JP3515082B2

JP3515082B2 - 核酸分析装置および核酸分析方法

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Publication number: JP3515082B2
Application number: JP2001124087A
Authority: JP
Inventors: 康彦佐々木
Original assignee: Hitachi Ltd
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Priority date: 2001-04-23
Filing date: 2001-04-23
Publication date: 2004-04-05
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Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸分析装置およ
び核酸分析方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来の核酸分析方法としては、特開昭６
２−８５８６３号公報（第１の従来技術）、ＷＯ９８／
１３５２３号公報（第２の従来技術）及びＷＯ９８／２
８４４０号公報（第３の従来技術）がある。これらの分
析方法は、核酸サンプルのプライマ以降の塩基配列を分
析する手法であり、具体的には、核酸サンプルを構成す
る４種のヌクレチオド、すなわちデオキシアデノシン
５'−三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン５'−
三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン５'−三リン
酸（ｄＣＴＰ）及びデオキシチミジン５'−三リン酸
（ｄＴＴＰ）に対して、各々結合性を持つ４種の活性化
ヌクレチオド前駆体試薬（デオキシヌレオシド５'−三
リン酸試薬：ｄＮＴＰ試薬）、すなわちｄＴＴＰ試薬、
ｄＣＴＰ試薬、ｄＧＴＰ試薬及びｄＡＴＰ試薬を核酸サ
ンプルに順次加えてその都度結合の有無を確認すること
によりプライマ以降の塩基配列を読みとる分析手法があ
る。この際、加えたｄＮＴＰ試薬の中の、ｄＡＴＰ試薬
とｄＴＴＰ試薬、或いはｄＣＴＰ試薬とｄＧＴＰ試薬と
は結合してしまうため、これらｄＮＴＰ試薬を核酸サン
プルに加えて結合を確認した後にはｄＮＴＰ試薬の洗浄
または失活が必要である。

【０００３】そこで、第１、第２の従来技術では、４種
のｄＮＴＰ試薬を順次反応室に注入して反応過程を計測
する際に、各試薬間の汚染を回避するために、洗浄工程
を導入している。また、第３の従来技術では、核酸サン
プルと発光試薬が入っている反応槽に４種のｄＮＴＰ試
薬を順次注入して反応過程を計測するが、予め反応槽に
ｄＮＴＰ失活試薬を入れておくことにより各ｄＮＴＰ試
薬間の汚染を確実に回避している。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、第１、
第２の従来技術では、反応過程を計測した後に反応室の
洗浄を行なってから次の反応過程を計測するようになっ
ているために、各反応過程に各洗浄時間が付加されてし
まうと共に、各ｄＮＴＰ試薬間の汚染を回避できるよう
に洗浄するには長時間の洗浄を行なうことが必要であっ
た。

【０００５】また、第３の従来技術では、反応過程を計
測した後に反応槽内の各ｄＮＴＰ試薬の失活を行なって
から次の反応過程を計測するようになっているために、
各反応過程に各失活時間が付加されてしまうと共に、反
応槽内に残留したｄＮＴＰの失活に際して、反応過程を
計測した後に残留しているｄＮＴＰ試薬の全容量分の失
活を行うために、失活するのに長時間を要するものであ
った。

【０００６】以上のように、これらの従来技術において
は、ｄＮＴＰ試薬間の汚染を回避するのに要する洗浄時
間または失活時間を含めた塩基配列の分析時間が長くか
かるという課題があった。また、これらの従来技術に
は、核酸サンプルの捕獲及び交換の容易性に付いては明
示されていない。

【０００７】本発明の目的は、反応過程と失活過程を平
行に行なって塩基配列の分析時間を短縮することが可能
な核酸分析装置及び核酸分析方法を得ることにある。

【０００８】本発明の別の目的は、反応過程後の失活時
間を短縮して塩基配列の分析時間を短縮させることが可
能な核酸分析装置及び核酸分析方法を得ることにある。

【０００９】本発明の別の目的は、核酸サンプルの捕獲
及び交換が容易に行なえる核酸分析分析方法を得ること
にある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明の代表的な発明の１つである核酸分析装置で
は、分析対象の核酸サンプルを供給する核酸サンプル供
給手段と、前記供給された核酸サンプルを捕獲する捕獲
手段と、前記核酸サンプルに１塩基単位で結合する第１
試薬及びこの第１試薬の結合に起因して発光する第２試
薬を前記捕獲された核酸サンプルに順次供給すると共
に、前記核酸サンプルへの前記第１試薬の供給に平行し
て前記第１試薬の結合作用を失活する第３試薬を前記第
１試薬の結合後の未反応第１試薬に供給する試薬供給手
段と、前記第２試薬の発光を検出する発光検出手段とを
備えている。

【００１１】上記別の目的を達成するために、本発明の
代表的な発明の１つである核酸分析装置では、核酸サン
プルを保管する核酸サンプル槽、１塩基単位で伸長作用
する第１試薬を保管する第１試薬槽、伸長に起因して発
光する第２試薬を保管する第２試薬槽、及び前記第１試
薬の伸長作用を失活する第３試薬を保管する第３試薬槽
を載置する第１ステージと、前記各槽に保管されたサン
プルまたは試薬の液体を吸引及び排出するノズル部材
と、前記ノズル部材に吸引されたサンプル液の核酸サン
プルを捕獲する捕獲手段と、前記ノズル部材及び前記捕
獲手段を保持し、前記第１ステージに対する左右上下の
相対位置が移動する第２ステージと、前記第２試薬の発
光を検出する発光検出手段とを備えている。

【００１２】上記別の目的を達成するために、本発明の
代表的な発明の１つである核酸分析方法では、磁性ビー
ズ付き核酸サンプルの入っている核酸サンプル液を反応
部に供給する手順と、前記反応部に供給された核酸サン
プル液中の磁性ビーズ付き核酸サンプルを電磁石の電磁
力により捕獲する手順と、前記捕獲した磁性ビーズ付き
核酸サンプルに１塩基単位で伸長作用する第１試薬を供
給手順と、前記磁性ビーズ付き核酸サンプルに接触して
第１試薬が結合することに起因して生ずる発光を発光検
出手段により検出する手順と、前記第１試薬を前記核酸
サンプルに接触させた後に未反応の第１試薬の伸長作用
を失活する第３試薬を供給してこの未反応の第１試薬を
失活する手順と、前記電磁石の電磁力を解除して前記磁
性ビーズ付き核酸サンプルを前記反応部から排出する手
順とを備えている。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明の第１の実施例の分析装置
を図１から図７を用いて説明する。

【００１４】まず、分析装置の全体構成を図１から図３
を参照しながら説明する。図１は本発明の第１の実施例
の分析装置の全体構成を示す斜視図、図２は図１のＡ部
の詳細図、図３は図１の分析装置の動作状態を示す模式
図である。

【００１５】分析装置１は、発光試薬と失活試薬が混合
された混合試薬１４０（図３参照）を保管する混合試薬
槽１００と、混合試薬１４０が循環して流れる反応流路
１１０と、４種のｄＮＴＰ試薬、すなわち図３に示すｄ
ＡＴＰ試薬１４１、ｄＴＴＰ試薬１４２、ｄＣＴＰ試薬
１４３及びｄＧＴＰ試薬１４４を各々保管する４個のｄ
ＮＴＰ試薬槽、すなわちｄＡＴＰ試薬槽１０１、ｄＴＴ
Ｐ試薬槽１０２、ｄＣＴＰ試薬槽１０３及びｄＧＴＰ試
薬槽１０４と、これらのｄＮＴＰ試薬が流れるｄＮＴＰ
試薬流路、すなわちｄＡＴＰ試薬流路１１１、ｄＴＴＰ
試薬流路１１２、ｄＣＴＰ試薬流路１１３及びｄＧＴＰ
試薬流路１１４と、混合試薬１４０を反応流路１１０中
に流す混合試薬ポンプ１２０と、各ｄＮＴＰ試薬を各ｄ
ＮＴＰ試薬流路に流す４個のｄＮＴＰ試薬ポンプ、すな
わちｄＡＴＰ試薬ポンプ１２１、ｄＴＴＰ試薬ポンプ１
２２、ｄＣＴＰ試薬ポンプ１２３及びｄＧＴＰ試薬ポン
プ１２４と、反応時に発生する光を検出する光量センサ
１３０と、磁性ビーズ付き核酸サンプル１４５を捕獲す
るための電磁石１３１等から成っている。

【００１６】反応流路１１０は、混合試薬１４０及び混
合試薬ポンプ１２０を連通する循環流路を形成するよう
になっており、混合試薬ポンプ１２０の吐出側流路の途
中にサンプル注入口１１５を有すると共に、このサンプ
ル注入口１１５と混合試薬ポンプ１２０との間にｄＮＴ
Ｐ試薬注入口、すなわちｄＡＴＰ試薬注入口１７１、ｄ
ＴＴＰ試薬注入口１７２、ｄＣＴＰ試薬注入口１７３及
びｄＧＴＰ試薬注入口１７４を有している。さらに、反
応流路１１０は、サンプル注入口１１５の下流側で光量
センサ１３０と電磁石１３１との間に位置するサンプル
保持部１１６を有すると共に、最終的には混合試薬槽１
００に接続している。また、ｄＡＴＰ試薬注入口１７
１、ｄＴＴＰ試薬注入口１７２、ｄＣＴＰ試薬注入口１
７３及びｄＧＴＰ試薬注入口１７４は、ｄＮＴＰ試薬流
路１１１〜１１４に連通している。

【００１７】ここで、反応流路１１０は、断面形状が幅
２ｍｍ、深さ０．１ｍｍであり、流路長が１２０ｍｍ、
反応流路内容積が２４μｌである。また、ｄＮＴＰ試薬
流路１１１〜１１４は、断面形状が幅０．１ｍｍ、深さ
０．１ｍｍであり、流路長が２３〜２５ｍｍ、ｄＮＴＰ
試薬流路内容積が０．２５μｌである。さらには、混合
試薬槽１００は、直径が１０ｍｍ、深さが５ｍｍ、混合
試薬槽容積が３９３μｌである。そして、ｄＮＴＰ試薬
槽１０１〜１０４は、直径が７ｍｍ、深さが５ｍｍ、ｄ
ＮＴＰ試薬槽容積が１９２μｌである。また、ｄＮＴＰ
試薬注入口１７１〜１７４とサンプル保持部１１６との
間隔は３０ｍｍである。

【００１８】各試薬１４０〜１４４の流れは次の通りで
ある。混合試薬１４０の場合は、混合試薬ポンプ１２０
が混合試薬槽１００から混合試薬１４０を吸い込み、反
応流路１１０へと吐き出す流れを作り出し、この流れは
混合試薬槽１００まで達する。混合試薬槽１００に戻っ
た混合試薬１４０を再び混合試薬ポンプ１２０が吸い込
み、反応流路１１０へと吐き出す。このように、混合試
薬ポンプ１２０は混合試薬１４０が反応流路１１０の中
を循環する流れを作り出す。一方、ｄＮＴＰ試薬１４１
〜１４４の場合は、ｄＮＴＰ試薬ポンプ１２１〜１２４
がｄＮＴＰ試薬槽１０１〜１０４からｄＮＴＰ試薬１４
１〜１４４を吸い込み、ｄＮＴＰ試薬流路１１１〜１１
４へと吐き出す流れを作り出し、ｄＮＴＰ試薬注入口１
７１〜１７４を通して反応流路１１０の中にｄＮＴＰ試
薬１４１〜１４４を注入する。

【００１９】ここで、反応流路１１０内の混合試薬１４
０の流速は２ｍｍ／ｓである。また、ｄＮＴＰ試薬１４
１〜１４４の１回の注入量は０．１μｌである。この
０．１μｌのｄＮＴＰ試薬１４１〜１４４が失活試薬に
より失活する時間は５０ｓである。

【００２０】電磁石１３１は、サンプル保持部１１６に
隣接して配置されて核酸サンプルの捕獲手段を構成し、
電流が流れると電磁力を発生し、サンプル注入口１１５
から注入された磁性ビーズ付き核酸サンプル１４５を反
応流路１１０の内壁にあるサンプル保持部１１６に捕獲
する。そして、光量センサ１３０は、この磁性ビーズ付
き核酸サンプル１４５が捕獲されるサンプル保持部１１
６に隣接して配置されて発光検出手段を構成し、核酸サ
ンプル１９２（図５参照）とｄＮＴＰ試薬１４１〜１４
４との化学反応に起因した発光を検知する。

【００２１】次に、係る分析装置１の動作手順を図３及
び図４を参照しながら説明する。図４は図１の分析装置
の動作手順を示すフローチャート図である。

【００２２】まず、試薬の充填について説明する。混合
試薬槽１１０に発光試薬と失活試薬を混合した混合試薬
１４０を充填すると共に、ｄＮＴＰ試薬槽１０１〜１０
４に４種類のｄＮＴＰ試薬１４１〜１４４を充填する。
その充填量は、例えば５０塩基分の分析の場合には、混
合試薬１４０が１００μｌ、ｄＮＴＰ試薬１４１〜１４
４が各々１０μｌである。そして、４個のｄＮＴＰ試薬
ポンプ１２１〜１２４を駆動し、ｄＮＴＰ試薬流路１１
１〜１１４内を各々のｄＮＴＰ試薬１４１〜１４４で充
填する。この際、ｄＮＴＰ試薬１４１〜１４４が反応流
路１１０に達するまでｄＮＴＰ試薬ポンプ１２１〜１２
４を駆動する。ｄＮＴＰ試薬１４１〜１４４が反応流路
１１０に達したら、混合試薬ポンプ１２０を駆動し、反
応流路１１０内を混合試薬１４０で充填する。この充填
が済んだらｄＮＴＰ試薬１４１〜１４４が混合試薬１４
０内の失活試薬にて失活するまで所定時間保持する。以
上で各流路１１０、１１１〜１１４内の試薬充填を終え
る（ステップ３１０）。

【００２３】次に、核酸サンプルの注入について説明す
る。電磁石１３１に電流を流して電磁力を発生させた状
態で、プライマの付いた磁性ビーズ付き核酸サンプル１
４５の入ったサンプル液をサンプル注入口１１５から反
応流路１１０内の混合試薬１４０に注入する。この注入
は、マイクロシリンジ等のシリンジポンプを用い、注射
針をサンプル注入口１１５に突き刺して反応流路１１０
内にサンプル液を注入する。そして、サンプル液が電磁
石１３１付近の反応流路１１０内にあるサンプル保持部
１１６を通過する時に、電磁石１３１の電磁力により磁
性ビーズ付き核酸サンプル１４５を捕獲する。このよう
に、磁性ビーズ付き核酸サンプル１４５の捕獲は、電磁
石１３1の通電制御により極めて容易に行なうことがで
きる。以上でサンプルの注入を終える（ステップ３１
１）。

【００２４】次に、分析の手順について説明する。ま
ず、混合試薬ポンプ１２０を駆動して混合試薬１４０を
反応流路１１０で循環し続ける（ステップ３１２）。ま
た、光量センサ１３０による計測も開始する（ステップ
３１３）。この状態で、ｄＡＴＰ試薬１４１のｄＡＴＰ
試薬ポンプ１２１を一定時間駆動することにより、ｄＡ
ＴＰ試薬１４１がｄＡＴＰ試薬槽１０１からｄＡＴＰ試
薬ポンプ１２１に吸込まれ、ｄＡＴＰ試薬ポンプ１２１
からｄＡＴＰ試薬流路１１１を通って反応流路１１０内
の混合試薬領域１５０に一定量のｄＡＴＰ試薬１４１が
注入され、反応流路１１０内の混合試薬領域中にｄＡＴ
Ｐ試薬１４１が混入した領域１５１が作られる（ステッ
プ３１４）。その後、一定時間間隔を空けてからｄＣＴ
Ｐ試薬１４３のｄＣＴＰ試薬ポンプ１２３を一定時間駆
動することにより、ｄＣＴＰ試薬１４３がｄＣＴＰ試薬
槽１０３からｄＣＴＰ試薬ポンプ１２３に吸込まれ、ｄ
ＣＴＰ試薬ポンプ１２３からｄＣＴＰ試薬流路１１３を
通って反応流路１１０に一定量のｄＣＴＰ試薬１４３が
注入され、反応流路１１０内の混合試薬領域中にｄＣＴ
Ｐ試薬を混入した領域１５３が作られる（ステップ３１
５）。さらに、一定時間間隔を空けてからｄＴＴＰ試薬
１４２のｄＴＴＰ試薬ポンプ１２２を一定時間駆動する
ことにより、ｄＴＴＰ試薬１４２がｄＴＴＰ試薬槽１０
２からｄＴＴＰ試薬ポンプ１２２に吸込まれ、ｄＴＴＰ
試薬ポンプ１２２からｄＴＴＰ試薬流路１１２を通って
反応流路１１０内の反応流路１１０に一定量のｄＴＴＰ
試薬１４２が注入され、反応流路１１０内の混合試薬領
域中にｄＴＴＰ試薬を混入した領域１５２が作られる
（ステップ３１６）。そして、一定時間間隔を空けてか
らｄＧＴＰ試薬１４４のｄＧＴＰ試薬ポンプ１２４を一
定時間駆動することにより、ｄＧＴＰ試薬１４４がｄＧ
ＴＰ試薬槽１０４からｄＧＴＰ試薬ポンプ１２４に吸込
まれ、ｄＧＴＰ試薬ポンプ１２４からｄＧＴＰ試薬流路
１１４を通って反応流路１１０に一定量のｄＧＴＰ試薬
１４４が注入され、反応流路１１０内の混合試薬領域中
にｄＧＴＰ試薬を混入した領域１５４が作られる（ステ
ップ３１７）。

【００２５】なお、ｄＮＴＰ試薬ポンプ１２１〜１２４
の駆動時間は１ｓとし、駆動間隔は５ｓとしている。ま
た、ｄＡＴＰ試薬１４１とｄＴＴＰ試薬１４２、或いは
ｄＣＴＰ試薬１４３とｄＧＴＰ試薬１４４とは各々結合
することから、上述したようにｄＡＴＰ試薬１４１とｄ
ＴＴＰ試薬１４２、或いはｄＣＴＰ試薬１４３とｄＧＴ
Ｐ試薬１４４が連続しない順序でｄＮＴＰ試薬を注入す
るようにしている。これにより、各ｄＮＴＰ試薬間の汚
染を防止してｄＮＴＰ試薬と核酸サンプルとの確実な結
合を図ることができる。

【００２６】以上の工程を繰り返すことにより、反応流
路１１０には４種類のｄＮＴＰ試薬１４１〜１４４を混
合試薬１４０にそれぞれ混入させた領域が縞状に形成さ
れ、順次、核酸サンプルと接触する。そして、接触した
時に核酸サンプル１９２とｄＮＴＰ試薬１４１〜１４４
の結合が行われると発光が生じ、既に計測を開始してい
る光量センサ１３０により発光量が計測される。この実
施例では、このような計測が５０塩基分が完了するまで
行われる（ステップ３１８）。

【００２７】次に、核酸サンプルとｄＮＴＰ試薬との具
体的な結合状況について図５を参照しながら説明する。
図５は図１の分析装置における核酸サンプルとｄＮＴＰ
試薬との結合状態を説明する模式図である。

【００２８】図５に示す磁性ビーズ付き核酸サンプル１
４５は、磁性を有する磁性ビーズ１９１と、この磁性ビ
ーズ１９１に付いている核酸サンプル１９２と、この核
酸サンプル１９２に結合しているプライマ１９３とから
なっており、電磁石１３１により反応流路１１０のサン
プル保持部１１６に保持されている。この磁性ビーズ付
き核酸サンプル１４５の初期状態は、図５（ａ）に示す
ように、核酸サンプル１９２にプライマ１９３が結合さ
れ、核酸サンプル１９２のプライマ１９３以降の塩基配
列がＴＡＡＣの場合の例である。なお、塩基配列の記号
は、Ａ：アデニン、Ｇ：グアニン、Ｃ：シトニン、Ｔ：
チミンである。

【００２９】この初期状態で、ｄＡＴＰ試薬１４１を混
入した領域１５１が反応流路１１０を流れてきてサンプ
ル保持部１１６の核酸サンプル１９２に接触すると、図
５（ｂ）に示すように、核酸サンプル１９２のＴと領域
１５１のｄＡＴＰ試薬１４１との結合が行われ、この結
合による化学反応に起因して発光が生ずる。この発光が
光量センサ１３０にて計測され、１結合分の発光量が計
測される。そして、ｄＡＴＰ試薬１４１を混入した領域
１５１は、サンプル保持部１１６を通過した後に、混合
試薬槽１００までの反応流路１１０で、未反応のｄＡＴ
Ｐ試薬１４１の大半が混合試薬１４０に含まれる失活試
薬により失活される。反応流路１１０で失活されなかっ
た未反応のｄＡＴＰ試薬１４１は混合試薬槽１００で失
活される。また、サンプル保持部１１６付近に残留する
未反応ｄＡＴＰ試薬１４１は、次に続く混合試薬１４０
だけの領域１５０がサンプル保持部１１６を通過する際
に領域１５０に含まれる失活試薬により失活する。

【００３０】次いで、ｄＣＴＰ試薬１４３を混入した領
域１５３が核酸サンプル１９２に接触すると、図５
（ｃ）に示すように、核酸サンプル１９２のＡとｄＣＴ
Ｐ試薬１４３とは結合しないために発光も生じない。し
たがって、光量センサ１３０にて発光量が測定されな
い。そして、未反応のｄＣＴＰ１４３は、上述したｄＡ
ＴＰ試薬１４１の失活と同様にして、混合試薬１４０に
含まれる失活試薬により失活する。

【００３１】次いで、ｄＴＴＰ試薬１４２を混入した領
域１５２が核酸サンプル１９２に接触すると、図５
（ｄ）に示すように、核酸サンプル１９２のＡと領域１
５２のｄＴＴＰ試薬１４２との結合が行われ、ほぼ同時
に核酸サンプル１９２の次のＡとのｄＴＴＰ試薬１４２
の結合が行われ、これらの結合による化学反応に起因し
てそれぞれの発光が生ずる。これらの発光が光量センサ
１３０にて計測され、２結合分の発光量が計測される。
そして、未反応のｄＡＴＰ試薬１４２は、上述したｄＡ
ＴＰ試薬１４１及びｄＣＴＰ試薬１４３の失活と同様に
して、混合試薬１４０に含まれる失活試薬により失活す
る。

【００３２】次いで、ｄＧＴＰ試薬１４４を混入した領
域１５４が核酸サンプル１９２に接触すると、図５
（ｅ）に示すように、核酸サンプル１９２のＣと領域１
５４のｄＧＴＰ試薬１４４の結合による化学反応に起因
して発光が生ずる。この発光が光量センサ１３０にて計
測され、１結合分の発光量が計測される。そして、未反
応のｄＡＴＰ試薬１４４は、上述したｄＡＴＰ試薬１４
１、ｄＣＴＰ試薬１４３及びｄＴＴＰ試薬１４２の失活
と同様にして、混合試薬１４０に含まれる失活試薬によ
り失活する。

【００３３】以上の工程により、計測された発光量プロ
フィールは、ｄＡＴＰ試薬で１結合分、ｄＴＴＰ試薬で
２結合分、ｄＧＴＰ試薬で１結合分の順序であるから、
核酸サンプルのプライマ以降の塩基配列がＴＡＡＣであ
ることが分析される。そして、上述した工程によれば、
核酸サンプル１９２への各ｄＮＴＰ１４１〜１４４の供
給と供給後の未反応の各ｄＮＴＰ試薬１４１〜１４４の
失活とが平行して行われるので、各ｄＮＴＰ試薬１４１
〜１４４の失活時間が分析時間に付加されることとにな
らず、分析時間が大幅に短縮される。

【００３４】次に、係る分析装置の反応流路における限
界値を図６を参照しながら説明する。図６は図１の分析
装置の反応流路の試薬注入口とサンプル保持部との間隔
及び流路長の限界値を説明する特性図である。

【００３５】ｄＮＴＰ試薬１４１〜１４４の塩基は、混
合試薬１４０に含まれる失活試薬により失活するため、
ｄＮＴＰ試薬注入口１７１〜１７４とサンプル保持部１
１６との間隔、及び反応流路１１０の流路長は、ｄＮＴ
Ｐ試薬の塩基数ｎ及び失活時間ｔと混合試薬１４０の流
速ｖに依存する。

【００３６】具体的には、初期の塩基数がｎ０個のｄＮ
ＴＰ試薬１４１〜１４４が失活試薬と混合してから時間
ｔ２で完全に失活する場合、塩基数を時間の一次近似で
表すと図６のようになる。そして、分析において必要最
低限の塩基数をｎ１個とすると、図６より残留する塩基
数がｎ１となる時間ｔ１が分析可能な限界値となり、時
間ｔ１までにｄＮＴＰ試薬１４１〜１４４を核酸サンプ
ル１９２に接触させる必要がある。このときの混合試薬
１４０の流速をｖとすると、ｄＮＴＰ試薬注入口１７１
〜１７４とサンプル保持部１１６との限界間隔はｄ＝ｔ
１×ｖとなり、この値が限界値となる。

【００３７】また、ｄＮＴＰ試薬１４１〜１４４は、混
合試薬１４０がｄＮＴＰ試薬注入口１７１〜１７４から
一巡するまでに失活している必要があるので、限界反応
流路長はＬ＝ｔ２×ｖとなり、この値が限界値となる。

【００３８】本実施例では、失活時間がｔ２＝５０ｓ、
流速がｖ＝２ｍｍ／ｓに設定してあるので、限界反応流
路長はＬ＝１００ｍｍとなり、上述した反応流路１１０
の長さ１２０ｍｍはこれを満足している。また、塩基数
比をｎ１／ｎ０＝０．６としてあるので、ｄＮＴＰ試薬
注入口１７１〜１７４とサンプル保持部１１６との限界
間隔はｄ＝４０ｍｍとなり、上述したｄＮＴＰ試薬注入
口１７１〜１７４とサンプル保持部１１６との間隔３０
ｍｍはこれを満足する。

【００３９】また、本実施例では各ｄＮＴＰ試薬槽１０
１〜１０４への試薬充填量は１０μｌである。この量は
ｄＮＴＰ試薬１４１〜１４４の一回の注入量が０．１μ
ｌで、核酸サンプルの５０塩基分の分析に必要な総消費
量５μｌとｄＮＴＰ試薬流路１１１〜１１４内の充填分
２μｌを満たす量である。そして、混合試薬槽１００へ
の充填量は１００μｌである。この量は反応流路１１０
内に注入される４種のｄＮＴＰ試薬１４１〜１４４の総
和を失活させるに十分な値であり、かつ反応流路１１０
内を充填するにも十分な容量である。

【００４０】以上のように、未反応のｄＮＴＰ試薬１４
１〜１４４の大半は混合試薬槽１００までの反応流路１
１０内及び混合試薬槽１００内にて失活させられるため
に、これに要する時間は分析時間に組み込まれない。し
たがって、分析のスループットを向上することができ
る。

【００４１】次に、係る分析装置１の製造方法を図７を
参照しながら説明する。図７は図１の分析装置の製造方
法を示す斜視図である。

【００４２】分析装置１は、槽基板１６１、流路基板１
６２、底基板１６３、混合試薬ポンプ１２０、ｄＮＴＰ
試薬ポンプ１２１〜１２４、光量センサ１３０、電磁石
１３１から成る。槽基板１６１と流路基板１６２と底基
板１６３は型枠に樹脂を流し込み成形する。樹脂には透
明で転写性に優れているポリジメチルシロキ酸（ＰＤＭ
Ｓ：ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）を用
いている。

【００４３】まず、槽基板１６１の製作について説明す
る。各槽１００〜１０４及び光量センサ１３０に相当す
る雄型部材を固定しガラス板と、このガラス板の外周に
はめた外枠と、この外枠を塞ぐように設けたガラス蓋と
により型枠を形成する。そして、この型枠の注入穴から
ＰＤＭＳを型枠内に注入し、注入したＰＤＭＳが硬化し
たら型枠を外してＰＤＭＳで構成された槽基板１６１を
取り出す。

【００４４】次に、底基板１６３の製作について説明す
る。ポンプ１２０〜１２４及び電磁石１３１に相当する
雄型部材を固定したガラス板と、このガラス板の外周に
はめた外枠と、この外枠を塞ぐように設けたガラス蓋と
により型枠を形成する。この型枠の注入穴からＰＤＭＳ
を型枠内に注入し、注入したＰＤＭＳが硬化したら型枠
を外してＰＤＭＳで構成された底基板１６３を取り出
す。

【００４５】次に、流路基板１６２の製作について説明
する。各流路１１０〜１１４に相当する凸部はマイクロ
ファブリケーションを用いて製作している。すなわち、
ウエハにレジストを塗布して乾燥させた後に、流路の平
面形状のフォトマスクを用いて露光を行いレジストを感
光させて現像し、流路の雄型をウエハに形成する。これ
に各槽の一部に相当する雄型部材を固定し、これの外周
に外枠をはめ、さらにガラス蓋をして型枠を形成する。
この型枠の注入穴からＰＤＭＳを型枠内に注入し、注入
したＰＤＭＳが硬化したら型枠を外してＰＤＭＳで構成
された流路基板１６２を取り出す。

【００４６】次に、分析装置１の組立について説明す
る。槽基板１６１と流路基板１６２と底基板１６３とを
重ね合わせ、その密着面を酸素プラズマでアッシングし
て貼り付ける。ポンプ１２０〜１２４、光量センサ１３
０、電磁石１３１を所定位置に配置して酸素プラズマで
アッシングして貼り付ける。なお、ポンプ１２０〜１２
４、光量センサ１３０、電磁石１３１を接着材にて固定
してもよい。

【００４７】以上のように、３枚の基板１６１〜１６３
を貼り付けることにより、分析装置１の基本的な構造体
が形成されるので、分析装置１を簡単に製造することが
できる。特に、マイクロファブリケーションを用いた型
枠作製とＰＤＭＳの転写性に優れた点を利用することに
より、微細流路を容易に製作することができ、この点か
らも分析装置１の製造を容易に行なえる。

【００４８】次に、本発明の第２の実施例の分析装置を
図８及び図９を用いて説明する。

【００４９】まず、分析装置２の全体構成を図８を参照
しながら説明する。図８は本発明の第２の実施例の分析
装置の全体構成を示す斜視図である。

【００５０】この分析装置２は本体２００とノズル部材
２１０から構成される。本体２００は、分析するための
槽２３０〜２３５を載置して水平方向に移動する２軸ス
テージ２４０と、ノズル部材２１０を保持して昇降する
昇降ステージ２４１とを有している。この２軸ステージ
２４０に載置される槽２３０〜２３５は、核酸サンプル
を含むサンプル液２５０を充填したサンプル槽２３０
と、発光試薬を含む４種類のｄＮＴＰ混合試薬を充填し
たｄＮＴＰ混合試薬槽２３１〜２３４と、失活試薬を充
填した失活試薬槽２３５とから構成され、２軸ステージ
２４０により移動可能となっている。各槽２３０〜２３
５は、同一形状をしており、複数の液体の収納部を有し
ている。また、２軸ステージ２４０は、ｄＮＴＰ混合試
薬槽２３１〜２３４の直下に位置する部分に光量センサ
２２１を配置している。一方、ノズル部材２１０は、核
酸サンプルとｄＮＴＰ試薬との反応部を構成するもので
あり、下端が開口するノズル２１１と、このノズル２１
１に連通するポンプ室２１２を有している。そして、ノ
ズル部材２１０のポンプ室２１２の上面はダイアフラム
になっており、その直上にはリニアアクチュエータ２４
２が配置されている。なお、ノズル２１１の側面に電磁
石２２０が配置されている（図９参照）。

【００５１】次に、係る分析装置２の分析の動作を図９
を参照しながら説明する。図９は図８の分析装置の分析
工程を説明するノズル部材周辺の縦断面工程図である。

【００５２】まず、図９（ａ）〜（ｃ）を用いて核酸サ
ンプル２５１の捕獲について説明する。２軸ステージ２
４０によりサンプル槽２３０をノズル２１１の直下に移
動させる。リニアアクチュエータ２４２を実線矢印の方
向に降下させてポンプ室２１２上面のダイアフラムを凹
ませてポンプ室内容積を減少させる。この状態で、図９
（ａ）のように、昇降ステージ２４１によりノズル部材
２１０を降下させ、ノズル２１１の下端部を槽内サンプ
ル液２５０に進入させる。そして、図９（ｂ）のよう
に、リニアアクチュエータ２４２を実線矢印の方向に引
き戻してポンプ室内容積を元の状態に戻すことによりノ
ズル２１１内にサンプル液２５０を吸引する。この状態
で、本体側の電磁石２２０に電流を流して磁性ビーズ付
核酸サンプル２５１をノズル２１１内に捕獲する。この
磁性ビーズ付核酸サンプル２５１をノズル２１１内に捕
獲した状態で、昇降ステージ２４１を上昇させてノズル
部材２１０を上昇させてノズル２１１をサンプル液体中
から引き上げ、２１１を図９（ｃ）のように、再度リニ
アアクチュエータ２４２を実線矢印の方向に降下させて
ポンプ室２１２上面のダイアフラムを凹ませることによ
り、磁性ビーズ付き核酸サンプル２５１をノズル２１１
内に残してサンプル液２５０を廃棄する。

【００５３】次に、図９（ｄ）〜（ｆ）を用いてｄＮＴ
Ｐ混合試薬ノズル２１１へ吸引して塩基配列の測定を行
なう方法について説明する。２軸ステージ２４０により
所定の槽、例えばｄＡＴＰ混合試薬槽２３１をノズル２
１１の直下に移動させる。そして、リニアアクチュエー
タ２４２を実線矢印の方向に降下させてポンプ室２１２
上面のダイアフラムを凹ませてポンプ室内容積を減少さ
せる。この状態で、図９（ｄ）のように、昇降ステージ
２４１によりノズル部材２１０を降下させ、ノズル２１
１の下端部を槽内ｄＡＴＰ混合試薬液２５３に進入させ
る。そして、図９（ｅ）のように、リニアアクチュエー
タ２４２を実線矢印方向に引き戻してポンプ室内容積を
元の状態に戻すことにより、ノズル２１１内にｄＡＴＰ
混合試薬液２５３を吸引する。これにより、ｄＡＴＰ混
合試薬２５３は磁性ビーズ付き核酸サンプル２５１に接
触し、上述した第１の実施例の場合と同様に、塩基配列
の分析対象がＴであればＴとｄＡＴＰ試薬の結合に起因
する化学反応により発光が生じ、光量センサ２２１によ
りその発光量が計測される。塩基配列の分析対象がＴ以
外であって結合が行われなければ発光は生じない。この
計測が済んだ後に、図９（ｆ）のように、再度リニアア
クチュエータ２４２を実線矢印の方向に降下させてポン
プ室２１２上面のダイアフラムを凹ませることにより、
ｄＡＴＰ混合試薬２５３を廃棄する。

【００５４】次に、ノズル２１１内壁に残留しているｄ
ＡＴＰ試薬を失活させる方法について説明する。２軸ス
テージ２４０により失活試薬槽２３５をノズル２１１の
直下に移動させる。そして、上述した図９（ｄ）〜
（ｆ）と同様の手順により、失活試薬をノズル２１１内
に吸引してノズル２１１内壁に残留しているｄＡＴＰ混
合試薬を失活させた後に失活試薬を廃棄する。

【００５５】続いて、上述した図９（ｄ）以降と同様の
工程で、ｄＣＴＰ混合試薬による測定およびその失活、
ｄＴＴＰ混合試薬による測定及びその失活、及びｄＧＴ
Ｐ混合試薬による測定及びその失活の順で繰り返すこと
により分析を行う。

【００５６】なお、上記の工程の中で、必要であれば各
試薬吐出後に蒸留水でノズル周りを洗浄しても良い。ま
た、本実施例によれば、吸入した各試薬を廃棄するよう
にしているが、核酸サンプルとｄＮＴＰ混合試薬との結
合またはｄＮＴＰ混合試薬の失活を再度行なうのに十分
な濃度が保持できれている場合には、これらの試薬を元
の槽に戻しても良い。これにより、各試薬を有効に活用
することができる。

【００５７】このようにして、１つの磁性ビーズ付き核
酸サンプル２５１の所定の分析が終了すると、電磁石２
２０への通電を停止することにより、磁性ビーズ付き核
酸サンプル２５１をノズル２１１から排出する。その
後、新たな磁性ビーズ付き核酸サンプルを分析が上述し
た図９（ａ）以降の工程で行なわれる。

【００５８】また、本実施例のノズル部材２１０は、上
述した第１の実施例と同様に、雄型治具を用いてＰＤＭ
Ｓによりポンプ室を製作し、ノズル２１１にはガラス管
を用いている。これにより、簡単にノズル部材２１０を
製作することができる。

【００５９】以上のように、本実施例によれば、未反応
のｄＮＴＰ試薬の大半は廃棄または元の試薬槽に戻さ
れ、ノズル２１１に残留したｄＮＴＰ試薬のみを失活す
るようにしているので、この失活時間を大幅に短縮でき
る。したがって、分析のスループットを向上することが
でき、塩基配列の分析時間を短縮させることが可能であ
る。

【００６０】また、本実施例によれば、電磁石の通電を
制御することにより、ノズル２１１内に吸引したサンプ
ル液中の磁性ビーズ付き核酸サンプル２５１を容易に捕
獲して各ｄＮＴＰ試薬との反応測定を行なうことができ
ると共に、反応測定終了後に容易に磁性ビーズ付き核酸
サンプル２５１を排出することができるので、磁性ビー
ズ付き核酸サンプル２５１の捕獲保持及び交換を容易に
行なうことができる。

【００６１】

【発明の効果】本発明によれば、反応過程と失活過程を
平行に行なって塩基配列の分析時間を短縮することが可
能な核酸分析装置及び核酸分析方法を得ることができ
る。

【００６２】また、本発明よれば、反応過程後の失活時
間を短縮して塩基配列の分析時間を短縮させることが可
能な核酸分析装置及び核酸分析方法を得ることができ
る。

【００６３】また、本発明よれば、核酸サンプルの捕獲
及び交換が容易に行なえる核酸分析方法を得ることがで
きる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第１の実施例の分析装置の全体構成を
示す斜視図である。

【図２】図１のＡ部の詳細図である。

【図３】図１の分析装置の動作状態を示す模式図であ
る。

【図４】図１の分析装置の動作手順を示すフローチャー
ト図である。

【図５】図１の分析装置における核酸サンプルとｄＮＴ
Ｐ試薬との結合状態を説明する模式図である。

【図６】図１の分析装置の反応流路の試薬注入口とサン
プル保持部との間隔及び流路長の限界値を説明する特性
図である。

【図７】図１の分析装置の製造方法を示す斜視図であ
る。

【図８】本発明の第２の実施例の分析装置の全体構成を
示す斜視図である。

【図９】図８の分析装置の分析工程を説明するノズル部
材周辺の縦断面工程図である。

【符号の説明】

１００…混合試薬槽、１０１…ｄＡＴＰ試薬槽、１０２
…ｄＴＴＰ試薬槽、１０３…ｄＣＴＰ試薬槽、１０４…
ｄＧＴＰ試薬槽、１１０…反応流路、１１１…ｄＡＴＰ
試薬流路、１１２…ｄＴＴ試薬流路、１１３…ｄＣＴＰ
試薬流路、１１４…ｄＧＴ試薬流路、１１５…サンプル
注入口、１１６…サンプル保持部、１２０…混合試薬ポ
ンプ、１２１…ｄＡＴＰ試薬ポンプ、１２２…ｄＴＴＰ
試薬ポンプ、１２３…ｄＣＴＰ試薬ポンプ、１２４…ｄ
ＧＴＰ試薬ポンプ、１３０…光量センサ、１３１…電磁
石、１４０…混合試薬、１４１…ｄＡＴＰ試薬、１４２
…ｄＴＴＰ試薬、１４３…ｄＣＴＰ試薬、１４４…ｄＧ
ＴＰ試薬、１４５…磁性ビーズ付き核酸サンプル、１５
０…混合試薬だけの領域、１５１…ｄＡＴＰ試薬を混入
した領域、１５２…ｄＴＴＰ試薬を混入した領域、１５
３…ｄＣＴＰ試薬を混入した領域、１５４…ｄＧＴＰ試
薬を混入した領域、１６１…槽基板、１６２…流路基
板、１６３…底基板、１７１…ｄＡＴＰ試薬注入口、１
７２…ｄＴＴＰ試薬注入口、１７３…ｄＣＴＰ試薬注入
口、１７４…ｄＧＴＰ試薬注入口、１９１…磁性ビー
ズ、１９２…核酸サンプル、１９３…プライマ、２００
…本体、２１０…ノズル部材、２１１…ノズル、２１２
…ポンプ室、２２０…電磁石、２２１…光量センサ、２
３０…サンプル槽、２３１…ｄＡＴＰ混合試薬槽、２３
２…ｄＴＴＰ混合試薬槽、２３３…ｄＣＴＰ混合試薬
槽、２３４…ｄＧＴＰ混合試薬槽、２３５…失活試薬
槽、２４０…２軸ステージ、２４１…昇降ステージ、２
４２…リニアアクチュエータ、２５０…サンプル液、２
５１…磁性ビーズ付き核酸サンプル、２５３…ｄＡＴＰ
混合試薬液。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/483 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/50 C12M 1/00 C12N 15/09 C12Q 1/68 G01N 21/78 G01N 33/483

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】分析対象の核酸サンプルを供給する核酸サ
ンプル供給手段と、前記供給された核酸サンプルを捕獲する捕獲手段と、前記核酸サンプルに１塩基単位で結合し且つｄＡＴＰ試
薬、ｄＴＴＰ試薬、ｄＣＴＰ試薬及びｄＧＴＰ試薬から
１つ選択されるｄＮＴＰ試薬である第１試薬と前記第１
試薬の結合に起因して発光する第２試薬と前記第１試薬
の結合作用を失活する第３試薬とを含む第１混合試薬
と、前記第１試薬の他のｄＮＴＰ試薬と第２試薬と第３
試薬とを含む第２混合試薬とが、前記第２試薬と前記第
３試薬とを含む第３混合試薬を介在して、前記捕獲され
た核酸サンプルに順次供給され、前記核酸サンプルに供
給された前記第１混合試薬から第３混合試薬の混合液が
順次流下される流路と、前記第２試薬の発光を検出する発光検出手段とを備えて
いることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項２】分析対象の核酸サンプルを核酸サンプル供
給手段により供給する手順と、前記供給された核酸サンプルを捕獲手段により捕獲する
手順と、前記核酸サンプルに１塩基単位で結合し且つｄＡＴＰ試
薬、ｄＴＴＰ試薬、ｄＣＴＰ試薬及びｄＧＴＰ試薬から
１つ選択されるｄＮＴＰ試薬である第１試薬と前記第１
試薬の結合に起因して発光する第２試薬と前記第１試薬
の結合作用を失活する第３試薬とを含む第１混合試薬
と、前記第１試薬の他のｄＮＴＰ試薬と第２試薬と第３
試薬とを含む第２混合試薬とを、前記第２試薬と前記第
３試薬とを含む第３混合試薬を介在して、前記捕獲され
た核酸サンプルに流路を通して順次供給すると共に、前
記核酸サンプルに供給された前記第１混合試薬から第３
混合試薬の混合液を流路を通して順次流下する手順と、前記第２試薬の発光を発光検出手段により検出する手順
とを備えていることを特徴とする核酸分析方法。
【請求項３】ｄＮＴＰ試薬が核酸サンプルに結合するこ
とに起因して発光する発光試薬及び前記ｄＮＴＰ試薬の
結合作用を失活する失活試薬を混合した混合試薬を反応
流路を通して循環させる循環手段と、分析対象の核酸サ
ンプルを前記反応流路の混合試薬中に供給する核酸サン
プル供給手段と、前記供給された核酸サンプルを前記反
応流路の途中で捕獲する捕獲手段と、前記核酸サンプル
に１塩基単位で結合する複数のｄＮＴＰ試薬を前記捕獲
手段の上流側で前記混合試薬中に順次間隔を空けて供給
するｄＮＴＰ試薬供給手段と、前記捕獲された核酸サン
プルと前記ｄＮＴＰ試薬との結合により生ずる発光を検
出する発光検出手段とを備えていることを特徴とする核
酸分析装置。
【請求項４】請求項３において、前記循環手段は、前記
混合試薬を保管する混合試薬槽と、前記混合試薬槽から
前記混合試薬を吸引して前記反応流路に吐出する混合試
薬ポンプと介して前記混合試薬を循環するものであり、
前記ｄＮＴＰ試薬は、ｄＡＴＰ試薬、ｄＴＴＰ試薬、ｄ
ＣＴＰ試薬及びｄＧＴＰ試薬の４種類のｄＮＴＰ試薬か
ら成り、前記ｄＮＴＰ供給手段は、前記４種類のｄＮＴ
Ｐ試薬をそれぞれ保管する４つのｄＮＴＰ試薬槽と、各
ｄＮＴＰ試薬槽から各ｄＮＴＰ試薬を吸引して前記反応
流路に連通する試薬流路に吐出するｄＮＴＰ試薬ポンプ
とを備えていることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項５】ｄＮＴＰ試薬が核酸サンプルに結合するこ
とに起因して発光する発光試薬及び前記ｄＮＴＰ試薬の
結合作用を失活する失活試薬を混合した混合試薬を循環
手段により反応流路を通して循環させる手順と、分析対
象の核酸サンプルを前記反応流路の混合試薬中に核酸サ
ンプル供給手段により供給する手順と、前記供給された
核酸サンプルを前記反応流路の途中で捕獲手段により捕
獲する手順と、前記核酸サンプルに１塩基単位で結合す
る複数のｄＮＴＰ試薬をｄＮＴＰ試薬供給手段により前
記捕獲手段の上流側で前記混合試薬中に順次間隔を空け
て供給すると、前記捕獲された核酸サンプルと前記ｄＮ
ＴＰ試薬との結合により生ずる発光を発光検出手段によ
り検出する手順とを備えていることを特徴とする核酸分
析方法。