JP3382637B2 - グループｉ型ホスホリパーゼａ２を含有する脳血管弛緩剤 - Google Patents
グループｉ型ホスホリパーゼａ２を含有する脳血管弛緩剤Info
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- JP3382637B2 JP3382637B2 JP17456492A JP17456492A JP3382637B2 JP 3382637 B2 JP3382637 B2 JP 3382637B2 JP 17456492 A JP17456492 A JP 17456492A JP 17456492 A JP17456492 A JP 17456492A JP 3382637 B2 JP3382637 B2 JP 3382637B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、グループＩ型ホスホリ
パーゼＡ2を含有する脳血管弛緩剤に関する。さらに詳
しくは、脳血管攣縮、脳梗塞、および脳卒中などの脳血
管疾患の治療あるいは予防に有用な、グループＩ型ホス
ホリパーゼＡ2を含有する脳血管弛緩剤に関する。
パーゼＡ2を含有する脳血管弛緩剤に関する。さらに詳
しくは、脳血管攣縮、脳梗塞、および脳卒中などの脳血
管疾患の治療あるいは予防に有用な、グループＩ型ホス
ホリパーゼＡ2を含有する脳血管弛緩剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】脳血管弛緩剤としては、現在塩酸パパベ
リン、フルナリジン、シンナリジン、ビンポセチン、塩
酸ニカルジピンなどが知られており、脳卒中、くも膜下
出血後の遅延性脳血管攣縮、あるいは慢性的循環不全に
よる脳血管性痴呆等の治療などに用いられている。
リン、フルナリジン、シンナリジン、ビンポセチン、塩
酸ニカルジピンなどが知られており、脳卒中、くも膜下
出血後の遅延性脳血管攣縮、あるいは慢性的循環不全に
よる脳血管性痴呆等の治療などに用いられている。
【０００３】脳血流量は、一定の範囲内では、血圧の変
動とは無関係に自動調節されている。しかし、脳血流量
の自動調節機能が著しく低下している前述のような脳血
流障害疾患を持つ患者または老人等に、上記の脳血管弛
緩剤を投与した場合、その強力な作用により、急激な血
圧降下が生じ、そのことにより脳血流量が低下すること
がある。この結果、脳循環不全が起こり、痴呆の促進な
どの逆効果が生じる可能性がある。
動とは無関係に自動調節されている。しかし、脳血流量
の自動調節機能が著しく低下している前述のような脳血
流障害疾患を持つ患者または老人等に、上記の脳血管弛
緩剤を投与した場合、その強力な作用により、急激な血
圧降下が生じ、そのことにより脳血流量が低下すること
がある。この結果、脳循環不全が起こり、痴呆の促進な
どの逆効果が生じる可能性がある。
【０００４】従って、例えばくも膜下出血後に起こる遅
延性脳血管攣縮の治療にも、前記の各種脳血管弛緩剤が
用いられてはいるが、安全性の面で問題が多い。さら
に、上記脳血管弛緩剤は、作用時間が短いため、持続性
にも問題がある。このようなことから、脳血管に関する
疾患に対して充分な治療効果を得るまでには至っていな
い。
延性脳血管攣縮の治療にも、前記の各種脳血管弛緩剤が
用いられてはいるが、安全性の面で問題が多い。さら
に、上記脳血管弛緩剤は、作用時間が短いため、持続性
にも問題がある。このようなことから、脳血管に関する
疾患に対して充分な治療効果を得るまでには至っていな
い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記の様に、現在脳血
管弛緩剤として用いられている薬剤は、脳血管障害の治
療に充分な効果を得られるものではない。従って、脳血
管弛緩剤として、比較的作用が緩やかでかつ長時間持続
するものが求められている。
管弛緩剤として用いられている薬剤は、脳血管障害の治
療に充分な効果を得られるものではない。従って、脳血
管弛緩剤として、比較的作用が緩やかでかつ長時間持続
するものが求められている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】ホスホリパーゼＡ2（Ｐ
ＬＡ2；ＥＣ ３．１．１．４）は、３−ｓｎ−ホスホ
グリセリドの２−アシルエステル結合を加水分解するリ
ン脂質分解酵素である。哺乳類の細胞外ＰＬＡ2は、そ
の一次構造に基づいて、グループＩ型とＩＩ型とに分け
られる。グループＩ型ＰＬＡ2（ＰＬＡ2−Ｉ）は哺乳類
の膵臓に存在しており、膵液中に分泌される消化酵素の
一つである。グループＩＩ型は、血小板に多く存在し、
おもに炎症反応に関与していると考えられる。
ＬＡ2；ＥＣ ３．１．１．４）は、３−ｓｎ−ホスホ
グリセリドの２−アシルエステル結合を加水分解するリ
ン脂質分解酵素である。哺乳類の細胞外ＰＬＡ2は、そ
の一次構造に基づいて、グループＩ型とＩＩ型とに分け
られる。グループＩ型ＰＬＡ2（ＰＬＡ2−Ｉ）は哺乳類
の膵臓に存在しており、膵液中に分泌される消化酵素の
一つである。グループＩＩ型は、血小板に多く存在し、
おもに炎症反応に関与していると考えられる。
【０００７】発明者らは、最近、ヒト由来のものを含む
様々な細胞あるいは組織の膜上に、分子量約１９０，０
００のＰＬＡ2−Ｉに特異的な結合タンパク質が存在す
ることを見い出した（Biol. Chem. 266, 19139-19141
(1991)）。このような結合タンパク質を介して、ＰＬＡ
2−Ｉは、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞、ラットの滑膜および
血管の平滑筋細胞において、直接ＤＮＡ合成を刺激し、
さらに、ラット大動脈の平滑筋細胞（Ａ７ｒ５）では、
遊走能の亢進を誘発することが判った。
様々な細胞あるいは組織の膜上に、分子量約１９０，０
００のＰＬＡ2−Ｉに特異的な結合タンパク質が存在す
ることを見い出した（Biol. Chem. 266, 19139-19141
(1991)）。このような結合タンパク質を介して、ＰＬＡ
2−Ｉは、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞、ラットの滑膜および
血管の平滑筋細胞において、直接ＤＮＡ合成を刺激し、
さらに、ラット大動脈の平滑筋細胞（Ａ７ｒ５）では、
遊走能の亢進を誘発することが判った。
【０００８】このことから、発明者らは、ＰＬＡ2−Ｉ
が何らかの病態生理学的な状態に関連した機能を有する
ことを予測し、種々検討を行った。その結果、ＰＬＡ2
−Ｉが、従来全く知られていなかった哺乳類の脳血管に
対する弛緩作用を有していることを見いだし、本発明を
完成するに至った。
が何らかの病態生理学的な状態に関連した機能を有する
ことを予測し、種々検討を行った。その結果、ＰＬＡ2
−Ｉが、従来全く知られていなかった哺乳類の脳血管に
対する弛緩作用を有していることを見いだし、本発明を
完成するに至った。
【０００９】本発明の脳血管弛緩剤は、グループＩ型ホ
スホリパーゼＡ2を含有する。
スホリパーゼＡ2を含有する。
【００１０】好ましい実施態様では、上記脳血管は、脳
底動脈、中大脳動脈、および前大脳動脈とそれらの分枝
からなる群から選択される。
底動脈、中大脳動脈、および前大脳動脈とそれらの分枝
からなる群から選択される。
【００１１】好ましい実施態様では、上記グループＩ型
ホスホリパーゼＡ2は、哺乳類由来である。
ホスホリパーゼＡ2は、哺乳類由来である。
【００１２】好ましい実施態様では、上記脳血管弛緩剤
は、脳血管疾患の処置に用いられる。
は、脳血管疾患の処置に用いられる。
【００１３】好ましい実施態様では、上記脳血管疾患
は、脳血管攣縮、脳梗塞、および脳卒中からなる群から
選択される。
は、脳血管攣縮、脳梗塞、および脳卒中からなる群から
選択される。
【００１４】本発明の脳血管弛緩剤に含有されるＰＬＡ
2−Ｉの由来は特に限定されず、天然に存在するＰＬＡ2
−Ｉ、および遺伝子操作技術によって得られるＰＬＡ2
−Ｉのいずれであってもよい。ＰＬＡ2−Ｉは、好まし
くは哺乳類由来である。ＰＬＡ2−Ｉは、例えばブタ由
来のものが使用され得る。ブタＰＬＡ2−Ｉは、例えば
J. Biol. Chem. 266 (1991), 19139-19141に記載の方法
で調製される。
2−Ｉの由来は特に限定されず、天然に存在するＰＬＡ2
−Ｉ、および遺伝子操作技術によって得られるＰＬＡ2
−Ｉのいずれであってもよい。ＰＬＡ2−Ｉは、好まし
くは哺乳類由来である。ＰＬＡ2−Ｉは、例えばブタ由
来のものが使用され得る。ブタＰＬＡ2−Ｉは、例えば
J. Biol. Chem. 266 (1991), 19139-19141に記載の方法
で調製される。
【００１５】ＰＬＡ2−Ｉの脳血管弛緩作用は、例えば
次の実験により確認され得る。
次の実験により確認され得る。
【００１６】（Ｉ）単離された脳血管のＰＬＡ2−Ｉへ
の応答 ＰＬＡ2−Ｉの脳血管への影響を調べるために、ＰＬＡ2
−Ｉを与えた際の脳血管の応答を調べる。
の応答 ＰＬＡ2−Ｉの脳血管への影響を調べるために、ＰＬＡ2
−Ｉを与えた際の脳血管の応答を調べる。
【００１７】（Ａ）脳血管の単離および調製
脳血管は、例えばブタ、ウシ、あるいはネコから得るこ
とができる。そのためにはまず、ブタおよびウシの脳を
入手し、そしてネコは麻酔をかけて、頸動脈から出血さ
せて死亡させた後、すぐにその脳を取り出す。次にこれ
らの脳から例えば、脳底動脈、中大脳動脈および前大脳
動脈を単離し、単離した動脈より、適当な長さのらせん
状の動脈細片の試料を調製する。
とができる。そのためにはまず、ブタおよびウシの脳を
入手し、そしてネコは麻酔をかけて、頸動脈から出血さ
せて死亡させた後、すぐにその脳を取り出す。次にこれ
らの脳から例えば、脳底動脈、中大脳動脈および前大脳
動脈を単離し、単離した動脈より、適当な長さのらせん
状の動脈細片の試料を調製する。
【００１８】得られた試料は、実験の目的に応じて、
（ｉ）未処理のまま、（ｉｉ）シクロオキシゲナーゼの
阻害剤である、インドメタシン処理を施して、あるいは
（ｉｉｉ）内皮細胞を除去して、下記（Ｂ）項の実験に
供する。
（ｉ）未処理のまま、（ｉｉ）シクロオキシゲナーゼの
阻害剤である、インドメタシン処理を施して、あるいは
（ｉｉｉ）内皮細胞を除去して、下記（Ｂ）項の実験に
供する。
【００１９】（Ｂ）脳血管の収縮あるいは弛緩の測定
上記（Ａ）項で得られた試料に、例えばJ. Biol. Chem.
266 (1991), 19139-19141に記載の方法で調製された、
ＰＬＡ2−Ｉ、ＰＬＡ2−ＩＩおよびプロＰＬＡ2−Ｉを
加えて、この試料の収縮あるいは弛緩の状態を測定す
る。そのためには、例えば以下の方法が用いられ得る。
266 (1991), 19139-19141に記載の方法で調製された、
ＰＬＡ2−Ｉ、ＰＬＡ2−ＩＩおよびプロＰＬＡ2−Ｉを
加えて、この試料の収縮あるいは弛緩の状態を測定す
る。そのためには、例えば以下の方法が用いられ得る。
【００２０】フックを設けた槽中に、適当な緩衝液を満
たし、適当な温度、好ましくは約３７℃に維持する。こ
の槽中のフックの間に試料を垂直に固定する。この試料
の上端は、力変位トランスデューサーのレバーにつなが
れており、試料の収縮および弛緩をオシログラフで記録
できるようにしておく。実験の始めに、それぞれの試料
の静止張力を調節しておく。
たし、適当な温度、好ましくは約３７℃に維持する。こ
の槽中のフックの間に試料を垂直に固定する。この試料
の上端は、力変位トランスデューサーのレバーにつなが
れており、試料の収縮および弛緩をオシログラフで記録
できるようにしておく。実験の始めに、それぞれの試料
の静止張力を調節しておく。
【００２１】全ての試料は、実験を始める前に槽中の溶
液に適当な時間放置し、溶液中で平衡化させる。この
間、好ましくは緩衝液を適当な時間間隔で数回交換す
る。
液に適当な時間放置し、溶液中で平衡化させる。この
間、好ましくは緩衝液を適当な時間間隔で数回交換す
る。
【００２２】試験する薬剤に応答して起こる血管の収縮
および弛緩は、既知の収縮剤および弛緩剤に対する血管
の応答を基準として、相対的な値で表示することができ
る。例えば、収縮に関しては、あらかじめ公知の収縮剤
であるＫ+に対する収縮応答を観察しておき、静止張力
とその値との差を１００％とする。そして加えた薬剤に
応答する収縮の程度を％で示すことができる。一方、弛
緩に関しては、例えば実験終了直前に、公知の弛緩剤で
あるパパベリンに対する弛緩応答を観察し、静止張力と
その値との差を１００％とする。そして加えた薬剤に応
答する弛緩の程度を％で示すことができる。
および弛緩は、既知の収縮剤および弛緩剤に対する血管
の応答を基準として、相対的な値で表示することができ
る。例えば、収縮に関しては、あらかじめ公知の収縮剤
であるＫ+に対する収縮応答を観察しておき、静止張力
とその値との差を１００％とする。そして加えた薬剤に
応答する収縮の程度を％で示すことができる。一方、弛
緩に関しては、例えば実験終了直前に、公知の弛緩剤で
あるパパベリンに対する弛緩応答を観察し、静止張力と
その値との差を１００％とする。そして加えた薬剤に応
答する弛緩の程度を％で示すことができる。
【００２３】これらの物質の弛緩効果を試験するため
に、動脈細片は、適当な収縮剤で前収縮させておくのが
よい。このための収縮剤としては、例えばプロスタグラ
ンジンＦ2α（ＰＧＦ2α）あるいはセロトニンが用いら
れ得る。
に、動脈細片は、適当な収縮剤で前収縮させておくのが
よい。このための収縮剤としては、例えばプロスタグラ
ンジンＦ2α（ＰＧＦ2α）あるいはセロトニンが用いら
れ得る。
【００２４】上記ＰＬＡ2−Ｉによる脳血管の弛緩作用
は、ＰＬＡ2−Ｉが脳血管に存在するある種のレセプタ
ーに結合するためではないかと推測される。発明者ら
は、脳血管の細胞に対するＰＬＡ2−Ｉの結合特性を調
べて、本発明の脳血管弛緩作用をさらに明確にするため
に、以下の実験を行った。
は、ＰＬＡ2−Ｉが脳血管に存在するある種のレセプタ
ーに結合するためではないかと推測される。発明者ら
は、脳血管の細胞に対するＰＬＡ2−Ｉの結合特性を調
べて、本発明の脳血管弛緩作用をさらに明確にするため
に、以下の実験を行った。
【００２５】（ＩＩ）ＰＬＡ2−Ｉの結合特性
（Ａ）細胞培養
脳血管の培養細胞は、例えば、ブタの脳底動脈から得る
ことができる。それには、まず、ブタの脳から、脳底動
脈を単離し、この動脈内壁を軽く擦ることによって、血
管内皮細胞を除去する。この動脈から、平滑筋細胞を、
例えばＲｏｓｓの方法（J. Cell. Biol. 50, 172-186
(1971)）によって単離し、得られた細胞を適当な条件下
で培養する。この培養細胞を回収し、再現性よく実験を
行うために、継代培養により、安定化した培養細胞を結
合実験に用いる。
ことができる。それには、まず、ブタの脳から、脳底動
脈を単離し、この動脈内壁を軽く擦ることによって、血
管内皮細胞を除去する。この動脈から、平滑筋細胞を、
例えばＲｏｓｓの方法（J. Cell. Biol. 50, 172-186
(1971)）によって単離し、得られた細胞を適当な条件下
で培養する。この培養細胞を回収し、再現性よく実験を
行うために、継代培養により、安定化した培養細胞を結
合実験に用いる。
【００２６】（Ｂ）ＰＬＡ2−Ｉの125Ｉ標識化
適当な方法により得られるＰＬＡ2−Ｉ、たとえはJ. Bi
ol. Chem. 266 (1991), 19139-19141の方法により調製
されたＰＬＡ2−Ｉを、Ｎａ125ＩおよびクロラミンＴと
適当な時間反応させた後、適当なカラムに通して125Ｉ
−ＰＬＡ2−Ｉと未反応の125Ｉとを分離し、125Ｉ−Ｐ
ＬＡ2−Ｉを得る。
ol. Chem. 266 (1991), 19139-19141の方法により調製
されたＰＬＡ2−Ｉを、Ｎａ125ＩおよびクロラミンＴと
適当な時間反応させた後、適当なカラムに通して125Ｉ
−ＰＬＡ2−Ｉと未反応の125Ｉとを分離し、125Ｉ−Ｐ
ＬＡ2−Ｉを得る。
【００２７】（Ｃ）バインディングアッセイ
上記（Ａ）で得た培養細胞をＰＢＳで洗浄後、ＢＳＡ
（ウシ血清アルブミン）を含むハンクス培地（ｐＨ７．
６）に懸濁する。その懸濁液に125Ｉ−ＰＬＡ2を加えイ
ンキュベートした後、懸濁液を吸引除去する。さらに細
胞を生理食塩水で洗浄後、細胞をＮａＯＨで溶解し、そ
の放射活性をカウントする。
（ウシ血清アルブミン）を含むハンクス培地（ｐＨ７．
６）に懸濁する。その懸濁液に125Ｉ−ＰＬＡ2を加えイ
ンキュベートした後、懸濁液を吸引除去する。さらに細
胞を生理食塩水で洗浄後、細胞をＮａＯＨで溶解し、そ
の放射活性をカウントする。
【００２８】なお、ＰＬＡ2−Ｉ非標識体存在下での放
射活性を非特異的結合量とし、それを非存在下での結合
量（全結合量）から差し引いた値を特異的結合量として
表す。
射活性を非特異的結合量とし、それを非存在下での結合
量（全結合量）から差し引いた値を特異的結合量として
表す。
【００２９】このバインディングアッセイの結果から、
培養細胞には、ＰＬＡ2−Ｉに対する単一の特異的なレ
セプターが存在することが判った。従って、ＰＬＡ2−
Ｉの血管弛緩作用には、このレセプターが関与している
ことが推定される。
培養細胞には、ＰＬＡ2−Ｉに対する単一の特異的なレ
セプターが存在することが判った。従って、ＰＬＡ2−
Ｉの血管弛緩作用には、このレセプターが関与している
ことが推定される。
【００３０】上記（Ｉ）および（ＩＩ）から、ＰＬＡ2
−Ｉが血管弛緩作用を有することが見いだされ、脳血管
攣縮、脳梗塞、および脳卒中、などの疾病の治療に有効
な脳血管弛緩剤として有利に用いられ得ることが示され
る。
−Ｉが血管弛緩作用を有することが見いだされ、脳血管
攣縮、脳梗塞、および脳卒中、などの疾病の治療に有効
な脳血管弛緩剤として有利に用いられ得ることが示され
る。
【００３１】ＰＬＡ2−Ｉを脳血管弛緩剤として使用す
るときには、ＰＬＡ2−Ｉを好ましくは、１０-9Ｍ以上
１０-6Ｍ以下、より好ましくは、５×１０-8Ｍ以上１０
-7Ｍ以下の濃度で血管と接触させ得るように、適当な緩
衝液に溶解させて投与するのが望ましい。
るときには、ＰＬＡ2−Ｉを好ましくは、１０-9Ｍ以上
１０-6Ｍ以下、より好ましくは、５×１０-8Ｍ以上１０
-7Ｍ以下の濃度で血管と接触させ得るように、適当な緩
衝液に溶解させて投与するのが望ましい。
【００３２】投与量は、性別、年齢、症状、および投与
後の経過などによって変化し得る。投与形態は、好まし
くは非経口投与であり、特に、クモ膜下出血の手術後に
見られる脳血管攣縮に対しては、動脈注射が好ましい。
後の経過などによって変化し得る。投与形態は、好まし
くは非経口投与であり、特に、クモ膜下出血の手術後に
見られる脳血管攣縮に対しては、動脈注射が好ましい。
【００３３】
【実施例】本発明を以下の実施例によりさらに説明す
る。
る。
【００３４】〔実施例１〕脳血管細胞に対するＰＬＡ2
−Ｉの結合に関するレセプターの存在を確認し、その特
異性を調べるために、以下の実験を行った。
−Ｉの結合に関するレセプターの存在を確認し、その特
異性を調べるために、以下の実験を行った。
【００３５】（１）ブタの脳底動脈から単離した細胞の
培養 屠殺場で入手したブタの脳から、脳底動脈を単離し、軽
く擦ることによって、血管内皮細胞を除去した。この動
脈の平滑筋細胞をＲｏｓｓの方法（J. Cell. Biol. 50,
172-186 (1971)）によって単離した。得られた細胞
を、３７℃で５％炭酸ガス存在下の湿度を保たれた環境
下で、２０％ウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌペニ
シリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを加
えたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養し
た。０．１２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡを含
む液で培養細胞を回収した。この操作を繰り返して継代
培養した。一連の継代培養の後、５代目と８代目の間で
回収した培養細胞を１２穴プレート上で培養し、次に行
うバインディングアッセイ用に準備した。
培養 屠殺場で入手したブタの脳から、脳底動脈を単離し、軽
く擦ることによって、血管内皮細胞を除去した。この動
脈の平滑筋細胞をＲｏｓｓの方法（J. Cell. Biol. 50,
172-186 (1971)）によって単離した。得られた細胞
を、３７℃で５％炭酸ガス存在下の湿度を保たれた環境
下で、２０％ウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌペニ
シリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを加
えたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養し
た。０．１２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡを含
む液で培養細胞を回収した。この操作を繰り返して継代
培養した。一連の継代培養の後、５代目と８代目の間で
回収した培養細胞を１２穴プレート上で培養し、次に行
うバインディングアッセイ用に準備した。
【００３６】（２）ＰＬＡ2−Ｉの125Ｉ標識化
ＰＬＡ2−Ｉは、J. Biol. Chem. 266 (1991), 19139-19
141に記載の方法で調製されたブタ由来のものを使用し
た。
141に記載の方法で調製されたブタ由来のものを使用し
た。
【００３７】２０μｇのＰＬＡ2−Ｉを含む１００μｌ
の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に、１ｍＣｉ
のＮａ125Ｉを含む５０μｌの０．５Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）を加え、さらにクロラミンＴ（９．６ｍ
ｇ／ｍｌ）を含む５０μｌの０．０２Ｍリン酸緩衝液を
２００μｌ加え、反応を停止させた。
の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に、１ｍＣｉ
のＮａ125Ｉを含む５０μｌの０．５Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）を加え、さらにクロラミンＴ（９．６ｍ
ｇ／ｍｌ）を含む５０μｌの０．０２Ｍリン酸緩衝液を
２００μｌ加え、反応を停止させた。
【００３８】この反応溶液を、あらかじめＰＢＳ（Phos
hate Buffered Saline）で平衡化したセファデックスＧ
−５０カラムに通して、125Ｉ−ＰＬＡ2−Ｉと未反応の
125Ｉとを分離し、125Ｉ−ＰＬＡ2−Ｉを得た。標識し
た125Ｉ−ＰＬＡ2−Ｉの比活性は、約２００Ｃｉ／ｍｍ
ｏｌ（１４．４μＣｉ／μｇ）であった。
hate Buffered Saline）で平衡化したセファデックスＧ
−５０カラムに通して、125Ｉ−ＰＬＡ2−Ｉと未反応の
125Ｉとを分離し、125Ｉ−ＰＬＡ2−Ｉを得た。標識し
た125Ｉ−ＰＬＡ2−Ｉの比活性は、約２００Ｃｉ／ｍｍ
ｏｌ（１４．４μＣｉ／μｇ）であった。
【００３９】（３）バインディングアッセイ
上記（１）で得られた培養細胞をＰＢＳで２回洗浄後、
０．１％ＢＳＡを含むハンクス培地（ｐＨ７．６）に懸
濁した。その懸濁液に０．３ｎＭから６ｎＭまでの種々
の濃度の125Ｉ−ＰＬＡ2を各プレート上の細胞に加えて
インキュベーションした後、懸濁液を吸引除去した。さ
らに細胞を０．９％ＮａＣｌ液で３回洗浄後、細胞を１
Ｎ ＮａＯＨで溶解し、その放射活性をカウントした。
０．１％ＢＳＡを含むハンクス培地（ｐＨ７．６）に懸
濁した。その懸濁液に０．３ｎＭから６ｎＭまでの種々
の濃度の125Ｉ−ＰＬＡ2を各プレート上の細胞に加えて
インキュベーションした後、懸濁液を吸引除去した。さ
らに細胞を０．９％ＮａＣｌ液で３回洗浄後、細胞を１
Ｎ ＮａＯＨで溶解し、その放射活性をカウントした。
【００４０】なお、各濃度の125Ｉ−ＰＬＡ2−Ｉのみ存
在する時の結合量を全結合量とし、500nMのＰＬＡ2−Ｉ
非標識体存在下での放射活性を非特異的結合量とした。
全結合量から非特異的結合量を差し引いた値を特異的結
合量として表した。
在する時の結合量を全結合量とし、500nMのＰＬＡ2−Ｉ
非標識体存在下での放射活性を非特異的結合量とした。
全結合量から非特異的結合量を差し引いた値を特異的結
合量として表した。
【００４１】（４）Scatchardプロットによる結合サイ
トの検討 上記（３）の方法でバインディングアッセイを行い、Sc
atchard分析を適用した。その結果、図１に示されるよ
うな直線で近似されるグラフが得られ、125Ｉ−ＰＬＡ2
−Ｉの解離定数（Kd）が３．８９ｎＭ、最大結合量（Bm
ax）が４０ｆｍｏｌ／１０6細胞である、単一のＰＬＡ2
−Ｉ結合サイトの存在が示唆された。この結合サイト
は、ＰＬＡ2−Ｉに対して特異的であり、可飽和性であ
る。
トの検討 上記（３）の方法でバインディングアッセイを行い、Sc
atchard分析を適用した。その結果、図１に示されるよ
うな直線で近似されるグラフが得られ、125Ｉ−ＰＬＡ2
−Ｉの解離定数（Kd）が３．８９ｎＭ、最大結合量（Bm
ax）が４０ｆｍｏｌ／１０6細胞である、単一のＰＬＡ2
−Ｉ結合サイトの存在が示唆された。この結合サイト
は、ＰＬＡ2−Ｉに対して特異的であり、可飽和性であ
る。
【００４２】125Ｉ−ＰＬＡ2−Ｉの細胞への特異的結合
は、100nMのＰＬＡ2−Ｉによって完全に阻害されたが、
ＰＬＡ2−ＩＩおよびプロＰＬＡ2−ＩＩによって阻害さ
れなかった。
は、100nMのＰＬＡ2−Ｉによって完全に阻害されたが、
ＰＬＡ2−ＩＩおよびプロＰＬＡ2−ＩＩによって阻害さ
れなかった。
【００４３】〔実施例２〕ＰＬＡ2−Ｉの脳血管への影
響を調べるために、ブタの前大脳動脈を用いて、ＰＬＡ
2−Ｉを与えた際の応答を調べた。
響を調べるために、ブタの前大脳動脈を用いて、ＰＬＡ
2−Ｉを与えた際の応答を調べた。
【００４４】ブタの脳を屠殺場から入手し、前大脳動脈
を単離した。単離した動脈を切り出して、約２０ｍｍの
らせん状の動脈細片の試料を調製した。
を単離した。単離した動脈を切り出して、約２０ｍｍの
らせん状の動脈細片の試料を調製した。
【００４５】得られた試料の収縮あるいは弛緩の状態を
モニターするために、以下の実験を行った。
モニターするために、以下の実験を行った。
【００４６】底にフックを設けた槽中に、標準溶液（変
法リンガーロック液；１２０ｍＭＮａＣｌ、５．４ｍＭ
ＫＣｌ、２．２ｍＭ ＣａＣｌ2、１．０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2、２５．０ｍＭ ＮａＨＣＯ3、および５．６ｍＭ
デキストロース）を満たし、３７±０．３℃に温度を
維持し、そして９５％酸素および５％炭酸ガスの混合ガ
スでバブリングした。試料の一端を槽の底に設けたフッ
クにつなぎ、試料のもう一方の端を力変位トランスデュ
ーサーのレバーにつないで、試料の収縮および弛緩をイ
ンク書きオシログラフで記録できるようにしておいた。
静止張力は、１．５ｇに調節した。
法リンガーロック液；１２０ｍＭＮａＣｌ、５．４ｍＭ
ＫＣｌ、２．２ｍＭ ＣａＣｌ2、１．０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2、２５．０ｍＭ ＮａＨＣＯ3、および５．６ｍＭ
デキストロース）を満たし、３７±０．３℃に温度を
維持し、そして９５％酸素および５％炭酸ガスの混合ガ
スでバブリングした。試料の一端を槽の底に設けたフッ
クにつなぎ、試料のもう一方の端を力変位トランスデュ
ーサーのレバーにつないで、試料の収縮および弛緩をイ
ンク書きオシログラフで記録できるようにしておいた。
静止張力は、１．５ｇに調節した。
【００４７】試料は、実験を始める前に槽中の標準溶液
中に９０〜１２０分間放置することで、平衡化した。こ
の期間中は、標準溶液を１０〜１５分ごとに置換した。
中に９０〜１２０分間放置することで、平衡化した。こ
の期間中は、標準溶液を１０〜１５分ごとに置換した。
【００４８】まず、３０ｍＭのＫ+に対する収縮応答を
最初に観察し、その後試料を新鮮な標準溶液で繰り返し
洗浄し、３０〜４０分間、同溶液中で平衡化させた。
最初に観察し、その後試料を新鮮な標準溶液で繰り返し
洗浄し、３０〜４０分間、同溶液中で平衡化させた。
【００４９】この溶液にＰＧＦ2αを１０-7〜３×１０
-7Ｍになるように加え、前収縮させた。その後、ＰＬＡ
2−Ｉを１０-8Ｍ加え、試料の収縮および弛緩の様子を
モニターした。
-7Ｍになるように加え、前収縮させた。その後、ＰＬＡ
2−Ｉを１０-8Ｍ加え、試料の収縮および弛緩の様子を
モニターした。
【００５０】弛緩の状態が安定した後、１０-4Ｍのパパ
ベリンを加えて弛緩の状態をさらにモニターした。その
結果、図２のＡに示すようなオシログラフを得た（試料
数ｎ＝４のうち、代表的なサンプルを示している）。
ベリンを加えて弛緩の状態をさらにモニターした。その
結果、図２のＡに示すようなオシログラフを得た（試料
数ｎ＝４のうち、代表的なサンプルを示している）。
【００５１】このグラフから判るように、試料は始めに
収縮を起こし、その後ゆっくりと弛緩し、徐々にその程
度は増大していった。パパベリンを加えるとさらに急激
な弛緩が誘起された。
収縮を起こし、その後ゆっくりと弛緩し、徐々にその程
度は増大していった。パパベリンを加えるとさらに急激
な弛緩が誘起された。
【００５２】次に、（ｉ）血管の試料をさらにシクロオ
キシゲナーゼ阻害剤である、インドメタシン１０-5Ｍで
処理したもの、あるいは（ｉｉ）血管試料の内皮細胞を
擦って除去したもの、を調製し、上記と同様の実験を行
った。内皮細胞の除去は、サブスタンスＰを１０-7Ｍ加
え、その内皮細胞依存的弛緩作用が消失したことによっ
て確認した。
キシゲナーゼ阻害剤である、インドメタシン１０-5Ｍで
処理したもの、あるいは（ｉｉ）血管試料の内皮細胞を
擦って除去したもの、を調製し、上記と同様の実験を行
った。内皮細胞の除去は、サブスタンスＰを１０-7Ｍ加
え、その内皮細胞依存的弛緩作用が消失したことによっ
て確認した。
【００５３】その結果、図２のＢ（上記（ｉ）の場合）
およびＣ（上記（ｉｉ）の場合）に示すオシログラフを
得た。未処理の試料でみられた一過性の収縮は、インド
メタシン処理あるいは内皮細胞除去処理試料では消失
し、ゆっくりとした弛緩の増加だけが起きた。その後の
弛緩は、これらの３つの試料の間で違いはみられなかっ
た。
およびＣ（上記（ｉｉ）の場合）に示すオシログラフを
得た。未処理の試料でみられた一過性の収縮は、インド
メタシン処理あるいは内皮細胞除去処理試料では消失
し、ゆっくりとした弛緩の増加だけが起きた。その後の
弛緩は、これらの３つの試料の間で違いはみられなかっ
た。
【００５４】図３には未処理の試料とインドメタシン処
理（１０-5Ｍ）試料における収縮および弛緩の平均値
（試料数ｎ＝４）をグラフに示してある。インドメタシ
ン処理試料に対する収縮作用は観察されなかったが、イ
ンドメタシン処理試料および未処理試料に対する弛緩作
用は、ほぼ同程度で観察された。
理（１０-5Ｍ）試料における収縮および弛緩の平均値
（試料数ｎ＝４）をグラフに示してある。インドメタシ
ン処理試料に対する収縮作用は観察されなかったが、イ
ンドメタシン処理試料および未処理試料に対する弛緩作
用は、ほぼ同程度で観察された。
【００５５】さらに、内皮細胞除去処理および未処理の
試料の弛緩の平均値は、それぞれ、４８．８４±２．２
７％（試料数ｎ＝５）および４１．６６±４．０６％
（試料数ｎ＝５）であった。
試料の弛緩の平均値は、それぞれ、４８．８４±２．２
７％（試料数ｎ＝５）および４１．６６±４．０６％
（試料数ｎ＝５）であった。
【００５６】従って、ＰＬＡ2−Ｉによる一過性の収縮
反応は、内皮細胞から産生されるシクロオキシゲナーゼ
代謝物（トロンボキサンＡ2およびプロスタグランジン
Ｆ2αなど）によるものと考えられ、その後の弛緩反応
は、内皮細胞非依存性の作用と考えられる。
反応は、内皮細胞から産生されるシクロオキシゲナーゼ
代謝物（トロンボキサンＡ2およびプロスタグランジン
Ｆ2αなど）によるものと考えられ、その後の弛緩反応
は、内皮細胞非依存性の作用と考えられる。
【００５７】〔実施例３〕ＰＬＡ2−Ｉの連続刺激に対
するブタの前大脳動脈への応答を調べるために、以下の
実験を行った。
するブタの前大脳動脈への応答を調べるために、以下の
実験を行った。
【００５８】ＰＬＡ2−Ｉの添加方法以外は、実施例２
と同一の方法を用いた。インドメタシン処理を行い、Ｐ
ＧＦ2αで前収縮させた動脈細片を用いて、実験開始後
直ちに、槽中に１０-8ＭのＰＬＡ2−Ｉを添加し、２５
分後、３×１０-8ＭのＰＬＡ2−Ｉを添加した。その結
果得られたオシログラフを図４の（Ａ）に示す。一過性
の収縮はみられず、弛緩がゆっくりと増大していき、３
×１０-8ＭのＰＬＡ2−Ｉを追加した時には、弛緩の程
度は、ほとんど変化しなかった。
と同一の方法を用いた。インドメタシン処理を行い、Ｐ
ＧＦ2αで前収縮させた動脈細片を用いて、実験開始後
直ちに、槽中に１０-8ＭのＰＬＡ2−Ｉを添加し、２５
分後、３×１０-8ＭのＰＬＡ2−Ｉを添加した。その結
果得られたオシログラフを図４の（Ａ）に示す。一過性
の収縮はみられず、弛緩がゆっくりと増大していき、３
×１０-8ＭのＰＬＡ2−Ｉを追加した時には、弛緩の程
度は、ほとんど変化しなかった。
【００５９】その後、動脈細片を標準溶液で洗浄し、４
０分間標準溶液中で平衡化した。この間標準溶液は、１
０分ごとに交換した。その後、動脈細片は再びＰＧＦ2
αで前収縮させ、１０-8ＭのＰＬＡ2−Ｉを加えた。そ
の結果得られたオシログラフを図４の（Ｂ）に示す。こ
の２回目の実験では、ＰＬＡ2−Ｉの添加による弛緩は
みられず、１０-8ＭのラットＡＮＰ（心房性ナトリウム
利尿ペプチド）を添加すると、急激な弛緩が起こった。
この結果をさらに棒グラフにすると、図５に示す図が得
られる。このような脱感作現象の結果から、ＰＬＡ2−
Ｉの脳血管弛緩作用は、そのレセプターを介しているこ
とが推定された。
０分間標準溶液中で平衡化した。この間標準溶液は、１
０分ごとに交換した。その後、動脈細片は再びＰＧＦ2
αで前収縮させ、１０-8ＭのＰＬＡ2−Ｉを加えた。そ
の結果得られたオシログラフを図４の（Ｂ）に示す。こ
の２回目の実験では、ＰＬＡ2−Ｉの添加による弛緩は
みられず、１０-8ＭのラットＡＮＰ（心房性ナトリウム
利尿ペプチド）を添加すると、急激な弛緩が起こった。
この結果をさらに棒グラフにすると、図５に示す図が得
られる。このような脱感作現象の結果から、ＰＬＡ2−
Ｉの脳血管弛緩作用は、そのレセプターを介しているこ
とが推定された。
【００６０】〔実施例４〕インドメタシン処理を行った
ブタの前大脳動脈の収縮あるいは弛緩に、種々のＰＬＡ
2が関与するか否かを調べるために、以下の実験を行っ
た。
ブタの前大脳動脈の収縮あるいは弛緩に、種々のＰＬＡ
2が関与するか否かを調べるために、以下の実験を行っ
た。
【００６１】ＰＬＡ2−Ｉを添加するまでの準備は、実
施例２と同様の方法で行った。８個の動脈細片からなる
試料群には、１０-9Ｍ、３×１０-9Ｍ、１０-8Ｍ、およ
び３×１０-8Ｍの濃度のＰＬＡ2−Ｉを槽中へ加えた。
さらに、比較のために、別の３個の動脈細片からなる試
料群には、ブタ由来のプロＰＬＡ2−Ｉを３×１０-9Ｍ
および１０-8Ｍ加え、さらに別の２個からなる試料群に
は、ラット由来のＰＬＡ2−ＩＩを、１０-8Ｍ、３×１
０-8Ｍ、および ３×１０-7Ｍ投与した。その結果を図
６に示す。ブタのＰＬＡ2−Ｉを加えた場合の５０％有
効濃度（ＥＣ50）の平均値は、２．３２±０．１６ｎＭ
であった。ブタのプロＰＬＡ2−ＩあるいはラットのＰ
ＬＡ2−ＩＩを投与しても、動脈細片に検出し得る程の
弛緩は生じなかった。
施例２と同様の方法で行った。８個の動脈細片からなる
試料群には、１０-9Ｍ、３×１０-9Ｍ、１０-8Ｍ、およ
び３×１０-8Ｍの濃度のＰＬＡ2−Ｉを槽中へ加えた。
さらに、比較のために、別の３個の動脈細片からなる試
料群には、ブタ由来のプロＰＬＡ2−Ｉを３×１０-9Ｍ
および１０-8Ｍ加え、さらに別の２個からなる試料群に
は、ラット由来のＰＬＡ2−ＩＩを、１０-8Ｍ、３×１
０-8Ｍ、および ３×１０-7Ｍ投与した。その結果を図
６に示す。ブタのＰＬＡ2−Ｉを加えた場合の５０％有
効濃度（ＥＣ50）の平均値は、２．３２±０．１６ｎＭ
であった。ブタのプロＰＬＡ2−ＩあるいはラットのＰ
ＬＡ2−ＩＩを投与しても、動脈細片に検出し得る程の
弛緩は生じなかった。
【００６２】〔実施例５〕インドメタシンで処理した種
々の大脳動脈を試料として、ＰＬＡ2−Ｉを加えた時の
弛緩の状態を調べるために、以下の実験を行った。
々の大脳動脈を試料として、ＰＬＡ2−Ｉを加えた時の
弛緩の状態を調べるために、以下の実験を行った。
【００６３】ブタおよびウシの脳は屠殺場から入手し、
そしてネコは麻酔をかけて、頸動脈から出血させて死亡
させた後、すぐにその脳を取り出した。次に、これらの
脳から、脳底動脈、中大脳動脈および前大脳動脈を単離
し、単離した動脈を切り出して、それぞれ約２０ｍｍの
らせん状の動脈細片の試料を調製した。
そしてネコは麻酔をかけて、頸動脈から出血させて死亡
させた後、すぐにその脳を取り出した。次に、これらの
脳から、脳底動脈、中大脳動脈および前大脳動脈を単離
し、単離した動脈を切り出して、それぞれ約２０ｍｍの
らせん状の動脈細片の試料を調製した。
【００６４】得られた試料は、シクロオキシゲナーゼの
阻害剤である、インドメタシン処理を施して、実施例２
に記載の方法と同様の方法で、１０-8ＭのＰＬＡ2−Ｉ
を投与して収縮あるいは弛緩の測定を行った。この結果
を表１に示す。
阻害剤である、インドメタシン処理を施して、実施例２
に記載の方法と同様の方法で、１０-8ＭのＰＬＡ2−Ｉ
を投与して収縮あるいは弛緩の測定を行った。この結果
を表１に示す。
【００６５】
【表１】
【００６６】ＰＬＡ2−Ｉに誘導される弛緩に、ブタ、
ウシ、あるいはネコから取りだしたそれぞれの脳底動
脈、中大脳動脈、および前大脳動脈の間で有為な差はな
かった。さらに、セロトニンで前収縮させた試料でも、
ＰＧＦ2αで前収縮させた試料を用いた場合と比べて、
その後の弛緩の状態に差はなかった。
ウシ、あるいはネコから取りだしたそれぞれの脳底動
脈、中大脳動脈、および前大脳動脈の間で有為な差はな
かった。さらに、セロトニンで前収縮させた試料でも、
ＰＧＦ2αで前収縮させた試料を用いた場合と比べて、
その後の弛緩の状態に差はなかった。
【００６７】
【発明の効果】本発明によれば、このように、グループ
Ｉ型ホスホリパーゼＡ2（ＰＬＡ2−Ｉ）を含有する脳血
管弛緩剤が提供される。
Ｉ型ホスホリパーゼＡ2（ＰＬＡ2−Ｉ）を含有する脳血
管弛緩剤が提供される。
【００６８】本発明のＰＬＡ2−Ｉを含有する脳血管弛
緩剤の弛緩作用は、非常に緩徐であり、投与量が増加し
ても過度の弛緩が生じにくい。さらに、比較的低濃度で
持続的な効果を示すことから、脳血管攣縮、脳梗塞、あ
るいは脳卒中等の各種の脳血管疾患の治療あるいは予防
に有用である。特に、くも膜下出血後の遅延性脳血管攣
縮の治療あるいは予防に有用である。
緩剤の弛緩作用は、非常に緩徐であり、投与量が増加し
ても過度の弛緩が生じにくい。さらに、比較的低濃度で
持続的な効果を示すことから、脳血管攣縮、脳梗塞、あ
るいは脳卒中等の各種の脳血管疾患の治療あるいは予防
に有用である。特に、くも膜下出血後の遅延性脳血管攣
縮の治療あるいは予防に有用である。
【図１】ブタの大脳動脈平滑筋細胞に対する125Ｉ−Ｐ
ＬＡ2−Ｉのバインディングアッセイの結果をスキャッ
チャ−ドプロットに変換したグラフである。
ＬＡ2−Ｉのバインディングアッセイの結果をスキャッ
チャ−ドプロットに変換したグラフである。
【図２】ＰＧＦ2αによって前収縮させた、ブタの前大
脳動脈条片を試料に、ＰＬＡ2−Ｉを作用させた結果を
示すチャートである。試料は、（Ａ）未処理、（Ｂ）イ
ンドメタシン処理、あるいは（Ｃ）内皮細胞除去処理を
行って用いた。
脳動脈条片を試料に、ＰＬＡ2−Ｉを作用させた結果を
示すチャートである。試料は、（Ａ）未処理、（Ｂ）イ
ンドメタシン処理、あるいは（Ｃ）内皮細胞除去処理を
行って用いた。
【図３】インドメタシン処理し、ＰＧＦ2αによって前
収縮されたブタの前大脳動脈条片試料を用いて、ＰＬＡ
2−Ｉの弛緩作用を調べた結果を示すグラフである。
収縮されたブタの前大脳動脈条片試料を用いて、ＰＬＡ
2−Ｉの弛緩作用を調べた結果を示すグラフである。
【図４】ＰＧＦ2αによって前収縮された、ブタ前大脳
動脈のＰＬＡ2−Ｉの反復投与に対する弛緩の状態を示
すチャートである。
動脈のＰＬＡ2−Ｉの反復投与に対する弛緩の状態を示
すチャートである。
【図５】ＰＧＦ2αによって前収縮されたブタの大脳動
脈のＰＬＡ2−Ｉに対する第一と第二の弛緩およびラッ
トＡＮＰに対する弛緩を示すグラフである。
脈のＰＬＡ2−Ｉに対する第一と第二の弛緩およびラッ
トＡＮＰに対する弛緩を示すグラフである。
【図６】ブタの前大脳動脈におけるブタのＰＬＡ2−
Ｉ、ブタのプロＰＬＡ2−Ｉ、およびラットのＰＬＡ2−
ＩＩに対する濃度−弛緩作用曲線である。
Ｉ、ブタのプロＰＬＡ2−Ｉ、およびラットのＰＬＡ2−
ＩＩに対する濃度−弛緩作用曲線である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 平２−286088（ＪＰ，Ａ)
欧州特許出願公開471549（ＥＰ，Ａ
１)
ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，1992年 ９月
14日，309（３），261−264
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，1992年
３月25日，267（９），6414−6420
Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ
ｃｔａ．1992年 ４月23日，1125
（２），210−214
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，1991年
５月25日，266（15），9956−9960
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
A61K 38/46
A61P 9/08
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ)
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】グループＩ型ホスホリパーゼＡ2を含有す
る脳血管弛緩剤。 - 【請求項２】前記脳血管は、脳底動脈、中大脳動脈、お
よび前大脳動脈とそれらの分枝からなる群から選択され
る、請求項１に記載の脳血管弛緩剤。 - 【請求項３】前記グループＩ型ホスホリパーゼＡ2が、
哺乳類由来である、請求項１に記載の脳血管弛緩剤。 - 【請求項４】脳血管に関する疾患の治療あるいは予防に
用いられる、請求項１に記載の脳血管弛緩剤。 - 【請求項５】前記脳血管の疾患が、脳血管攣縮、脳梗
塞、および脳卒中からなる群から選択される、請求項４
に記載の脳血管弛緩剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17456492A JP3382637B2 (ja) | 1992-07-01 | 1992-07-01 | グループｉ型ホスホリパーゼａ２を含有する脳血管弛緩剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17456492A JP3382637B2 (ja) | 1992-07-01 | 1992-07-01 | グループｉ型ホスホリパーゼａ２を含有する脳血管弛緩剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0616566A JPH0616566A (ja) | 1994-01-25 |
| JP3382637B2 true JP3382637B2 (ja) | 2003-03-04 |
Family
ID=15980769
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17456492A Expired - Fee Related JP3382637B2 (ja) | 1992-07-01 | 1992-07-01 | グループｉ型ホスホリパーゼａ２を含有する脳血管弛緩剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3382637B2 (ja) |
-
1992
- 1992-07-01 JP JP17456492A patent/JP3382637B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１９９２年 ４月２３日，１１２５（２），２１０−２１４ |
| ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９２年 ９月１４日，３０９（３），２６１−２６４ |
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９１年 ５月２５日，２６６（１５），９９５６−９９６０ |
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２年 ３月２５日，２６７（９），６４１４−６４２０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0616566A (ja) | 1994-01-25 |
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