JP3382719B2 - 総ビタミンb6 計測用バイオセンサ - Google Patents

総ビタミンb6 計測用バイオセンサ

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【発明の詳細な説明】 【0001】 【産業上の利用分野】本発明は、ビタミンB6 を定量す
る装置、詳しくは、特定の微生物の性質を利用してなる
総ビタミンB6 計測用バイオセンサに関するものであ
る。 【0002】 【従来の技術】ビタミンB6 は、ピリドキシン、ピリド
キサール、ピリドキサミン及びそれらのリン酸エステル
を基本的な化合物としていることが知られており、その
定量法としては、総ビタミンB6 の定量法〔微生物定量
法等〕と全ビタミンB6 の分離定量法〔高速液体コロマ
トグラフィー(HPLC)等〕が報告されている〔「ビ
タミンハンドブック ビタミン分析法」日本ビタミン
学会編、p.81、(株)化学同人 (1989)参照〕。 【0003】 【発明が解決しようとする課題】総ビタミンB6 の定量
法としては、酵母サッカロミセス セレビシアを用いた
微生物定量法が汎用されているが、この微生物定量法で
は、微生物の培養に15〜18時間を要し、試料中の総
ビタミンB6 量の迅速な計測が不可能であるとの問題が
あった。 【0004】従って、本発明の目的は、試料中の総ビタ
ミンB6 量を迅速且つ簡便に計測できる総ビタミンB6
計測用バイオセンサを提供することにある。 【0005】 【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記目的
を達成すべく種々検討した結果、生物素子;酵母サッカ
ロミセス セレビシアとトランスデューサー;酸素電極
とからなる微生物電極を用いることにより、ビタミンB
6 の存在下において変化する酵母の呼吸活性の変化を電
気信号として検出することができ、この検出されたセン
サ出力と試料中の総ビタミンB6 量との間に良好な相関
関係があることを知見した。 【0006】本発明は、上記知見に基づいてなされたも
ので、酵母サッカロミセス セレビシア(Sacharomyces
cerevisiae) ATCC 9080固定化膜と酸素電極とからなる
微生物電極、緩衝液槽及びビタミンB6 定量用基礎培地
を含む試料液槽から構成される、総ビタミンB6 計測用
バイオセンサを提供するものである。尚、ATCCは、アメ
リカン・タイプカルチャー・コレクション保存菌株を示
す。 【0007】 【作用】上記の如く構成された本発明の総ビタミンB6
計測用バイオセンサによれば、ビタミンB6 の存在下に
おいて変化する酵母サッカロミセス セレビシアの呼吸
活性の変化が、次のようにして電流減少値(センサ出
力)として検出される。微生物電極を緩衝液槽中に浸漬
すると、暫くして酵母の呼吸活性が安定して電極の出力
電流値が一定となる。該電流値が一定となった後、微生
物電極をビタミンB6 定量用基礎培地を含む試料液槽中
に移動すると、酵母は、試料液中のビタミンB6 を資化
して呼吸活性を増し、酸素電極先端部の酸素を消費す
る。この酸素消費により、酸素電極に到達する酸素量が
減少するため、電極の電流値が低下する。暫くすると、
酵母の消費酸素量が一定となり、酸素電極に到達する酸
素量も一定となるため、定常電流値が得られる。微生物
電極を緩衝液槽中に浸漬したときに得られた定常電流値
と試料液槽中に浸漬したときに得られた定常電流値との
差が、電流減少値(センサ出力)である。 【0008】 【実施例】次に、本発明の総ビタミンB6 計測用バイオ
センサを、図1及び図2に示す一実施態様に基づいて説
明する。図1は、本発明のバイオセンサを組み込んだセ
ンサシステムの一例の概略図で、図2は、上記センサシ
ステムに組み込まれた本発明のバイオセンサの構成要素
の微生物電極を示す概略図である。 【0009】図1に示すセンサシステムは、微生物電極
2、緩衝液槽3及び試料液槽4から構成される本発明の
バイオセンサ1を、上記微生物電極2の電気的応答を記
録するために、エレクトロメーター5を介して記録計6
に接続してなるものである。この外、図中7は、上記緩
衝液槽3内の緩衝液及び上記試料液槽4内の試料液を一
定温度に維持するための恒温水槽であり、また図中8
は、上記緩衝液槽3内の緩衝液中及び上記試料液槽4内
の試料液中にそれぞれ空気を供給し、それぞれの液を酸
素飽和状態とするためのアエレーションポンプである。
また、図中9は、微生物電極2を支持するための支柱付
き載置台である。 【0010】上記図1に示すセンサシステムに組み込ま
れた本発明のバイオセンサ1の構成要素の上記微生物電
極2は、図2に示すように、先端部(電極部)を酸素ガ
スの透過性膜23で被覆した酸素電極21と、その下方
から上記透過性膜23を被覆するように装着した酵母サ
ッカロミセス セレビシアATCC 9080 固定化膜22とか
ら構成されている。尚、上記固定化膜22及び上記透過
性膜23は、それぞれOリング24及び25で上記酸素
電極21の周囲に固定されている。 【0011】上記固定化膜22としては、その調製法が
特に制限されるものではなく、例えば、酵母サッカロミ
セス セレビシアATCC 9080 をニトロセルロース膜に常
法により吸着固定したもの等が用いられる。また、上記
酸素電極21としては、白金電極(カソード)をテフロ
ン膜(透過性膜)で被覆したクラーク型酸素電極等が用
いられる。また、上記緩衝液槽3内の緩衝液としては、
リン酸緩衝液、イミダゾール/塩酸緩衝液、マレイン酸
/トリス/水酸化ナトリウム緩衝液等が用いられる。 【0012】次に、本センサシステムの作用を、図3及
び図4も参照しながら説明する。先ず、微生物電極2を
緩衝液槽3内の緩衝液中に浸漬すると、暫くして定常電
流値Aが得られる。次いで、微生物電極2を試料液槽4
内のビタミンB6 定量用基礎培地を含む試料液中に浸漬
すると、電流値が低下するが、暫くすると定常電流値B
が得られる。この際の微生物電極2の電流値の変化は、
図3に示すような応答曲線として記録計6により記録さ
れる。 【0013】本センサシステムにより上記の如くして測
定された定常電流値Aと定常電流値Bの差、即ち電流減
少値(センサ出力)は、試料液中の総ビタミンB6
(濃度)と良好な相関関係がある。従って、本センサシ
ステムによれば、既知濃度のビタミンB6 を含む試料液
について上記電流減少値を測定し、図4に示す如き検量
線を作成することにより、未知濃度の試料液中の総ビタ
ミンB6 量を計測することができる。 【0014】以上、本発明のバイオセンサを図1及び図
2に示す一実施態様に基づいて説明してきたが、本発明
はこれに限定されるものではない。例えば、本発明のバ
イオセンサの構成要素の微生物電極としては、図2に示
すものに限定されず、酵母サッカロミセス セレビシア
ATCC 9080 固定化膜が酸素電極の電極部に装着された
ものであれば良く、その具体的形状及び固定化膜の装着
手段等は適宜変更可能であることは言うまでもない。 【0015】次に、本発明のバイオセンサについて、該
バイオセンサを用いて試料液中の総ビタミンB6 量の計
測を行う実験例を挙げ、具体的に説明する。 【0016】実験例1 酵母サッカロミセス セレビシア ATCC 9080 を生理食
塩水に懸濁し、吸収波長550nmにおける吸光度(O
550)0.08の酵母溶液を調製した。この溶液1mlを
用いてニトロセルロース膜(孔径0.45μm)の中心
部の直径13mmの円の範囲上に上記酵母を吸着固定し、
酵母固定化膜を調製した。この酵母固定化膜をクラーク
型酸素電極の白金面(直径10mm)に装着して微生物電
極を作製した。この微生物電極2と、リン酸緩衝液(p
H6.5)槽3及びビタミンB6定量用培地を含む試料
液槽4とから本発明のバイオセンサ1を構成した。この
バイオセンサ1を図1に示したセンサシステムに組み込
み、試料液中の総ビタミンB6 量の計測を以下のように
して行った。 【0017】緩衝液槽2及び試料液槽3は、恒温水槽7
により一定温度(30℃)に維持するとともに、アエレ
ーションポンプ8により空気を供給し、それぞれ酸素飽
和状態とした。また、微生物電極2の出力電流値は、エ
レクトロメーター5を介して接続した記録計6により記
録した。尚、上記微生物電極2の出力電流値に及ぼす固
定化菌体濃度の影響を検討したところ、OD550 =0.
08が最適であった。また、反応温度(緩衝液及び試料
液の温度)は、40℃附近で微生物電極2の出力電流値
は最大を示したが、電極の応答が不安定であったため3
0℃に設定した。 【0018】先ず、微生物電極2をリン酸緩衝液槽3中
に浸漬し出力電流値を安定させた後、既知濃度のビタミ
ンB6 (ピリドキシン)を含む試料液槽4中に微生物電
極2を移動する。電流値は、移動直後に急激に減少し、
その後、一定の値を示し安定する。この際の電流値の変
化を図3に示した。以上のようにして測定した緩衝液槽
及び試料液槽における微生物電極の出力電流値の差(電
流減少値)を縦軸に、試料液中の総ビタミンB6 量(ピ
リドキシン濃度)を横軸にとって両者の関係を図4に示
した。図4から明らかなように、試料液中の総ビタミン
6 量(ピリドキシン濃度)と上記電流減少値との間に
は良好な相関関係(直線関係)が認められた。尚、一検
体の分析所要時間は約10分間であった。 【0019】上記により得られた検量線(図4)を用
い、本発明のバイオセンサ1を組み込んだ図1に示した
センサシステムにより、魚体内部位の総ビタミンB6
の測定を実施した。本センサシステム(センサ法)によ
る測定結果と従来法〔微生物定量法;「ビタミンハンド
ブック ビタミン分析法」日本ビタミン学会編、p.8
1、(株)化学同人 (1989)参照〕による測定結果の比
較を図5に示した。尚、図5中の点1〜10はそれぞ
れ、次の魚体内部位の総ビタミンB6 量を示す。1=カ
レイ背肉、2=カレイ腹肉、3=カレイ血合肉、4=カ
レイ肝臓、5=アジ血合肉、6=アジ肝臓、7=イワシ
背肉、8=イワシ血合肉、9=イワシ内臓、10=エ
ビ。 【0020】 【発明の効果】本発明の総ビタミンB6 計測用バイオセ
ンサによれば、試料中の総ビタミンB 6 量を迅速且つ簡
便に計測できる。
【図面の簡単な説明】 【図1】本発明のバイオセンサを組み込んだセンサシス
テムの一例の概略図である。 【図2】図1のセンサシステムに組み込まれた本発明の
バイオセンサの構成要素の微生物電極を示す概略図であ
る。 【図3】測定時の微生物電極の電流値の変化を示すグラ
フである。 【図4】試料液中の総ビタミンB6 量(ピリドキシン濃
度)と微生物電極の電流減少値との相関関係を示すグラ
フである。 【図5】本発明のバイオセンサによる総ビタミンB6
の測定結果と従来法による総ビタミンB6 量の測定結果
との比較を示すグラフである。 【符号の説明】 1 バイオセンサ 2 微生物電極 21 酸素電極 22 固定化膜 3 緩衝液槽 4 試料液槽
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平5−137597(JP,A) 特開 平6−78795(JP,A) 特開 昭54−138182(JP,A) 特開 昭58−113859(JP,A) 特開 昭63−248398(JP,A) 特開 昭53−120594(JP,A) (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) G01N 27/327 G01N 27/26 - 27/49 G01N 33/58 - 33/98 C12Q 1/00 - 3/00 JICSTファイル(JOIS)

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 【請求項1】 酵母サッカロミセス セレビシア(Sach
    aromyces cerevisiae) ATCC 9080固定化膜と酸素電極と
    からなる微生物電極、緩衝液槽及びビタミンB6 定量用
    基礎培地を含む試料液槽から構成される、総ビタミンB
    6 計測用バイオセンサ。
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