JP3329778B2 - アンドロゲン受容体及びプロゲステロン受容体と結合するホルモン応答エレメント - Google Patents
アンドロゲン受容体及びプロゲステロン受容体と結合するホルモン応答エレメントInfo
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Description
【０００１】
【発明の分野】本発明は、アストロゲン受容体及びプロ
ゲステロン受容体が結合する新しいHRE(ホルモン応答エ
レメント、ホルモン受容体結合部位）、その配列及び使
用に関する。
ゲステロン受容体が結合する新しいHRE(ホルモン応答エ
レメント、ホルモン受容体結合部位）、その配列及び使
用に関する。
【０００２】
【発明の背景】ステロイド受容体は、リガンド結合部
位、DNA 結合部位及びいくつかのトランス作用活性を有
する転写因子である。リガンドがそのステロイド受容体
に結合すると、受容体の立体構造が変化する。この構造
変化によって、受容体は二量体を形成し、特異的な二重
鎖DNA 配列、いわゆるHRE(ホルモン応答エレメント、ホ
ルモン受容体結合部位）に結合し、そして補助活性化因
子及び他の転写因子と相互作用する。その結果、標的遺
伝子、すなわちそのHRE によって調節される遺伝子の転
写が活性化される。この様なHRE は、普通は、標的遺伝
子のプロモーター領域の要素であるが、標的遺伝子のイ
ントロン又は3'側部分にも見つかっている。アンドロゲ
ン受容体のHRE として、共通配列GG(T/A)ACAnnnTGTTCT
が同定されている(Roche at al.1992, Mol.Endocrinol.
6,2229-2235)。この場合、ｎは任意のヌクレオチドを指
す。「nnn 」の前後のヌクレオチド配列で規定される半
エレメント同志は、ほぼパリンドローム構造である。ア
ンドロゲンによって高度に調節されるCRISP-1 遺伝子の
プロモーターに存在する配列GGTACAtctTGTTCA は、アン
ドロゲン受容体との結合親和性が高いことが示された(S
chwidetzky et al.1997,Biochem.J.321,325-332)。以下
本明細書において、この配列を共通HRE と称する。しか
しこのHRE は、アンドロゲン受容体ばかりでなく、グル
ココルチコイド受容体及びプロゲステロン受容体によっ
ても認識される。しかしプロバシン(probasin)遺伝子の
プロモーター領域では、このHRE は、アンドロゲン受容
体と特異的に結合するが、グルココルチコイド受容体と
は結合しない(F.Claessens et al.1996,J.Biol.Chem.27
1,19013-19016)。プロゲステロン受容体との結合に関す
る情報は、現在得られていない。インビトロ選択方法に
よって、アンドロゲン受容体と結合することができる新
しいDNA 配列(IDR17と命名された）が、最近見つかった
(Zhou et al.1997,J.Biol.Chem.272,8227-8235) 。種々
の実験から、この配列は、グルココルチコイド受容体よ
りも、アンドロゲン受容体に対して高い選択性を有する
ことが示された。プロゲステロン受容体との比較は、記
載されていなかった。配列IDR17 は、インビトロで見つ
かった配列であり、インビボにも存在するか、HRE とし
て機能するかどうかに関する示唆はない。
位、DNA 結合部位及びいくつかのトランス作用活性を有
する転写因子である。リガンドがそのステロイド受容体
に結合すると、受容体の立体構造が変化する。この構造
変化によって、受容体は二量体を形成し、特異的な二重
鎖DNA 配列、いわゆるHRE(ホルモン応答エレメント、ホ
ルモン受容体結合部位）に結合し、そして補助活性化因
子及び他の転写因子と相互作用する。その結果、標的遺
伝子、すなわちそのHRE によって調節される遺伝子の転
写が活性化される。この様なHRE は、普通は、標的遺伝
子のプロモーター領域の要素であるが、標的遺伝子のイ
ントロン又は3'側部分にも見つかっている。アンドロゲ
ン受容体のHRE として、共通配列GG(T/A)ACAnnnTGTTCT
が同定されている(Roche at al.1992, Mol.Endocrinol.
6,2229-2235)。この場合、ｎは任意のヌクレオチドを指
す。「nnn 」の前後のヌクレオチド配列で規定される半
エレメント同志は、ほぼパリンドローム構造である。ア
ンドロゲンによって高度に調節されるCRISP-1 遺伝子の
プロモーターに存在する配列GGTACAtctTGTTCA は、アン
ドロゲン受容体との結合親和性が高いことが示された(S
chwidetzky et al.1997,Biochem.J.321,325-332)。以下
本明細書において、この配列を共通HRE と称する。しか
しこのHRE は、アンドロゲン受容体ばかりでなく、グル
ココルチコイド受容体及びプロゲステロン受容体によっ
ても認識される。しかしプロバシン(probasin)遺伝子の
プロモーター領域では、このHRE は、アンドロゲン受容
体と特異的に結合するが、グルココルチコイド受容体と
は結合しない(F.Claessens et al.1996,J.Biol.Chem.27
1,19013-19016)。プロゲステロン受容体との結合に関す
る情報は、現在得られていない。インビトロ選択方法に
よって、アンドロゲン受容体と結合することができる新
しいDNA 配列(IDR17と命名された）が、最近見つかった
(Zhou et al.1997,J.Biol.Chem.272,8227-8235) 。種々
の実験から、この配列は、グルココルチコイド受容体よ
りも、アンドロゲン受容体に対して高い選択性を有する
ことが示された。プロゲステロン受容体との比較は、記
載されていなかった。配列IDR17 は、インビトロで見つ
かった配列であり、インビボにも存在するか、HRE とし
て機能するかどうかに関する示唆はない。
【０００３】
【発明の目的】HRE に関する情報は、ホルモン依存性疾
患を治療するための薬物を開発する際に有用である。ア
ンドロゲン受容体の共通HRE との結合を阻害する抗アン
ドロゲン剤を用いる前立腺ガンの治療において、アンド
ロゲンによって調節される遺伝子の全てが抑制されるわ
けではないこと、更に、一定の治療期間後には、抗アン
ドロゲン剤はもはや活性を示さないことが、多数報告さ
れている。これらの事実から、様々な遺伝子を調節する
ために、それらのホルモン依存性を担う異なったHRE が
存在することが判る。従って、ホルモン療法を成功させ
るために、アンドロゲン受容体が結合する他のHRE を見
つけることが望まれる。その結果、特異活性を有する天
然ホルモン、合成ホルモン又は抗ホルモン剤を同定する
ことができるだろう。そして、その様な抗ホルモン剤を
用いて、前記疾患に関連する遺伝子を活性化又は不活性
化することができる。現在まで、アンドロゲン及びその
HREによって調節される遺伝子は、ほんの少数しか知ら
れていない。この例には、プロバシン遺伝子及びC3(1)
遺伝子があり、両遺伝子ともアンドロゲンによってラッ
ト前立腺において誘導される(F.Claessens et al.1989,
Biochem.Biophys.Res.Commun.164,833-840; P.S.Rennie
et al.1993,Mol.Endocrinol.7,23-36) 。ラットの精巣
上体においては、pem 遺伝子がアンドロゲン依存性に発
現している(S.Malti et al.1996,J.Biol.Chem.271,1753
6-17546)。２つの初期転写部位のおおよその位置が報告
されているが、そのHRE は同定されていない。
患を治療するための薬物を開発する際に有用である。ア
ンドロゲン受容体の共通HRE との結合を阻害する抗アン
ドロゲン剤を用いる前立腺ガンの治療において、アンド
ロゲンによって調節される遺伝子の全てが抑制されるわ
けではないこと、更に、一定の治療期間後には、抗アン
ドロゲン剤はもはや活性を示さないことが、多数報告さ
れている。これらの事実から、様々な遺伝子を調節する
ために、それらのホルモン依存性を担う異なったHRE が
存在することが判る。従って、ホルモン療法を成功させ
るために、アンドロゲン受容体が結合する他のHRE を見
つけることが望まれる。その結果、特異活性を有する天
然ホルモン、合成ホルモン又は抗ホルモン剤を同定する
ことができるだろう。そして、その様な抗ホルモン剤を
用いて、前記疾患に関連する遺伝子を活性化又は不活性
化することができる。現在まで、アンドロゲン及びその
HREによって調節される遺伝子は、ほんの少数しか知ら
れていない。この例には、プロバシン遺伝子及びC3(1)
遺伝子があり、両遺伝子ともアンドロゲンによってラッ
ト前立腺において誘導される(F.Claessens et al.1989,
Biochem.Biophys.Res.Commun.164,833-840; P.S.Rennie
et al.1993,Mol.Endocrinol.7,23-36) 。ラットの精巣
上体においては、pem 遺伝子がアンドロゲン依存性に発
現している(S.Malti et al.1996,J.Biol.Chem.271,1753
6-17546)。２つの初期転写部位のおおよその位置が報告
されているが、そのHRE は同定されていない。
【０００４】
【発明の内容及び実施態様】アンドロゲン受容体の新し
いHRE が求められている。本発明は、アンドロゲン受容
体及びプロゲステロン受容体と結合し、且つ、 ａ．一般式(N)xTCTCATTCTGTTCCで表され、N が互いに独
立に任意の組合せでA,T, C 又はG であり、そしてx が
０〜３であるDNA 配列か； ｂ．ａで記載した配列の変異体か；又は、 ｃ．ａ又はｂで記載したDNA 配列に相補的なDNA 配列、
を含んでいる新しいHRE を提供する。
いHRE が求められている。本発明は、アンドロゲン受容
体及びプロゲステロン受容体と結合し、且つ、 ａ．一般式(N)xTCTCATTCTGTTCCで表され、N が互いに独
立に任意の組合せでA,T, C 又はG であり、そしてx が
０〜３であるDNA 配列か； ｂ．ａで記載した配列の変異体か；又は、 ｃ．ａ又はｂで記載したDNA 配列に相補的なDNA 配列、
を含んでいる新しいHRE を提供する。
【０００５】前記配列の変異体は、例えば対立遺伝子変
異体でもよい。対立遺伝子の変異は、突然変異、すなわ
ちヌクレオチドの天然の欠失、付加又は置換で特徴づけ
られるDNA 配列の変化として規定される。これらのいず
れかの変化は、単独又は他の変化との組合せで、当DNA
配列中に１箇所又は数箇所存在してもよい。これらの変
化によって、HRE の結合特性は有意に変化しない。対立
遺伝子変異体は、ａで記載した配列に対して、少なくと
も80％、好ましくは85％、最も好ましくは90％の配列同
一性を有するべきである。本発明のDNA 配列は、インビ
ボでは二重鎖として存在する、すなわち本配列は、本配
列と相補的なDNA 配列と結合する。
異体でもよい。対立遺伝子の変異は、突然変異、すなわ
ちヌクレオチドの天然の欠失、付加又は置換で特徴づけ
られるDNA 配列の変化として規定される。これらのいず
れかの変化は、単独又は他の変化との組合せで、当DNA
配列中に１箇所又は数箇所存在してもよい。これらの変
化によって、HRE の結合特性は有意に変化しない。対立
遺伝子変異体は、ａで記載した配列に対して、少なくと
も80％、好ましくは85％、最も好ましくは90％の配列同
一性を有するべきである。本発明のDNA 配列は、インビ
ボでは二重鎖として存在する、すなわち本配列は、本配
列と相補的なDNA 配列と結合する。
【０００６】更に、この様な変異体は、ストリンジェン
トな条件で、本発明の変異体とハイブリダイズする配列
であってもよい。17ヌクレオチドから成るHRE の場合、
ストリンジェントな条件とは、QuickHyb緩衝液(Stratag
ene)中で、ハイブリダイゼーション温度35℃、好ましく
は38℃、最も好ましくは41℃を指す。アンドロゲン受容
体及びプロゲステロン受容体は、特異的に本発明のHRE
と結合するが、グルココルチコイド受容体は結合しな
い。本発明のHRE は、前記の共通HRE 及びIDR17-HRE に
比べてより高い感受性で、アンドロゲン受容体及びプロ
ゲステロン受容体と反応し、標的遺伝子をより強く誘導
する（実施例４参照）。アンドロゲン受容体と相互作用
すると推定されるタンパク質をコードする発現構成体を
同時にトランスフェクションすると、共通HRE の場合と
比べて、より強力な本発明のHRE(ARE17)の活性化が得ら
れる（実施例４参照）。アンドロゲンによる本発明のHR
E の活性化は、共通HRE の場合とは異なり、125ng/mlゲ
ルダナマイシンによって容易に阻害される。共通HRE は
むしろより活性化され、より高濃度のゲルダナマイシン
によってしか阻害されない（実施例４参照）。ゲルダナ
マイシンは、ステロイド受容体の作用を阻害する物質で
ある(D.F.Smith et al.1995,Cell.Biol.15,6804-6812)
。エストロゲン、グルココルチコイド又はミネラルコ
ルチコイド受容体と結合するHRE は、ほとんどパリンド
ローム構造をなす２つの半エレメントから成る(Evans e
t al. US 5,597,693) 。アンドロゲン受容体の共通HRE
も、ほとんどパリンドローム構造をなす。しかし本発明
のHRE は、パリンドローム構造をとらず、半エレメント
TGTTCTの「直列反復」であるようである。この構造上の
差異及び前記の差異から、アンドロゲン受容体と本発明
のHRE との相互作用は、アンドロゲン受容体と共通HRE
との相互作用とは異なるだろうことが判る。従って、本
発明のHRE との相互作用は、共通HRE との相互作用の場
合とは異なる別の機構によって、そして別のアンドロゲ
ン又は抗アンドロゲンによって、修飾される可能性があ
る。
トな条件で、本発明の変異体とハイブリダイズする配列
であってもよい。17ヌクレオチドから成るHRE の場合、
ストリンジェントな条件とは、QuickHyb緩衝液(Stratag
ene)中で、ハイブリダイゼーション温度35℃、好ましく
は38℃、最も好ましくは41℃を指す。アンドロゲン受容
体及びプロゲステロン受容体は、特異的に本発明のHRE
と結合するが、グルココルチコイド受容体は結合しな
い。本発明のHRE は、前記の共通HRE 及びIDR17-HRE に
比べてより高い感受性で、アンドロゲン受容体及びプロ
ゲステロン受容体と反応し、標的遺伝子をより強く誘導
する（実施例４参照）。アンドロゲン受容体と相互作用
すると推定されるタンパク質をコードする発現構成体を
同時にトランスフェクションすると、共通HRE の場合と
比べて、より強力な本発明のHRE(ARE17)の活性化が得ら
れる（実施例４参照）。アンドロゲンによる本発明のHR
E の活性化は、共通HRE の場合とは異なり、125ng/mlゲ
ルダナマイシンによって容易に阻害される。共通HRE は
むしろより活性化され、より高濃度のゲルダナマイシン
によってしか阻害されない（実施例４参照）。ゲルダナ
マイシンは、ステロイド受容体の作用を阻害する物質で
ある(D.F.Smith et al.1995,Cell.Biol.15,6804-6812)
。エストロゲン、グルココルチコイド又はミネラルコ
ルチコイド受容体と結合するHRE は、ほとんどパリンド
ローム構造をなす２つの半エレメントから成る(Evans e
t al. US 5,597,693) 。アンドロゲン受容体の共通HRE
も、ほとんどパリンドローム構造をなす。しかし本発明
のHRE は、パリンドローム構造をとらず、半エレメント
TGTTCTの「直列反復」であるようである。この構造上の
差異及び前記の差異から、アンドロゲン受容体と本発明
のHRE との相互作用は、アンドロゲン受容体と共通HRE
との相互作用とは異なるだろうことが判る。従って、本
発明のHRE との相互作用は、共通HRE との相互作用の場
合とは異なる別の機構によって、そして別のアンドロゲ
ン又は抗アンドロゲンによって、修飾される可能性があ
る。
【０００７】本発明のHRE として、x=0 である配列番号
３のDNA 配列が好ましい。更に、x=3 である本発明のHR
E も好ましい。x=3 且つN=AGA である配列番号１のDNA
配列が最も好ましい。本発明のHRE のDNA 配列を、アン
ドロゲン及び／又はプロゲステロンによって調節される
遺伝子の検出のために用いることができる。この検出
は、人間又は動物組織に対して行うことができる。その
結果、新しい遺伝子が同定されるか、又は、既知遺伝子
及び未知遺伝子のアンドロゲン及び／又はプロゲステロ
ンによる調節を検出できる。この検出は、例えば、コン
ピュータによるDNA データバンクの分析、DNA 配列の決
定又は点突然変異スクリーニング（例えばPCR 増幅した
ゲノム断片の配列決定又は一本鎖構造多型SSCP）によっ
て行うことができる(A.C.Goodeve 1998,Clin.Lab.Hemat
ol.20,3-19) 。この場合、分析対象のDNA 配列を本発明
のHRE のDNA 配列と比較する。更に、本発明のHRE の配
列のオリゴヌクレオチドを合成することができる。この
合成は、例えばM.H.Caruthers et al.1983,Gene Ampli
f.Anal.3,1-26に記載された通常の方法によって行う。
このオリゴヌクレオチドを、放射性標識するか、又は検
出可能な基、例えばジゴキシゲニン、アルカリホスファ
ターゼ、ビオチン、フルオレセイン、ローダミン、テキ
サスレッド、オレゴングリーン若しくはBODIPY色素によ
って標識することができる。本発明のHRE のDNA 配列に
一致するオリゴヌクレオチドを用いて、本発明のHRE に
よって調節される遺伝子を、ゲノムバンクのスクリーニ
ング、サザンブロット又はin situ ハイブリダイゼーシ
ョンによって、あるいは、当業者に既知の他の方法によ
って検出することができる。
３のDNA 配列が好ましい。更に、x=3 である本発明のHR
E も好ましい。x=3 且つN=AGA である配列番号１のDNA
配列が最も好ましい。本発明のHRE のDNA 配列を、アン
ドロゲン及び／又はプロゲステロンによって調節される
遺伝子の検出のために用いることができる。この検出
は、人間又は動物組織に対して行うことができる。その
結果、新しい遺伝子が同定されるか、又は、既知遺伝子
及び未知遺伝子のアンドロゲン及び／又はプロゲステロ
ンによる調節を検出できる。この検出は、例えば、コン
ピュータによるDNA データバンクの分析、DNA 配列の決
定又は点突然変異スクリーニング（例えばPCR 増幅した
ゲノム断片の配列決定又は一本鎖構造多型SSCP）によっ
て行うことができる(A.C.Goodeve 1998,Clin.Lab.Hemat
ol.20,3-19) 。この場合、分析対象のDNA 配列を本発明
のHRE のDNA 配列と比較する。更に、本発明のHRE の配
列のオリゴヌクレオチドを合成することができる。この
合成は、例えばM.H.Caruthers et al.1983,Gene Ampli
f.Anal.3,1-26に記載された通常の方法によって行う。
このオリゴヌクレオチドを、放射性標識するか、又は検
出可能な基、例えばジゴキシゲニン、アルカリホスファ
ターゼ、ビオチン、フルオレセイン、ローダミン、テキ
サスレッド、オレゴングリーン若しくはBODIPY色素によ
って標識することができる。本発明のHRE のDNA 配列に
一致するオリゴヌクレオチドを用いて、本発明のHRE に
よって調節される遺伝子を、ゲノムバンクのスクリーニ
ング、サザンブロット又はin situ ハイブリダイゼーシ
ョンによって、あるいは、当業者に既知の他の方法によ
って検出することができる。
【０００８】アンドロゲン及び／又はプロゲステロンに
よって調節される遺伝子の発現変化を検出するために、
本発明のHRE の配列、又は本発明のHRE の配列によって
調節される配列を用いることができる。従って、例え
ば、疾患細胞を、正常細胞と比較することができる。本
発明のHRE の配列によって調節される配列は、例えば、
標的遺伝子のコード領域由来の配列であってよい。
よって調節される遺伝子の発現変化を検出するために、
本発明のHRE の配列、又は本発明のHRE の配列によって
調節される配列を用いることができる。従って、例え
ば、疾患細胞を、正常細胞と比較することができる。本
発明のHRE の配列によって調節される配列は、例えば、
標的遺伝子のコード領域由来の配列であってよい。
【０００９】更に、本発明は、人間又は動物組織におい
て、アンドロゲン又はプロゲステロンによって調節され
る発現調節エレメント、特にHRE における変異を検出す
るために、本発明のDNA 配列に相当するオリゴヌクレオ
チドを使用することに関する。この場合、正常細胞すな
わち未変化細胞、確立された細胞株、及び腫瘍細胞を用
いることができる。この様な変異の検出は、例えば、前
記組織又は細胞から単離されたゲノムDNA の配列決定に
よって、あるいは点変異スクリーニングによって行うこ
とができる(A.C.Goodeve 1998,Clin.Lab.Hematol.20,3-
19) 。この様な変異は、抗ホルモン剤による腫瘍患者の
治療においてしばしば観察される再発の際に作用すると
思われる。アンタゴニスト又は部分アゴニストを結合さ
せることによって、変異HRE とアンドロゲン受容体又は
プロゲステロン受容体との相互作用を変化させ、その結
果、遺伝子の発現変化又は発現抑制を起こすことができ
る。この様な変異の検出によって、その変異が認められ
た患者により適応した治療が可能となる。
て、アンドロゲン又はプロゲステロンによって調節され
る発現調節エレメント、特にHRE における変異を検出す
るために、本発明のDNA 配列に相当するオリゴヌクレオ
チドを使用することに関する。この場合、正常細胞すな
わち未変化細胞、確立された細胞株、及び腫瘍細胞を用
いることができる。この様な変異の検出は、例えば、前
記組織又は細胞から単離されたゲノムDNA の配列決定に
よって、あるいは点変異スクリーニングによって行うこ
とができる(A.C.Goodeve 1998,Clin.Lab.Hematol.20,3-
19) 。この様な変異は、抗ホルモン剤による腫瘍患者の
治療においてしばしば観察される再発の際に作用すると
思われる。アンタゴニスト又は部分アゴニストを結合さ
せることによって、変異HRE とアンドロゲン受容体又は
プロゲステロン受容体との相互作用を変化させ、その結
果、遺伝子の発現変化又は発現抑制を起こすことができ
る。この様な変異の検出によって、その変異が認められ
た患者により適応した治療が可能となる。
【００１０】本発明は、発現させる遺伝子と作用可能に
連結した本発明のHRE を含んでいるベクターにも関す
る。この場合、本発明のHRE は、数コピー、好ましくは
１〜４コピー存在してよい。作用可能な連結には、最小
プロモーター配列を用いることができる。文献には、い
くつかの利用可能なベクター及び最小プロモーターが記
載されている。例えば、ベクターpGL3ベーシック又はpG
L3エンハンサーを用いることができる。プロモーターと
して、TK最小プロモーター(G.R.Reyes et al.1982,J.Ge
n.Virol.62,191-206) 又はこれに匹敵する最小プロモー
ターを用いることができる。最小プロモーターは、TATA
ボックス及び転写開始点のみを有するプロモーターであ
る。TATAボックスとは、タンパク質複合体TFIID によっ
て検出されるDNA 配列のことである。
連結した本発明のHRE を含んでいるベクターにも関す
る。この場合、本発明のHRE は、数コピー、好ましくは
１〜４コピー存在してよい。作用可能な連結には、最小
プロモーター配列を用いることができる。文献には、い
くつかの利用可能なベクター及び最小プロモーターが記
載されている。例えば、ベクターpGL3ベーシック又はpG
L3エンハンサーを用いることができる。プロモーターと
して、TK最小プロモーター(G.R.Reyes et al.1982,J.Ge
n.Virol.62,191-206) 又はこれに匹敵する最小プロモー
ターを用いることができる。最小プロモーターは、TATA
ボックス及び転写開始点のみを有するプロモーターであ
る。TATAボックスとは、タンパク質複合体TFIID によっ
て検出されるDNA 配列のことである。
【００１１】本発明のベクター、又は本発明のHRE を有
するDNA によって、細胞を形質転換することができる。
この様な形質転換細胞も、本発明の対象である。この細
胞は、真核生物細胞でよく、例えば酵母でもよい。適当
な細胞は、例えば、PC-3細胞(M.E.Kaighn et al.1979,I
nvest.Urol.17,16-23)、LNCaP 細胞(J.S.Horoszewiczet
al.1983,Cancer Res.43,1809-1818)、CV-1細胞(F.C.Je
nsen et al.1964,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 52,53-59)
、HeLa細胞(T.T.Puck et al.1956,J.Exp.Med.103,273-
284) 及びDunning 細胞(D.D.Mickey et al.1977,Cancer
Res.37,4049-4058) である。トランスフェクション
は、通常の方法、例えばトランスフェクション試薬、塩
化カルシウム、Fu遺伝子、リポTAXI、DOTAP 、ポフェク
チン、リポフェクタミン若しくはスーパーフェクトを用
いた方法、又はエレクトロポレーション法、又は遺伝子
銃を用いた方法によって行うことができる。トランスフ
ェクション法は、Molecular Cloning:A Laboratory Man
ual(Sambrook et al.1989, Cold Spring Harbor Labora
tory Press) に記載されている。
するDNA によって、細胞を形質転換することができる。
この様な形質転換細胞も、本発明の対象である。この細
胞は、真核生物細胞でよく、例えば酵母でもよい。適当
な細胞は、例えば、PC-3細胞(M.E.Kaighn et al.1979,I
nvest.Urol.17,16-23)、LNCaP 細胞(J.S.Horoszewiczet
al.1983,Cancer Res.43,1809-1818)、CV-1細胞(F.C.Je
nsen et al.1964,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 52,53-59)
、HeLa細胞(T.T.Puck et al.1956,J.Exp.Med.103,273-
284) 及びDunning 細胞(D.D.Mickey et al.1977,Cancer
Res.37,4049-4058) である。トランスフェクション
は、通常の方法、例えばトランスフェクション試薬、塩
化カルシウム、Fu遺伝子、リポTAXI、DOTAP 、ポフェク
チン、リポフェクタミン若しくはスーパーフェクトを用
いた方法、又はエレクトロポレーション法、又は遺伝子
銃を用いた方法によって行うことができる。トランスフ
ェクション法は、Molecular Cloning:A Laboratory Man
ual(Sambrook et al.1989, Cold Spring Harbor Labora
tory Press) に記載されている。
【００１２】本HRE 配列に作用可能に連結された遺伝子
を発現させるために、本発明の細胞を用いることができ
る。本HRE に結合することができ、そしてリガンド結合
ドメインが追加されているポリペプチドを有する細胞が
好ましい。このポリペプチドとして、アンドロゲン受容
体又はプロゲステロン受容体が特に好ましい。アンドロ
ゲン受容体遺伝子又はプロゲステロン受容体遺伝子によ
って、それらの部分によって、又は、他の因子のトラン
ス作用活性ドメインと組み合わせたそれらの部分によっ
て、安定に又は一過的に、本発明の細胞を形質転換する
ことができ、その結果この培養細胞にアンドロゲン又は
プロゲスチンを添加することで、前記タンパク質の発現
が誘導される。前記のアンドロゲン受容体又はプロゲス
テロン受容体の部分とは、例えば、リガンド結合ドメイ
ン、トランス作用活性ドメイン及びDNA 結合ドメインで
ある。前記の他の因子のトランス作用活性ドメインと
は、例えば、Gal4のトランス作用活性ドメイン又はVP16
トランス作用活性ドメインである。
を発現させるために、本発明の細胞を用いることができ
る。本HRE に結合することができ、そしてリガンド結合
ドメインが追加されているポリペプチドを有する細胞が
好ましい。このポリペプチドとして、アンドロゲン受容
体又はプロゲステロン受容体が特に好ましい。アンドロ
ゲン受容体遺伝子又はプロゲステロン受容体遺伝子によ
って、それらの部分によって、又は、他の因子のトラン
ス作用活性ドメインと組み合わせたそれらの部分によっ
て、安定に又は一過的に、本発明の細胞を形質転換する
ことができ、その結果この培養細胞にアンドロゲン又は
プロゲスチンを添加することで、前記タンパク質の発現
が誘導される。前記のアンドロゲン受容体又はプロゲス
テロン受容体の部分とは、例えば、リガンド結合ドメイ
ン、トランス作用活性ドメイン及びDNA 結合ドメインで
ある。前記の他の因子のトランス作用活性ドメインと
は、例えば、Gal4のトランス作用活性ドメイン又はVP16
トランス作用活性ドメインである。
【００１３】本発明は、ホルモン受容体結合活性を有す
る物質を検査するシステムであって、 ａ．発現又は転写させる異種遺伝子に作用可能に連結し
た本発明のDNA 配列；及び、 ｂ．ａで記載した本発明のDNA 配列と結合することがで
きるポリペプチド、を含んでいる前記検査システムにも
関する。
る物質を検査するシステムであって、 ａ．発現又は転写させる異種遺伝子に作用可能に連結し
た本発明のDNA 配列；及び、 ｂ．ａで記載した本発明のDNA 配列と結合することがで
きるポリペプチド、を含んでいる前記検査システムにも
関する。
【００１４】発現させる遺伝子は、検出可能なタンパク
質をコードするものでよい。転写される遺伝子は、検出
可能なRNA として転写されるものでよい。更に、本発明
は、アンドロゲン活性を有する検査物質を検出する検査
システムであって、 ａ．本発明の細胞においてリポーター遺伝子を発現させ
て； ｂ．前記細胞がアンドロゲン受容体を全く又は少ししか
含まない場合、アンドロゲン受容体の発現ベクターによ
って更に前記細胞を形質転換して； ｃ．検査物質の存在下又は非存在下に前記細胞を培養し
て；そして、 ｄ．前記リポーター遺伝子の発現変化を測定すること、
による前記検査システムに関する。
質をコードするものでよい。転写される遺伝子は、検出
可能なRNA として転写されるものでよい。更に、本発明
は、アンドロゲン活性を有する検査物質を検出する検査
システムであって、 ａ．本発明の細胞においてリポーター遺伝子を発現させ
て； ｂ．前記細胞がアンドロゲン受容体を全く又は少ししか
含まない場合、アンドロゲン受容体の発現ベクターによ
って更に前記細胞を形質転換して； ｃ．検査物質の存在下又は非存在下に前記細胞を培養し
て；そして、 ｄ．前記リポーター遺伝子の発現変化を測定すること、
による前記検査システムに関する。
【００１５】更に、本発明は、抗アンドロゲン活性を有
する検査物質を検出する検査システムであって、 ａ．本発明の細胞においてリポーター遺伝子を発現させ
て； ｂ．前記細胞がアンドロゲン受容体を全く又は少ししか
含まない場合、アンドロゲン受容体の発現ベクターによ
って更に前記細胞を形質転換して； ｃ．検査物質の存在下又は非存在下に、同時にアンドロ
ゲンの存在下に前記細胞を培養して；そして、 ｄ．前記リポーター遺伝子の発現変化を測定すること、
による前記検査システムに関する。
する検査物質を検出する検査システムであって、 ａ．本発明の細胞においてリポーター遺伝子を発現させ
て； ｂ．前記細胞がアンドロゲン受容体を全く又は少ししか
含まない場合、アンドロゲン受容体の発現ベクターによ
って更に前記細胞を形質転換して； ｃ．検査物質の存在下又は非存在下に、同時にアンドロ
ゲンの存在下に前記細胞を培養して；そして、 ｄ．前記リポーター遺伝子の発現変化を測定すること、
による前記検査システムに関する。
【００１６】更に、本発明は、プロゲスチン活性を有す
る検査物質を検出する検査システムであって、 ａ．本発明の細胞においてリポーター遺伝子を発現させ
て； ｂ．前記細胞がプロゲステロン受容体を全く又は少しし
か含まない場合、プロゲステロン受容体の発現ベクター
によって更に前記細胞を形質転換して； ｃ．検査物質の存在下又は非存在下に前記細胞を培養し
て；そして、 ｄ．前記リポーター遺伝子の発現変化を測定すること、
による前記検査システムに関する。
る検査物質を検出する検査システムであって、 ａ．本発明の細胞においてリポーター遺伝子を発現させ
て； ｂ．前記細胞がプロゲステロン受容体を全く又は少しし
か含まない場合、プロゲステロン受容体の発現ベクター
によって更に前記細胞を形質転換して； ｃ．検査物質の存在下又は非存在下に前記細胞を培養し
て；そして、 ｄ．前記リポーター遺伝子の発現変化を測定すること、
による前記検査システムに関する。
【００１７】最後に、本発明は、抗プロゲスチン活性を
有する検査物質を検出する検査システムであって、 ａ．本発明の細胞においてリポーター遺伝子を発現させ
て； ｂ．前記細胞がプロゲステロン受容体を全く又は少しし
か含まない場合、プロゲステロン受容体の発現ベクター
によって更に前記細胞を形質転換して； ｃ．検査物質の存在下又は非存在下に、同時にプロゲス
チンの存在下に前記細胞を培養して；そして、 ｄ．前記リポーター遺伝子の発現変化を測定すること、
による前記検査システムに関する。
有する検査物質を検出する検査システムであって、 ａ．本発明の細胞においてリポーター遺伝子を発現させ
て； ｂ．前記細胞がプロゲステロン受容体を全く又は少しし
か含まない場合、プロゲステロン受容体の発現ベクター
によって更に前記細胞を形質転換して； ｃ．検査物質の存在下又は非存在下に、同時にプロゲス
チンの存在下に前記細胞を培養して；そして、 ｄ．前記リポーター遺伝子の発現変化を測定すること、
による前記検査システムに関する。
【００１８】リポーター遺伝子は、例えば、ルシフェラ
ーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子、ウロキナーゼ遺伝子、グリーンフルオ
レセンスタンパク質遺伝子及びβガラクトシダーゼ遺伝
子でよい。アンドロゲンは、R1881 、テストステロン、
ジヒドロテストステロン及びテストステロン誘導体の群
中から選択されてよく、プロゲスチンは、レボノルゲス
トレル、プロゲステロン、R5020 、ドロスピリノン及び
ジエノゲストの群中から選択されてよい。抗アンドロゲ
ン活性を有する物質は、アンドロゲン受容体へのアンド
ロゲンの作用を抑制する。抗プロゲスチンは、プロゲス
テロン受容体へのプロゲステロン又はプロゲスチンの作
用を阻害する。
ーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子、ウロキナーゼ遺伝子、グリーンフルオ
レセンスタンパク質遺伝子及びβガラクトシダーゼ遺伝
子でよい。アンドロゲンは、R1881 、テストステロン、
ジヒドロテストステロン及びテストステロン誘導体の群
中から選択されてよく、プロゲスチンは、レボノルゲス
トレル、プロゲステロン、R5020 、ドロスピリノン及び
ジエノゲストの群中から選択されてよい。抗アンドロゲ
ン活性を有する物質は、アンドロゲン受容体へのアンド
ロゲンの作用を抑制する。抗プロゲスチンは、プロゲス
テロン受容体へのプロゲステロン又はプロゲスチンの作
用を阻害する。
【００１９】アンドロゲン受容体の発現ベクターが安定
に発現する様に事前に形質転換されたPC-3細胞（PC-3/A
R 細胞）又は一過的に発現する様に事前に形質転換した
PC-3細胞を用いること、並びにルシフェラーゼ遺伝子を
使用することが好ましい。更に、TK最小プロモーターの
使用が好ましい。アンドロゲン受容体の発現ベクターを
有するPC-3/AR 細胞を、２コピーの本発明のHRE 、TK最
小プロモーター及びルシフェラーゼ遺伝子を含有する構
成体によって形質転換した場合、アンドロゲンR1881(C.
Bonne and J.P.Raynaud 1975,Steroids 26,227-232) の
添加によって、10.5倍のルシフェラーゼ活性が誘導され
た（実施例３及び図４参照）。グルココルチコイド受容
体の発現ベクターを有するPC-3/AR 細胞を、２コピーの
本発明のHRE 、TK最小プロモーター及びルシフェラーゼ
遺伝子を含有する構成体によって形質転換した場合、グ
ルココルチコイドのデキサメタゾンの添加によって、1.
9倍の活性誘導しか観察されなかった。前記実験で、本
発明のHRE を２コピー用いる代わりに４コピー用いた場
合、R1881 によって、ルシフェラーゼ活性は46倍増加し
たが、デキサメタゾンによっては、1.8 倍しか増加しな
かった。プロゲステロン受容体の発現ベクターを有する
PC-3/AR 細胞を、４コピーの本発明のHRE 、TK最小プロ
モーター及びルシフェラーゼ遺伝子を含有する構成体に
よって形質転換した場合、プロゲスチンのレボノルゲス
トレルの添加によって、52.2倍の活性誘導が観察された
（実施例３及び図５参照）。このプロゲスチンは合成プ
ロゲステロンアナログである。本検査システムの使用
は、実施例に記載した検査物質に限定されず、むしろ、
本検査システムは、大きな物質群のスクリーニングのた
めに用いられる。
に発現する様に事前に形質転換されたPC-3細胞（PC-3/A
R 細胞）又は一過的に発現する様に事前に形質転換した
PC-3細胞を用いること、並びにルシフェラーゼ遺伝子を
使用することが好ましい。更に、TK最小プロモーターの
使用が好ましい。アンドロゲン受容体の発現ベクターを
有するPC-3/AR 細胞を、２コピーの本発明のHRE 、TK最
小プロモーター及びルシフェラーゼ遺伝子を含有する構
成体によって形質転換した場合、アンドロゲンR1881(C.
Bonne and J.P.Raynaud 1975,Steroids 26,227-232) の
添加によって、10.5倍のルシフェラーゼ活性が誘導され
た（実施例３及び図４参照）。グルココルチコイド受容
体の発現ベクターを有するPC-3/AR 細胞を、２コピーの
本発明のHRE 、TK最小プロモーター及びルシフェラーゼ
遺伝子を含有する構成体によって形質転換した場合、グ
ルココルチコイドのデキサメタゾンの添加によって、1.
9倍の活性誘導しか観察されなかった。前記実験で、本
発明のHRE を２コピー用いる代わりに４コピー用いた場
合、R1881 によって、ルシフェラーゼ活性は46倍増加し
たが、デキサメタゾンによっては、1.8 倍しか増加しな
かった。プロゲステロン受容体の発現ベクターを有する
PC-3/AR 細胞を、４コピーの本発明のHRE 、TK最小プロ
モーター及びルシフェラーゼ遺伝子を含有する構成体に
よって形質転換した場合、プロゲスチンのレボノルゲス
トレルの添加によって、52.2倍の活性誘導が観察された
（実施例３及び図５参照）。このプロゲスチンは合成プ
ロゲステロンアナログである。本検査システムの使用
は、実施例に記載した検査物質に限定されず、むしろ、
本検査システムは、大きな物質群のスクリーニングのた
めに用いられる。
【００２０】本発明の対象は、本発明の検査システムに
よって検査物質を検出するプロセスにも関する。本発明
は、更に、医薬活性物質を調製するためのプロセスであ
って、 ａ．検査する物質に、本発明の検査システムを適用し
て； ｂ．本検査システムにおける前記物質の作用を、コント
ロールと比較して測定して；そして、 ｃ．過程ｂにおいて異種ペプチドの発現調節活性を呈す
る物質を同定すること、を含んで成る前記プロセスを提
供する。
よって検査物質を検出するプロセスにも関する。本発明
は、更に、医薬活性物質を調製するためのプロセスであ
って、 ａ．検査する物質に、本発明の検査システムを適用し
て； ｂ．本検査システムにおける前記物質の作用を、コント
ロールと比較して測定して；そして、 ｃ．過程ｂにおいて異種ペプチドの発現調節活性を呈す
る物質を同定すること、を含んで成る前記プロセスを提
供する。
【００２１】本発明は、更に、医薬剤を調製するための
プロセスであって、 ａ．検査する物質に、本発明の検査システムを適用し
て； ｂ．本検査システムにおける前記物質の作用を、場合に
よってはコントロールと比較して、測定して； ｃ．過程ｂにおいて異種ポリペプチドの発現調節活性を
呈する物質を同定して；そして、 ｄ．過程ｃにおいて同定された物質を、医薬に一般に用
いられている配合物質と混合すること、を含んで成る前
記プロセスを提供する。
プロセスであって、 ａ．検査する物質に、本発明の検査システムを適用し
て； ｂ．本検査システムにおける前記物質の作用を、場合に
よってはコントロールと比較して、測定して； ｃ．過程ｂにおいて異種ポリペプチドの発現調節活性を
呈する物質を同定して；そして、 ｄ．過程ｃにおいて同定された物質を、医薬に一般に用
いられている配合物質と混合すること、を含んで成る前
記プロセスを提供する。
【００２２】本発明は、更に、医薬剤を調製するための
プロセスであって、 ａ．検査物質に、本発明の検査システムを適用して； ｂ．本検査システムにおける前記物質の作用を、コント
ロールと比較して測定して； ｃ．過程ｂにおいて異種ポリペプチドの発現調節活性を
呈する物質を同定して； ｄ．過程ｃにおいて同定された物質を、場合によっては
最適化して；そして、 ｅ．場合によっては最適化された前記物質を、医薬に一
般に用いられている配合物質と混合すること、を含んで
成る前記プロセスを提供する。
プロセスであって、 ａ．検査物質に、本発明の検査システムを適用して； ｂ．本検査システムにおける前記物質の作用を、コント
ロールと比較して測定して； ｃ．過程ｂにおいて異種ポリペプチドの発現調節活性を
呈する物質を同定して； ｄ．過程ｃにおいて同定された物質を、場合によっては
最適化して；そして、 ｅ．場合によっては最適化された前記物質を、医薬に一
般に用いられている配合物質と混合すること、を含んで
成る前記プロセスを提供する。
【００２３】本発明の検査システムにおいてリポーター
遺伝子の活性を少なくとも10倍増加又は阻害する物質が
好ましい。本発明のプロセスによって同定された物質
は、場合によっては、代謝安定性、本発明の検査システ
ムにおける活性、及び／又は生物利用性に関して最適化
される。この場合、化学分野において標準な方法を用い
ることができる。
遺伝子の活性を少なくとも10倍増加又は阻害する物質が
好ましい。本発明のプロセスによって同定された物質
は、場合によっては、代謝安定性、本発明の検査システ
ムにおける活性、及び／又は生物利用性に関して最適化
される。この場合、化学分野において標準な方法を用い
ることができる。
【００２４】好ましい調製剤は、経口、腸管内又は腸管
外投与に適する剤形をとる。この様な剤形は、例えば、
錠剤、フィルム錠剤、被覆錠剤、丸剤、カプセル、散剤
又は貯留剤、並びに座剤である。この様な錠剤は、例え
ば、活性成分と、既知の補助剤、例えば、不活性希釈
剤、例えばデキストロース、糖、ソルビトール、マンニ
トール又はポリビニルピロリドン、崩壊剤、例えばコー
ンスターチ又はアルギン酸、結合剤、例えばスターチ又
はゼラチン、滑沢剤、例えばカルボキシポリメチレン、
カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフ
タレート又はポリビニルアセテートとを混合することに
よって得られる。本錠剤は、いくつかの層から成っても
よい。
外投与に適する剤形をとる。この様な剤形は、例えば、
錠剤、フィルム錠剤、被覆錠剤、丸剤、カプセル、散剤
又は貯留剤、並びに座剤である。この様な錠剤は、例え
ば、活性成分と、既知の補助剤、例えば、不活性希釈
剤、例えばデキストロース、糖、ソルビトール、マンニ
トール又はポリビニルピロリドン、崩壊剤、例えばコー
ンスターチ又はアルギン酸、結合剤、例えばスターチ又
はゼラチン、滑沢剤、例えばカルボキシポリメチレン、
カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフ
タレート又はポリビニルアセテートとを混合することに
よって得られる。本錠剤は、いくつかの層から成っても
よい。
【００２５】被覆錠剤は、前記錠剤と同様にして調製さ
れた中心体を、錠剤の被覆に一般に用いられる物質、例
えばポリビニルピロリドン又はセラック、アラビアゴ
ム、タルク、酸化チタン又は糖によって被覆することに
よって、相応に調製される。この場合、被覆錠剤の外殻
は、前記の錠剤用補助剤を用いたいくつかの層から成っ
てもよい。活性成分を含有するカプセルは、例えば、活
性成分を不活性賦形剤、例えばラクトース又はソルビト
ールと混合してから、ゼラチンカプセル中に封入するこ
とによって調製される。本発明の物質を、適当な溶液、
例えば普通の生理食塩水中に含ませて、注入又は注射溶
液として用いることもできる。腸管外投与のためには、
特に油性溶液、例えばごま油、ひまし油又は綿実油が適
している。溶解性を増すためには、可溶化剤、例えばベ
ンジルベンゾエート又はベンジルアルコールを追加して
もよい。本発明のプロセスによって得ることができる又
は得られた物質を経皮剤形中で用いて、従って経皮投与
することもできる。
れた中心体を、錠剤の被覆に一般に用いられる物質、例
えばポリビニルピロリドン又はセラック、アラビアゴ
ム、タルク、酸化チタン又は糖によって被覆することに
よって、相応に調製される。この場合、被覆錠剤の外殻
は、前記の錠剤用補助剤を用いたいくつかの層から成っ
てもよい。活性成分を含有するカプセルは、例えば、活
性成分を不活性賦形剤、例えばラクトース又はソルビト
ールと混合してから、ゼラチンカプセル中に封入するこ
とによって調製される。本発明の物質を、適当な溶液、
例えば普通の生理食塩水中に含ませて、注入又は注射溶
液として用いることもできる。腸管外投与のためには、
特に油性溶液、例えばごま油、ひまし油又は綿実油が適
している。溶解性を増すためには、可溶化剤、例えばベ
ンジルベンゾエート又はベンジルアルコールを追加して
もよい。本発明のプロセスによって得ることができる又
は得られた物質を経皮剤形中で用いて、従って経皮投与
することもできる。
【００２６】検査物質を検出するための本発明のプロセ
スによって、ポリペプチド、好ましくはアンドロゲン受
容体又はプロゲステロン受容体と、既知の共通HRE 配列
との結合に比べて、本発明のHRE との選択的結合を仲介
する物質を調製することもできる。本発明の医薬剤を、
アンドロゲン又はプロゲステロン依存性の疾患を治療す
る薬物を生産するために用いることができる。この様な
疾患は、例えば前立腺ガン又は精巣ガンである。
スによって、ポリペプチド、好ましくはアンドロゲン受
容体又はプロゲステロン受容体と、既知の共通HRE 配列
との結合に比べて、本発明のHRE との選択的結合を仲介
する物質を調製することもできる。本発明の医薬剤を、
アンドロゲン又はプロゲステロン依存性の疾患を治療す
る薬物を生産するために用いることができる。この様な
疾患は、例えば前立腺ガン又は精巣ガンである。
【００２７】本発明の医薬剤を、出生調節用の薬物を生
産するために用いることができる。雄側の出生調節のた
めに、例えば、成熟精子を形成するために必要な遺伝子
の発現を阻害することができる。
産するために用いることができる。雄側の出生調節のた
めに、例えば、成熟精子を形成するために必要な遺伝子
の発現を阻害することができる。
【００２８】
【実施例】実施例で用いた分子生物学的方法、例えば、
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) 、cDNAの調製、DNA クロー
ニング、DNA 配列の決定、トランスフェクション、ルシ
フェラーゼ活性の決定は、既知の教科書、例えばMolecu
lar Cloning: A Laboratory Manual(Sambrook et al.,1
989,Cold Spring Harbor Laboratory Press)に記載され
ている。 実施例１：精巣上体におけるPem 遺伝子の発現のアンド
ロゲン依存性 GnRHアンタゴニストによって毎日処理することによっ
て、マウスを化学的に去勢した(B.Haendler et al.199
7,Eur.J.Biochem.250,440-446) 。この去勢処理によっ
て、アンドロゲンの生合成が抑制される。１又は２週間
後、精巣上体を取り出し、そこからRNA を単離した。そ
のRNA から合成したcDNAと、pem 特異的オリゴヌクレオ
チドプライマーとを用いてPCR を行った。pem 増幅産物
をアガロースゲルで分離し、その量を比較した。その結
果、去勢後には、pem の発現が非常に減少することが判
った。コントロール量の１％しか発現されていなかっ
た。このことは、pem 遺伝子には、非常に強力なアンド
ロゲン応答エレメントが存在するだろうことを示唆す
る。 実施例２：本発明のHRE の同定 報告されているラットのpem 遺伝子のプロモーター領域
を解析したところ、共通HRE に近縁の配列は存在しな
い。半エレメントTGTTCTに類似したより短い領域が存在
するが、これらの領域が、HRE であるかどうかは知られ
ていない。驚くことに、これらの領域の１つが、実施例
４に記載した検査において、非常に強力なアンドロゲン
による誘導活性を示した。本発明者は、この領域をARE1
7 と名付けた。この配列を配列番号１に示す。 実施例３：マウスPem 遺伝子プロモーター領域における
本発明のHRE の同定 GenomeWalker Kit(Clontech)を用いて、マウスのゲノム
DNA から、310 塩基対のプロモーター断片を増幅した。
このために、アンチセンスプライマー5'-GTTCTTCCGAGTC
TTCCTTGAC-3'(pem遺伝子特異的）及びセンスプライマー
5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'（ゲノムDNA 断片の末端
にあるアダプター配列に対応するもの）を用いた。ゲル
で分離した後、この増幅断片をプラスミドにサブクロー
ニングし、その配列を決定した。この配列を配列番号２
に示す。翻訳開始点は、位置313-315(ATG)である。この
配列は、ラットのPem 遺伝子プロモーター領域(1-312)
と81.5% 同一である。そこには、ラットのプロモーター
領域と同じ位置に(228-244) 、配列番号１の配列を有す
るARE17 が含まれる。 実施例４：検査システム 配列番号１の配列を有する本発明のHRE(ARE17)、又は配
列5'-GGTACATCTTGTTCA-3' を有する共通HRE(ARE)を用い
て本検査システムを行い、両者を比較した。その他全て
の構成要素は各々同一とした。ARE17 のコピーを、pGL3
基本ベクター中に、TK最小プロモーター及びルシフェラ
ーゼ遺伝子の上流に導入した（図１）。アンドロゲン受
容体を安定に発現しているPC-3/AR 細胞を、RPMI1640/1
0%cFCS/L- グルタミン中で、18-24 時間飽和するまで培
養し、そしてリポータープラスミド100ng 及びFu遺伝子
トランスフェクション試薬(Boehringer Mannheim) を用
いて、５時間かけて形質転換した。その培地をRPMI1640
/10%cFCS/L- グルタミンに交換し、42時間後にリポータ
ー遺伝子の活性を測定した。アンドロゲンR1881(10 -7M)
の存在下では、ルシフェラーゼ活性の強力な誘導が観察
された（図２）。その活性は、リポーターベクター中の
ARE17 のコピー数に応じて増加し、共通HREを用いた場
合よりも高かった。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) 、cDNAの調製、DNA クロー
ニング、DNA 配列の決定、トランスフェクション、ルシ
フェラーゼ活性の決定は、既知の教科書、例えばMolecu
lar Cloning: A Laboratory Manual(Sambrook et al.,1
989,Cold Spring Harbor Laboratory Press)に記載され
ている。 実施例１：精巣上体におけるPem 遺伝子の発現のアンド
ロゲン依存性 GnRHアンタゴニストによって毎日処理することによっ
て、マウスを化学的に去勢した(B.Haendler et al.199
7,Eur.J.Biochem.250,440-446) 。この去勢処理によっ
て、アンドロゲンの生合成が抑制される。１又は２週間
後、精巣上体を取り出し、そこからRNA を単離した。そ
のRNA から合成したcDNAと、pem 特異的オリゴヌクレオ
チドプライマーとを用いてPCR を行った。pem 増幅産物
をアガロースゲルで分離し、その量を比較した。その結
果、去勢後には、pem の発現が非常に減少することが判
った。コントロール量の１％しか発現されていなかっ
た。このことは、pem 遺伝子には、非常に強力なアンド
ロゲン応答エレメントが存在するだろうことを示唆す
る。 実施例２：本発明のHRE の同定 報告されているラットのpem 遺伝子のプロモーター領域
を解析したところ、共通HRE に近縁の配列は存在しな
い。半エレメントTGTTCTに類似したより短い領域が存在
するが、これらの領域が、HRE であるかどうかは知られ
ていない。驚くことに、これらの領域の１つが、実施例
４に記載した検査において、非常に強力なアンドロゲン
による誘導活性を示した。本発明者は、この領域をARE1
7 と名付けた。この配列を配列番号１に示す。 実施例３：マウスPem 遺伝子プロモーター領域における
本発明のHRE の同定 GenomeWalker Kit(Clontech)を用いて、マウスのゲノム
DNA から、310 塩基対のプロモーター断片を増幅した。
このために、アンチセンスプライマー5'-GTTCTTCCGAGTC
TTCCTTGAC-3'(pem遺伝子特異的）及びセンスプライマー
5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'（ゲノムDNA 断片の末端
にあるアダプター配列に対応するもの）を用いた。ゲル
で分離した後、この増幅断片をプラスミドにサブクロー
ニングし、その配列を決定した。この配列を配列番号２
に示す。翻訳開始点は、位置313-315(ATG)である。この
配列は、ラットのPem 遺伝子プロモーター領域(1-312)
と81.5% 同一である。そこには、ラットのプロモーター
領域と同じ位置に(228-244) 、配列番号１の配列を有す
るARE17 が含まれる。 実施例４：検査システム 配列番号１の配列を有する本発明のHRE(ARE17)、又は配
列5'-GGTACATCTTGTTCA-3' を有する共通HRE(ARE)を用い
て本検査システムを行い、両者を比較した。その他全て
の構成要素は各々同一とした。ARE17 のコピーを、pGL3
基本ベクター中に、TK最小プロモーター及びルシフェラ
ーゼ遺伝子の上流に導入した（図１）。アンドロゲン受
容体を安定に発現しているPC-3/AR 細胞を、RPMI1640/1
0%cFCS/L- グルタミン中で、18-24 時間飽和するまで培
養し、そしてリポータープラスミド100ng 及びFu遺伝子
トランスフェクション試薬(Boehringer Mannheim) を用
いて、５時間かけて形質転換した。その培地をRPMI1640
/10%cFCS/L- グルタミンに交換し、42時間後にリポータ
ー遺伝子の活性を測定した。アンドロゲンR1881(10 -7M)
の存在下では、ルシフェラーゼ活性の強力な誘導が観察
された（図２）。その活性は、リポーターベクター中の
ARE17 のコピー数に応じて増加し、共通HREを用いた場
合よりも高かった。
【００２９】アンドロゲンによるARE17 又は共通HRE の
活性化は、抗アンドロゲンの酢酸シプロテロン（10-7及
び10-8M)（図３）によって阻害された。アンドロゲン非
存在下に本検査を行った場合、酢酸シプロテロンは、用
量依存的にARE17 を活性化したが、共通HRE をほとんど
又は全く活性化しなかった（図10）。しかし、抗アンド
ロゲンのヒドロキシフルタミドは、ARE17 も共通HRE も
どちらも活性化しなかった。
活性化は、抗アンドロゲンの酢酸シプロテロン（10-7及
び10-8M)（図３）によって阻害された。アンドロゲン非
存在下に本検査を行った場合、酢酸シプロテロンは、用
量依存的にARE17 を活性化したが、共通HRE をほとんど
又は全く活性化しなかった（図10）。しかし、抗アンド
ロゲンのヒドロキシフルタミドは、ARE17 も共通HRE も
どちらも活性化しなかった。
【００３０】更に本検査によって、本発明のHRE(ARE1
7)、共通HRE(5'-GGTACATCTTGTTCA-3')又はIDR17 エレメ
ント(5'-GGAACGCAACATGTTCT-3')(Zhou et al.1997,J.Bi
ol.Chem.272,8227-8235)の活性化を比較した。その他全
ての構成要素は各々同一とした。４コピーの各エレメン
トを、pGL3基本ベクター中に、TK最小プロモーター及び
ルシフェラーゼ遺伝子の上流に導入し（図１）、前記通
りに、アンドロゲン受容体を安定に発現しているPC-3/A
R 細胞を形質転換した。合成アンドロゲンR1881(最終濃
度10-9M 又は10-7M)を用いて活性化を行った。両濃度で
は、決定的な差は認められなかった。
7)、共通HRE(5'-GGTACATCTTGTTCA-3')又はIDR17 エレメ
ント(5'-GGAACGCAACATGTTCT-3')(Zhou et al.1997,J.Bi
ol.Chem.272,8227-8235)の活性化を比較した。その他全
ての構成要素は各々同一とした。４コピーの各エレメン
トを、pGL3基本ベクター中に、TK最小プロモーター及び
ルシフェラーゼ遺伝子の上流に導入し（図１）、前記通
りに、アンドロゲン受容体を安定に発現しているPC-3/A
R 細胞を形質転換した。合成アンドロゲンR1881(最終濃
度10-9M 又は10-7M)を用いて活性化を行った。両濃度で
は、決定的な差は認められなかった。
【００３１】本発明のHRE(ARE17)、共通HRE(ARE)及びID
R17 エレメントの比較から、本発明のHRE(ARE17)を用い
た場合に、アンドロゲンR1881 によって最も強力にルシ
フェラーゼ活性が誘導され、共通HRE(ARE)を用いた場合
には、最も弱い活性が見られた（図７）。アンドロゲン
受容体選択的補助活性化因子ARA70(Yen and Chang,199
6,Proc,Natl.Acad.Sci.93.5517-5521) をコードする発
現ベクターpCMX-ARA70(100ng) を同時にトランスフェク
ションした場合、コントロール(ARA70遺伝子を有さない
発現ベクターpCMX 100ng) の場合と比べて、R1881 によ
る活性化が認められた。この活性化は、共通HRE(ARE)の
場合よりも、本発明のARE17 の場合の方がとても顕著で
あった（図８）。
R17 エレメントの比較から、本発明のHRE(ARE17)を用い
た場合に、アンドロゲンR1881 によって最も強力にルシ
フェラーゼ活性が誘導され、共通HRE(ARE)を用いた場合
には、最も弱い活性が見られた（図７）。アンドロゲン
受容体選択的補助活性化因子ARA70(Yen and Chang,199
6,Proc,Natl.Acad.Sci.93.5517-5521) をコードする発
現ベクターpCMX-ARA70(100ng) を同時にトランスフェク
ションした場合、コントロール(ARA70遺伝子を有さない
発現ベクターpCMX 100ng) の場合と比べて、R1881 によ
る活性化が認められた。この活性化は、共通HRE(ARE)の
場合よりも、本発明のARE17 の場合の方がとても顕著で
あった（図８）。
【００３２】タンパク質14-3-3η(Muratake et al.199
5,Mol.Neurobiol.11,223-230)をコードする発現ベクタ
ーpSV-14-3-3を同時にトランスフェクションした場合、
プラスミド用量依存的に、アンドロゲンによる活性化が
促進した。この促進は、共通HRE(ARE)の場合よりも、本
発明のARE17 の場合の方が顕著であった（図９）。グル
ココルチコイド受容体の発現ベクターと、ARE17 構成体
又は共通HRE 構成体とを同時にトランスフェクションし
たPC-3/AR 細胞を、デキサメタゾン（10-6M)によって処
理した場合、有意な差が認められた。ARE17 を用いた場
合、活性化は実質的に見られなかった。共通HRE を用い
た場合、デキサメタゾン刺激及びR1881 刺激による効果
は同等であった（図４）。更に注目することに、プロゲ
ステロン受容体の発現ベクターを同時にトランスフェク
ションした場合、プロゲスチンであるレボノルゲストレ
ル（10-6M)によって、ARE17 が非常に活性化された（図
５）。ステロイド受容体の作用を阻害する物質ゲルダナ
マイシンの処理実験からは、低濃度(125ng/ml)のゲルダ
ナマイシンで、アンドロゲンによるARE17 の活性化が阻
害されるが、一方共通HRE の活性化は促進されることが
判った（図６）。
5,Mol.Neurobiol.11,223-230)をコードする発現ベクタ
ーpSV-14-3-3を同時にトランスフェクションした場合、
プラスミド用量依存的に、アンドロゲンによる活性化が
促進した。この促進は、共通HRE(ARE)の場合よりも、本
発明のARE17 の場合の方が顕著であった（図９）。グル
ココルチコイド受容体の発現ベクターと、ARE17 構成体
又は共通HRE 構成体とを同時にトランスフェクションし
たPC-3/AR 細胞を、デキサメタゾン（10-6M)によって処
理した場合、有意な差が認められた。ARE17 を用いた場
合、活性化は実質的に見られなかった。共通HRE を用い
た場合、デキサメタゾン刺激及びR1881 刺激による効果
は同等であった（図４）。更に注目することに、プロゲ
ステロン受容体の発現ベクターを同時にトランスフェク
ションした場合、プロゲスチンであるレボノルゲストレ
ル（10-6M)によって、ARE17 が非常に活性化された（図
５）。ステロイド受容体の作用を阻害する物質ゲルダナ
マイシンの処理実験からは、低濃度(125ng/ml)のゲルダ
ナマイシンで、アンドロゲンによるARE17 の活性化が阻
害されるが、一方共通HRE の活性化は促進されることが
判った（図６）。
【００３３】
【配列表】 SEQUENCE PROTOCOL <110> Schering Aktiengesellschaft <120> Androgen-and progesterone-response element <130> 51619AEPM1XXOO-P <140> <141> <150> DE 198 55 013.8-44 <151> 1998-11-20 <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 1 agatctcatt ctgttcc 17 <210> 2 <211> 385 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 tgagctgtaa ctgggcaccc taagttctgc acacccacat gcccatgaac tgtgtccatc 60 ttgcaagcac atcgtgctca ttacatcccc aaactgctat cacttgtgta ccccaaaggc 120 tcggcccaca ggaacgtcct gtgagcaaat cacaaagacc agcttagggc tggaaacatt 180 gtaacctgaa gtaggccaga ggagatccct gccaggttga gcatcacaga tctcattctg 240 ttcccgggga caccaggggc ccaagctcag aatctgccga agcataactt catcattgat 300 cctattcagg gtatggaagc tgagggttcc agccgcaagg tcaccaggct actccgcctg 360 ggagtcaagg aagactcgga agaac 385 <210> 3 <211> 14 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 tctcattctg ttcc 14
【図１】図１は、配列番号１に相当する本発明のHRE(AR
E17 と称する）を１〜４コピー有するリポータープラス
ミドの地図を示す。
E17 と称する）を１〜４コピー有するリポータープラス
ミドの地図を示す。
【図２】図２は、アンドロゲンによるARE17 の活性化
を、共通HRE(ARE と称する）の場合と比較して示す。指
示したコピー数の当エレメントをリポーターベクターに
導入した。これをPC-3/AR 細胞にトランスフェクション
し、そしてR1881 処理後に、ルシフェラーゼ活性を測定
した。ｙ軸は、R1881 未処理の細胞と比較した活性化の
倍率を示す。
を、共通HRE(ARE と称する）の場合と比較して示す。指
示したコピー数の当エレメントをリポーターベクターに
導入した。これをPC-3/AR 細胞にトランスフェクション
し、そしてR1881 処理後に、ルシフェラーゼ活性を測定
した。ｙ軸は、R1881 未処理の細胞と比較した活性化の
倍率を示す。
【図３】図３は、ARE17 の活性化に対する抗アンドロゲ
ンによる阻害を、共通HRE(ARE)の場合と比較して示す。
４コピーの当エレメントをリポーターベクターに導入し
た。これをPC-3/AR 細胞にトランスフェクションし、そ
してR1881 及び酢酸シプロテロン処理後に、ルシフェラ
ーゼ活性を測定した。ｙ軸は、R1881 未処理の細胞と比
較した活性化の倍率を示す。酢酸シプロテロン(CPA) の
濃度を mol/lで示す。
ンによる阻害を、共通HRE(ARE)の場合と比較して示す。
４コピーの当エレメントをリポーターベクターに導入し
た。これをPC-3/AR 細胞にトランスフェクションし、そ
してR1881 及び酢酸シプロテロン処理後に、ルシフェラ
ーゼ活性を測定した。ｙ軸は、R1881 未処理の細胞と比
較した活性化の倍率を示す。酢酸シプロテロン(CPA) の
濃度を mol/lで示す。
【図４】図４は、アンドロゲン又はグルココルチコイド
によるARE17 の活性化を、共通HRE(ARE)の場合と比較し
て示す。１〜４コピーの当エレメントをリポーターベク
ターに導入した。これをPC-3/AR 細胞にトランスフェク
ションし、そしてR1881又はデキサメタゾン処理後に、
ルシフェラーゼ活性を測定した。ｙ軸は、アンドロゲン
又はグルココルチコイド未処理の細胞と比較した活性化
の倍率を示す。R1881 及びデキサメタゾン(Dex) の濃度
を mol/lで示す。
によるARE17 の活性化を、共通HRE(ARE)の場合と比較し
て示す。１〜４コピーの当エレメントをリポーターベク
ターに導入した。これをPC-3/AR 細胞にトランスフェク
ションし、そしてR1881又はデキサメタゾン処理後に、
ルシフェラーゼ活性を測定した。ｙ軸は、アンドロゲン
又はグルココルチコイド未処理の細胞と比較した活性化
の倍率を示す。R1881 及びデキサメタゾン(Dex) の濃度
を mol/lで示す。
【図５】図５は、アンドロゲン又はプロゲスチンによる
ARE17 の活性化を、共通HRE(ARE)の場合と比較して示
す。２又は４コピーの当エレメントをリポーターベクタ
ーに導入した。これをPC-3/AR 細胞にトランスフェクシ
ョンし、そしてR1881 又はレボノルゲストレル処理後
に、ルシフェラーゼ活性を測定した。ｙ軸は、アンドロ
ゲン又はプロゲスチン未処理の細胞と比較した活性化の
倍率を示す。R1881 及びレボノルゲストレル(Lev) の濃
度を mol/lで示す。
ARE17 の活性化を、共通HRE(ARE)の場合と比較して示
す。２又は４コピーの当エレメントをリポーターベクタ
ーに導入した。これをPC-3/AR 細胞にトランスフェクシ
ョンし、そしてR1881 又はレボノルゲストレル処理後
に、ルシフェラーゼ活性を測定した。ｙ軸は、アンドロ
ゲン又はプロゲスチン未処理の細胞と比較した活性化の
倍率を示す。R1881 及びレボノルゲストレル(Lev) の濃
度を mol/lで示す。
【図６】図６は、アンドロゲンによるARE17 の活性化に
対するゲルダナマイシンによる阻害を、共通HRE(ARE)の
場合と比較して示す。４コピーの当エレメントをリポー
ターベクターに導入した。これをPC-3/AR 細胞にトラン
スフェクションし、そしてR1881 及びゲルダナマイシン
処理後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。ゲルダナマ
イシン濃度をng/ml で示す。コントロールでは、ゲルダ
ナマイシン処理しなかった。ｙ軸は、アンドロゲン未処
理の細胞と比較した活性化の倍率を示す。
対するゲルダナマイシンによる阻害を、共通HRE(ARE)の
場合と比較して示す。４コピーの当エレメントをリポー
ターベクターに導入した。これをPC-3/AR 細胞にトラン
スフェクションし、そしてR1881 及びゲルダナマイシン
処理後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。ゲルダナマ
イシン濃度をng/ml で示す。コントロールでは、ゲルダ
ナマイシン処理しなかった。ｙ軸は、アンドロゲン未処
理の細胞と比較した活性化の倍率を示す。
【図７】図７は、アンドロゲンR1881 によるIDR17-HRE
、ARE17 又は共通HRE(ARE)の活性化を示す。４コピー
の各エレメントをリポーターベクターに導入した。これ
をPC-3/AR 細胞にトランスフェクションし、そしてR188
1 処理後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。ｙ軸は、
「相対明度単位(R.L.U) 」によるルシフェラーゼ活性を
示す。
、ARE17 又は共通HRE(ARE)の活性化を示す。４コピー
の各エレメントをリポーターベクターに導入した。これ
をPC-3/AR 細胞にトランスフェクションし、そしてR188
1 処理後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。ｙ軸は、
「相対明度単位(R.L.U) 」によるルシフェラーゼ活性を
示す。
【図８】図８は、アンドロゲンによる共通HRE(ARE)又は
ARE17 の活性化に対する、補助活性化因子ARA70 遺伝子
を有する発現ベクター(pCMX-ARA70)又は有さない発現ベ
クター(pCMX)との同時トランスフェクションの効果を示
す。４コピーの各エレメントをリポーターベクターに導
入した。ｙ軸は、「相対明度単位(R.L.U) 」によるルシ
フェラーゼ活性を示す。
ARE17 の活性化に対する、補助活性化因子ARA70 遺伝子
を有する発現ベクター(pCMX-ARA70)又は有さない発現ベ
クター(pCMX)との同時トランスフェクションの効果を示
す。４コピーの各エレメントをリポーターベクターに導
入した。ｙ軸は、「相対明度単位(R.L.U) 」によるルシ
フェラーゼ活性を示す。
【図９】図９は、アンドロゲンによる共通HRE(ARE)又は
ARE17 の活性化に対する、14-3-3η遺伝子を有する発現
ベクター(pSV-14-3-3)又は有さない発現ベクター(pSV)
との同時トランスフェクションの効果を示す。４コピー
の各エレメントをリポーターベクターに導入した。トラ
ンスフェクションしたpSV 及びpSV-14-3-3の各プラスミ
ド量をngで示す。トランスフェクションした両プラスミ
ドの合計量を100ng に保った。ｙ軸は、「相対明度単位
(R.L.U) 」によるルシフェラーゼ活性を示す。
ARE17 の活性化に対する、14-3-3η遺伝子を有する発現
ベクター(pSV-14-3-3)又は有さない発現ベクター(pSV)
との同時トランスフェクションの効果を示す。４コピー
の各エレメントをリポーターベクターに導入した。トラ
ンスフェクションしたpSV 及びpSV-14-3-3の各プラスミ
ド量をngで示す。トランスフェクションした両プラスミ
ドの合計量を100ng に保った。ｙ軸は、「相対明度単位
(R.L.U) 」によるルシフェラーゼ活性を示す。
【図１０】図10は、指示した濃度の酢酸シプロテロン及
びヒドロキシフルタミドによるARE17 又は共通HRE(ARE)
の活性化を示す。４コピーの各エレメントをリポーター
ベクターに導入した。ｙ軸は、「相対明度単位(R.L.U)
」によるルシフェラーゼ活性を示す。
びヒドロキシフルタミドによるARE17 又は共通HRE(ARE)
の活性化を示す。４コピーの各エレメントをリポーター
ベクターに導入した。ｙ軸は、「相対明度単位(R.L.U)
」によるルシフェラーゼ活性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/02 1/66 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（1996）, Ｖｏｌ．271，Ｎｏ．29，ｐ．17536− 17546 Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ. （1993），Ｖｏｌ．13，Ｎｏ．10，ｐ. 6326−6335 Ｃｅｌｌ（1995），Ｖｏｌ．83，Ｎ ｏ．６，ｐ．835−839 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 5/10 C12Q 1/00 - 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ
Claims (19)
- 【請求項１】 アンドロゲン受容体及びプロゲステロン
受容体と結合するHRE(ホルモン応答エレメント、ホルモ
ン受容体結合部位）であって、 ａ．配列番号１に相当するDNA 配列；又は ｂ．ａで記載したDNA 配列に相補的なDNA 配列を含んで
いることを特徴とする前記HRE 。 - 【請求項２】 アンドロゲン及び／又はプロゲステロン
によって調節される遺伝子を検出するための、請求項１
のHRE のDNA 配列の使用。 - 【請求項３】 疾患細胞における、正常細胞と比べた、
アンドロゲン及び／又はプロゲステロンによって調節さ
れる遺伝子の発現変化を検出するための、請求項１のHR
E のDNA 配列、又は、請求項１のHRE のDNA 配列によっ
て調節される配列の使用。 - 【請求項４】 アンドロゲン及び／又はプロゲステロン
によって調節される発現調節エレメント、特にHRE 、に
おける変異を検出するための、請求項１のHRE のDNA 配
列の使用。 - 【請求項５】 腫瘍細胞における前記変化を検出するた
めの、請求項３又は４に記載の使用。 - 【請求項６】 １コピー以上の請求項１のHRE を、発現
させようとする遺伝子に作用可能に連結して、含んでい
る、ベクター。 - 【請求項７】 作用可能な連結が、TK最小プロモーター
による、請求項６のベクター。 - 【請求項８】 請求項１の配列によって、あるいは請求
項６又は７のベクターによって形質転換された細胞。 - 【請求項９】 前記細胞が、PC-3細胞、LNCaP 細胞、CV
-1細胞、HeLa細胞及びDunning 細胞から成る群から選択
される、請求項８の細胞。 - 【請求項１０】 HRE 配列に作用可能に連結した前記遺
伝子を発現させるための、請求項８又は９の細胞の使
用。 - 【請求項１１】 前記HRE に結合することができ、且つ
追加のリガンド結合ドメインを有するポリペプチドを、
前記細胞が有している、請求項10に記載の使用。 - 【請求項１２】 ホルモン受容体結合活性を有する物質
を検査する方法であって、 ａ．発現又は転写させようとする異種遺伝子に作用可能
に連結した請求項１のDNA 配列、及び ｂ．その請求項１のDNA 配列に結合することができるポ
リペプチド、 を使用することを特徴とする方法。 - 【請求項１３】 アンドロゲン活性を有する検査物質を
検出するための請求項12の検査方法であって、 ａ．請求項８又は９の細胞においてリポーター遺伝子を
発現させて； ｂ．前記細胞が任意のアンドロゲン受容体を有さない場
合、アンドロゲン受容体の発現ベクターによって更に前
記細胞を形質転換して； ｃ．検査物質の存在下又は非存在下に前記細胞を培養し
て；そして、 ｄ．前記リポーター遺伝子の発現変化を測定すること、 による前記検査方法。 - 【請求項１４】 抗アンドロゲン活性を有する検査物質
を検出するための請求項12の検査方法であって、 ａ．請求項８又は９の細胞においてリポーター遺伝子を
発現させて； ｂ．前記細胞が任意のアンドロゲン受容体を有さない場
合、アンドロゲン受容体の発現ベクターによって更に前
記細胞を形質転換して； ｃ．検査物質の存在下又は非存在下に、同時にアンドロ
ゲンの存在下に、前記細胞を培養して；そして、 ｄ．前記リポーター遺伝子の発現変化を測定すること、 による前記検査方法。 - 【請求項１５】 プロゲスチン活性を有する検査物質を
検出するための請求項12の検査方法であって、 ａ．請求項８又は９の細胞においてリポーター遺伝子を
発現させて； ｂ．前記細胞が任意のプロゲステロン受容体を有さない
場合、プロゲステロン受容体の発現ベクターによって更
に前記細胞を形質転換して； ｃ．検査物質の存在下又は非存在下に前記細胞を培養し
て；そして、 ｄ．前記リポーター遺伝子の発現変化を測定すること、 による前記検査方法。 - 【請求項１６】 抗プロゲスチン活性を有する検査物質
を検出するための請求項12の検査方法であって、 ａ．請求項８又は９の細胞においてリポーター遺伝子を
発現させて； ｂ．前記細胞が任意のプロゲステロン受容体を有さない
場合、プロゲステロン受容体の発現ベクターによって更
に前記細胞を形質転換して； ｃ．検査物質の存在下又は非存在下に、同時にプロゲス
チンの存在下に、前記細胞を培養して；そして、 ｄ．前記リポーター遺伝子の発現変化を測定すること、 による前記検査方法。 - 【請求項１７】 前記リポーター遺伝子が、ルシフェラ
ーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子、ウロキナーゼ遺伝子、グリーンフルオ
レセンスタンパク質遺伝子及びβガラクトシダーゼ遺伝
子から成る群から選択される、請求項12〜16のいずれか
の検査方法。 - 【請求項１８】 請求項12〜17のいずれかの検査方法を
用いて、検査物質を検出するための方法。 - 【請求項１９】 医薬活性物質を調製するための方法で
あって、 ａ．物質に、請求項12〜17のいずれかの検査方法を適用
して； ｂ．前記検査方法における前記物質の作用を、コントロ
ールと比較して測定して；そして、 ｃ．過程ｂにおいて前記異種ペプチドの発現調節活性を
呈する物質を同定すること、 による前記方法。
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