention relates to a novel protein isolated from human placental tissue and having a taxol-like activity, a method for producing the same, and a novel use thereof as an anticancer agent and an antiviral agent.
Background art
Microtubules are predominantly located in the cytosol and are heterodimeric tubulin subunits, a protein consisting of α-tubulin and β-tubulin, which, when formed, GTP and microtubule-associated proteins (“MAPs”). (Olmsted, JB, 1986, Ann. Rev. Cell Biol., 2: 421-457; Chen, J. et al, 1992, Nature, 360: 674-677; Brandt). , R. and Lee, G., 1993, J. Biol. Chem., 268: 3414-3419; Maekawa, S. et al., 1992, Eur. J. Biochem., 205: 195-200).
Microtubules are the major component of the mitotic spindle that directs the chromosomes arranged on the equatorial plate to bipolar during mitosis, including maintenance of cell shape, motility and attachment, and intracellular trafficking during interphase Plays an essential role in many cellular actions (Shiff, PBand Horwitz, SB, 1981, "Molecular actions and targets in anticancer chemotherapeutics", "Tubulin: a target of chemotherapeutics", pp483-507, Academic Press, NY, USA; Glotz, JSet al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 7026-7030; Rowinsky, EKet al., 1990, Nature, 82: 1247-1259). They are also important in regulating the interaction of growth factors with receptors on the cell surface and the transmembrane proliferation signals induced by these interactions.
On the other hand, vinblastine and vincristine have an anticancer effect by suppressing the formation of microtubules. On the other hand, yew (TaxusTaxol, a type of diterpenoid isolated from a genus plant, has attracted attention as a therapeutic agent for solid cancers, particularly breast cancer and uterine cancer. It promotes microtubule formation and increases microtubule stability, thereby inhibiting microtubule depolymerization, normal dynamic reorganization of the microtubule network, and cell growth, and ultimately anti-microbial activity. Showing cancer activity (Schiff, PB et al., 1979, Nature, 277: 665-667; Schiff, PBand Horwitz, SB, 1981, Biochemistry, 20: 3247-3252; Crossin, KLand Carney, DH, 1981, Cell, 27: 341-350; Wilson, L. et al., 1985, Biochemistry, 24: 5254-5262; Wiernik, PH et al., 1987, Cancer Res., 47: 2486-2493). However, the amount of Taxol isolated therefrom is of course limited due to the limited number of Taxus plants and their slow growth. Furthermore, environmental destruction is a problem by cutting down a large amount of plants required for the production of taxol.
Summary of the Invention
In the present invention, taxol-like protein (TALP) isolated from human placental tissue promotes and stabilizes the formation of microtubules in a manner similar to taxol in vitro, which is the active ingredient of anticancer and antiviral agents. It was found to be available.
Accordingly, a main object of the present invention is to provide a novel taxol-like protein (TALP) isolated from mammalian tissues and having a taxol-like action.
It is another object of the present invention to provide a method for preparing TALP from mammalian tissue.
Another object of the present invention is to provide a novel use of TALP as an active ingredient of anticancer and antiviral agents.
[Brief description of the drawings]
The above and other objects and features of the present invention will be apparent from the following description in conjunction with the accompanying drawings:
FIG. 1 is a photograph showing an SDS-PAGE pattern of TALP isolated from human placental tissue.
FIG. 2A is a photograph showing an SDS-PAGE pattern of a fraction obtained in the process of purifying TALP from human placental tissue.
FIG. 2 (B) is a photograph showing a Western blot analysis corresponding to SDS-PAGE shown in FIG. 2 (A).
FIG. 3 is a graph showing the effect of TALP on microtubule polymerization as compared to GTP and Taxol.
FIG. 4 is a graph showing the effect of TALP on microtubules formed by taxol.
FIG. 5 shows Ca against microtubules formed by GTP, taxol or TALP.²⁺6 is a graph showing the effect of the above.
FIG. 6 is a graph showing the effect of low temperature (4 ° C.) on microtubules formed by GTP, taxol or TALP.
FIG. 7 (A) is a photograph showing SDS-PAGE patterns of the supernatant and the pellet obtained by centrifuging the reaction mixture for microtubule formation in the presence of GTP, taxol or TALP, respectively.
FIG. 7 (B) is a photograph showing SDS-PAGE patterns of the supernatant and the pellet obtained by centrifuging the reaction mixture for microtubule formation in the presence of various concentrations of TALP.
FIG. 8 is a graph showing the effect of TALP on lysis of E. coli by virus.
FIG. 9 is a graph showing the results of wavelength scanning of TALP and BSA (bovine serum albumin).
FIG. 10 (A) shows αβ-tubulin or αβ_S-It is a photograph which shows the SDS-PAGE pattern after co-precipitation in order to investigate the binding of TALP to tubulin.
FIG. 10 (B) shows αβ-tubulin or α_Sβ_S-It is a photograph which shows the SDS-PAGE pattern after co-precipitation in order to investigate the binding of TALP to tubulin.
FIG. 11 (A) is a photograph showing an SDS-PAGE pattern after coprecipitation for examining the binding of tau protein and MAP2 to a tubulin molecule.
FIG. 11 (B) is a photograph showing a Western blot analysis using a monoclonal antibody against tau protein corresponding to SDS-PAGE shown in FIG. 12 (A).
FIG. 11 (C) is a photograph showing a Western blot analysis using a monoclonal antibody against MAP2 corresponding to the SDS-PAGE shown in FIG. 12 (A).
FIG. 12 (A) is an electron micrograph of an immunogold label of tau protein in the presence of GTP.
FIG. 12 (B) is an electron micrograph of an immunogold label of tau protein in the presence of TALP.
FIG. 13 is a graph showing suppression of proliferation of HM7 human colorectal cancer cells by TALP.
FIG. 14 is a graph showing suppression of cell motility of HM7 human colorectal cancer cells by TALP.
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
To separate TALP from mammalian tissues such as human placenta, the tissues were homogenized and centrifuged to obtain supernatant. The supernatant thus obtained was placed on a cation exchange resin column, and the column was washed. Next, the fraction containing TALP was eluted from the column, and then subjected to hydroxyapatite chromatography, whereby TALP of about 35 kDa was finally purified.
MAPs promote tubulin polymerization in the presence of GTP, and the polymerized microtubules²⁺Decomposes at low temperatures of 4 ° C. or less, whereas taxol promotes the polymerization of tubulin without GTP, thereby polymerizing microtubules²⁺And has been reported to be highly stable and resistant to degradation by low temperatures of 4 ° C or less (Schiff, PB et al., 1979, Nature, 277: 665-667; Schiff, PBand Horwitz). , SB, 1981, Biochemistry, 20: 3247-3252; Crossin, KLand Carney, DH, 1981, Cell, 27: 341-350; Wilson, L. et al., 1985, Biochemistry, 24: 5254-5262; Wiernik , PH et al., 1987, Cancer Res., 47: 2486-2493).
In this context, the characterization of TALP purified from mammalian tissues was performed, and TALP promotes the polymerization of tubulin, even in the absence of GTP, like taxol, which polymerized microtubules²⁺It was also found that the polymer was not depolymerized by a low temperature of 4 ° C. or less, and was stabilized much better than the case of taxol. This suggests that the anticancer activity of TALP by suppressing cell proliferation is much higher than that of taxol. Microtubule formation was caused by the direct binding of TALP to microtubules, and this mechanism of action of TALP was found to be similar to that of taxol.
Therefore, ‘TALP 'in the present invention means a protein that promotes the polymerization of tubulin even without GTP or MAPs, and the thus polymerized microtubules are Ca²⁺And resistance to low temperatures of 4 ° C. or lower and very stabilized.
TALP is degraded by trypsin into at least seven fragments, the exact number of which depends on factors such as the specific activity of trypsin, the concentration of TALP, ionic strength, pH, temperature and incubation time.
MAPs, such as tau protein and MAP2, promote tubulin polymerization by binding to the carboxyl-terminal portion of tubulin. In the case of TALP, unlike MAP2, it binds to tubulin competitively with tau protein, which can also be seen in electron micrographs using a tau protein immunogold label. Therefore, since TALP competitively inhibits the binding of tau protein to tubulin, it can be used for the development of a therapeutic agent for Alzheimer's disease.
TALP acts like taxol in vitro. Therefore, in order to examine whether TALP can be used as an anticancer agent such as taxol, regeneration of exfoliated NIH 3T3 cells, growth and motility of HM7 human colorectal cancer cells in vitro, and fertilization of xenops (South Africa) The effect of TALP on the cell division of oocytes of frogs (Xenopus) was investigated. In addition, human colon cancer cells were injected into the spleen of nude mice to examine the effect of TALP on metastasis to the liver. As a result, TALP inhibits cell growth like Taxol, i.e., regeneration of exfoliated NIH 3T3 cells, growth and motility of HM7 human colorectal cancer cells in vitro, and fertilized Xenopus oocyte cells Each was found to suppress division. Similarly, it was revealed that TALP also markedly inhibited HM7 metastasis to the liver. Therefore, the TALP of the present invention can be used as an anticancer agent, an antimetastatic agent, and a therapeutic agent for Alzheimer's disease. In addition, in a lysis experiment of Escherichia coli with a virus, it was found that pretreatment of the virus with TALP did not cause lysis of Escherichia coli, which suggests that the TALP of the present invention can also be used as an antiviral agent. I have.
The following examples illustrate the invention in more detail, but they should not be construed as limiting the scope of the invention. In particular, the present invention extends to all proteins that exhibit the same properties and characteristics as the TALP of the present invention regardless of the source of the protein, and to a 35 kDa protein isolated from human placental tissue described in the following examples. It is not limited.
Example 1: Isolation of TALP from human placental tissue
Human term placenta was washed several times with 0.154 M NaCl solution to completely remove blood. The washed placenta is cut into small pieces, and 250 g of 0.6 M phosphate buffer A (0.6 M potassium phosphate, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, 0.5 μg / ml leupeptin, 10% glycerol, pH 7 .0) and Polytron (Kinemetica^TM, Switzerland) for 2 minutes and left in an ice bath for 1 hour to obtain a crude extract of TALP.
The extract obtained above was filtered through double cheese sloth and centrifuged at 30,000 × g for 30 minutes to obtain a supernatant. This supernatant was loaded on a phosphocellulose column equilibrated with 0.6 M phosphate buffer A. After sufficiently washing the column with the same buffer, TALP was eluted with a linear phosphate gradient of 0.6 M to 1.8 M. From the measurement of TALP activity, it was confirmed that TALP was eluted in a phosphate concentration range of 1.0 M to 1.3 M.
The active fraction containing TALP was collected and dialyzed against a glycerol solution (a 10% glycerol solution containing 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 0.5 mM PMSF and 0.5 μg / ml leupeptin). Then, the mixture was centrifuged, and the supernatant was applied to a hydroxyapatite column equilibrated with 0.35 M phosphate buffer A. After washing the column with the same buffer, TALP was subsequently eluted with a linear gradient of phosphate from 0.35M to 0.55M. From the measurement of TALP activity, it was found that TALP was eluted in the phosphate concentration range of 0.43M to 0.48M.
The active fraction was collected, diluted three-fold with a glycerol solution, and fractionated on a hydroxyapatite column in the same procedure as above. A 12% SDS-PAGE of the eluted fraction showed a single band at an apparent molecular weight of 35 kDa (see FIG. 1).
All purification steps were performed at 4 ° C. or lower, and the TALP activity was measured by visualization of normal tubulin polymerization by turbidity (Gaskin, F. et al., 1974, J. Mol. Biol., 89: 737). -758). Hamel et al. Or Asnes et al. (Hamel E. et al., 1981, Arch. Biochem. Biophys., 209: 29-40; Asnes, CFand Wilson, L., 1979, Anal. Biochem., 98: 64-). 73) The tubulin prepared according to 73) was adjusted to a final concentration of 1 mg / ml with a 0.1 M MES (2- [N-morpholino] ethanesulfonic acid) buffer (1 mMEGTA and 1 mM MgCl2)._TwoAnd 0.1 M MES, pH 6.8), and a solution containing TALP was added so that the final reaction volume was 250 μl. The reaction mixture was incubated at 37 ° C. for 30 minutes and the change in absorbance at 350 nm was monitored with a Gilford Model 2600 spectrophotometer (Gilford, USA).
Example 2: Identification of TALP by Western blot analysis
In order to prepare a polyclonal antibody against TALP, TALP purified in Example 1 was separated by 12% SDS-PAGE, and the protein band corresponding to a molecular weight of 35 kDa was cleaved to obtain the protein. The same amount of Freund's complete adjuvant was added to the obtained protein, mixed well, and separately injected into the subcutaneous and lower limb muscles of a 1.5 kg male rabbit. Thereafter, the same amount of protein was mixed with incomplete adjuvant every month and boosted twice (Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: Laboratory Manuals. In: Immunization, pp53-137, Cold). Spring Harbor Laboratory). Ten days later, antibody production was confirmed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Next, serum was collected from the rabbit and the polyclonal antibody was purified by protein A-Sepharose affinity chromatography. The concentration of the antibody thus purified was 4.0 mg / ml.
To determine the binding specificity of TALP using the polyclonal antibody prepared above, Western blot analysis was performed: a 1.5 mm thick 12% SDS-PAGE gel (Laemmli) was modified by a modified method of Laemmli. 11x16 cm) was prepared (Laemmli U., 1970, Nature, 227: 680-685). Next, the protein solutions, that is, the placenta homogenate, the phosphocellulose chromatography eluate, and the secondary hydroxyapatite chromatography eluate obtained in Example 1, respectively, were subjected to slab gel electrophoresis (Bio-Rad, USA). The gel was subjected to SDS-PAGE analysis at a flow rate of 20 mA per gel thickness (see FIG. 2A). Subsequently, the separated protein was electrically transferred onto a nitrocellulose membrane, and immunostained using the polyclonal antibody against TALP prepared above. As a result, it was found that the 35 kDa protein present in all the samples on SDS-PAGE was strongly detected by the polyclonal antibody, and that the protein of about 32 kDa was weakly detected by the polyclonal antibody (see FIG. 2 (B)). ). In FIG. 2 (A) and FIG. 2 (B), lanes 1, 2 and 3 show a placenta homogenate, a phosphocellulose chromatography eluate, and a secondary hydroxyapatite chromatography eluate, respectively.
Thus, since the polyclonal antibody produced above specifically binds to TALP, it was found that it can be used for the detection and quantification of TALP in tissues and organelles.
Example 3: Effect of TALP on tubulin polymerization
In the same manner as described in Example 1, the effect of GTP, taxol and TALP on tubulin polymerization was examined. As shown in FIG. 3, in the presence of 2 mM GTP (control group), tubulin polymerization occurs in a typical sigmoidal curve showing a lag time of 1-2 minutes; in the presence of 0.5 μM TALP, Tubulin polymerization occurred in a hyperbolic manner at a height 2.5 times higher than that in the presence of 1 μM TALP. These indicate that TALP promotes tubulin polymerization in a dose-dependent manner. In addition, in the presence of 20 μM taxol, tubulin polymerization occurs 2.5 times as compared with the control group, and this activity is equivalent to that of 0.5 μM TALP. This indicates that TALP promotes tubulin polymerization with about 40 times the strength of taxol. Furthermore, it was revealed that TALP promotes tubulin polymerization even in the absence of GTP, similarly to taxol.
Example 4: Effect of TALP on taxol-formed microtubules
To investigate the effect of TALP on microtubules formed by taxol, 10 μM taxol was added to the reaction solution of the polymerization assay described in Example 1. Addition of 0.5 μM TALP to the reaction mixture resulted in tubulin polymerization more than twice as high as that without the addition of TALP (see FIG. 4).
Example 5： Ca in tubulin polymerization²⁺Effect
Ca in tubulin polymerization²⁺To examine the effect of tubulin, tubulin was added to 0.1 M MES buffer (pH 6.8) without EGTA, GTP, taxol or TALP was added, and the microtubules were polymerized at 37 ° C for 15 minutes. Then, add 4mM CaCl to the reaction mixture._TwoWas added, and the depolymerization of microtubules formed by adding GTP, Taxol or TALP was measured (see FIG. 5). As shown in FIG. 5, almost all microtubules formed by 2 mM GTP were depolymerized, and 30% of microtubules formed by 10 μM taxol were depolymerized, whereas microtubules formed by 0.5 μM TALP were It was not depolymerized at all. Therefore, microtubules stabilized by TALP²⁺Has been shown to be resistant to the depolymerization caused by
Example 6: Effect of low temperature (4 ° C) on tubulin polymerization
To examine the effect of low temperature on tubulin polymerization, tubulin was added to 0.1 M MES buffer (pH 6.8). Then, GTP, Taxol or TALP was added to the reaction mixture and the microtubules were polymerized at 37 ° C for 15 minutes. Thereafter, the reaction solution was cooled to 4 ° C., and depolymerization of microtubules formed by adding GTP, taxol or TALP was measured (see FIG. 6). As shown in FIG. 6, 25% and 10% of microtubules formed by 10 μM taxol and 0.5 μM TALP were depolymerized, respectively, but almost all microtubules formed by 2 mM GTP were depolymerized. Thus, microtubules stabilized by TALP were shown to be as resistant to depolymerization caused by low temperatures (4 ° C.) as microtubules stabilized by taxol.
Example 7: Identification of coprecipitation of tubulin and TALP
To determine whether TALP promotes microtubule formation in a manner similar to taxol, tubulin isolated from bovine brain was added at a concentration of 0.4 mg / ml in 0.1 M MES buffer, pH 6.8. . Then, 2 mM GTP, 10 μM taxol or 4 μM TALP was added to the reaction mixture and the microtubules were polymerized at 37 ° C. for 30 minutes. The reaction mixture was centrifuged for 20 minutes, and the obtained supernatant and pellet were analyzed by 12% SDS-PAGE (see FIG. 7A). As shown in FIG. 7 (A), about 20% and almost all tubulin were polymerized in the presence of 10 μM taxol and 4 μM TALP, respectively, but almost all tubulin was polymerized in the presence of 2 mM GTP. Was not done.
Further, tubulin polymerization was examined by changing the concentration of TALP. As a result, microtubule formation increased with increasing TALP concentration (see FIG. 7 (B)), which is consistent with the results in FIG. 7 (A) and 7 (B), S and P indicate a supernatant and a pellet, respectively. As shown in FIGS. 7 (A) and 7 (B), TALP was not present in the supernatant, but was precipitated together with the microtubules. Therefore, it was suggested that TALP promotes microtubule formation by directly binding to microtubules, which is consistent with the action of taxol.
Example 8： Electron microscopy analysis of microtubules
When the polymerization of microtubules is monitored by absorbance measurement as in Example 1, an increase in absorbance can occur not only due to microtubule formation but also due to tubulin aggregation. Then, in order to confirm that the change in turbidity was caused by the formation of microtubules, the morphology of this polymer was examined with an electron microscope. Tubulin was added to a 0.1 M MES buffer at a concentration of 1 mg / ml, and GTP, Taxol or TALP was added to a final reaction volume of 250 μl. The reaction mixture was incubated at 37 ° C. for 30 minutes and the change in absorbance at 350 nm was monitored. At this time, the reaction solution showing an increase in absorbance was fixed, placed on a carbon coating grid, and dried. The grid was then stained with 1% uranyl acetate for 5 minutes, washed with distilled water and dried. Then, it investigated by the acceleration voltage of 75 kv using the electron microscope (Hitachi H-600, Japan). As a result, it was confirmed that typical microtubules were formed in all of the reaction solutions to which GTP, taxol or TALP was added.
From the results of Examples 3 to 8, the TALP of the present invention promotes the polymerization of tubulin even without GTP or MAPs, similar to taxol, and the microtubules thus polymerized are Ca²⁺It was found to be resistant to degradation caused by low temperatures below 4 ° C. and much better stabilized than taxol. This suggests that the anticancer activity of TALP by suppressing cell proliferation as described below is much higher than that of taxol.
Example 9: Inhibition of cell proliferation by TALP
TALP acts like taxol in vitro. Therefore, in order to examine whether taxol can be used as an anticancer agent like Taxol, the effect of TALP on regeneration of exfoliated NIH 3T3 cells and cell division of fertilized Xenopus oocytes was examined.
Example 9-1: Inhibition of regeneration of detached NIH 3T3 cells
The NIH 3T3 cell line (ATCC CRL 6442) was cultured in RPMI 1640 medium to a 95% growth stage. Thereafter, the cells were detached by scraping the culture dish with a sterilized loop, TALP was added to the medium, and the effect of TALP on the regeneration of the detached NIH 3T3 cells was observed. As a result, cells not treated with TALP were regenerated, but cells treated with 1 μM TALP were not regenerated. Therefore, it was found that TALP can be used as an anticancer agent to suppress cell proliferation, similarly to taxol.
Example 9-2: Inhibition of cell division in fertilized Xenopus oocytes
One cell of the fertilized frog egg in the 2 division stage was microinjected with saline or TALP as a control using a microinjector (Drummond Scientific, USA) (Hiramoto, Y., 1962, Exp. Cell. Res., 27: 416-426). At this time, care was taken to adjust the microinjection volume to an error range of less than 0.5%. For a 1.2 nm fertilized egg, the cytosolic volume was assumed to be 450 nl, assuming that yolk platelets occupy half of the total volume, and this was used in calculating the final concentration of the infusion solution.
As a result, the control cells grew rapidly, but the cells injected with TALP did not grow at all. Therefore, it was confirmed that TALP can be used as an anticancer agent to suppress cell proliferation like taxol.
Example 10: Antiviral activity of TALP
To examine the inhibitory effect of TALP on virus growth, albumin, TALP or a mixture of albumin and TALP filtered through a 0.22 μm acro-disc was added to the P4 phage-containing solution, and a Luria medium (100 g of distilled water, 1 g of tryptone, 1 g of yeast extract, 0.5 g of NaCl and 1 g of NaCl, pH 7.5) to a final volume of 100 μl. The reaction mixture was incubated at 37 ° C. for 30 minutes and E. coli C117 was added and mixed well. Thereafter, 4 ml of Luria medium containing 0.7% agarose was added to the mixture, and poured into a plate on which 6 ml of Luria medium containing 1.4% agarose had been fixed in advance. The cells were then cultured overnight at 37 ° C. and the number of lysed plaques was counted (see FIG. 8). As shown in FIG. 8, an average of 58 plaques were found in the control plate with albumin alone; the plates with 25 μg / ml and 50 μg / ml TALP resulted in 30% and 52% plaque reduction, respectively. Plaque was hardly observed on the plate to which 100 μg / ml of TALP was added. The plate to which the mixture of albumin and TALP was added showed the same pattern as the plate treated with TALP alone.
Therefore, it was found that the TALP of the present invention has antiviral activity and can be used as an antiviral agent.
Example 11: TALP wavelength scanning
To investigate the characteristics of TALP. The change in the absorbance of TALP and BSA was measured in the ultraviolet region from 200 nm to 340 nm (see FIG. 9). In FIG. 9, the solid line and the dotted line indicate changes in the absorbance of BSA and TALP, respectively. As shown in FIG. 9, it was found that TALP exhibited a relatively low absorbance at 280 nm as compared with BSA, which suggests that the amino acid composition of TALP is different from other proteins. .
Example 12: Binding of TALP to tubulin cleaved with αβ-tubulin and subtilisin
To determine whether TALP binds to the carboxyl terminus of the tubulin molecule, αβ_S-Tubulin and α_Sβ_S-After preparing tubulin and adding TALP to form microtubules, a coprecipitation assay was performed. Tubulin-free MAPs isolated by phosphocellulose chromatography were added at a concentration of 0.4 mg / ml to 50 mM MES buffer (pH 6.8), taxol was added at a final concentration of 20 μM, and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. . Then, αβ_S-Tubulin and α_Sβ_S-To prepare tubulin, tubulin was cut with 2% (w / w) subtilisin for 30 minutes and 9 hours, respectively, and the proteolytic reaction was stopped by adding PMSF. Subtilisin-cleaved tubulin was polymerized at 37 ° C. for 30 minutes in the presence of 0.4 μM TALP or without TALP, and then centrifuged for 20 minutes. The obtained supernatant and pellet were analyzed by 9% SDS-PAGE (see FIGS. 10 (A) and 10 (B)). In FIG. 10 (A) and FIG. 10 (B), S and P indicate a supernatant and a pellet, respectively. In FIG. 10 (A), lane 1 shows αβ-tubulin polymerization; lane 2 shows αβ_SLane 3 shows αβ-tubulin polymerization in the presence of 0.4 μM TALP; lane 4 shows αβ in the presence of 0.4 μM TALP._S-Shows tubulin polymerization; and lane 5 shows αβ-tubulin and αβ in the presence of 0.4 μM TALP._S-Shows respectively tubulin polymerization. In FIG. 10 (B), lane 1 shows αβ-tubulin polymerization; lane 2 shows αβ-tubulin polymerization._Sβ_SLane 3 shows αβ-tubulin polymerization in the presence of 0.4 μM TALP; lane 4 shows α in the presence of 0.4 μM TALP._Sβ_S-Shows tubulin polymerization; and lane 5 shows αβ-tubulin and α in the presence of 0.4 μM TALP._Sβ_S-Shows respectively tubulin polymerization.
As shown in FIGS. 10 (A) and 10 (B), TALP was found to induce the polymerization of tubulin cleaved with αβ-tubulin and subtilisin. Αβ-tubulin, αβ for the purpose of polymerizing tubulin_S-Tubulin or α_Sβ_S-When TALP was added to the tubulin solution containing tubulin, TALP was precipitated together with αβ-tubulin. This result indicates that the binding affinity of TALP for intact tubulin is stronger than for any of the subtilisin-cleaved tubulins, and that the high-affinity binding site for TALP resides in the carboxyl-terminal domain of the tubulin molecule. Is shown.
Example 13: Competition between tau protein and TALP in tubulin polymerization
It is well known that tau proteins and MAPs that activate microtubule formation bind to the C-terminus of tubulin molecules. As seen in FIGS. 10 (A) and 10 (B), TALP also binds to the C-terminus of the tubulin molecule. In this regard, in order to examine the binding mode of tau protein and MAPs to tubulin when TALP coexists, microtubule formation and coprecipitation using tubulin containing MAPs were sequentially performed.
Tubulin obtained from bovine brain is suspended in 50 mM MES buffer (pH 6.8) to a final concentration of 0.4 mg / ml, and 0.5, 1, 2, or 4 μM TALP is added thereto, and then at 37 ° C. for 30 minutes. And polymerized. After centrifugation for 20 minutes, the resulting pellet was suspended and loaded on a 12% SDS-PAGE gel (see FIG. 11 (A)). The gel of FIG. 11 (A) was transferred to a nitrocellulose membrane and immunostained to detect tau protein and MAP2 (see FIGS. 11 (B) and 11 (C)). In FIGS. 11 (A), 11 (B) and 11 (C), S and P indicate a supernatant and a pellet, respectively.
As shown in FIG. 11 (B), when TALP coexists, the level of tubulin-bound tau protein decreases linearly with increasing TALP concentration, and in the presence of a high concentration of TALP, no tau protein binds at all. Without TALP bound to tubulin instead of tau protein. However, as shown in FIG. 11 (C), in the coexistence of TALP, the level of MAP2 bound to tubulin increased linearly with an increase in the concentration of TALP.
Therefore, it was confirmed that TALP binds to the C-terminal of the tubulin molecule, and that TALP and tau protein competitively bind to the same C-terminal of the tubulin molecule.
Example 14: Competitive binding of tau protein to TALP by electron microscopy
In order to examine the competitive binding of TALP and tau protein to the C-terminal of tubulin, immunogold labeling was performed on tau protein, and examined using a scanning electron microscope (Hitachi H-600, Japan) at an acceleration voltage of 75 kv. 2 mM GTP and 4 μM TALP were added to the reaction mixture containing tubulin and MAPs, respectively. Subsequently, it was polymerized at 37 ° C. for 30 minutes, crosslinked with 0.96% glutaraldehyde three times at 26 ° C., and dropped on a nickel / form bar coated grid and dried. Immunogold labeling was performed using mouse anti-tau protein and anti-mouse IgE conjugated to 12 mm gold particles, stained with 1% uranyl acetate for 5 minutes, washed with distilled water, dried and examined by electron microscopy. (See FIGS. 12A and 12B).
FIGS. 12 (A) and 12 (B) are electron micrographs of the immunogold label of tau protein in the presence of 2 mM GTP and 4 μM TALP, respectively, magnified 30,000 times. The inset of FIG. 12 (A) shows an electron micrograph at 8,000 times magnification. As shown in FIG. 12 (A) and FIG. 12 (B), it was found that the number of gold particles on the microtubules stabilized by TALP was significantly reduced as compared with the normal microtubules. This is consistent with the result of immunostaining for tau protein described in Example 13.
Example 15: Human colon cancer HM7 cell line growth suppression
To examine the effect of TALP on the suppression of human cancer cell multiplication by TALP, HM7 cell line derived from human colon cancer LSI74T (Kuan SF et al., Cancer Res., 47: 5715-5572, 1987; Kuan SFet al., J. Biol. Chem., 264: 19271-19277, 1989) on a 96-well microplate.^FourAfter seeding at a concentration of cells / 200 μl and incubating for 4 days, TALP was added at a concentration of 0.1, 0.5, 1, and 2 μM, but at concentrations below 2 μM TALP was not cytotoxic to HM7 cells. Selected from experimental data. Thereafter, after further incubation for 4 days, the number of cells was calculated by measuring the absorbance at 540 nm by the MTT method (see FIG. 13).
As shown in FIG. 13, the inhibition rate (%) against the multitude of HM7 cells was measured as 33.3%, 45.8%, 52.8% and 55.14%, respectively, depending on the concentration of the treated TALP.₅₀Was estimated to be 0.83 μM. Therefore, it was found that TALP can suppress the growth of human cancer cells even at a low concentration.
Example 16: In vitro motility assay
If stimulation and stabilization of microtubule formation in the HM7 cell line by TALP results in suppression of cell proliferation, it is likely that motility of HM7 cells is naturally reduced. Therefore, in order to confirm the prediction, an in vitro motility assay was performed as follows using a transwell cell culture chamber equipped with a polycarbonate filter having a pore size of 8 μm and a diameter of 6.5 mm (Yoon et al., BBRC). , 222: 694-699, 1996).
That is, 200 μl of HM7 cell suspension (2 × 10 5) was placed in the upper compartment of the transwell cell culture chamber.^FiveCells / 200 μl) and 800 μl of cell culture with 0.01, 0.1 and 1 μM TALP in the lower compartment. After culturing for 3 days, the cells adhering to the upper region of the filter were removed with absorbent cotton, the filter was stained with hematoxylin, and the number of cells that migrated to the lower region of the filter was counted under a microscope of 100 × (see FIG. 14). . As shown in FIG. 14, the number of cells in the control group was measured as 41.33 ± 3.32, and in the experimental group treated with 0.01, 0.1 and 1 μM TALP, they were 26.13 ± 6.05, 21.33 ± 2.5 and 4.44 ± 2.07, respectively. Corresponds to a 36.8%, 48.4% and 89.3% reduction in motility, respectively.
Therefore, it has been clarified that TALP can efficiently suppress cell motility even at a low concentration of 1 μM or less. This suggests that TALP can be used as a cancer metastasis inhibitor because the in vitro motility assay shows both cell proliferation and motility of the test cells.
Example 17: In vivo metastasis suppression test
To demonstrate whether the inhibitory effects of TALP on cell proliferation and motility described in Examples 15 and 16 resulted in significantly reducing metastasis, in vivo studies were performed using nude mice.
75cm^TwoHM7 cells cultured in a tissue culture flask are treated with trypsin for several minutes, washed several times with PBS, and then added to a serum-free culture medium for 10 minutes.⁷The cells were suspended at a concentration of cells / ml. 100 μl of this suspension was injected into the spleen of a 4-week-old BALB / C / nu / nu athymic nude mouse (female), and the spleen was excised one minute later. Thereafter, 100 μl of TALP (50 μg / 100 μl) was injected intraperitoneally once a day for 8 days, ie, up to 7 days after splenectomy. Four weeks later, the mice were sacrificed, and the weight of the liver and the number of foci that had metastasized to the liver were measured. As a control, 100 μl of sterile saline was injected instead of TALP.
Liver weight in the control group was measured on average 5.05 g, which corresponds to 3.7 times the mean value of 1.388 g in the TALP treated group. In addition, the number of lesions in the control group was measured and found to be 73 in the TALP treatment group, which means that the number decreased by 82.8%. Therefore, it was found that TALP plays two roles of an anticancer drug and an antimetastatic drug.
As clearly described and demonstrated above, the present invention provides novel taxol-like proteins (TALPs), methods for their preparation, and their use as anticancer and antiviral agents. The TALP of the present invention, like taxol, promotes tubulin polymerization even without GTP, whereby the polymerized microtubules²⁺And resistant to decomposition caused by low temperatures of 4 ° C. or less, and is very stabilized. In addition, the TALPs of the present invention inhibit cell proliferation, regeneration of exfoliated NIH 3T3 cells, growth and motility of HM7 human colorectal cancer cells, cell division of fertilized Xenopus oocytes, and lysis of E. coli by viruses. Suppress.

Claims

Taxol-like protein (TALP) isolated from human placenta and capable of promoting microtubule formation and having a molecular weight of about 35 kDa determined by SDS-PAGE.

The taxol-like protein (TALP) according to claim 1, wherein the microtubules formed by TALP are resistant to degradation caused by Ca ²⁺ or a low temperature of 4 ° C or lower.

The taxol-like protein (TALP) according to claim 1, which promotes the microtubule formation without GTP or a microtubule-associated protein.

The taxol-like protein (TALP) according to claim 1, which suppresses cell proliferation.

The taxol-like protein (TALP) according to claim 1, which suppresses virus growth.

The taxol-like protein (TALP) according to claim 1, which suppresses cell motility.

The taxol-like protein (TALP) according to claim 1, which suppresses metastasis of cancer cells.

The taxol-like protein (TALP) according to claim 1, which inhibits binding of a tau protein to a tubulin molecule.

(I) a step of homogenizing and centrifuging a mammalian tissue to obtain a supernatant; and (ii) a step of fractionating the supernatant obtained above by cation exchange chromatography and hydroxyapatite chromatography. The method for producing a taxol-like protein (TALP) according to claim 1, which comprises: