JP3551443B2

JP3551443B2 - Cinnamyl alcohol dehydrogenase gene of udo and hardwood, and hardwood into which the gene is introduced

Info

Publication number: JP3551443B2
Application number: JP15262293A
Authority: JP
Inventors: 尾野隆日; 田大輔柴
Original assignee: Oji Holdings Corp; Oji Paper Co Ltd
Current assignee: New Oji Paper Co Ltd; Oji Holdings Corp
Priority date: 1992-06-02
Filing date: 1993-06-01
Publication date: 2004-08-04
Anticipated expiration: 2019-08-04
Also published as: JPH06181775A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ウド及び広葉樹のシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（以下、ＣＡＤということもある）遺伝子及びそのプロモーター部位、並びにこれらの全部又は一部を用いて作成したアンチセンス遺伝子を導入してなるリグニン含量が調節された広葉樹に関するものである。
【０００２】
本発明のウド及びユーカリのＣＡＤのアミノ酸配列を規定する遺伝子は広葉樹で有効に発現し、広葉樹中のリグニン合成に関与するため、これらのアンセチンス遺伝子を広葉樹に導入することによって広葉樹に含まれるＣＡＤ活性を任意に変化させ、リグニン含量の制御を可能とするものである。紙パルプ生産において原料となる木材からのリグニン分解には多大のコストを要しているため、本発明によってリグニン含量を低下させた木材を紙パルプ生産に用いれば、リグニン除去に要するコストを大幅に低減させることができ、紙パルプ生産の分野において極めて有効である。
【０００３】
【従来の技術】
リグニンは高等植物が普遍的に有する高分子複合体であり、高等植物の細胞間に存在し、植物体の強度を保つ役割を担っている。リグニンの生合成は樋口ら（ＷｏｏｄＳｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２４，２３，１９９０）により詳細に研究されてきた。特にシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼはその酵素学的性質がよく研究されている。１９８８年にＣ．Ｊ．ＬａｍｂらによりインゲンマメＣＡＤ遺伝子のｃＤＮＡの単離が報告された（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５，５５４６，１９８８）。しかし彼らは１９９０年に発表した論文（ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５，５２５，１９９０）において、このｃＤＮＡのコードするタンパク質がトウモロコシのマリックエンザイムと高い相同性を有することから、ＣＡＤをコードすることに対しての疑問を示唆した。それ以降にマリックエンザイムが各種の植物で単離され、インゲンマメから単離したｃＤＮＡはＣＡＤをコードしていないことが明らかとなっている。このようなクローニングの誤ちは、ＣＡＤの生化学的性質が不明であったことに起因する。
【０００４】
その後、複数の研究グループによりＣＡＤに関する報告がなされた。１９９１年１０月に、タバコのＣＡＤ遺伝子の単離に関する報告（掲示番号：１６５３）が第３回国際植物分子生物学会（米国、ツーソン）の掲示発表においてなされたが、塩基配列及びアミノ酸配列に関する報告は皆無であった。また、同学会においてテーダ松のＣＡＤに関する報告（掲示番号：１１１１）もなされたが、アミノ末端の一部アミノ酸配列が示されるに留まった。この一部アミノ酸配列については１９９２年４月号のＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ誌に掲載された（ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，９８，１３６４，１９９２）。ただし、テーダ松は裸子植物（針葉樹）であり、本発明の被子植物であるウド及びユーカリと比較した場合、ＣＡＤの酵素的な性質の相違が存在する。
【０００５】
植物中のリグニンを構成する単量体として２種のモノリグノール（コニフェリルアルコール（ＣＡ）及びシナピルアルコール（ＳＡ））が存在する。被子植物ではこの２種のモノリグノールが混合したリグニンを形成するが、裸子植物ではシナピルアルコールのみでリグニンが形成される。Ｋｕｔｓｕｋｉらの報告（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１，１９，１９８２）において、複数の被子植物及び裸子植物からＣＡＤを部分精製し、ＣＡ及びＳＡに対する酵素活性の測定がなされ、被子植物ＣＡＤはＣＡ及びＳＡの双方に対して同等に作用するが、裸子植物ＣＡＤはＳＡに対する活性が低いことが示された。特に、マツ類ＣＡＤのＳＡに対する酵素活性は、ＣＡのそれに対して約５分の１以下であった。他の針葉樹ＣＡＤの基質特異性についての詳細なデータが、スプルース（トウヒ）ＣＡＤの精製に関する論文（ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１９，１１５，１９８４）に示されている。これによれば、スプルースＣＡＤはＣＡ及びＳＡに対する基質特異性に１０倍以上の差があることが明らかである。以上の観点から、裸子植物（特に針葉樹）ＣＡＤ及び被子植物ＣＡＤは基質の認識に関与する立体構造に決定的な違いがある、互いに異なる酵素であると結論される。
【０００６】
リグニンは紙パルプ生産過程において不要な物質であり、その除去過程に多大なコストを費やしている。従って、林木のリグニン含量を低減することは重要な育種目標である。近年の遺伝子組換え技術の進歩により、林木における該技術を用いた育種が可能となりつつある。従って、リグニン生合成に関与する遺伝子の単離および同定、これを用いた遺伝子組換え技術による林木の品種改良が待たれていた。
【０００７】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明は上記に示した現状に鑑み、リグニン含量の低い林木の作出、並びに林木中のリグニン含有量のコントロールを目的として、リグニン生合成に関与する酵素群の中からシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼに着目し、この遺伝子の単離及び構造の解明のためになされたものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、各方面から鋭意研究した結果、ウドの幼梢よりＣＡＤを精製し、部分的なアミノ酸配列を決定し、このアミノ酸配列から推定されるオリゴヌクレオチドプローブを作成し、このフローブを用いてウド幼梢由来のｃＤＮＡライブラリーからＣＡＤのｃＤＮＡの釣り出しに成功した。さらにウドＣＡＤのｃＤＮＡをプローブとして用い、ユーカリ由来のゲノムライブラリーからＣＡＤ遺伝子の釣り出しに成功した。本発明は、以上の知見に基づいてさらに研究した結果、完成されたものである。即ち、本発明はウド並びにユーカリＣＡＤ遺伝子に関するものであって、それらの塩基配列は配列表の配列番号１並びに２に示した。
【０００９】
本発明によれば、ウドＣＡＤのｃＤＮＡをプローブとして用いることによりユーカリＣＡＤ遺伝子を釣り出すことができたが、このことはＣＡＤ塩基配列がウド及びユーカリといった被子植物間で高い相同性を有していることに他ならない。従って、ウド並びにユーカリのＣＡＤ遺伝子及びその断片をプローブに用いることにより、全ての被子植物からＣＡＤ遺伝子を釣り出すことが可能である。
【００１０】
ウドのＣＡＤ遺伝子、及び広葉樹のＣＡＤ遺伝子の全部または一部を用いて、アンチセンス遺伝子として人工的に構築し、この遺伝子をエレクトロポレーション法（ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．，９２，２２６，１９９０）及びアグロバクテリウムを用いる遺伝子導入法（ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．，９３，１１１０，１９９０）等の確立された方法に従いウド、ユーカリはもとより、クワ、ポプラ等の広範囲の広葉樹に導入、発現させることが可能である。
【００１１】
本発明によれば、植物体再生が確立されている広葉樹であれば、ＣＡＤアンチセンス遺伝子を導入することによりリグニン含量の低減が可能である。例えばパルプ材として利用される木材を対象とすれば、リグニン含量の低い良質のパルプ材として作出することが可能である。
【００１２】
以降では本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。操作の手順は特に記述しない限りにおいて、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ．１９８７）に記載された方法に従った。
【００１３】
【実施例】
【００１４】
（１）材料
市販されている食用ウドを購入し、材料とした。ＣＡＤの活性測定用の基質であるコニフェリルアルデヒド、シナップアルデヒド（以下、両者を総称してアルデヒドと呼ぶ場合がある）については、Ｋｕｔｓｕｋｉらの方法（木材学会誌２７，５２０，１９８１）に従い合成した。コニフェリルアルコール、シナピルアルコール（以下、両者を総称してアルコールと呼ぶ場合がある）については、前者をアルドリッチ社から購入し、後者を岐阜大学、河合真吾博士より分譲して頂いた。
【００１５】
（２）ＣＡＤ活性の測定方法
アルコールからアルデヒドへの酸化反応は、２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．２５）中に０．１ｍＭＮＡＤＰ＋、０．０７ｍＭコニフェリルアルコール又はシナピルアルコールを加え全量を１ｍＬとし、酵素液を加えて３０℃でおこなった。反応は分光光度計の測定用セル中でおこない、生成したアルデヒドによる４００ｎｍの光吸収を測定し、ＣＡＤのアルコール酸化反応活性を計算した。
【００１６】
アルデヒドからアルコールへの還元反応は、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）中に０．１ｍＭＮＡＤＰＨ、０．０５ｍＭコニフェリルアルデヒド又はシナップアルデヒドを加え全量を１ｍＬとし、酵素液を加えて３０℃でおこなった。反応は上記と同様におこない、減少したＮＡＤＰＨを３４０ｎｍの光吸収により測定し、ＣＡＤのアルデヒド還元反応活性を計算した。
【００１７】
（３）ＣＡＤの精製
市販のウドを吸水させながら１日放置すると、ＣＡＤ活性が約２倍に上昇したので、この処理をおこなったウド４．５ｋｇを出発試料とした。約１ｃｍ角に切断し、ＣＡＤ抽出用緩衝液（１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ β−メルカプトエタノール）４Ｌと混合した後、ジューサーミキサーを用いて細かく破砕した。試料溶液をガーゼをもちいて濾し、直ちに硫酸アンモニウムを４０％飽和濃度となるように加え、遠心分離をおこない、上清を回収した。上清に７０％飽和濃度となるように硫酸アンモニウムを加え、遠心分離をおこない、沈澱を回収した。沈澱をＣＡＤ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール）に溶解させ酵素溶液とし、ゲルろ過をおこない脱塩した。酵素溶液に硫酸アンモニウムを加え、最終濃度を０．５Ｍとした後、０．５Ｍ硫酸アンモニウムで平衡化した東ソー社製のブチルトヨパールによる疎水クロマトグラフィーをおこない酵素溶液を分画した。溶出は硫酸アンモニウムの０．５Ｍから０Ｍの直線濃度勾配によりおこなった。得られたＣＡＤ画分をゲルろ過により脱塩した後、ファルマシア社製のモノＱカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーをおこない、さらに細かく分画した。溶出は塩化ナトリウムの０Ｍから０．３Ｍの直線濃度勾配によりおこなった。得られたＣＡＤ画分をゲルろ過により脱塩した後、ファルマシア社製のＮＡＤＰ＋−アガロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーをおこない、１ｍＭＮＡＤＰ＋でＣＡＤを溶出させた。これをウドＣＡＤ最終標本とした。
【００１８】
上記の方法により２４０μｇの精製ＣＡＤを得た。精製ＣＡＤをファルマシア社製のファストシステムを用いて８％から２５％の濃度勾配を持つポリアクリルアミドゲル電気泳動をおこない、銀染色法によりタンパク質を検出したところ、単一のバンドが確認できた。精製ＣＡＤをファルマシア社製のスーパーロース１２カラム及び同社製の分子量測定用マーカーを用いてゲルろ過をおこなった結果、ウドＣＡＤの分子量は７２，０００であることが判明した。この値は、既報のＣＡＤの分子量と類似していた。さらに、ＳＤＳを含む同様の電気泳動をおこなったところ、分子サイズが３８ｋＤａ及び３９ｋＤａと推定される２つのバンドが確認された。このことから、ウドＣＡＤは類似した２種類のサブユニットからなる２量体であることが示唆された。一方、基質に対するＫｍ値を測定したところ、既報のＣＡＤのＫｍ値に類似の値が得られた。また、低級アルデヒド（アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド）、ＮＡＤＨ及びＮＡＤ＋は、ＣＡＤの基質とはならないことも確認した。以上の結果から、精製した酵素標本がリグニン生合成系にのみ存在するアルデヒドおよびアルコールに対して高い基質特異性を有することが示され、本酵素標本はウドＣＡＤであることが明らかとなった。
【００１９】
（４）ウドＣＡＤのアミノ酸配列の決定
精製したＣＡＤを５０μｇ取り、モル比で１００倍のシアン化臭素を加え、４０℃で２０時間反応させたＣＡＤの部分分解をおこなった。反応終了後、試料溶液を凍結乾燥させ、得られたペプチドを０．１ｍＬの０．１％トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと省略する）に溶解した。これを日本分光社製のＣ１８・ＯＤＳカラムを用いる逆相クロマトグラフィーにより分画した。液相として０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルの０％から８０％の直線濃度勾配を用い、ペプチドの検出方法として２２０ｎｍの紫外線吸収を測定した。分画されたペプチドを各々凍結乾燥を経て回収した。アプライドバイオシステム社製の自動アミノ酸配列分析装置（モデルＮｏ．４７０Ａ）を用い、得られたペプチドのアミノ酸配列を決定した。その結果、図１に示した４つのＣＡＤの部分アミノ酸配列が得られた。
【００２０】
（５）オリゴヌクレオチドの合成
図１に示したアミノ酸配列の中からペプチド＃１５のアミノ酸配列を選び、アプライドバイオシステム社製のＤＮＡ合成装置（モデルＮｏ．３８１Ａ）を用いてこれに相当するオリゴヌクレオチドを化学合成した。図２に合成したオリゴヌクレオチドの塩基配列を示した。
【００２１】
（６）ウドｃＤＮＡライブラリーの作成
ＣＡＤ精製に用いた際と同じウドを材料としてＲＮＡの抽出操作をおこない、２５０μｇの全ＲＮＡを得た。さらに、ファルマシア社製のオリゴｄＴカラムを用いてアフィニティークロマトグラフィーを行い、１３．５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡを得た。２μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡ、ファルマシア社製のｃＤＮＡ合成キット及びλｇｔ１１、ストラータジーン社製のファージ粒子パッケージングキットを用いてｃＤＮＡライブラリーを作成した。作成したｃＤＮＡライブラリーを大腸菌（Ｙ１０８８）に感染させファージの増殖をおこなった際、ＳＭ緩衝液に溶出させ保存した。ライブラリー中の組換え体総数は約１６０万であった。
【００２２】
（７）ウドＣＡＤのｃＤＮＡ単離
プラークハイブリダイゼーション法に従い、ウドｃＤＮＡライブラリー中の約３０万の組換え体から、ＣＡＤのｃＤＮＡ単離をおこなった。プローブは、【００２０】に表記の合成オリゴヌクレオチドを〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドカイネースを用いてリン酸付加反応により標識したものを使用した。ハイブリダイゼーション時の温度は４２℃という比較的穏やかな条件に設定した。その結果、プローブと高い相同性を有するｃＤＮＡクローンが２０個得られたが、全て同一のｃＤＮＡクローンであることが判明したので、約１．４ｋｂｐ（１ｂｐは１塩基対）を有する最長のｃＤＮＡ断片をストラータジーン社製のプラスミドベクター（ブルースクリプトＳＫ＋）に移し換え、ｐＵＣＡＤ１０と命名した。以降の解析にはこのｐＵＣＡＤ１０を用いた。
【００２３】
（８）ウドＣＡＤのｃＤＮＡ解析及び同定
ｐＵＣＡＤ１０のｃＤＮＡ断片の塩基配列解析は、宝酒造社製のＭ１３シークエンスキットを用いてダイデオキシ法に従っておこなった。この際、プロメガ社製のデレーションキットを用いることにより、ｐＵＣＡＤ１０のｃＤＮＡ断片を一方向から約２５０塩基対の間隔で短くした計５つのｐＵＣＡＤ１０由来プラスミドを両方向について作成した。各々の塩基配列を約３００塩基対程度まで解析し、重複する塩基配列部分でつなぎ合わせた。得られたｐＵＣＡＤ１０の塩基配列を表１から表４で示した配列表の配列番号１に示した。
【００２４】
【表１】

【００２５】
【表２】

【００２６】
【表３】

【００２７】
【表４】

【００２８】
即ち、上記に示した配列表の配列番号１の配列は
【００２３】に表記したｃＤＮＡ断片の塩基配列とこれによって規定されるアミノ酸配列を示すものである。
【００２９】
このｃＤＮＡによって規定されるアミノ酸配列をウドＣＡＤのアミノ酸配列解析から得られたアミノ酸配列と比較したところ、両者の配列がほぼ一致することが示された。一致した部分については配列表の配列番号１中の下線で示した。このことから本ｃＤＮＡはウドＣＡＤのｃＤＮＡであることが明らかとなった。また、アミノ末端の配列（図１のペプチドＮ）についても確認できたことから、本ｃＤＮＡはウドＣＡＤ全長を規定していることが示された。
【００３０】
これまでのＣＡＤについての報告と異なり、ウドＣＡＤは類似する２種のサブユニットからの構成されていることが明らかであり、得られたｃＤＮＡはどちらか一方のサブユニットのアミノ酸配列を規定する。本発明はＣＡＤ遺伝子を利用して、最終的に植物内のＣＡＤ活性を抑えるためのものである。即ち、サブユニットに対する発現抑制を行うことによって、本発明の目的は達成される。
【００３１】
（９）ユーカリゲノムライブラリーの作成
ユーカリ（ボトルオイデス種）苗状原基由来のカルスをＭＳ培地上で生育させた。日尾野らの方法（第３６回リグニン討論会要旨集、６１頁、１９９１）に従い、ユーカリカルスからゲノムＤＮＡを抽出後、制限酵素（Ｓａｕ３ＡＩ）により部分分解し、塩化ナトリウムの２％から２５％の直線密度勾配遠心法により約１６から２０ｋｂｐのゲノムＤＮＡ断片を回収した。このゲノムＤＮＡ断片とストラタジーン社製のＥＭＢＬ３及びファージ粒子パッケージングキットを用いて、ユーカリゲノムライブラリーを作成した。作成したｃＤＮＡライブラリーを大腸菌（ＳＲＢ）に感染させファージの増殖をおこなった後、ＳＭ緩衝液に溶出させ保存した。ライブラリー中の組換え体総数は約２５０万であった。
【００３２】
（１０）ユーカリＣＡＤ遺伝子の単離
プラークハイブリダイゼーション法に従い、ユーカリゲノムライブラリー中の約５０万の組換え体から、ＣＡＤ遺伝子の単離をおこなった。プローブは、ウドＣＡＤのｃＤＮＡ断片全長を〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰ及びベーリンガー社製ランダムプライムドＤＮＡラベリングキットを用いて標識したものを使用した。その結果、プローブと高い相同性を有するＣＡＤ遺伝子クローンが３つ得られた。これらの制限酵素地図の作成を行った。図３に示すように、３つのクローンのうち２つは互いに重複するクローンであり、残りの１つはユーカリ遺伝子断片上のＣＡＤを含まない部分において１箇所のみ制限酵素部位の相違が見られた。これは、作物などのように人工的に純系とされたものと異なり、林木においては対になる相同染色体間で微細な相違があることに起因すると推定される。３つのクローンは、λＥＣＡＤ７４、λＥＣＡＤ７２、λＥＣＡＤ２１と命名した。これらのクローン中にＣＡＤ遺伝子全域が含まれていることを確認するために、ウドＣＡＤのｃＤＮＡのＮ末端側の断片及びＣ末端側の断片を各々プローブとして用い、サザン分析を行なった。プローブとした断片はｐＵＣＡＤ１０の塩基配列を解析する際に作成したデレーションクローンの中から、Ｎ末端側およびＣ末端側を有するものを選び、そのｃＤＮＡ断片を制限酵素で切断して用いた。即ち、Ｎ端側プローブは配列表の配列番号１に示した１番から２０３番で示した塩基配列を有するＤＮＡ断片であり、Ｃ末端側プローブは配列表の配列番号１に示した９５１番から１３３６番で示した塩基配列を有するＤＮＡ断片である。ユーカリＣＡＤクローンを制限酵素ＳａｌＩで消化した後、アガロース電気泳動により分離し、ナイロン膜に転写した。このＤＮＡを転写したナイロン膜に対して、上記のＮ末端側及びＣ末端側のプローブ各々を用いてサザン分析を行なった結果、λＥＣＡＤ７４、λＥＣＡＤ２１については両プローブともにハイブリダイズした。従ってこの２つのクローンはユーカリＣＡＤ全長をコードしていると結論した。λＥＣＡＤ７２については、Ｃ末端側プローブのみハイブリダイズしなかったので、このクローンはＣ末端の一部を欠いていると考えられる。図３に斜線網掛けで示すプローブと相同性を有する断片（ＳａｌＩによって切断される断片）を宝酒造社製のプラスミドベクター（ｐＵＣ１９）に連結し、各々ｐＥＣＡＤＳ１、ｐＥＣＡＤＳ２、ｐＥＣＡＤＳ３と命名した。即ち、ｐＥＣＡＤＳ１及びｐＥＣＡＤＳ２はユーカリＣＡＤ全長をコードするＤＮＡ断片を有するプラスミドである。尚、ｐＥＣＡＤＳ１については、このプラスミドを有する大腸菌（識別のための表示：Ｅ．ｃｏｌｉｐＥＣＡＤＳ１）を通産省工業技術院、生命工学工業技術研究所、特許微生物寄託センターに寄託した（ＦＥＲＭＰ−１３６５３）。尚、ラムダファージクローンλＥＣＡＤ７４については上記機関がファージの寄託を受け付けていないために寄託はできないが、第３者からの申し出が生じた場合、ファージクローンの分譲は可能である。
【００３３】
（１２）ユーカリＣＡＤ遺伝子の解析
ｐＥＣＡＤＳ１については遺伝子断片が８ｋｂに及ぶのでゲノムＤＮＡ断片の塩基配列解析を行なうにあたって、さらに小断片化及びそのサザン分析を行なった。その結果、制限酵素（ＳａｌＩ及びＢｇｌＩ）を用いることによって得られる約３．３ｋｂｐの断片がＣＡＤ全長をコードしていることが判明したので、これについて塩基配列解析を行うことにした。この３．３ｋｂｐのゲノムＤＮＡ断片を末端平滑化した後、制限酵素（ＳｍａＩ）で消化済みの宝酒造社製のプラスミドベクター（ｐＵＣ１１９）に連結し、ｐＥＣＡＤＳ１３３と命名した。塩基配列解析は、宝酒造社製のＭ１３シークエンスキットを用いてダイデオキシ法に従って行なった。この際、プロメガ社製のデレーションキットを用いることにより、ｐＥＣＡＤＳ１３３のゲノム断片を一方向から約２５０塩基対の間隔で短かくした計９つのｐＥＣＡＤＳ１３３由来プラスミドを両方向について作成した。各々の塩基配列を約３００塩基対程度まで解析し、重複する塩基配列部分でつなぎ合わせた。ｐＥＣＡＤＳ２及びｐＥＣＡＤＳ３についても同様の塩基配列解析を行なったがこれら３つのクローンの塩基配列は全て同一であった。従って、以下にｐＥＣＡＤＳ１３３のゲノムＤＮＡの塩基配列を表５から表１１で示した配列表の配列番号２に示した。
【００３４】
【表５】

【００３５】
【表６】

【００３６】
【表７】

【００３７】
【表８】

【００３８】
【表９】

【００３９】
【表１０】

【００４０】
【表１１】

【００４１】
即ち、上記に示した配列表の配列番号２の配列は
【００３３】に表記したユーカリゲノムＤＮＡ断片の塩基配列、これによって規定されるアミノ酸配列を示すものである。この塩基配列中には、プロモーター部位及び４つの介在配列が存在した。
【００４２】
両者のアミノ酸配列は８０．７％の相同性を有することから、本ゲノムＤＮＡはューカリＣＡＤ全長を規定しているユーカリＣＡＤ遺伝子であることが明らかとなった。また、ウド及びユーカリ間において、ＣＡＤ遺伝子の塩基配列の相同性が７６．６％と高いことから（コード領域のみ）。被子植物全般でＣＡＤ遺伝子の塩基配列が類似していることが推定された。
【００４３】
本ユーカリＣＡＤ遺伝子の５′上流側の塩基配列中には、転写開始シグナルであるＴＡＴＡボックス（配列表の配列番号２の４７４から４８１）、ＣＡＴボックス（配列表の配列番号２の４２から４５、３６４から３６７及び２３から４２７）及び２カ所の繰り返し配列（配列表の配列番号２の１２３から１４０までと１５９から１７６及び４４１から４５０までと４４８から４５７）といったプロモーターに特異的な配列が存在した。即ち、このプロモーター領域はＣＡＤ遺伝子の発現において、時期及び組織特異的な制御を担っていると考えられる。
【００４４】
（１２）ウドＣＡＤのｃＤＮＡを用いたアンチセンス遺伝子の作成
ウドＣＡＤのｃＤＮＡクローン（ｐＵＣＡＤ１０）の制限酵素（ＮｏｔＩ）消化してｃＤＮＡ断片全長を取り出し、宝酒造社製のＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端処理した。また、２つの制限酵素（ＡｃｃＩ及びＫｐｎＩ）を用い消化により、約６５０ｂｐの部分断片を取り出し、同様に平滑末端処理した。一方、カリフラワーモザイクウィルス由来の３５Ｓプロモーターを有するクローンテック社製のＴｉプラスミドベクター（ｐＢＩ１２１）からＧＵＳ遺伝子を除いて平滑末端処理した。上記の平滑末端化したＣＡＤのＤＮＡ断片とベクターを各々連結し、ｃＤＮＡ断片の連結方向が異なる２種のプラスミドＤＮＡを得た。これらの内、ｃＤＮＡの連結が３５Ｓプロモーターに対して逆方向、即ち本来のアミノ酸配列を規定する向きとは反対の向き、であるプラスミドＤＮＡについて、全長断片を含むものをｐＵＣＡＤ１２１Ａと命名し、部分断片を含むものをｐＵＣＡＤ１２１ａと命名した。即ち、ｐＵＣＡＤ１２１ＡはウドＣＡＤ遺伝子全長を含むアンチセンス遺伝子、ｐＵＣＡＤ１２１ａはウドＣＡＤ遺伝子部分断片を含むアンチセンス遺伝子である。
【００４５】
（１３）ユーカリＣＡＤ遺伝子を用いたアンチセンス遺伝子の作成
ユーカリＣＡＤ遺伝子クローン（ｐＥＣＡＤＳ１及びｐＥＣＡＤＳ１３３）のインサートＤＮＡ全長を制限酵素消化してゲノムＤＮＡ断片を取り出し、宝酒造社製のＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端処理した。一方、カリフラワーモザイクウィルス由来の３５Ｓプロモーターを有するクローンテック社製のＴｉプラスミドベクター（ｐＢＩ１２１）からＧＵＳ遺伝子を除いて平滑末端処理した。上記の平滑末端化したＤＮＡを連結し、ｐＥＣＡＤＳ１及びｐＥＣＡＤＳ１３３各々に由来するゲノムＤＮＡ断片について、連結の向きが異なる２種のプラスミドＤＮＡを得た。これらの内、ゲノムＤＮＡの連結が３５Ｓプロモーターに対して逆方向、即ち本来のアミノ酸配列を規定する向きとは反対の向き、であるプラスミドＤＮＡをｐＥＣＡＤ１２１Ａと命名した。即ち、ｐＥＣＡＤ１２１ＡはユーカリＣＡＤアンチセンス遺伝子である。同様にｐＥＣＡＤＳ１３３由来のアンチセンス遺伝子をｐＥＣＡＤ１２１Ａ３３と命名した。
【００４６】
（１４）ウドＣＡＤのアンチセンス遺伝子の広葉樹への導入
ｐＵＣＡＤ１２１Ａ及びｐＵＣＡＤ１２１ａのプラスミドＤＮＡを太田らの方法（特許出願番号、平２−１６２６９５）に従って、各々ユーカリに導入し、植物体を再生させた。
【００４７】
全ての形質転換体よりゲノムＤＮＡを抽出し、各々について導入したプラスミドＤＮＡをプローブとしてサザン分析をおこなったところ、４株からｐＵＣＡＤ１２１Ａ由来のＤＮＡを、別の３株からｐＵＣＡＤ１２１ａ由来のＤＮＡを確認できた。これら７つの形質転換体からタンパク質を抽出して、ＣＡＤ活性を測定した。その結果、ｐＵＣＡＤ１２１Ａの導入された４株のＣＡＤ活性は対照植物体に比べ１４％から２７％であり、これらは平均で７８％の活性減少が示された。一方、ｐＵＣＡＤ１２１ａの導入された３株のＣＡＤ活性は対照とした植物体に比べ１６％から３５％であり、平均で７６％の活性減少が示された。
【００４８】
ｐＵＣＡＤ１２１ＡのプラスミドＤＮＡを町井らの方法（日本蚕系学会誌５９，１０５，１９９０）に従ってクワに導入し、植物体を再生させた。
【００４９】
全ての形質転換体よりゲノムＤＮＡを抽出し、各々について導入したプラスミドＤＮＡをプローブとしてサザン分析をおこなったところ、３株からｐＵＣＡＤ１２１Ａ由来のＤＮＡを確認できた。これら３つの形質転換体からタンパク質を抽出して、ＣＡＤ活性を測定した。その結果、ｐＵＣＡＤ１２１Ａの導入された４株のＣＡＤ活性は対照植物体に比べ１２％から２５％であり、これらは平均で８２％の活性減少が示された。
【００５０】
これらの結果から、本発明のウドＣＡＤの全部又は一部を用いて作成したアンチセンス遺伝子により、これらを用いて作出した形質転換植物中でのＣＡＤ活性を低減させることが可能であることが示された。これにより広葉樹におけるリグニン含量を低減させることが可能であることが示唆された。
【００５１】
（１５）ユーカリＣＡＤのアンチセンス遺伝子の広葉樹への導入
ｐＥＣＡＤ１２１Ａ及びｐＥＣＡＤ１２１Ａ３３の各々のプラスミドＤＮＡを太田らの方法（特許出願番号、平２−１６２６９５）に従ってユーカリに導入し、植物体を再生させた。
【００５２】
全ての形質転換体よりゲノムＤＮＡを抽出し、各々について導入したプラスミドＤＮＡをプローブとしてサザン分析をおこなったところ、４株からｐＥＣＡＤ１２１Ａ由来のＤＮＡを、３株からｐＥＣＡＤ１２１Ａ３３由来のＤＮＡを確認できた。これら計７つの形質転換体からタンパク質を抽出して、ＣＡＤ活性を測定した。ｐＥＣＡＤ１２１Ａの導入された４株のＣＡＤ活性は対照植物体に比べ６％から１５％であり、これらは平均で８９％の活性減少が示された。一方ｐＥＣＡＤ１２１Ａ３３の導入された３株についても同様の結果が得られ、平均で９０％のＣＡＤの活性減少が示された。
【００５３】
ｐＥＣＡＤ１２１ＡのプラスミドＤＮＡを町井らの方法（日本蚕糸学会誌５９，１０５，１９９０）に従ってクワに導入し、植物体を再生させた。
【００５４】
全ての形質転換体よりゲノムＤＮＡを抽出し、各々について導入したプラスミドＤＮＡをプローブとしてサザン分析をおこなったところ、４株からｐＥＣＡＤ１２１Ａ由来のＤＮＡを確認できた。これら計４つの形質転換体からタンパク質を抽出して、ＣＡＤ活性を測定した。その結果、ｐＥＣＡＤ１２１Ａに導入された４株のＣＡＤ活性は対照植物体に比べ１２％から２４％であり、これらは平均で８２％の活性減少が示された。
【００５５】
これらの結果から、本発明のユーカリＣＡＤのアンチセンス遺伝子により、これらを用いて作出した形質転換植物中でのＣＡＤ活性を低減させることが可能であることが示された。これにより広葉樹におけるリグニン含量を低減させることが可能であることが示唆された。
【００５６】
【発明の効果】
本発明によって初めて、ウド及びユーカリからのＣＡＤ遺伝子の単離に成功した。このことにより本発明は、各種の著効を奏する事が可能であり、それらを以下に説明する。
【００５７】
ＣＡＤの植物のリグニン生合成反応に関与しており、本発明により得られたＣＡＤ遺伝子を用いることにより、広葉樹においてＣＡＤ活性を調節可能であることを示した。従って、林木に含まれるリグニン含量を低減させることが可能であり、これは紙パルプ産業におけるリグニン除去にかかるコストを大きく節約する事になる。
【００５８】
本発明者らは、ＣＡＤが木化（即ち、リグニン化）していく組織中に特異的に発現していることを確認している。即ち、ＣＡＤ遺伝子はリグニン化組織においてのみ特異的な発現がなされている。本発明で得られたユーカリＣＡＤ遺伝子のプロモーター部位はこの特異的発現を担うものであり、これを任意の遺伝子と結合させれば、リグニン化組織に特異的に働く人工遺伝子を作製することが可能である。即ち、図３に示したプロモーター部位のＤＮＡ断片を任意の構造遺伝子と連結することによって作製した人工遺伝子を植物中に導入することにより、その構造遺伝子の規定するタンパク質をリグニン化組織で特異的に発現させることができる。その結果、リグニンの構成成分の変換やリグニンと密接な関係にあるセルロースやヘミセルロースの含量にも影響を与えることが可能となり、これらの分子育種への道が開かれる。また、本発明で得られたユーカリプロモーター部位はユーカリのみならず他の植物においても機能すると考えられ、広く植物の分子育種に利用することが可能である。
【００５９】
本発明で得られたウドＣＡＤのｃＤＮＡは、ウドＣＡＤのサブユニット全長アミノ酸を規定している。従って、このｃＤＮＡを用いれば、人工的に作られた無細胞翻訳系及び大腸菌内によって、ＣＡＤを大量に発現させ、精製、単離することが可能である。このようにして大量にＣＡＤを得られれば、これに対する各種薬剤の効果をあらゆる方面から検討することによって、ＣＡＤに作用してその活性を抑制するような薬剤の開発が可能となる。即ち、ＣＡＤに特異的な抑制剤の投与により植物体中で約２５％を占めるリグニン生合成を止め、植物を枯死させることができれば、これを農薬として利用できる。ＣＡＤは植物に特異的であり、ＣＡＤを持たない動物への影響は極めて低いと考えられる。また、このようなＣＡＤ特異的薬剤の環境への悪影響は少なく有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】精製したウドＣＡＤのアミノ末端部分及びウドＣＡＤ由来の４つのペプチドのアミノ酸配列を示した。ペプチドＮはＣＡＤのアミノ末端からの配列である。
【図２】ウドＣＡＤ由来のペプチド＃１５のアミノ酸配列を参考にして作成したオリゴヌクレオチドの塩基配列を示した。
【図３】ユーカリＣＡＤ遺伝子クローンの制限酵素地図を示した。ＣＡＤをコードしている部位は斜線網掛けで示した。塩基配列を決定した領域を矢印で示した。プロモーター部位は別に指定した範囲である。[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to a cinnamyl alcohol dehydrogenase (hereinafter also referred to as CAD) gene of udo and hardwood, a promoter site thereof, and a lignin content obtained by introducing an antisense gene prepared by using all or a part of these genes. It is about regulated hardwoods.
[0002]
Since the genes defining the amino acid sequences of udo and eucalyptus CAD of the present invention are effectively expressed in broadleaf trees and are involved in lignin synthesis in broadleaf trees, the CAD activity contained in broadleaf trees by introducing these ansetins genes into broadleaf trees Is arbitrarily changed to control the lignin content. Lignin decomposition from wood as a raw material in pulp and paper production requires a great deal of cost.Thus, if wood with a reduced lignin content is used for pulp and paper production according to the present invention, the cost required for lignin removal will be greatly increased. It can be reduced and is very effective in the field of pulp and paper production.
[0003]
[Prior art]
Lignin is a polymer complex that higher plants have universally, and is present between cells of higher plants and plays a role in maintaining the strength of the plant. Lignin biosynthesis has been studied in detail by Higuchi et al. (Wood Sci. Technol., 24, 23, 1990). In particular, cinnamyl alcohol dehydrogenase has been well studied for its enzymatic properties. In 1988, C.I. J. Lamb et al. Reported the isolation of the cDNA of the kidney bean CAD gene (Proc. Natl. Acad. Sci., 85, 5546, 1988). However, they reported in a paper published in 1990 (Plant Mol. Biol., 15, 525, 1990) that, since the protein encoded by this cDNA has high homology with maize malic enzyme, it was decided to encode CAD. He suggested a question for him. Since then, the malic enzyme has been isolated from various plants, and it has been revealed that cDNA isolated from kidney beans does not encode CAD. Such cloning errors are due to unknown biochemical properties of CAD.
[0004]
Later, several research groups reported on CAD. In October 1991, a report on the isolation of the CAD gene of tobacco (post number: 1653) was made at the 3rd International Bulletin of the International Association of Plant Molecular Biology (Tucson, USA), and a report on the nucleotide sequence and amino acid sequence was made. Was none. In addition, a report on CAD of loblolly pine was made at the same society (post number: 1111), but only a part of the amino-terminal amino acid sequence was shown. This partial amino acid sequence was published in the April 1992 issue of Plant Physiology (Plant Physiology, 98, 1364, 1992). However, loblolly pine is a gymnosperm (coniferous tree), and there is a difference in the enzymatic properties of CAD when compared with the angiosperms of the present invention, udo and eucalyptus.
[0005]
There are two types of monolignol (coniferyl alcohol (CA) and sinapyr alcohol (SA)) as monomers constituting lignin in plants. In angiosperms, these two types of monolignol form lignin mixed, while in gymnosperms, lignin is formed only with synapyr alcohol. In a report by Kutsuki et al. (Phytochemistry, 21, 19, 1982), CAD was partially purified from a plurality of angiosperms and gymnosperms, and enzymatic activities on CA and SA were measured. CAD on angiosperms was expressed on both CA and SA. Although acting equally on the contrary, gymnosperm CAD was shown to have low activity on SA. In particular, the enzyme activity of pine CAD against SA was about one-fifth or less of that of CA. Detailed data on the substrate specificity of other softwood CADs is provided in a paper on the purification of spruce (spruce) CAD (European Journal of Biochemistry, 119, 115, 1984). According to this, it is clear that spruce CAD has a 10-fold or more difference in substrate specificity for CA and SA. From the above viewpoints, it is concluded that gymnosperm (especially conifer) CAD and angiosperm CAD are different enzymes having a decisive difference in the three-dimensional structure involved in substrate recognition.
[0006]
Lignin is an unnecessary substance in the pulp and paper production process, and it costs a great deal of money to remove it. Therefore, reducing the lignin content of forest trees is an important breeding goal. Recent advances in genetic recombination technology have enabled the breeding of forest trees using this technology. Therefore, isolation and identification of genes involved in lignin biosynthesis and improvement of forest tree varieties by genetic recombination techniques using the same have been awaited.
[0007]
[Problems to be solved by the present invention]
In view of the above-mentioned situation, the present invention focuses on cinnamyl alcohol dehydrogenase from a group of enzymes involved in lignin biosynthesis for the purpose of producing a forest tree having a low lignin content and controlling the lignin content in the forest tree. The purpose of this study was to isolate and elucidate the structure of this gene.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies from various directions, and as a result, purified CAD from the lobster of Udo, determined a partial amino acid sequence, prepared an oligonucleotide probe deduced from this amino acid sequence, and prepared this probe. Using this, CAD cDNA was successfully extracted from a cDNA library derived from lobster. Furthermore, the CAD gene was successfully extracted from a eucalyptus-derived genomic library using udo CAD cDNA as a probe. The present invention has been completed as a result of further research based on the above findings. That is, the present invention relates to Udo and Eucalyptus CAD genes, and their nucleotide sequences are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 in the sequence listing.
[0009]
According to the present invention, the eucalyptus CAD gene could be detected by using the cDNA of udo CAD as a probe, but this is because the CAD base sequence has high homology between angiosperms such as udo and eucalyptus. It is nothing but being. Therefore, it is possible to extract CAD genes from all angiosperms by using Udo and Eucalyptus CAD genes and fragments thereof as probes.
[0010]
An artificial gene was constructed as an antisense gene using all or a part of the CAD gene of Udo and the CAD gene of hardwood, and this gene was electroporated (Plant Physiol., 92, 226, 1990) and used for Agrobacterium. It can be introduced and expressed in a wide range of broad-leaved trees such as udo and eucalyptus as well as mulberry and poplar according to established methods such as a gene transfer method using plant um (Plant Physiol., 93, 1110, 1990).
[0011]
According to the present invention, lignin content can be reduced by introducing a CAD antisense gene in a broadleaf tree in which plant regeneration is established. For example, in the case of wood used as a pulp material, it can be produced as a high-quality pulp material having a low lignin content.
[0012]
Hereinafter, the present invention will be described in detail based on examples. Unless otherwise specified, the procedure of the operation was in accordance with the method described in Current Protocols in Molecular Biology (edited by FM Ausubel et al., John Wiley & Sons. 1987).
[0013]
【Example】
[0014]
(1) Material
A commercially available edible udo was purchased and used as a material. Coniferyl aldehyde and synapaldehyde, which are substrates for measuring the activity of CAD (hereinafter, both may be collectively referred to as aldehyde), were synthesized according to the method of Kutsuki et al. (Mokuzai Gakkaishi 27, 520, 1981). . Coniferyl alcohol and synapyr alcohol (both are sometimes collectively referred to as alcohol) were purchased from Aldrich and the latter were sold by Gifu University and Dr. Shingo Kawai.
[0015]
(2) Method for measuring CAD activity
The oxidation reaction from alcohol to aldehyde is performed by adding 0.1 mM NADP +, 0.07 mM coniferyl alcohol or sinapyr alcohol to 200 mM potassium phosphate buffer (pH 6.25) to make the total volume 1 mL, and adding the enzyme solution to the solution. C. The reaction was carried out in a measuring cell of a spectrophotometer, the light absorption at 400 nm by the generated aldehyde was measured, and the alcohol oxidation reaction activity of CAD was calculated.
[0016]
The reduction reaction from aldehyde to alcohol is performed by adding 0.1 mM NADPH, 0.05 mM coniferyl aldehyde, or synapaldehyde to 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.8) to make the total volume 1 mL, and adding the enzyme solution at 30 ° C. I did it. The reaction was carried out in the same manner as above, and the reduced NADPH was measured by light absorption at 340 nm, and the aldehyde reduction reaction activity of CAD was calculated.
[0017]
(3) Purification of CAD
When a commercially available udo was allowed to stand for one day while absorbing water, the CAD activity increased about twice, so 4.5 kg of the udo that had been subjected to this treatment was used as a starting sample. It was cut into about 1 cm squares, mixed with 4 L of a CAD extraction buffer (100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 20 mM β-mercaptoethanol), and finely crushed using a juicer mixer. The sample solution was filtered using gauze, ammonium sulfate was immediately added to a saturation concentration of 40%, centrifuged, and the supernatant was recovered. Ammonium sulfate was added to the supernatant to a concentration of 70% saturation, centrifuged, and the precipitate was collected. The precipitate was dissolved in a CAD buffer (10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 10 mM β-mercaptoethanol) to give an enzyme solution, and the solution was subjected to gel filtration and desalted. Ammonium sulfate was added to the enzyme solution to make the final concentration 0.5M, and then the solution was subjected to hydrophobic chromatography using butyl toyopearl manufactured by Tosoh Corporation equilibrated with 0.5M ammonium sulfate to fractionate the enzyme solution. Elution was performed with a linear concentration gradient of ammonium sulfate from 0.5M to 0M. The obtained CAD fraction was desalted by gel filtration, and then subjected to ion exchange chromatography using Pharmacia Mono Q column to further finely fractionate. Elution was performed with a linear concentration gradient of 0 M to 0.3 M of sodium chloride. After the obtained CAD fraction was desalted by gel filtration, affinity chromatography using NADP + -agarose manufactured by Pharmacia was performed to elute CAD with 1 mM NADP +. This was used as the final Udo CAD specimen.
[0018]
240 μg of purified CAD was obtained by the above method. The purified CAD was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis having a concentration gradient of 8% to 25% using a fast system manufactured by Pharmacia, and the protein was detected by silver staining. As a result, a single band was confirmed. The purified CAD was subjected to gel filtration using a Superose 12 column manufactured by Pharmacia and a marker for molecular weight measurement manufactured by the company, and as a result, it was found that the molecular weight of udo CAD was 72,000. This value was similar to the reported molecular weight of CAD. Furthermore, when the same electrophoresis including SDS was performed, two bands whose molecular sizes were estimated to be 38 kDa and 39 kDa were confirmed. This suggested that udo CAD is a dimer composed of two similar subunits. On the other hand, when the Km value for the substrate was measured, a value similar to the previously reported Km value of CAD was obtained. It was also confirmed that lower aldehydes (acetaldehyde, propionaldehyde), NADH and NAD + did not become CAD substrates. From the above results, it was shown that the purified enzyme specimen had high substrate specificity for aldehyde and alcohol present only in the lignin biosynthesis system, and it was revealed that this enzyme specimen was udoCAD.
[0019]
(4) Determination of amino acid sequence of udo CAD
50 μg of the purified CAD was taken, bromide cyanide was added in a molar ratio of 100 times, and the CAD was reacted at 40 ° C. for 20 hours to partially decompose the CAD. After the reaction was completed, the sample solution was lyophilized, and the obtained peptide was dissolved in 0.1 mL of 0.1% trifluoroacetic acid (hereinafter abbreviated as TFA). This was fractionated by reverse phase chromatography using a C18 ODS column manufactured by JASCO Corporation. Using a linear concentration gradient of 0% to 80% of acetonitrile containing 0.1% TFA as the liquid phase, ultraviolet absorption at 220 nm was measured as a method for detecting the peptide. Each of the fractionated peptides was recovered by freeze-drying. The amino acid sequence of the obtained peptide was determined using an automatic amino acid sequence analyzer (Model No. 470A) manufactured by Applied Biosystems. As a result, the partial amino acid sequences of the four CADs shown in FIG. 1 were obtained.
[0020]
(5) Synthesis of oligonucleotide
The amino acid sequence of peptide # 15 was selected from the amino acid sequence shown in FIG. 1, and the corresponding oligonucleotide was chemically synthesized using a DNA synthesizer (Model No. 381A) manufactured by Applied Biosystems. FIG. 2 shows the nucleotide sequence of the synthesized oligonucleotide.
[0021]
(6) Preparation of udo cDNA library
RNA extraction was performed using the same material as that used in the CAD purification to obtain 250 μg of total RNA. Further, affinity chromatography was performed using an oligo dT column manufactured by Pharmacia to obtain 13.5 μg of poly (A) RNA. A cDNA library was prepared using 2 μg of poly (A) RNA, a cDNA synthesis kit manufactured by Pharmacia and λgt11, and a phage particle packaging kit manufactured by Stratagene. When the prepared cDNA library was infected to Escherichia coli (Y1088) and phage was propagated, it was eluted and stored in SM buffer. The total number of recombinants in the library was about 1.6 million.
[0022]
(7) cDNA isolation of Udo CAD
According to the plaque hybridization method, CAD cDNA was isolated from about 300,000 recombinants in a Udo cDNA library. The probe was a synthetic oligonucleotide represented by the formula [γ- ³² [P] Labeled by a phosphate addition reaction using ATP and T4 polynucleotide kinase was used. The temperature during hybridization was set at a relatively mild condition of 42 ° C. As a result, 20 cDNA clones having high homology with the probe were obtained, but all were found to be the same cDNA clone. Therefore, the longest cDNA fragment having about 1.4 kbp (1 bp is 1 base pair) was obtained. Was transferred to a plasmid vector (Bluescript SK +) manufactured by Stratagene, and named pUCAD10. This pUCAD10 was used for the subsequent analysis.
[0023]
(8) cDNA analysis and identification of Udo CAD
The nucleotide sequence analysis of the cDNA fragment of pUCAD10 was performed according to the dideoxy method using an M13 sequence kit manufactured by Takara Shuzo. At this time, using a deletion kit manufactured by Promega, a total of five pUCAD10-derived plasmids in which the cDNA fragment of pUCAD10 was shortened at an interval of about 250 base pairs from one direction were prepared in both directions. Each base sequence was analyzed up to about 300 base pairs and joined at overlapping base sequence portions. The nucleotide sequence of the obtained pUCAD10 is shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing shown in Tables 1 to 4.
[0024]
[Table 1]

[0025]
[Table 2]

[0026]
[Table 3]

[0027]
[Table 4]

[0028]
That is, the sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing shown above is
1 shows the nucleotide sequence of the cDNA fragment and the amino acid sequence defined thereby.
[0029]
When the amino acid sequence defined by this cDNA was compared with the amino acid sequence obtained from the amino acid sequence analysis of udo CAD, it was shown that both sequences were almost identical. The corresponding part is indicated by an underline in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. From this, it became clear that this cDNA was cDNA of udoCAD. In addition, the amino-terminal sequence (peptide N in FIG. 1) was also confirmed, indicating that the present cDNA defines the full length udoCAD.
[0030]
Unlike previous reports on CAD, it is clear that udo CAD is composed of two similar subunits, and the resulting cDNA defines the amino acid sequence of either subunit. The present invention is intended to finally suppress CAD activity in a plant by utilizing a CAD gene. That is, the object of the present invention is achieved by suppressing the expression of the subunit.
[0031]
(9) Creation of eucalyptus genome library
Calli derived from Eucalyptus (bottle oides) seedling primordia were grown on MS medium. According to the method of Hiono et al. (Summary of the 36th Meeting of the Lignin Symposium, p. 61, 1991), genomic DNA was extracted from eucalyptus callus, partially digested with a restriction enzyme (Sau3AI), and reduced to 2% to 25% A genomic DNA fragment of about 16 to 20 kbp was recovered by linear density gradient centrifugation. A eucalyptus genome library was prepared using this genomic DNA fragment and EMBL3 and phage particle packaging kit manufactured by Stratagene. The prepared cDNA library was infected to Escherichia coli (SRB) to propagate phage, and then eluted and stored in SM buffer. The total number of recombinants in the library was about 2.5 million.
[0032]
(10) Isolation of eucalyptus CAD gene
According to the plaque hybridization method, CAD genes were isolated from about 500,000 recombinants in the eucalyptus genome library. The probe used the full length of the cDNA fragment of Udo CAD [α- ³² P] Labeled using dCTP and a random primed DNA labeling kit manufactured by Boehringer was used. As a result, three CAD gene clones having high homology with the probe were obtained. These restriction maps were created. As shown in FIG. 3, two of the three clones were mutually overlapping clones, and the remaining one had a difference in the restriction enzyme site at only one site in the portion of the eucalyptus gene fragment that did not contain CAD. . This is presumed to be caused by a slight difference between homologous chromosomes that form a pair in forest trees, unlike artificially pure ones such as crops. The three clones were named λECAD74, λECAD72, and λECAD21. In order to confirm that the entire region of the CAD gene was contained in these clones, Southern analysis was performed using the N-terminal fragment and the C-terminal fragment of udoCAD cDNA as probes. The fragment used as the probe was selected from those having N-terminal side and C-terminal side from among the deletion clones created when analyzing the base sequence of pUCAD10, and the cDNA fragment was cut with a restriction enzyme and used. That is, the N-terminal probe is a DNA fragment having the nucleotide sequence of Nos. 1 to 203 shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing, and the C-terminal probe is a DNA fragment having a nucleotide sequence of No. 951 shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. It is a DNA fragment having the base sequence shown by No. 1336. The eucalyptus CAD clone was digested with a restriction enzyme SalI, separated by agarose electrophoresis, and transferred to a nylon membrane. As a result of Southern analysis using the above-mentioned N-terminal and C-terminal probes on the nylon membrane onto which this DNA was transferred, both probes hybridized with respect to λECAD74 and λECAD21. Therefore, it was concluded that these two clones encoded the full length eucalyptus CAD. As for λECAD72, only the C-terminal probe did not hybridize, so this clone is considered to lack a part of the C-terminal. A fragment having homology to the probe (a fragment cleaved by SalI) indicated by hatching in FIG. 3 was ligated to a plasmid vector (pUC19) manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd., and named pECADS1, pECADS2, and pECADS3, respectively. That is, pECADS1 and pECADS2 are plasmids having a DNA fragment encoding the full length of Eucalyptus CAD. In addition, pECADS1 was deposited in E. coli harboring this plasmid (indication for identification: E. coli pECADS1) with the Ministry of International Trade and Industry, the Institute of Biotechnology, and the Patent Microorganisms Depositary Center (FERM P-13653). The lambda phage clone λECAD74 cannot be deposited because the above organization does not accept phage deposits, but phage clones can be distributed in the event of a request from a third party.
[0033]
(12) Eucalyptus CAD gene analysis
Since pECADS1 has a gene fragment of 8 kb, small fragmentation and Southern analysis were further performed when analyzing the base sequence of the genomic DNA fragment. As a result, it was found that a fragment of about 3.3 kbp obtained by using the restriction enzymes (SalI and BglI) encodes the full-length CAD, and the nucleotide sequence was analyzed for this. After the 3.3 kbp genomic DNA fragment was blunt-ended, it was ligated to a plasmid vector (pUC119) manufactured by Takara Shuzo, which had been digested with a restriction enzyme (SmaI), and named pECADS133. The nucleotide sequence analysis was performed according to the dideoxy method using an M13 sequence kit manufactured by Takara Shuzo. At this time, a total of nine plasmids derived from pECADS133 were prepared in both directions by shortening the genomic fragment of pECADS133 at an interval of about 250 base pairs from one direction by using a deletion kit manufactured by Promega. Each base sequence was analyzed up to about 300 base pairs and joined at overlapping base sequence portions. The same nucleotide sequence analysis was performed for pECADS2 and pECADS3, but the nucleotide sequences of these three clones were all the same. Accordingly, the base sequence of the genomic DNA of pECADS133 is shown below as SEQ ID NO: 2 in the sequence listings shown in Tables 5 to 11.
[0034]
[Table 5]

[0035]
[Table 6]

[0036]
[Table 7]

[0037]
[Table 8]

[0038]
[Table 9]

[0039]
[Table 10]

[0040]
[Table 11]

[0041]
That is, the sequence of SEQ ID NO: 2 in the above sequence listing is
1 shows the nucleotide sequence of the eucalyptus genomic DNA fragment and the amino acid sequence defined thereby. In this nucleotide sequence, there was a promoter site and four intervening sequences.
[0042]
Since both amino acid sequences have a homology of 80.7%, it was revealed that the present genomic DNA is a eucalyptus CAD gene that defines the full length of the eucalyptus CAD. In addition, the homology of the nucleotide sequence of the CAD gene between Udo and Eucalyptus is as high as 76.6% (only the coding region). It was presumed that the nucleotide sequences of CAD genes were similar in all angiosperms.
[0043]
In the nucleotide sequence 5 ′ upstream of the present eucalyptus CAD gene, a TATA box (474 to 481 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) and a CAT box (42 to 45 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing; 364 to 367 and 23 to 427) and two repeat sequences (123 to 140, 159 to 176 and 441 to 450, and 448 to 457 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing). . That is, it is considered that this promoter region is responsible for time- and tissue-specific control of CAD gene expression.
[0044]
(12) Preparation of antisense gene using udoCAD cDNA
The Udo CAD cDNA clone (pUCAD10) was digested with a restriction enzyme (NotI) to extract the full-length cDNA fragment, which was blunt-ended with T4 DNA polymerase manufactured by Takara Shuzo. Further, a partial fragment of about 650 bp was taken out by digestion using two restriction enzymes (AccI and KpnI), and similarly blunt-ended. On the other hand, the GUS gene was removed from a cloned Ti plasmid vector (pBI121) having a 35S promoter derived from a cauliflower mosaic virus and blunt-ended. The blunt-ended CAD DNA fragment and the vector were each ligated to obtain two types of plasmid DNAs having different ligation directions of the cDNA fragments. Among these, plasmid DNAs in which the ligation of the cDNA is in the reverse direction to the 35S promoter, that is, the direction opposite to the direction defining the original amino acid sequence, are those containing the full-length fragment and designated as pUCAD121A. Was named pUCAD121a. That is, pUCAD121A is an antisense gene containing the full length udo CAD gene, and pUCAD121a is an antisense gene containing a partial fragment of the udo CAD gene.
[0045]
(13) Creation of antisense gene using eucalyptus CAD gene
The entire insert DNA of the Eucalyptus CAD gene clones (pECADS1 and pECADS133) was digested with a restriction enzyme to remove a genomic DNA fragment, and blunt-ended with T4 DNA polymerase manufactured by Takara Shuzo. Separately, the GUS gene was removed from a cloned Ti plasmid vector (pBI121) having a 35S promoter derived from cauliflower mosaic virus, and blunt-ended. The above-mentioned blunt-ended DNAs were ligated to obtain two types of plasmid DNAs having different ligation directions with respect to genomic DNA fragments derived from pECADS1 and pECADS133, respectively. Among these, the plasmid DNA in which the genomic DNA was linked in the reverse direction to the 35S promoter, that is, the direction opposite to the direction defining the original amino acid sequence, was designated as pECAD121A. That is, pECAD121A is a eucalyptus CAD antisense gene. Similarly, the antisense gene derived from pECADS133 was named pECAD121A33.
[0046]
(14) Introduction of UdoCAD antisense gene into hardwood
Plasmid DNAs of pUCAD121A and pUCAD121a were respectively introduced into eucalyptus according to the method of Ota et al. (Patent Application No. Hei 2-162695) to regenerate plants.
[0047]
Genomic DNA was extracted from all the transformants, and Southern analysis was performed using the introduced plasmid DNA as a probe. As a result, pUCAD121A-derived DNA was confirmed from four strains and pUCAD121a-derived DNA was confirmed from another three strains. . Proteins were extracted from these seven transformants and the CAD activity was measured. As a result, the CAD activity of the four strains into which pUCAD121A was introduced was 14% to 27% as compared with the control plant, and these showed an average reduction of 78% in activity. On the other hand, the CAD activity of the three strains into which pUCAD121a was introduced was 16% to 35% as compared with the control plants, and the activity was reduced by 76% on average.
[0048]
Plasmid DNA of pUCAD121A was introduced into mulberry according to the method of Machii et al. (Journal of the Japanese Society of Silkworm Science, 59, 105, 1990) to regenerate plants.
[0049]
Genomic DNA was extracted from all the transformants, and Southern analysis was performed using the plasmid DNAs introduced for each as a probe. As a result, DNA derived from pUCAD121A was confirmed from the three strains. Proteins were extracted from these three transformants and the CAD activity was measured. As a result, the CAD activity of the four strains into which pUCAD121A was introduced was 12% to 25% as compared with the control plant, and these showed an average 82% reduction in activity.
[0050]
These results indicate that the antisense gene prepared using all or a part of the udo CAD of the present invention can reduce the CAD activity in a transgenic plant produced using the antisense gene. Was done. This suggests that it is possible to reduce the lignin content in hardwoods.
[0051]
(15) Introduction of eucalyptus CAD antisense gene into hardwood
Plasmid DNAs of each of pECAD121A and pECAD121A33 were introduced into eucalyptus according to the method of Ota et al. (Patent Application No. Hei 2-162695) to regenerate plants.
[0052]
Genomic DNA was extracted from all the transformants and subjected to Southern analysis using the introduced plasmid DNA as a probe. As a result, DNA derived from pECAD121A from 4 strains and DNA derived from pECAD121A33 from 3 strains were confirmed. Proteins were extracted from these seven transformants in total, and CAD activities were measured. The CAD activity of the four strains into which pECAD121A was introduced was 6% to 15% as compared to the control plant, and these showed an average activity reduction of 89%. On the other hand, similar results were obtained for the three strains into which pECAD121A33 had been introduced, showing a 90% reduction in CAD activity on average.
[0053]
Plasmid DNA of pECAD121A was introduced into mulberry according to the method of Machii et al. (Journal of the Japanese Society of Silk Science, 59, 105, 1990) to regenerate plants.
[0054]
Genomic DNA was extracted from all the transformants, and Southern analysis was performed using the plasmid DNA introduced for each as a probe. As a result, DNA derived from pECAD121A was confirmed from the four strains. Proteins were extracted from these four transformants, and CAD activities were measured. As a result, the CAD activity of the four strains introduced into pECAD121A was 12% to 24% as compared to the control plant, and these showed an average 82% reduction in activity.
[0055]
From these results, it was shown that the antisense gene of eucalyptus CAD of the present invention can reduce CAD activity in a transgenic plant produced using them. This suggests that it is possible to reduce the lignin content in hardwoods.
[0056]
【The invention's effect】
According to the present invention, for the first time, CAD genes from Udo and Eucalyptus have been successfully isolated. As a result, the present invention can exert various remarkable effects, which will be described below.
[0057]
CAD is involved in the lignin biosynthesis reaction of plants, and it has been shown that CAD activity can be regulated in broadleaf trees by using the CAD gene obtained according to the present invention. Thus, it is possible to reduce the lignin content in the forest trees, which will greatly save the cost of lignin removal in the pulp and paper industry.
[0058]
The present inventors have confirmed that CAD is specifically expressed in tissues that are lignified (ie, ligninized). That is, the CAD gene is specifically expressed only in ligninated tissues. The promoter site of the eucalyptus CAD gene obtained in the present invention is responsible for this specific expression, and by linking it to any gene, it is possible to produce an artificial gene that works specifically for ligninated tissues. It is. That is, by introducing an artificial gene prepared by ligating the DNA fragment at the promoter site shown in FIG. 3 with an arbitrary structural gene into a plant, the protein defined by the structural gene can be specifically expressed in a ligninated tissue. Can be expressed. As a result, it is possible to influence the conversion of the components of lignin and the content of cellulose and hemicellulose that are closely related to lignin, thereby opening the way to molecular breeding. Further, the eucalyptus promoter site obtained in the present invention is considered to function not only in eucalyptus but also in other plants, and can be widely used for molecular breeding of plants.
[0059]
The Udo CAD cDNA obtained in the present invention defines the full length amino acid of the Udo CAD subunit. Therefore, by using this cDNA, it is possible to express, purify and isolate CAD in a large amount using an artificially created cell-free translation system and Escherichia coli. If CAD can be obtained in a large amount in this way, it is possible to develop a drug that acts on CAD and suppresses its activity by examining the effects of various drugs on the CAD from all aspects. That is, if the administration of a CAD-specific inhibitor can stop lignin biosynthesis, which accounts for about 25% of the plant, and can kill the plant, it can be used as an agricultural chemical. CAD is specific to plants and is considered to have a very low effect on animals without CAD. In addition, such CAD-specific drugs have little adverse effect on the environment and are useful.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the amino-terminal portion of purified udoCAD and the amino acid sequences of four peptides derived from udoCAD. Peptide N is the sequence from the amino terminus of CAD.
FIG. 2 shows the nucleotide sequence of an oligonucleotide prepared with reference to the amino acid sequence of peptide # 15 derived from udo CAD.
FIG. 3 shows a restriction map of a eucalyptus CAD gene clone. The site encoding CAD is indicated by hatching. The region where the nucleotide sequence was determined is indicated by an arrow. The promoter site is in the range specified separately.

Claims

A gene encoding the amino acid sequence of udo cinnamyl alcohol dehydrogenase defined by No. 1 to No. 358 shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.

A gene encoding the amino acid sequence of eucalyptus cinnamyl alcohol dehydrogenase defined by No. 1 to No. 355 shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.