【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、融合細胞株とその取得方法に関する。詳しくは、ヒト細胞株を用いた免疫系の諸現象、すなわちアレルギー、ガンなどのメカニズム解明、それらの疾病の予防、診断、治療等を目的とした食品機能の検索、新規医薬品の探索、製造に使用するためのヒト免疫担当細胞株の取得に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、ヒトの体内から分離した細胞を体外で培養するには、困難を伴うことが多い。例えば、ヒトの体内から分離したリンパ球などの細胞を体外で無限増殖させることは困難である。通常、これら細胞を培養液中で培養しても、２週間から数ヶ月程度で死滅してしまう。ガン細胞や上皮細胞のある種のものは、培地組成によっては体外での継代培養が可能であるが、研究等に用いるために必要十分な量を確保することは難しい。さらに、体内細胞を体外において増殖させるには、細胞に何らかの刺激を与える必要がある。そのために、培養液に種々の生理活性物質を添加しなければならないが、その適切な物質の選択等に問題があり、かなりの労力を要する。
【０００３】
近年では、このような問題点を解消する方法として、目的とする細胞に発ガン物質等の薬剤を添加したり、紫外線や放射線を照射する等の処理を行い、目的の細胞に突然変異を生じさせる（トランスフォーム）方法が提案されている。このような処理を行うことにより、無限増殖が可能な細胞株（変異株）を取得することができる。また、遺伝子導入法（細胞に特定の遺伝子を導入する方法）を用いて、株化したい細胞に、不死化遺伝子を導入して形質転換を生じさせ、無限増殖する細胞を取得する方法も報告されている。
【０００４】
さらに、このようにトランスフォームを利用した方法のほかに、リンパ球などのように体内で抗体や免疫調節因子（リンフォカイン）を産生する細胞を、無限増殖する細胞と融合して、体外でもその抗体や免疫調節因子を産生する融合細胞（ハイブリドーマ）として樹立する方法も知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらの従来の方法では、次のような問題点があった。まず、薬剤を添加する方法や紫外線等の照射を利用する方法においては、獲得した変異形質およびその他の細胞機能が安定した細胞株として樹立するために、数カ月から数年もの長期間を要し、樹立した細胞株が利用できるようになるまでにかなりの期間が必要であった。また、処理に供した細胞数あたりの取得される変異株数（変異効率）が低く、目的細胞を容易に株化することが困難であった。
【０００６】
また、細胞融合によって株化する方法は、モノクローナル抗体やリンフォカイン等の細胞由来物質の安定生産系としては有用である。しかしながら、この方法で得られる融合細胞株は、生体内で生じる種々の免疫反応に対しては、その細胞応答が低下もしくは消失していると言われている。したがって、これらの方法を用いても、生体内での細胞の相互作用を生体外でも再現可能な樹立細胞系として用いるためには多くの困難が伴った。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、株化細胞の取得法について検討を重ね、細胞融合法による株化がその他の方法に比較して、細胞をトランスフォームさせる効率が比較的高い点に着目した。ただし、細胞融合して得られる株細胞の性質は、融合に供した生体由来の免疫担当細胞ばかりでなく、他方のパートナーであるヒト親細胞株に大きく依存していることが知られている。
【０００８】
そこで、種々のヒト由来の免疫担当細胞を細胞機能を保持したまま効率よく株化するために、本発明者らは親細胞株について研究し、変異株であるヒトＴ 細胞性白血病細胞株ＩＣＬＵ−Ｔを樹立した。このヒト親細胞株を用いて、生体内の各種ヒト免疫担当細胞と細胞融合することにより得られる融合細胞は、該細胞が生体内で有していたと考えられる細胞機能を保持する性質を残していることが分かった。
【０００９】
また、この細胞融合用親細胞株であるＩＣＬＵ−Ｔは、よく知られている細胞融合促進剤（ポリエチレングリコール、以下ＰＥＧと記載する。）および融合細胞のみを増殖させる融合細胞選択培地（ＨＡＴ培地）では、効率的な細胞融合を行うことは不可能であることが判明した。そこで、本発明者らは、ＩＣＬＵ−Ｔを親細胞株として利用し、融合細胞を得るための手段について検討した結果、ＰＥＧとリン脂質であるレシチンを混合した融合促進剤を開発すると共に、ヒポキサンチンとアメソプテリンで構成される選択培地を開発した。その結果、これらを用いることにより、効率よく細胞融合を行うことができることを見出した。なお、本発明で用いるヒト細胞融合用親細胞株ＩＣＬＵ−Ｔは、必ずしも免疫担当細胞とのみ融合可能なわけではなく、その他の組織由来の細胞とも融合可能である。
【００１０】
請求項１記載の本発明は、ヒトＴ細胞性白 血病細胞株ＰＥＥＲから、８−アザグアニン耐性クローンを選択し、さらに無血清培養可能にした変異株であるＩＣＬＵ−Ｔを親細胞株とするヒト免疫担当融合細胞株である。
【００１１】
また、請求項２記載の本発明は、ヒト細胞融合用親細胞株ＩＣＬＵ−Ｔとヒト免疫担当細胞を用いて融合細胞を作成する際に、ＰＥＧとレシチンの存在下に行うことを特徴とするヒト免疫担当融合細胞株の取得方法である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。融合細胞の性質は、前記したように、融合に供した生体由来の免疫細胞だけでなく、親細胞株にも大きく依存している。そこで、本発明者らは、種々のヒト由来の免疫担当細胞を細胞機能を保持したまま効率よく株化するために用いることができるヒト細胞融合用親細胞株を樹立した。すなわち、ヒト免疫細胞由来細胞から、次のようにして親細胞株を取得した。ヒトＴ細胞性白血病細胞株（ＰＥＥＲ）は８−アザグアニン（終濃度２０μg/ml）を含む１０％牛胎児血清（以下、ＦＢＳと記載する。） を含むＥＲＤＦ培地（極東製薬工業（株）製）で培養し た。なお、１０％の濃度でＦＢＳを添加したＥＲＤＦ培 地を、以下１０ ％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地と記載する。
【００１３】
３週間程度培養した後、増殖してきたクローンを分取し、クローニングを行った。クローニングは、９６穴培養プレートの１穴につき１個の細胞が入るように、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地を用いて細胞懸濁液を稀釈して巻き込む限界稀釈法に従った。９６穴培養プレートに細胞をまきこんで２４〜３０時間後に、プレートの各穴を検鏡し、細胞が２個になっている穴に印をいれた。さらに、２４〜３０時間後（すなわち、まきこんでから４８〜６０時間後）に、印がついている穴を検鏡し、細胞が４個になっている穴に印をいれた。まきこんでから２０日後に、２つの印がついている穴を検鏡し、細胞が増殖していることを確認して細胞数を血球計算板で計測した。最も細胞数が多かった穴の細胞を、さらに上記と同様の方法で再クローニングした。
【００１４】
親細胞株が樹立された後、細胞融合で得られる融合細胞が無血清培養可能となるように、クローニングで得られたクローンをインスリン（終濃度１０μg/ml）、トランスフェリン（終濃度２０μg/ml）、エタノールアミン（終濃度２０μＭ）、亜セレン酸ナトリウム（終濃度２５ｎＭ）を含むＥＲＤＦ培地（極東製薬工業（株）製）で、９６穴培養プレートに、１穴につき１個の細胞が入るように稀釈して２週間程度培養した。増殖してきた各穴の細胞数を計測し、最も細胞数が多かった順に各穴の細胞の一部をアミノプテリン（終濃度０．４ｍＭ）を含む１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地で培養した。培養後３日目〜５日目に検鏡し、細胞が死滅したクローンの３、４株を親細胞株の候補として樹立した。
【００１５】
得られた親細胞株の候補となるクローンを用いて実際に細胞融合した。その結果、使用した各クローンの細胞数を１０5 細胞としたときの取得した融合細胞数（融合効率）を指標として、この値が最も高いクローンを樹立親細胞株とした。このようにして樹立した親 細胞株、すなわちＰＥＥＲ由来の親細胞株をヒトＴ細胞 性白血病細胞株（ＩＣＬＵ−Ｔ）と命名した。このようにして樹立された親細胞株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、その受託番号は、ＩＣＬ Ｕ−ＴがＦＥＲＭ ＢＰ−６２５５である。この親細胞株を、ヒト末梢血リンパ球のようなヒト免疫担当細胞と融合操作を行うことにより、請求項１記載の融合細胞株を得ることができる。
【００１６】
親細胞株とヒト免疫担当細胞との融合操作は、例えば以下のようにして行うことができる。まず、上記の親細胞株とヒト免疫担当細胞とを混合する。ここで、親細胞株と融合させる他方のヒト免疫担当細胞としては、ヒトリンパ球などのヒトの生体内で免疫機能を有する細胞であればいずれも使用できる。親細胞株に対するヒト免疫担当細胞の使用割合は、例えば親細胞株としてＩＣＬＵ−Ｔを使用する場合は０．８〜１．２倍とするのが好ましい。
【００１７】
また、ヒト免疫担当細胞の代わりに、その他のヒト組織由来の細胞、例えばヒトガン細胞などを用いて融合させることも可能である。ガン細胞を用いる場合、該細胞の由来する組織の種類は特に限定されず、例えば胃ガン細胞や乳ガン細胞など、いずれも同じように使用することができる。この場合、親細胞株に対するこれら細胞の使用割合は、上記と同様でよい。
【００１８】
親細胞株とヒト免疫担当細胞等の混合物を遠心分離することにより、培養上清と細胞ペレットとに分離し、このうちの培養上清を除去する。残った細胞ペレットに、融合促進剤であるＰＥＧを基本合成培地で希釈したもの（通常は、４０〜５０％に希釈）を添加する。ここで用いる培地としては、例えば基本合成培地としてＥＲＤＦ培地、ＲＰＭ１１６４０培地、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）などが使用可能である。これらの培地と共に、成長因子として牛胎児血清（ＦＢＳ）を併用したり、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウムなどの無血清培養用成長因子を併用することもできる。また、融合促進剤であるＰＥＧとしては、平均分子量が4,０００〜6,０００程度のものを使用できるが、融合効率の点から平均分子量4,０００程度のものが好ましく、ＩＣＬＵ−Ｔの場合は平均分子量4,０００程度のものが特に好ましい。
【００１９】
ところで、親細胞株としてＩＣＬＵ−Ｔ細胞を用いた場合は、融合促進剤としてＰＥＧにレシチンを混合したものを使用する必要がある。ＰＥＧにレシチンを混合せずに、ＩＣＬＵ−Ｔ細胞の細胞融合操作を行った場合、ＩＣＬＵ−Ｔの細胞膜破壊が顕著に生じ、残存する生細胞数が減少する上に、目的とする融合細胞を効率よく得ることができない。レシチンは、細胞膜の主たる構成成分であるリン脂質の一種である。このレシチンを混合すると、ＩＣＬＵ−Ｔ細胞を用いた融合操作を行った場合に、細胞膜の主成分であるリン脂質を保護し、ＰＥＧによる細胞膜破壊を極力抑えることができる。
【００２０】
培地で希釈された融合促進剤を添加した細胞ペレットを遠心分離した後、該細胞ペレットの中から融合細胞を選択する。
【００２１】
ＩＣＬＵ−Ｔを親細胞株として用いた場合の融合細胞の選択は、ヒポキサンチンおよびアミノプテリン（代わりに、アメソプテリンでもよい。以下、同 じ）を含むが、チミジンを含まない培地で構成された選択培地を使用する。ＩＣＬＵ−Ｔ細胞を親細胞とする場合、選択培地にチミジンが存在すると、増殖阻害が生じるため、チミジンの添加を避けるべきである。融合後２４〜３０時間経過した後、懸濁液にヒポキサンチンとアミノプテリンを含有した選択培地（例えば、１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地）を添加する。この培地は、上記と同様に、数日おきに半量ずつ交換する。このようにして２週間程度培養することにより、融合細胞を取得することができる。親細胞から融合操作を経て得られる融合細胞は、生体内において当該免疫担当細胞が発現していた特定の免疫反応（細胞機能）を、生体外でもそのまま保持することができる。
【００２２】
【実施例】
次に、本発明を詳細に説明するために代表的な実施例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例１〔ＩＣＬＵ−Ｔを用いたヒトリンパ球の株化〕ＩＣＬＵ−Ｔ（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２５５）を４×１06個、ヒト末梢血リンパ球を４×１06個で混合した。この混合物を遠心分離し、培養上清と細胞ペレットとに分離した後、培養上清を除去した。細胞ペレットに基本培地であるＥＲＤＦ培地（極東製薬工業（株）製）と１％レシチンで調製した４０％ＰＥＧ（平均分子量：４０００）を１ｍｌ添加した。さらに、ＥＲＤＦ培地９ｍｌを添加して、全量を１０ｍｌとした。これを再び遠心分離して得られた細胞のペレットを、ＥＲＤＦ培地８５％、ＦＢＳ１５％になるように調製された１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地２５ｍｌで懸濁した。懸濁液は、９６穴培養プレートの各穴に１００μｌずつ添加した。この融合操作の４日後に、１３３μＭヒポキサンチン、0.２６μＭアメソプテリン含有１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地を９６穴培養プレートの各穴に１００μｌずつ添加した。次いで、４、５日おきに、６７μＭヒポキサンチン、0.１３μＭアメソプテリン含有１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地と半量ずつ培地交換した。培養開始から２週間程度経過後に、形成されたＩＣＬＵ−Ｔとヒト末梢血リンパ球との融合細胞の出現ウェル数および融合効率を測定した。結果を第１表に示す。また、ＩＣＬＵ−Ｔ（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２５５） ５×１06個とヒト末梢血リンパ球５×１06個とを用いたこと以外は、上記と同様の条件で細胞融合を行った。その結果も第１表に示す。
【００２３】
次に、得られた融合細胞株の性質を、下記のようにして検討した。まず、蛍光標識した抗Ｂ細胞抗体、抗Ｔ細胞抗体および抗単球抗体を用いて、融合細胞がいずれの抗体に反応するかを検討した。この判別結果により、融合細胞が、Ｂ細胞性、Ｔ細胞性および単球性のいずれであるかを知ることができる。 この抗体による検討の結果、融合細胞がＢ細胞性であった場合は、抗体（Ｉｇ）産生能を有するか否かについてさらに検討した。また、融合細胞がＴ細胞性であった場合は、さらにどのようなサブクラスに分類されるかについて検討した。融合細胞が単球性であった場合は、食細胞作用等を有するかについても検討した。上記２回の融合操作により得られた融合細胞の細胞種とその比率等の平均値を第２表に示す
【００２４】
【表１】第 １ 表
【００２５】
【表２】第 ２ 表
【００２６】
第１表より、親細胞株としてＩＣＬＵ−Ｔ を用いた場合、２週間程度の培養で、高い効率のヒト末梢血リンパ球との融合細胞を得ることができることがわかる。また、第２表より、以下のことがわかる。まず、親細胞株は生体内の各種の免疫担当細胞を株化することができることが明らかである。ＩＣＬＵ−Ｔを細胞融合の親細胞株として使用した場合、主としてＴ細胞系の融合細胞を得ており、これらのＴ細胞種の融合細胞は、ヘルパー型を示す。したがって、細胞融合に供した末梢血リンパ球のうち、Ｔリンパ球の性質を受け継いでいることが明らかである。
【００２７】
実施例２〔親細胞株ＩＣＬＵ−Ｔを用いて細胞融合を行う場合の融合促進剤の検討〕ＩＣＬＵ−Ｔ細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２５５）とヒト末梢血リンパ球とを、細胞数が約１：１（具体的な数値は第３表に示した）となるように混合した。この混合物を遠心分離し、培養上清と細胞ペレットとに分離し、培養上清を除去した。次に、細胞ペレットに基本培地であるＥＲＤＦ培地（極東製薬工業（株）製）と１％レシチンで調製した１％レシチン−４０％ＰＥＧ（平均分子量：４０００）を１ｍｌ添加した。さらに、ＥＲＤＦ培地９ｍｌを添加して全量を１０ｍｌとした。これを再び遠心分離して得られた細胞のペレットを、ＥＲＤＦ培地８５％、ＦＢＳ１５％になるように調製された１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地５０ｍｌで懸濁した。懸濁液は、９６穴培養プレートの各穴に１００μｌずつ添加した。この融合操作の４日後に、１３３μＭヒポキサンチン、0.２６μＭアメソプテリン含有１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地を９６穴培養プレートの各穴に１００μｌずつ添加した。次いで、４、５日おきに、６７μＭヒポキサンチン、0.１３μＭアメソプテリン含有１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地と半量ずつ培地交換した。培養開始から２週間程度経過後に、形成されたＩＣＬＵ−Ｔとヒト末梢血リンパ球との融合細胞の出現ウェル数および融合効率を測定した。結果を第３表に示す。一方、対照として、レシチンを添加しないＥＲＤＦ培地で希釈して調製した４０％ＰＥＧ（平均分子量：４０００）を用いた他は上記と同様に細胞融合を行った。その結果も第３表に併せて示す。
【００２８】
【表３】第 ３ 表
* 親細胞１05個当たり
【００２９】
第３表より、融合促進剤としてＰＥＧのみを用いても、融合細胞が全く得られないか、あるいは得られる場合でもその効率は非常に低いことがわかる。一方、レシチンとＰＥＧの両方を用いた場合は、融合細胞を効率よく得ることができることが明らかである。この結果から、ＩＣＬＵ−Ｔを親細胞として細胞融合を行う際は、融合促進剤としてＰＥＧの他にレシチンも添加する必要があることがわかる。
【００３０】
【発明の効果】
ＩＣＬＵ−Ｔを親細胞株として用いて作成された本発明のヒト免疫担当融合細胞株は、生体内において当該免疫担当細胞が元来有していた免疫機能、その他の性質を生体外においてそのまま発現するものである。また、請求項２記載の本発明方法のように、ポリエチレングリコールとレシチンの存在下において、ＩＣＬＵ−Ｔとヒト免疫担当細胞から融合細胞を作成すると、生体内における免疫機能をそのまま保持した融合細胞を効率よく株化することができる。本発明の融合細胞株は、生体内での細胞間相互作用を、生体外で研究するために好適に利用することができる。本件は、（旧）独立行政法人農業技術研究機構と（旧）生物系特定産業技術研究推進機構との共同出願でありましたが、平成１５年１０月１日付けで両者が統合され、特許出願人欄に記載の名称となりました。なお、（旧）生物系特定産業技術研究推進機構の名称変更届は関係書類が整い次第提出いたします。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a fusion cell line and a method for obtaining the same. For more details, we will elucidate the mechanisms of immune system phenomena using human cell lines, ie, allergies, cancer, etc., search for food functions for the prevention, diagnosis, and treatment of such diseases, search for new drugs, and manufacture new drugs. The present invention relates to obtaining a human immunocompetent cell line for use.
[0002]
[Prior art]
Generally, it is often difficult to culture cells isolated from the human body outside the body. For example, it is difficult to grow cells such as lymphocytes isolated from the human body indefinitely outside the body. Usually, even if these cells are cultured in a culture solution, they die in about two weeks to several months. Certain types of cancer cells and epithelial cells can be subcultured in vitro depending on the composition of the medium, but it is difficult to secure a sufficient and sufficient amount for use in research and the like. Further, in order for cells in the body to proliferate outside the body, it is necessary to apply some stimulation to the cells. For this purpose, various physiologically active substances must be added to the culture solution, but there is a problem in selection of an appropriate substance, and considerable labor is required.
[0003]
In recent years, as a method of solving such problems, a mutation such as adding a drug such as a carcinogen to target cells or irradiating ultraviolet rays or radiation is performed to cause mutation in target cells. (Transform) method has been proposed. By performing such a treatment, a cell line (mutant strain) capable of infinite proliferation can be obtained. In addition, a method has been reported in which an immortalizing gene is introduced into cells to be established, transformation is caused, and cells that grow indefinitely are obtained using a gene transfer method (a method of introducing a specific gene into cells). ing.
[0004]
In addition to the transform-based method, cells that produce antibodies and immunomodulators (lymphokines) in the body, such as lymphocytes, are fused with cells that grow indefinitely, and the antibody is used outside the body. And a method of establishing it as a fusion cell (hybridoma) that produces an immunomodulatory factor is also known.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
However, these conventional methods have the following problems. First, in the method of adding a drug or the method of using irradiation with ultraviolet light, it takes a long period of several months to several years to establish the acquired mutant trait and other cell functions as a stable cell line, It took a considerable period of time for the established cell lines to become available. Further, the number of mutant strains obtained per the number of cells subjected to the treatment (mutation efficiency) was low, and it was difficult to easily establish target cells.
[0006]
In addition, the method of cell line establishment by cell fusion is useful as a stable production system for cell-derived substances such as monoclonal antibodies and lymphokines. However, it is said that the fused cell lines obtained by this method have reduced or eliminated cellular responses to various immune reactions generated in vivo. Therefore, even if these methods are used, there are many difficulties in using them as an established cell system in which the interaction of cells in vivo can be reproduced in vitro.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have studied the method of obtaining a cell line, and have noticed that the cell fusion method is relatively high in cell transformation efficiency as compared with other methods. However, it is known that the properties of the cell line obtained by cell fusion largely depend not only on the immunocompetent cells derived from the living body subjected to the fusion but also on the other human partner cell line as the partner.
[0008]
Thus, in order to efficiently establish various human immunocompetent cells while retaining cell functions, the present inventors studied the parent cell line and found that the mutant human T- cell leukemia cell line ICLU- T was established. Using this human parental cell line, fusion cells obtained by various human immunocompetent cells and cell fusion in the body, leaving the nature of the cells retain the cellular functions believed to have a have in vivo I knew it was there.
[0009]
Further, ICLU-T is the cell fusion for the parental cell line are well-known cell fusion promoter (polyethylene glycol, hereinafter referred to as PEG.) And fused cells selective medium (HAT medium for growing only fused cells ) Proved that it was impossible to perform efficient cell fusion. Thus, the present inventors have studied the means for obtaining fused cells by using ICLU-T as a parent cell line, and as a result, have developed a fusion promoter comprising a mixture of PEG and lecithin, a phospholipid, and A selective medium consisting of xanthine and amesopterin was developed. As a result, they have found that cell fusion can be performed efficiently by using these. In addition, the parent cell line for human cell fusion ICLU-T used in the present invention is not necessarily capable of being fused only with an immunocompetent cell, but is also capable of being fused with cells derived from other tissues.
[0010]
The present invention according to claim 1, from human T-cell leukemia cell lines PEER, 8- azaguanine-resistant clones were selected and further the parent cell line ICLU-T is a mutant strain allows serum-free culture It is a fusion cell line responsible for human immunity.
[0011]
The present invention according to claim 2 is characterized in that when a fusion cell is prepared using the parent cell line for human cell fusion ICLU-T and a human immunocompetent cell, the fusion cell is prepared in the presence of PEG and lecithin. This is a method for obtaining a fusion cell line responsible for human immunity.
[0012]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail. As described above, the properties of the fused cells largely depend not only on the immune cells derived from the living body subjected to the fusion but also on the parent cell line. Thus, the present inventors have established parent cell lines for human cell fusion that can be used to efficiently establish various human immunocompetent cells while maintaining cell functions. That is, a parent cell line was obtained from human immune cell-derived cells as follows. The human T-cell leukemia cell line (PEER) is an ERDF medium (manufactured by Far East Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 10% fetal bovine serum (hereinafter referred to as FBS ) containing 8-azaguanine (final concentration: 20 μg / ml) . And cultured . Incidentally, the ERDF culture land supplemented with FBS at a concentration of 10%, to as 10% FBS-ERDF medium below.
[0013]
After culturing for about three weeks, the clones that had proliferated were separated and cloned. The cloning was performed according to the limiting dilution method in which the cell suspension was diluted and involved using 10% FBS-ERDF medium so that one cell was inserted in each well of a 96-well culture plate. Twenty-four to thirty hours after inoculating the cells into a 96-well culture plate, each hole of the plate was inspected by microscopy, and a mark was made in the hole where two cells were present. Further, after 24 to 30 hours (that is, 48 to 60 hours after the swallowing), the marked hole was inspected by microscopy, and the hole having four cells was marked. Twenty days after the injection, the holes marked with two marks were inspected, and after confirming that the cells had proliferated, the number of cells was counted using a hemocytometer. The cells in the wells with the largest number of cells were further recloned in the same manner as described above.
[0014]
After the parent cell line has been established, clones obtained by cloning are cloned into insulin (final concentration 10 μg / ml) and transferrin (final concentration 20 μg / ml) so that the fused cells obtained by cell fusion can be serum-free cultured. ERDF medium (manufactured by Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.) containing ethanolamine (final concentration: 20 μM) and sodium selenite (final concentration: 25 nM) so that one cell per well is placed in a 96-well culture plate. After dilution, the cells were cultured for about 2 weeks. The number of cells in each well that had grown was counted, and a portion of the cells in each well was cultured in a 15% FBS-ERDF medium containing aminopterin (final concentration 0.4 mM) in the order of the largest number of cells. The cells were examined on the third to fifth days after the culture, and three or four clones in which the cells had died were established as candidate parent cell strains.
[0015]
Cell fusion was actually performed using the obtained clones that were candidate parent cells. As a result, as obtained fused cells number (fusion efficiency) indicators of when the number of cells of each clone were used with 10 5 cells were the value is the highest clones with established parental cell line. The parent cell line thus established , ie , the parent cell line derived from PEER, was named human T-cell leukemia cell line (ICLU-T) . The parent cell line thus established has been deposited with the National Institute of Bioscience and Human-Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, and its accession number is ICL UT as FERM BP-6255 . The parent cell line is subjected to a fusion operation with a human immunocompetent cell such as a human peripheral blood lymphocyte, whereby the fusion cell line according to claim 1 can be obtained.
[0016]
The fusion operation between the parent cell line and the human immunocompetent cell can be performed, for example, as follows. First, the parent cell line and human immunocompetent cells are mixed. Here, as the other human immunocompetent cell to be fused with the parent cell line, any cell having an immune function in a human body such as human lymphocytes can be used. For example, when ICLU-T is used as the parent cell line, the ratio of the human immunocompetent cells to the parent cell line is preferably 0.8 to 1.2 times .
[0017]
In addition, instead of the human immunocompetent cells, it is also possible to fuse using cells derived from other human tissues, for example, human cancer cells. When cancer cells are used, the type of tissue from which the cells are derived is not particularly limited, and for example, gastric cancer cells, breast cancer cells, and the like can all be used in the same manner. In this case, the use ratio of these cells to the parent cell line may be the same as described above.
[0018]
The mixture of the parent cell line and the human immunocompetent cells is separated into a culture supernatant and a cell pellet by centrifugation, and the culture supernatant is removed. To the remaining cell pellet, a PEG as a fusion promoter diluted with a basic synthetic medium (usually diluted to 40 to 50%) is added. As the medium used here, for example, ERDF medium, RPM11640 medium, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), etc. can be used as a basic synthetic medium. Along with these media, fetal bovine serum (FBS) can be used in combination as a growth factor, or serum-free growth factors such as insulin, transferrin, ethanolamine, and sodium selenite can be used in combination. As the PEG as a fusion accelerator, those having an average molecular weight of about 4,000 to 6,000 can be used, and those having an average molecular weight of about 4,000 are preferable from the viewpoint of fusion efficiency. In the case of ICLU-T, Having an average molecular weight of about 4,000 is particularly preferable.
[0019]
By the way, when ICLU-T cells are used as the parent cell line, it is necessary to use PEG mixed with lecithin as a fusion promoter. When a cell fusion operation of ICLU-T cells is performed without mixing lecithin with PEG, ICLU-T cell membrane destruction occurs remarkably, the number of remaining viable cells decreases, and the target fused cells It cannot be obtained efficiently. Lecithin is a type of phospholipid that is a major component of cell membranes. When this lecithin is mixed, when a fusion operation using ICLU-T cells is performed, phospholipids, which are the main components of the cell membrane, are protected, and destruction of the cell membrane by PEG can be suppressed as much as possible.
[0020]
After centrifuging the cell pellet to which the fusion promoter diluted with the medium has been added, a fused cell is selected from the cell pellet .
[0021]
Selection of fused cells with ICLU-T as a parent cell line may (alternatively, may be amethopterin. Hereinafter, the same) hypoxanthine and aminopterin selected including, made up of a thymidine-free medium Use medium. When ICLU-T cells are used as parent cells, the addition of thymidine should be avoided because the presence of thymidine in the selection medium causes growth inhibition. After 24 to 30 hours from the fusion, a selective medium containing hypoxanthine and aminopterin (for example, 15% FBS-ERDF medium) is added to the suspension. The medium is changed by half every several days as described above. By culturing for about two weeks in this way, a fused cell can be obtained. A fused cell obtained from a parent cell through a fusion operation can retain a specific immune response (cell function) expressed by the immunocompetent cell in the living body as it is outside the living body.
[0022]
【Example】
Next, representative examples will be described to explain the present invention in detail, but the present invention is not limited to these examples. 4 × 10 6 pieces of Example 1 [cell line of human lymphocytes with ICLU-T] ICLU-T (FERM BP-6255 ), was mixed with 4 × 10 6 cells of human peripheral blood lymphocytes. This mixture was centrifuged to separate into a culture supernatant and a cell pellet, and then the culture supernatant was removed. To the cell pellet, 1 ml of an ERDF medium (Kanto Pharmaceutical Co., Ltd.) as a basic medium and 40% PEG (average molecular weight: 4000) prepared with 1% lecithin were added. Furthermore, 9 ml of ERDF medium was added to make the total amount 10 ml. This was centrifuged again, and the cell pellet obtained was suspended in 25 ml of a 15% FBS-ERDF medium prepared to be 85% ERDF medium and 15% FBS. 100 μl of the suspension was added to each well of a 96-well culture plate. Four days after the fusion operation, 100 μl of a 15% FBS-ERDF medium containing 133 μM hypoxanthine and 0.26 μM amesopterin was added to each well of a 96-well culture plate. Then, every 4 or 5 days, the medium was exchanged with a 15% FBS-ERDF medium containing 67 μM hypoxanthine and 0.13 μM amesopterin by half volume. About two weeks after the start of the culture, the number of wells in which fused cells of the formed ICLU-T and human peripheral blood lymphocytes appeared and the fusion efficiency were measured. The results are shown in Table 1. Cell fusion was performed under the same conditions as described above, except that 5 × 10 6 ICLU-T (FERM BP-6255) and 5 × 10 6 human peripheral blood lymphocytes were used. The results are also shown in Table 1.
[0023]
Next, properties of the obtained fusion cell line were examined as described below. First, using a fluorescently labeled anti-B cell antibody, anti-T cell antibody and anti-monocyte antibody, it was examined which antibody the fused cells would react with. From the result of this determination, it can be known whether the fused cells are B-cell, T-cell, or monocyte. As a result of the examination using this antibody, when the fused cells were B-cell, it was further examined whether or not they had an antibody (Ig) -producing ability. Further, when the fused cells were T-cells, the subclasses were further examined. When the fused cells were monocytic, it was also examined whether they had a phagocytic effect or the like. Table 2 shows the cell types of the fused cells obtained by the two fusion operations and the average values of the ratios and the like.
[Table 1] Table 1
[0025]
[Table 2] Table 2
[0026]
Table 1 shows that when ICLU-T was used as the parent cell line , highly efficient fusion cells with human peripheral blood lymphocytes could be obtained by culturing for about 2 weeks. Table 2 shows the following. First, it is clear that the parent cell line can establish various immunocompetent cells in vivo. When using the ICLU-T as a parent cell line for cell fusion mainly have obtained fused cells of T cell line, these T cell types fusion cells show helper type. Therefore, it is clear that , among the peripheral blood lymphocytes subjected to cell fusion, they inherit the properties of T lymphocytes .
[0027]
Example 2 [Study of fusion promoting agent when cell fusion is performed using parental cell line ICLU-T] ICLU-T cells (FERM BP-6255) and human peripheral blood lymphocytes have a cell number of about 1: 1 (specific values are shown in Table 3). This mixture was centrifuged, separated into a culture supernatant and a cell pellet, and the culture supernatant was removed. Next, 1 ml of an ERDF medium (Kanto Pharmaceutical Co., Ltd.) as a basic medium and 1% lecithin-40% PEG (average molecular weight: 4000) prepared with 1% lecithin were added to the cell pellet. Further, 9 ml of ERDF medium was added to make the total amount 10 ml. This was centrifuged again, and the cell pellet obtained was suspended in 50 ml of a 15% FBS-ERDF medium prepared to be 85% ERDF medium and 15% FBS. 100 μl of the suspension was added to each well of a 96-well culture plate. Four days after the fusion operation, 100 μl of a 15% FBS-ERDF medium containing 133 μM hypoxanthine and 0.26 μM amesopterin was added to each well of a 96-well culture plate. Then, every 4 or 5 days, the medium was exchanged with a 15% FBS-ERDF medium containing 67 μM hypoxanthine and 0.13 μM amesopterin by half volume. About two weeks after the start of the culture, the number of wells in which fused cells of the formed ICLU-T and human peripheral blood lymphocytes appeared and the fusion efficiency were measured. The results are shown in Table 3. On the other hand, as a control, cell fusion was performed in the same manner as described above except that 40% PEG (average molecular weight: 4000) prepared by diluting with an ERDF medium to which lecithin was not added was used. The results are also shown in Table 3.
[0028]
[Table 3] Table 3
* Per 10 5 parent cells [0029]
Table 3 shows that even when PEG alone was used as the fusion promoter, no fused cells were obtained, or even when such cells were obtained, the efficiency was very low. On the other hand, when both lecithin and PEG are used, it is clear that fused cells can be obtained efficiently. From these results, it can be seen that when performing cell fusion using ICLU-T as a parent cell, it is necessary to add lecithin in addition to PEG as a fusion promoter.
[0030]
【The invention's effect】
The human immunocompetent fusion cell line of the present invention prepared using ICLU-T as a parent cell line expresses the immune function and other properties originally possessed by the immunocompetent cell in vivo in vivo. Is what you do. Further, when a fused cell is prepared from ICLU-T and a human immunocompetent cell in the presence of polyethylene glycol and lecithin as in the method of the present invention as described in claim 2, the fused cell retaining the in vivo immune function is obtained. It can be efficiently stocked. The fusion cell line of the present invention can be suitably used for studying cell-cell interaction in vivo in vitro. This application was a joint application between the (former) National Institute of Agricultural Technology (formerly) and the (former) Organization for Promoting Specified Industrial Technology (Biological), but the two were integrated on October 1, 2003, and a patent application was filed. It became the name described in the person column. A notification of name change of the (former) Organization for Promoting Specified Biotechnology will be submitted as soon as the relevant documents are ready.
