JP3280072B2 - Method for producing 9-O-acetylated sialic acid binding compound - Google Patents
Method for producing 9-O-acetylated sialic acid binding compoundInfo
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Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、リパーゼを用いたシア
ル酸結合化合物をアセチル化し、９−Ｏ−アセチル化シ
アル酸結合化合物を得る方法に関する。本発明の方法を
用いて、合成されるアセチル化されたシアル酸結合化合
物は医学・薬学・生化学などの分野において有用であ
る。The present invention relates to a method for acetylating a sialic acid-binding compound using lipase to obtain a 9-O-acetylated sialic acid-binding compound. The acetylated sialic acid-binding compound synthesized using the method of the present invention is useful in fields such as medicine, pharmacy, and biochemistry.
【０００２】[0002]
【従来の技術】ガングリオシドの内、シアル酸の９位が
アセチル化されたものは９−Ｏ−アセチルガングリオシ
ドと通称されており、この化合物として、９−Ｏ−アセ
チルＧD3、９−Ｏ−アセチルＧT3などが良く知られてい
る。９−Ｏ−アセチルＧD3は、メラノーマ等の癌組織に
特異的に現れることが知られており、現在、癌の特異的
マーカーとして用いられようとしている。又、９位がア
セチル化されたシアル酸は、インフルエンザＣ型のレセ
プターとなることが知られているが、そのことについて
の詳細な点はいまだ判明していない。更に、９−Ｏ−ア
セチル化シアル酸は、シアリダーゼに対して抵抗性を持
つことが知られており、そのため、９−Ｏ−アセチル化
シアル酸が存在している化合物や、組織といったものの
生体内半減期を延ばすことが明かとなっている。2. Description of the Related Art Among gangliosides, those in which sialic acid is acetylated at the 9-position are commonly referred to as 9-O-acetyl gangliosides, and as such compounds, 9-O-acetyl GD3 , 9-O-acetyl. GT3 and the like are well known. 9-O-acetyl GD3 is known to specifically appear in cancer tissues such as melanoma, and is currently being used as a specific marker for cancer. Sialic acid having an acetylation at the 9-position is known to serve as an influenza C receptor, but the details thereof have not yet been elucidated. Furthermore, 9-O-acetylated sialic acid is known to have resistance to sialidase. Therefore, 9-O-acetylated sialic acid is present in vivo in compounds such as compounds and tissues in which 9-O-acetylated sialic acid is present. It is clear that the half-life will be extended.
【０００３】９−Ｏ−アセチル化シアル酸結合化合物
は、上記のような特徴を持つものであるが、天然界には
微量しか存在せず、そのため、これらに関する研究は余
り進んでいない。また、これらの有機化学的合成法につ
いても全く知られていない。[0003] 9-O-acetylated sialic acid-binding compounds have the above-mentioned characteristics, but are present in only a trace amount in the natural world. Further, none of these organic chemical synthesis methods is known.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このように
天然界に微量しか存在せず、しかも有機化学的合成法の
知られていない９−Ｏ−アセチル化シアル酸結合化合物
を酵素反応を利用して効率的に、かつ大量に製造するこ
とを目的としてなされたものである。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention relates to the reaction of a 9-O-acetylated sialic acid-binding compound, which is present in a very small amount in the natural world and whose organic chemical synthesis method is unknown, as described above. It is intended to be used efficiently and for mass production.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】本発明は、シアル酸結合
化合物をリパーゼを用いてアセチル化を行い、９−Ｏ−
アセチル化シアル酸結合化合物を合成する方法に関す
る。According to the present invention, a sialic acid-binding compound is acetylated using a lipase to give 9-O-
The present invention relates to a method for synthesizing an acetylated sialic acid binding compound.
【０００６】本発明では、アセチル化されるシアル酸結
合化合物とアセチル基を供与する化合物、及びリパーゼ
を、溶液に懸濁または溶解させてアセチル化を行う。本
発明に於いて用いるリパーゼは、豚のすい臓由来リパー
ゼ、ムコール属(Mucor) 由来リパーゼ、フィコマイセス
(Phycomices)属由来リパーゼなどを例示することができ
るが、特には何の制限もなく用いられる。リパーゼの種
類については反応溶液は水溶液でも有機溶媒でもよい。
有機溶媒の例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアルデ
ヒド、ジメチルスルフォキシド、ジオキサン、アセトニ
トリル等を挙げることができる。反応溶液に有機溶媒を
用いるときは有機溶媒中に於ける分散性を上昇させた修
飾酵素を用いると良い結果が得られる。In the present invention, acetylation is carried out by suspending or dissolving a sialic acid-binding compound to be acetylated, a compound providing an acetyl group, and a lipase. The lipase used in the present invention includes lipase derived from pig pancreas, lipase derived from Mucor, and Phycomyces
A lipase derived from the genus (Phycomices) can be exemplified, but it is not particularly limited and used. Regarding the type of lipase, the reaction solution may be an aqueous solution or an organic solvent.
Examples of the organic solvent include N, N-dimethylformaldehyde, dimethylsulfoxide, dioxane, acetonitrile and the like. When an organic solvent is used for the reaction solution, good results can be obtained by using a modified enzyme having an increased dispersibility in the organic solvent.
【０００７】シアル酸結合化合物としては、ガングリオ
シドＧD3あるいはガングリオシドＧD1b などのようなシ
アル酸結合糖脂質、グリコホリン、グリコマクロペプチ
ドのようなシアル酸結合糖タンパク質などのシアル酸と
結合した化合物であればどのようなものでも用いること
ができる。また、アセチル基供与体は、アセチル基を供
与できる化合物ならどのようなものでもよく、例として
は、トリアセチン、無水酢酸、酢酸エチル等を挙げるこ
とができる。酵素反応は、前記したシアル酸結合物とア
セチル基供与体を適当な割合で調整し、これにリパーゼ
を加え、室温で数日間行うことで行なわれる。反応終了
後、反応液を濃縮し、溶媒及びアセチル基供与体を留去
して生成した９−Ｏ−アセチル化シアル酸結合化合物を
得るかあるいはクロマトグラフィー等、通常化合物の分
離に用いられる手段を用いて生成した９−Ｏ−アセチル
化シアル酸結合化合物を単離精製することができる。The sialic acid-binding compound may be a sialic acid-binding glycolipid such as ganglioside G D3 or ganglioside G D1b, or a compound bound to sialic acid such as sialic acid-binding glycoprotein such as glycophorin or glycomacropeptide. Anything can be used. The acetyl group donor may be any compound as long as it can provide an acetyl group, and examples include triacetin, acetic anhydride, and ethyl acetate. The enzymatic reaction is carried out by adjusting the sialic acid conjugate and the acetyl group donor at an appropriate ratio, adding lipase thereto, and performing the reaction at room temperature for several days. After completion of the reaction, the reaction solution is concentrated, and the solvent and the acetyl group donor are distilled off to obtain a 9-O-acetylated sialic acid-binding compound, or a means usually used for separation of the compound such as chromatography. The 9-O-acetylated sialic acid-binding compound produced by the use can be isolated and purified.
【０００８】元来、リパーゼはエステル結合の加水分解
反応を触媒する酵素である。リパーゼは、２段階の反応
で進むと考えられる。第１段階は、エステル結合を切断
する。第２段階は、切れたエステル結合に、水分子を付
加させて、安定な化合物にする。しかし、疎水条件下で
行うとこの逆反応も生起する。すなわち、上記ステップ
とは逆の脱水縮合反応が起きる。従って、水酸基に結合
するアシル基の組成は、化学量論的な比率に近づいてい
くことになり、その結果として、アセチル化されると考
えられる。この発明においては、水酸基がある化合物
は、シアル酸結合化合物である。この化合物の場合、分
子が巨大なため立体障害によりリパーゼが近づくことが
難しい。ただ、末端にあるシアル酸の９位の水酸基の周
りには嵩高い物が存在しないため、リパーゼが近づくこ
とができる。そこで初めて、酵素反応（この場合、アセ
チル基転移反応）が起き、アセチル基転移反応が起こ
り、前記のような９−Ｏ−アセチル化シアル酸結合化合
物を得ることができる。[0008] Originally, lipase is an enzyme that catalyzes a hydrolysis reaction of an ester bond. Lipases are thought to proceed in a two-step reaction. The first step cleaves the ester bond. The second step is to add a water molecule to the broken ester bond to make a stable compound. However, this reverse reaction also occurs under hydrophobic conditions. That is, a dehydration-condensation reaction opposite to the above-described step occurs. Therefore, the composition of the acyl group bonded to the hydroxyl group will approach the stoichiometric ratio, and as a result, it will be acetylated. In the present invention, the compound having a hydroxyl group is a sialic acid binding compound. In the case of this compound, it is difficult for lipase to approach due to steric hindrance because the molecule is huge. However, since there is no bulky substance around the hydroxyl group at the ninth position of sialic acid at the terminal, lipase can approach. Then, for the first time, an enzymatic reaction (in this case, an acetyl group transfer reaction) occurs, and an acetyl group transfer reaction occurs, whereby the 9-O-acetylated sialic acid-binding compound can be obtained.
【０００９】[0009]
【発明の効果】本発明を用いると、いままで入手が困難
であった９−Ｏ−アセチル化シアル酸結合化合物を容易
に入手でき、そのため、この化合物を用いて医学・薬学
・生化学等の研究、特に癌やインフルエンザ、薬剤の研
究を有効に行なうことができる。さらに、本発明の方法
によると、９−Ｏ−アセチルＧD3、９−Ｏ−アセチルＧ
T3のみならず、天然界には存在しない９−Ｏ−アセチル
化シアル酸結合化合物も合成することができ、非常に有
用である。さらに、有機合成的手法と併せて用いると類
縁体の合成には、多大な効果を与えると考えられる。According to the present invention, it is difficult to obtain until now.
9-O-acetylated sialic acid binding compound
Available for medical and pharmaceutical applications.
・ Research on biochemistry, especially research on cancer, influenza and drugs
Research can be performed effectively. Further, the method of the present invention
According to 9-O-acetyl GD3, 9-O-acetyl G
T3In addition, 9-O-acetyl which does not exist in the natural world
Sialic acid-binding compounds can also be synthesized
It is for. Furthermore, when used in conjunction with organic synthetic techniques,
It is believed that the synthesis of the analog has a great effect.
【００１０】以下に、実施例を示して本発明について、
具体的に説明する。Hereinafter, the present invention will be described with reference to Examples.
This will be specifically described.
【実施例１】ガングリオシドＧD3（牛乳由来）200 mg及
び酢酸エチル1.0 mlをN,N-ジメチルホルムアルデヒド
（ＤＭＦ）10mlに加えて分散させ、これに、豚のすい臓
由来リパーゼ (シグマ社) 1000U を加え、反応温度37℃
にて４日間反応させた。その後、溶液を濾過して酵素を
取り除き、減圧乾固して、ＤＭＦ及び酢酸エチルを留去
した。得られた濃縮物を、シリカゲル分配クロマトグラ
フィーに供し、反応生成物を分離し、白色粉末15mgを得
た。この粉末を薄層クロマトグラフィー (メルク社、展
開溶媒クロロホルム：メタノール：0.02％塩化カルシウ
ム水溶液＝55：35：8)にて分析したところ、標準品であ
る９−Ｏ−アセチルＧD3 (牛乳由来) とＲｆ値が同じで
あった（図１参照）。さらに、この濃縮物を９−Ｏ−ア
セチルＧD3に対する特異的モノクローナル抗体を用い
て、ＴＬＣイムノステイニング法を用いた分析を行っ
た。この結合、ＴＬＣ上で標準品と同じ位置で染色され
ることがわかった（図２参照）。以上の結果より、得ら
れた白色粉末が、９−Ｏ−アセチルＧD3であることが確
認された。又、ＩＲによる分析でも前記の構造を支持し
ていた（図４参照）。比較として、ガングリオシドＧD3
のＩＲによる分析結果を図３に示す。Example 1 200 mg of ganglioside G D3 (from milk) and 1.0 ml of ethyl acetate were added to 10 ml of N, N-dimethylformaldehyde (DMF) and dispersed, and 1000 U of lipase (porcine pancreatic lipase, Sigma) was added thereto. In addition, reaction temperature 37 ℃
For 4 days. Thereafter, the solution was filtered to remove the enzyme, and dried under reduced pressure to remove DMF and ethyl acetate. The obtained concentrate was subjected to silica gel partition chromatography to separate a reaction product, thereby obtaining 15 mg of a white powder. The powder was analyzed by thin-layer chromatography (Merck, developing solvent: chloroform: methanol: 0.02% calcium chloride aqueous solution = 55: 35: 8), and 9-O-acetyl G D3 (derived from milk) as a standard was analyzed. And Rf values were the same (see FIG. 1). Furthermore, the concentrate using specific monoclonal antibodies against 9-O-acetyl G D3, was analyzed using TLC immuno staining method. This binding was found to be stained on the TLC at the same position as the standard (see FIG. 2). From the above results, it was confirmed that the obtained white powder was 9-O-acetyl GD3 . The above structure was also supported by IR analysis (see FIG. 4). For comparison, ganglioside G D3
FIG. 3 shows the results of IR analysis of the sample.
【００１１】[0011]
【実施例２】ガングリオシドＧD3（牛乳由来）20mg、及
びトリアセチン0.1 mlをジメチルスルフォキシド（ＤＭ
ＳＯ）１mlに投入し、これにフィコマイセス属(Phycomi
ces)のリパーゼ (和光純薬) を特開平4-23981 号公報に
記載される方法によってＣ18の脂肪酸で修飾して有機溶
媒中での溶解性を改善した修飾リパーゼを120Uを加え、
反応温度37℃にて４日間反応させた。その後、溶液を濾
過して酵素を取り除き、ジオキサンを加え凍結乾燥を行
い、ＤＭＳＯ及びトリアセチンを取除した。得られた濃
縮物を、シリカゲル分配クロマトグラフィーに供し、反
応生成物を分離し、白色粉末４mgを得た。得られた白色
粉末を、実施例１と同じ方法にて分析した結果、９−Ｏ
−アセチルＧD3であることが確認された。Example 2 20 mg of ganglioside G D3 (derived from milk) and 0.1 ml of triacetin were dissolved in dimethyl sulfoxide (DM
SO) into 1 ml, and add this to the genus Phycomyces (Phycomi
ces) lipase (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was modified with a C18 fatty acid by the method described in JP-A-4-23981, and a modified lipase having improved solubility in an organic solvent was added with 120 U,
The reaction was performed at a reaction temperature of 37 ° C. for 4 days. Thereafter, the solution was filtered to remove the enzyme, dioxane was added and freeze-dried, and DMSO and triacetin were removed. The obtained concentrate was subjected to silica gel partition chromatography to separate a reaction product, thereby obtaining 4 mg of a white powder. The obtained white powder was analyzed in the same manner as in Example 1, and as a result, 9-O
-Acetyl GD3 was confirmed.
【図１】実施例１によって得られた９−Ｏ−アセチルＧ
D3の薄層クロマトグラフィーによる分析結果を示す。FIG. 1 shows 9-O-acetyl G obtained according to Example 1.
4 shows the results of analysis of D3 by thin-layer chromatography.
【図２】実施例１によって得られた９−Ｏ−アセチルＧ
D3のＴＬＣイムノステイニング法による分析結果を示
す。FIG. 2 shows 9-O-acetyl G obtained according to Example 1.
The result of the analysis of D3 by the TLC immunostaining method is shown.
【図３】ガングリオシドＧD3の赤外分析結果を示す。Figure 3 shows an infrared analysis of the ganglioside G D3.
【図４】実施例１によって得られた９−Ｏ−アセチルＧ
D3の赤外分析結果を示す。FIG. 4 shows 9-O-acetyl G obtained according to Example 1.
3 shows the results of infrared analysis of D3 .
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 出家 栄記 埼玉県狭山市入間川71−６−６−8026 (56)参考文献 特開 平３−127756（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−83943（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−77456（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 19/26 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of the front page (72) Inventor Eiji Eiji 71-6-6-2026 Irumagawa, Sayama City, Saitama Prefecture (56) References JP-A-3-127756 (JP, A) JP-A-3-83943 (JP) , A) JP-A-4-77456 (JP, A) (58) Fields investigated (Int. Cl. 7 , DB name) C12P 19/26
Claims (2)
の存在下にリパーゼを作用させて末端のシアル酸の9-O-
位のみを、アセチル基供与体のアセチル基によってアセ
チル化することを特徴とする9-O-アセチル化シアル酸結
合化合物の製造法。A sialic acid-binding compound is reacted with a lipase in the presence of an acetyl group donor to form 9-O-
A method for producing a 9-O-acetylated sialic acid-binding compound, wherein only the position is acetylated by an acetyl group of an acetyl group donor.
Ｄ３である請求項１記載の化合物の製造法。2. The method according to claim 2, wherein the sialic acid binding compound is ganglioside G.
The method for producing a compound according to claim 1, which is D3.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16221292A JP3280072B2 (en) | 1992-05-28 | 1992-05-28 | Method for producing 9-O-acetylated sialic acid binding compound |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16221292A JP3280072B2 (en) | 1992-05-28 | 1992-05-28 | Method for producing 9-O-acetylated sialic acid binding compound |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05328989A JPH05328989A (en) | 1993-12-14 |
| JP3280072B2 true JP3280072B2 (en) | 2002-04-30 |
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ID=15750099
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| JP16221292A Expired - Fee Related JP3280072B2 (en) | 1992-05-28 | 1992-05-28 | Method for producing 9-O-acetylated sialic acid binding compound |
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|---|---|---|---|---|
| CN113671090A (en) * | 2021-09-24 | 2021-11-19 | 华东理工大学 | Method for measuring sialic acid content in serum |
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1992
- 1992-05-28 JP JP16221292A patent/JP3280072B2/en not_active Expired - Fee Related
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| JPH05328989A (en) | 1993-12-14 |
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