JP3547504B2

JP3547504B2 - Novel polypeptide and its use

Info

Publication number: JP3547504B2
Application number: JP26872394A
Authority: JP
Inventors: 俊二名取; 治雄高橋; 洋平小林; 正治星野
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1994-11-01
Filing date: 1994-11-01
Publication date: 2004-07-28
Anticipated expiration: 2019-07-28
Also published as: JPH08134096A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は新規なポリペプチド及びその用途に係る。本発明によるポリペプチド又はその塩は一般細菌のみならず、真菌に対しても優れた抗菌活性を有しており且つ毒性が極めて低いので、一般細菌性疾患又はカンジダ症等の真菌性疾患治療剤の有効成分として、更には食品又は飼料用の抗菌性添加剤として使用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
抗菌活性を有するペプチド類の開発に関するの研究は従来から盛んに行われている。
例えば、環状ペプチド誘導体（特開昭５８ − ２１３７４４号公報）、酵母類に対する抗菌ポリペプチド（特開昭６０ − １３０５９９号公報）、新規グリコペプチド（特開昭６１− ２５１６９９号公報）、グラム陽性菌に効果を示すオリゴペプチド（特開昭６２ −２２７９８号公報）、ペプチド系抗生物質（特開昭６３ − １７８９７及び特開平６ −５６８８９号公報）等を例示することができる。しかしながら、これらのペプチド類の内で、殊に真菌に対して充分な抗菌効果を発揮するものは存在しないようである。
尚、近年に至り臨床の場ではＡＩＤＳ等による真菌症が問題になってきている。抗真菌剤としてはアムホテリシンＢやトリアゾール系のものが主として用いられているが、その効果が充分でなかったり副作用が強い等の点で満足し得る抗真菌剤は得られていないのが現状である。従って、安全性に優れ、効果が充分に期待できるペプチド性の抗真菌剤が求められている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題乃至発明の目的】
本発明は従来技術におけるこのような困難をふまえてなされたものであり、本発明の目的は、ポリペプチド系抗菌剤を開発する上で従来課題とされてきた生産コストを低く抑え且つ合成が容易であり、しかも正常細胞に対しては毒性が極めて低く且つ抗菌活性、殊に抗真菌活性においても優れた新規なポリペプチドを提供することにある。
【０００４】
【課題を解決し、目的を達成する手段及び作用】
本発明者等は鋭意検討を重ねた結果、正電荷を有するリジン残基を基本とし、これに主としてバリン又はロイシン残基を組み合わせた１０個以下の構成アミノ酸からなるポリペプチドがカンジタ菌等に対しても強い抗真菌活性を示すと共に、赤血球やミドリザル由来の腎細胞等の正常細胞に対する毒性が極めて低いことを見い出し、これによって本発明を基本的には完成するに至った。
【０００５】
従って、本発明は一般式（Ｉ、配列番号：１）
Ｌｙｓ−Ｘａａ_１−Ｌｙｓ−Ｘａａ_２−Ｘａａ_２−Ｘａａ_２−Ｌｙｓ−Ｘａａ_１−Ｌｙｓ−Ｒ
（式中Ｘａａ_１はＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ又はＩｌｅを意味し、Ｘａａ_２はＶａｌ又はＬｅｕを意味し、ＲはＯＨ又はＮＨ_２を意味する）
にて示されるポリペプチド又はその塩を提供すると共に、これらの内の少なくとも１種を有効成分として含有する抗菌剤乃至食品及び飼料用の抗菌性添加剤を提供するものである。
【０００６】
本明細書において、アミノ酸は本技術分野において慣用されている３文字又は１文字略号で示され、例示すれば下記の通りである。
リジン：Ｌｙｓ又はＫ、ロイシン：Ｌｅｕ又はＬ、バリン：Ｖａｌ又はＶ、
フェニルアラニン：Ｐｈｅ又はＦ、イソロイシン：Ｉｌｅ又はＩ。
【０００７】
本発明によるポリペプチドは、上記の一般式（Ｉ）から明らかなようにＬｙｓ− Ｘａａ_１−Ｌｙｓ（Ｘａａ_１は上記の疎水性アミノ酸を意味する）なる配列を有するトリペプチドをＮ及びＣ末端に有し、中央の部位にロイシン又はバリンを３個有している比較的単純な構造を有するポリペプチドである。尚、Ｃ末端がカルボキシル基であっても、アミド化されていてもポリペプチドの抗菌活性は殆ど同じであり、アミド化されている場合の方が若干高い。
本発明によるポリペプチドは、その構成アミノ酸の数が僅か９個であり、合成上に課題のあるトリプトファン、システイン、メチオニン等を含有していないので、化学合成法により容易に且つ廉価に大量生産することが可能でき、これにより既述の課題を解決すると共に本発明の目的を達成することができる。
これらのポリペプチドは塩の形であることが可能であり、例えば塩酸、トリフルオロ酢酸や燐酸等の無機又は有機酸の付加塩であることができる。
【０００８】
本発明による抗菌剤はペプチドであるために経口投与等された場合においては、毒性の発現は殆どない。その他の投与経路であっても、他の化学物質である抗生物質のように残留性が問題になることはない。従って、本発明によるポリペプチドはヒト又は他の動物における細菌性疾患、特に真菌症に対して有効であり、又食品や飼料用の抗菌性添加物としても使用することができる。
本発明によるポリペプチドを医薬品として用いる場合には、主として注射剤として製剤化されるが、錠剤等の経口剤、クリーム剤乃至軟膏剤、ローション剤、ゲル剤、膣剤又はトローチ剤とすることもできる。
【０００９】
【実施例等】
次に、製造例及び薬理活性試験例に関連して本発明を更に詳細且つ具体的に説明する。
製造例
（１）抗菌性ポリペプチドの合成と精製
ポリペプチドの合成は、パーキンエルマー社製のペプチド合成装置（ｍｏｄｅｌ４３１Ａ）を使用し、ｔ−Ｂｏｃアミノ酸を用いた固相法により行った。
アミノ酸は、α−アミノ基がｔ−ブトキシカルボニル基（ｔ−Ｂｏｃ基）にて保護されたもので、その他 ε−アミノ基は２−クロロベンジルオキシカルボニル基等で保護されたものを用いた。樹脂は、Ｃ末端がアミドのペプチドを与えるｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂又はＣ末端がカルボキシルのペプチドを与えるフェニルアセトアミドメチル（ＰＡＭ）樹脂を用いた。
ＭＢＨＡ樹脂またはｔ−Ｂｏｃリジンが導入されたＰＡＭ樹脂０．５ｍｍｏｌをトリフルオロ酢酸／塩化メチレンによりｔ−Ｂｏｃ基を除去し、保護アミノ酸２ｍｍｏｌとジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）／ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）で縮合反応を行うことによりペプチド結合を形成させた。塩化メチレンにて洗浄後、上記の操作を繰り返すことによりカルボキシル末端から順次アミノ酸を導入することにより本発明による各種のペプチドを合成していった。
合成したペプチドについてはトリフルオロメタンスルホン酸法にて脱保護基、脱樹脂を行なった。即ち、ペプチド５００ｍｇに対しトリフルオロメタンスルホン酸１ｍｌ、トリフルオロ酢酸５ｍｌ、チオアニソール１ｍｌ及びエタンジチオール０．５ｍｌを氷冷しながら２ − ３時間反応させた。
粗ペプチドを下記に示す条件の逆相ＨＰＬＣにより精製した。
カラム：ウォーターズ社製の μ−ボンダスフェアＣ−１８（１９ｍｍｘ１５ｃｍ）、
溶出液：０．０１２Ｎ塩酸中１５％から５０％のアセトニトリルの直線勾配、３５分間、
流速：７．０ｍｌ／ｍｉｎ。
ＨＰＬＣによるメインピーク部分を回収して凍結乾燥した。その一部をパーキンエルマー社製のペプチドシークェンサーにて調べた処、サンプルはすべて正しく化学合成されていることが確認された。
尚、本発明の範畴に属しない各種のアミノ酸配列を有する抗菌性ポリペプチドも同様に合成され、精製された。
【００１０】
（２）生理活性の試験法
抗菌活性は、微量液体希釈法により最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）として求めた。
測定はＮａｔｉｏｎａｌＣｏｍｍｉｔｔｅｅｆｏｒＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｔａｎｄａｒｄｓ（ＮＣＣＬＳ，Ｖｉｌｌａｎｏｖａ，１９８８）ｆｒｏｍＵＳＡに従って行った。即ち、各菌体をＣａｔｉｏｎＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄＭｕｅｌｌｅｒ−ＨｉｎｔｏｎＢｒｏｔｈ（ＣＳＭＨＢ）培地で振盪培養後、６５０ｎｍにおける吸光度が０．３になるように菌の濃度を調整し、更に培地で１０^６ＣＦＵ／ｍｌになるように希釈する。この菌体溶液と培地で希釈した抗菌物質のサンプルを各々５０μｌ添加し、３５℃ で２０ − ２４時間培養し最小発育阻止濃度を求めた。
【００１１】
抗菌活性の測定例１（中央部のＬｅｕの数が異なるアナログの抗菌活性）
Ｎ末端とＣ末端におけるアミノ酸配列がＲＬＫの場合とＫＬＫの場合について、中央の部位がＬであって、その数が異なるポリペプチドの抗菌活性を調べた結果は、下記の表１に示される通りであった。
この表１から、Ｎ及びＣ末端がＲＬＫの場合には、Ｌｅｕの数が５個の場合に最も活性が高く４個、３個になると活性は弱くなる傾向がある。一方、本発明が関与するＫＬＫを基本にした場合には４個や３個の方が活性において優れていることが明らかになった。
【００１２】
【表１】

【００１３】
抗菌活性の測定例２（ＫＬＫの部位を変換したアナログの抗菌活性）
ＭＩＣの測定結果が下記の表２に示されている。この表２から明らかなように、ＫＬＫのＫ（リジン）の部位を正電荷を有する他のアミノ酸に変換した場合に、Ｒ（アルギニン）への変換では活性は保持されるが、Ｈ（ヒスチジン）への変換では活性は消失する。又、表２には明示されていないが、アミノ酸配列における中央部にＬ（ロイシン）を有しないものは活性を有しないことが判明した。尚、ＫＬＫＬＬＬＫＬＫ−ＮＨ_２を基本としてＫＬＫのＬｅｕの部位を他のアミノ酸に変換したアナログではＧｌｙ（グリシン）に変換したものでは活性は殆ど消失し、Ａ（アラニン）又はＣ（システイン）に変換したものではＭＲＳＡ等の耐性菌に対する活性が大幅に減少し、他の疎水性アミノ酸であるＶ（バリン）、Ｉ（イソロイシン）又はＦ（フェニルアラニン）に変換したものでは活性が保持されることも判明した。
【００１４】
【表２】

【００１５】
抗菌活性の測定例３（Ｃ末端にＫＬＫの部位を有しないポリペプチドの抗菌活性）
Ｃ末端にＫＬＫのトリペプチドを有しないポリペプチドのＳ．ａｕｒｅｕｓに対する抗菌活性はＬｅｕの数に拘らず、Ｃ末端にＫＬＫを有する場合の活性と比較して１／２ − １／８程度に低下した（下記の表３参照）。
【００１６】
【表３】

【００１７】
抗菌活性の測定例４（カンジタ菌に対する活性測定）
真菌に対する活性は、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓを用い培地はサブロー培地を用いてＭＩＣの測定を行った。その結果ＫＬＫＬＬＬＫＬＫ−ＮＨ_２及びＫＶＫＬＬＬＫＶＫ−ＮＨ_２が他のペプチドと比較して極めて抗真菌活性の高いことが明らかになった（下記の表４参照）。
【００１８】
【表４】

【００１９】
抗菌活性の測定例５
抗菌活性の測定例３及び４の結果からＫＬＫＬＬＬＫＬＫ−ＮＨ_２（配列番号７）はＳ．ａｕｒｅｕｓやＥ．ｃｏｌｉに対してのみでなく真菌に対しても強い抗真菌活性を示し、又ＫＶＫＬＬＬＫＶＫ−ＮＨ_２（配列番号２）も強い抗真菌活性を示すので、アミノ酸配列のＮ及びＣ末端がＫＬＫ又はＫＶＫであり且つ中央の部位がＬＬＬのみではなく、ＶＶＶ又はＶとＬの組合せからなる各種のポリペプチドを合成してＭＩＣを求めた結果を下記の表５に示す（この表５には上記の配列番号２及び７に該当するポリペプチドの抗細菌及び抗真菌活性も併せて示されている）。
【００２０】
【表５】

【００２１】
表５から明らかなように、本発明によるポリペプチドはグラム陽性菌及びグラム陰性菌の広い範囲の微生物に対してのみならず、真菌であるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに対しても強い抗菌活性を示すことが判明した。
【００２２】
正常細胞に対する細胞障害活性の測定
（１）培養細胞における細胞障害活性
ミドリザル腎（ＧＭＫ）由来の細胞を９６穴プレートでコンフルエントになるまで培養する。培地を捨てて新たに検体である抗菌性ポリペプチドを含有する培地を添加する。３７℃、５％ＣＯ_２で２０ − ２４時間培養する。培地を除去し、ＰＢＳ（−）１００μｌにて洗浄する。
１ｍＭの臭化３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウム（ＭＴＴ）を含有する培地５０μｌを添加し、３７ ℃、５％ＣＯ_２で１時間培養する。その後、１０％ドデシル硫酸ナトリウムと０．０４Ｎ塩酸を含有する５０％イソブタノール溶液１００μｌを添加した後に、５４０ｎｍで吸光度を測定する。この場合に、生細胞の酵素によりＭＴＴが呈色物質のホルマザンに還元され、このホルマザンの量は細胞数に比例して増加するので、特異的吸光度を測定することにより障害を受けていない細胞の量が判明する。結果は、５０％の細胞障害性を示す抗菌性ペプチド濃度で表した（後記の表６参照）。
表６から明かな通り、本発明によるポリペプチド、即ちアミノ酸配列の中央部が３個の疎水性アミノ酸から構成されるポリペプチドは５０％の細胞障害性値が何れも２００μｇ／ｍｌ以上であり、正常細胞に対して作用する蜂毒のメリチンと比較する場合に細胞障害活性は弱く１／４０以下であり、中央部が５個の疎水性アミノ酸から構成されるポリペプチドと比較する場合にも１／３以下であり毒性は少なく安全性に優れたペプチドであることが判明した。
【００２３】
（２）羊赤血球（ＳＲＢＣ）の溶血反応
羊保存血液（羊血液にアルセバー氏液を等量添加したもの）０．２ｍｌにＰＢＳを０．８ｍｌ添加し、２０００ｘｇで５分間遠心し、上清を除去することにより洗浄を行う。ＰＢＳを１０ｍｌ添加した後、この赤血球溶液２５μｌに検体である抗菌性ポリペプチド溶液２５μｌを添加し、３７℃ で２時間インキュベーションする。２０００ｘｇで５分間遠心を行い、上清の吸光度を５７６ｎｍで測定する。結果は、１０％の溶血性を示す抗菌性ポリペプチド濃度で表した（下記の表６参照）。
表６から明かな通り、本発明によるポリペプチド、即ちアミノ酸配列の中央部が３個の疎水性アミノ酸から構成されるポリペプチドでは溶血作用濃度が何れも２５０μｇ／ｍｌ以上であり、蜂毒のメリチンと比較する場合に赤血球に対する溶血活性は１／６０以下であり、中央部が５個の疎水性アミノ酸から構成されるポリペプチドと比較する場合にも有意に低く、毒性が少ない安全性に優れたペプチドであることが判明した。
【００２４】
【表６】

【００２５】
製剤例
本発明によるポリペプチド（ＫＶＫＬＬＬＫＶＫ−ＮＨ_２、配列番号２）を５０ｍｇ宛含有するようにバイアルに無菌的に分配し、凍結乾燥により水分を除去して密封する。この製剤は用時は注射用生理食塩水に溶解せしめられる。
尚、本発明によるポリペプチドの安定化剤としてアルギニン等のアミノ酸類やクエン酸等の有機酸及びヒト血清アルブミン等を用いることができる。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によるポリペプチドは、正常細胞に対する毒性が極めて低く、幅広い抗菌活性を有しており、殊に真菌に対しても強い抗菌活性を示すので一般細菌性感染症のみならず真菌症の治療剤の有効成分として、更には食品及び飼料用の抗菌性添加剤として利用することが可能である。尚、本発明によるポリペプチドは、その構成アミノ酸の数が僅か９個であり且つ合成上等において課題のあるアミノ酸を有していないので化学合成法により比較的廉価に調製することができる。
【配列表】

[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to novel polypeptides and uses thereof. Since the polypeptide or its salt according to the present invention has excellent antibacterial activity not only against general bacteria but also against fungi and has extremely low toxicity, it is useful for treating fungal diseases such as general bacterial diseases or candidiasis. And an antimicrobial additive for food or feed.
[0002]
[Prior art]
Studies on the development of peptides having antibacterial activity have been actively conducted.
For example, cyclic peptide derivatives (JP-A-58-213744), antibacterial polypeptides against yeasts (JP-A-60-130599), novel glycopeptides (JP-A-61-251699), gram-positive bacteria Oligopeptides (JP-A-62-22798) and peptide-based antibiotics (JP-A-63-17897 and JP-A-6-56889) which exhibit the following effects. However, none of these peptides appear to exert sufficient antibacterial effects, especially against fungi.
In recent years, mycosis due to AIDS or the like has become a problem in clinical settings. Amphotericin B and triazoles are mainly used as antifungal agents.However, at present, there are no antifungal agents that are satisfactory in terms of insufficient effect or strong side effects. is there. Therefore, there is a need for a peptidic antifungal agent which is excellent in safety and can be expected to be sufficiently effective.
[0003]
[Problems to be Solved by the Invention]
The present invention has been made in view of such difficulties in the prior art, and an object of the present invention is to reduce the production cost, which has conventionally been a subject in developing a polypeptide-based antibacterial agent, and to simplify the synthesis. Another object of the present invention is to provide a novel polypeptide having extremely low toxicity to normal cells and having excellent antibacterial activity, especially antifungal activity.
[0004]
Means and action for solving the problem and achieving the object
The present inventors have conducted intensive studies and found that a polypeptide comprising 10 or less constituent amino acids based on a lysine residue having a positive charge and mainly combining a valine or leucine residue with respect to Candida bacteria and the like. In addition, they have demonstrated strong antifungal activity and extremely low toxicity to normal cells such as erythrocytes and green monkey-derived renal cells, thereby completing the present invention basically.
[0005]
Accordingly, the present invention provides a compound of the general formula (I, SEQ ID NO: 1)
Lys-Xaa ₁ -Lys-Xaa ₂ -Xaa ₂ -Xaa ₂ -Lys-Xaa ₁ -Lys-R
(Where Xaa ₁ represents Val, Leu, Phe or Ile, Xaa ₂ represents Val or Leu, and R represents OH or NH ₂ )
And a salt thereof, and an antibacterial agent or an antibacterial additive for food and feed containing at least one of them as an active ingredient.
[0006]
In the present specification, amino acids are represented by three-letter or one-letter abbreviations commonly used in this technical field, for example, as follows.
Lysine: Lys or K, Leucine: Leu or L, Valine: Val or V,
Phenylalanine: Phe or F, Isoleucine: Ile or I.
[0007]
As apparent from the general formula (I), the polypeptide according to the present invention comprises a tripeptide having a sequence of Lys-Xaa ₁ -Lys (Xaa ₁ means the above-mentioned hydrophobic amino acid) at the N and C termini. It is a polypeptide having a relatively simple structure having three leucine or valine at the central site. The antibacterial activity of the polypeptide is almost the same regardless of whether the C-terminus is a carboxyl group or is amidated, and is slightly higher when amidated.
Since the polypeptide according to the present invention has only 9 constituent amino acids and does not contain tryptophan, cysteine, methionine, etc., which are problematic in synthesis, it can be easily and inexpensively mass-produced by a chemical synthesis method. This can solve the problems described above and achieve the object of the present invention.
These polypeptides can be in the form of salts, for example, addition salts of inorganic or organic acids such as hydrochloric acid, trifluoroacetic acid and phosphoric acid.
[0008]
Since the antibacterial agent according to the present invention is a peptide, when it is orally administered, toxicity is hardly exhibited. With other routes of administration, persistence is not an issue as with other chemicals, antibiotics. Thus, the polypeptides according to the invention are effective against bacterial diseases in humans or other animals, especially mycosis, and can also be used as antimicrobial additives for food and feed.
When the polypeptide according to the present invention is used as a pharmaceutical, it is mainly formulated as an injection, but it can also be made into an oral preparation such as a tablet, a cream or ointment, a lotion, a gel, a vagina or a troche. it can.
[0009]
[Examples]
Next, the present invention will be described in more detail and specifically with reference to Production Examples and Pharmacological Activity Test Examples.
Production Example (1) Synthesis of Antimicrobial Polypeptide and Purification The synthesis of the polypeptide was performed by a solid phase method using a t-Boc amino acid using a peptide synthesizer (model 431A) manufactured by PerkinElmer.
Amino acids used were those in which the α-amino group was protected with a t-butoxycarbonyl group (t-Boc group), and those in which the other ε-amino group was protected with a 2-chlorobenzyloxycarbonyl group or the like. As the resin, a p-methylbenzhydrylamine (MBHA) resin giving a peptide having an amide at the C-terminus or a phenylacetamidomethyl (PAM) resin giving a peptide having a carboxyl at the C-terminus was used.
0.5 mmol of MBHA resin or PAM resin into which t-Boc lysine has been introduced is used to remove the t-Boc group with trifluoroacetic acid / methylene chloride, and 2 mmol of protected amino acid and dicyclohexylcarbodiimide (DCC) / hydroxybenzotriazole (HOBt) ) To form a peptide bond. After washing with methylene chloride, the above operation was repeated to sequentially introduce amino acids from the carboxyl terminal to synthesize various peptides according to the present invention.
The synthesized peptide was subjected to deprotection and resin removal by the trifluoromethanesulfonic acid method. That is, 1 ml of trifluoromethanesulfonic acid, 5 ml of trifluoroacetic acid, 1 ml of thioanisole and 0.5 ml of ethanedithiol were reacted with 500 mg of the peptide for 2 to 3 hours while cooling with ice.
The crude peptide was purified by reverse phase HPLC under the following conditions.
Column: μ-Bondasphere C-18 (19 mm x 15 cm) manufactured by Waters,
Eluent: linear gradient from 15% to 50% acetonitrile in 0.012N hydrochloric acid, 35 min.
Flow rate: 7.0 ml / min.
The main peak by HPLC was collected and freeze-dried. When a part thereof was examined using a peptide sequencer manufactured by Perkin-Elmer, it was confirmed that all the samples were chemically synthesized correctly.
In addition, antibacterial polypeptides having various amino acid sequences not belonging to the category of the present invention were similarly synthesized and purified.
[0010]
(2) Physiological activity test method The antibacterial activity was determined as the minimum growth inhibitory concentration (MIC) by a microfluidic dilution method.
The measurement was performed according to the National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, Villanova, 1988) from USA. That is, after shaking culture each cell in CationSupplemented Mueller-Hinton Broth (CSMHB) medium, the absorbance at 650nm is adjusted to a concentration of bacteria to be 0.3, so that such a 10 ⁶ CFU / ml in further medium Dilute to. 50 μl of each of the bacterial cell solution and the antimicrobial substance sample diluted with the medium were added, and the cells were cultured at 35 ° C. for 20 to 24 hours to determine the minimum growth inhibitory concentration.
[0011]
Antibacterial activity measurement example 1 (Antibacterial activity of analogs with different numbers of Leu in the center)
When the amino acid sequence at the N-terminal and C-terminal is RLK and KLK, the antimicrobial activity of polypeptides having L at the center and different numbers is shown in Table 1 below. Met.
From Table 1, it can be seen that when the N and C terminals are RLK, the activity is highest when the number of Leu is 5 and the activity tends to be weaker when the number of Leu is 4 or 3. On the other hand, when KLK was involved in the present invention, it was revealed that 4 or 3 cells were superior in activity.
[0012]
[Table 1]

[0013]
Antibacterial activity measurement example 2 (Antibacterial activity of analog converted KLK site)
The MIC measurement results are shown in Table 2 below. As is apparent from Table 2, when the K (lysine) site of KLK is converted to another amino acid having a positive charge, the activity is maintained in the conversion to R (arginine) but H (histidine) The activity is lost on conversion to. Although not explicitly shown in Table 2, it was found that those having no L (leucine) at the center in the amino acid sequence had no activity. In the analog converting the site of KLK of Leu to KLKLLLKLK-NH ₂ as a basic to other amino acids which was converted to Gly (glycine) activity almost disappeared and converted to A (alanine) or C (cysteine) The activity against resistant bacteria such as MRSA is greatly reduced, and the activity is maintained when converted to other hydrophobic amino acids such as V (valine), I (isoleucine) or F (phenylalanine). found.
[0014]
[Table 2]

[0015]
Measurement Example 3 of Antibacterial Activity ( Antibacterial activity of polypeptide having no KLK site at C-terminal)
S. of the polypeptide without the KLK tripeptide at the C-terminus The antibacterial activity against Aureus was reduced to about 1/2 to 1/8 of the activity when KLK was present at the C-terminus, regardless of the number of Leu (see Table 3 below).
[0016]
[Table 3]

[0017]
Antibacterial activity measurement example 4 (activity measurement against Candida)
The activity against fungi was determined by measuring MIC using Candida albicans and using Sabouraud's medium as the medium. Consequently KLKLLLKLK-NH ₂ and KVKLLLKVK-NH ₂ was found to be extremely high antifungal activity compared with other peptides (Table 4 see below).
[0018]
[Table 4]

[0019]
Antibacterial activity measurement example 5
KLKLLLKLK-NH ₂ from the results of measurement example 3 and 4 of the antibacterial activity (SEQ ID NO: 7) S. aureus or E. showed strong antifungal activity against fungi not only against coli, also KVKLLLKVK-NH ₂ (SEQ ID NO: 2) Since also exhibit strong antifungal activity, N and C-terminal amino acid sequences in KLK or KVK The MIC was determined by synthesizing various polypeptides comprising not only LLL but also VLL or a combination of V and L, and the results of the MIC are shown in Table 5 below. The antibacterial and antifungal activities of the polypeptides corresponding to 2 and 7 are also shown).
[0020]
[Table 5]

[0021]
As is evident from Table 5, the polypeptides according to the invention are not only against a wide range of microorganisms, Gram-positive and Gram-negative bacteria, but also C. albicans also showed strong antibacterial activity.
[0022]
Measurement of cytotoxic activity against normal cells (1) Cytotoxic activity in cultured cells Green cells derived from green monkey kidney (GMK) are cultured in a 96-well plate until they become confluent. The medium is discarded, and a medium containing an antimicrobial polypeptide as a specimen is newly added. Incubate at 37 ° C., 5% CO ₂ for 20-24 hours. The medium is removed and washed with 100 μl of PBS (−).
Add 50 μl of a medium containing 1 mM of 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H tetrazolium (MTT) and culture for 1 hour at 37 ° C., 5% CO _2. You. Thereafter, 100 μl of a 50% isobutanol solution containing 10% sodium dodecyl sulfate and 0.04 N hydrochloric acid is added, and the absorbance is measured at 540 nm. In this case, MTT is reduced to the color substance formazan by the enzyme of the living cells, and the amount of this formazan increases in proportion to the number of cells. The amount of turns out. The results were expressed as the concentration of the antimicrobial peptide showing 50% cytotoxicity (see Table 6 below).
As is evident from Table 6, the polypeptides according to the invention, ie the polypeptides whose central part of the amino acid sequence consists of three hydrophobic amino acids, all have a cytotoxicity value of 50% of 200 μg / ml or more, Compared to bee venom melittin, which acts on normal cells, it has a weak cytotoxic activity of 1/40 or less. Compared to a polypeptide composed of 5 hydrophobic amino acids at the center, 1 / 3 or less, which proved to be a peptide with low toxicity and excellent safety.
[0023]
(2) Hemolysis reaction of sheep red blood cells (SRBC) 0.2 ml of sheep blood (added with an equal volume of Alsebar's solution) to PBS was added with 0.8 ml of PBS, and centrifuged at 2000 xg for 5 minutes. Washing is performed by removing the cleaning. After adding 10 ml of PBS, 25 μl of the test sample antibacterial polypeptide solution is added to 25 μl of this erythrocyte solution, and the mixture is incubated at 37 ° C. for 2 hours. Centrifuge at 2000 × g for 5 minutes and measure the absorbance of the supernatant at 576 nm. The results were expressed as the concentration of the antimicrobial polypeptide exhibiting 10% hemolysis (see Table 6 below).
As is clear from Table 6, any of the polypeptides according to the present invention, that is, polypeptides in which the central part of the amino acid sequence is composed of three hydrophobic amino acids, have a hemolytic action concentration of 250 μg / ml or more, and have a bee venom. Hemolytic activity on erythrocytes is 1/60 or less when compared with melittin, and significantly lower when compared with polypeptides composed of 5 hydrophobic amino acids at the center, with low toxicity and excellent safety Was found to be a peptide.
[0024]
[Table 6]

[0025]
Polypeptide (KVKLLLKVK-NH _2, SEQ ID NO: 2) according to Formulation Example <br/> present invention was aseptically distributed into vials so that to contain destined 50mg, sealed to remove moisture by lyophilization. When used, this preparation is dissolved in physiological saline for injection.
In addition, amino acids such as arginine, organic acids such as citric acid, human serum albumin, and the like can be used as stabilizers for the polypeptide according to the present invention.
[0026]
【The invention's effect】
The polypeptide according to the present invention has extremely low toxicity to normal cells and has a wide range of antibacterial activities, and in particular, has a strong antibacterial activity against fungi. As an active ingredient, and as an antibacterial additive for foods and feeds. The polypeptide of the present invention can be prepared at relatively low cost by a chemical synthesis method since it has only 9 constituent amino acids and does not have an amino acid which is problematic in synthesis or the like. .
[Sequence list]

Claims

General formula (I, SEQ ID NO: 1)
Lys-Xaa ₁ -Lys-Xaa ₂ -Xaa ₂ -Xaa ₂ -Lys-Xaa ₁ -Lys-R
(Where Xaa ₁ represents Val, Leu, Phe or Ile, Xaa ₂ represents Val or Leu, and R represents OH or NH ₂ )
A polypeptide or a salt thereof, characterized by having an antibacterial activity represented by the formula:

An antibacterial agent comprising the polypeptide according to claim 1 or a salt thereof as an active ingredient.

A therapeutic agent for a bacterial disease, comprising the polypeptide according to claim 1 or a salt thereof as an active ingredient.

An antifungal agent comprising the polypeptide according to claim 1 or a salt thereof as an active ingredient.

A therapeutic agent for a fungal disease comprising the polypeptide according to claim 1 or a salt thereof as an active ingredient.

An antibacterial additive for food or feed, comprising the polypeptide or a salt thereof according to claim 1 as an active ingredient.