JP3547879B2

JP3547879B2 - Biochemical test method using sialyl sugar chain in fibrinogen and method for purifying fibrinogen

Info

Publication number: JP3547879B2
Application number: JP34433495A
Authority: JP
Inventors: 裕之大菅; 裕章中川; 義則塚本; 禮子高橋; 吉也川村; 雅史溝上
Original assignee: 株式会社中埜酢店
Priority date: 1995-12-06
Filing date: 1995-12-06
Publication date: 2004-07-28
Anticipated expiration: 2015-12-06
Also published as: JPH09159669A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液または組織液中の糖蛋白質フィブリノーゲンに結合しているシアリル糖鎖であるモノシアリル、ジシアリル糖鎖量を測定し、それらの濃度や濃度比から肝細胞癌などの疾患を診断する生化学的検査方法と、該検査方法に用いるフィブリノーゲンの精製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肝炎をはじめとする肝疾患に対して、実に多くの検査方法がある。例えば血液中のトランスアミナーゼの定量を肝炎の一指標としたり、ＭＲＩなどの画像診断によって腫瘍の有無を確認する方法である。その中で肝機能を測定する検査の一つにシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）がある。シアル酸は一般に炎症マーカーとして利用され炎症時には高い値を示すが、様々な糖蛋白質成分としてそれぞれ機能が違うために疾患の特定の他、病態を決めることは難しいというのが現実である。
【０００３】
肝細胞癌における腫瘍マーカーは、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ビタミンＫ欠乏によって誘導される異常なプロトロンビン（ＰＩＶＫＡ−ＩＩ）定量を行うことが主流であり、肝細胞癌の疑いのある患者には大抵この検査を行っている（間中大ら，臨外，４７（５），５６９−５７１（１９９２）、菅原俊ら，診療と新薬，２６（２），２７６−２８１（１９８９））。しかし、それらの陽性率を調べてみると、ＡＦＰでは原発性肝癌の場合では７〜８割、ＰＩＶＫＡ−ＩＩでは５割であるといわれ確かにほとんどの肝細胞患者が含まれる感じに見受けられるが、両方のマーカーで陰性を示した肝細胞癌患者も数割存在することも事実である。従って、さらに診断の確率（陽性率）を上げるために、肝生検や色素注入方法のような患者に苦痛を伴う検査を行ったり、画像診断のような癌細胞の増殖のかなり進んだ段階でないと検出できないような検査を組み合わせて診断しなければならない大きな問題点も生じているのが現状である。本発明でいう肝細胞癌とは、一般的な肝癌又は肝腫瘍を示し、原発性肝癌や転移性肝癌が含まれる。特に、本発明は、原発性肝癌の検査に好適である。
【０００４】
このように、生体内の複雑な病変の情報を早期にかつ正確に捉えることは非常に難しい。このため、的中率の高い検査方法の探索研究が緊急、かつ、きわめて重要な課題になっている。
糖鎖の生体に関する情報の有意義性については、近年生化学、医学の知見より、臨床利用についての要望がさらに一層高まってきている。しかし微量な糖鎖の変化を検査する方法は、レクチン、抗体等で一部試みられてはいるが定量性に乏しく微量の変化は検出しにくいという欠点があり、また、それら疾患で変化することが明らかな例えばアルファ−１−酸性糖蛋白質や絨毛性ホルモンなどの糖蛋白質は、その存在量（濃度）が少なく、各患者より、定量性が高い方法で分析するだけの試料を得るのが困難であり、また疾患により糖鎖の濃度や組成や構造が変化することが予想され、糖鎖が臨床検査に利用できることが予想されていても各患者より試料を精製し、その糖鎖を詳細に分析することは困難であった。
【０００５】
このような現状に鑑み我々は、血液中に比較的多く存在する糖蛋白質、フィブリノーゲンのシアリル糖鎖に注目し、臨床検査への利用を鋭意研究してきた。
フィブリノーゲンは約８割が血液、約２割が組織液に分布する分子量３４万の巨大な糖蛋白質であり、肝細胞（肝実質細胞）中で合成される。フィブリノーゲンはＡα、Ｂβ、γの３つのポリペプチド鎖がジスルフィド結合して形成されるサブユニット構造（Ａα−Ｂβ−γ）が２個さらにジスルフィド結合した構造（Ａα−Ｂβ−γ）_２を形成している。フィブリノーゲン１分子中のシアリル糖鎖の数は４本でフィブリノーゲン分子中のＢβ、γ鎖に付加され、フィブリノーゲン分子全体の約３％を占める。健常人の場合、血漿１ｍｌあたり約３ｍｇ含まれている。フィブリノーゲンは血液中からでも組織液中からでも採取は可能であるが、上記したフィブリノーゲンの存在量が、血液中に約８割と多く、また組織片を採取することなく精製が可能である等の点から、血液（血漿）から精製した方が好ましい。フィブリノーゲンの糖鎖は全てアスパラギンに結合しており、糖鎖の構造としては、いわゆるバイアンテナリ（２分岐アンテナ様）糖鎖構造が骨格になって糖鎖の２個所のガラクトース残基非還元末端にシアル酸が１つ（モノシアリル糖鎖）ないしは２つ（ジシアリル糖鎖）の２種類が存在する（松田道生ら編，止血・血栓・線溶，１７４−１８０，（１９９４）中外医学社出版）。フィブリノーゲンのシアリル糖鎖が２種類しか存在しないので、疾患によるフィブリノーゲンのシアリル糖鎖の構造変化も２種類しか存在しないことや、フィブリノーゲンが、同じ構造をしたサブユニット（Ａα−Ｂβ−γ）から形成しているため、変化したシアリル糖鎖を特定し分析することは、今の分析技術ではほとんど不可能である。しかし、本発明者らは、１）フィブリノーゲンは肝細胞で産生されること、２）シアル酸は炎症反応等により増加する傾向にあること、また、肝細胞癌患者でフィブリノーゲンのシアル酸が増加しているという報告がされている（ＨａｒｖｅｙＲ．Ｇｒａｌｎｉｃｋｅｔ．ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２９９（５），２２１−２２６（１９７８））が、しかし、肝細胞癌等の肝疾患が起きることによって、フィブリノーゲン糖鎖構造が変化することを発明者らは初めて見出した。
【０００６】
フィブリノーゲンのシアリル糖鎖の分離、分析は例えば陰イオンカラムやＯＤＳカラム等を用いた高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと略す）による方法が一般的で簡単である。ＯＤＳカラムを用いたフィブリノーゲンのＨＰＬＣ溶出パターンは、第１図に示すとおりである。健常者の場合のフィブリノーゲンシアリル糖鎖のモノシアリル糖鎖、ジシアリル糖鎖の割合はほとんど一定している。シアリル糖鎖は生体内の環境の変化に支配されているので疾患との関わりが深いということ、また、フィブリノーゲンは肝細胞で産生されるということから、肝細胞癌のような肝臓の異変時には、フィブリノーゲンのシアリル糖鎖にも必ず異変が起きていることは予想できることである。本発明者らは、健常人と肝炎、肝細胞癌患者のフィブリノーゲン糖鎖を分析した結果、肝細胞癌患者におけるフィブリノーゲンのシアリル糖鎖の含量とその比率が他に比べて大きく変化しているという事実を発見し、臨床検査方法として開発させた。
【０００７】
フィブリノーゲンの精製は松田道生らの論文（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７２，１０３４−１０４１（１９８３））による方法が良く知られている。以下に操作方法を順を追って説明する。
１）リジン結合セファロース、ゼラチン結合セファロース（共にファルマシア社製）の２種類のアフィニティ担体を別々に詰めたカラムを連結させる。これらのアフィニティ担体は、プラスミノーゲン、プラスミノーゲン活性化因子、ｒＲＮＡ、フィブロネクチン等を特異的に結合させる作用がある。
２）血漿を通し、血漿中のフィブロネクチンやプラスミノーゲン等をアフィニティ担体と結合させて除去し、素通り画分を得る。
３）フィブリノーゲンを含んだ素通り画分に対して２５％飽和になるように硫酸アンモニウムを加える。
【０００８】
この方法の問題点として次の２点が挙げられる。
・２つのカラムに別々にアフィニティ担体を詰め、これらを連結したものを用いてフィブリノーゲンを精製させるため１検体の精製に要する作業時間が長く、また手間もかかり、１検体づつ精製するので、多検体を扱う臨床検査としては不向きである。
・この方法で得られた素通り画分中には、血液成分中最も量の多い糖蛋白質であるＩｇＧが含まれ、硫安沈殿の際にＩｇＧも一緒に混在して沈殿してくることがあり、フィブリノーゲン糖鎖を分析するサンプルに使用することは不向きである。
【０００９】
以上の問題点から、本発明者らは短時間で多検体のフィブリノーゲンを精製する方法を鋭意研究した結果、上記２種類のアフィニティ担体にＩｇＧを結合させるプロテインＧ（ファルマシア社製）を加えて３種類の担体を混合させ、これをメンブレンフィルター付き容器に詰めたものを用いて遠心力によって連続的に流動させてフィブリノーゲンを分画すれば、一度に多検体を処理でき、しかも夾雑物のほとんどないフィブリノーゲンを精製することができた。さらに試験を積み重ねた結果、血漿１００μｌ程度でフィブリノーゲンを精製することに成功し、フィブリノーゲン糖鎖の変化を詳細に分析することができるようになった。この方法は通常の臨床検査で採血した残りの血漿で本発明で定量する糖鎖が分析でき、患者に余計な負担をかけることなく糖鎖を分析する精製方法として画期的な方法である。さらに上記の３種類のアフィニティ担体に別の種類の例えば血液中のプロトロンビンと結合するアルギニンセファロース（ファルマシア社製）を付加すれば、精製効率をさらに上昇させることができる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の生化学検査方法は、上記のような事情を鑑みてなされたものであり、フィブリノーゲンのシアリル糖鎖の有する生体情報により新規な生化学検査方法を提供することと該検査方法に用いるフィブリノーゲンの効率的な精製方法を提供することを目的としている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一は、フィブリノーゲンから切り出したシアリル糖鎖を疾患の指標とすることを特徴とする疾患の生化学検査方法である。
本発明の第二は、疾患の指標が、モノおよび／またはジシアリル糖鎖の濃度、またはモノシアリル糖鎖対ジシアリル糖鎖の濃度比もしくはクロマトグラムの相対面積比であることを特徴とする上記記載の生化学検査方法である。
【００１２】
本発明の第三は、疾患が、肝細胞癌であることを特徴とする上記記載の生化学検査方法である。
本発明の第四は、上記記載の生化学検査方法と、ＡＦＰ法および／またはＰＩＶＫＡ−ＩＩ法とを組み合わせて肝細胞癌の検査を行うことを特徴とする肝細胞癌の生化学検査方法である。
【００１３】
本発明の第五は、プラスミノーゲン、プラスミノーゲン活性化因子、ｒＲＮＡ、フィブロネクチン、ＩｇＧなどの血液成分と親和性のある少なくとも３種類のアフィニティ担体を用いて血漿又は組織液からフィブリノーゲンを精製することを特徴とするフィブリノーゲンを精製する方法である。
本発明の第六は、アフィニティ担体を、メンブレンフィルタ付きの容器内で混合もしくは重層してフィブリノーゲンを精製することを特徴とする上記記載のフィブリノーゲンの精製方法である。
【００１４】
本発明において、モノシアリル糖鎖とは、下記の式（Ｉ）で示すようにバイアンテナリ（２分岐アンテナ様）糖鎖構造が骨格になって糖鎖の２個所のガラクトース残基非還元末端の内の一つにシアル酸が１つ結合した糖鎖である。また、ジシアリル糖鎖とは、下記の式（ＩＩ）で示すようにバイアンテナリ（２分岐アンテナ様）糖鎖構造が骨格になって糖鎖の２個所のガラクトース残基非還元末端にシアル酸が一つづつ結合した糖鎖である（図１において、ピークＡがモノシアリル糖鎖、ピークＢがジシアリル糖鎖を示す）。
【００１５】
【化１】

【００１６】
【化２】

【００１７】
（式中、Ｓはシアル酸、Ｇはガラクトース、ＧＮがＮ−アセチルグルコサミン、Ｍはマンノースを表す。）
本発明による生化学検査方法は、本発明者らによって行われてきたフィブリノーゲンついての一層正確な病変の情報の取得と、的中率の高い診断法としての確立に関する研究に基づいて完成されたものである。そしてこの方法は、血液中のフィブリノーゲン糖鎖が肝細胞癌における量的変化だけでなく、質的変化、即ちフィブリノーゲン結合糖鎖のプロフィールを詳細に検討することによって、的確な肝細胞癌の情報を取得し、従来の肝細胞癌の腫瘍マーカーと組み合わせることにより、より陽性率の高い肝細胞癌の診断法として確立すべく努めてきた成果によるものである。
【００１８】
本発明に関する２つのシアリル糖鎖を定量する方法としては、たとえば、ＨＰＬＣが有効である。
以下、本発明を詳細に説明する。
（ヒト血漿からのフィブリノーゲン精製方法）
体液からフィブリノーゲンを精製する方法は、従来の技術の項目で述べた松田らのアフィニティカラムを用いた方法を適用することも可能であるが、精製度や作業の点での問題もあるため、ＩｇＧのような血液中に多く存在する成分を効率良く除去するためには松田らが用いた２種の担体のほか、ＩｇＧに親和性を示す担体を用いてフィブリノーゲンを精製することが望ましい。ＩｇＧに親和性を示す担体としては、プロテインＧが結合した担体を例示することができる。
【００１９】
血漿からフィブリノーゲンを精製する具体的な方法を以下に示す。まず、メンブレンフィルタ付き容器（例えばミリポア社ウルトラフリー）内でフィブロネクチン親和性アフィニティ担体、プラスミノーゲン、プラスミノーゲン活性化因子、ｒＲＮＡ親和性アフィニティ担体、ＩｇＧ親和性アフィニティ担体の３種のアフィニティ担体（例えば、リジン結合セファロース、ゼラチン結合セファロース、プロテインＧ結合セファロース（共にファルマシア社製））とプラスミノーゲン、プラスミノーゲン活性化因子、ｒＲＮＡ、フィブロネクチン、ＩｇＧ等の血液成分を結合させる。メンブレンフィルタで濾過することにより、ほとんど夾雑物の除かれたフィブリノーゲンを得ることができる。この３種のアフィニティ担体の詰め方は３種を層状にして詰めても混合させても同じ効果が得られる。ただ層状にして詰めるやり方は、技術的に手間がかかるので、多検体を扱う臨床検査に使用する場合には不向きである。従って同じ効果で比較的簡単にできる３種のアフィニティ担体を混合して詰めるやり方が良い。
（糖鎖の切り出し・精製）
糖鎖を調整する方法としては、酵素を用いて糖鎖を遊離する方法と、無水ヒドラジンにより化学的に糖鎖を切り出す方法とがある。何れの方法を用いても本分析結果に影響はしないが、酵素を用いた方法の方が熟練を必要とせず、毒物指定されている無水ヒドラジンを使用しないで済むため有利である。しかし、近年この無水ヒドラジンによる糖鎖の遊離を行う装置が市販されており、それらを利用しても差し支えない。酵素を用いる方法としては糖鎖をできるだけシアル酸の結合した状態で切り出すことが必要十分な条件である。従って強酸性下での酵素消化は糖鎖中のシアル酸の解離が起こる可能性があり、望ましくない。その上では蛋白分解酵素としてトリプシン、キモトリプシンを用いた方がシアル酸の解離を防ぐことができる。蛋白分解の後、グリコアミダーゼＡで糖鎖を切り出し、後で糖鎖を精製しやすいようにプロナーゼ消化する。切り出した糖鎖を陽および陰イオン交換樹脂を用いて精製する。
（糖鎖の標識化）
糖鎖を標識する方法としては、２アミノピリジンで蛍光標識する方法と、トリチウムラベルで放射線標識する方法が一般的である。本発明者らは、一般の研究室で取り扱いやすいことと、また高速液体クロマトグラフで検出しやすいこと、分離が良くなることにより、２アミノピリジンで蛍光標識する方法が好適である。２アミノピリジンで蛍光標識する方法としては、長谷等によって開発された２アミノピリジン塩酸溶液を蛍光標識剤として、水素化シアノホウ素ナトリウムを還元剤として使用する方法（Ｓ．Ｈａｓｅ，Ｔ．Ｉｂｕｋｉ，Ｔ．Ｉｋｅｎａｋａ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５，１９７−２０３（１９８４））と、近藤等が開発した２アミノピリジン無水酢酸溶液を蛍光標識剤として、ボランジメチルアミンコンプレックスを還元剤として使用する方法（Ｋｏｎｄｏ，ｅｔ．ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４，２１６９−２１７０（１９９０））があるが、何れの方法でも本分析結果に影響しないが、長谷等の方法が用意する装置が少なく、手軽にできる。近藤等の方法はその方法を行う装置（宝酒造製）が市販されており、それを利用しても良い。蛍光標識化した糖鎖は、化学的に安定であり、ＨＰＬＣ分析により短時間で高感度に分析できるという利点がある。
（糖鎖の分析）
本発明においては、以上のようにフィブリノーゲンから切り出され、標識化されたシアリル糖鎖を指標として疾患の検査を行う。ここで検査の対象とすることのできる疾患としては、肝細胞癌を挙げることができるが、これに限定されない。具体的な検査方法としては、モノおよび／またはジシアリル糖鎖の濃度を指標として行う方法と、モノシアリル糖鎖対ジシアリル糖鎖の濃度比を指標として行う方法の二つの方法を挙げることができる。いずれの方法も、まず、蛍光標識化した糖鎖をゲル濾過により精製し、ＨＰＬＣ分析に供する。ＨＰＬＣに用いるカラムとしては、ＯＤＳ−シリカカラムが好ましいが、ＯＤＰカラムやＤＥＡＥカラムを用いても差し支えない。次に、ＨＰＬＣの溶出ピークパターンから、フィブリノーゲンのシアリル糖鎖の含量（濃度）に対応するモノシアリル、ジシアリル糖鎖のピーク面積値を割り出す。上記のモノおよび／またはジシアリル糖鎖の濃度を指標とする方法では、モノシアリル糖鎖のピーク面積値とジシアリル糖鎖のピーク面積値とから、両糖鎖の濃度を算出する。いずれか一方の糖鎖の濃度あるいは両者の濃度を健常人あるいは良性疾患患者の濃度と比べて、高値低値によって肝細胞癌などの各種疾患について陽性であるか否かを判定する。モノシアリル糖鎖対ジシアリル糖鎖の濃度比を指標とする方法では、モノシアリル糖鎖のピーク面積値とジシアリル糖鎖のピーク面積値とから、ジシアリル糖鎖量に対するモノシアリル糖鎖量の比を算出する。この量比の値を健常人、あるいは良性疾患患者の値と比べて、高値低値によって肝細胞癌などの各種疾患について陽性であるか否かを判定する。
【００２０】
以上により、この発明した方法は、診断法として有効な情報を実用的な処理に適応しえるものとした。
以下実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、これら実施例に限定されるものではない。
【００２１】
【発明の実施の態様】
【００２２】
【実施例】
〔実施例１〕
健常人、慢性Ｃ型肝炎、原発性肝細胞癌患者の血漿を用いてフィブリノーゲン及びフィブリノーゲン糖鎖を精製し、ＨＰＬＣ分析した。ジシアリル糖鎖の変化量を調べた。
【００２３】
リジン結合セファロース、ゼラチン結合セファロース、プロテインＧ結合セファロース（共にファルマシア社製）を５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．５にそれぞれ膨潤させた。検査検体１件当たり膨潤ゲル各２５０μｌを混合させてメンブレンフィルター付き容器（商品名ウルトラフリーチューブ、ミリポア社製）に詰めた。次に血漿１００μｌを入れて、プラスミノーゲン、プラスミノーゲン活性化因子、ｒＲＮＡ、フィブロネクチン等を上記アフィニティ担体と結合させて遠心分離（１５００ｒｐｍ×１０秒）した。さらに上記バッファーを２ｍｌ加えて再び遠心分離（上記）を行い、素通りした画分を得た（溶液量として約２．５ｍｌ）。以上の作業は約２時間で終了した。なお、常法ではフィブリノーゲン１検体精製するのに約５時間必要であるが、この方法では遠心分離器の作業可能な検体数に応じて数１０検体を一度に取扱うことができ、検体数が増えても約２時間で終了するので効率的である。
【００２４】
得られた素通り画分に対して、２５％飽和となるように硫酸アンモニウムを加えて混合させることにより、フィブリノーゲン（約０．３ｍｇ）を沈殿させた。フィブリノーゲン溶液を遠心分離（２５００ｒｐｍ×２０分）にかけ、得られた沈殿（フィブリノーゲン）に０．１Ｍトリス−塩酸、２％塩化ナトリウム溶液ｐＨ８．２を加えてフィブリノーゲンを溶かした。健常人の場合、血漿１００μｌから約０．３ｍｇフィブリノーゲンを得ることができた。
【００２５】
フィブリノーゲンの精製具合はＳＤＳ電気泳動で確認した。フィブリノーゲンは健常人の血漿から精製し、対照として市販のヒトフィブリノーゲン、ＩｇＧ試薬（以上Ｓｉｇｍａ社製）を用いて蛋白非還元の状態でそれぞれ同量（各１０μｇ）を泳動させた。
電気泳動の条件
・使用電源：ＡＴＴＯＤＩＧＩ−ＰＯＷＥＲＳＪ−１０８１
・使用電気泳動装置：テフコ・セル・ミニＭｏｄｅｌＴＣ−８０８（ＴＥＦＣＯ社製）
・使用ゲル：ＳＤＳ−ｍｉｎｉ（ＴＥＦＣＯ社製）、ゲル濃度４％、厚さ１．５ｍｍ
・サンプリング：

【００２６】
各サンプル１０μｇ分の溶液量に対してサンプルバッファーを加えて５倍希釈し、沸騰水中で５分間加熱したものを泳動した。
・泳動条件：２７ｍＡ定電流で７０分
図２に結果を示した。精製物（レーン３）のバンドは、市販のフィブリノーゲン（レーン１）と同じ位置にあり、これ以外にバンドは見えないことが確認できた。さらに後に述べるＨＰＬＣによる分析結果によっても市販品と精製物とは同一のクロマトグラムを示したことから、上記方法によって、フィブリノーゲンは精製できた。
【００２７】
次に得られたフィブリノーゲン溶液を加熱処理（９０℃、１０分）した後、トリプシン（Ｓｉｇｍａ製）、キモトリプシン（ＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を加えて酵素消化した。反応後再び加熱処理（９０℃、１０分）して溶液を濃縮乾固した後、反応溶液をｐＨ４〜６に調整し、グリコペプチダーゼＡ（生化学工業製）を加え酵素により糖鎖を遊離させた。次にプロナーゼ（商品名アクチナーゼＥ、科研製薬製）を加えてペプチドをさらに細かく切断した後、固形物を遠心分離により除き、上清を予めイオン交換水で平衡化させた陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂で脱塩、精製した。脱塩、精製溶液を濃縮乾固し、２−アミノピリジン１ｇを５６０μｌの濃塩酸に溶解した溶液４０μｌを加え、９０℃、１０分間置いた後、２０ｍｇの水素化シアノホウ素ナトリウムを１２μｌの水に溶解させた水溶液４μｌを加え９０℃で１時間反応させた。セファンデックスＧ−１５（ファルマシア製）のカラムを用いて糖鎖を精製した。２−アミノピリジン−糖鎖画分を集め、乾固した後ＨＰＬＣ分析に供した。
【００２８】
ＨＰＬＣの分析条件
・溶出液Ａ：１０ｍＭリン酸一ナトリウム溶液（ｐＨ３．８）
・溶出液Ｂ：溶出液Ａにｎ−ブタノールを最終濃度０．５％になるように加えた液
・カラム：ＮａｋａｎｏｐａｋＯＤＳ−Ａ（６．０φ×１５０ｍｍ、中埜酢店製）
・蛍光検出器：ＳＨＩＭＡＤＺＵＲＦ−５５０（島津製作所製）
・検出：蛍光検出（励起波長：３２０ｎｍ、蛍光波長：４００ｎｍ）
・溶出液流速：１ｍｌ／分
・糖鎖の溶出条件：溶出液Ｂの濃度を分析開始から６０分までに、２０％から５０％に上昇させる条件
ＨＰＬＣ分析後の解析
ＨＰＬＣによって検出されたクロマトグラムから、フィブリノーゲン糖鎖のモノシアリル糖鎖とジシアリル糖鎖のピーク（図１参照）の面積値を得る。肝細胞癌ではモノシアリル糖鎖に対するジシアリル糖鎖の割合が増えてくる（図３−Ｂ）ので、面積値からジシアリル糖鎖の増加量に注目して、次のように面積比（量比）を算出する：
ジシアリル糖鎖の増加割合＝ジシアリル糖鎖のピーク面積／モノシアリル糖鎖のピーク面積
（以下ｄｉ／ｍｏｎｏと略す）
結果
ここで用いた検体数は、健常人（７例）、慢性Ｃ型肝炎（４０例）、原発性肝癌（３７例）であった。添付した図３は、上記のようにして得られたＨＰＬＣの溶出パターンを示し、大きく２種類存在するフィブリノーゲン糖鎖が、ＯＤＳ−シリカカラムへの微妙な親和性の差異に基づいて得られた溶出プロフィールを示している。先に述べたように、健常人のフィブリノーゲン糖鎖ではモノシアリル、ジシアリル糖鎖の量割合がほとんど一定である（図３−Ａ）。
【００２９】
この結果を基に統計的に健常人を含む各疾患グループに分けて解析し、健常人と慢性Ｃ型肝炎患者、健常人と肝細胞癌患者、慢性Ｃ型肝炎患者と肝細胞癌患者との間に有意な差が果たして出るか調べてみた（図４）。その結果健常人と慢性Ｃ型肝炎患者との間では有意な差は出なかったが、健常人と肝細胞癌及び肝炎患者と肝細胞癌患者との間では有意差が見られた（Ｐ＜０．００１）。さらにこの図から慢性Ｃ型肝炎患者のｄｉ／ｍｏｎｏ値の上限が０．８なので、肝細胞癌患者でｄｉ／ｍｏｎｏ値が０．８以上（つまり陽性）の例が３７例中２８例であり、この結果、陽性率として７５．７％であった。
〔実施例２〕
さらに肝細胞癌患者３７例の中で、フィブリノーゲンのシアリル糖鎖のｄｉ／ｍｏｎｏ値と、腫瘍マーカーとしてよく利用されているＡＦＰとＰＩＶＫＡ−ＩＩとの陽性率の比較を行った。この結果を表１と図５に示した。
【００３０】
【表１】

【００３１】
この結果、フィブリノーゲンのシアリル糖鎖分析によってのみ陽性と認められた患者７例を加えると、ＡＦＰとＰＩＶＫＡ−ＩＩのみで判定された陽性率が７５．７％から９４．６％に上昇した。このことから、本発明は、肝細胞癌の腫瘍マーカーとして有用であり、既存の検査方法との併用によって肝細胞癌の陽性率を高いレベルで検査できることから、非常に効果的であることがわかる。
【００３２】
【発明の効果】
本発明の生化学検査方法により、肝細胞癌をはじめとする各種疾患をより高い確率で発見することができる。
また、本発明のフィブリノーゲンの精製方法により、簡易な操作で夾雑物の少ないフィブリノーゲンを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】フィブリノーゲンから切り出したシアリル糖鎖のＨＰＬＣ溶出パターンを示す図である。
【図２】本発明の精製方法により精製されたフィブリノーゲンのＳＤＳ電気泳動を示す写真である。
【図３】健常人及び肝細胞癌患者のシアリル糖鎖のＨＰＬＣ溶出パターンを示す図である。
【図４】健常人、慢性Ｃ型肝炎患者、肝細胞癌患者のｄｉ／ｍｏｎｏ値を示す図である。
【図５】ｄｉ／ｍｏｎｏ値、ＡＦＰ法、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ法の３種の検査方法による陽性率の比較を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention measures the amount of monosialyl and disialyl sugar chains that are sialyl sugar chains bound to the glycoprotein fibrinogen in blood or tissue fluid, and diagnoses diseases such as hepatocellular carcinoma based on their concentrations and concentration ratios. And a method for purifying fibrinogen used in the method.
[0002]
[Prior art]
There are indeed many test methods for liver diseases such as hepatitis. For example, it is a method in which quantification of transaminase in blood is used as an index of hepatitis, or the presence or absence of a tumor is confirmed by image diagnosis such as MRI. One of the tests for measuring liver function is sialic acid (N-acetylneuraminic acid). Sialic acid is generally used as an inflammation marker and shows a high value during inflammation. However, since it has different functions as various glycoprotein components, it is a reality that it is difficult to specify a disease and determine a disease state, in reality.
[0003]
As a tumor marker in hepatocellular carcinoma, the mainstream is to quantify abnormal prothrombin (PIVKA-II) induced by alpha-fetoprotein (AFP) and vitamin K deficiency. Laboratory tests have been conducted (Manaka Dai et al., Jinjin, 47 (5), 569-571 (1992), Sugahara Shun et al., Medical and New Medicine, 26 (2), 276-281 (1989)). However, when examining the positive rates thereof, it is said that AFP is 70 to 80% in the case of primary liver cancer and PIVKA-II is 50%. It is also true that there are several percent of hepatocellular carcinoma patients who show negative results for both markers. Therefore, in order to further increase the probability of diagnosis (positive rate), it is not a very advanced stage of cancer cell growth, such as performing a painful test on the patient such as a liver biopsy or a dye injection method, or imaging. At present, there is a major problem that must be diagnosed by combining tests that cannot be detected. The hepatocellular carcinoma referred to in the present invention refers to general liver cancer or liver tumor, and includes primary liver cancer and metastatic liver cancer. In particular, the present invention is suitable for testing primary liver cancer.
[0004]
As described above, it is very difficult to quickly and accurately capture information on a complicated lesion in a living body. For this reason, the search and research for an inspection method with a high accuracy is an urgent and extremely important task.
Regarding the significance of the information on the living body of the sugar chain, in recent years, requests for clinical use have been further increased based on biochemical and medical findings. However, although some methods for examining minute changes in sugar chains have been tried with lectins, antibodies, etc., they have the disadvantages of poor quantitativeness and are difficult to detect minute changes. For example, glycoproteins such as alpha-1-acid glycoprotein and chorionic hormone have low abundances (concentrations), and it is difficult to obtain a sample that can be analyzed by a method with high quantitativeness from each patient. In addition, it is expected that the concentration, composition, and structure of sugar chains will change due to disease, and even if sugar chains are expected to be available for clinical testing, a sample is purified from each patient and the sugar chains are analyzed in detail. It was difficult to analyze.
[0005]
In view of such circumstances, we have focused on sialyl sugar chains of fibrinogen, a glycoprotein that is relatively abundant in blood, and have been studying its use for clinical tests.
Fibrinogen is a giant glycoprotein having a molecular weight of 340,000, which is distributed about 80% in blood and about 20% in tissue fluid, and is synthesized in hepatocytes (liver parenchymal cells). Fibrinogen has a structure in which two subunit structures (Aα-Bβ-γ) formed by disulfide bonding of three polypeptide chains of Aα, Bβ, and γ are further disulfide bonded (Aα-Bβ-γ) ₂ Is formed. The number of sialyl sugar chains in one molecule of fibrinogen is four, which is added to the Bβ and γ chains in the fibrinogen molecule, and accounts for about 3% of the whole fibrinogen molecule. In a healthy person, about 3 mg is contained per 1 ml of plasma. Although fibrinogen can be collected from blood or tissue fluid, the amount of the above-mentioned fibrinogen is as high as about 80% in blood, and it can be purified without collecting tissue fragments. Therefore, it is preferable to purify from blood (plasma). All of the sugar chains of fibrinogen are bound to asparagine, and the sugar chain structure is a so-called biantennary (two-branch antenna-like) sugar chain structure and the non-reducing end of two galactose residues in the sugar chain Sialic acid has one type (monosialyl sugar chain) or two types (disialyl sugar chain) (Michio Matsuda et al., Edited by Haemostasis, Thrombus, Fibrinolysis, 174-180, published by Chugai Medical Co., Ltd.) . Since there are only two types of sialyl sugar chains of fibrinogen, there are only two types of structural changes in sialyl sugar chains of fibrinogen due to disease, and fibrinogen is formed from subunits (Aα-Bβ-γ) having the same structure. Therefore, it is almost impossible to identify and analyze the changed sialyl sugar chain with the current analysis technology. However, the present inventors have found that 1) that fibrinogen is produced in hepatocytes, 2) that sialic acid tends to increase due to inflammatory reactions and the like, and that sialic acid of fibrinogen increases in hepatocellular carcinoma patients. (Harvey R. Granick et. Al., N. Engl. J. Med., 299 (5), 221-226 (1978)), however, liver diseases such as hepatocellular carcinoma have been reported. The inventors have found for the first time that the occurrence of the above causes a change in the fibrinogen sugar chain structure.
[0006]
For separation and analysis of sialyl sugar chains of fibrinogen, a method by high performance liquid chromatography (hereinafter abbreviated as HPLC) using, for example, an anion column or an ODS column is general and simple. The HPLC elution pattern of fibrinogen using an ODS column is as shown in FIG. The ratio of monosialyl and disialyl sugar chains of fibrinogen sialyl sugar chains in healthy subjects is almost constant. Since sialyl sugar chains are governed by changes in the environment in the living body, they are deeply involved in the disease, and since fibrinogen is produced in hepatocytes, when liver abnormalities such as hepatocellular carcinoma occur, It is expected that catabolic is always occurring in the sialyl sugar chain of fibrinogen. The present inventors have analyzed the fibrinogen sugar chains of healthy people and hepatitis, hepatocellular carcinoma patients, and found that the content and ratio of sialyl sugar chains of fibrinogen in hepatocellular carcinoma patients are significantly different from others. He discovered the fact and developed it as a clinical test method.
[0007]
For the purification of fibrinogen, a method according to a paper by Michio Matsuda et al. (J. Clin. Invest. 72, 1034-1041 (1983)) is well known. The operation method will be described below step by step.
1) A column in which two types of affinity carriers, lysine-bound Sepharose and gelatin-bound Sepharose (both manufactured by Pharmacia), are separately packed is connected. These affinity carriers have an action of specifically binding plasminogen, plasminogen activator, rRNA, fibronectin and the like.
2) Through plasma, fibronectin, plasminogen and the like in the plasma are removed by binding to an affinity carrier to obtain a flow-through fraction.
3) Ammonium sulfate is added so as to be 25% saturated with respect to the flow-through fraction containing fibrinogen.
[0008]
There are the following two problems with this method.
・ Affinity carriers are packed separately in two columns, and fibrinogen is purified by using those that are connected to each other to purify fibrinogen. The work time required to purify one sample is long, it is troublesome, and purification is performed for each sample. It is not suitable as a clinical test dealing with.
-The flow-through fraction obtained by this method contains IgG, which is the most abundant glycoprotein in blood components, and may precipitate together with IgG during ammonium sulfate precipitation, It is not suitable for use in samples for analyzing fibrinogen sugar chains.
[0009]
In view of the above problems, the present inventors have intensively studied a method for purifying multiple samples of fibrinogen in a short time, and as a result, added protein G (manufactured by Pharmacia) that binds IgG to the above two types of affinity carriers. A mixture of different types of carriers, which are packed in a container with a membrane filter and continuously flowed by centrifugal force to fractionate fibrinogen, can process multiple samples at once, and have almost no impurities Fibrinogen could be purified. As a result of further tests, fibrinogen was successfully purified from about 100 μl of plasma, and the change in the sugar chain of fibrinogen could be analyzed in detail. This method is an epoch-making method as a purification method in which a sugar chain to be quantified in the present invention can be analyzed from the remaining plasma collected by a normal clinical test, and the sugar chain is analyzed without imposing an extra burden on the patient. Further, if another kind of arginine sepharose (manufactured by Pharmacia), which binds to prothrombin in blood, is added to the above three kinds of affinity carriers, the purification efficiency can be further increased.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
The biochemical test method of the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a novel biochemical test method based on biological information of a sialyl sugar chain of fibrinogen and fibrinogen used in the test method. It is an object of the present invention to provide an efficient purification method.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
A first aspect of the present invention is a method for biochemical examination of a disease, characterized in that a sialyl sugar chain cut out from fibrinogen is used as an indicator of the disease.
The second aspect of the present invention is characterized in that the indicator of the disease is a mono- and / or disialyl sugar chain concentration, or a monosialyl sugar chain to disialyl sugar chain concentration ratio or a relative area ratio of a chromatogram. This is a biochemical test method.
[0012]
A third aspect of the present invention is the above-described biochemical test method, wherein the disease is hepatocellular carcinoma.
A fourth aspect of the present invention is a hepatocellular carcinoma biochemical test method characterized by performing a hepatocellular carcinoma test by combining the above-described biochemical test method with the AFP method and / or the PIVKA-II method. is there.
[0013]
A fifth aspect of the present invention is to purify fibrinogen from plasma or tissue fluid using at least three kinds of affinity carriers having an affinity for blood components such as plasminogen, plasminogen activator, rRNA, fibronectin, and IgG. And a method for purifying fibrinogen.
The sixth aspect of the present invention is the above-mentioned method for purifying fibrinogen, wherein the fibrinogen is purified by mixing or layering the affinity carrier in a container provided with a membrane filter.
[0014]
In the present invention, a monosialyl sugar chain refers to a non-reducing end of two galactose residues in a sugar chain having a biantennary (two-branch antenna-like) sugar chain structure as a skeleton as shown in the following formula (I). One of them is a sugar chain to which one sialic acid is bound. In addition, disialyl sugar chain is a sialic acid at the non-reducing end of two galactose residues in a sugar chain as shown in the following formula (II), in which a biantennary (two-branch antenna-like) sugar chain structure forms a skeleton. Are sugar chains linked one by one (in FIG. 1, peak A indicates a monosialyl sugar chain, and peak B indicates a disialyl sugar chain).
[0015]
Embedded image

[0016]
Embedded image

[0017]
(In the formula, S represents sialic acid, G represents galactose, GN represents N-acetylglucosamine, and M represents mannose.)
The biochemical test method according to the present invention has been completed based on studies conducted by the present inventors on obtaining more accurate lesion information on fibrinogen and establishing it as a highly accurate diagnostic method. It is. This method provides accurate information on hepatocellular carcinoma by examining not only quantitative changes in fibrinogen sugar chains in blood but also qualitative changes, that is, profiles of fibrinogen-binding sugar chains. It is the result of efforts to establish a diagnostic method for hepatocellular carcinoma with a higher positive rate by acquiring and combining it with a conventional tumor marker for hepatocellular carcinoma.
[0018]
As a method for quantifying two sialyl sugar chains according to the present invention, for example, HPLC is effective.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
(Method of purifying fibrinogen from human plasma)
As a method for purifying fibrinogen from a body fluid, the method using an affinity column of Matsuda et al. Described in the section of the prior art can be applied. However, since there is a problem in the degree of purification and work, IgG is used. In order to efficiently remove components that are often present in blood, such as the above, it is desirable to purify fibrinogen using a carrier exhibiting affinity for IgG, in addition to the two carriers used by Matsuda et al. As a carrier exhibiting affinity for IgG, a carrier to which protein G is bound can be exemplified.
[0019]
A specific method for purifying fibrinogen from plasma is described below. First, in a container with a membrane filter (for example, Millipore Ultrafree), three types of affinity carriers (fibronectin affinity carrier, plasminogen, plasminogen activator, rRNA affinity carrier, and IgG affinity carrier) are used. For example, lysine-bound sepharose, gelatin-bound sepharose, protein G-bound sepharose (both manufactured by Pharmacia) and blood components such as plasminogen, plasminogen activator, rRNA, fibronectin, and IgG are bound. Filtration with a membrane filter makes it possible to obtain fibrinogen substantially free of contaminants. Regarding the way of packing these three kinds of affinity carriers, the same effect can be obtained even if the three kinds are packed in layers or mixed. However, the method of packing in layers is technically laborious and is not suitable for use in clinical tests involving multiple samples. Therefore, it is preferable to mix and pack three kinds of affinity carriers which can be relatively easily produced with the same effect.
(Cut and refine sugar chains)
As a method of adjusting the sugar chain, there are a method of releasing the sugar chain using an enzyme and a method of chemically cutting the sugar chain with anhydrous hydrazine. Either method does not affect the results of this analysis, but the method using an enzyme is advantageous because it requires no skill and does not require the use of anhydrous hydrazine, which is a toxicant. However, in recent years, an apparatus for releasing a sugar chain with this anhydrous hydrazine is commercially available, and use of such an apparatus is not problematic. As a method using an enzyme, it is a necessary and sufficient condition that the sugar chain is cleaved as much as possible with sialic acid bound. Therefore, enzymatic digestion under strong acidity is not desirable because sialic acid in the sugar chain may be dissociated. In addition, the use of trypsin or chymotrypsin as a proteolytic enzyme can prevent the dissociation of sialic acid. After proteolysis, the sugar chain is cut out with glycoamidase A, and then the sugar chain is digested with pronase to facilitate purification. The excised sugar chains are purified using cation and anion exchange resins.
(Labeling of sugar chains)
As a method of labeling a sugar chain, a method of fluorescent labeling with 2 aminopyridine and a method of radiolabeling with a tritium label are generally used. The present inventors prefer a method of fluorescent labeling with 2-aminopyridine because it is easy to handle in general laboratories, easy to detect by high-performance liquid chromatography, and improves separation. As a method of fluorescent labeling with 2 aminopyridine, a method using a 2 aminopyridine hydrochloric acid solution developed by Hase et al. As a fluorescent labeling agent and sodium cyanoborohydride as a reducing agent (S. Hase, T. Ibuki, T.) Ikenaka, Biochemistry, 95, 197-203 (1984)) and a method using 2aminopyridine acetic anhydride solution developed by Kondo et al. As a fluorescent labeling agent and borane dimethylamine complex as a reducing agent (Kondo, et. Al.). , Agric. Biol. Chem., 54, 2169-2170 (1990)), but any of these methods does not affect the results of this analysis, but Hase et al. For the method of Kondo et al., An apparatus (Takara Shuzo) for performing the method is commercially available, and it may be used. Fluorescently labeled sugar chains have the advantage that they are chemically stable and can be analyzed in a short time with high sensitivity by HPLC analysis.
(Sugar chain analysis)
In the present invention, a disease is examined using the sialyl sugar chain, which is cut out from fibrinogen as described above and labeled, as an indicator. Here, examples of the disease that can be tested include hepatocellular carcinoma, but are not limited thereto. As a specific test method, there are two methods, a method of using the concentration of mono- and / or disialyl sugar chains as an index, and a method of using the concentration ratio of monosialyl sugar chains to disialyl sugar chains as an index. In either method, first, a fluorescently labeled sugar chain is purified by gel filtration, and then subjected to HPLC analysis. As a column used for HPLC, an ODS-silica column is preferable, but an ODP column or a DEAE column may be used. Next, the peak area values of monosialyl and disialyl sugar chains corresponding to the content (concentration) of sialyl sugar chains of fibrinogen are determined from the elution peak pattern of HPLC. In the method using the concentration of mono- and / or disialyl sugar chains as an index, the concentrations of both sugar chains are calculated from the peak area value of monosialyl sugar chains and the peak area value of disialyl sugar chains. The concentration of either one of the sugar chains or the concentration of both is compared with the concentration of a healthy person or a patient with a benign disease, and it is determined whether or not the concentration is positive for various diseases such as hepatocellular carcinoma based on the high and low values. In the method using the concentration ratio of monosialyl sugar chains to disialyl sugar chains as an index, the ratio of the amount of monosialyl sugar chains to the amount of disialyl sugar chains is calculated from the peak area value of monosialyl sugar chains and the peak area value of disialyl sugar chains. The value of this ratio is compared with the value of a healthy person or a patient with a benign disease, and it is determined whether or not the value is positive for various diseases such as hepatocellular carcinoma based on the high and low values.
[0020]
As described above, the method of the present invention enables information effective as a diagnostic method to be adapted to practical processing.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
[0021]
DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS
[0022]
【Example】
[Example 1]
Fibrinogen and fibrinogen sugar chains were purified from the plasma of healthy subjects, patients with chronic hepatitis C, and patients with primary hepatocellular carcinoma, and analyzed by HPLC. The amount of change in the disialyl sugar chain was examined.
[0023]
Lysine-bound Sepharose, gelatin-bound Sepharose, and protein G-bound Sepharose (both manufactured by Pharmacia) were swelled in a 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5. Each test sample was mixed with 250 μl of the swelling gel and packed in a container with a membrane filter (trade name: Ultrafree Tube, manufactured by Millipore). Next, 100 μl of plasma was added thereto, and plasminogen, plasminogen activator, rRNA, fibronectin and the like were bound to the affinity carrier and centrifuged (1500 rpm × 10 seconds). Further, 2 ml of the above buffer was added, and the mixture was centrifuged again (above) to obtain a passed fraction (about 2.5 ml as a solution amount). The above operation was completed in about 2 hours. In the ordinary method, it takes about 5 hours to purify one sample of fibrinogen, but this method can handle several tens of samples at a time according to the number of samples that can be operated by the centrifuge, and the number of samples increases. Even in this case, the process is completed in about 2 hours, which is efficient.
[0024]
Ammonium sulfate was added to the obtained flow-through fraction so as to be 25% saturated and mixed, whereby fibrinogen (about 0.3 mg) was precipitated. The fibrinogen solution was centrifuged (2500 rpm × 20 minutes), and the resulting precipitate (fibrinogen) was added with 0.1 M Tris-hydrochloric acid, 2% sodium chloride solution (pH 8.2) to dissolve the fibrinogen. In the case of a healthy person, about 0.3 mg of fibrinogen could be obtained from 100 μl of plasma.
[0025]
The degree of purification of fibrinogen was confirmed by SDS electrophoresis. Fibrinogen was purified from healthy human plasma, and the same amounts (10 μg each) were run in the non-reduced state using commercially available human fibrinogen and an IgG reagent (all manufactured by Sigma) as controls.
Electrophoresis conditions
-Power supply used: ATTO DIGI-POWER SJ-1081
・ Electrophoresis equipment used: Tefco Cell Mini Model TC-808 (manufactured by TEFCO)
-Gel used: SDS-mini (manufactured by TEFCO), gel concentration 4%, thickness 1.5mm
·sampling:

[0026]
A sample buffer was added to a solution amount of 10 μg for each sample to dilute it five-fold, and the mixture was heated in boiling water for 5 minutes and electrophoresed.
・ Electrophoresis conditions: 70 mA at a constant current of 27 mA
FIG. 2 shows the results. The band of the purified product (lane 3) was located at the same position as the commercially available fibrinogen (lane 1), and it was confirmed that no other band was visible. Furthermore, the commercial product and the purified product showed the same chromatogram also by the analysis result by HPLC described later, so that fibrinogen could be purified by the above method.
[0027]
Next, the resulting fibrinogen solution was subjected to heat treatment (90 ° C., 10 minutes), and then subjected to enzymatic digestion by adding trypsin (manufactured by Sigma) and chymotrypsin (manufactured by Worthington Biochemical Corporation). After the reaction, the solution is again heated (90 ° C., 10 minutes), and the solution is concentrated to dryness. The reaction solution is adjusted to pH 4 to 6, and glycopeptidase A (manufactured by Seikagaku Corporation) is added to release the sugar chain by the enzyme. I let it. Then, pronase (trade name: Actinase E, manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.) was added to cut the peptide further finely. Then, solid matter was removed by centrifugation, and the supernatant was equilibrated with ion exchange water. It was desalted and purified with an ion exchange resin. The desalted and purified solution was concentrated to dryness, 40 μl of a solution of 1 g of 2-aminopyridine in 560 μl of concentrated hydrochloric acid was added, the mixture was left at 90 ° C. for 10 minutes, and 20 mg of sodium cyanoborohydride was added to 12 μl of water. 4 μl of the dissolved aqueous solution was added and reacted at 90 ° C. for 1 hour. The sugar chain was purified using a column of Sepundex G-15 (manufactured by Pharmacia). The 2-aminopyridine-sugar chain fraction was collected, dried and subjected to HPLC analysis.
[0028]
HPLC analysis conditions
・ Eluent A: 10 mM monosodium phosphate solution (pH 3.8)
• Eluate B: a solution obtained by adding n-butanol to eluate A to a final concentration of 0.5%
・ Column: Nakanopak ODS-A (6.0φ × 150mm, manufactured by Nakano Vinegar)
・ Fluorescence detector: SHIMADZU RF-550 (manufactured by Shimadzu Corporation)
-Detection: fluorescence detection (excitation wavelength: 320 nm, fluorescence wavelength: 400 nm)
・ Eluent flow rate: 1 ml / min
-Sugar chain elution conditions: conditions for increasing the concentration of eluate B from 20% to 50% by 60 minutes from the start of analysis
Analysis after HPLC analysis
From the chromatogram detected by HPLC, the area values of the peaks of the monosialyl and disialyl sugar chains of the fibrinogen sugar chain (see FIG. 1) are obtained. In hepatocellular carcinoma, the ratio of disialyl sugar chains to monosialyl sugar chains increases (Fig. 3-B). Therefore, paying attention to the increase in disialyl sugar chains from the area value, the area ratio (quantity ratio) is calculated as follows. calculate:
Increase rate of disialyl sugar chain = peak area of disialyl sugar chain / peak area of monosialyl sugar chain
(Hereinafter abbreviated as di / mono)
result
The number of specimens used here was healthy subjects (7 cases), chronic hepatitis C (40 cases), and primary liver cancer (37 cases). FIG. 3 attached hereto shows the elution pattern of HPLC obtained as described above, and the two major types of fibrinogen sugar chains were obtained based on the subtle difference in affinity to the ODS-silica column. Shows profile. As described above, the proportion of monosialyl and disialyl sugar chains in fibrinogen sugar chains of healthy individuals is almost constant (FIG. 3-A).
[0029]
Based on this result, analysis was performed by statistically dividing the disease into groups including healthy subjects, and analyzing healthy subjects and chronic hepatitis C patients, healthy subjects and hepatocellular carcinoma patients, and chronic hepatitis C patients and hepatocellular carcinoma patients. We examined whether a significant difference could be realized between them (FIG. 4). As a result, there was no significant difference between a healthy person and a chronic hepatitis C patient, but a significant difference was observed between a healthy person and a hepatocellular carcinoma patient and a hepatitis patient and a hepatocellular carcinoma patient (P < 0.001). Furthermore, from this figure, since the upper limit of the di / mono value of patients with chronic hepatitis C is 0.8, 28 of 37 patients with a di / mono value of 0.8 or more (ie, positive) in patients with hepatocellular carcinoma are shown. As a result, the positive rate was 75.7%.
[Example 2]
Furthermore, among 37 patients with hepatocellular carcinoma, the di / mono value of sialyl sugar chain of fibrinogen was compared with the positive rates of AFP and PIVKA-II, which are often used as tumor markers. The results are shown in Table 1 and FIG.
[0030]
[Table 1]

[0031]
As a result, when 7 patients who were confirmed to be positive only by sialyl sugar chain analysis of fibrinogen were added, the positive rate determined only by AFP and PIVKA-II increased from 75.7% to 94.6%. From this, it can be seen that the present invention is useful as a tumor marker for hepatocellular carcinoma and can be tested at a high level for the positive rate of hepatocellular carcinoma by using it in combination with an existing test method. .
[0032]
【The invention's effect】
According to the biochemical test method of the present invention, various diseases including hepatocellular carcinoma can be found with higher probability.
In addition, by the method for purifying fibrinogen of the present invention, fibrinogen with few impurities can be obtained by a simple operation.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a view showing an HPLC elution pattern of a sialyl sugar chain cut out from fibrinogen.
FIG. 2 is a photograph showing SDS electrophoresis of fibrinogen purified by the purification method of the present invention.
FIG. 3 is a view showing HPLC elution patterns of sialyl sugar chains of healthy persons and hepatocellular carcinoma patients.
FIG. 4 is a diagram showing di / mono values of healthy subjects, patients with chronic hepatitis C, and patients with hepatocellular carcinoma.
FIG. 5 is a diagram showing a comparison of a positive rate by a di / mono value, an AFP method, and a PIVKA-II method according to three test methods.

Claims

A biochemical examination method for hepatocellular carcinoma, characterized in that the ratio of the concentration of monosialyl sugar chains to disialyl sugar chains or the relative area ratio of chromatograms in sialyl sugar chains cut out from fibrinogen is used as an indicator of hepatocellular carcinoma.

A biochemical test method for hepatocellular carcinoma, wherein the test for hepatocellular carcinoma is performed by combining the biochemical test method according to claim 1 with an AFP method and / or a PIVKA-II method.