JP3445038B2 - 精神的ストレス性障害関連抗原の測定法 - Google Patents
精神的ストレス性障害関連抗原の測定法Info
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- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、精神的ストレス性
障害の診断に関するものであり、詳しくは、精神的スト
レス負荷時に分泌される精神的ストレス関連タンパク質
に対する抗体またはその断片を用いて、免疫学的測定法
によりヒト体液中の精神的ストレス性障害関連抗原を測
定する方法、ならびに該方法に用いる診断キットに関す
る。
障害の診断に関するものであり、詳しくは、精神的スト
レス負荷時に分泌される精神的ストレス関連タンパク質
に対する抗体またはその断片を用いて、免疫学的測定法
によりヒト体液中の精神的ストレス性障害関連抗原を測
定する方法、ならびに該方法に用いる診断キットに関す
る。
【０００２】
【従来技術】ストレスは一般には疲労感、不眠、不快
感、焦燥、不安などを生じさせる。ストレスはある個体
の心身に対して特別な負荷がかかった状態をさす。この
ストレス状態を引き起こす心身の外的内的作用因子に
は、（１）寒さ、暑さ、騒音、酸素欠乏などの物理化学
的な因子、（２）飢え、絶食、ビタミン不足、筋肉重労
働、妊娠などの生物学因子、（３）家族的要因、職業、
生活環境に属するもの、対人関係、経済的問題などの心
理的社会的因子、が挙げられる。現在では、心理的社会
的ストレスがもっとも大きな問題となっている。
感、焦燥、不安などを生じさせる。ストレスはある個体
の心身に対して特別な負荷がかかった状態をさす。この
ストレス状態を引き起こす心身の外的内的作用因子に
は、（１）寒さ、暑さ、騒音、酸素欠乏などの物理化学
的な因子、（２）飢え、絶食、ビタミン不足、筋肉重労
働、妊娠などの生物学因子、（３）家族的要因、職業、
生活環境に属するもの、対人関係、経済的問題などの心
理的社会的因子、が挙げられる。現在では、心理的社会
的ストレスがもっとも大きな問題となっている。
【０００３】例えば、アメリカ精神医学会による「ＤＳ
Ｍ−ＩＩＩ−Ｒ精神障害の診断、統計マニュアル」によ
れば、心理的社会的ストレスの強さの尺度は、急激に起
こる事象と持続的環境に分けられ、またそのストレスの
種類は成人と小児および青年用に分けられる。この尺度
によりおおまかなストレスの種類と強さの程度を決め、
それに基づく治療計画あるいは危機介入、援助計画をた
てることができる。特に急激に起こる事象では、その原
因は明確であるので、見落とされることは少ないが、持
続的環境による精神的ストレスはしばしば見落とされ、
かつこの持続的な精神的ストレスがさまざまな精神的ス
トレス関連障害の病因的働きをすることが多い。
Ｍ−ＩＩＩ−Ｒ精神障害の診断、統計マニュアル」によ
れば、心理的社会的ストレスの強さの尺度は、急激に起
こる事象と持続的環境に分けられ、またそのストレスの
種類は成人と小児および青年用に分けられる。この尺度
によりおおまかなストレスの種類と強さの程度を決め、
それに基づく治療計画あるいは危機介入、援助計画をた
てることができる。特に急激に起こる事象では、その原
因は明確であるので、見落とされることは少ないが、持
続的環境による精神的ストレスはしばしば見落とされ、
かつこの持続的な精神的ストレスがさまざまな精神的ス
トレス関連障害の病因的働きをすることが多い。
【０００４】しかしながら、このような精神的ストレス
の診断基準はあいまいで、かつ診断に多大な時間を要す
る。したがって、精神的ストレスの蓄積を簡単に予測、
判定できる方法があれば便利である。
の診断基準はあいまいで、かつ診断に多大な時間を要す
る。したがって、精神的ストレスの蓄積を簡単に予測、
判定できる方法があれば便利である。
【０００５】ところで、精神的ストレス状態において苦
味の感受性が低下することが、味の時間強度測定装置を
用いた官能評価によって本発明者らにより報告されてい
る（水間ら、味と匂学会誌、Vol.3:340-343, 1994）。
これによると、精神的ストレス状態に陥ると、苦味物質
であるキニーネ水溶液を口に含んだ後の苦味強度が低下
し、後味の持続時間が減少する。すなわち、苦味物質を
口にいれても苦味をあまり感じなくなる。
味の感受性が低下することが、味の時間強度測定装置を
用いた官能評価によって本発明者らにより報告されてい
る（水間ら、味と匂学会誌、Vol.3:340-343, 1994）。
これによると、精神的ストレス状態に陥ると、苦味物質
であるキニーネ水溶液を口に含んだ後の苦味強度が低下
し、後味の持続時間が減少する。すなわち、苦味物質を
口にいれても苦味をあまり感じなくなる。
【０００６】このように身体の状態あるいは心理状態に
よって味の感受性が変化することは日常ほとんどの人が
経験することであるが、何故変化するのかを解明した例
は少ない。数少ない例として、激しい運動をした後、酸
味の感受性が変化する原因として、唾液の緩衝能が増大
するために酸味を感じなくなる、という研究が報告され
ている（A. I. Spielman, Journal of Dent. Res., 69:
838-843, 1990）。
よって味の感受性が変化することは日常ほとんどの人が
経験することであるが、何故変化するのかを解明した例
は少ない。数少ない例として、激しい運動をした後、酸
味の感受性が変化する原因として、唾液の緩衝能が増大
するために酸味を感じなくなる、という研究が報告され
ている（A. I. Spielman, Journal of Dent. Res., 69:
838-843, 1990）。
【０００７】苦味感受性あるいは苦味を抑制する物質の
研究としては、唾液中成分でタンニン酸の苦味を抑制す
る物質としてＰＲＰｓ（Ｐｒｏｌｉｎ Ｒｉｃｈ Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ）の存在が知られている（J. I. Glendinnin
g, Chem. Sens., 17:1-12, 1992）。また、口腔内のｖ
ｏｎ Ｅｂｎｅｒ’ｓ ｇｌａｎｄｓから分泌されるＶ
ＥＧプロテインが脂溶性物質を味覚感受器に運ぶ役割を
演じているという報告もある（H. Schmale et al., Nat
ure 343:366-369, 1990）。しかしながら、これらの物
質とストレスとの間の関係については何ら報告されてい
ない。
研究としては、唾液中成分でタンニン酸の苦味を抑制す
る物質としてＰＲＰｓ（Ｐｒｏｌｉｎ Ｒｉｃｈ Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ）の存在が知られている（J. I. Glendinnin
g, Chem. Sens., 17:1-12, 1992）。また、口腔内のｖ
ｏｎ Ｅｂｎｅｒ’ｓ ｇｌａｎｄｓから分泌されるＶ
ＥＧプロテインが脂溶性物質を味覚感受器に運ぶ役割を
演じているという報告もある（H. Schmale et al., Nat
ure 343:366-369, 1990）。しかしながら、これらの物
質とストレスとの間の関係については何ら報告されてい
ない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、精神
的ストレスの蓄積を簡単に予測、判定できる方法を開発
し、これを精神的ストレス性障害の診断に応用すること
である。
的ストレスの蓄積を簡単に予測、判定できる方法を開発
し、これを精神的ストレス性障害の診断に応用すること
である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するため鋭意研究した結果、精神的ストレスとな
るような長時間の連続作業を負荷したときに、苦味感受
性を低下させるあるタンパク質が唾液中に産生されるこ
と、ならびにこのタンパク質に対する抗体を用いてヒト
体液中の該タンパク質を測定できることを見いだして本
発明を完成した。
を達成するため鋭意研究した結果、精神的ストレスとな
るような長時間の連続作業を負荷したときに、苦味感受
性を低下させるあるタンパク質が唾液中に産生されるこ
と、ならびにこのタンパク質に対する抗体を用いてヒト
体液中の該タンパク質を測定できることを見いだして本
発明を完成した。
【００１０】すなわち、本発明は、以下の性質を有する
精神的ストレス関連タンパク質： （１）分子量：約１４ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る） （２）配列番号１に示すＮ末端部分配列を有する に対する抗体またはその断片を用いて、免疫学的測定法
によりヒト体液中の精神的ストレス性障害関連抗原を測
定する方法を提供する。
精神的ストレス関連タンパク質： （１）分子量：約１４ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る） （２）配列番号１に示すＮ末端部分配列を有する に対する抗体またはその断片を用いて、免疫学的測定法
によりヒト体液中の精神的ストレス性障害関連抗原を測
定する方法を提供する。
【００１１】本発明の方法で使用する抗体を得るための
精神的ストレス関連タンパク質は後述する方法で精神的
ストレスを負荷したヒトの唾液から分離、精製したもの
である。この精神的ストレス関連タンパク質はＳＤＳ−
ＰＡＧＥで約１４ｋＤａの分子量を有するタンパク質で
あることが判明した。切り取ったバンドからプロテイン
シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
Ｊａｐａｎ（株）ＡＢＩ４７３Ａ）により配列を決定
し、配列番号１に示すＮ末端アミノ酸配列を得た。
精神的ストレス関連タンパク質は後述する方法で精神的
ストレスを負荷したヒトの唾液から分離、精製したもの
である。この精神的ストレス関連タンパク質はＳＤＳ−
ＰＡＧＥで約１４ｋＤａの分子量を有するタンパク質で
あることが判明した。切り取ったバンドからプロテイン
シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
Ｊａｐａｎ（株）ＡＢＩ４７３Ａ）により配列を決定
し、配列番号１に示すＮ末端アミノ酸配列を得た。
【００１２】本発明において使用する精神的ストレス関
連タンパク質に対する抗体は上記精神的ストレス関連タ
ンパク質を例えば、ウサギ、ラット、ヤギ、ヒツジ、マ
ウスなどの動物に免疫することにより当業者に公知の方
法で作製できる。また、精神的ストレス関連タンパク質
は固相合成法などにより合成したタンパク質、あるいは
遺伝子組換え法で得られたタンパク質を使用してもよ
い。
連タンパク質に対する抗体は上記精神的ストレス関連タ
ンパク質を例えば、ウサギ、ラット、ヤギ、ヒツジ、マ
ウスなどの動物に免疫することにより当業者に公知の方
法で作製できる。また、精神的ストレス関連タンパク質
は固相合成法などにより合成したタンパク質、あるいは
遺伝子組換え法で得られたタンパク質を使用してもよ
い。
【００１３】抗体はポリクローナル抗体であっても、モ
ノクローナル抗体であってもよく、これらの作製方法は
当業者に公知である。また、このようなモノクローナル
抗体およびポリクローナル抗体の結合性断片、例えば、
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ断片も本発明の方法で使
用できる。抗体断片は完全な抗体をパパインまたはペプ
シンなどで消化して常法により得ることができる。
ノクローナル抗体であってもよく、これらの作製方法は
当業者に公知である。また、このようなモノクローナル
抗体およびポリクローナル抗体の結合性断片、例えば、
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ断片も本発明の方法で使
用できる。抗体断片は完全な抗体をパパインまたはペプ
シンなどで消化して常法により得ることができる。
【００１４】本発明で用いる免疫学的測定法としては、
ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍
光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、
免疫比濁法など、いずれを用いてもよいが、エンザイム
イムノアッセイ、特にＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉ
ｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）
が精神的ストレス関連タンパク質を高感度で検出でき、
かつ多数の検体を自動的に測定できるので、病院などの
使用に好適である。
ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍
光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、
免疫比濁法など、いずれを用いてもよいが、エンザイム
イムノアッセイ、特にＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉ
ｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）
が精神的ストレス関連タンパク質を高感度で検出でき、
かつ多数の検体を自動的に測定できるので、病院などの
使用に好適である。
【００１５】ＥＬＩＳＡ法においては、まず精神的スト
レス関連タンパク質に対する抗体、好ましくはモノクロ
ーナル抗体またはその断片を一次抗体として担体に固定
化する。担体としては固体担体が好ましく、例えばスチ
レンやポリスチレンなどの高分子担体を用いて成型され
たＥＬＩＳＡプレート容器を使用できる。モノクローナ
ル抗体またはその断片の担体への固定化は、例えばモノ
クローナル抗体またはその断片を炭酸緩衝液やホウ酸緩
衝液などの緩衝液に溶解して担体に吸着させることによ
り実施できる。
レス関連タンパク質に対する抗体、好ましくはモノクロ
ーナル抗体またはその断片を一次抗体として担体に固定
化する。担体としては固体担体が好ましく、例えばスチ
レンやポリスチレンなどの高分子担体を用いて成型され
たＥＬＩＳＡプレート容器を使用できる。モノクローナ
ル抗体またはその断片の担体への固定化は、例えばモノ
クローナル抗体またはその断片を炭酸緩衝液やホウ酸緩
衝液などの緩衝液に溶解して担体に吸着させることによ
り実施できる。
【００１６】他方、二次抗体としての抗体（モノクロー
ナル抗体またはポリクローナル抗体またはその断片）を
標識、好ましくは非放射性標識により標識する。非放射
性標識としては、酵素標識、蛍光標識、発光標識などを
用いることができる。酵素標識が好ましく、例えばアル
カリ性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホー
スラディッシュパーオキシダーゼなどを用いることがで
きる。
ナル抗体またはポリクローナル抗体またはその断片）を
標識、好ましくは非放射性標識により標識する。非放射
性標識としては、酵素標識、蛍光標識、発光標識などを
用いることができる。酵素標識が好ましく、例えばアル
カリ性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホー
スラディッシュパーオキシダーゼなどを用いることがで
きる。
【００１７】本発明において利用できる体液は限定され
ないが、精神的ストレス関連タンパク質が精神的ストレ
ス負荷時に唾液中に多く分泌されることから唾液が好ま
しい。
ないが、精神的ストレス関連タンパク質が精神的ストレ
ス負荷時に唾液中に多く分泌されることから唾液が好ま
しい。
【００１８】本発明の方法において診断できる精神的ス
トレス性障害は上述した精神的ストレス状態を引き起こ
す各種の心身の外的内的作用因子のうち、特に家族的要
因、職業、生活環境に属するもの、対人関係、経済的問
題などの心理的社会的因子による精神的ストレスであ
る。
トレス性障害は上述した精神的ストレス状態を引き起こ
す各種の心身の外的内的作用因子のうち、特に家族的要
因、職業、生活環境に属するもの、対人関係、経済的問
題などの心理的社会的因子による精神的ストレスであ
る。
【００１９】本発明はさらに、精神的ストレス関連タン
パク質に対する抗体またはその断片を含む、精神的スト
レス性障害の診断キットを提供する。このキットは、例
えば２種のモノクローナル抗体を用いる場合であれば、
精神的ストレス関連タンパク質に対する１種のモノクロ
ーナル抗体を固定化した担体、もしくは精神的ストレス
関連タンパク質に対するモノクローナル抗体とその固定
化用担体、および標識された他方のモノクローナル抗体
を含む。このキットにはさらに、検量線、標準溶液の取
り扱い指示書などを含むことができる。
パク質に対する抗体またはその断片を含む、精神的スト
レス性障害の診断キットを提供する。このキットは、例
えば２種のモノクローナル抗体を用いる場合であれば、
精神的ストレス関連タンパク質に対する１種のモノクロ
ーナル抗体を固定化した担体、もしくは精神的ストレス
関連タンパク質に対するモノクローナル抗体とその固定
化用担体、および標識された他方のモノクローナル抗体
を含む。このキットにはさらに、検量線、標準溶液の取
り扱い指示書などを含むことができる。
【００２０】本発明を以下の参照例及び実施例によって
さらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定さ
れない。
さらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定さ
れない。
【００２１】
【参照例】
参照例１：精神的ストレス指標
被験者に精神的ストレスとなるような長時間の連続作業
を負荷した後の苦味に対する感受性の変化を精神的スト
レスの指標として用いた。
を負荷した後の苦味に対する感受性の変化を精神的スト
レスの指標として用いた。
【００２２】作業内容は、コンピューターディスプレイ
上に示された文字列の中に指定された文字が幾つあるか
を数え、答えを入力するものであり、４０分負荷を行っ
た。作業後の被験者の疲労感は強く示され、口腔内唾液
ｐＨの低下およびＧＳＲ（皮膚電気抵抗）の低下など生
理評価においても示された（図１）。
上に示された文字列の中に指定された文字が幾つあるか
を数え、答えを入力するものであり、４０分負荷を行っ
た。作業後の被験者の疲労感は強く示され、口腔内唾液
ｐＨの低下およびＧＳＲ（皮膚電気抵抗）の低下など生
理評価においても示された（図１）。
【００２３】この作業負荷前後で硫酸キニーネ１３．６
ｐｐｍに対する主観的苦味評価を行ってもらった。苦味
評価は苦味溶液１０ｍｌを口に含んだ時点と溶液を吐き
出してから１０秒おき、もしくは３０秒おきに２１０秒
までの主観的苦味強度を評価シートに行ってもらった
（図２）。また、同時に苦味溶液を吐き出してから、３
０、６０、１２０秒後に吐き出し法により唾液を採取
し、これらの唾液中の硫酸キニーネ濃度を測定した。測
定条件は採取した唾液を蒸留水にて希釈したものを、Ｏ
ＤＳ−ＡＭ１５０×４６ｍｍを用いるＨＰＬＣにて、蛍
光波長（Ｅｘ．２５２ｎｍ；Ｅｍ．３８２ｎｍ）、溶
媒：８０％ＭｅＯＨ、流速：１．０ｍｌにて測定を行っ
た。その結果、被験者５名において、作業負荷後に主観
的苦味強度が低下する傾向が認められた。また、同時に
唾液中の硫酸キニーネ濃度にも低下が認められ、主観的
苦味評価との関連が示唆された（図３）。これらの結果
から、苦味に対する感受性の変化を精神的ストレスの指
標として用いることとした。
ｐｐｍに対する主観的苦味評価を行ってもらった。苦味
評価は苦味溶液１０ｍｌを口に含んだ時点と溶液を吐き
出してから１０秒おき、もしくは３０秒おきに２１０秒
までの主観的苦味強度を評価シートに行ってもらった
（図２）。また、同時に苦味溶液を吐き出してから、３
０、６０、１２０秒後に吐き出し法により唾液を採取
し、これらの唾液中の硫酸キニーネ濃度を測定した。測
定条件は採取した唾液を蒸留水にて希釈したものを、Ｏ
ＤＳ−ＡＭ１５０×４６ｍｍを用いるＨＰＬＣにて、蛍
光波長（Ｅｘ．２５２ｎｍ；Ｅｍ．３８２ｎｍ）、溶
媒：８０％ＭｅＯＨ、流速：１．０ｍｌにて測定を行っ
た。その結果、被験者５名において、作業負荷後に主観
的苦味強度が低下する傾向が認められた。また、同時に
唾液中の硫酸キニーネ濃度にも低下が認められ、主観的
苦味評価との関連が示唆された（図３）。これらの結果
から、苦味に対する感受性の変化を精神的ストレスの指
標として用いることとした。
【００２４】
実施例１：精神的ストレスによるタンパク質産生
被験者５名の安静時および作業負荷直後（０秒後）と負
荷前後の苦味溶液評価時において苦味溶液吐き出し３
０、６０、１２０秒に採取した唾液についてＳＤＳ電気
泳動を行った。各唾液サンプルは、タンパク質の溶解性
を高めるため唾液１０μｌに対してサンプルバッファー
３μｌ（０．０６２５Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％グリセ
ロール、５％β−メルカプトエタノール、２．３％ＳＤ
Ｓ）を加え、３７℃で３０分反応させた後、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ（ただし１５％分離ゲル）により泳動させた。泳
動条件は電極バッファー（Ｔｒｉｓ３．０３％、グリセ
リン１４．４％、ＳＤＳ１％）を用い、３０ｍＡ／１プ
レート（６．５×９ｃｍ2）で約６０分泳動させた。泳
動後、銀染色を行った。染色条件は、５０％メタノー
ル、１０％酢酸で３０分、５％メタノール、７％酢酸で
３０分以上ゲルを浸透させた後、蒸留水で１５分３回洗
浄、５ｇ／ｍｌＤＤＴで３０分、０．１％ＡｇＮＯ3で
３０分処理し、蒸留水で軽く洗浄後、Ｄｅｖｅｌｏｐｅ
ｒ（ホルムアルデヒド１０７μｌ、Ｎａ2ＣＯ3６ｇを蒸
留水で２００ｍｌにフィルアップ）＋５ｍｌ ２．３Ｍ
クエン酸で５分処理後、蒸留水で洗浄した。その結果、
１４ｋＤａ付近に作業負荷前後で明らかに濃度差の認め
られるバンドが発見された。このバンドは０、３０、６
０、１２０秒後に採取したいずれの唾液においても作業
前後で濃度差が認められ、負荷後の濃度が高く、最も差
が顕著であったのは安静時と作業負荷直後に採取した０
秒後の唾液を比較した場合であった。この結果につい
て、デンシトメーター（島津社製、ＣＳ−９０００）に
てクロマトグラムを得て、負荷前後で濃度変化が顕著に
示された１４ｋＤａ付近のピーク面積の比較を行った。
結果をグラフで示す（図４）。このバンドの濃度差は時
間経過とともに減少した。したがって、このバンドが示
すタンパク質は精神的ストレスが生じたときに短期的に
産生する特異的なタンパク質であり、精神的ストレスの
指標たりうる精神的ストレス関連タンパク質であると推
測される。
荷前後の苦味溶液評価時において苦味溶液吐き出し３
０、６０、１２０秒に採取した唾液についてＳＤＳ電気
泳動を行った。各唾液サンプルは、タンパク質の溶解性
を高めるため唾液１０μｌに対してサンプルバッファー
３μｌ（０．０６２５Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％グリセ
ロール、５％β−メルカプトエタノール、２．３％ＳＤ
Ｓ）を加え、３７℃で３０分反応させた後、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ（ただし１５％分離ゲル）により泳動させた。泳
動条件は電極バッファー（Ｔｒｉｓ３．０３％、グリセ
リン１４．４％、ＳＤＳ１％）を用い、３０ｍＡ／１プ
レート（６．５×９ｃｍ2）で約６０分泳動させた。泳
動後、銀染色を行った。染色条件は、５０％メタノー
ル、１０％酢酸で３０分、５％メタノール、７％酢酸で
３０分以上ゲルを浸透させた後、蒸留水で１５分３回洗
浄、５ｇ／ｍｌＤＤＴで３０分、０．１％ＡｇＮＯ3で
３０分処理し、蒸留水で軽く洗浄後、Ｄｅｖｅｌｏｐｅ
ｒ（ホルムアルデヒド１０７μｌ、Ｎａ2ＣＯ3６ｇを蒸
留水で２００ｍｌにフィルアップ）＋５ｍｌ ２．３Ｍ
クエン酸で５分処理後、蒸留水で洗浄した。その結果、
１４ｋＤａ付近に作業負荷前後で明らかに濃度差の認め
られるバンドが発見された。このバンドは０、３０、６
０、１２０秒後に採取したいずれの唾液においても作業
前後で濃度差が認められ、負荷後の濃度が高く、最も差
が顕著であったのは安静時と作業負荷直後に採取した０
秒後の唾液を比較した場合であった。この結果につい
て、デンシトメーター（島津社製、ＣＳ−９０００）に
てクロマトグラムを得て、負荷前後で濃度変化が顕著に
示された１４ｋＤａ付近のピーク面積の比較を行った。
結果をグラフで示す（図４）。このバンドの濃度差は時
間経過とともに減少した。したがって、このバンドが示
すタンパク質は精神的ストレスが生じたときに短期的に
産生する特異的なタンパク質であり、精神的ストレスの
指標たりうる精神的ストレス関連タンパク質であると推
測される。
【００２５】実施例２：精神的ストレス関連タンパク質
の単離方法とアミノ酸配列 作業負荷前後で採取した唾液サンプルは、約２５ｖｏｌ
％になるようにサンプルバッファー（４．６５ｍＭバル
ビツール酸ナトリウム塩酸塩、１０％グリセロール、ｐ
Ｈ６．８）を加え、３７℃、３０分加温した。
の単離方法とアミノ酸配列 作業負荷前後で採取した唾液サンプルは、約２５ｖｏｌ
％になるようにサンプルバッファー（４．６５ｍＭバル
ビツール酸ナトリウム塩酸塩、１０％グリセロール、ｐ
Ｈ６．８）を加え、３７℃、３０分加温した。
【００２６】これを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気
泳動を行った。ただし、分離ゲル（７．５％アクリルア
ミド（Ｂｉｓ１．２％）、ランニングゲルバッファー
（９１．１ｍＭバルビツール酸ナトリウム塩酸塩、ｐＨ
８．９）、１０％ＡＰＳ、１％ＴＭＥＭＤ）、濃縮ゲル
（５％アクリルアミド（Ｂｉｓ１．２％）、スタッキン
グゲルバッファー（９．３ｍＭバルビツール酸ナトリウ
ム塩酸塩、ｐＨ６．７））、電極バッファー（４１．１
ｎＭバルビツール酸ナトリウム−グリセリン、ｐＨ８．
３）とする。
泳動を行った。ただし、分離ゲル（７．５％アクリルア
ミド（Ｂｉｓ１．２％）、ランニングゲルバッファー
（９１．１ｍＭバルビツール酸ナトリウム塩酸塩、ｐＨ
８．９）、１０％ＡＰＳ、１％ＴＭＥＭＤ）、濃縮ゲル
（５％アクリルアミド（Ｂｉｓ１．２％）、スタッキン
グゲルバッファー（９．３ｍＭバルビツール酸ナトリウ
ム塩酸塩、ｐＨ６．７））、電極バッファー（４１．１
ｎＭバルビツール酸ナトリウム−グリセリン、ｐＨ８．
３）とする。
【００２７】電気泳動後、ＰＶＤＦ膜にブロッティング
し、膜を半分にカットし、片方だけをＣＢＢ染色した。
ただし、ブロッティングバッファー（４．６５ｍＭバル
ビツール酸ナトリウム−グリセリン、２０％ＭｅＯＨ）
とする。
し、膜を半分にカットし、片方だけをＣＢＢ染色した。
ただし、ブロッティングバッファー（４．６５ｍＭバル
ビツール酸ナトリウム−グリセリン、２０％ＭｅＯＨ）
とする。
【００２８】ＣＢＢ染色した結果から、目的とするタン
パク質のバンド位置を読み取り、染色しなかった残り半
分から一致した部分を切り取った。切り取ったバンドか
らプロテインシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ Ｊａｐａｎ（株）ＡＢＩ４７３Ａ）によ
りＮ末端から約３０残基までのアミノ酸配列を読み取
り、配列番号１に示すアミノ酸配列を得た。
パク質のバンド位置を読み取り、染色しなかった残り半
分から一致した部分を切り取った。切り取ったバンドか
らプロテインシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ Ｊａｐａｎ（株）ＡＢＩ４７３Ａ）によ
りＮ末端から約３０残基までのアミノ酸配列を読み取
り、配列番号１に示すアミノ酸配列を得た。
【００２９】実施例３：精神的ストレス関連タンパク質
に対する抗体の作製 １）免疫原の調製 精神的ストレス関連タンパク質をＰＢＳ（−）に溶解し
てタンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌに調整し、ミリポアフィ
ルター（０．２２ｕｍ ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔ）を用
いて滅菌濾過後、凍結用滅菌チューブに分注して−８０
℃で凍結保存し、用時に解凍して使用した。初回免疫の
場合、フロインドの完全アジュバントと等量混合してエ
マルジョン（油中水滴型）にして用いた。追加免疫に
は、フロインドの不完全アジュバントとのエマルジョン
（油中水滴型）にして用いた。
に対する抗体の作製 １）免疫原の調製 精神的ストレス関連タンパク質をＰＢＳ（−）に溶解し
てタンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌに調整し、ミリポアフィ
ルター（０．２２ｕｍ ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔ）を用
いて滅菌濾過後、凍結用滅菌チューブに分注して−８０
℃で凍結保存し、用時に解凍して使用した。初回免疫の
場合、フロインドの完全アジュバントと等量混合してエ
マルジョン（油中水滴型）にして用いた。追加免疫に
は、フロインドの不完全アジュバントとのエマルジョン
（油中水滴型）にして用いた。
【００３０】２）動物の免疫
免疫注射のスケジュールは、初回免疫の場合、１週間間
隔で追加免疫を３回実施した。ＳＰＦ（ｓｐｅｃｉａｌ
ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ）グレードの日本白色種
雌家兎（体重３．５ｋｇ）二翔に初回免疫は抗原量とし
て０．２ｍｇ／ウサギを前肢のｆｏｏｔ ｐａｄ数カ所
に、追加免疫は０．１ｍｇ／ウサギを皮下注射した。Ｂ
ＡＬＢ／ｃメスマウス６週齢１０匹に初回免疫は抗原量
０．０２ｍｇ／マウスを皮下および腹腔内に、追加免疫
は０．０１ｍｇ／マウスを腹腔内注射して、最終免疫の
１週間後にＥｈｒｌｉｃｈ腫瘍細胞を２〜５×１０6／
マウス腹腔内注射する。
隔で追加免疫を３回実施した。ＳＰＦ（ｓｐｅｃｉａｌ
ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ）グレードの日本白色種
雌家兎（体重３．５ｋｇ）二翔に初回免疫は抗原量とし
て０．２ｍｇ／ウサギを前肢のｆｏｏｔ ｐａｄ数カ所
に、追加免疫は０．１ｍｇ／ウサギを皮下注射した。Ｂ
ＡＬＢ／ｃメスマウス６週齢１０匹に初回免疫は抗原量
０．０２ｍｇ／マウスを皮下および腹腔内に、追加免疫
は０．０１ｍｇ／マウスを腹腔内注射して、最終免疫の
１週間後にＥｈｒｌｉｃｈ腫瘍細胞を２〜５×１０6／
マウス腹腔内注射する。
【００３１】３）血清および腹水上清の分離と脱脂操作
家兎の場合、最終免疫の１０日後に耳中心動脈から無菌
的に採血、遠心分離して、血清を回収し非動化（５６
℃、３０分加温）する。マウスの場合、貯留腹水を採
取、遠心分離して腹水上清を回収する。ガラス製共栓付
遠心管に氷冷血清（腹水上清）と氷冷したトリクロロ−
トリフルオロエタンを容積比３：２で混合して激烈に撹
拌、振とうした後、冷凍遠心分離機にかけて上清を回収
する。
的に採血、遠心分離して、血清を回収し非動化（５６
℃、３０分加温）する。マウスの場合、貯留腹水を採
取、遠心分離して腹水上清を回収する。ガラス製共栓付
遠心管に氷冷血清（腹水上清）と氷冷したトリクロロ−
トリフルオロエタンを容積比３：２で混合して激烈に撹
拌、振とうした後、冷凍遠心分離機にかけて上清を回収
する。
【００３２】４）抗体の精製方法
脱脂した血清（腹水上清）に飽和硫酸アンモニウムｐＨ
７．４を等量混合して高速遠心機にかけて塩析画分を回
収、セファデックスＧ２５カラムでＰＢＳ（−）を用い
て脱塩する。次いでＤＥＡＥカラムクロマトグラフィー
を行い、ＩｇＧ画分を精製分離する。ＰＢＳ（−）で１
０ｍｇ／ｍｌに調整して−８０℃で凍結保存する。
７．４を等量混合して高速遠心機にかけて塩析画分を回
収、セファデックスＧ２５カラムでＰＢＳ（−）を用い
て脱塩する。次いでＤＥＡＥカラムクロマトグラフィー
を行い、ＩｇＧ画分を精製分離する。ＰＢＳ（−）で１
０ｍｇ／ｍｌに調整して−８０℃で凍結保存する。
【００３３】５）家兎ＩｇＧＦ（ａｂ’）2の作製
家兎ＩｇＧ画分をｐＨ４．３の０．１Ｍ酢酸緩衝液で透
析してからＩｇＧとペプシンを重量比５０：１で混合す
る。この混合液を３７℃の混浴中で８〜１４時間反応
後、氷冷する。高速遠心機にかけて沈殿物を除去してか
ら１Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ８．０に調整する。最後
にセファデックスＧ１５０カラムクロマトグラフィーに
よりＩｇＧＦ（ａｂ’）2断片を回収する。
析してからＩｇＧとペプシンを重量比５０：１で混合す
る。この混合液を３７℃の混浴中で８〜１４時間反応
後、氷冷する。高速遠心機にかけて沈殿物を除去してか
ら１Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ８．０に調整する。最後
にセファデックスＧ１５０カラムクロマトグラフィーに
よりＩｇＧＦ（ａｂ’）2断片を回収する。
【００３４】６）抗体の力価測定
精神的ストレス関連タンパク質を０．１Ｍｃａｒｂｏｎ
ａｔｅ／ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ、ｐＨ９．５に溶解し
て０．００１ｍｇ／ｍｌに調整して９６ウエルミクロタ
イタープレート（平底）に０．１ｍｌ／ウエルで分注
し、３７℃、１時間静置する。上清を除去、プレートを
洗浄液（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ
（−））で洗浄、ブロッキング溶液（１％ゼラチンを含
むＰＢＳ（−））を０．１５ｍｌ／ウエルで分注、３７
℃、３０分間静置する。
ａｔｅ／ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ、ｐＨ９．５に溶解し
て０．００１ｍｇ／ｍｌに調整して９６ウエルミクロタ
イタープレート（平底）に０．１ｍｌ／ウエルで分注
し、３７℃、１時間静置する。上清を除去、プレートを
洗浄液（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ
（−））で洗浄、ブロッキング溶液（１％ゼラチンを含
むＰＢＳ（−））を０．１５ｍｌ／ウエルで分注、３７
℃、３０分間静置する。
【００３５】別途、希釈液（０．１％ゼラチンを含むＰ
ＢＳ（−））で抗体試料を１ｍｇ／ｍｌに調整し、次い
で９６ウエルミクロタイタープレート（Ｖ底）にて段階
希釈する（×５００、×１０００、×２０００、×４０
００、×８０００、×１６０００、×３２０００、×６
４０００）。
ＢＳ（−））で抗体試料を１ｍｇ／ｍｌに調整し、次い
で９６ウエルミクロタイタープレート（Ｖ底）にて段階
希釈する（×５００、×１０００、×２０００、×４０
００、×８０００、×１６０００、×３２０００、×６
４０００）。
【００３６】上記のストレス関連タンパク質吸着プレー
トを洗浄、抗体試料希釈液を２系列で０．１ｍｌ／ウエ
ル分注して３７℃、１時間静置する。プレートを洗浄し
てビオチン化第２抗体（家兎抗体試料にはビオチン化抗
−ウサギＩｇ、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｃａｔ Ｎｏ．ＲＰ
Ｎ−１００４、マウス抗体にはビオチン化抗−マウスＩ
ｇ、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｃａｔ Ｎｏ．ＲＰＮ−１００
１）の１０００倍希釈液を０．１ｍｌ／ウエル分注して
３７℃、１時間静置する。プレートを洗浄して酵素標識
アビジン（アルカリホスファターゼ結合アビジン、Ｄａ
ｋｏｐａｔｔｓｃａｔ Ｎｏ．Ｄ３６５またはアルカリ
ホスファターゼ結合ストレプトアビジン、ＧＩＢＣＯ
ＢＲＬ、ｃａｔ Ｎｏ．９５４２ＳＡ）の１０００倍希
釈液を０．１ｍｌ／ウエル分注して３７℃、３０分間静
置する。洗浄して基質（０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む
１０ｍＭジエタノールアミン中の２．５ｍＭ ｐ−ニト
ロフェニルホスフェート二ナトリウム塩、ｐＨ９．５）
を０．１ｍｌ／ウエル分注して室温にて１０分間遮光、
静置後、停止液（３Ｍ ＮａＯＨ水溶液）を０．０５ｍ
ｌ／ウエル添加する。
トを洗浄、抗体試料希釈液を２系列で０．１ｍｌ／ウエ
ル分注して３７℃、１時間静置する。プレートを洗浄し
てビオチン化第２抗体（家兎抗体試料にはビオチン化抗
−ウサギＩｇ、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｃａｔ Ｎｏ．ＲＰ
Ｎ−１００４、マウス抗体にはビオチン化抗−マウスＩ
ｇ、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｃａｔ Ｎｏ．ＲＰＮ−１００
１）の１０００倍希釈液を０．１ｍｌ／ウエル分注して
３７℃、１時間静置する。プレートを洗浄して酵素標識
アビジン（アルカリホスファターゼ結合アビジン、Ｄａ
ｋｏｐａｔｔｓｃａｔ Ｎｏ．Ｄ３６５またはアルカリ
ホスファターゼ結合ストレプトアビジン、ＧＩＢＣＯ
ＢＲＬ、ｃａｔ Ｎｏ．９５４２ＳＡ）の１０００倍希
釈液を０．１ｍｌ／ウエル分注して３７℃、３０分間静
置する。洗浄して基質（０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む
１０ｍＭジエタノールアミン中の２．５ｍＭ ｐ−ニト
ロフェニルホスフェート二ナトリウム塩、ｐＨ９．５）
を０．１ｍｌ／ウエル分注して室温にて１０分間遮光、
静置後、停止液（３Ｍ ＮａＯＨ水溶液）を０．０５ｍ
ｌ／ウエル添加する。
【００３７】反応プレートをミクロプレートオートリー
ダーにかけ４０５ｎｍにおける吸光度を計測する。抗体
試料１ｍｇ／ｍｌの希釈倍数を片対数グラフの対数目盛
に、吸光度を等目盛に設定して測定値をプロットする。
希釈倍数の低い試料から順次曲線で結んで描かれるシグ
モイド曲線の対数変化を示す直線領域の中点に対応する
希釈倍数を求めて抗体力価（Ｕｎｉｔ／ｍｇ）とする。
家兎抗体ＩｇＧＦ（ａｂ’）2の抗体力価は２ロットと
もに、１２，０００Ｕｎｉｔ／ｍｇ、マウス腹水型プー
ルＩｇＧは８，０００Ｕｎｉｔ／ｍｇ算定した。
ダーにかけ４０５ｎｍにおける吸光度を計測する。抗体
試料１ｍｇ／ｍｌの希釈倍数を片対数グラフの対数目盛
に、吸光度を等目盛に設定して測定値をプロットする。
希釈倍数の低い試料から順次曲線で結んで描かれるシグ
モイド曲線の対数変化を示す直線領域の中点に対応する
希釈倍数を求めて抗体力価（Ｕｎｉｔ／ｍｇ）とする。
家兎抗体ＩｇＧＦ（ａｂ’）2の抗体力価は２ロットと
もに、１２，０００Ｕｎｉｔ／ｍｇ、マウス腹水型プー
ルＩｇＧは８，０００Ｕｎｉｔ／ｍｇ算定した。
【００３８】７）ビオチン化抗体の作製
ビオチン化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＢＮＨＳ）
を用いてマウスＩｇＧにビオチンを共有結合させる。具
体的には、０．１Ｍ ＢＮＨＳ（蒸留ジメチルホルムア
ミドに溶解）の５７μｌを１０ｍｇ／ｍｌマウスＩｇＧ
（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3に溶解）の１ｍｌに添加して
２２℃で１時間反応後、０．０５Ｍ ＰＢＳ（−）、ｐ
Ｈ７．２を用いて４℃で２４時間透析を行う。透析外液
は数回取り替える。透析後に等容量の再蒸留グリセロー
ルを添加して凍結保存する。
を用いてマウスＩｇＧにビオチンを共有結合させる。具
体的には、０．１Ｍ ＢＮＨＳ（蒸留ジメチルホルムア
ミドに溶解）の５７μｌを１０ｍｇ／ｍｌマウスＩｇＧ
（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3に溶解）の１ｍｌに添加して
２２℃で１時間反応後、０．０５Ｍ ＰＢＳ（−）、ｐ
Ｈ７．２を用いて４℃で２４時間透析を行う。透析外液
は数回取り替える。透析後に等容量の再蒸留グリセロー
ルを添加して凍結保存する。
【００３９】８）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識
抗体の作製 飽和硫酸アンモニウム沈殿物として市販のＡＰ（ａｌｋ
ａｌｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｙｐｅ Ｖ
ＩＩＳ，Ｓｉｇｍａ）の５ｍｇを１．２５％グルタルア
ルデヒドを含む０．１Ｍ ＰＢＳ（−）、ｐＨ６．８の
０．２ｍｌに再度懸濁して、２２℃で一夜放置してから
生理食塩液に透析して、容量を１ｍｌに生理食塩液を用
いて調整する。それに２．５ｍｇ／ｍｌマウスＩｇＧの
１ｍｌと１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ９．５を添加して４℃で２
４時間放置後、２Ｍリシン溶液を１０μｌ添加して２２
℃で２時間放置した。０．００５Ｍ ＰＢＳ（−）、ｐ
Ｈ７．２を回収して遮光容器に入れて４℃で保存した。
抗体の作製 飽和硫酸アンモニウム沈殿物として市販のＡＰ（ａｌｋ
ａｌｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｙｐｅ Ｖ
ＩＩＳ，Ｓｉｇｍａ）の５ｍｇを１．２５％グルタルア
ルデヒドを含む０．１Ｍ ＰＢＳ（−）、ｐＨ６．８の
０．２ｍｌに再度懸濁して、２２℃で一夜放置してから
生理食塩液に透析して、容量を１ｍｌに生理食塩液を用
いて調整する。それに２．５ｍｇ／ｍｌマウスＩｇＧの
１ｍｌと１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ９．５を添加して４℃で２
４時間放置後、２Ｍリシン溶液を１０μｌ添加して２２
℃で２時間放置した。０．００５Ｍ ＰＢＳ（−）、ｐ
Ｈ７．２を回収して遮光容器に入れて４℃で保存した。
【００４０】９）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識
アビジンの作製 ＡＰ５ｍｇを前記７）と同じ要領でグルタルアルデヒド
で活性化処理してからアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ社）とモ
ル比１：１で混合して４℃で一夜反応後、生理食塩液に
対して４℃で一夜透析した。ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）を最終濃度１％になるよう添加して遮光、保存し
た。
アビジンの作製 ＡＰ５ｍｇを前記７）と同じ要領でグルタルアルデヒド
で活性化処理してからアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ社）とモ
ル比１：１で混合して４℃で一夜反応後、生理食塩液に
対して４℃で一夜透析した。ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）を最終濃度１％になるよう添加して遮光、保存し
た。
【００４１】実施例４：ＥＬＩＳＡ−サンドイッチ法に
よる測定ＥＬＩＳＡ−サンドイッチＡＰ法の場合 １）リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）の調製 ＮａＣｌ ８．０ｇ、ＫＣｌ ０．２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4
０．２４ｇを蒸留水８００ｍｌに溶解してｐＨ７．２に
調整を行い、全量１０００ｍｌとする。
よる測定ＥＬＩＳＡ−サンドイッチＡＰ法の場合 １）リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）の調製 ＮａＣｌ ８．０ｇ、ＫＣｌ ０．２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4
０．２４ｇを蒸留水８００ｍｌに溶解してｐＨ７．２に
調整を行い、全量１０００ｍｌとする。
【００４２】２）抗体吸着プレートの作製
ウサギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2抗−ストレス関連タンパ
ク質を前記１）のＰＢＳで希釈して０．０２ｍｇ／ｍｌ
にしてＥＬＩＳＡ用９６ウエルミクロタイタープレート
（平底）（Ｃｏｓｔａｒ ｃａｔ Ｎｏ．３５９０）へ
５０μｌ／ウエル分注する。室温で２時間放置する。プ
レートに抗体が約１００ｎｇ／ウエル（３００ｎｇ／ｃ
ｍ2）結合する。
ク質を前記１）のＰＢＳで希釈して０．０２ｍｇ／ｍｌ
にしてＥＬＩＳＡ用９６ウエルミクロタイタープレート
（平底）（Ｃｏｓｔａｒ ｃａｔ Ｎｏ．３５９０）へ
５０μｌ／ウエル分注する。室温で２時間放置する。プ
レートに抗体が約１００ｎｇ／ウエル（３００ｎｇ／ｃ
ｍ2）結合する。
【００４３】３）抗体溶液を回収、除去して、ＰＢＳで
２回洗浄し、ブロッキング溶液（１％ゼラチンおよび
０．０２％ ＮａＮ3を含むＰＢＳ）を２００μｌ／ウ
エル分注して室温で２時間以上一夜放置する。
２回洗浄し、ブロッキング溶液（１％ゼラチンおよび
０．０２％ ＮａＮ3を含むＰＢＳ）を２００μｌ／ウ
エル分注して室温で２時間以上一夜放置する。
【００４４】４）抗原試料の調製
タンパク溶解液（１０％グリセロール、５％β−メルカ
プトエタノール、２．３％ＳＤＳを含む０．０６２５Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ）の１５μｌを唾液試料５０μｌに添加
して３７℃で３０分間放置後に遠心機にかけて上清を回
収した。次いで希釈用９６ウエルミクロタイタープレー
ト（Ｖ底）（Ｃｏｓｔａｒ ｃａｔ Ｎｏ．３８９７）
を用いて希釈液（０．１％ゼラチン、０．０２％ Ｎａ
Ｎ3、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）にて
対照標準試料（１ｍｇ／ｍｌ）の８段階希釈液（１×１
０4、２×１０4、４×１０4、８×１０4、１６×１
０4、３２×１０4、６４×１０4、１２８×１０4）およ
びタンパク溶解液で処理した唾液上清の４段階希釈液
（１×７．７、３×７．７、９×７．７、２７×７．
７）を調製した。
プトエタノール、２．３％ＳＤＳを含む０．０６２５Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ）の１５μｌを唾液試料５０μｌに添加
して３７℃で３０分間放置後に遠心機にかけて上清を回
収した。次いで希釈用９６ウエルミクロタイタープレー
ト（Ｖ底）（Ｃｏｓｔａｒ ｃａｔ Ｎｏ．３８９７）
を用いて希釈液（０．１％ゼラチン、０．０２％ Ｎａ
Ｎ3、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）にて
対照標準試料（１ｍｇ／ｍｌ）の８段階希釈液（１×１
０4、２×１０4、４×１０4、８×１０4、１６×１
０4、３２×１０4、６４×１０4、１２８×１０4）およ
びタンパク溶解液で処理した唾液上清の４段階希釈液
（１×７．７、３×７．７、９×７．７、２７×７．
７）を調製した。
【００４５】５）前記３）のプレートを洗浄液（０．０
２％ ＮａＮ3、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰ
ＢＳ）で２回洗浄して、前記３）の調製試料を２系列で
５０μｌ／ウエル分注して３７℃で１時間放置する。
２％ ＮａＮ3、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰ
ＢＳ）で２回洗浄して、前記３）の調製試料を２系列で
５０μｌ／ウエル分注して３７℃で１時間放置する。
【００４６】６）プレートを洗浄して酵素標識第２抗体
（アルカリホスファターゼ結合マウスＩｇＧ抗−ストレ
ス関連タンパク質抗体、１ｍｇ／ｍｌ）の５００倍希釈
液を５０μｌ／ウエル分注して３７℃で１時間放置す
る。
（アルカリホスファターゼ結合マウスＩｇＧ抗−ストレ
ス関連タンパク質抗体、１ｍｇ／ｍｌ）の５００倍希釈
液を５０μｌ／ウエル分注して３７℃で１時間放置す
る。
【００４７】７）プレートを洗浄して基質（０．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2を含む１０ｍＭジエタノールアミン中の
２．５ｍＭ ｐ−ニトロフェニルホスフェート二ナトリ
ウム塩、ｐＨ９．５）を５０μｌ／ウエル分注して室温
にて１０分間遮光、放置後、反応停止液（３Ｍ ＮａＯ
Ｈ水溶液）を２５μｌ／ウエル添加する。
ＭｇＣｌ2を含む１０ｍＭジエタノールアミン中の
２．５ｍＭ ｐ−ニトロフェニルホスフェート二ナトリ
ウム塩、ｐＨ９．５）を５０μｌ／ウエル分注して室温
にて１０分間遮光、放置後、反応停止液（３Ｍ ＮａＯ
Ｈ水溶液）を２５μｌ／ウエル添加する。
【００４８】８）反応プレートをミクロプレートオート
リーダーにかけ４０５ｎｍにおける吸光度を計測する。
リーダーにかけ４０５ｎｍにおける吸光度を計測する。
【００４９】９）対照標準試料１ｍｇ／ｍｌの濃度を片
対数グラフの対数目盛に、吸光度を等目盛に設定して測
定値をプロットして順次曲線で結ぶとシグモイド曲線が
得られる。唾液試料希釈液の吸光度が標準曲線上の対数
変化を示す直線領域にくるものを選抜して、対応する濃
度を求め、得られる値に試料希釈倍数（希釈液による希
釈倍数×１．３）を乗じると唾液試料中の精神的ストレ
ス関連タンパク質濃度が算定される。
対数グラフの対数目盛に、吸光度を等目盛に設定して測
定値をプロットして順次曲線で結ぶとシグモイド曲線が
得られる。唾液試料希釈液の吸光度が標準曲線上の対数
変化を示す直線領域にくるものを選抜して、対応する濃
度を求め、得られる値に試料希釈倍数（希釈液による希
釈倍数×１．３）を乗じると唾液試料中の精神的ストレ
ス関連タンパク質濃度が算定される。
【００５０】１０）希釈試料の測定濃度は、１０−２０
０ｎｇ／ｍｌ、検出感度は２ｎｇ／ｍｌであった。
０ｎｇ／ｍｌ、検出感度は２ｎｇ／ｍｌであった。
【００５１】ＥＬＩＳＡ−ビオチン／アビジン法の場合
操作手順の１）〜６）は上記ＥＬＩＳＡ−サンドイッチ
ＡＰ法の場合と共通する。
ＡＰ法の場合と共通する。
【００５２】７）プレートを洗浄してビオチン化第２抗
体（ビオチン化マウスＩｇＧ抗−ストレス関連タンパク
質抗体、１ｍｇ／ｍｌ）の５００倍希釈液を５０μｌ／
ウエル分注して３７℃、１時間放置する。
体（ビオチン化マウスＩｇＧ抗−ストレス関連タンパク
質抗体、１ｍｇ／ｍｌ）の５００倍希釈液を５０μｌ／
ウエル分注して３７℃、１時間放置する。
【００５３】８）プレートを洗浄して酵素標識アビジン
（アルカリホスファターゼ結合アビジン、Ｄａｋｏｐａ
ｔｔｓ ｃａｔ Ｎｏ．Ｄ３６５）の５００倍希釈液を
５０μｌ／ウエルを分注して３７℃、１時間放置する。
（アルカリホスファターゼ結合アビジン、Ｄａｋｏｐａ
ｔｔｓ ｃａｔ Ｎｏ．Ｄ３６５）の５００倍希釈液を
５０μｌ／ウエルを分注して３７℃、１時間放置する。
【００５４】操作手順９）〜１２）はＥＬＩＳＡ−サン
ドイッチＡＰ法の場合の７）〜１０）に各々対応する。
ドイッチＡＰ法の場合の７）〜１０）に各々対応する。
【００５５】１３）希釈試料の測定濃度は１−５０ｎｇ
／ｍｌ、検出感度は０．２ｎｇ／ｍｌであった。
／ｍｌ、検出感度は０．２ｎｇ／ｍｌであった。
【００５６】
【発明の効果】本発明の方法および診断キットを用いる
と、従来法に比べて精神的ストレス関連タンパク質を簡
単に感度よく検出することができ、本人の気づかないう
ちに蓄積している精神的ストレスの程度を測定すること
が可能となる。これによって精神的ストレス性障害を未
然に防ぎ、あるいは早期に適切な処置を施すことができ
る。
と、従来法に比べて精神的ストレス関連タンパク質を簡
単に感度よく検出することができ、本人の気づかないう
ちに蓄積している精神的ストレスの程度を測定すること
が可能となる。これによって精神的ストレス性障害を未
然に防ぎ、あるいは早期に適切な処置を施すことができ
る。
【００５７】
【００５８】配列番号：１
配列の長さ：２８
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ser Ser Ser Lys Glu Glu Asn Arg Ile Ile Pro Gly Gly Ile Tyr
1 5 10 15
Asp Ala Asp Lue Asn Asp Xaa Trp Val Gln Arg Ala Lue
20 25 28
【図１】精神的ストレス負荷時の唾液ｐＨの変化を示
す。
す。
【図２】精神的ストレス負荷前後の硫酸キニーネに対す
る主観的苦味強度を示す。
る主観的苦味強度を示す。
【図３】精神的ストレス負荷後に吐き出した唾液中の硫
酸キニーネ濃度を示す。
酸キニーネ濃度を示す。
【図４】精神的ストレス負荷前後の唾液中の精神的スト
レス関連タンパク質の定量結果を示す。
レス関連タンパク質の定量結果を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 寺野 由剛
大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１
号 サントリー株式会社 生物医学研究
所内
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/53
G01N 33/577
Claims (4)
- 【請求項１】 以下の性質を有する精神的ストレス関連
タンパク質： （１）分子量：約１４ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る） （２）配列番号１に示すＮ末端部分配列を有する に対する抗体またはその断片を用いて、免疫学的測定法
によりヒト体液中の精神的ストレス性障害関連抗原を測
定する方法。 - 【請求項２】 免疫学的測定法がＥＬＩＳＡ法である請
求項１記載の方法。 - 【請求項３】 体液が唾液である請求項１または２記載
の方法。 - 【請求項４】 以下の性質を有する精神的ストレス関連
タンパク質： （１）分子量：約１４ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る） （２）配列番号１に示すＮ末端部分配列を有する に対する抗体またはその断片を含む、精神的ストレス性
障害の診断キット。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27303495A JP3445038B2 (ja) | 1995-09-26 | 1995-10-20 | 精神的ストレス性障害関連抗原の測定法 |
| EP96931974A EP0907080B1 (en) | 1995-09-26 | 1996-09-25 | Method for assaying antigen relating to mental stress disorders |
| DE69637466T DE69637466T2 (de) | 1995-09-26 | 1996-09-25 | Verfahren zur prüfung von antigenen, die mit durch mentalen stress bedingten erkrankungen assoziiert sind |
| AT96931974T ATE389175T1 (de) | 1995-09-26 | 1996-09-25 | Verfahren zur prüfung von antigenen, die mit durch mentalen stress bedingten erkrankungen assoziiert sind |
| PCT/JP1996/002747 WO1997012243A1 (fr) | 1995-09-26 | 1996-09-25 | Procede de dosage d'un antigene associe aux troubles mentaux lies au stress |
| EP08000214A EP1925937A1 (en) | 1995-09-26 | 1996-09-25 | Method for assaying antigen related to disorders caused by mental stress |
| US09/043,703 US6265227B1 (en) | 1995-09-26 | 1996-09-25 | Method for assaying antigen related to disorders caused by mental stress |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7-247788 | 1995-09-26 | ||
| JP24778895 | 1995-09-26 | ||
| JP27303495A JP3445038B2 (ja) | 1995-09-26 | 1995-10-20 | 精神的ストレス性障害関連抗原の測定法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09152430A JPH09152430A (ja) | 1997-06-10 |
| JP3445038B2 true JP3445038B2 (ja) | 2003-09-08 |
Family
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27303495A Expired - Fee Related JP3445038B2 (ja) | 1995-09-26 | 1995-10-20 | 精神的ストレス性障害関連抗原の測定法 |
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|---|---|
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| EP (2) | EP0907080B1 (ja) |
| JP (1) | JP3445038B2 (ja) |
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| DE (1) | DE69637466T2 (ja) |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008016101A1 (fr) | 2006-08-04 | 2008-02-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Procédé d'évaluation de stress, appareil d'évaluation de stress, système d'évaluation de stress, programme d'évaluation de stress et support d'enregistrement associé |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2878852B1 (fr) * | 2000-09-28 | 2007-02-23 | Imtix Sangstat | Procede de production d'immunoglobulines anti-thymocytes humains |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994015578A1 (en) * | 1992-12-30 | 1994-07-21 | George Joe Revis | Anticaries compositions |
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-
1996
- 1996-09-25 EP EP96931974A patent/EP0907080B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-25 WO PCT/JP1996/002747 patent/WO1997012243A1/ja active IP Right Grant
- 1996-09-25 AT AT96931974T patent/ATE389175T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-09-25 DE DE69637466T patent/DE69637466T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-25 EP EP08000214A patent/EP1925937A1/en not_active Withdrawn
- 1996-09-25 US US09/043,703 patent/US6265227B1/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008016101A1 (fr) | 2006-08-04 | 2008-02-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Procédé d'évaluation de stress, appareil d'évaluation de stress, système d'évaluation de stress, programme d'évaluation de stress et support d'enregistrement associé |
| US8673647B2 (en) | 2006-08-04 | 2014-03-18 | Ajinomoto Co., Inc. | Stress evaluating apparatus, method, system and program and recording medium therefor |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| EP1925937A1 (en) | 2008-05-28 |
| JPH09152430A (ja) | 1997-06-10 |
| EP0907080A4 (en) | 2004-08-11 |
| US6265227B1 (en) | 2001-07-24 |
| EP0907080B1 (en) | 2008-03-12 |
| WO1997012243A1 (fr) | 1997-04-03 |
| ATE389175T1 (de) | 2008-03-15 |
| EP0907080A1 (en) | 1999-04-07 |
| DE69637466T2 (de) | 2009-03-26 |
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