JP3373299B2 - Concentration gradient generating apparatus and method for manufacturing the same - Google Patents
Concentration gradient generating apparatus and method for manufacturing the sameInfo
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Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、主に基礎医学の分野で
用いられ、生体細胞の化学物質に対する走性検出および
新規走化性因子探索の際に用いられる濃度勾配を生成す
る装置に関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to an apparatus mainly used in the field of basic medicine and for producing a concentration gradient used in the detection of chemotaxis of biological cells for chemical substances and the search for new chemotactic factors. Is.
【０００２】[0002]
【従来の技術】生体細胞は様々な化学物質に対して、化
学物質の濃度差が刺激となる走性（走化性）を有してい
る。生体細胞の走化性の例としては、神経系における神
経細胞の神経突起が示す神経成長因子（ＮＧＦ）濃度勾
配に対する正の走化性、または、免疫系における白血球
遊走促進因子による炎症反応局所部位への白血球の正の
走化性等、様々なものが知られている。2. Description of the Related Art Living cells have chemotaxis against various chemical substances, which is stimulated by the difference in concentration of the chemical substances. Examples of chemotaxis of biological cells include positive chemotaxis to nerve growth factor (NGF) concentration gradient exhibited by nerve cell neurites in the nervous system, or local site of inflammatory reaction by leukocyte migration promoting factor in immune system. Various things are known, such as positive chemotaxis of white blood cells to the.
【０００３】生体における恒常性の維持および形態形成
において、細胞の走化性および走化性因子は重要な役割
を担っており、細胞の走化性を詳細に調べること、およ
び新しい走化性因子を探索することは、生体における恒
常性の維持および形態形成機構解明の上で重要であるば
かりでなく、新規医薬品開発においても重要である。ま
た、生体の情報処理の中心である神経系において、その
情報処理の根幹である神経回路網形成過程で、ＮＧＦを
始めとする種々の走化性因子の働きが関与していること
が知られており、これら走化性因子とそれに対する神経
細胞の反応を解析することは、神経系の情報処理様式の
解明および神経系の情報処理様式を模したニューラルネ
ットワーク開発においても重要である。[0003] Cell chemotaxis and chemotactic factors play an important role in maintaining homeostasis and morphogenesis in the living body, and detailed investigation of cell chemotaxis and new chemotactic factors Searching for is important not only for maintaining homeostasis and elucidating the mechanism of morphogenesis in the living body, but also for developing new drugs. Further, in the nervous system, which is the center of information processing in the living body, it is known that various chemotactic factors such as NGF are involved in the process of forming a neural network that is the basis of the information processing. Therefore, analyzing these chemotactic factors and the response of nerve cells to them is important in elucidating the information processing mode of the nervous system and developing a neural network imitating the information processing mode of the nervous system.
【０００４】従来、細胞の走化性を調べるために用いら
れていた濃度勾配生成装置および方法には以下に示すも
のがあった。
１）透明な材質でできた容器内部を細胞が通過しない程
度の微細多孔を有する壁面で二分した構成を有する装置
で、容器内の一方で分析対象細胞を培養し、容器内のも
う一方で分析対象細胞に対して走化性因子を分泌する細
胞を培養し、微細多孔壁面を通じて分析対象細胞部に浸
透してくる走化性因子に対する分析対象細胞の応答性を
観察する方法と、
２）先端を微細に加工したガラス管とガラス管を固定し
ておくための固定冶具と圧力または電圧を調節するため
の制御装置とガラス管と制御装置とを連結する管または
導線から成る構成を有する装置を用い、ガラス管内部に
走化性因子を含む溶液を入れ、細胞近傍に固定冶具によ
りガラス管先端を静置し、圧力によりガラス管内部の溶
液を噴射、または走化性因子が電荷を有する場合は、電
圧をかけることにより、電気泳動的に内部の走化性因子
をガラス管先端から投与し、ガラス管先端から周囲に向
けて等方的に拡がる濃度勾配を形成し、細胞の反応を観
察する方法である。細胞の走化性を観察する上で上記濃
度勾配生成装置および方法は有効であった。Conventionally, the concentration gradient generating apparatus and method used for investigating the chemotaxis of cells include the following. 1) A device that has a structure in which the inside of a container made of a transparent material is divided into two parts by a wall surface that has a microscopic porosity that does not allow cells to pass. A method of culturing cells that secrete chemotactic factors to the target cells and observing the responsiveness of the analyzed cells to the chemotactic factors that permeate the analyzed cell part through the microporous wall, and 2) tip A device having a structure comprising a glass tube which is finely processed, a fixing jig for fixing the glass tube, a control device for adjusting the pressure or voltage, and a tube or a wire connecting the glass tube and the control device. When a solution containing a chemotactic factor is placed inside the glass tube, the tip of the glass tube is left stationary near the cells with a fixing jig, and the solution inside the glass tube is jetted by pressure, or when the chemotactic factor has a charge Is a A method of observing the cell reaction by electrophoretically administering the chemotactic factor inside from the tip of the glass tube by applying pressure to form a concentration gradient that isotropically spreads from the tip of the glass tube to the surroundings. Is. The above-described concentration gradient generation device and method were effective in observing the chemotaxis of cells.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記
１）の方法では走化性因子分泌細胞を分析対象細胞と共
に培養する方式を採っているため、培養に際して、両細
胞種間での栄養要求性等の違いを考慮する必要があると
いう課題があった。またこれに関連して、両方の細胞に
対して最適な培養環境を提供することは困難であるとい
う課題があった。また、両細胞種間の栄養要求性、培養
環境が大きく異なる場合は、共に培養できないために、
解析が出来ない可能性があり、汎用性に欠けるという課
題があった。However, since the method of 1) above adopts a method of culturing chemotactic factor-secreting cells together with the cells to be analyzed, the auxotrophy between the two cell types during the culturing, etc. There was a problem that it was necessary to consider the difference between. In addition, there is a problem in that it is difficult to provide an optimal culture environment for both cells. Also, if the auxotrophy and culture environment between the two cell types differ greatly, they cannot be cultured together,
There was a problem in that it could not be analyzed and lacked versatility.
【０００６】上記２）の方法においては、濃度勾配はガ
ラス管先端から放出した物質の自然拡散によっており、
安定な濃度勾配を得るためには、濃度勾配の生成源であ
るガラス管先端を一定位置に固定する必要がある。この
場合、通常は無視出来る程の微弱な振動も問題となるた
め、ガラス管および培養細胞が入った容器を固定してお
くために、固定精度の高い特殊な固定冶具を必要とする
という課題があった。また、ガラス管先端からの走化性
因子投与に際しては、安定な濃度勾配を得るために、投
与時の圧力または電圧を制御するための制御装置が必要
であるという課題があった。また方式上の課題として、
使用しているガラス管により細胞に傷害を与える恐れ、
または、ガラス管先端からの走化性因子投与時に、細胞
に対して衝撃を与える恐れがあるという課題があった。In the above method 2), the concentration gradient is due to natural diffusion of the substance released from the tip of the glass tube,
In order to obtain a stable concentration gradient, it is necessary to fix the tip of the glass tube, which is the source of the concentration gradient, at a fixed position. In this case, a weak vibration that is usually negligible is also a problem.Therefore, in order to fix the glass tube and the container containing the cultured cells, a special fixing jig with high fixing accuracy is required. there were. In addition, when chemotactic factors are administered from the tip of a glass tube, there is a problem that a control device for controlling the pressure or voltage during administration is necessary in order to obtain a stable concentration gradient. In addition, as a problem in the system,
The glass tube used may damage cells,
Alternatively, there is a problem that shock may be exerted on cells when the chemotactic factor is administered from the tip of the glass tube.
【０００７】従来の装置による濃度勾配は、最高濃度部
を濃度勾配の中心に持ち、周囲に向かって濃度が等方的
に減少していく濃度勾配である。この濃度勾配は中心に
高濃度部を有していることから、濃度勾配を形成した走
化性因子に対して細胞が正の走化性を示す場合、培養細
胞は中心の高濃度部に凝集する。従って、この濃度勾配
は凝集した細胞間の相互作用を解析するのに適したもの
である。しかしながら、生体細胞の走化性を詳細に調べ
る上で、上記濃度勾配は必ずしも最適なものではない。
例えば、神経細胞による神経繊維の伸長、標的への神経
投射という一連の現象における走化性因子の役割、およ
び神経細胞の応答性を調べる場合を考えると、上記のよ
うな濃度勾配では、走化性因子が神経繊維に対して正の
走化性を持つ物質であった場合、濃度勾配内の神経細胞
からの神経繊維は、より高濃度の濃度勾配生成源に向か
って伸長し、濃度勾配生成源付近では、多数の神経細胞
からの神経繊維が密集するようになる。この際に問題と
なるのが、神経繊維の標的への投射の際には、先に伸長
した神経繊維上に発現される細胞接着因子に依存した神
経繊維伸長も見られるため、伸長している神経繊維が走
化性因子の作用に依存するものなのか、細胞接着性因子
の作用に依存するものなのか区別がつきにくくなり、濃
度勾配生成源付近では、純粋な走化性因子による神経繊
維伸長現象の観察および解析が困難であるという課題が
あった。The density gradient by the conventional apparatus is a density gradient in which the highest density part is located at the center of the density gradient and the density isotropically decreases toward the surroundings. Since this concentration gradient has a high concentration part in the center, when the cells show positive chemotaxis to the chemotactic factor that formed the concentration gradient, the cultured cells aggregate in the high concentration part in the center. To do. Therefore, this concentration gradient is suitable for analyzing the interaction between aggregated cells. However, the above-mentioned concentration gradient is not necessarily optimal for examining the chemotaxis of living cells in detail.
For example, considering the role of chemotactic factors in a series of phenomena of nerve fiber elongation by nerve cells, nerve projection to a target, and nerve cell responsiveness, chemotaxis is observed in the above concentration gradient. If the sex factor is a substance that has a positive chemotaxis to the nerve fiber, the nerve fiber from the nerve cells in the concentration gradient elongates toward the higher concentration gradient generation source, and the concentration gradient generation occurs. Near the source, nerve fibers from many nerve cells become dense. The problem at this time is that during the projection of nerve fibers to the target, there is also nerve fiber elongation dependent on the cell adhesion factor expressed on the previously expanded nerve fibers, and therefore it is elongated. It becomes difficult to distinguish whether the nerve fiber depends on the action of the chemotactic factor or the action of the cell adhesion factor. There is a problem that it is difficult to observe and analyze the elongation phenomenon.
【０００８】本発明は上記課題を解決するため、濃度勾
配生成のために種類の違う細胞を共培養する必要および
特殊な制御装置を必要とせず、また、濃度勾配の生成が
容易で、濃度勾配生成部により細胞に悪影響を与える恐
れがなく、また、細胞の走化性現象解析において重要
な、個々の細胞に対する走化性因子の作用および細胞間
の相互作用の解析を考慮し、各々の解析に適した濃度勾
配を生成する装置を提供することを目的とする。In order to solve the above-mentioned problems, the present invention does not require the co-culture of cells of different types to generate a concentration gradient and a special controller, and the concentration gradient can be easily generated and the concentration gradient can be improved. There is no risk of adverse effects on cells due to the generation part, and in consideration of the analysis of the action of chemotactic factors on individual cells and the interaction between cells, which is important in the analysis of cell chemotaxis phenomenon, each analysis is performed. It is an object of the present invention to provide an apparatus for generating a concentration gradient suitable for.
【０００９】[0009]
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に、本発明の濃度勾配生成装置は、実質的に平坦な基盤
上に、濃度勾配形成物質を含むコラーゲンゲルから成る
濃度勾配生成部と、前記濃度勾配生成部を囲む壁面と、
前記壁面と濃度勾配生成部の間に溶液を蓄えることが可
能な空間とを備えたものである。前記構成においては、
壁面が円周上に設けられており、濃度勾配生成部が壁面
で囲まれた領域の中央に位置し、かつ前記濃度勾配生成
部が円柱形であることが好ましい。また、前記構成にお
いては、壁面が長方形若しくは正方形上に設けられてお
り、かつ濃度勾配生成部が前記壁面の少なくとも一面に
接して平行に設けられたことが好ましい。また、前記構
成においては、壁面が円周上に設けられており、濃度勾
配生成部が壁面に沿って平行に設けられることが好まし
い。In order to achieve the above-mentioned object, a concentration gradient generating device of the present invention comprises a concentration gradient generating part comprising a collagen gel containing a concentration gradient forming substance on a substantially flat base. A wall surface surrounding the concentration gradient generation unit,
A space capable of storing a solution is provided between the wall surface and the concentration gradient generation unit. In the above configuration,
It is preferable that the wall surface is provided on the circumference, the concentration gradient generation unit is located at the center of the region surrounded by the wall surface, and the concentration gradient generation unit has a cylindrical shape. Further, in the above configuration, it is preferable that the wall surface is provided in a rectangular shape or a square shape, and the concentration gradient generation unit is provided in parallel to at least one surface of the wall surface. Further, in the above configuration, it is preferable that the wall surface is provided on the circumference and the concentration gradient generation unit is provided in parallel along the wall surface.
【００１０】次に、本発明の濃度勾配生成装置の製造方
法は、コラーゲンゲルから成る濃度勾配生成部を形成す
る工程と、基盤上に壁面を接着する工程と、前記基盤上
に前記濃度勾配生成部を配置する工程とを備えたもので
ある。Next, the method of manufacturing the concentration gradient generating device of the present invention comprises the steps of forming a concentration gradient generating portion made of collagen gel, adhering a wall surface to a substrate, and generating the concentration gradient on the substrate. And a step of arranging the parts.
【００１１】[0011]
【作用】前記本発明の濃度勾配生成装置によれば、基盤
上に、濃度勾配形成物質を含むコラーゲンゲルから成る
濃度勾配生成部と、前記濃度勾配生成部を囲む壁面と、
前記壁面と濃度勾配生成部の間に溶液を蓄えることが可
能な空間とを備えたことにより、種類の異なる細胞を一
緒に培養する必要がなく、特殊な装置等を用いることな
く細胞に悪影響を与えずに濃度勾配を生成することがで
きる濃度勾配生成装置を達成できる。According to the concentration gradient generating apparatus of the present invention, a concentration gradient generating section made of a collagen gel containing a concentration gradient forming substance, and a wall surface surrounding the concentration gradient generating section are provided on the base.
By providing a space capable of storing a solution between the wall surface and the concentration gradient generation unit, it is not necessary to culture different types of cells together, and adversely affect cells without using a special device or the like. It is possible to achieve a concentration gradient generation device that can generate a concentration gradient without giving it.
【００１２】また、壁面が円周上に設けられており、濃
度勾配生成部が壁面で囲まれた領域の中央に位置し、か
つ前記濃度勾配生成部が円柱形であるという本発明の好
ましい構成によれば、濃度勾配形成物質に対して正の走
化性を示す細胞の濃度勾配下での細胞間相互作用および
細胞集団を容易に観察することができる。すなわち、濃
度勾配生成装置の、濃度勾配生成部と壁面までの基盤上
の領域に溶液を入れると、濃度勾配生成部内の濃度勾配
形成物質は外部溶液中の濃度に依存して、濃度勾配生成
部周囲の溶液中の可能な全ての方向に対して、等速度で
拡散していく。これにより濃度勾配生成部と周囲の壁面
との間の溶液中に濃度勾配生成部から壁面に向けて濃度
勾配形成物質の濃度が減少していく濃度勾配を形成する
ことが出来る。この場合、濃度勾配の中心の濃度勾配生
成部に向かう程、等濃度領域の面積は小さくなってい
る。濃度勾配形成物質に対して細胞が正の走化性を示す
場合、細胞または神経細胞の場合は神経繊維が高濃度部
の中心部分に向かうにしたがって、接触および凝集する
可能性は高くなるからである。[0012] Further, a preferable construction of the present invention in which the wall surface is provided on the circumference, the concentration gradient generation portion is located at the center of the region surrounded by the wall surface, and the concentration gradient generation portion is cylindrical. According to the above, it is possible to easily observe the cell-cell interaction and the cell population under the concentration gradient of the cells showing positive chemotaxis to the concentration gradient forming substance. That is, when the solution is put into the area on the base up to the concentration gradient generation unit and the wall surface of the concentration gradient generation device, the concentration gradient forming substance in the concentration gradient generation unit depends on the concentration in the external solution and the concentration gradient generation unit It spreads at a constant velocity in all possible directions in the surrounding solution. Thus, a concentration gradient in which the concentration of the concentration gradient forming substance decreases from the concentration gradient generating section toward the wall surface can be formed in the solution between the concentration gradient generating section and the surrounding wall surface. In this case, the area of the equal density region becomes smaller toward the density gradient generation unit at the center of the density gradient. When cells exhibit positive chemotaxis to a concentration gradient-forming substance, in the case of cells or nerve cells, the possibility of contact and aggregation increases as the nerve fibers move toward the central part of the high concentration part. is there.
【００１３】また、壁面が長方形若しくは正方形に設け
られており、かつ濃度勾配生成部が前記壁面の少なくと
も一面に接して平行に設けられたという本発明の好まし
い構成によれば、細胞の移動方向または、神経細胞の神
経繊維伸長方向の濃度勾配生成部垂直方向からのずれを
測定することによって、細胞がどの程度正確な濃度勾配
を検出しているかを調べることができる。すなわち、前
記構成によれば濃度勾配形成物質の可能な拡散方向は、
溶液側方向に限られる。溶液内の濃度勾配生成部の各微
小領域からの拡散は溶液側へ半球状に起こるが、濃度勾
配生成部全体からの拡散はこれらの総和となり、濃度勾
配生成部の面に対して平行に起こる。これにより濃度勾
配生成部から溶液内へ向けて、濃度勾配生成部と平行
で、濃度勾配生成部との垂直方向の距離に依存して、濃
度勾配形成物質の濃度が減少する濃度勾配を形成するこ
とが出来る。本濃度勾配中では濃度勾配形成物質に対し
て細胞または、神経細胞の場合は神経繊維が正の走化性
を示す場合、細胞または神経細胞の神経繊維が正確に濃
度勾配を検出して、移動、伸長しているのであれば理想
的には、初期位置から高濃度部の濃度勾配生成部に向か
って垂直方向に移動、伸長していく可能性が高いからで
ある。Further, according to the preferable construction of the present invention in which the wall surface is provided in a rectangular shape or a square shape, and the concentration gradient generating portion is provided in parallel with at least one surface of the wall surface, the cell movement direction or By measuring the deviation of the nerve cell from the direction perpendicular to the concentration gradient generation portion in the nerve fiber extension direction, it is possible to examine how accurately the cell detects the concentration gradient. That is, according to the above configuration, the possible diffusion direction of the concentration gradient forming substance is
Limited to the solution side. Diffusion from each minute region of the concentration gradient generation part in the solution occurs in a hemispherical shape toward the solution side, but diffusion from the entire concentration gradient generation part is the sum of these, and occurs parallel to the surface of the concentration gradient generation part. . As a result, a concentration gradient is formed from the concentration gradient generation unit into the solution, parallel to the concentration gradient generation unit, and depending on the distance in the vertical direction from the concentration gradient generation unit, the concentration gradient of the concentration gradient forming substance decreases. You can In this concentration gradient, when cells or nerve fibers in the case of nerve cells show positive chemotaxis to the concentration gradient forming substance, nerve fibers of cells or nerve cells accurately detect the concentration gradient and migrate. This is because, if it is extended, ideally, there is a high possibility that it will move and extend in the vertical direction from the initial position toward the concentration gradient generation unit of the high concentration portion.
【００１４】また、壁面が円周上に設けられており、濃
度勾配生成部が壁面に沿って平行に設けられたという本
発明の好ましい構成によれば、濃度勾配形成物質に対し
て正の走化性を示す細胞の濃度勾配下での細胞個々の応
答性を解析することができる。すなわち、前記装置と逆
に濃度勾配生成部から壁面で囲まれた領域内の中央部と
の間の溶液中に濃度勾配生成部から領域内中央部に向け
て濃度勾配形成物質の濃度が減少していく濃度勾配を形
成することが出来る。本濃度勾配では、高濃度部の濃度
勾配生成部に向かう程、等濃度領域の面積は大きくなっ
ている。本濃度勾配中では濃度勾配形成物質に対して細
胞が正の走化性を示す場合、細胞または神経細胞の場合
は神経繊維が高濃度部の濃度勾配生成部に向かうにした
がって、接触および凝集する可能性は低くなるからであ
る。Further, according to the preferred construction of the present invention in which the wall surface is provided on the circumference and the concentration gradient generating portion is provided in parallel along the wall surface, the positive migration with respect to the concentration gradient forming substance is obtained. It is possible to analyze the responsiveness of individual cells under a concentration gradient of cells exhibiting chemoattractability. That is, the concentration of the concentration gradient forming substance in the solution between the concentration gradient generator and the central portion in the region surrounded by the wall surface decreases from the concentration gradient generator toward the central portion in the region. An increasing concentration gradient can be formed. In this concentration gradient, the area of the equal concentration region is increased toward the concentration gradient generation unit in the high concentration region. When cells exhibit positive chemotaxis to the substance forming the concentration gradient in this concentration gradient, in the case of cells or nerve cells, the nerve fibers are contacted and aggregated toward the concentration gradient generation part in the high concentration part. This is because the possibility is low.
【００１５】次に、前記本発明の製造方法によれば、コ
ラーゲンゲルから成る濃度勾配生成部を形成する工程
と、基盤上に壁面を接着する工程と、前記基盤上に前記
濃度勾配生成部を配置する工程とを備えたことにより、
本発明の濃度勾配生成装置を効率的に製造することがで
きる。Next, according to the manufacturing method of the present invention, the step of forming the concentration gradient generating portion made of collagen gel, the step of adhering the wall surface to the base, and the concentration gradient generating portion on the base. By having the step of placing,
The concentration gradient generation device of the present invention can be efficiently manufactured.
【００１６】[0016]
【実施例】以下本発明を実施例を用いて具体的に説明す
る。本発明の装置の濃度勾配生成部にはコラーゲンゲル
を用いている。コラーゲンゲルを構成するコラーゲン繊
維は生体内の細胞外基質構成成分であり、多くの細胞に
対して培養時の培養基盤として有効である。特に細胞接
着、神経繊維伸長において効果がある。従って、濃度勾
配生成部にコラーゲンゲルを用いることにより、細胞と
濃度勾配生成部が直接的な接触を持つ現象を調べる場合
に、細胞と濃度勾配生成部の材質との間の不適合による
細胞走化性への影響を考慮する必要がなくなる。また、
コラーゲンゲルはコラーゲン繊維が網目状に入り組んだ
構造を持ち、その網目の内部に濃度勾配を形成させる物
質を含む溶液を蓄えることが出来る。このコラーゲンゲ
ルを溶液中に設置した場合、コラーゲンゲル内部に蓄え
られた物質は外部溶液中における濃度に依存して、外部
に拡散し、物質の濃度勾配を形成することが出来る。ま
た構成される網目構造は微細であるため、コラーゲンゲ
ル内部に蓄えられたタンパク質等の巨大分子の溶液中へ
の急激な拡散は起こり難く、装置への溶液注入時の操作
性が容易である。また、コラーゲンゲルはゲル構成時に
任意に成形することが出来る。また、コラーゲンゲル構
成時のコラーゲン濃度を調整することにより、コラーゲ
ン分子が重合して出来たコラーゲン繊維の網目の大きさ
を調整することが可能で、コラーゲンゲル中の物質の拡
散速度を調整することが出来る。EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples. Collagen gel is used for the concentration gradient generation part of the device of the present invention. The collagen fiber that constitutes the collagen gel is a constituent component of the extracellular matrix in a living body, and is effective as a culture base for culturing many cells. It is especially effective in cell adhesion and nerve fiber elongation. Therefore, when collagen gel is used for the concentration gradient generation part, cell chemotaxis due to incompatibility between the cells and the concentration gradient generation part is investigated when investigating the phenomenon that the cells and the concentration gradient generation part have direct contact. There is no need to consider the effect on sex. Also,
Collagen gel has a structure in which collagen fibers are intricately meshed, and a solution containing a substance that forms a concentration gradient can be stored inside the mesh. When this collagen gel is placed in a solution, the substance stored inside the collagen gel can diffuse to the outside depending on the concentration in the external solution to form a concentration gradient of the substance. Further, since the network structure constituted is fine, rapid diffusion of macromolecules such as proteins stored inside the collagen gel into the solution is unlikely to occur, and operability during solution injection into the device is easy. In addition, the collagen gel can be optionally molded when forming the gel. In addition, by adjusting the collagen concentration during the formation of the collagen gel, it is possible to adjust the size of the mesh of collagen fibers formed by the polymerization of collagen molecules, and to adjust the diffusion rate of the substance in the collagen gel. Can be done.
【００１７】本実施例の濃度勾配生成装置において用い
る基盤材料としては、細胞の様子を顕微鏡観察出来るこ
とが好ましいため透明な基盤が好ましく、また、解析対
象細胞が神経細胞の場合、細胞を電気的に刺激したり、
細胞の電気活動を記録できることが好ましいため、絶縁
材料であることが好ましい。濃度勾配の均一性の観点か
ら基盤の表面は実質的に平坦であることが好ましい。上
記要件は壁面の材料についても同様である。以下、本実
施例の各濃度勾配生成装置を図面を参照しながら具体的
に説明する。As the base material used in the concentration gradient generator of this embodiment, a transparent base is preferable because it is preferable that the state of cells can be observed under a microscope, and when the cells to be analyzed are nerve cells, the cells are electrically charged. To stimulate
An insulating material is preferred because it is preferable to be able to record the electrical activity of cells. From the viewpoint of uniformity of concentration gradient, it is preferable that the surface of the substrate is substantially flat. The above requirements are the same for the wall material. Hereinafter, each concentration gradient generation device of the present embodiment will be specifically described with reference to the drawings.
【００１８】（実施例１）図１は本実施例の濃度勾配生
成装置を示す図である。図１において、１は基盤を表し
ており、２は溶液を蓄え得る様に基盤上に築かれた壁面
であり、３はコラーゲンゲルから成る濃度勾配生成部を
表し、２の壁面と３の濃度勾配生成部の間の領域４が濃
度勾配生成領域であり、細胞を培養する際の細胞培養部
となる。(Embodiment 1) FIG. 1 is a diagram showing a concentration gradient generating apparatus of this embodiment. In FIG. 1, 1 is a base, 2 is a wall surface built on the base so that a solution can be stored, 3 is a concentration gradient generating part made of collagen gel, and 2 walls and 3 concentrations The region 4 between the gradient generation portions is the concentration gradient generation region, which serves as a cell culture portion when culturing cells.
【００１９】〈濃度勾配生成部の作製〉濃度勾配生成部
の作製法は大きく分けて、コラーゲンゲル作製溶液の調
製、濃度勾配生成部の作製から成る。<Production of Concentration Gradient Generating Unit> The method of producing the concentration gradient producing unit is roughly divided into the preparation of a collagen gel producing solution and the production of the concentration gradient producing unit.
【００２０】（コラーゲンゲル作製溶液の調製）
１．切断したラットの尾を、７０体積％エタノール水溶
液中に５分程度漬ける。以下の操作は、低温（４℃）、
滅菌環境下で行い、試料中に粉塵等が混入しないように
注意する。
２．滅菌したラットの尾から尾腱を取り出す。
３．約１匹分のラットの尾腱に対して、１０ｍｌの０．
５Ｍ酢酸、０．１４Ｍ塩化ナトリウム溶液を加え、静か
に撹拌し、コラーゲンを抽出する。
４．不要成分をろ過および超遠心（５０，０００ｇで２
時間）で除く。
５．調製したコラーゲン溶液を濃縮し、濃度を３ｍｇ／
ｍｌ程度にする。４℃で使用時まで静置する。本実施例
では、溶液中のコラーゲンの濃度を３ｍｇ／ｍｌとした
が、コラーゲン溶液の濃度は、構成する濃度勾配生成部
の用途に応じて調製すれば良く、上記濃度に限定するも
のではない。
６．上記調製した酸性コラーゲン溶液に、０．１Ｎの水
酸化ナトリウム溶液にフェノールレッドを加えた溶液
（４℃）を徐々に加え、フェノールレッドの色変化を指
標とし、コラーゲン溶液のｐＨを７．４にし、０．１４
Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．４，４℃）でタンパク
濃度が２．４ｍｇ／ｍｌになるように希釈する。４℃で
使用時まで静置する。この場合についても、先に記した
通り本濃度に限定するものではない。(Preparation of Collagen Gel Preparation Solution) 1. The cut rat tail is immersed in 70% by volume ethanol aqueous solution for about 5 minutes. The following operations are for low temperature (4 ℃),
Perform in a sterilized environment and be careful not to let dust, etc. enter the sample. 2. The tail tendon is removed from the sterilized rat tail. 3. For the tail tendon of approximately 1 rat, 10 ml of 0.1.
5M acetic acid and 0.14M sodium chloride solution are added, and the mixture is gently stirred to extract collagen. 4. Unwanted components are filtered and ultracentrifuged (2 at 50,000 g
Exclude by (time). 5. The prepared collagen solution is concentrated to a concentration of 3 mg /
Make it about ml. Leave at 4 ° C until use. In the present embodiment, the concentration of collagen in the solution was set to 3 mg / ml, but the concentration of the collagen solution may be adjusted according to the application of the constituent concentration gradient generating section, and is not limited to the above concentration. 6. A solution (4 ° C.) of 0.1N sodium hydroxide solution and phenol red was gradually added to the prepared acidic collagen solution, and the pH of the collagen solution was adjusted to 7.4 using the color change of phenol red as an index. , 0.14
Dilute with M sodium chloride solution (pH 7.4, 4 ° C.) to a protein concentration of 2.4 mg / ml. Leave at 4 ° C until use. Also in this case, the concentration is not limited to this as described above.
【００２１】上記のように調製した中性コラーゲン溶液
（以下コラーゲンゲル作製溶液とする。）は、室温下で
５分から１０分程度でゲル化する。
（濃度勾配生成部の作製）以下の操作は、滅菌環境下で
行う。
１．あらかじめ洗浄、滅菌した円筒形のガラス管中に気
泡が入らないように注意し、上記で調製したコラーゲン
ゲル作製溶液をガラス管全長の半分程度まで吸入し、ガ
ラス管の一端を封じ、ガラス管を立てた状態で１５分程
度室温で静置する。
２．静置後、ガラス管のゲルが詰まっていない方の端か
ら、ガラス管内部に注射器により滅菌した蒸留水を注入
し、水圧によりガラス管からコラーゲンゲルを出す。ガ
ラス管から出たコラーゲンゲルは、あらかじめ用意して
おいた滅菌した蒸留水を入れた滅菌シャーレ中に入れ
る。
３．滅菌シャーレ中の蒸留水の置換を繰り返し、コラー
ゲンゲル内部の溶液を蒸留水に置換する。
４．上記の円柱状コラーゲンゲルを目的の長さに切断
し、この円柱を濃度勾配形成物質を含む溶液中に入れゲ
ル内の溶液を濃度勾配形成物質を含む溶液に置換する。The neutral collagen solution prepared as described above (hereinafter referred to as a collagen gel preparation solution) gels in about 5 to 10 minutes at room temperature. (Preparation of Concentration Gradient Generation Section) The following operations are performed in a sterilized environment. 1. Carefully prevent air bubbles from entering the cylindrical glass tube that has been washed and sterilized in advance, inhale the collagen gel preparation solution prepared above to about half the length of the glass tube, seal one end of the glass tube, and Let stand and stand at room temperature for about 15 minutes. 2. After standing still, distilled water sterilized with a syringe is injected into the inside of the glass tube from the end of the glass tube where the gel is not clogged, and collagen gel is taken out from the glass tube by hydraulic pressure. The collagen gel discharged from the glass tube is placed in a sterile petri dish containing sterile distilled water prepared in advance. 3. The replacement of distilled water in the sterile petri dish is repeated to replace the solution inside the collagen gel with distilled water. 4. The above-mentioned columnar collagen gel is cut into a desired length, this cylinder is put into a solution containing a concentration gradient forming substance, and the solution in the gel is replaced with a solution containing a concentration gradient forming substance.
【００２２】上記のゲル内の溶液を濃度勾配形成物質を
含む溶液に置換した円柱形コラーゲンゲル塊が濃度勾配
生成部である。この濃度勾配生成部の断面を基盤に接着
する。この濃度勾配生成部は使用時まで濃度勾配形成物
質を含む溶液中に入れて保存しておく。使用時には、ゲ
ルに付着した余分な溶液は充分に除く。本実施例におい
ては、濃度勾配生成部として円断面を有するコラーゲン
ゲル塊を作製したが、これは断面が円であると、基盤平
面上で周囲に対して等方的濃度勾配を形成するのに好ま
しいからである。生成濃度勾配に対して厳密性を必要と
しないのであれば、濃度勾配生成部は例えば、基盤上に
コラーゲンゲル作製溶液を滴下し、ゲル塊を構成するこ
とにより作製することも可能である。The columnar collagen gel mass in which the solution in the gel is replaced with the solution containing the concentration gradient forming substance is the concentration gradient generating section. The cross section of the concentration gradient generating portion is adhered to the base. The concentration gradient generator is stored in a solution containing a concentration gradient forming substance until use. When using, thoroughly remove excess solution attached to the gel. In this example, a collagen gel mass having a circular cross section was produced as the concentration gradient generation part. However, if the cross section is circular, it is possible to form an isotropic concentration gradient with respect to the surroundings on the base plane. This is because it is preferable. If strictness is not required for the generated concentration gradient, the concentration gradient generation unit can be prepared, for example, by dropping a collagen gel preparation solution on a substrate to form a gel mass.
【００２３】〈濃度勾配生成装置の作製〉基盤材料とし
ては、機械的強度の強い透明な絶縁素材として、厚さが
１ｍｍの市販の硬質ガラス板を用いた。また、基盤上に
形成する壁面には、市販のプラスティック製円筒を用い
た。本実施例では、上記に示すような絶縁基盤および壁
面にプラスティック製円筒を用いたが、絶縁基盤の材
質、大きさおよび形状は表面が滑らかなものであればい
ずれでも良く、また、厚みについても顕微鏡観察が必要
な場合は、１ｍｍ程度までのものが好ましいが、必要が
ない場合は任意のもので良い。<Preparation of Concentration Gradient Generating Device> As the base material, a commercially available hard glass plate having a thickness of 1 mm was used as a transparent insulating material having high mechanical strength. A commercially available plastic cylinder was used for the wall surface formed on the base. In this embodiment, the insulating base and the plastic cylinder are used for the wall surface as described above, but the material, size and shape of the insulating base may be any as long as the surface is smooth, and the thickness is also When microscopic observation is required, the thickness is preferably up to about 1 mm, but when it is not necessary, it may be arbitrary.
【００２４】以下に、具体的作製方法を記載する。
１．まず、用意した絶縁基盤および壁面の表面の粉塵等
の汚れを洗剤等で洗浄することにより除く。この際基盤
上および壁面上に洗剤が残らないように注意する。
２．上記絶縁基盤および壁面を蒸留水で再度充分に洗浄
し、室温で乾燥させる。
３．上記絶縁基盤および壁面をオートクレーブ滅菌（１
２０℃、２０分）する。本実施例においては、滅菌法と
してオートクレーブ法（加圧下での加熱による方法）を
採ったが、９０体積％エタノール水溶液中に絶縁基盤お
よび壁面を浸すことにより滅菌する方法を採ることも可
能である。この場合、絶縁基盤および壁面表面に気泡が
付着しないように注意し、絶縁基盤および壁面全面が９
０体積％エタノール水溶液中に浸るようにし、１時間以
上放置する。放置後は、滅菌環境下でエタノールを蒸発
させ、絶縁基盤および壁面を乾燥させる。以下の操作
は、オートクレーブ滅菌の場合と同様に行うことが出来
る。
４．オートクレーブ滅菌により付着した水分を乾燥さ
せ、絶縁基盤上に壁面を接着剤を用いて接着する（以下
この基盤を、壁面一体化絶縁基盤と称す。）。本操作は
滅菌環境下で行われることが好ましく、接着に用いる接
着剤および用具についても滅菌済みのものを用いること
が好ましい。滅菌済みのものが使用できない場合は、接
着後の壁面一体化絶縁基盤を再度オートクレーブ法等に
より滅菌する必要がある。また接着剤については、細胞
培養への利用性を考えた場合には、例えば、医療用のシ
リコン性接着剤の様な細胞毒性の少ないものを用いるこ
とが好ましい。A specific manufacturing method will be described below. 1. First, remove dirt such as dust on the prepared insulating substrate and wall surface by washing with detergent or the like. At this time, be careful not to leave the detergent on the base and the wall. 2. The insulating base and the wall are thoroughly washed again with distilled water and dried at room temperature. 3. Autoclave sterilization (1
20 ° C., 20 minutes). In this embodiment, the autoclave method (method by heating under pressure) is adopted as the sterilization method, but it is also possible to adopt the method of sterilizing by immersing the insulating base and the wall surface in a 90% by volume ethanol aqueous solution. . In this case, be careful so that air bubbles do not adhere to the surface of the insulation base and the wall surface, and
It is immersed in a 0% by volume aqueous ethanol solution and left for 1 hour or more. After standing, ethanol is evaporated in a sterilized environment to dry the insulating base and wall. The following operations can be performed in the same manner as in autoclave sterilization. 4. The attached water is dried by autoclave sterilization, and the wall surface is adhered onto the insulating substrate with an adhesive (hereinafter, this substrate is referred to as a wall-integrated insulating substrate). This operation is preferably performed in a sterilized environment, and it is preferable to use sterilized adhesives and tools used for bonding. If a sterilized product cannot be used, it is necessary to sterilize the wall-integrated insulating substrate after bonding again by the autoclave method or the like. Further, regarding the adhesive, it is preferable to use, for example, a medical silicone adhesive having low cytotoxicity in view of its applicability to cell culture.
【００２５】以下の操作は、滅菌環境下で行うものとす
る。
５．壁面一体化絶縁基盤を滅菌した蒸留水で洗浄し、接
着により発生した不要物を除去する。
６．乾燥後、基盤上の壁面で囲まれた領域内の濃度勾配
生成部を設置する部位に、先に作製したコラーゲンゲル
作製溶液を薄く塗る。
７．塗布したコラーゲンがゲル化しない内に、速やか
に、先に作製した濃度勾配生成部をその上に配置する。
８．これを、コラーゲンゲルが乾燥しないように注意し
ながら室温下で静置し、コラーゲンをゲル化させ、濃度
勾配生成部を定着させる。The following operations are performed in a sterilized environment. 5. The wall-integrated insulating substrate is washed with sterilized distilled water to remove unnecessary substances generated by adhesion. 6. After drying, the collagen gel preparation solution prepared above is thinly applied to the site on the substrate where the concentration gradient generating section is to be installed in the area surrounded by the wall surface. 7. While the applied collagen does not gel, the concentration gradient generating part prepared above is immediately placed on it. 8. This is allowed to stand at room temperature, taking care not to dry the collagen gel, to gel the collagen, and to fix the concentration gradient generating part.
【００２６】以上の方法により、図１に示した濃度勾配
生成装置を得た。なお、上記のように作製した濃度勾配
生成装置は、濃度勾配生成部のコラーゲンゲルが乾燥し
ないように湿度を高く保った状態で使用時まで保存す
る。また、装置の作製に際しては、細胞培養への利用性
を考え、素材に付着している、粉塵等の除去、および素
材の滅菌処理を行ったが、滅菌が不要な場合は、上記方
法に示した滅菌操作および滅菌環境は必須ではない。By the above method, the concentration gradient generator shown in FIG. 1 was obtained. In the concentration gradient generator manufactured as described above, the collagen gel in the concentration gradient generator is kept in a high humidity state until the time of use so as not to dry. In addition, when manufacturing the device, we considered the applicability to cell culture, removed the dust adhering to the material, and sterilized the material.If sterilization is not necessary, use the above method. The sterilization operation and sterilization environment are not essential.
【００２７】（実施例２）図２は本実施例の濃度勾配生
成装置を示す図である。上記実施例１で示した図と同一
の符号を付した部分は実質的に同一の部材であり、その
説明を省略する。以下に、この濃度勾配生成装置の作製
方法を記載する。
〈濃度勾配生成部の作製〉コラーゲンゲル作製溶液の調
製については、実施例１に記載した方法と同様であるた
め省略する。以下、濃度勾配生成部の作製法のみを記載
する。(Embodiment 2) FIG. 2 is a diagram showing a concentration gradient generator of this embodiment. The parts denoted by the same reference numerals as those shown in the above-described first embodiment are substantially the same members, and the description thereof will be omitted. The method of manufacturing this concentration gradient generation device will be described below. <Preparation of Concentration Gradient Generating Section> The preparation of the collagen gel preparation solution is the same as the method described in Example 1 and is omitted. Hereinafter, only the method of manufacturing the concentration gradient generation unit will be described.
【００２８】（濃度勾配生成部の作製方法）実施例１と
同様、以下の操作を滅菌環境下で行う。
１．あらかじめ洗浄、滅菌したシャーレ中に気泡が入ら
ないように注意し、上記で調製したコラーゲンゲル作製
溶液をシャーレ底面からの高さが、目的の濃度勾配生成
部の厚みと同じ大きさになるまで加え、平坦な場所で１
５分程度室温で静置する。
２．静置後、シャーレ内のゲルをメスを用いて目的の形
状に切断し、不要部分のゲルをヘラ等を用いて除く。
３．このシャーレ内に滅菌した蒸留水を注ぎこみ、シャ
ーレ底面に吸着している目的形状のゲルを傷つけないよ
うに剥す。
４．滅菌シャーレ中の蒸留水の置換を繰り返し、コラー
ゲンゲル内部の溶液を蒸留水に置換する。
５．滅菌シャーレ中の蒸留水を除き、濃度勾配形成物質
を含む溶液をシャーレに充分に加え、ゲル内の溶液を濃
度勾配形成物質を含む溶液に置換する。(Manufacturing Method of Concentration Gradient Generation Section) As in Example 1, the following operations are performed in a sterilized environment. 1. Carefully prevent bubbles from entering the dish that has been washed and sterilized in advance, and add the collagen gel preparation solution prepared above until the height from the bottom of the dish becomes the same as the thickness of the desired concentration gradient generation part. , On a flat place 1
Let stand at room temperature for about 5 minutes. 2. After standing still, the gel in the petri dish is cut into a desired shape with a scalpel, and the gel in the unnecessary portion is removed with a spatula or the like. 3. Sterilized distilled water is poured into this petri dish, and the gel of the target shape adsorbed on the bottom of the petri dish is peeled off without damaging it. 4. The replacement of distilled water in the sterile petri dish is repeated to replace the solution inside the collagen gel with distilled water. 5. The distilled water in the sterilized petri dish is removed, the solution containing the concentration gradient forming substance is sufficiently added to the petri dish, and the solution in the gel is replaced with the solution containing the concentration gradient forming substance.
【００２９】このように作製した濃度勾配生成部は使用
時まで濃度勾配形成物質を含む溶液中に入れて保存して
おく。使用時には、ゲルに付着した余分な溶液は充分に
除く。濃度勾配生成部の形状は、濃度勾配生成部を配置
する壁面において、濃度勾配生成時に溶液に浸る部分全
面を覆うことが出来るものであればいずれでも良い。ま
た、濃度勾配生成部の厚みについては、作製した濃度勾
配生成装置の濃度勾配生成領域が確保出来るものであれ
ば、特に指定はない。The concentration gradient generator thus produced is stored in a solution containing a concentration gradient forming substance until use. When using, thoroughly remove excess solution attached to the gel. The shape of the concentration gradient generation unit may be any shape as long as it can cover the entire surface of the wall surface where the concentration gradient generation unit is arranged, which is immersed in the solution when the concentration gradient generation is generated. Further, the thickness of the concentration gradient generation unit is not particularly specified as long as the concentration gradient generation region of the manufactured concentration gradient generation device can be secured.
【００３０】〈濃度勾配生成装置の作製〉濃度勾配生成
装置は実施例１と同様の方法で作製した。絶縁基盤の材
料、基盤の材質、形状および大きさ関する要件について
は、実施例１の内容と同様である。基盤上に形成する壁
面には、厚さ１ｍｍの市販のプラスティック製の板か
ら、縦１０ｍｍ、横２０ｍｍの長方形を４枚とり、各長
方形の長さ１０ｍｍの辺を接着剤を用いて接着し、長さ
が１０ｍｍで、１辺が２０ｍｍの正方形の筒を構成し、
これを用いた。<Production of Concentration Gradient Generating Device> The concentration gradient generating device was produced in the same manner as in Example 1. The requirements regarding the material of the insulating base, the material, the shape and the size of the base are the same as those in the first embodiment. On the wall surface to be formed on the base, from a commercially available plastic plate having a thickness of 1 mm, four rectangles having a length of 10 mm and a width of 20 mm are taken, and the sides having a length of 10 mm of each rectangle are bonded with an adhesive, Construct a square cylinder with a length of 10 mm and a side of 20 mm,
This was used.
【００３１】なお、作製した濃度勾配生成装置は、上記
実施例と同様に濃度勾配生成部のコラーゲンゲルが乾燥
しないように湿度を高く保った状態で使用時まで保存す
る。また、装置の作製に際しては、細胞培養への利用性
を考え、素材に付着している、ゴミ等の除去、および素
材の滅菌処理を行ったが、滅菌が不要な用途に用いる場
合、上記方法に示した滅菌操作および滅菌環境は必須で
はない。The concentration gradient producing apparatus thus prepared is stored until the time of use in a state where the humidity is kept high so that the collagen gel in the concentration gradient producing section is not dried, as in the above-mentioned embodiment. In addition, when manufacturing the device, considering the applicability to cell culture, the adhering material, dust, etc. were removed and the material was sterilized. The sterilization operation and sterilization environment shown in 1 above are not essential.
【００３２】（実施例３）図３は本実施例の濃度勾配生
成装置を示す図である。上記実施例１及び実施例２で示
した図と同一の符号を付した部分は実質的に同一の部材
であり、その説明を省略する。以下に、この濃度勾配生
成装置の作製方法を記載する。(Embodiment 3) FIG. 3 is a diagram showing a concentration gradient generator of this embodiment. The parts denoted by the same reference numerals as those shown in the above-described first and second embodiments are substantially the same members, and the description thereof will be omitted. The method of manufacturing this concentration gradient generation device will be described below.
【００３３】〈濃度勾配生成部の作製〉コラーゲンゲル
作製溶液の調製については、実施例１に記載した方法と
同様であるため省略する。以下、濃度勾配生成部の作製
法のみを記載する。<Preparation of Concentration Gradient Generating Part> The preparation of the collagen gel preparation solution is the same as the method described in Example 1, and therefore its description is omitted. Hereinafter, only the method of manufacturing the concentration gradient generation unit will be described.
【００３４】（濃度勾配生成部の作製方法）上記実施例
１及び２と同様、以下の操作は滅菌環境下で行う。
１．あらかじめ洗浄、滅菌した濃度勾配生成装置に用い
る壁面および壁面より小さく壁面と相似な形状を有する
筒または柱を用意する。
２．次に、壁面で囲まれた領域内に壁面と相似な形状を
有する物体を入れ、物体の側面が全ての場所で壁面から
等距離にあるように調整する。
３．調整後両者の位置関係を固定し、これを鋳型とす
る。この状態を保ったまま、この鋳型をシャーレの底面
に、液漏れがしないようにコラーゲンゲル作製溶液を塗
布し固定する。
４．鋳型が固定されたのを確認後、壁面と物体との間に
コラーゲンゲル作製溶液を流し込み、平坦な場所で室温
で１５分間静置する。
５．静置後、ヘラ等でシャーレ底面から鋳型をはずし、
滅菌した蒸留水中で出来上がったコラーゲンゲルを傷つ
けないように、鋳型をはずす。
６．シャーレ中の蒸留水の置換を繰り返し、コラーゲン
ゲル内部の溶液を蒸留水に置換する。
７．シャーレ中の蒸留水を除き、濃度勾配形成物質を含
む溶液をシャーレに充分に加え、ゲル内の溶液を濃度勾
配形成物質を含む溶液に置換する。(Manufacturing Method of Concentration Gradient Generation Section) Similar to the above-mentioned Examples 1 and 2, the following operations are carried out in a sterilized environment. 1. A wall surface and a cylinder or a column which is smaller than the wall surface and has a shape similar to the wall surface are prepared by previously washing and sterilizing the concentration gradient generating apparatus. 2. Next, an object having a shape similar to that of the wall surface is placed in the area surrounded by the wall surface, and the side surfaces of the object are adjusted so that they are equidistant from the wall surface at all locations. 3. After the adjustment, the positional relationship between the two is fixed, and this is used as a mold. While maintaining this state, this mold is applied and fixed to the bottom surface of a petri dish with a collagen gel preparation solution so as not to leak. 4. After confirming that the template has been fixed, the collagen gel preparation solution is poured between the wall surface and the object, and left standing at room temperature for 15 minutes in a flat place. 5. After standing, remove the mold from the bottom of the dish with a spatula,
Remove the mold so as not to damage the resulting collagen gel in sterile distilled water. 6. The replacement of distilled water in the petri dish is repeated to replace the solution inside the collagen gel with distilled water. 7. The distilled water in the petri dish is removed, the solution containing the concentration gradient forming substance is sufficiently added to the petri dish, and the solution in the gel is replaced with the solution containing the concentration gradient forming substance.
【００３５】このように作製した濃度勾配生成部は使用
時まで濃度勾配形成物質を含む溶液中に入れて保存して
おく。使用時には、ゲルに付着した余分な溶液は充分に
除く。濃度勾配生成部の厚みについては、作製した濃度
勾配生成装置の濃度勾配生成領域が確保出来るものであ
れば、特に指定はない。The concentration gradient generator thus prepared is stored in a solution containing a concentration gradient forming substance until use. When using, thoroughly remove excess solution attached to the gel. The thickness of the concentration gradient generation unit is not particularly specified as long as the concentration gradient generation region of the manufactured concentration gradient generation device can be secured.
【００３６】〈濃度勾配生成装置の作製〉濃度勾配生成
装置を上記実施例１及び２と同様の方法で作製した。使
用する基盤および壁面は実施例１のものと同じものを用
いた。基盤および壁面の材質、形状および大きさ関する
要件についても、実施例１の内容と同様である。なお、
上記のように作製した濃度勾配生成装置は、濃度勾配生
成部のコラーゲンゲルが乾燥しないように湿度を高く保
った状態で使用時まで保存する。また、装置の作製に際
しては、細胞培養への利用性を考え、素材に付着してい
る、ゴミ等の除去、および素材の滅菌処理を行ったが、
滅菌が不要な用途に用いる場合、上記方法に示した滅菌
操作および滅菌環境は必須ではない。<Production of Concentration Gradient Generating Device> A concentration gradient generating device was produced by the same method as in the first and second embodiments. The same base and wall as used in Example 1 were used. The requirements regarding the material, shape, and size of the base and the wall surface are the same as those in the first embodiment. In addition,
The concentration gradient generating device manufactured as described above stores the collagen gel in the concentration gradient generating unit in a high humidity state until the time of use so as not to dry. In addition, at the time of manufacturing the device, in consideration of its applicability to cell culture, the adhering material, dust, etc. were removed and the material was sterilized.
When used in applications where sterilization is unnecessary, the sterilization operation and sterilization environment shown in the above method are not essential.
【００３７】（実施例４）実施例１〜３の濃度勾配生成
装置について、形成される濃度勾配の様子を濃度勾配形
成物質としてフェノールレッドを用いて生成される濃度
勾配について調べた結果について説明する。(Embodiment 4) With respect to the concentration gradient generators of Examples 1 to 3, the results of examining the state of the concentration gradient formed with respect to the concentration gradient generated using phenol red as the concentration gradient forming substance will be described. .
【００３８】濃度勾配形成物質であるフェノールレッド
はあらかじめ生理食塩水（ＮａＣｌ８．０ｇ／ｌ、ＫＣ
ｌ０．２ｇ／ｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4１．１５ｇ／ｌ、ＫＨ2
ＰＯ4０．２ｇ／ｌ、ｐＨ７．４）中に濃度が３ｍｇ／
ｍｌになるように溶解しておいた。Phenol red, which is a substance for forming a concentration gradient, was previously prepared in physiological saline (NaCl 8.0 g / l, KC).
0.2 g / l, Na 2 HPO 4 1.15 g / l, KH 2
PO 4 0.2 g / l, pH 7.4) with a concentration of 3 mg /
It was dissolved so that it became ml.
【００３９】まず、実施例１の濃度勾配生成装置では、
絶縁基盤として５０×５０×１ｍｍの硬質ガラス（ＩＷ
ＡＫＩ ＣＯＤＥ ７７４０ ＧＬＡＳＳ〈岩城硝子
（株）製〉以下同じ）を用いた。また、基盤上に形成す
る壁面には、内径２５ｍｍ、高さ６ｍｍ、厚さ１ｍｍの
市販のプラスティック製円筒を用いた。濃度勾配生成部
に直径５ｍｍ、高さ１０ｍｍの円柱形のものを用い、こ
れに上記方法に示した手順で、色素溶液を濃度勾配生成
部内に蓄えさせた。濃度勾配生成部は、壁面で囲まれた
円形領域のほぼ中央に設置した。First, in the concentration gradient generator of the first embodiment,
50 x 50 x 1 mm hard glass (IW
AKI CODE 7740 GLASS (manufactured by Iwaki Glass Co., Ltd.) is the same). A commercially available plastic cylinder having an inner diameter of 25 mm, a height of 6 mm, and a thickness of 1 mm was used for the wall surface formed on the base. A cylindrical shape having a diameter of 5 mm and a height of 10 mm was used as the concentration gradient generating section, and the dye solution was stored in the concentration gradient generating section by the procedure shown in the above method. The concentration gradient generation unit was installed in the approximate center of the circular area surrounded by the wall surface.
【００４０】実施例２の濃度勾配生成装置では、絶縁基
盤として上記と同じものを用い、壁面としては、実施例
２の正方形の筒を用いた。また濃度勾配生成部には、厚
さが２ｍｍ、大きさが縦１０ｍｍ、横２０ｍｍの板状の
ものを用い、これに上記方法に示した手順で、色素溶液
を濃度勾配生成部内に蓄えさせた。In the concentration gradient generator of the second embodiment, the same insulating base as above is used, and the square cylinder of the second embodiment is used as the wall surface. As the concentration gradient generation unit, a plate-shaped member having a thickness of 2 mm, a length of 10 mm and a width of 20 mm was used, and the dye solution was stored in the concentration gradient generation unit by the procedure shown in the above method. .
【００４１】実施例３の濃度勾配生成装置では、絶縁基
盤としてこの場合も上記と同様のものを用い、壁面とし
ても先に述べた実施例１の濃度勾配生成装置と同様の内
径２５ｍｍ、高さ１０ｍｍ、厚さ１ｍｍの市販のプラス
ティック製円筒を用いた。濃度勾配生成部の形成には、
外径２４ｍｍの円筒を用意し、実施例３記載の方法によ
り、濃度勾配生成部を構成し、フェノールレッド溶液を
濃度勾配生成部内に蓄えさせた。In the concentration gradient generator of the third embodiment, the same insulating base as above is used also in this case, and the wall surface has the same inner diameter of 25 mm and height as the concentration gradient generator of the first embodiment described above. A commercially available plastic cylinder having a thickness of 10 mm and a thickness of 1 mm was used. To form the concentration gradient generator,
A cylinder having an outer diameter of 24 mm was prepared, a concentration gradient generating section was configured by the method described in Example 3, and the phenol red solution was stored in the concentration gradient generating section.
【００４２】上記のように構成した各濃度勾配生成部
は、壁面一体化基盤に装着する前に、濃度勾配生成部内
に蓄えられたフェノールレッド溶液を逃がさないように
注意しながら、軽く表面を蒸留水ですすぎ、表面に付着
した色素溶液を除いた。濃度勾配生成部の壁面一体化基
盤への装着法は先に実施例で述べた通りである。Each of the concentration gradient generating sections configured as described above lightly distills the surface before attaching it to the wall-integrated substrate, taking care not to let the phenol red solution stored in the concentration gradient generating section escape. It was rinsed with water to remove the dye solution adhering to the surface. The method of mounting the concentration gradient generation unit on the wall surface integrated substrate is as described in the above embodiment.
【００４３】上記のように構成した濃度勾配生成装置中
に各２．０ｍｌの生理食塩水を加え、濃度勾配生成装置
を平坦な場所で室温で静置し、濃度勾配生成部からのフ
ェノールレッドの拡散による濃度勾配生成過程を観察し
た。各濃度勾配生成装置とも静置後約５分程度から濃度
勾配生成部からのフェノールレッドの拡散が確認でき始
めた。その後も静置し続けたところ、実施例１の濃度勾
配生成装置の場合は、約１時間、実施例２の濃度勾配生
成装置の場合は３時間程度、実施例３の濃度勾配生成装
置の場合は２時間程度でフェノールレッドが壁面内の溶
液ほぼ全面に行き渡り、各濃度勾配生成装置により生成
された濃度勾配がフェノールレッドの色の濃淡で確認で
きた。2.0 ml of physiological saline was added to each of the concentration gradient generators constructed as described above, and the concentration gradient generators were allowed to stand at room temperature in a flat place to remove phenol red from the concentration gradient generator. The concentration gradient generation process by diffusion was observed. Diffusion of phenol red from the concentration gradient generation unit began to be confirmed in about 5 minutes after standing still in each concentration gradient generation device. When the apparatus was continued to stand still thereafter, it was about 1 hour in the case of the concentration gradient generating apparatus of Example 1, about 3 hours in the case of the concentration gradient generating apparatus of Example 2, and the case of the concentration gradient generating apparatus of Example 3. In about 2 hours, phenol red was spread over almost the entire surface of the solution in the wall surface, and the concentration gradient generated by each concentration gradient generation device was confirmed by the shade of the color of phenol red.
【００４４】実施例１の濃度勾配生成装置の場合は、濃
度勾配生成部を中心として濃度勾配生成部から壁面に向
けて同心円状の形状で、濃度勾配生成部から壁面に向け
て濃度が減少する濃度勾配が形成できた。In the case of the concentration gradient generating apparatus of the first embodiment, the concentration gradient generating unit is the center, and the concentration gradient generating unit has a concentric shape toward the wall surface, and the concentration decreases from the concentration gradient generating unit toward the wall surface. A concentration gradient could be formed.
【００４５】実施例２の濃度勾配生成装置の場合は、濃
度勾配生成部が取り付けられた壁面から、その壁面と向
かい合う壁面に向けて濃度勾配生成部からの距離に従っ
て濃度が減少する濃度勾配が形成できた。In the case of the concentration gradient generating device of the second embodiment, a concentration gradient is formed in which the concentration decreases from the wall surface to which the concentration gradient generating portion is attached toward the wall surface facing the wall surface according to the distance from the concentration gradient generating portion. did it.
【００４６】実施例３の濃度勾配生成装置の場合は、実
施例１の濃度勾配とは濃度勾配の形状は同心円状で同じ
であるが、濃度の高低が逆の関係にある壁面部分から壁
面で囲まれた領域内の中央に向けて、濃度が減少する濃
度勾配が形成できた。In the case of the concentration gradient generator of the third embodiment, the shape of the concentration gradient is the same as that of the concentration gradient of the first embodiment in the form of concentric circles, but from the wall surface portion where the level of the concentration is opposite to the wall surface. A concentration gradient with decreasing concentration could be formed towards the center in the enclosed area.
【００４７】本実施例の濃度勾配形成物質は低分子のフ
ェノールレッド（分子量約３５５）であったため濃度勾
配生成部からの拡散が速く、上記濃度勾配形成後数時間
で、肉眼で壁面内の濃度勾配は確認できなくなり、溶液
内フェノールレッド濃度はほぼ一定になっていた。濃度
勾配形成物質が分子量が数万のタンパク質であった場合
は、濃度勾配生成の速度は本実施例に比べてゆるやかに
なると考えられる。Since the concentration gradient forming substance of this example was low molecular weight phenol red (molecular weight of about 355), diffusion from the concentration gradient generating part was fast, and the concentration on the wall surface was visually observed within several hours after the concentration gradient was formed. The gradient could not be confirmed, and the concentration of phenol red in the solution was almost constant. When the concentration gradient-forming substance is a protein having a molecular weight of tens of thousands, the rate of concentration gradient generation is considered to be slower than in this example.
【００４８】[0048]
【発明の効果】以上説明したように、前記本発明の各濃
度勾配生成装置によれば、基盤上に、濃度勾配形成物質
を含むコラーゲンゲルから成る濃度勾配生成部と、前記
濃度勾配生成部を囲む壁面と、前記壁面と濃度勾配生成
部の間に溶液を蓄えることが可能な空間とを備えたこと
により、種類の異なる細胞を一緒に培養する必要がな
く、特殊な装置等を用いることなく細胞に悪影響を与え
ずに濃度勾配を生成することができる濃度勾配生成装置
を達成できる。As described above, according to each of the concentration gradient generating devices of the present invention, the concentration gradient generating section made of collagen gel containing the concentration gradient forming substance and the concentration gradient generating section are provided on the substrate. By providing a surrounding wall surface and a space capable of storing a solution between the wall surface and the concentration gradient generation unit, it is not necessary to culture cells of different types together and without using a special device or the like. It is possible to achieve a concentration gradient generation device that can generate a concentration gradient without adversely affecting cells.
【００４９】また、壁面が円周上に設けられており、濃
度勾配生成部が壁面で囲まれた領域の中央に位置し、か
つ前記濃度勾配生成部が円柱形であると、濃度勾配形成
物質に対して正の走化性を示す細胞の濃度勾配下での細
胞間相互作用および細胞集団を容易に観察することがで
きる。Further, when the wall surface is provided on the circumference, the concentration gradient generating portion is located at the center of the region surrounded by the wall surface, and the concentration gradient generating portion is cylindrical, the concentration gradient forming substance is formed. It is possible to easily observe the cell-cell interaction and the cell population under a concentration gradient of cells that show positive chemotaxis to.
【００５０】また、壁面が長方形若しくは正方形に設け
られており、かつ濃度勾配生成部が前記壁面の少なくと
も一面に接して平行に設けられていると、細胞の移動方
向または、神経細胞の神経繊維伸長方向の濃度勾配生成
部垂直方向からのずれを測定することによって、細胞が
どの程度正確な濃度勾配を検出しているかを調べること
ができる。Further, when the wall surface is provided in a rectangular or square shape, and the concentration gradient generator is provided in parallel with at least one surface of the wall surface, the direction of cell migration or nerve fiber extension of nerve cells. By measuring the deviation of the concentration gradient generation unit from the vertical direction, it is possible to investigate how accurately the cells detect the concentration gradient.
【００５１】また、壁面が円周上に設けられており、濃
度勾配生成部が壁面に沿って平行に設けられていると、
濃度勾配形成物質に対して正の走化性を示す細胞の濃度
勾配下での細胞個々の応答性を解析することができる。Further, when the wall surface is provided on the circumference and the concentration gradient generating section is provided in parallel along the wall surface,
It is possible to analyze the individual responsiveness of cells under a concentration gradient of cells showing positive chemotaxis to a concentration gradient forming substance.
【００５２】次に、前記本発明の製造方法によれば、コ
ラーゲンゲルから成る濃度勾配生成部を形成する工程
と、基盤上に壁面を接着する工程と、前記基盤上に前記
濃度勾配生成部を配置する工程とを備えたことにより、
本発明の濃度勾配生成装置を効率的に製造することがで
きる。Next, according to the manufacturing method of the present invention, the step of forming the concentration gradient generating portion made of collagen gel, the step of adhering the wall surface to the substrate, and the concentration gradient generating portion on the substrate are performed. By having the step of placing,
The concentration gradient generation device of the present invention can be efficiently manufactured.
【００５３】本発明の濃度勾配生成装置は単一で使用し
た場合でも細胞の走化性解析に適しているが、各濃度勾
配生成装置をその目的に応じて、組み合わせて利用する
ことにより、より詳細な細胞走化性の解析を行うことが
可能である。The concentration gradient generator of the present invention is suitable for the chemotaxis analysis of cells even when used alone, but by using the concentration gradient generators in combination depending on the purpose, It is possible to perform detailed analysis of cell chemotaxis.
【図１】本発明の実施例１の濃度勾配生成装置の概要を
表す斜視図である。FIG. 1 is a perspective view illustrating an outline of a concentration gradient generation device according to a first embodiment of the present invention.
【図２】本発明の実施例２の濃度勾配生成装置の概要を
表す斜視図である。FIG. 2 is a perspective view showing an outline of a concentration gradient generation device according to a second embodiment of the present invention.
【図３】本発明の実施例３の濃度勾配生成装置の概要を
表す斜視図である。FIG. 3 is a perspective view illustrating an outline of a concentration gradient generation device according to a third embodiment of the present invention.
１ 基盤 ２ 壁面 ３ 濃度勾配生成部 ４ 濃度勾配生成領域 1 foundation 2 walls 3 Concentration gradient generator 4 Concentration gradient generation area
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 竹谷 誠 大阪府門真市大字門真1006番地 松下電 器産業株式会社内 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12M 1/00 - 1/32 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (72) Inventor Makoto Takeya 1006 Kadoma, Kadoma City, Osaka Prefecture Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. (58) Fields investigated (Int.Cl. 7 , DB name) C12M 1/00- 1/32
Claims (5)
物質を含むコラーゲンゲルから成る濃度勾配生成部と、
前記濃度勾配生成部を囲む壁面と、前記壁面と濃度勾配
生成部の間に溶液を蓄えることが可能な空間とを備えた
濃度勾配生成装置。1. A concentration gradient generator comprising a collagen gel containing a concentration gradient-forming substance on a substantially flat substrate,
A concentration gradient generation device comprising: a wall surface surrounding the concentration gradient generation unit; and a space capable of storing a solution between the wall surface and the concentration gradient generation unit.
配生成部が壁面で囲まれた領域の中央に位置し、かつ前
記濃度勾配生成部が円柱形である請求項１記載の濃度勾
配生成装置。2. The concentration according to claim 1, wherein the wall surface is provided on the circumference, the concentration gradient generation unit is located at the center of the region surrounded by the wall surface, and the concentration gradient generation unit is cylindrical. Gradient generator.
れており、かつ濃度勾配生成部が前記壁面の少なくとも
一面に接して平行に設けられた請求項１記載の濃度勾配
生成装置。3. The concentration gradient generation device according to claim 1, wherein the wall surface is provided in a rectangular shape or a square shape, and the concentration gradient generation unit is provided in parallel to at least one surface of the wall surface.
配生成部が壁面に沿って平行に設けられた請求項１記載
の濃度勾配生成装置。4. The concentration gradient generation device according to claim 1, wherein the wall surface is provided on a circumference, and the concentration gradient generation unit is provided in parallel along the wall surface.
を形成する工程と、基盤上に壁面を接着する工程と、前
記基盤上に前記濃度勾配生成部を配置する工程とを備え
た濃度勾配生成装置の製造方法。5. A concentration gradient generation device comprising: a step of forming a concentration gradient generation section made of collagen gel; a step of adhering a wall surface to a substrate; and a step of disposing the concentration gradient generation section on the substrate. Manufacturing method.
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|---|---|---|---|
| JP15978894A JP3373299B2 (en) | 1994-07-12 | 1994-07-12 | Concentration gradient generating apparatus and method for manufacturing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP15978894A JP3373299B2 (en) | 1994-07-12 | 1994-07-12 | Concentration gradient generating apparatus and method for manufacturing the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0823956A JPH0823956A (en) | 1996-01-30 |
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1994
- 1994-07-12 JP JP15978894A patent/JP3373299B2/en not_active Expired - Fee Related
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