JP3561351B2

JP3561351B2 - Sugar analysis method

Info

Publication number: JP3561351B2
Application number: JP28597095A
Authority: JP
Inventors: 和之大石; 一彦嶋田
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1995-11-02
Filing date: 1995-11-02
Publication date: 2004-09-02
Anticipated expiration: 2015-11-02
Also published as: JPH09127090A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は液体クロマトグラフィー法による糖類の分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖類の分析において液体クロマトグラフィー分析は汎用されている分析手法の一つである。この液体クロマトグラフィー分析、例えば、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）分析は、一般に順相分配系液体クロマトグラフィーで行われている。順相分配系液体クロマトグラフィーとは、極性の比較的強い固定相と、固定相に比べて極性の弱い移動相を用いる液体クロマトグラフィーのことであり、固定相用の充填剤としては順相分配液体クロマトグラフィー用充填剤が使用され、例えば、官能基として−ＮＨ_２、−ＣＮ、−ＯＨなどをもつ充填剤が使用される。
【０００３】
この糖類の分析で得られるクロマトグラムにおいて、分析時間を短くすると分離が悪くなるという問題があった。糖類の分析において各ピークの保持時間の短縮、各ピークの分離性等のクロマトグラムを改良したい場合、その方法としては、溶離液種類、測定温度またはカラムサイズの変更など種々あるが、特に充填剤の改良が最も効果的である。しかし、目的にあった充填剤を新たに製造し、それを用いてクロマトグラムを改良することは、他の方法に比べると煩雑であり容易なことではない。
【０００４】
また、液体クロマトグラフィーの分析手法を簡便に改良する一方法として、２種類の充填剤を一本のカラムに充填されてなるカラムを用いた手法が開示されている。例えば、特開平６−２７３４０１号公報には、陽イオン交換基を備えた充填剤と陰イオン交換基を備えた充填剤を一本のカラムに充填し、移動相としてアルカリ性溶液および酸性溶液を用い、これら両溶液を切り替えてカラム内に流通させて各イオン種を別々に溶出させて分析を行う、イオン交換液体クロマトグラフィーによる陽イオンおよび陰イオンの分析方法が開示されているが、これは、カラムを交換することなく両方のイオン種を分析して手法の簡便化を図るものであり、測定対象試料のクロマトグラムの改良はなされていない。また、これは、イオン交換系液体クロマトグラフィーに関するものであり、順相分配系液体クロマトグラフィーではなく、糖類の分析には適用され得ない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、糖類を短時間で分離性良く分析し得る液体クロマトグラフィー法による分析方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の糖類の分析方法（以下、請求項１記載の発明を本発明１という）は、糖類を含有する試料を、順相分配液体クロマトグラフィー用充填剤（Ａ）と、上記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の上記糖類に対するクロマトグラムを改良し得る充填剤（Ｂ）とが一本のカラムに充填されてなる液体クロマトグラフィー用カラムに導入し、液体クロマトグラフィー分析を行うことを特徴とする。
【０００７】
本発明１でいうクロマトグラムの改良とは、例えば、各ピークの保持時間の短縮、各ピークの分離性、ピークのシャープさなどを言う。
【０００８】
本発明１で使用される充填剤（Ａ）は、糖類の分離に主に作用する充填剤であり、順相分配液体クロマトグラフィー用充填剤に限定される。
【０００９】
上記充填剤（Ａ）としては、順相分配液体クロマトグラフィー用充填剤であれば特に制限はなく、公知のいずれもが使用可能である。順相分配液体クロマトグラフィー用充填剤とは、前述の順相分配系液体クロマトグラフィーに使用される充填剤のことであり、例えば、官能基として−ＮＨ_２、−ＣＮ、−ＯＨなどをもつ充填剤である。上記充填剤（Ａ）の骨格の素材としても、特に限定されず、有機系、無機系のいずれも使用可能であり、有機系のものとしては、合成系、天然系のいずれでもよい。上記合成系の素材としては、例えば、アクリル系、スチレン系の高分子が挙げられ、上記天然系の素材としては、例えば、セルロース系、キトサン系、ポリアミノ酸などが挙げられ、更に無機系のものとしては、例えば、シリカ、ジルコニア等が挙げられる。
【００１０】
本発明１で使用される充填剤（Ｂ）は、上記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の糖類に対するクロマトグラムを改良し得る充填剤に限定される。上記充填剤（Ｂ）の選択範囲としては、具体的には、順相分配液体クロマトグラフィー用充填剤が挙げられる。また、上記充填剤（Ｂ）の骨格の素材としても、特に限定されず、例えば、前述の充填剤（Ａ）の骨格の素材として例示したものが例示される。また、充填剤（Ｂ）は、２種以上混合されて使用されてもよい。
【００１１】
充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の組合せとしては、上記充填剤（Ｂ）が順相分配液体クロマトグラフィー用充填剤である場合としては、ＮＨ₂基をもつシリカ系素材からなる充填剤とＮＨ₂基をもつポリマー系素材からなる充填剤の組合せが挙げられる。

【００１３】
充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の使用量の比率は、用いる充填剤の種類により異なるが、通常、充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）の合計量中の充填剤（Ｂ）の含有量は、５０重量％以下が好ましい。
【００１４】
本発明１で用いられるカラムは、従来から液体クロマトグラフィー用カラムとして用いられているものであれば、特に制限されないが、直径１〜２０ｍｍ、長さ２０〜５００ｍｍのステンレス管が好ましい。
【００１５】
本発明１で用いられる液体クロマトグラフィー用カラムを製造するには、一本のカラムに充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）を充填すればよい。充填順序としては、充填剤（Ａ）及び充填剤（Ｂ）を混合してから充填してもよいし、別々に充填（この場合は充填剤が多層状態でカラム内に存在することになる）してもよい。また、充填方法としては湿式充填法が好ましい。具体的には、分析に使用する溶離液等に、カラムサイズに見合った量の充填剤を分散させてパッカーに移し、パッカーの入口側にポンプ、出口側にカラムを接続し、定流量又は定圧送液して充填する方法が挙げられる。
【００１６】
本発明１で分析される糖類を含有する試料としては、糖を含む化合物を含有する試料であれば特に限定されず、糖を含む化合物としては、例えば、単糖類、２〜２０糖類のオリゴ糖類、糖アルコール類などが挙げられる。
【００１７】
本発明１の糖類の分析方法は、分析に使用するカラムとして、上述の液体クロマトグラフィー用カラムを使用することの他は、従来の液体クロマトグラフィー法による糖類の分析方法と同様である。以下、本発明１の糖類の分析方法について詳述する。
【００１８】
図１は、上述の液体クロマトグラフィー用カラムを使用して糖類の分析をする際の装置の構成の一例である。液体クロマトグラフィー用カラム１に移動相２を送液ポンプ３により供給しながら、サンプラー４から糖類を含有する試料を導入する。液体クロマトグラフィー用カラム１によって分離された試料は、検出器５よって検出され、その結果が記録計６に記録される。なお、糖類を含有する試料に必要に応じて公知の前処理が施されてもよい。
【００１９】
上記移動相としては、順相分配モードにおける公知の溶離液が用いられる。例えば、水系では、無機酸（リン酸など）、有機酸（クエン酸など）および／またはこれらの塩よりなる緩衝液などが用いられる。また、有機溶媒系では、例えば、メタノール、エタノール、アセトニトリルなどが用いられる。また、特に、水と有機溶媒の混合系が好ましく用いられる。移動相の通液する速度（流速）は、一般に０．５〜５ｍｌ／ｍｉｎ程度が選ばれる。
【００２０】
上記の分離については、公知の方法が採用され、適当濃度の移動相により試料が分離溶出される。また、クロマトグラムの改良ため、分析途中で溶離液濃度や流速等を変えることもできる。また、液体クロマトグラフィー用カラム等を恒温槽内に設置することもできる。
【００２１】
上記の検出についても公知の技術が用いられ、例えば、紫外可視分光光度計、示差屈折計などが好適に使用される。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例を説明する。
実施例における分析装置は、前記図１のように構成して行った。なお、各装置は、以下のものを使用した。
送液ポンプ３：島津製作所社製、ＬＣ−９Ａ。
サンプラー４：オートサンプラー。積水化学工業社製、ＡＳＵ−４２０。
検出器５：示差屈折計。昭和電工社製、ＲＩＳＥ−５１。
【００２３】
実施例において使用した充填剤は、以下の通りである。
充填剤順相−１
市販の順相分配液体クロマトグラフィー用充填剤（μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ−ＮＨ_２、Ｗａｔｅｒｓ社製）。骨格の素材として、シリカが使用され、官能基として−ＮＨ_２を有している。
【００２４】
充填剤順相−２
以下のように、特開平３−１８８９４２号公報の方法により順相分配液体クロマトグラフィー用充填剤を製造した。
アリルアミン（和光純薬社製）２４ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ及びｔ−ブチルパーオキシネオデカノエート（重合開始剤、和光純薬社製）１．５ｇを混合・溶解し、２０００ｍｌの４重量％ポリビニルアルコール（日本合成社製）水溶液に添加した。これに、リン酸７８ｇを添加し、その後、窒素置換下で攪拌しながら５０℃で２４時間重合し、生成物を熱水、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液及びアセトンで順次、洗浄し、乾燥した。得られた粒子を空気分級機（日鉄鉱業社製）で分級して６〜８μｍの粒子を集め、これを充填剤順相−２とした。充填剤順相−２は、官能基として−ＮＨ_２を有する。
【００２７】
（実施例１、比較例１）
（１）液体クロマトグラフィー用カラムの製造
表１に示した充填剤（Ａ）と充填剤（Ｂ）を、表１に示した使用量（ｇ）で３０ｍｌの５０重量％メタノール水溶液に分散した（比較例１は、充填剤（Ａ）のみ使用）。内径６ｍｍ、長さ５０ｍｍのステンレス製カラムを接続したパッカー（容量３０ｍｌ：梅谷精機社製）に上記分散液を加え、送液ポンプ（島津製作所社製、ＬＣ−６ＡＤ）をパッカーに接続して、定圧充填を行ってカラムを製造した。
【００２８】
【表１】

【００２９】
（２）糖類の分離
上記装置に上記液体クロマトグラフィー用カラムを取りつけた装置で、糖類を含有する試料として糖類標品（フルクトース、グルコース、シュクロース、マルトース及びラクトースを含有）を水に溶解したものを分析した。溶出には、アセトニトリル８容と水２容の混合溶液を使用し、流速は２．０ｍｌ／ｍｉｎとした。実施例１で得られたクロマトグラムを図２に、比較例１で得られたクロマトグラムを図３に示した。なお、図２及び３における各ピークは、１０フルクトース、１１グルコース、１２シュクロース、１３マルトース、１４ラクトースである
【００３０】
【発明の効果】
本発明１の糖類の分析方法の構成は上記の通りであり、糖類のクロマトグラムの改良がなされ得、糖類を短時間で分離性良く分析し得る。また、本発明１の糖類の分析方法に使用される液体クロマトグラフィー用カラムは、順相分配液体クロマトグラフィー用充填剤（Ａ）と、上記充填剤（Ａ）とは異なり、かつ上記充填剤（Ａ）の上記糖類に対するクロマトグラムを改良し得る充填剤（Ｂ）とが一本のカラムに充填されてなる液体クロマトグラフィー用カラムであり、その製造が容易である。従って、本発明１の糖類の分析方法は、簡便な方法でより正確に糖類を分析できる方法である。
【００３１】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の糖類の分析を行う際の装置の構成の一例である。
【図２】実施例１のクロマトグラムである。
【図３】比較例１のクロマトグラムである。
【符号の説明】
１液体クロマトグラフィー用カラム
２移動相
３送液ポンプ
４サンプラー
５検出器
６記録計[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for analyzing saccharides by liquid chromatography.
[0002]
[Prior art]
In the analysis of saccharides, liquid chromatography analysis is one of widely used analytical methods. This liquid chromatography analysis, for example, HPLC (high performance liquid chromatography) analysis is generally performed by normal-phase partition liquid chromatography. Normal-phase partitioning liquid chromatography refers to liquid chromatography that uses a relatively strong stationary phase and a mobile phase that is less polar than the stationary phase. used fillers for liquid chromatography, for example, _-NH 2 as a functional group, -CN, fillers having a like -OH is used.
[0003]
In the chromatogram obtained by analyzing this saccharide, there is a problem that if the analysis time is shortened, the separation becomes poor. In the analysis of saccharides, when it is desired to shorten the retention time of each peak or to improve the chromatogram such as the resolution of each peak, there are various methods, such as changing the type of eluent, measurement temperature or column size. Is most effective. However, it is cumbersome and not easy to improve the chromatogram by newly producing a filler suitable for the purpose and using it.
[0004]
Further, as one method for simply improving the analysis method of liquid chromatography, a method using a column in which two types of fillers are packed in one column is disclosed. For example, JP-A-6-273401 discloses that a column having a cation exchange group and a column having an anion exchange group are packed in one column, and an alkaline solution and an acidic solution are used as a mobile phase. A method for analyzing cations and anions by ion-exchange liquid chromatography, in which both these solutions are switched and circulated through a column to separately elute and analyze each ionic species, is disclosed. The technique is intended to simplify both methods by analyzing both ion species without replacing the column, and the chromatogram of the sample to be measured has not been improved. This also relates to ion-exchange liquid chromatography, not normal-phase partition liquid chromatography, and cannot be applied to the analysis of saccharides.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide an analysis method by a liquid chromatography method capable of analyzing a saccharide in a short time with good separability.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
In the method for analyzing saccharides according to claim 1 (hereinafter, the invention according to claim 1 is referred to as the present invention 1), a saccharide-containing sample is prepared by using a filler (A) for normal-phase partition liquid chromatography and the filler A filler (B) different from (A) and capable of improving the chromatogram of the above-mentioned filler (A) with respect to the above-mentioned saccharide is introduced into a column for liquid chromatography, which is packed in one column, and It is characterized by performing a chromatographic analysis.
[0007]
The improvement of the chromatogram in the present invention 1 means, for example, shortening of retention time of each peak, separation of each peak, sharpness of the peak, and the like.
[0008]
The filler (A) used in the present invention 1 is a filler mainly acting on separation of saccharides, and is limited to a filler for normal-phase partition liquid chromatography.
[0009]
The filler (A) is not particularly limited as long as it is a filler for normal-phase partition liquid chromatography, and any known filler can be used. The normal phase distribution packing material for liquid chromatography is that the filler used in normal phase distribution based liquid chromatography described above, for example, -NH 2 as a functional group, _-CN, filled with like -OH Agent. The material of the skeleton of the filler (A) is not particularly limited, and any of an organic type and an inorganic type can be used, and the organic type may be a synthetic type or a natural type. Examples of the synthetic material include acrylic and styrene polymers, and examples of the natural material include cellulose, chitosan, and polyamino acids, and inorganic materials. Examples thereof include silica, zirconia and the like.
[0010]
The filler (B) used in the present invention 1 is different from the filler (A) and is limited to the filler capable of improving the chromatogram of the filler (A) with respect to saccharides. The selection of the filler (B), in concrete terms, include normal phase distribution packing material for liquid chromatography. In addition, the material of the skeleton of the filler (B) is not particularly limited, and examples thereof include those exemplified as the material of the skeleton of the filler (A) described above. The filler (B) may be used as a mixture of two or more kinds.
[0011]
As a combination of filler (A) and the filler (B), as if the filler (B) is a normal phase distribution packing material for liquid chromatography is composed of silica-based material having a N H ₂ group filling And a filler composed of a polymer material having an NH ₂ group.

[0013]
The ratio of the amount of the filler (A) to the amount of the filler (B) used depends on the type of the filler used, but usually the filler (B) in the total amount of the filler (A) and the filler (B) is used. Is preferably 50% by weight or less.
[0014]
The column used in the present invention 1 is not particularly limited as long as it has been conventionally used as a column for liquid chromatography, but a stainless steel tube having a diameter of 1 to 20 mm and a length of 20 to 500 mm is preferable.
[0015]
In order to manufacture the column for liquid chromatography used in the first aspect of the present invention, one column may be filled with the filler (A) and the filler (B). As the filling order, the filler (A) and the filler (B) may be mixed and then charged, or may be charged separately (in this case, the filler is present in the column in a multilayer state). May be. As a filling method, a wet filling method is preferable. Specifically, an amount of the filler corresponding to the column size is dispersed in the eluent used for analysis and transferred to the packer.A pump is connected to the inlet of the packer, and a column is connected to the outlet, and a constant flow or constant A method of filling the solution by pressure feeding is given.
[0016]
The sample containing a saccharide analyzed in the present invention 1 is not particularly limited as long as it is a sample containing a compound containing a saccharide. Examples of the compound containing a saccharide include monosaccharides, oligosaccharides of 2 to 20 saccharides, and the like. And sugar alcohols.
[0017]
The method for analyzing saccharides of the present invention 1 is the same as the conventional method for analyzing saccharides by liquid chromatography, except that the above-mentioned column for liquid chromatography is used as a column for analysis. Hereinafter, the method for analyzing a saccharide of the present invention 1 will be described in detail.
[0018]
FIG. 1 shows an example of the configuration of an apparatus for analyzing saccharides using the above-described liquid chromatography column. While supplying the mobile phase 2 to the liquid chromatography column 1 by the liquid sending pump 3, a sample containing a saccharide is introduced from the sampler 4. The sample separated by the liquid chromatography column 1 is detected by the detector 5, and the result is recorded in the recorder 6. In addition, a known pretreatment may be applied to the sample containing a saccharide as necessary.
[0019]
As the mobile phase, a known eluent in a normal phase distribution mode is used. For example, in an aqueous system, a buffer solution composed of an inorganic acid (such as phosphoric acid), an organic acid (such as citric acid) and / or a salt thereof is used. Further, in the organic solvent system, for example, methanol, ethanol, acetonitrile and the like are used. In particular, a mixed system of water and an organic solvent is preferably used. The flow rate (flow rate) of the mobile phase is generally selected to be about 0.5 to 5 ml / min.
[0020]
For the above separation, a known method is adopted, and the sample is separated and eluted with a mobile phase having an appropriate concentration. In order to improve the chromatogram, the eluent concentration and the flow rate can be changed during the analysis. Further, a column for liquid chromatography or the like can be installed in the thermostat.
[0021]
Known techniques are also used for the above detection, and for example, an ultraviolet-visible spectrophotometer, a differential refractometer, and the like are preferably used.
[0022]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, examples of the present invention will be described.
The analyzer in the embodiment was configured as shown in FIG. In addition, each apparatus used the following.
Liquid sending pump 3: LC-9A, manufactured by Shimadzu Corporation.
Sampler 4: Auto sampler. ASU-420 manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.
Detector 5: Differential refractometer. RISE-51, manufactured by Showa Denko KK
[0023]
The fillers used in the examples are as follows.
Filler Normal phase-1
Commercially available packing material for normal-phase partition liquid chromatography (μBondasphere-NH ₂ , manufactured by Waters). As a scaffold material, silica is used, and a -NH ₂ as a functional group.
[0024]
Filler Normal phase-2
A packing material for normal-phase partition liquid chromatography was produced by the method described in JP-A-3-188942 as follows.
24 g of allylamine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 400 g of triethylene glycol dimethacrylate (manufactured by Shin-Nakamura Chemical Co., Ltd.) and 1.5 g of t-butyl peroxyneodecanoate (polymerization initiator, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) It was dissolved and added to 2000 ml of a 4% by weight aqueous solution of polyvinyl alcohol (manufactured by Nippon Gosei). To this, 78 g of phosphoric acid was added, and then polymerized at 50 ° C. for 24 hours while stirring under nitrogen substitution, and the product was washed with hot water, 0.1N aqueous sodium hydroxide solution and acetone in that order, and dried. . The obtained particles were classified by an air classifier (manufactured by Nippon Steel Mining Co., Ltd.) to collect particles having a size of 6 to 8 μm, which was designated as filler normal phase-2. Fillers normal phase-2 has a -NH ₂ as a functional group.
[0027]
(Example 1 , Comparative Example 1)
(1) Preparation of Liquid Chromatography Column The filler (A) and the filler (B) shown in Table 1 were dispersed in 30 ml of a 50% by weight aqueous methanol solution in the used amount (g) shown in Table 1 ( Comparative Example 1 uses only the filler (A)). The above dispersion was added to a packer (capacity: 30 ml, manufactured by Umeda Seiki Co., Ltd.) connected to a stainless steel column having an inner diameter of 6 mm and a length of 50 mm, and a liquid feed pump (manufactured by Shimadzu Corporation, LC-6AD) was connected to the packer. The column was manufactured by constant pressure packing.
[0028]
[Table 1]

[0029]
(2) Separation of saccharides An apparatus in which the above-mentioned liquid chromatography column is attached to the above apparatus, and a saccharide sample (containing fructose, glucose, sucrose, maltose and lactose) dissolved in water as a saccharide-containing sample. Was analyzed. For elution, a mixed solution of 8 volumes of acetonitrile and 2 volumes of water was used, and the flow rate was 2.0 ml / min. FIG. 2 shows the chromatogram obtained in Example 1, and FIG. 3 shows the chromatogram obtained in Comparative Example 1 . Contact name each peak in Figures 2 and 3, 10 fructose, 11 glucose, 12 sucrose, 13 maltose, 14 Lactose [0030]
【The invention's effect】
The configuration of the saccharide analysis method of the present invention 1 is as described above, the chromatogram of the saccharide can be improved, and the saccharide can be analyzed in a short time with good separability. Further, the column for liquid chromatography used in the method for analyzing saccharides of the present invention 1 is different from the packing material (A) for normal phase partitioning liquid chromatography and the packing material (A) and is different from the packing material (A). A column for liquid chromatography in which the filler (B) capable of improving the chromatogram for the above saccharide of A) is packed in one column, and its production is easy. Therefore, the saccharide analysis method of the present invention 1 is a method that can more accurately analyze saccharides by a simple method.
[0031]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an example of the configuration of an apparatus for analyzing a saccharide according to the present invention.
FIG. 2 is a chromatogram of Example 1.
FIG. 3 is a chromatogram of Comparative Example 1.
[Explanation of symbols]
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Column for liquid chromatography 2 Mobile phase 3 Liquid sending pump 4 Sampler 5 Detector 6 Recorder

Claims

A sample containing a saccharide is subjected to a normal phase partitioning liquid chromatography filler (A) and a normal phase which is different from the filler (A) and can improve the chromatogram of the filler (A) with respect to the saccharide. This is a method for analyzing saccharides in which a filler for distribution liquid chromatography (B) is introduced into a column for liquid chromatography in which the filler (B) is packed in one column, and liquid chromatography is performed. (B) a combination of analysis method saccharide which is a combination of fillers consisting of a polymer-based material with fillers and NH ₂ groups of silica based material with N H ₂ group.