JP3555691B2 - Hyaluronan binding protein and antibody from human synovial fluid - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒト関節液由来ヒアルロナン結合性タンパク質、該タンパク質とヒアルロナンとの複合体、該タンパク質に対する抗体、該タンパク質の測定法、関節炎の診断方法および関節炎の診断用キットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
関節液は、身体各所の関節の関節包内にあって関節軟骨と関節軟骨との間を満たしており、関節の円滑な運動性を保ち、運動時に加わる衝撃を緩和する機能を有している。そしてこれらの機能は、実際には関節液内に豊富に含まれているヒアルロナン（ヒアルロン酸）の働きに負うところが大である。正常人の関節液中のヒアルロナンはほぼ単独で存在しているが、変形性関節炎やリウマチ性関節炎などの炎症性疾患患部関節液中のヒアルロナンには、数種類のタンパク質が結合していることが知られている。関節液の組成は、ヒアルロナンの豊富なことを除けば基本的には血漿成分と同じであり、ヒアルロナンは滑膜細胞により関節液中に放出される。関節に炎症が生じると患部血管の浸透性が変化して、ハプトグロビンやα１−プロテアーゼインヒビターなどのいわゆる急性期の炎症性タンパク質が関節液内に浸透する。これらのタンパク質がヒアルロナンと結合するという報告においては、抗体との反応性において、ハプトグロビン、α２−プロテアーゼインヒビター、インターαトリプシンインヒビター、の３種類が検出された。これらのタンパク質のヒアルロナンとの結合が特異的なものであるかどうかは明らかにされていない。関節液中のヒアルロナンが、その還元末端のアルデヒド基とタンパク質のアミノ基との間でシッフ塩基を形成して結合し、アマドリ転移によって安定な結合を形成する、という、非特異的な結合様式で、アルブミンやトランスフェリンと複合体を形成するという報告もある。
一方、米田らはウシ血清中からヒアルロナン結合性タンパク質を単離し、これが従来知られていない性質を有することを見いだし、血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質（Ｓｅｒｕｍ Ｄｒｉｖｅｄ Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＳＨＡＰ）と命名した（Ｙｏｎｅｄａ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．，（１９９０），Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２６５，（９），５２４７−５２５７）。
しかし、従来ヒトの関節炎患者の関節液からヒアルロナンに結合性を有するタンパク質が精製単離されたことは報告されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、関節炎患者の関節液に存在するヒト関節液由来ヒアルロナン結合性タンパク質およびこれに対する抗体を提供することである。
また、本発明の目的は、ヒト関節液に存在するヒト関節液由来ヒアルロナン結合性タンパク質を、この抗体を使用して測定して関節炎を検出する方法を提供することである。
さらに、本発明の目的は、この関節炎の診断に用いる診断用キットを提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒトの関節炎患者の関節液中にヒアルロナン結合性タンパク質が豊富に存在することを見出し、この物質を精製単離し、その物性を明らかにした。また、関節炎の罹患部位におけるヒアルロナン−タンパク質相互作用の重要性を探る上で、本発明のヒアルロナン結合性タンパク質は、新たなプローブとなる可能性を持ち、関節液中のこの物質を測定することが、上記の関節炎、すなわち変形性膝関節炎とリウマチ性膝関節炎とを鑑別する上で有用な手段となり得ることを見出した。
【０００５】
すなわち、本発明は、変形性膝関節炎またはリウマチ性膝関節炎のヒト患者の膝関節液中においてヒアルロナンと結合して存在しており、これらの膝関節液から分離され、かつ下記理化学的性質を有するヒト関節液由来ヒアルロナン結合性タンパク質：
（Ａ）分子量：
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動上で非還元状態において約８５キロダルトン（Ｘバンド）と約８３キロダルトン（Ｙバンド）の二本の主バンドを形成する、
（Ｂ）部分タンパク質一次構造：
▲１▼ ＸバンドのプロテアーゼＶ８処理によって得られるペプチドフラグメントの一次構造は次のとおり；
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｐｒｏ
▲２▼ ＹバンドのプロテアーゼＶ８処理によって得られるペプチドフラグメントは次のとおり；
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｘａａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｐｒｏ
（式中、Ｘａａは未同定アミノ酸を示す）である。
（Ｃ）等電点： 約 ６．０〜７．０ （ＤＥＡＥ−セルロファインＡ８００ に対する結合のｐＨ依存性からの推定値）。
また、本発明は上記ヒト関節液由来ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロナンとの複合体である。
【０００６】
さらに、本発明は前記のヒト関節液由来ヒアルロナン結合性タンパク質、そのＸバンド成分、Ｙバンド成分、それらのペプチドフラグメント、または該ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロナンの複合体をヒト以外の哺乳動物に免疫し、該動物の体液から採取することができ、または該動物の抗体産生細胞によって産生され、該ヒアルロナン結合性タンパク質、そのＸバンド成分およびＹバンド成分の１または２以上と交差反応を示す抗体である。
また、本発明は上記の抗体を用いることを特徴とするヒト関節液由来ヒアルロナン結合性タンパク質を測定する方法である。
さらに、本発明は上記抗体を用いてヒト関節から採取された関節液中のヒアルロナン結合性タンパク質含量を測定して関節炎を検出する方法である。
さらにまた、本発明は固相に結合されたプロテオグリカン由来のヒアルロナン結合タンパク質（プロテオグリカンのヒアルロナン結合部位；ＨＡＢＲ）と、上記の抗体と、標識物質を結合した、または結合し得る抗イムノグロブリン抗体とから本質的に構成される関節炎の診断用キットである。
以下本発明を詳細に説明する。
【０００７】
本明細書において、アミノ酸、ペプチドはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略記法により表示され、例えば下記の略号が使用される。なお、アミノ酸などに関し光学異性体が有り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
Ａｌａ：アラニン
Ａｒｇ：アルギニン
Ａｓｎ：アスパラギン
Ａｓｐ：アスパラギン酸
Ｇｌｎ：グルタミン
Ｇｌｕ：グルタミン酸
Ｇｌｙ：グリシン
Ｈｉｓ：ヒスチジン
Ｉｌｅ：イソロイシン
Ｌｅｕ：ロイシン
Ｌｙｓ：リジン
Ｍｅｔ：メチオニン
Ｐｈｅ：フェニルアラニン
Ｐｒｏ：プロリン
Ｓｅｒ：セリン
Ｔｈｙ：スレニオン
Ｔｙｒ：チロシン
Ｖａｌ：バリン
【０００８】
本発明のヒアルロナン結合性タンパク質は、ヒトの変形性膝関節炎またはリウマチ性膝関節炎患者の膝関節液中において多量に発見されたものである。この物質の精製は以下の方法で行うことができる。
すなわち、上記関節炎患者のヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロナンとの複合体を含有する関節液を採取し、これに低濃度のタンパク質変性剤（例えば、０．４ Ｍ程度のグアニジン塩酸塩）を加えてタンパク質とヒアルロナンとが会合した状態（非解離条件下）で超遠心（アソシエイティブ超遠心）を行う。次に、このヒアルロナンを多く含むフラクションに、より高濃度のタンパク質変性剤（例えば、４Ｍ程度のグアニジン塩酸塩）を加えてタンパク質解離条件下で超遠心（ディソシエイティブ超遠心）し、ヒアルロナンを多く含むフラクションを採取する。このタンパク質変性剤としてはグアニジン塩酸塩、尿素等が用いられる。
ヒアルロナンを多く含むフラクションを、脱塩し、７５％エタノール飽和とすることによって沈澱物を得る。この沈澱物は、ヒアルロナンとヒアルロナン結合性タンパク質との複合体である。この複合体は、タンパク質解離条件下でも解離しない。
【０００９】
次に、この複合体をヒアルロナンを基質として分解することができるムコ多糖類分解酵素で分解し、必要に応じて透析処理、分子ふるい処理（ゲル濾過、限外濾過等） 、電気泳動処理などを行ってヒアルロナン結合性タンパク質を精製単離する。ヒアルロナンを基質として分解することができるムコ多糖類分解酵素としては、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼなどが用いられる。
【００１０】
本発明の抗体を作成するには、ヒト関節液由来ヒアルロナン結合性タンパク質、そのサブユニットと考えられるＸバンド成分もしくはＹバンド成分、これらを酵素的もしくは化学的に分解して得られるペプチドフラグメント、またはヒアルロナンと上記タンパク質との複合体を抗原（免疫原）として用い、これをヒト以外の動物（好ましくは哺乳動物）に投与することによって該動物を免疫し、該動物の体内に産生された抗体をその体液（血液等）から得ることができる（例えば、抗血清として）。また、免疫された動物の抗体産生細胞（脾細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞など）を採取し、これを使用してモノクローナル抗体を得ることもできる。
【００１１】
具体的には、上記抗原をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の適当な溶媒に溶解し、通常これにアジュバント（フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、アルミニウムアジュバント、百日咳菌アジュバントなど）を混合し、ヒト以外の動物（好ましくは哺乳動物）、例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ニワトリ、アヒル等（好ましくは、ウサギ、ラット、マウス、ヤギ）のリンパ節、皮下、皮内、静脈内または腹腔内等に投与する。初回投与後、１〜５週間に一度、１〜５回程度同様に追加免疫を行うと上記抗原（免疫原）に対する抗体が免疫感作された動物の体内に産生される。抗原をコートしたマイクロプレートを用いる免疫測定（ＥＬＩＳＡ等）によって血液等の抗体価を調べ、抗体価が上昇した後に血液等を採取する。血液から抗血清を分離するには、採血した血液を放置後、遠心分離する方法によることができる。このような抗血清をさらに精製する必要があるときは、溶解度差を利用した選択的分別法（硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等の中性塩による塩析、低温アルコール沈澱など）、電荷の差を利用した分別法（等電点沈澱、電気泳動、イオン交換クロマトグラフィーなど）、抗体、イムノグロブリンとの特異的親和性の差を利用する分別方法（プロテインＡ等によるアフィニティークロマトグラフィーなど）、担体への吸着係数の差を利用する方法（ハイドロキシアパタイト吸着体等による吸着クロマトグラフィーなど）、分子量の差を利用する分別法（ゲル濾過法、超遠心法など）など、抗血清の精製法として通常用いられる方法を適宜組み合わせて分離精製を行うことができる。
【００１２】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は前記抗体産生細胞を公知の方法（ハイブリドーマ法；Ｇ． Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｅｕｒ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６， ５１１−５１９（１９７６）；Ｎａｔｕｒｅ， ２５６， ４９５−４９７（１９７５）；Ｍ．Ｓｈｕｌｍａｎ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ， ２７６， ２６９−２７０（１９７８）；「単クローン抗体−ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ−」，（株）講談社，１９８３年２月２０日発行など参照）によって長期間増殖可能にし、該細胞を培養することによって培地中に産生、蓄積させることができる。また、ハイブリドーマを、主要組織適合性が一致する動物、例えばＢＡＬＢ／ｃマウスなどに、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を予め投与した後、その腹腔内に投与し、腹水腫瘍を形成させて腹水中に抗体を蓄積させることもできる。このように産生されたモノクローナル抗体は上記抗血清と同様の方法により精製することができる。
【００１３】
以上のごとく調製された本発明の抗体は、ヒト関節液由来ヒアルロナン結合性タンパク質、そのＸバンド成分およびＹバンド成分の１または２以上と交差反応を示すものであり、ヒトの関節炎が変形性関節炎かリウマチ性関節炎であるかの鑑別診断、あるいは関節炎治療の予後の診断等に使用することができる。なお、本発明の抗体は、以上の抗原特異性を有するものである限り、免疫動物、製法等は限定されず、ポリクローナル抗体（抗血清など）およびモノクローナル抗体を包含する。また、このような抗体をパパイン、ペプシン、トリプシンなどのプロテアーゼで限定分解して得られたフラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２ 、Ｆａｂ’、Ｆａｂなど）であって本発明の抗体の特徴を保持するものは本発明の抗体に包含される。
【００１４】
この診断に用いる検出法は、関節炎患者の関節から関節液を採取し、そのなかに含有されるヒアルロナン結合性タンパク質複合体を定量し、その量によって多い場合にはリウマチ性関節炎（ＲＡ）、少ない場合には変形性関節炎（ＯＡ）と鑑別することができる検出法である。この定量方法としては公知の免疫測定法、ドットブロット法（ウエスタンブロット法）等が用いられる。
【００１５】
本発明に使用される公知の免疫測定（イムノアッセイ）としては、上記の本発明の抗体を使用してヒト関節液由来ヒアルロナン結合性を定量的または定性的に測定できる方法であれば限定されない。
すなわち、沈降反応や凝集反応を光学的に検出する免疫比濁法（ＴｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ゲルを支持体として用いて抗原と抗体を拡散させ、沈降線または沈降輪を形成させる免疫拡散法（Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、担体上に抗原を吸着させ、これと抗体を反応させ、さらにこの抗体を抗イムノグロブリン抗体、プロテインＡなどを用いて二次的に検出するウエスタンブロット法（ドットブロット法）、または分別検出の容易な物質で標識した抗原または抗体を用いる標識化免疫測定法（Ｌａｂｅｌｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）の何れの測定系も本発明の測定法に適用できる。より具体的には、免疫比濁法としては、本発明の抗体を結合したポリスチレン微粒子（ラテックス）、赤血球などを担体粒子として使用する凝集反応法などが例示され；免疫拡散法としては、本発明の抗体の担体として寒天ゲル、アガロースゲル、セルロースアセテート膜、デキストランゲルなどを使用するオクタロニー拡散法、ウーダン拡散法などが例示され；ウエスタンブロット法（ドットブロット法）としては、ニトロセルロース膜またはポリビニリデンフルオライド膜に抗原を吸着させ、本発明の抗体を抗原と反応させ、次いで酵素標識抗イムノグロブリン抗体（例、パーオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体）または放射性同位元素標識プロテインＡで本発明の抗体を検出する方法が例示され；標識化免疫測定法としては、酵素を標識物質として使用するエンザイムイムノアッセイ（酵素免疫測定法，ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ））；放射性同位元素を標識物質として使用するラジオイムノアッセイ（放射線免疫測定法，ＲＩＡ）、蛍光物質を標識物質として使用する蛍光イムノアッセイ（蛍光免疫測定法）などが例示される。
【００１６】
これらの測定法は、公知の方法［入江 實編、「続ラジオイムノアッセイ」、（株）講談社、１９７９年５月１日発行；石川栄治ら編、「酵素免疫測定法」、第２版、（株）医学書院、１９８２年１２月１５日発行；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．９２， （１９８３）， Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐａｒｔ Ｅ： Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，アカデミックプレス社発行 参照］に準じて実施される。
【００１７】
なお、標識化免疫測定法による場合、本発明の抗体または抗イムノグロブリン抗体を、酵素（パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなど）、放射性同位元素（１２５ Ｉ、１３１ Ｉ、３ Ｈなど）、蛍光物質（フルオレセインイソチオシアネート、ウンベリフェロンなど）、化学発光物質（ルミノールなど）などの標識物質で直接標識するか、または他の物質（ビオチン−アビジン（もしくはストレプトアビジン）系、抗免疫グロブリン抗体など）を介して間接的にこれらの標識物質で標識して測定に供する。
抗原抗体反応後、検体中の抗原と結合した抗体（サンドイッチ結合物を含む）と、未結合の遊離の状態の抗体との分離（ＢＦ分離）が必要な場合、液相法（二次抗体、ポリエチレングリコール、デキストラン炭末などを使用する）または固相法（固相化した測定対照物質に結合性を有するタンパク質、抗体を使用する）のいずれの方法によってもよいが、固相法が好適である。
【００１８】
本発明の免疫測定法としては、特に以下の方法が簡便であり、好ましい。すなわち、プロテオグリカン由来のヒアルロナン結合タンパク質（ＨＡＢＲ）を固相に固定化し、このＨＡＢＲと、測定試料中に存在するヒアルロナンとヒアルロナン結合性タンパク質との複合体とを反応させて、該複合体をそのヒアルロナン部分を介して固相上に捕捉し、捕捉された該複合体と本発明の抗体とを抗原抗体反応によって結合させ、固相上に捕捉された該複合体に特異的に結合した抗体を公知の方法で検出、測定する方法である。抗体を検出、測定する方法としては、抗体として前記のような標識物質を予め結合させた本発明の抗体を用いて標識物質を測定する方法；未標識の抗体を上記免疫反応に使用し、複合体と結合した抗体を、標識物質を結合した抗イムノグロブリン抗体と反応させて標識物質を測定する方法；あるいは未標識の抗体を上記免疫反応に使用し、複合体と結合した抗体を、ビオチン等の物質を結合した抗イムノグロブリン抗体とを反応させ、さらにビオチン等の物質と特異的に反応するアビジン（またはストレプトアビジン）と標識物質との結合物を反応させて標識物質を測定する方法などが挙げられる。
なお、上記固相としては試験管、ビーズ、マイクロプレート、濾紙、ラテックスなどが使用され、固相にＨＡＢＲ、抗体などを固定化する方法としては、物理的吸着法、共有結合法、包括法など固定化酵素の調製法として一般的な方法［「固定化酵素」、１９７５年３月２０日、（株）講談社発行、第９〜７５頁参照］を応用して行うことができる。特に物理的吸着法は簡便な点で好ましい。なお、ＨＡＢＲ、抗体等が結合していない部分を血清アルブミン、ゼラチンなどによってブロッキングすることが好ましい。
【００１９】
また、前記ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロナンとの複合体の定量には、本発明の関節炎診断用キットを用いることができる。このような関節炎診断用キットとしては、例えば、固相に結合されたプロテオグリカン由来のヒアルロナン結合タンパク質、前記した抗体、及び標識物質を結合した、または結合し得る抗イムノグロブリン抗体（好ましくは、抗ＩｇＧ抗体）とから本質的に構成される関節炎診断用キットが用いられる。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明の具体的実施例を説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。
実施例１
ヒアルロナン結合性タンパク質の調製
１）関節液からのヒアルロナン−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体の精製
リウマチ性膝関節炎患者の関節液を採取し、軽く遠心分離して不溶物を取り除き、ハンクス液によって５〜６倍に希釈した。これに１／１０体積の４Ｍグアニジン塩酸塩溶液を加え、アジ化ナトリウムを微量加えた後、塩化セシウムを加えて５０％（ｗ／ｖ）とした。超遠心チューブに入れて４℃に静置後、４℃、１２３，０００ ×ｇ の超遠心を４８時間行った（タンパク質非解離条件での超遠心；アソシエイティブ超遠心）。超遠心後、チューブの底から１０等分に分割したフラクションをとり、その各々の比重とヒアルロナンおよびタンパク質濃度とを測定し、図１にその結果を示した。
【００２１】
図１において実線はローリー（Ｌｏｗｒｙ） 法によって定量した各フラクションのタンパク質濃度（単位：ｍｇ／ｍｌ）を表し、破線は放線菌ヒアルロニダーゼを用いる方法により定量したヒアルロナン濃度（単位：μｇ／ｍｌ）を表している。比重の小さい画分（比重 １．３０ 前後） に集まっているヒアルロナンは、関節の炎症に伴い、低分子化したヒアルロナン断片と考えられる。比重 １．４３ 以上のフラクションに全体比３０％以上のヒアルロナンが存在し、９３％以上のタンパク質成分はそれ以下の比重の画分に分布していた。
【００２２】
ヒアルロナンを多く含む比重 １．４３ 以上の画分を集め、更にグアニジン塩酸塩を加えて、最終のグアニジン塩酸塩濃度を４Ｍとした。これを再度超遠心にかけ（タンパク質解離条件下での超遠心；ディソシエイティブ超遠心）、１０等分のフラクションに分割して、比重とヒアルロナンおよびタンパク質濃度とを測った結果を図２に示した。
図２において、実線、破線はそれぞれタンパク質濃度（単位：ｍｇ／ｍｌ）、ヒアルロナン濃度（単位：μｇ／ｍｌ） を表している。
【００２３】
ヒアルロナンは比重１．４５〜１．４６を中心として分布し、比重約 １．４〜１．５ の範囲に全体比６０％以上のヒアルロナンが集中していたので、この範囲のフラクションを集めた。このフラクションを脱塩し、７５％エタノール沈澱によって沈澱物を得た。この沈澱物はヒアルロナンとヒアルロナン結合性タンパク質との複合体（ＨＡ−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体）であり、ここに含まれるタンパク質量は元々の関節液に含まれていた量の約０．０３％であった。この画分を放線菌由来のヒアルロニダーゼで処理したところ、下記（３）に示すドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ；１１％）電気泳動において分子量約８５，０００ダルトンと約８３，０００ダルトンの２本のバンド（それぞれＸバンドおよびＹバンド）を示した（図３参照）。
【００２４】
図のマーカーは、ファルマシア社製、標準分子量キットの電気泳動図である。分子量の９４，０００ダルトンはホスホリラーゼｂ、６７，０００ダルトンはウシ血清アルブミン、４３，０００ダルトンは卵白アルブミン、３０，０００ダルトンはカーボニックアンヒドラーゼ、２０，１００ダルトンは大豆トリプシンインヒビター、１４，４００ダルトンはα−ラクトアルブミンをそれぞれ示す。
レーン３は、精製されたＨＡ−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体にヒアルロニダーゼを加えて加温し、その後加熱処理を含む調製法によって電気泳動サンプルとしたものである。レーン２は、複合体に酵素を加えずに、その他はレーン３のサンプルと同様の処理を行って調製した電気泳動サンプルである。レーン１は複合体に酵素を加えず、一切の加温、加熱もせずに調製した電気泳動サンプルである。
レーン１でもレーン２でも、染色バンドは出現せず、レーン３にのみ２本のバンドが出現した。従ってレーン３で現れたバンドは、酵素処理時の加温や電気泳動サンプル調製時の加熱によって生成された物質ではなく、ＨＡ−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体のヒアルロナンがヒアルロニダーゼによって消化されることにより遊離したタンパク質を表していることがわかった。
【００２５】
２）ヒアルロナン−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体からのヒアルロナン結合性タンパク質の分離法
ＨＡ−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体を適当な緩衝液中に溶解し、コンドロイチナーゼＡＢＣをホルミル−セルロファイン（商品名，チッソ（株）製，生化学工業株式会社販売）に固定化した担体を充填したカラムにアプライしてヒアルロナンを消化した後、消化物を透析してヒアルロナン分解物を除き、ヒアルロナン結合性タンパク質単独溶液を得た。
【００２６】
３）ヒアルロナン特異的定量法
試料溶液（１００μｌ 〜 ３００μｌ）に、 １．３％の酢酸カリウムを含む９５％エタノールを３倍体積加えて攪拌し、氷温で３０分静置後、１５，０００ ｒ．ｐ．ｍで３０分間遠心し、上澄みを除いた。得られた沈澱に５０ｍＭ酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を加えて溶かし、放線菌由来ヒアルロニダーゼ ２．５〜５．０ ＴＲＵ（濁度減少ユニット）を加え、５０℃で３０分消化した。消化後、１００ ℃で３分間加熱して酵素反応を止め、φ０．２２μｍのフィルターで遠心濾過した。濾液をポストカラム反応式糖質検出ＨＰＬＣシステム（東ソー（株））にアプライすることによってヒアルロナン分解物を定量した。定量には、鶏冠由来ヒアルロン酸ナトリウムを同緩衝液に溶解し、試料と同時に酵素処理したものをスタンダードとして用いた。
【００２７】
４）分子量測定法
Ｓｅｇｒｅｓｔ らの方法〔Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｇｙ， ２８−Ｂ 巻， ５４−６３ 頁（１９７２）〕に従い、トリス／グリシン／ＳＤＳ（ｐＨ８．３）でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに１０μｌの試料を付与し、電気泳動を行った。試料には、ＨＡ−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体をヒアルロニダーゼで処理してヒアルロナンを除いたものを用いた。染色をクーマシー・ブリリアント・ブルーＲ−２５０ で行い、標準分子量キット（ファルマシア社製）の同電気泳動における泳動度に基づき、分子量を観察した。その結果を図３に示す。
前述したように、本発明のヒアルロナン結合性タンパク質は約８５，０００ダルトン（Ｘバンド）と約８３，０００ダルトン（Ｙバンド）との二本のバンドを示し、それらはいずれもヒアルロニダーゼ処理しなかった試料には見られず、ヒアルロニダーゼとは異なる位置のバンドであった。また、この結果は試料を還元処理しても、しなくても同じであった。
【００２８】
５）等電点の測定
本発明のＨＡ−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体のヒアルロナンを酵素（ヒアルロニダーゼ）消化してヒアルロナン結合性タンパク質単独とした場合、陰イオン交換体カラム（ＤＥＡＥ−セルロファインＡ８００ ：チッソ（株）製，生化学工業株式会社販売）に対して、ｐＨ７．０ ではすべて結合し、ｐＨ６．０ では結合するものとしないものとがおおよそ同じ割合であった。この現象より、当該タンパク質の等電点は約ｐＨ６．０ から７．０ の間、特に約ｐＨ ６．０〜６．５ であると判断した。
【００２９】
６）部分的アミノ酸一次構造の決定
本発明のヒアルロナン結合性タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にてＸバンドとＹバンドとに分け、そのそれぞれを既知の方法に従ってプロテアーゼＶ８で処理し、得られたペプチドフラグメントの内から、Ｘバンドから１種類、Ｙバンドから１種類のペプチドを選んで、アプライド・バイオシステムズ社製のアミノ酸配列決定器を用い、固相法によってアミノ末端からのアミノ酸配列を決定した。それぞれのペプチドのアミノ末端からのアミノ酸配列は下記の通りであった。
【００３０】
▲１▼ ＸバンドのプロテアーゼＶ８処理によって得られるペプチドフラグメントの一次構造。
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｐｒｏ
▲２▼ ＹバンドのプロテアーゼＶ８処理によって得られるペプチドフラグメントの一次構造。
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｘａａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｐｒｏ
（Ｘａａは未同定アミノ酸を示す）
なお、プロテアーゼＶ８ （Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｖ８）は、スタフィロコッカス・アウレウスＶ８（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｖ８）から調製された酵素で、リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）中で、アスパラギン酸またはグルタミン酸のカルボキシル基末端側を切断するエンドプロティナーゼ（至適ｐＨ４．０ と７．８）である〔製造元 ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）。
【００３１】
実施例２
ヒト関節液ヒアルロナン結合性タンパク質に対する抗体の作成
実施例１に従って得られたＨＡ−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体を、５０ｍＭ酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解して放線菌由来のヒアルロニダーゼで消化後、消化物を実施例１ ４）と同様にしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ヒアルロナン結合性タンパク質のＸバンド成分とＹバンド成分を抽出した。これらそれぞれを抗原として含む ０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を同体積のフロイント完全アジュバントと混合し、ウサギ膝嵩リンパ節に注射した。その後２週間おきに２回５０μｌ の ＰＢＳを同体積のフロイント不完全アジュバントに混合し、同じ部位に注射した。毎週ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ） によって抗体価を調べ、２回目のブーストの２週間後に採血し、２種類の抗血清を得た。この抗血清を抗体として用いた。得られた抗体はＸ成分とＹ成分どちらを抗原としたものでもＸ成分とＹ成分の双方に同程度に反応した。また、これらの抗体は、ウシ血清やマウス血清においても、その中に含まれる本発明のヒアルロナン結合性タンパク質に相当する成分と反応した。
なお、ＨＡ−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体を抗原とした場合も、同様の抗原特異性を有する抗体が得られる。
【００３２】
実施例３
関節炎患者関節液中のヒアルロナン結合性タンパク質の免疫測定
（１）変形性関節炎患者関節液とリウマチ性関節炎患者関節液とに含まれるヒアルロナン結合性タンパク質量の、ドットブロットによる比較
変形性膝関節炎（以下ＯＡと略す）患者（３例）、およびリウマチ性膝関節炎（以下ＲＡと略す）患者（３例）ついて、以下のドットブロット法によって本発明のヒアルロナン結合性タンパク質を測定した。なお、各患者関節液は名古屋大学医学部整形外科の岩田教授より提供された。
【００３３】
各患者関節液を２０ｍＭリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）で希釈し、ニトロセルロース膜またはポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に５μｌ ずつスポッティングした。この膜を１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中でに浸し、３７℃で２時間ブロッキングした。その後実施例２で調製した抗ヒアルロナン結合性タンパク質抗体を含むＰＢＳ中にて室温で１時間反応させ、よく洗浄した後、パーオキシダーゼ結合抗ＩｇＧ抗体で同じく室温で１時間反応させ、膜に結合したパーオキシダーゼを、過酸化水素とジアミノベンチジンとによって発色させた。その結果を図４に示す。図４は発色強度を模式的に示したものであり、図中、●は濃く発色、○は明確に識別できる程度に発色、△は薄く見える程度に発色、∴は殆ど見えない程度に発色したことをそれぞれ示している。
【００３４】
その結果、ＲＡ患者の関節液中のヒアルロナン結合性タンパク質の濃度はＯＡ患者の関節液中よりも明らかに高く、試料の希釈倍率から判断して、数倍から数十倍の差があった。
【００３５】
（２）変形性関節炎患者関節液とリウマチ性関節炎患者関節液とに含まれるヒアルロナン−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体量の、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）による比較
実施例３（１）のドットブロッティングでそのヒアルロナン結合性タンパク質濃度に差がみられたＯＡ関節液とＲＡ関節液各２例について、ＥＬＩＳＡにより、ヒアルロナンと結合しているヒアルロナン結合性タンパク質（ＨＡ−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体）の量を比較した。
【００３６】
（Ａ）プロテオグリカン由来のヒアルロナン結合タンパク質の精製
市販のウシ鼻軟骨プロテオグリカンモノマーより、既知の方法（Ｔｅｎｇｌａｄ， Ａ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， ５７８， Ｐ２８１，１９７９）及び特開昭６４−４６９号公報記載の方法に従ってヒアルロナン結合タンパク質（プロテオグリカンのヒアルロナン結合部位； 以下ＨＡＢＲと略す）を精製した。
すなわち、牛の鼻中隔軟骨 ３００ｇをハサミで小片に切断し、これを予め４℃に保持されたグアニジン塩酸塩４Ｍを含む酢酸ナトリウム ０．５Ｍ溶液（ｐＨ５．８）に投入して４℃に保持して一夜撹拌抽出した。抽出液を１３，０００Ｘｇで２０分間遠心分離し、上清液を採取した。この上清液を精製水に透析させ、凍結乾燥させ、得られる固形分を粉砕して粗抽出物粉末を得た。
【００３７】
得られた粗抽出物粉末１６００ｍｇと、トリプシン（シグマ社製）０．８ｍｇ とを、酢酸ナトリウム ０．１Ｍを含んだ ０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．３）２５ｍｌに加え、３７℃で２時間保存した。次いで大豆由来トリプシン阻害剤１ｍｇ（シグマ社製）及びグアニジン塩酸塩１９．１ｇを加えた後、さらに ０．１Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えて総量を５０ｍｌとした。
このようにして得られたトリプシン処理したＨＡＢＲ含有溶液５０ｍｌにヒアルロン酸結合セファローズ５０ｍｌを加えて混合し、直ちに透析膜の中に入れ、４℃に冷却し９倍量の精製水中で一夜透析させた。透析後、ゲル全量を内径 ３．２ ｃｍ のカラムに充填し、１Ｍの食塩水溶液で洗浄し、未吸着分を除去した。
【００３８】
さらに１Ｍ〜３Ｍの食塩水溶液で順次洗浄し不要な蛋白を除去し、前記塩酸グアニジン塩酸塩４Ｍを含む０．５ Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．８）で吸着分を溶出させ回収した。
この回収液をＤＩＡＦＬＯ ＰＭ−１０（アミコン社製）で濃縮し、全量を４ｍｌとし、セファロース６Ｂカラム（φ ３．１×４３ｃｍ）を通過させ、第２及び第３ピークを示す成分を回収し、それぞれをＤＩＡＦＬＯ ＰＭ−１０で分離濃縮してＨＡＢＲの精製標品を得た。
【００３９】
（Ｂ）ＥＬＩＳＡ
（Ａ）で調製したＨＡＢＲをｐＨ７．２ の２０ｍＭ ＰＢＳに ５μｇ／ｍｌの濃度に溶解し、この溶液を９６穴マイクロプレートに １００μｌ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩静置してコーティングした。プレートを洗浄後、１％ウシ血清アルブミン／ＰＢＳ溶液を ２００μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で２時間インキュベートしてブロッキングした。試料の関節液（ＯＡ患者およびＲＡ患者関節液各２例）はＰＢＳでそれぞれのヒアルロナン濃度を合わせて希釈列を作成し、ブロッキング後のプレートに １００μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で１時間インキュベートを行った。プレートを洗浄後、実施例２で調製した抗ヒアルロナン結合性タンパク質抗体（Ｘバンド成分を抗原としたもの）（約１μｇ／ｍｌ）を １００μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で１時間インキュベートし、更にパーオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ抗体（ジャクソン社製，生化学工業株式会社販売；市販原液を１／５０００に希釈したもの）を １００μｌ／ウェルずつ分注して３７℃で１時間インキュベートした。プレートをよく洗浄し、マイクロプレートに結合したパーオキシダーゼをオルトフェニレンジアミンと過酸化水素で発色させ、プレートリーダーで４９０ｎｍ における吸光度を比色した。ＲＡおよびＯＡ患者関節液について結果をそれぞれ図５及び図６に示す。各図中、実線と点線は、各疾患の異なる２患者の関節液を示す。図５はＲＡ関節液の場合であり、図６はＯＡ関節液である。ＯＡ関節液はＲＡ関節液よりもヒアルロナン濃度が１０倍高くなっている。
その結果、ＯＡ関節液中のＨＡ−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体の量は、ＲＡ関節液中よりもはるかに少なく、１／５０以下であった。
【００４０】
【発明の効果】
１）現在、リウマチの診断は、医師の所見や患者の自覚が頼りとされる部分が大きく、客観的、定量的診断法が切に求められている。現在用いられている診断法として最も一般的なものは、アメリカリウマチ協会の１１項目からなる診断基準であり、そのうち何項目を満たすかによってリウマチかそうでないかの診断が行われている。ところが、それに含まれている項目は、上述のように医師や患者の主観に基づくものや、リウマチ因子のように、肝疾患や癌患者など他の疾病でも検出されるもの、あるいは健常人でも検出されるものが含まれている。絶対的な客観的、定量的診断法というものを確立することはたいへん困難と思われるが、何通りかの客観的、定量的な診断手法の組み合わせにより、ＲＡかＯＡかの診断をより確実かつ罹患早期に行うことは、そうした困難を解決するための重要なステップであると考えられる。
本発明のヒアルロナン結合性タンパク質に対する抗体を用いた免疫測定（イムノアッセイ）によって、ＯＡとＲＡとの区別を明確に行うことができる。この測定系を診断試薬へ応用することにより、従来の診断法に新たな視点からの客観的かつ定量的な診断基準を供与することができる。
２）ヒアルロナン結合性タンパク質の合成を抑制する物質、あるいは体液中のヒアルロナン結合性タンパク質をスカベンジする物質をスクリーニングすることにより、新たな治療薬の開発できることが予測される。
【００４１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１によるアソシエイティブ超遠心分離した各フラクションの比重とヒアルロナン及びタンパク質濃度との関係を示す。
【符号の説明】
─── タンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）
……… ヒアルロナン濃度（μｇ／ｍｌ）
【図２】実施例１のアソシエイティブ超遠心分離した比重１．４３以上の画分をさらにディソシエイティブ超遠心した各フラクションの比重とヒアルロナン及びタンパク質濃度との関係を示す。
【符号の説明】
─── タンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）
……… ヒアルロナン濃度 （μｇ／ｍｌ）
【図３】実施例１のヒアルロナン−ヒアルロナン結合性タンパク質複合体の放線菌由来ヒアルロニダーゼによる処理物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図を示す。
【符号の説明】
レーン１ ヒアルロニダーゼ処理せず、加熱処理もしなかった試料
レーン２ ヒアルロニダーゼ処理せず、加熱処理をした試料
レーン３ ヒアルロニダーゼ処理を行った試料
【図４】実施例３のリウマチ性関節炎（ＲＡ１〜ＲＡ３）と変形性関節炎（ＯＡ１〜ＯＡ３）各３人の患者の関節液の、抗ヒアルロナン結合性タンパク質抗体を用いたドットプロットによるヒアルロナン結合性タンパク質濃度の比較模式図を示す。
【符号の説明】
●、○、△、∴は発色強度を示す。●＞○＞△＞∴である。
【図５】実施例３のリウマチ性膝関節炎の関節液のヒアルロナン濃度とパーオキシダーゼ発色の吸光度（４９０ｍｍ）との関係を示す。
【符号の説明】
─── 患者Ａ
……… 患者Ｂ
【図６】
実施例３の変形性膝関節炎の関節液のヒアルロナン濃度とパーオキシダーゼ発色の吸光度（４９０ｍｍ）との関係を示す。
【符号の説明】
─── 患者Ｃ
……… 患者Ｄ[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to a human synovial fluid-derived hyaluronan-binding protein, a complex of the protein and hyaluronan, an antibody against the protein, a method for measuring the protein, a method for diagnosing arthritis, and a kit for diagnosing arthritis.
[0002]
[Prior art]
Synovial fluid is present in the joint capsules of the joints in various parts of the body and fills the space between the articular cartilage and the joint cartilage, and has a function to maintain smooth joint motility and reduce shock applied during exercise. . These functions largely depend on the action of hyaluronan (hyaluronic acid) which is abundantly contained in synovial fluid. Hyaluronan in the synovial fluid of normal humans exists almost alone, but it is known that several proteins are bound to hyaluronan in the synovial fluid of affected inflammatory diseases such as osteoarthritis and rheumatoid arthritis. Have been. The composition of the synovial fluid is basically the same as the plasma component except that it is rich in hyaluronan, and hyaluronan is released into synovial fluid by synovial cells. When inflammation occurs in the joint, the permeability of the affected blood vessel changes, and so-called acute-phase inflammatory proteins such as haptoglobin and α1-protease inhibitor penetrate into the synovial fluid. In reports that these proteins bind to hyaluronan, three types of haptoglobin, α2-protease inhibitor, and inter-α-trypsin inhibitor were detected in reactivity with antibodies. It is not clear whether the binding of these proteins to hyaluronan is specific. Hyaluronan in synovial fluid forms a Schiff base between the aldehyde group at its reducing end and the amino group of the protein and binds, forming a stable bond by Amadori transfer, in a non-specific binding mode. There is also a report that forms a complex with albumin and transferrin.
On the other hand, Yoneda et al. Isolated a hyaluronan-binding protein from bovine serum and found that it had a previously unknown property and named it serum-derived hyaluronan-associated protein (SHAP) (Yoneda). , M. et al., (1990), J. Biol. Chem., 265, (9), 5247-5257).
However, it has not been reported that a protein having a binding property to hyaluronan was isolated and purified from synovial fluid of a human arthritis patient.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a human synovial fluid-derived hyaluronan-binding protein present in the synovial fluid of an arthritis patient and an antibody thereto.
Also, an object of the present invention is to measure arthritis by measuring a human synovial fluid-derived hyaluronan-binding protein present in human synovial fluid using this antibody. detection Is to provide a way to
It is a further object of the present invention to provide a diagnostic kit for use in diagnosing this arthritis.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have found that there is abundant hyaluronan-binding protein in the synovial fluid of human arthritis patients, purified and isolated this substance, and clarified its physical properties. Further, in exploring the importance of the hyaluronan-protein interaction in the affected area of arthritis, the hyaluronan-binding protein of the present invention has a possibility of becoming a new probe, and it is necessary to measure this substance in synovial fluid. It has been found that this can be a useful means for distinguishing the above-mentioned arthritis, that is, knee osteoarthritis from rheumatoid arthritis.
[0005]
That is, the present invention is present in the knee joint fluid of human patients with osteoarthritis or rheumatic knee arthritis in combination with hyaluronan, is separated from these knee joint fluids, and has the following physicochemical properties: Hyaluronan binding protein from human synovial fluid:
(A) Molecular weight:
Forming two main bands of about 85 kilodaltons (X band) and about 83 kilodaltons (Y band) in a non-reducing state on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis;
(B) Primary structure of partial protein:
{Circle around (1)} The primary structure of the peptide fragment obtained by treating the X band with protease V8 is as follows:
Val Asp Gln Val Thr Leu Tyr Ser Tyr Lys Val Gln Ser Thr Ile Thr Ser Arg Met Ala Thr Thr Phys GlnsAl LysValGinSer LynsValAsV
{Circle around (2)} The peptide fragments obtained by treating the Y band with protease V8 are as follows:
Ile Val Ile Lys Val Lys Pro Lys Gln Leu Val His His Phe Glu Ile Asp Val Asp Ile Phe Glu Pro Gln Gly Ile SerA La Lys Ala Lua La Lys Aux
Wherein Xaa represents an unidentified amino acid.
(C) Isoelectric point: about 6.0-7.0 (estimated from pH dependence of binding to DEAE-Cellulofine A800).
Further, the present invention is a complex of the above-mentioned human synovial fluid-derived hyaluronan-binding protein and hyaluronan.
[0006]
Further, the present invention provides a method for immunizing a non-human mammal with the aforementioned human synovial fluid-derived hyaluronan-binding protein, its X band component, Y band component, peptide fragment thereof, or a complex of the hyaluronan binding protein and hyaluronan. An antibody that can be collected from a body fluid of the animal or that is produced by an antibody-producing cell of the animal and that cross-reacts with the hyaluronan binding protein, one or more of its X and Y band components. .
The present invention also provides a method for measuring a human synovial fluid-derived hyaluronan-binding protein using the above-mentioned antibody.
Furthermore, the present invention measures arthritis by measuring the content of hyaluronan-binding protein in synovial fluid collected from human joints using the above antibody. detection How to
Furthermore, the present invention relates to a proteoglycan-derived hyaluronan-binding protein (proteoglycan hyaluronan-binding site; HABR) bound to a solid phase, the above-mentioned antibody, and a labeled substance bound or capable of binding an anti-immunoglobulin antibody. A diagnostic kit for arthritis consisting essentially of:
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0007]
In the present specification, amino acids and peptides are indicated by an abbreviation adopted by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Committee (CBN). For example, the following abbreviations are used. In addition, when there is an optical isomer with respect to an amino acid or the like, the L-form is indicated unless otherwise specified.
Ala: Alanine
Arg: Arginine
Asn: Asparagine
Asp: Aspartic acid
Gln: Glutamine
Glu: glutamic acid
Gly: glycine
His: histidine
Ile: Isoleucine
Leu: Leucine
Lys: lysine
Met: methionine
Phe: phenylalanine
Pro: Proline
Ser: Serine
Thy: Surenion
Tyr: Tyrosine
Val: Valine
[0008]
The hyaluronan-binding protein of the present invention has been found in large amounts in the knee joint fluid of human knee osteoarthritis or rheumatic knee arthritis patients. This substance can be purified by the following method.
That is, a synovial fluid containing a complex of a hyaluronan-binding protein and hyaluronan from the above arthritis patient is collected, and a low-density protein denaturant (for example, about 0.4 M guanidine hydrochloride) is added to the protein. Ultracentrifugation (associative ultracentrifugation) is performed in a state where the and hyaluronan are associated (under non-dissociation conditions). Next, to the fraction containing a large amount of hyaluronan, a higher concentration of a protein denaturing agent (for example, guanidine hydrochloride of about 4 M) is added, and ultracentrifugation (disociative ultracentrifugation) is performed under protein dissociation conditions to increase the amount of hyaluronan. Collect fractions containing. Guanidine hydrochloride, urea and the like are used as the protein denaturant.
The hyaluronan-rich fraction is desalted and the precipitate is obtained by 75% ethanol saturation. This precipitate is a complex of hyaluronan and a hyaluronan binding protein. This complex does not dissociate under protein dissociation conditions.
[0009]
Next, this complex is decomposed with a mucopolysaccharide degrading enzyme that can be decomposed using hyaluronan as a substrate, and dialysis treatment, molecular sieving treatment (gel filtration, ultrafiltration, etc.), electrophoresis treatment, etc. are performed as necessary. The hyaluronan binding protein is purified and isolated. As the mucopolysaccharide-degrading enzyme that can be decomposed using hyaluronan as a substrate, hyaluronidase, chondroitinase, and the like are used.
[0010]
To prepare the antibody of the present invention, a human synovial fluid-derived hyaluronan-binding protein, an X band component or a Y band component considered to be a subunit thereof, a peptide fragment obtained by enzymatically or chemically decomposing these, or A complex of hyaluronan and the above protein is used as an antigen (immunogen) and administered to an animal other than a human (preferably a mammal) to immunize the animal, and an antibody produced in the body of the animal is immunized. It can be obtained from the body fluid (such as blood) (eg, as an antiserum). In addition, antibody-producing cells (spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells, and the like) of the immunized animal can be collected and used to obtain a monoclonal antibody.
[0011]
Specifically, the above antigen is dissolved in a suitable solvent such as phosphate buffered saline (PBS), and adjuvants (complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, aluminum adjuvant, B. pertussis adjuvant, etc.) are usually mixed therewith. And non-human animals (preferably mammals), such as rabbits, mice, rats, guinea pigs, hamsters, goats, sheep, cows, horses, chickens, ducks and the like (preferably rabbits, rats, mice, goats) Administer to lymph nodes, subcutaneous, intradermal, intravenous or intraperitoneal. When booster immunization is performed once to once every five weeks or once to five times after the first administration, an antibody against the antigen (immunogen) is produced in the body of the immunized animal. The antibody titer of blood or the like is examined by immunoassay (ELISA or the like) using a microplate coated with an antigen, and the blood or the like is collected after the antibody titer increases. The antiserum can be separated from blood by centrifugation after leaving the collected blood. When it is necessary to further purify such antisera, a selective fractionation method using a difference in solubility (eg, salting out with a neutral salt such as sodium sulfate or ammonium sulfate, low-temperature alcohol precipitation, etc.), and a difference in charge were used. Fractionation method (isoelectric point precipitation, electrophoresis, ion exchange chromatography, etc.), fractionation method using affinity difference between antibody and immunoglobulin (affinity chromatography with protein A, etc.), adsorption to carrier Methods commonly used as antiserum purification methods, such as a method using a difference in coefficient (such as adsorption chromatography using a hydroxyapatite adsorbent) and a fractionation method using a difference in molecular weight (gel filtration, ultracentrifugation, etc.) Can be appropriately combined for separation and purification.
[0012]
The antibodies of the present invention may be monoclonal antibodies. Monoclonal antibodies can be obtained by subjecting the antibody-producing cells to known methods (hybridoma method; G. Kohler et al, Eur. J. Immunol., 6, 511-519 (1976); Nature, 256, 495-497 (1975); Shulman et al, Nature, 276, 269-270 (1978); see "Monoclonal Antibody-Hybridoma and ELISA-", Kodansha Co., Ltd., published on February 20, 1983, etc. Can be produced and accumulated in the culture medium by culturing. In addition, the hybridoma is administered in advance to pristane (2,6,10,14-tetramethylpentadecane) to an animal having the same major histocompatibility, for example, a BALB / c mouse, and then to the intraperitoneal cavity to give ascites. Antibodies can also accumulate in ascites by forming tumors. The monoclonal antibody produced in this manner can be purified by the same method as the above antiserum.
[0013]
The antibody of the present invention prepared as described above exhibits a cross-reactivity with human synovial fluid-derived hyaluronan-binding protein and one or more of the X band component and the Y band component thereof. It can be used for differential diagnosis of rheumatoid arthritis or prognosis of the treatment of arthritis. The antibody of the present invention is not limited to an immunized animal and a production method as long as it has the above antigen specificity, and includes a polyclonal antibody (such as an antiserum) and a monoclonal antibody. Further, a fragment (for example, F (ab ')) obtained by subjecting such an antibody to limited digestion with a protease such as papain, pepsin, and trypsin 2 , Fab ′, Fab, etc.) that retain the characteristics of the antibodies of the present invention are encompassed by the antibodies of the present invention.
[0014]
This diagnostic Detection used for The method involves collecting synovial fluid from the joints of arthritis patients, quantifying the hyaluronan-binding protein complex contained therein, and depending on the amount, rheumatoid arthritis (RA) if the amount is high and deformability if the amount is low. With arthritis (OA) Can be discriminated it can Detection method It is. Known immunoassays, dot blotting (Western blotting) and the like are used as the quantification method.
[0015]
The known immunoassay (immunoassay) used in the present invention is not limited as long as it is a method capable of quantitatively or qualitatively measuring the binding property of human synovial fluid-derived hyaluronan using the above-described antibody of the present invention.
That is, an immunoturbidimetric method (Turbidimetric Immunoassay) for optically detecting a sedimentation reaction or an agglutination reaction, an immunodiffusion method for diffusing an antigen and an antibody using a gel as a support to form a sedimentation line or a sedimentation ring (Immunodiffusion), Western blotting (dot blotting), in which an antigen is adsorbed on a carrier, and the antibody is reacted with the antibody, and the antibody is secondarily detected using an anti-immunoglobulin antibody, protein A, etc. Any of the labeled immunoassays (Labeled Immunoassay) using an antigen or an antibody labeled with any substance can be applied to the assay of the present invention. More specifically, examples of the immunoturbidimetry include an agglutination reaction method using polystyrene fine particles (latex) bound with the antibody of the present invention and erythrocytes as carrier particles; Examples of the antibody carrier include an octalone diffusion method and a udan diffusion method using an agar gel, an agarose gel, a cellulose acetate membrane, a dextran gel, etc .; and a nitrocellulose membrane or a polyvinylidene membrane as the Western blotting (dot blotting). The antigen of the present invention is allowed to react with the antigen by adsorbing the antigen to the fluoride membrane, and then the antibody of the present invention is detected by an enzyme-labeled anti-immunoglobulin antibody (eg, a peroxidase-labeled anti-IgG antibody) or a radioisotope-labeled protein A. An example of a labeled immunoassay is that an enzyme is labeled with a labeled substance. Immunoassay (enzyme linked immunosorbent assay (EIA) or ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)); radioimmunoassay (radioimmunoassay, RIA) using a radioisotope as a labeling substance, and a fluorescent substance as a labeling substance Fluorescent immunoassay (fluorescent immunoassay) and the like are exemplified.
[0016]
These measurement methods are known methods [Minoru Irie, "Sequence Radioimmunoassay", published by Kodansha Co., Ltd., May 1, 1979; Eiji Ishikawa et al., "Enzyme Immunoassay", Second Edition, ( Medical Shoin, published on December 15, 1982; Methods in Enzymology, Vol. 92, (1983), Immunochemical Technologies, Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods, Academic Press, Inc.].
[0017]
In the case of the labeled immunoassay, the antibody of the present invention or the anti-immunoglobulin antibody can be treated with an enzyme (peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, etc.), a radioisotope ( 125 I, 131 I, 3 H), a fluorescent substance (fluorescein isothiocyanate, umbelliferone, etc.), a chemiluminescent substance (luminol, etc.), or another substance (biotin-avidin (or streptavidin), Indirectly via an immunoglobulin antibody or the like) and then used for measurement.
After the antigen-antibody reaction, if separation (BF separation) of an antibody (including a sandwich conjugate) bound to an antigen in the sample and an unbound free antibody is required, a liquid phase method (secondary antibody, Either polyethylene glycol, dextran charcoal powder or the like) or solid phase method (using a protein or an antibody having a binding property to an immobilized measurement reference substance) may be used, but the solid phase method is preferred. is there.
[0018]
As the immunoassay of the present invention, the following method is particularly convenient and preferred. That is, a proteoglycan-derived hyaluronan-binding protein (HABR) is immobilized on a solid phase, and this HABR is allowed to react with a complex of hyaluronan and a hyaluronan-binding protein present in a measurement sample, and the complex is reacted with the hyaluronan. Captured on a solid phase via a portion, the captured complex is bound to the antibody of the present invention by an antigen-antibody reaction, and an antibody specifically bound to the complex captured on the solid phase is known. This is a method of detecting and measuring by the method described above. As a method of detecting and measuring an antibody, a method of measuring a labeling substance using the antibody of the present invention to which the above-described labeling substance has been previously bound as an antibody; A method of measuring the labeling substance by reacting the antibody bound to the body with an anti-immunoglobulin antibody bound to the labeling substance; or using an unlabeled antibody for the above immunoreaction and binding the antibody bound to the complex to biotin or the like. Reacting with an anti-immunoglobulin antibody bound to a substance, and then reacting a conjugate of avidin (or streptavidin) that specifically reacts with a substance such as biotin with a labeled substance to measure the labeled substance. No.
Test tubes, beads, microplates, filter paper, latex, etc. are used as the solid phase, and methods for immobilizing HABR, antibodies, etc. on the solid phase include physical adsorption, covalent bonding, and inclusive methods. The immobilized enzyme can be prepared by applying a general method [“Immobilized enzyme”, March 20, 1975, Kodansha Co., Ltd., pp. 9-75]. Particularly, the physical adsorption method is preferred in terms of simplicity. In addition, it is preferable to block a portion to which HABR, an antibody, and the like are not bound by serum albumin, gelatin, or the like.
[0019]
In addition, the kit for diagnosing arthritis of the present invention can be used for quantifying the complex of the hyaluronan-binding protein and hyaluronan. Examples of such an arthritis diagnostic kit include, for example, a proteoglycan-derived hyaluronan-binding protein bound to a solid phase, an antibody described above, and an anti-immunoglobulin antibody bound to or capable of binding a labeling substance (preferably an anti-IgG And an antibody for diagnosis of arthritis.
[0020]
【Example】
Hereinafter, specific examples of the present invention will be described, but the present invention is not limited thereto.
Example 1
Preparation of hyaluronan binding protein
1) Purification of hyaluronan-hyaluronan binding protein complex from synovial fluid
The synovial fluid of a rheumatic knee arthritis patient was collected, lightly centrifuged to remove insolubles, and diluted 5 to 6-fold with Hanks' solution. To this was added 1/10 volume of a 4M guanidine hydrochloride solution, a trace amount of sodium azide was added, and then cesium chloride was added to 50% (w / v). After being placed in an ultracentrifuge tube and allowed to stand at 4 ° C., ultracentrifugation at 43,000 ° C. and 123,000 × g was performed for 48 hours (ultracentrifugation under non-dissociated protein conditions; associative ultracentrifugation). After ultracentrifugation, fractions divided into 10 equal parts were taken from the bottom of the tube, and the specific gravity, hyaluronan and protein concentration of each were measured, and the results are shown in FIG.
[0021]
In FIG. 1, the solid line represents the protein concentration (unit: mg / ml) of each fraction quantified by the Lowry method, and the broken line represents the hyaluronan concentration (unit: μg / ml) quantified by the method using actinomycete hyaluronidase. ing. Hyaluronan collected in a fraction having a low specific gravity (specific gravity of about 1.30) is considered to be a low molecular weight hyaluronan fragment due to joint inflammation. A fraction having a specific gravity of 1.43 or more contained hyaluronan in an overall ratio of 30% or more, and a protein component of 93% or more was distributed in a fraction having a specific gravity of less than that.
[0022]
Fractions having a specific gravity of 1.43 or more containing a large amount of hyaluronan were collected, and guanidine hydrochloride was further added to adjust the final guanidine hydrochloride concentration to 4M. This was again subjected to ultracentrifugation (ultracentrifugation under protein dissociation conditions; dissociative ultracentrifugation), divided into 10 equal fractions, and the results of measurement of specific gravity, hyaluronan, and protein concentration are shown in FIG. .
In FIG. 2, the solid line and the broken line represent the protein concentration (unit: mg / ml) and the hyaluronan concentration (unit: μg / ml), respectively.
[0023]
Hyaluronan was distributed with a specific gravity of 1.45 to 1.46 as the center, and hyaluronan with a total ratio of 60% or more was concentrated in a range of specific gravity of about 1.4 to 1.5, so fractions in this range were collected. This fraction was desalted and a precipitate was obtained by 75% ethanol precipitation. This precipitate is a complex of hyaluronan and a hyaluronan-binding protein (HA-hyaluronan-binding protein complex), and the amount of protein contained therein is about 0.03% of the amount originally contained in the synovial fluid. Met. When this fraction was treated with actinomycete-derived hyaluronidase, the molecular weight was about 85,000 daltons and about 83,000 daltons in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel (SDS-PAGE; 11%) electrophoresis shown in (3) below. (The X band and the Y band, respectively) were shown (see FIG. 3).
[0024]
The markers in the figure are electrophoresis diagrams of a standard molecular weight kit manufactured by Pharmacia. The molecular weight of 94,000 dalton is phosphorylase b, 67,000 dalton is bovine serum albumin, 43,000 dalton is ovalbumin, 30,000 dalton is carbonic anhydrase, 20,100 dalton is soybean trypsin inhibitor, 14,400 Dalton indicates α-lactalbumin, respectively.
No staining band appeared in either
[0025]
2) Method for separating hyaluronan-binding protein from hyaluronan-hyaluronan-binding protein complex
The carrier in which the HA-hyaluronan-binding protein complex is dissolved in an appropriate buffer solution and the chondroitinase ABC is immobilized on formyl-cellulofine (trade name, manufactured by Chisso Corporation, sold by Seikagaku Corporation) is used. After applying hyaluronan to the packed column to digest the hyaluronan, the digest was dialyzed to remove the hyaluronan-decomposed product to obtain a hyaluronan-binding protein single solution.
[0026]
3) Hyaluronan-specific quantification method
Three times the volume of 95% ethanol containing 1.3% potassium acetate was added to the sample solution (100 μl to 300 μl), stirred, left at ice temperature for 30 minutes, and then 15,000 r.p. p. and the supernatant was removed. A 50 mM acetic acid / sodium acetate buffer (pH 5.0) was added to the obtained precipitate to dissolve it, and actinomycete-derived hyaluronidase 2.5 to 5.0 TRU (turbidity reducing unit) was added, followed by digestion at 50 ° C. for 30 minutes. . After digestion, the enzyme reaction was stopped by heating at 100 ° C. for 3 minutes, followed by centrifugal filtration with a φ0.22 μm filter. Hyaluronan hydrolyzate was quantified by applying the filtrate to a post-column reaction type carbohydrate detection HPLC system (Tosoh Corporation). For the quantification, sodium hyaluronate derived from cockscomb was dissolved in the same buffer, and a sample treated with an enzyme simultaneously with the sample was used as a standard.
[0027]
4) Molecular weight measurement method
According to the method of Segrest et al. [Method in Enzymology, Vol. 28-B, pp. 54-63 (1972)], 10 μl of a sample is applied to SDS-polyacrylamide gel with Tris / glycine / SDS (pH 8.3), and electrophoresis Was done. The sample was prepared by treating the HA-hyaluronan-binding protein complex with hyaluronidase to remove hyaluronan. Staining was performed with Coomassie Brilliant Blue R-250, and the molecular weight was observed based on the electrophoretic mobility of the standard molecular weight kit (manufactured by Pharmacia) in the same electrophoresis. The result is shown in FIG.
As described above, the hyaluronan binding protein of the present invention shows two bands, about 85,000 daltons (X band) and about 83,000 daltons (Y band), none of which was treated with hyaluronidase. It was not found in the sample and was a band at a position different from that of hyaluronidase. This result was the same whether or not the sample was subjected to the reduction treatment.
[0028]
5) Isoelectric point measurement
When the hyaluronan of the HA-hyaluronan-binding protein complex of the present invention is digested with an enzyme (hyaluronidase) to make the hyaluronan-binding protein alone, an anion exchanger column (DEAE-Cellulofine A800: manufactured by Chisso Corporation, Biochemistry) (Industry Co., Ltd. sales), all were bound at pH 7.0, and those at pH 6.0 were approximately the same as those not bound. From this phenomenon, it was determined that the isoelectric point of the protein was between about pH 6.0 and 7.0, particularly about pH 6.0 to 6.5.
[0029]
6) Determination of partial amino acid primary structure
The hyaluronan-binding protein of the present invention is divided into an X band and a Y band by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and each of them is treated with protease V8 according to a known method. And one peptide from the Y band were selected, and the amino acid sequence from the amino terminal was determined by a solid phase method using an amino acid sequencer manufactured by Applied Biosystems. The amino acid sequence from the amino terminus of each peptide was as follows.
[0030]
{Circle around (1)} Primary structure of a peptide fragment obtained by treating X band with protease V8.
Val Asp Gln Val Thr Leu Tyr Ser Tyr Lys Val Gln Ser Thr Ile Thr Ser Arg Met Ala Thr Thr Phys GlnsAl LysValGinSer LynsValAsV
{Circle around (2)} Primary structure of a peptide fragment obtained by treating the Y band with protease V8.
Ile Val Ile Lys Val Lys Pro Lys Gln Leu Val His His Phe Glu Ile Asp Val Asp Ile Phe Glu Pro Gln Gly Ile SerA La Lys Ala Lua La Lys Aux
(Xaa indicates an unidentified amino acid)
In addition, protease V8 (Protease V8) was obtained from Staphylococcus aureus V8. (Staphylococcus aureus V8) is an endoproteinase (optimal pH 4.0 and 7.8) that cleaves the carboxyl terminal side of aspartic acid or glutamic acid in phosphate buffer (pH 7.8) [manufacturer] ICN Biomedicals Inc. ).
[0031]
Example 2
Generation of antibodies against human synovial fluid hyaluronan binding protein
The HA-hyaluronan-binding protein complex obtained according to Example 1 was dissolved in a 50 mM acetic acid / sodium acetate buffer (pH 5.0) and digested with actinomycete-derived hyaluronidase. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed in the same manner as described above. The X band component and the Y band component of the hyaluronan binding protein were extracted. 0.5 ml of phosphate buffered saline (PBS) containing each of them as antigens was mixed with an equal volume of Freund's complete adjuvant and injected into the rabbit knee bulk lymph node. Thereafter, every two weeks, 50 μl of PBS was mixed with the same volume of incomplete Freund's adjuvant twice and injected at the same site. The antibody titer was checked weekly by ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), and blood was collected two weeks after the second boost to obtain two types of antisera. This antiserum was used as an antibody. The obtained antibody reacted to the same extent with both the X component and the Y component, regardless of whether the antigen was the X component or the Y component. These antibodies also reacted with components contained in bovine serum and mouse serum that correspond to the hyaluronan-binding protein of the present invention.
When the HA-hyaluronan-binding protein complex is used as an antigen, an antibody having the same antigen specificity can be obtained.
[0032]
Example 3
Immunoassay for hyaluronan-binding protein in synovial fluid of arthritis patients
(1) Comparison by dot blot of the amount of hyaluronan-binding protein contained in synovial fluid of osteoarthritis patients and synovial fluid of rheumatoid arthritis patients
The hyaluronan-binding protein of the present invention was measured by the following dot blot method in osteoarthritis knee (hereinafter abbreviated as OA) patients (3 cases) and rheumatoid knee arthritis (hereinafter abbreviated as RA) patients (3 cases). . The synovial fluid of each patient was provided by Prof. Iwata of Orthopedic Surgery, Nagoya University School of Medicine.
[0033]
Each patient's synovial fluid was diluted with 20 mM phosphate buffered saline (PBS) (pH 7.2) and spotted on a nitrocellulose membrane or polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane in an amount of 5 μl. This membrane was immersed in PBS containing 1% bovine serum albumin and blocked at 37 ° C. for 2 hours. Thereafter, the cells were reacted in PBS containing the anti-hyaluronan-binding protein antibody prepared in Example 2 at room temperature for 1 hour, washed well, reacted with peroxidase-conjugated anti-IgG antibody for 1 hour at room temperature, and bound to the membrane. Peroxidase was developed with hydrogen peroxide and diaminobenzidine. The result is shown in FIG. FIG. 4 schematically shows the intensity of color development. In the figure, ● represents a deep color, ○ represents a color enough to be clearly distinguished, Δ represents a color that appears to be faint, and Δ represents a color that barely appears. Respectively.
[0034]
As a result, the concentration of the hyaluronan-binding protein in the synovial fluid of the RA patient was clearly higher than that in the synovial fluid of the OA patient, and there was a difference of several times to several tens times as judged from the dilution ratio of the sample.
[0035]
(2) Comparison of the amount of the hyaluronan-hyaluronan binding protein complex contained in the synovial fluid of a patient with osteoarthritis and the synovial fluid of a patient with rheumatoid arthritis by ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
The hyaluronan-binding protein (HA-HA) bound to hyaluronan was determined by ELISA for each of the two cases of OA synovial fluid and RA synovial fluid in which the difference in the hyaluronan-binding protein concentration was found in the dot blotting of Example 3 (1). (Hyaluronan binding protein complex).
[0036]
(A) Purification of hyaluronan binding protein derived from proteoglycan
From a commercially available bovine nasal cartilage proteoglycan monomer, a hyaluronan-binding protein (proteoglycan hyaluronan) can be obtained according to a known method (Tenglad, A., Biochim. Biophys. Acta, 578, P281, 1979) and a method described in JP-A-64-469. Binding site; hereinafter abbreviated as HABR).
That is, 300 g of bovine nasal septum cartilage was cut into small pieces with scissors, and this was poured into a 0.5 M solution of sodium acetate (pH 5.8) containing 4 M of guanidine hydrochloride, which had been kept at 4 ° C., and kept at 4 ° C. And extracted overnight. The extract was centrifuged at 13,000 Xg for 20 minutes, and the supernatant was collected. The supernatant was dialyzed against purified water, freeze-dried, and the resulting solid was pulverized to obtain a crude extract powder.
[0037]
1600 mg of the obtained crude extract powder and 0.8 mg of trypsin (manufactured by Sigma) were added to 25 ml of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.3) containing 0.1 M of sodium acetate, and the mixture was added at 37 ° C. Stored for 2 hours. Next, 1 mg of soybean-derived trypsin inhibitor (manufactured by Sigma) and 19.1 g of guanidine hydrochloride were added, and a 0.1 M sodium acetate solution was further added to adjust the total amount to 50 ml.
50 ml of the trypsin-treated HABR-containing solution thus obtained is mixed with 50 ml of hyaluronic acid-bound sepharose, immediately put into a dialysis membrane, cooled to 4 ° C., and dialyzed overnight in 9 volumes of purified water. Was. After the dialysis, the entire amount of the gel was packed in a column having an inner diameter of 3.2 cm and washed with a 1 M saline solution to remove unadsorbed components.
[0038]
Further, the protein was washed successively with a 1 M to 3 M saline solution to remove unnecessary proteins, and the adsorbed components were eluted and recovered with a 0.5 M sodium acetate solution (pH 5.8) containing 4 M of guanidine hydrochloride hydrochloride.
The collected solution was concentrated with DIAFLO PM-10 (manufactured by Amicon) to a total volume of 4 ml, passed through a Sepharose 6B column (φ3.1 × 43 cm), and the components showing the second and third peaks were collected. Each was separated and concentrated with DIAFLO PM-10 to obtain a purified sample of HABR.
[0039]
(B) ELISA
The HABR prepared in (A) was dissolved at a concentration of 5 μg / ml in 20 mM PBS at pH 7.2, and this solution was dispensed at 100 μl / well into a 96-well microplate, and allowed to stand at 4 ° C. overnight for coating. did. After washing the plate, a 1% bovine serum albumin / PBS solution was dispensed at 200 μl / well and incubated at 37 ° C. for 2 hours to block. The sample synovial fluid (2 patients each for OA patients and RA patients) was diluted with PBS to adjust the concentration of each hyaluronan, and 100 μl / well was dispensed into the plate after blocking, and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Incubation was performed. After washing the plate, the anti-hyaluronan-binding protein antibody (with the X band component as an antigen) (about 1 μg / ml) prepared in Example 2 was dispensed at 100 μl / well and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Further, a peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG antibody (manufactured by Jackson, sold by Seikagaku Corporation; a stock solution diluted to 1/5000) was dispensed at 100 μl / well and incubated at 37 ° C. for 1 hour. The plate was washed well, the peroxidase bound to the microplate was developed with orthophenylenediamine and hydrogen peroxide, and the absorbance at 490 nm was compared with a plate reader. The results for RA and OA patient synovial fluid are shown in FIGS. 5 and 6, respectively. In each figure, the solid and dotted lines show the synovial fluid of two patients with different diseases. FIG. 5 shows the case of RA synovial fluid, and FIG. 6 shows OA synovial fluid. OA synovial fluid has a 10-fold higher hyaluronan concentration than RA synovial fluid.
As a result, the amount of the HA-hyaluronan binding protein complex in the OA synovial fluid was much smaller than that in the RA synovial fluid, and was 1/50 or less.
[0040]
【The invention's effect】
1) Currently, the diagnosis of rheumatism largely depends on the findings of the doctor and the patient's awareness, and an objective and quantitative diagnosis is urgently required. The most common diagnostic method used at present is the diagnostic criteria of the American Rheumatism Association consisting of 11 items, and the diagnosis of rheumatism or not is made based on how many items are satisfied. However, the items contained therein are based on the subjectivity of physicians and patients as described above, as well as those detected in other diseases such as liver disease and cancer patients, such as rheumatoid factors, or in healthy people. Is included. It seems very difficult to establish an absolute objective and quantitative diagnostic method, but by combining several objective and quantitative diagnostic methods, the diagnosis of RA or OA can be made more reliable. Performing early in morbidity may be an important step in resolving such difficulties.
OA and RA can be clearly distinguished by immunoassay (immunoassay) using an antibody against the hyaluronan binding protein of the present invention. By applying this measurement system to a diagnostic reagent, it is possible to provide an objective and quantitative diagnostic standard from a new viewpoint to a conventional diagnostic method.
2) It is expected that a new therapeutic agent can be developed by screening a substance that suppresses the synthesis of a hyaluronan-binding protein or a substance that scavenges a hyaluronan-binding protein in a body fluid.
[0041]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the relationship between the specific gravity of each fraction subjected to associative ultracentrifugation according to Example 1 and the concentration of hyaluronan and protein.
[Explanation of symbols]
タ ン パ ク 質 Protein concentration (mg / ml)
……… Hyaluronan concentration (μg / ml)
FIG. 2 shows the relationship between the specific gravity of each fraction obtained by associative ultracentrifugation of a fraction having a specific gravity of 1.43 or more and the concentration of hyaluronan and protein in Example 1, which is further subjected to dissociative ultracentrifugation.
[Explanation of symbols]
タ ン パ ク 質 Protein concentration (mg / ml)
……… Hyaluronan concentration (μg / ml)
FIG. 3 shows an SDS-PAGE electrophoretogram of a treated product of the hyaluronan-hyaluronan-binding protein complex of Example 1 with actinomycete-derived hyaluronidase.
[Explanation of symbols]
FIG. 4 shows hyaluronan binding properties of synovial fluid of each of three patients with rheumatoid arthritis (RA1 to RA3) and osteoarthritis (OA1 to OA3) of Example 3 by dot plot using an anti-hyaluronan binding protein antibody. Fig. 3 shows a comparative schematic diagram of protein concentration.
[Explanation of symbols]
●, ○, Δ, Δ indicate coloring intensity. ● ＞ ○ ＞ △ ＞ ∴.
FIG. 5 shows the relationship between the concentration of hyaluronan in the synovial fluid of rheumatic knee arthritis of Example 3 and the absorbance (490 mm) of peroxidase coloration.
[Explanation of symbols]
患者 Patient A
……… Patient B
FIG. 6
4 shows the relationship between the hyaluronan concentration of the synovial fluid of knee osteoarthritis of Example 3 and the absorbance (490 mm) of peroxidase coloring.
[Explanation of symbols]
患者 Patient C
……… Patient D
Claims (6)
（Ａ）分子量： 該複合体をヒアルロニダーゼ処理することにより、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動上で非還元状態において約85キロダルトン（Ｘバンド）と約83キロダルトン（Ｙバンド）の二本の主バンドを形成する、
（Ｂ）部分タンパク質一次構造：
1) ＸバンドのプロテアーゼＶ８処理によって得られるペプチドフラグメントの一次構造は次のとおり；
Val Asp Gln Val Thr Leu Tyr Ser Tyr Lys Val Gln Ser Thr Ile Thr Ser Arg
Met Ala Thr Thr Met Ile Gln Ser Lys Val Val Asn Asn Ser Pro Gln Pro
2) ＹバンドのプロテアーゼＶ８処理によって得られるペプチドフラグメントの一次構造は次のとおり；
Ile Val Ile Lys Val Lys Pro Lys Gln Leu Val His His Phe Glu Ile Asp Val
Asp Ile Phe Glu Pro Gln Gly Ile Ser Lys Leu Asp Ala Xaa Ala Ser Pro
（式中、Ｘａａは未同定アミノ酸を示す）
（Ｃ）等電点: 約 6.0〜7.0 （ＤＥＡＥ−セルロファインＡ800 に対する結合のpH依存性からの推定値）It is present in the knee joint fluid of a human patient with osteoarthritis of the knee or rheumatic knee arthritis, is isolated from these knee joint fluids, and has a hyaluronan-binding protein and a hyaluronan- derived human synovial fluid having the following physicochemical properties: Bound complex.
(A) Molecular weight: The complex is treated with hyaluronidase to give two lines of about 85 kDa (X band) and about 83 kDa (Y band) in a non-reduced state on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Forming the main band of
(B) Primary structure of partial protein:
1) The primary structure of the peptide fragment obtained by treating the X band with protease V8 is as follows:
Val Asp Gln Val Thr Leu Tyr Ser Tyr Lys Val Gln Ser Thr Ile Thr Ser Arg
Met Ala Thr Thr Met Ile Gln Ser Lys Val Val Asn Asn Ser Pro Gln Pro
2) The primary structure of the peptide fragment obtained by treating the Y band with protease V8 is as follows:
Ile Val Ile Lys Val Lys Pro Lys Gln Leu Val His His Phe Glu Ile Asp Val
Asp Ile Phe Glu Pro Gln Gly Ile Ser Lys Leu Asp Ala Xaa Ala Ser Pro
(Where Xaa represents an unidentified amino acid)
(C) Isoelectric point: about 6.0-7.0 (estimated from pH dependence of binding to DEAE-Cellulofine A800)
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