JP3227475B2 - Total nucleotide sequence of Akabane virus S RNA and primer sequences for abnormal production related virus disease gene diagnosis - Google Patents

Total nucleotide sequence of Akabane virus S RNA and primer sequences for abnormal production related virus disease gene diagnosis

Info

Publication number
JP3227475B2
JP3227475B2 JP10442098A JP10442098A JP3227475B2 JP 3227475 B2 JP3227475 B2 JP 3227475B2 JP 10442098 A JP10442098 A JP 10442098A JP 10442098 A JP10442098 A JP 10442098A JP 3227475 B2 JP3227475 B2 JP 3227475B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
virus
rna
pcr
akabane
target animal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP10442098A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JPH11290080A (en
Inventor
博臣 明石
Original Assignee
独立行政法人 農業技術研究機構
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 独立行政法人 農業技術研究機構 filed Critical 独立行政法人 農業技術研究機構
Priority to JP10442098A priority Critical patent/JP3227475B2/en
Publication of JPH11290080A publication Critical patent/JPH11290080A/en
Application granted granted Critical
Publication of JP3227475B2 publication Critical patent/JP3227475B2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、ウシ、ヒツジ、ヤ
ギ等の動物におけるアカバネウイルス及びアイノウイル
ス病の遺伝子診断方法に関する。
The present invention relates to a method for diagnosing Akabane virus and Ainovirus disease in animals such as cows, sheep and goats.

【0002】[0002]

【従来の技術】ウシ、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物に流
産、死産、早産等の異常産を引き起こすウイルスとし
て、わが国ではアカバネウイルス、カスバウイルス、牛
ウイルス性下痢ウイルス及びアイノウイルスが知られて
いる。これらのウイルスのうち、アカバネウイルス及び
アイノウイルスは分類学上同じウイルス群(ブニヤウイ
ルス科)に属する。
2. Description of the Related Art Akabane virus, Kasbah virus, bovine viral diarrhea virus and Ainovirus are known in Japan as viruses that cause abnormal production such as abortion, stillbirth, premature birth and the like in mammals such as cows, sheep and goats. . Among these viruses, Akabane virus and Aino virus belong to the same taxonomic group (Vunyaviridae).

【0003】ブニヤウイルス科に属するウイルスの遺伝
子は、3分節に分かれた、マイナスの1本鎖RNAであ
り、分子量の大きい方からL(large)、M(mediu
m)、S(small)と命名されている。それぞれのRNA
はL蛋白、G1とG2の糖蛋白、N蛋白をコードしてい
ることが知られており、また各分節の両末端の8〜13の
ヌクレオチドは同属間でよく保存され、3'末端と5'末端
は相補的でパンハンドル構造を形成することが知られて
いる。
The gene of the virus belonging to the Bunyaviridae family is a single-stranded negative RNA divided into three segments, and L (large) and M (mediu) in descending order of molecular weight.
m) and S (small). Each RNA
Is known to encode the L protein, glycoproteins of G1 and G2, and the N protein. The 8-13 nucleotides at both ends of each segment are well conserved among the same genera. 'The ends are known to be complementary and form a panhandle structure.

【0004】アカバネウイルスとアイノウイルスとは性
状が酷似しているため、アカバネウイルス感染とアイノ
ウイルス感染との判別は容易ではない。一方、アカバネ
ウイルス感染とアイノウイルス感染とを判別すること
は、ウイルス病の治療において重要であるとともに、ウ
イルス病の流行を予測する上でも非常に重要である。
Since the properties of Akabane virus and Aino virus are very similar, it is not easy to distinguish Akabane virus infection from Aino virus infection. On the other hand, discriminating between Akabane virus infection and Ainovirus infection is important not only in the treatment of viral diseases but also in predicting the spread of viral diseases.

【0005】従来、アカバネウイルス感染とアイノウイ
ルス感染との判別は、血清学的診断によって行われてい
た。
Conventionally, the distinction between Akabane virus infection and Aino virus infection has been made by serodiagnosis.

【0006】しかし、この方法では、異状を呈した子ウ
シ等の初乳未摂取の血清が必要であること、血清反応自
体にも細胞が必要であること、感染の有無の判別に1週
間以上の期間を要すること等、操作が煩雑で判別に長期
間を要するという問題点があった。そこで、ウシ、ヒツ
ジ、ヤギ等の動物におけるアカバネウイルス感染とアイ
ノウイルス感染とを、簡易かつ精度よく判別できる方法
の開発が望まれている。
However, according to this method, it is necessary to use serum that has not been ingested by colostrum of a calf or the like that has exhibited an abnormality, that cells need to be used for the serum reaction itself, and that it takes more than one week to determine the presence or absence of infection. For example, there is a problem that the operation is complicated and a long time is required for the determination. Therefore, development of a method that can easily and accurately discriminate between Akabane virus infection and Ainovirus infection in animals such as cows, sheep, and goats is desired.

【0007】[0007]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ウシ、ヒツ
ジ、ヤギ等の動物におけるアカバネウイルス感染及びア
イノウイルス感染を簡易かつ精度よく判別できる方法を
提供することを目的とする。
SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a method for easily and accurately distinguishing Akabane virus infection and Ainovirus infection from animals such as cows, sheep and goats.

【0008】[0008]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため鋭意研究した結果、アカバネウイルスの
S RNAの全塩基配列を決定することに成功し、このアカ
バネウイルスのS RNAの塩基配列と既に公知であるアイ
ノウイルスのS RNAの塩基配列とを比較することによ
り、両塩基配列の異なる部分を明らかにした。そして、
この塩基配列の違いに基づいて、アカバネウイルS RNA
を特異的に増幅できるRT-PCR及びnested PCR用プライマ
ー、並びにアイノウイルスS RNAを特異的に増幅できるR
T-PCR及びnested PCR用プライマーを作製し、本発明を
完成するに至った。
Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that
Succeeded in determining the entire nucleotide sequence of the S RNA, and by comparing the nucleotide sequence of this Akabane virus S RNA with the nucleotide sequence of the already known Ainovirus S RNA, the different portions of both nucleotide sequences were determined. Revealed. And
Based on this base sequence difference,
Primers for RT-PCR and nested PCR that can specifically amplify RNA, and R that can specifically amplify inovirus S RNA
The present invention was completed by preparing primers for T-PCR and nested PCR.

【0009】すなわち、本発明は、以下の工程: (a)対象動物の細胞及び/又は血液からRNAを含有
する試料を調製する工程、(b)上記試料に対して、ア
カバネウイルスS RNAに特異的に結合するプライマーを
用いたRT-PCRを行う工程、及び(c)工程(b)で得ら
れる増幅断片の有無により、対象動物がアカバネウイル
スに感染しているか否かを判別する工程、を含んでなる
ことを特徴とする、アカバネウイルス感染の判別方法で
ある。
That is, the present invention provides the following steps: (a) a step of preparing a sample containing RNA from cells and / or blood of a target animal; and (b) specificity of the sample to Akabane virus S RNA. Performing a step of performing RT-PCR using primers that bind specifically, and (c) determining whether the target animal is infected with Akabane virus based on the presence or absence of the amplified fragment obtained in step (b). A method for determining Akabane virus infection, comprising:

【0010】また、本発明は、上記プライマーが、次の
2種のプライマー: 5'− TAACTACGCATTGCAATGGC −3' 5'− TAAGCTTAGATCTGGATACC −3' であることを特徴とする上記判別方法である。さらに、
本発明は、上記工程(b)において、RT-PCR産物に対し
て、次の2種のプライマー: 5'− GAAGGCCAAGATGGTCTTAC −3' 5'− GGCATCACAATTGTGGCAGC −3' を用いたnested PCRをさらに行うことを特徴とする上記
判別方法である。
Further, the present invention is the above-mentioned discriminating method, wherein the primer is the following two primers: 5′-TAACTACGCATTGCAATGGC-3 ′ 5′-TAAGCTTAGATCTGGATACC-3 ′. further,
According to the present invention, in the step (b), the RT-PCR product is further subjected to nested PCR using the following two primers: 5′-GAAGGCCAAGATGGTCTTAC-3′5′-GGCATCACAATTGTGGCAGC-3 ′. This is the above-described determination method.

【0011】さらに、本発明は、上記工程(c)におい
て、工程(b)で得られる増幅断片を制限酵素で処理
し、その制限断片長多型により、対象動物がアカバネウ
イルスに感染しているか否かを判別することを特徴とす
る上記判別方法である。さらに、本発明は、以下の工
程: (a)対象動物の細胞及び/又は血液からRNAを含有
する試料を調製する工程、(b)上記試料に対して、ア
イノウイルスS RNAに特異的に結合するプライマーを用
いたRT-PCRを行う工程、及び(c)工程(b)で得られ
る増幅断片の有無により、対象動物がアイノウイルスに
感染しているか否かを判別する工程、を含んでなること
を特徴とする、アイノウイルス感染の判別方法である。
[0011] Further, the present invention provides a method according to the present invention, wherein in the step (c), the amplified fragment obtained in the step (b) is treated with a restriction enzyme, and the restriction fragment length polymorphism determines whether the target animal is infected with the Akabane virus. The above-mentioned determination method is characterized in that it is determined whether or not it is not. Further, the present invention provides the following steps: (a) a step of preparing a sample containing RNA from cells and / or blood of a target animal; (b) specific binding of the sample to inovirus S RNA (C) determining whether the target animal is infected with an inovirus based on the presence or absence of the amplified fragment obtained in step (b). A method for discriminating inovirus infection.

【0012】さらに、本発明は、上記プライマーが、次
の2種のプライマー: 5'− CCCAACTCAATTTCGATACC −3' 5'− TTTGGAACACCATACTGGGG −3' であることを特徴とする上記判別方法である。さらに、
本発明は、上記工程(b)において、RT-PCR産物に対し
て、次の2種のプライマー: 5'− CCATCGTCTCTCAGGATATC −3' 5'− ACAGCATTGAAGGCTGCACG −3' を用いたnested PCRをさらに行うことを特徴とする上記
判別方法である。さらに、本発明は、上記工程(c)に
おいて、工程(b)で得られる増幅断片を制限酵素で処
理し、その制限断片長多型により、対象動物がアイノウ
イルスに感染しているか否かを判別することを特徴とす
る上記判別方法である。
Further, the present invention provides the above-described method, wherein the primer is the following two primers: 5′-CCCAACTCAATTTCGATACC-3 ′ 5′-TTTGGAACACCATACTGGGG-3 ′. further,
According to the present invention, in the step (b), the RT-PCR product is further subjected to nested PCR using the following two primers: 5′-CCATCGTCTCTCAGGATATC-3 ′ 5′-ACAGCATTGAAGGCTGCACG-3 ′. This is the above-described determination method. Further, in the present invention, in the above step (c), the amplified fragment obtained in the step (b) is treated with a restriction enzyme, and whether or not the target animal is infected with an inovirus is determined by the restriction fragment length polymorphism. It is the above-mentioned discrimination method characterized by discriminating.

【0013】[0013]

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。 1.アカバネウイルス感染の判別方法 本発明のアカバネウイルス感染の判別方法は、以下の工
程: (a)対象動物の細胞及び/又は血液からRNAを含有
する試料を調製する工程、(b)上記試料に対して、ア
カバネウイルスS RNAに特異的に結合するプライマーを
用いたRT-PCRを行う工程、及び(c)工程(b)で得ら
れる増幅断片の有無により、対象動物がアカバネウイル
スに感染しているか否かを判別する工程、を含んでなる
ことを特徴とする。
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail. 1. The method for determining Akabane virus infection The method for determining Akabane virus infection according to the present invention comprises the following steps: (a) a step of preparing a sample containing RNA from cells and / or blood of a target animal; Whether the subject animal is infected with Akabane virus by RT-PCR using a primer that specifically binds to Akabane virus S RNA, and (c) the presence or absence of the amplified fragment obtained in step (b). Judging whether or not the image data is not included.

【0014】以下、各工程ごとに説明する。 (1)工程(a) 工程(a)は、対象動物の細胞及び/又は血液からRN
Aを含有する試料を調製する工程である。工程(a)に
おける対象動物とは、アカバネウイルス感染の有無を判
別しようとする動物を意味する。対象動物は、アカバネ
ウイルスに感染し得る動物である限り特に限定されず、
いかなる動物であってもよい。このような対象動物とし
ては、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ハムスタ
ー、ニワトリ胎児等が挙げられる。
Hereinafter, each step will be described. (1) Step (a) In the step (a), RN is obtained from cells and / or blood of a target animal.
This is a step of preparing a sample containing A. The target animal in the step (a) means an animal for which the presence or absence of Akabane virus infection is to be determined. The target animal is not particularly limited as long as it is an animal that can be infected with Akabane virus,
It can be any animal. Examples of such target animals include cows, sheep, goats, mice, hamsters, chicken fetuses, and the like.

【0015】工程(a)で使用する対象動物の細胞及び
/又は血液は、対象動物に由来する限り特に限定され
ず、いかなる組織由来の細胞及び/又は血液であっても
よい。このような細胞及び/又は血液としては、例え
ば、脳、心臓、肺、脾臓、腎臓、肝臓等の組織由来の細
胞及び/又は血液を使用することができる。対象動物の
細胞及び/又は血液は、対象動物から常法に従って採取
することができる。また、対象動物の血液は、蚊、ヌカ
カ等の吸血昆虫材料から常法に従って採取することもで
きる。
The cells and / or blood of the target animal used in step (a) are not particularly limited as long as they are derived from the target animal, and may be cells and / or blood derived from any tissue. As such cells and / or blood, for example, cells and / or blood derived from tissues such as brain, heart, lung, spleen, kidney, and liver can be used. The cells and / or blood of the target animal can be collected from the target animal according to a conventional method. In addition, the blood of the target animal can be collected from blood-sucking insect materials such as mosquitoes and brassicae according to a conventional method.

【0016】工程(a)で調製するRNAを含有する試
料とは、対象動物の細胞及び/又は血液由来のRNAを
含有する試料を意味する。従って、RNAを含有する試
料には、アカバネウイルスゲノムRNAが含有される限
り、いかなるRNA、DNA、タンパク質等が含有され
ていてもよい。また、RNAを含有する試料は、常法に
従って精製してもよい。
The sample containing RNA prepared in step (a) means a sample containing RNA derived from cells and / or blood of a target animal. Therefore, the RNA-containing sample may contain any RNA, DNA, protein, etc. as long as it contains Akabane virus genomic RNA. Further, the sample containing RNA may be purified according to a conventional method.

【0017】対象動物の細胞及び/又は血液からのRN
Aを含有する試料の調製は、常法に従って行うことがで
きる。例えば、対象動物の細胞及び/又は血液を破砕
し、可溶化剤によって可溶化した後、変性剤によってタ
ンパク質を除去し、エタノール等によって沈殿させるこ
とによって、対象動物の細胞からRNAを含有する試料
を調製することができる。
RN from cells and / or blood of a subject animal
Preparation of the sample containing A can be performed according to a conventional method. For example, by crushing cells and / or blood of a target animal, solubilizing with a solubilizing agent, removing the protein with a denaturing agent, and precipitating with ethanol or the like, a sample containing RNA is obtained from the cells of the target animal. Can be prepared.

【0018】(2)工程(b) 工程(b)は、上記試料に対して、アカバネウイルスS
RNAに特異的に結合するプライマーを用いたRT-PCRを行
う工程である。工程(b)で使用するプライマーは、ア
カバネウイルスS RNAに特異的に結合する限り、その塩
基配列は特に限定されない。このようなプライマーの塩
基配列は、例えば、アカバネウイルスS RNAの塩基配列
とアイノウイルスS RNAの塩基配列との間で塩基配列の
異なる部分に基づいて決定することができる。ここで、
両ウイルスS RNAの塩基配列の間で塩基配列の異なる部
分を図1に示す。図1中、両ウイルスS RNAの塩基配列
が同一である部分は「:」によって表され、異なる部分
は空欄によって表される。従って、図1に示される両ウ
イルスS RNAの塩基配列の異なる部分を適宜選択するこ
とにより、アカバネウイルスS RNAに特異的に結合する
プライマーの塩基配列を決定することができる。
(2) Step (b) In step (b), Akabane virus S
This is a step of performing RT-PCR using a primer that specifically binds to RNA. The nucleotide sequence of the primer used in step (b) is not particularly limited as long as it specifically binds to Akabane virus S RNA. The nucleotide sequence of such a primer can be determined, for example, based on a portion where the nucleotide sequence differs between the nucleotide sequence of Akabane virus S RNA and the nucleotide sequence of Ainovirus S RNA. here,
FIG. 1 shows the portions where the nucleotide sequences differ between the nucleotide sequences of both virus S RNAs. In FIG. 1, a portion where the nucleotide sequences of both virus S RNAs are the same is represented by “:”, and a different portion is represented by a blank. Therefore, the nucleotide sequence of a primer that specifically binds to Akabane virus S RNA can be determined by appropriately selecting different portions of the nucleotide sequence of both virus S RNAs shown in FIG.

【0019】アカバネウイルスS RNAに特異的に結合す
るプライマーとしては、例えば、次の2種のプライマ
ー: 5'− TAACTACGCATTGCAATGGC −3' 5'− TAAGCTTAGATCTGGATACC−3' を例示することができる。
Examples of primers that specifically bind to Akabane virus S RNA include the following two primers: 5'-TAACTACGCATTGCAATGGC-3 '5'-TAAGCTTAGATCTGGATACC-3'.

【0020】これらのプライマーのうち、5'− TAACTAC
GCATTGCAATGGC −3'は、アカバネウイルスS RNAの19〜3
8番目の塩基配列に相補的であり、5'− TAAGCTTAGATCTG
GATACC −3'は、アカバネウイルスS RNAの相補鎖の721
〜740番目の塩基配列に相補的である。従って、これら
のプライマーは、アカバネウイルスゲノムS RNAに特異
的に結合する。アカバネウイルスS RNAに特異的に結合
するプライマーは、例えば、常法に従って化学合成する
ことができる。
Of these primers, 5'-TAACTAC
GCATTGCAATGGC −3 ′ is 19 to 3 of Akabane virus S RNA.
Complementary to the eighth base sequence, 5'-TAAGCTTAGATCTG
GATACC-3 'is 721 of the complement of Akabane virus S RNA.
It is complementary to the 740th base sequence. Thus, these primers specifically bind to Akabane virus genomic S RNA. Primers that specifically bind to Akabane virus S RNA can be chemically synthesized, for example, according to a conventional method.

【0021】上記試料に対して、アカバネウイルスS RN
Aに特異的に結合するプライマーを用いたRT-PCRを行う
ことにより、試料中にアカバネウイルスS RNAが含有さ
れている場合には、アカバネウイルスS RNAを特異的に
増幅することができる。アカバネウイルスS RNAに特異
的に結合するプライマーを用いたRT-PCRは、常法に従っ
て行うことができる。RT-PCRの条件は、アカバネウイル
スS RNAに特異的に結合するプライマーを用いる限り特
に限定されない。
For the above sample, Akabane virus S RN
By performing RT-PCR using a primer that specifically binds to A, if Akabane virus S RNA is contained in the sample, Akabane virus S RNA can be specifically amplified. RT-PCR using a primer that specifically binds to Akabane virus S RNA can be performed according to a conventional method. The conditions for RT-PCR are not particularly limited as long as a primer that specifically binds to Akabane virus S RNA is used.

【0022】工程(b)において、アカバネウイルスS
RNAに特異的に結合するプライマーを用いたRT-PCRによ
り得られるRT-PCR産物に対して、RT-PCR産物に特異的に
結合するプライマーを用いたnested PCRをさらに行うこ
とが好ましい。例えば、RT−PCRのプライマーとして5'
− TAACTACGCATTGCAATGGC −3'及び5'− TAAGCTTAGATCT
GGATACC−3'を使用した場合には、nested PCRのプライ
マーとして、次の2種のプライマー: 5'− GAAGGCCAAGATGGTCTTAC −3' 5'− GGCATCACAATTGTGGCAGC −3' を用いることができる。
In step (b), Akabane virus S
It is preferable to further perform nested PCR using a primer that specifically binds to the RT-PCR product on an RT-PCR product obtained by RT-PCR using a primer that specifically binds to RNA. For example, 5 'as a primer for RT-PCR
− TAACTACGCATTGCAATGGC −3 ′ and 5′− TAAGCTTAGATCT
When GGATACC-3 'is used, the following two primers can be used as primers for nested PCR: 5'-GAAGGCCAAGATGGTCTTAC-3'5'-GGCATCACAATTGTGGCAGC-3'.

【0023】これらのプライマーのうち、5'− GAAGGCC
AAGATGGTCTTAC −3'は、アカバネウイルスS RNAの177〜
196番目の塩基配列に相補的であり、5'− GGCATCACAATT
GTGGCAGC −3'は、アカバネウイルスS RNAの相補鎖の38
8〜407番目の塩基配列に相補的である。従って、これら
のプライマーは、RT-PCR産物に特異的に結合する。RT-P
CR産物に特異的に結合するプライマーは、例えば、常法
に従って化学合成することができる。
Of these primers, 5'-GAAGGCC
AAGATGGTCTTAC -3 'is 177 to
Complementary to the base sequence at position 196, 5'-GGCATCACAATT
GTGGCAGC −3 ′ is 38% of the complementary strand of Akabane virus S RNA.
It is complementary to the nucleotide sequence at positions 8 to 407. Thus, these primers specifically bind to the RT-PCR product. RT-P
Primers that specifically bind to the CR product can be chemically synthesized, for example, according to a conventional method.

【0024】RT-PCR産物に対して、RT-PCR産物に特異的
に結合するプライマーを用いたnested PCRを行うことに
より、RT-PCR産物は特異的に増幅される。これにより、
目的の領域以外に由来する産物を除去することができ
る。RT-PCR産物に特異的に結合するプライマーを用いた
nested PCRは、常法に従って行うことができる。nested
PCRの条件は、RT-PCR産物に特異的に結合するプライマ
ーを用いる限り特に限定されない。
The RT-PCR product is specifically amplified by performing nested PCR using a primer that specifically binds to the RT-PCR product. This allows
Products derived from regions other than the target region can be removed. Using primers that specifically bind to RT-PCR products
Nested PCR can be performed according to a conventional method. nested
PCR conditions are not particularly limited as long as a primer that specifically binds to the RT-PCR product is used.

【0025】(3)工程(c) 工程(c)は、工程(b)で得られる増幅断片の有無に
より、対象動物がアカバネウイルスに感染しているか否
かを判別する工程である。増幅断片の有無の確認は、常
法に従って行うことができる。例えば、電気泳動により
増幅断片の有無を確認することができる。
(3) Step (c) Step (c) is a step of judging whether or not the target animal is infected with the Akabane virus based on the presence or absence of the amplified fragment obtained in step (b). Confirmation of the presence or absence of the amplified fragment can be performed according to a conventional method. For example, the presence or absence of the amplified fragment can be confirmed by electrophoresis.

【0026】増幅断片の有無の確認の結果、増幅断片が
存在する場合には、対象動物がアカバネウイルスに感染
している可能性が高いと判別することができる。例え
ば、プライマーとして5'− TAACTACGCATTGCAATGGC −3'
及び5'− TAAGCTTAGATCTGGATACC−3'を用いたRT-PCRを
行った結果、増幅断片が得られた場合には、対象動物が
アカバネウイルス又はTinarooウイルスに感染している
可能性が高い。また、増幅断片の有無の確認の結果、増
幅断片が存在しない場合には、対象動物がアカバネウイ
ルスに感染していない可能性が高いと判別することがで
きる。特に、nested PCRを行った後、増幅断片が存在し
ない場合には、対象動物がアカバネウイルスに感染して
いない可能性が極めて高い。
As a result of confirming the presence or absence of the amplified fragment, if the amplified fragment is present, it can be determined that there is a high possibility that the target animal is infected with the Akabane virus. For example, 5'-TAACTACGCATTGCAATGGC-3 '
If an amplified fragment is obtained as a result of RT-PCR using 5′-TAAGCTTAGATCTGGATACC-3 ′, it is highly likely that the target animal is infected with Akabane virus or Tinaroo virus. In addition, as a result of confirming the presence or absence of the amplified fragment, if the amplified fragment does not exist, it can be determined that there is a high possibility that the target animal is not infected with the Akabane virus. In particular, if there is no amplified fragment after performing nested PCR, it is highly likely that the target animal is not infected with Akabane virus.

【0027】対象動物がアカバネウイルスに感染してい
るか否かをさらに精度よく判別するために、増幅断片が
アカバネウイルスS RNAに由来することを確認すること
が好ましい。増幅断片がアカバネウイルスS RNAに由来
することを確認する方法としては、例えば、増幅断片を
制限酵素で処理して得られる制限断片長多型解析を行う
方法が挙げられる。
In order to more accurately determine whether or not the target animal is infected with Akabane virus, it is preferable to confirm that the amplified fragment is derived from Akabane virus S RNA. As a method for confirming that the amplified fragment is derived from Akabane virus S RNA, for example, a method of performing restriction fragment length polymorphism analysis obtained by treating the amplified fragment with a restriction enzyme can be mentioned.

【0028】この際使用する制限酵素としては、増幅断
片を切断し制限断片長多型を示し得るものであれば特に
限定されない。このような制限酵素としては、例えば、
アカバネウイルスS RNA由来の増幅断片を切断し得る制
限酵素(例えば、Hph I等)やアカバネウイルスS RNA由
来の増幅断片を切断し得ない制限酵素(例えば、Bst EI
I等)を使用することができる。これらの制限酵素は、
単独で使用してもよいが、2種以上を組み合わせて使用
することが望ましい。
The restriction enzyme used at this time is not particularly limited as long as it can cleave the amplified fragment and show a restriction fragment length polymorphism. Such restriction enzymes include, for example,
Restriction enzymes capable of cleaving amplified fragments derived from Akabane virus S RNA (eg, Hph I) and restriction enzymes capable of cleaving amplified fragments derived from Akabane virus S RNA (eg, BstEI)
I etc.) can be used. These restriction enzymes
Although they may be used alone, it is desirable to use two or more kinds in combination.

【0029】増幅断片を制限酵素で処理して得られる制
限断片長多型は、例えば、サザンブロット法により検出
することができる。増幅断片を制限酵素で処理して得ら
れる制限断片長多型により、増幅断片がアカバネウイル
スゲノムRNAを鋳型として増幅した断片であるか否か
を判別することができる。従って、制限断片長多型によ
り、試料中にアカバネウイルスゲノムRNAが含有され
ているか否かを判別することができ、これにより対象動
物がアカバネウイルスに感染しているか否かをさらに精
度よく判別することができる。
The restriction fragment length polymorphism obtained by treating the amplified fragment with a restriction enzyme can be detected by, for example, Southern blotting. Based on the restriction fragment length polymorphism obtained by treating the amplified fragment with a restriction enzyme, it can be determined whether or not the amplified fragment is a fragment amplified using the Akabane virus genomic RNA as a template. Therefore, it is possible to determine whether or not the sample contains the Akabane virus genomic RNA based on the restriction fragment length polymorphism, thereby more accurately determining whether or not the target animal is infected with the Akabane virus. be able to.

【0030】2.アイノウイルス感染の判別方法 本発明のアイノウイルス感染の判別方法は、以下の工
程: (a)対象動物の細胞及び/又は血液からRNAを含有
する試料を調製する工程、(b)上記試料に対して、ア
イノウイルスS RNAに特異的に結合するプライマーを用
いたRT-PCRを行う工程、及び(c)工程(b)で得られ
る増幅断片の有無により、対象動物がアイノウイルスに
感染しているか否かを判別する工程、を含んでなること
を特徴とする。
2. Method for discriminating inovirus infection The method for discriminating inovirus infection of the present invention comprises the following steps: (a) a step of preparing a sample containing RNA from cells and / or blood of a target animal; Performing the RT-PCR using primers that specifically bind to the inovirus S RNA, and (c) determining whether the target animal is infected with the inovirus by the presence or absence of the amplified fragment obtained in the step (b). Judging whether or not the image data is not included.

【0031】以下、各工程ごとに説明する。 (1)工程(a) 工程(a)は、対象動物の細胞及び/又は血液からRN
Aを含有する試料を調製する工程である。工程(a)
は、上記アカバネウイルス感染の判別方法の工程(a)
と同様にして行うことができる。
Hereinafter, each step will be described. (1) Step (a) In step (a), RN is obtained from cells and / or blood of a target animal.
This is a step of preparing a sample containing A. Step (a)
Shows the step (a) of the method for determining Akabane virus infection.
Can be performed in the same manner as described above.

【0032】(2)工程(b) 工程(b)は、上記試料に対して、アイノウイルスS RN
Aに特異的に結合するプライマーを用いたRT-PCRを行う
工程である。工程(b)は、プライマーとしてアイノウ
イルスS RNAに特異的に結合するプライマーを使用してR
T-PCRを行う点を除けば、上記アカバネウイルス感染の
判別方法の工程(b)と同様にして行うことができる。
(2) Step (b) In the step (b), the inovirus SRN
This is a step of performing RT-PCR using a primer that specifically binds to A. Step (b) is performed using a primer that specifically binds to inovirus S RNA as a primer.
Except for performing T-PCR, it can be performed in the same manner as in step (b) of the above-described method for determining Akabane virus infection.

【0033】工程(b)で使用するプライマーは、アイ
ノウイルスS RNAに特異的に結合する限り、その塩基配
列は特に限定されない。このようなプライマーの塩基配
列は、例えば、アカバネウイルスS RNAの塩基配列とア
イノウイルスS RNAの塩基配列との間で塩基配列の異な
る部分に基づいて決定することができる。両ウイルスSR
NAの塩基配列の間で塩基配列の異なる部分を図1に示
す。従って、図1に示される両ウイルスS RNAの塩基配
列の異なる部分を適宜選択することにより、アイノウイ
ルスS RNAに特異的に結合するプライマーの塩基配列を
決定することができる。
The nucleotide sequence of the primer used in step (b) is not particularly limited, as long as it specifically binds to inovirus S RNA. The nucleotide sequence of such a primer can be determined, for example, based on a portion where the nucleotide sequence differs between the nucleotide sequence of Akabane virus S RNA and the nucleotide sequence of Ainovirus S RNA. Both viruses SR
FIG. 1 shows a portion where the nucleotide sequence differs between the nucleotide sequences of NA. Therefore, the nucleotide sequence of a primer that specifically binds to the inovirus S RNA can be determined by appropriately selecting different portions of the nucleotide sequence of both virus S RNAs shown in FIG.

【0034】アイノウイルスS RNAに特異的に結合する
プライマーとしては、例えば、次の2種のプライマー: 5'− CCCAACTCAATTTCGATACC −3' 5'− TTTGGAACACCATACTGGGG −3’ を例示することができる。
Examples of primers that specifically bind to inovirus S RNA include the following two primers: 5'-CCCAACTCAATTTCGATACC-3'5'-TTTGGAACACCATACTGGGG-3 '.

【0035】これらのプライマーのうち、5’− CCCAA
CTCAATTTCGATACC −3'はアイノウイルスS RNAの132〜15
1番目の塩基配列に相補的であり、5'− TTTGGAACACCATA
CTGGGG−3'はアイノウイルスS RNAの相補鎖の761〜780
番目の塩基配列に相補的である。従って、これらのプラ
イマーは、アイノウイルスS RNAに特異的に結合する。
Of these primers, 5'-CCCAA
CTCAATTTCGATACC -3 'is 132-15 of inovirus S RNA
Complementary to the first nucleotide sequence, 5′-TTTGGAACACCATA
CTGGGG-3 'is the complement of the Ainovirus S RNA 761-780
Complementary to the base sequence. Thus, these primers specifically bind to the Ainovirus S RNA.

【0036】また、工程(b)において、アイノウイル
スS RNAに特異的に結合するプライマーを用いたRT-PCR
により得られるRT-PCR産物に対して、RT-PCR産物に特異
的に結合するプライマーを用いたnested PCRをさらに行
うことが好ましい。例えば、RT-PCRのプライマーとして
5'− CCCAACTCAATTTCGATACC −3'及び5'−TTTGGAACACCA
TACTGGGG −3'を使用した場合には、nested PCRのプラ
イマーとして、次の2種のプライマー: 5'− CCATCGTCTCTCAGGATATC −3' 5'− ACAGCATTGAAGGCTGCACG −3' を用いることができる。
In the step (b), RT-PCR using primers that specifically bind to inovirus S RNA
It is preferable to further perform nested PCR using a primer that specifically binds to the RT-PCR product obtained by the above. For example, as a primer for RT-PCR
5'-CCCAACTCAATTTCGATACC -3 'and 5'-TTTGGAACACCA
When TACTGGGG-3 'is used, the following two primers can be used as primers for nested PCR: 5'-CCATCGTCTCTCAGGATATC-3'5'-ACAGCATTGAAGGCTGCACG-3'.

【0037】これらのプライマーのうち、5'− CCATCGT
CTCTCAGGATATC −3'はアイノウイルスS RNAの313〜332
番目の塩基配列と相補的であり、5'− ACAGCATTGAAGGCT
GCACG−3'はアイノウイルスS RNAの相補鎖の638〜657番
目の塩基配列と相補的である。従って、これらのプライ
マーは、RT-PCR産物に特異的に結合する。
Of these primers, 5'-CCATCGT
CTCTCAGGATATC -3 'is 313-332 of inovirus S RNA
5'-ACAGCATTGAAGGCT
GCACG-3 'is complementary to the nucleotide sequence at positions 638 to 657 of the complementary strand of inovirus S RNA. Thus, these primers specifically bind to the RT-PCR product.

【0038】(3)工程(c) 工程(c)は、工程(b)で得られる増幅断片の有無に
より、対象動物がアイノウイルスに感染しているか否か
を判別する工程である。工程(c)は、上記アカバネウ
イルス感染の判別方法の工程(c)と同様にして行うこ
とができる。増幅断片の有無の確認の結果、増幅断片が
存在する場合には、対象動物がアイノウイルスに感染し
ている可能性が高いと判別することができる。例えば、
プライマーとして5'− CCCAACTCAATTTCGATACC −3'及び
5'− TTTGGAACACCATACTGGGG−3'を用いたRT-PCRを行
い、増幅断片が得られた場合には、対象動物がアイノウ
イルス又はPeatonウイルスに感染している可能性が高
い。
(3) Step (c) Step (c) is a step of judging whether or not the target animal is infected with an inovirus based on the presence or absence of the amplified fragment obtained in step (b). Step (c) can be performed in the same manner as in step (c) of the above-described method for determining Akabane virus infection. As a result of confirming the presence or absence of the amplified fragment, if the amplified fragment is present, it can be determined that there is a high possibility that the target animal is infected with the Ainovirus. For example,
5'-CCCAACTCAATTTCGATACC-3 'as a primer and
When RT-PCR using 5′-TTTGGAACACCATACTGGGG-3 ′ is performed and an amplified fragment is obtained, there is a high possibility that the target animal is infected with an inovirus or a Peaton virus.

【0039】また、増幅断片の有無の確認の結果、増幅
断片が存在しない場合には、対象動物がアイノウイルス
に感染していない可能性が高いと判別することができ
る。特に、nested PCRを行った後、増幅断片が存在しな
い場合には、対象動物がアイノウイルスに感染していな
い可能性が極めて高い。工程(c)において、対象動物
がアイノウイルスに感染しているか否かをさらに精度よ
く判別するために、増幅断片がアイノウイルスS RNAに
由来することを確認することが好ましい。
In addition, as a result of confirming the presence or absence of the amplified fragment, if the amplified fragment does not exist, it can be determined that there is a high possibility that the target animal is not infected with the inovirus. In particular, if there is no amplified fragment after performing nested PCR, it is highly likely that the target animal has not been infected with the Ainovirus. In step (c), it is preferable to confirm that the amplified fragment is derived from the inovirus S RNA in order to more accurately determine whether or not the target animal is infected with the inovirus.

【0040】増幅断片がアイノウイルスS RNAに由来す
ることを確認する方法としては、例えば、増幅断片を制
限酵素で処理して得られる制限断片長多型解析を行う方
法が挙げられる。この際使用する制限酵素としては、増
幅断片を切断し制限断片長多型を示し得るものであれば
特に限定されない。このような制限酵素としては、例え
ば、アイノウイルスS RNA由来の増幅断片を切断し得る
制限酵素(例えば、Ava II、Eco RI、Hae II等)を使用
することができる。
As a method for confirming that the amplified fragment is derived from the Ainovirus S RNA, for example, there is a method of analyzing a restriction fragment length polymorphism obtained by treating the amplified fragment with a restriction enzyme. The restriction enzyme used at this time is not particularly limited as long as it can cleave the amplified fragment and show a restriction fragment length polymorphism. As such a restriction enzyme, for example, a restriction enzyme (for example, Ava II, Eco RI, Hae II, or the like) that can cleave an amplified fragment derived from inovirus S RNA can be used.

【0041】[0041]

【実施例】以下、具体例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明する。 〔実施例1〕アカバネウイルスS RNAの全塩基配列の決
定 (1)アカバネウイルスS RNAの抽出 HmLu-1細胞中で増殖させたアカバネウイルスOBE-1株
を、ショ糖密度勾配遠心分離法によって精製した。精製
したアカバネウイルスOBE-1株にSDSを添加した後、フェ
ノール抽出によりRNAを抽出し、エタノール沈殿によ
りRNAを回収した。
Now, the present invention will be described in further detail with reference to specific examples. [Example 1] Determination of total nucleotide sequence of Akabane virus S RNA (1) Extraction of Akabane virus S RNA Purified Akabane virus OBE-1 strain grown in HmLu-1 cells by sucrose density gradient centrifugation did. After SDS was added to the purified Akabane virus OBE-1 strain, RNA was extracted by phenol extraction, and the RNA was recovered by ethanol precipitation.

【0042】このRNAを、水酸化メチル水銀10mMを含
有する1%アガロースゲル上に分離した。臭化エチジウ
ムで染色した後、S RNAを含むバンドを切り出し、フェ
ノールを用いて溶解、抽出した。次いで、RNAをエタ
ノール沈殿した。これにより、アカバネウイルスS RNA
が得られた。
The RNA was separated on a 1% agarose gel containing 10 mM methylmercury hydroxide. After staining with ethidium bromide, a band containing S RNA was cut out, dissolved and extracted with phenol. The RNA was then ethanol precipitated. Thus, Akabane virus S RNA
was gotten.

【0043】(2)アカバネウイルスS RNAの塩基配列
決定 上記(1)で得られた5μgの精製S RNAの3'末端にポ
リA鎖を付加した。
(2) Determination of base sequence of Akabane virus S RNA A poly A chain was added to the 3 'end of 5 µg of the purified S RNA obtained in the above (1).

【0044】ポリA鎖の付加は、ATP及びポリアデニル
酸(ポリA)ポリメラーゼを使用して、Sippelの方法
(Sippel,A.E. European Journal of Biochemistry 3
7.31-40(1973))に従って行った。ポリA鎖を付加した
S RNAをSephadex G-50カラムで精製し、オリゴ(dT)
を用いてcDNA合成キット(Amersham社)により2本
鎖cDNAを合成した。
The addition of the poly A chain is carried out by the method of Sippel (Sippel, AE European Journal of Biochemistry 3) using ATP and polyadenylic acid (poly A) polymerase.
7.31-40 (1973)). Poly A chain added
S RNA is purified by Sephadex G-50 column and oligo (dT)
Was used to synthesize a double-stranded cDNA using a cDNA synthesis kit (Amersham).

【0045】合成した2本鎖cDNAの3'末端に、ター
ミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用
いてデオキシシチジル酸を付加し、PstIで切断しデオキ
シグアニン鎖を3'末端に付加したpBR322(Bethesda Res
earch Laboratories社)中へクローニングした。このプ
ラスミドを用いてMC1061細胞を形質転換した後、ウイル
スRNAを含むプラスミドを保有するクローンを回収
し、cDNAプローブを用いたハイブリダイゼーション
によりスクリーニングした(Bishop,d.H.Lら.,Nucleic
Acids Research 10. 3703-3713 (1982)参照)。最も大
きいクローン(789ヌクレオチド長)の塩基配列をマキ
サム・ギルバート法により決定した。
[0045] Deoxycytidylic acid was added to the 3 'end of the synthesized double-stranded cDNA using terminal deoxynucleotidyl transferase, digested with PstI, and pBR322 (Bethesda Res.
earch Laboratories). After transforming MC1061 cells with this plasmid, clones containing the plasmid containing the viral RNA were recovered and screened by hybridization using a cDNA probe (Bishop, dHL et al., Nucleic
Acids Research 10. 3703-3713 (1982)). The nucleotide sequence of the largest clone (789 nucleotides in length) was determined by the Maxam-Gilbert method.

【0046】以上により塩基配列決定されたcDNAは
完全長ではなかったため、既に報告されている他の同族
ウイルスのS RNAの塩基配列を基にして、5'末端の塩基
配列を推定し、合成プライマーを用いたRT-PCRにより残
りの塩基配列を決定した。すなわち、ブニヤウイルス科
に属するウイルスは、相補的な末端配列(9位にはミス
マッチ(UとG)がある)を有することが知られている
(Elliott,R.M. Journal of General Virology 71.501-
522 (1990);Elliott,R.M.ら Current Topics in Micr
obiology and Immunology 169. 91−141 (1991))。ま
た、アイノウイルスS RNAに関するデータにより、3'末
端及び5'末端の約25残基の配列は類似している(但し、
9位には1つのミスマッチがあり、ゲノムセンスRNAの
5'末端から10位には1個のヌクレオチドが付加されてい
る)ことが明らかとなっている(Akashi,H.ら Virus Re
search 1.51-63 (1984))。
Since the cDNA whose nucleotide sequence was determined as described above was not full-length, the nucleotide sequence at the 5 'end was estimated based on the S RNA nucleotide sequences of other homologous viruses already reported, and the synthesized primers were synthesized. The remaining nucleotide sequence was determined by RT-PCR using PCR. That is, it is known that a virus belonging to the Bunyaviridae has a complementary terminal sequence (mismatch (U and G) at position 9) (Elliott, RM Journal of General Virology 71.501-).
522 (1990); Elliott, RM et al. Current Topics in Micr
obiology and Immunology 169. 91-141 (1991)). In addition, according to data on the Ainovirus S RNA, the sequences of about 25 residues at the 3 ′ end and the 5 ′ end are similar (however,
There is one mismatch at position 9 and the genomic sense RNA
It is clear that one nucleotide has been added to position 10 from the 5 'end (Akashi, H. et al. Virus Re
search 1.51-63 (1984)).

【0047】そこで、2種のreverseプライマーを合成
した。すなわち、ブニヤウイルス共通型としてプライマ
ーAKSRS:5'-AGTAGTGTGCTCCAC-3'、アイノウイルス型と
してプライマーAKSRL:5'-AGTAGTGTGGCTCCAC-3'を合成
した。RT-PCRによるアカバネウイルスS RNAの5'末端の
増幅は、forwardプライマーAKSF19:TAACTACGCATTGCAATG
GC-3'、及び上記2種のreverseプライマー(AKSRS及びAK
SRL)によって行った。このforwardプライマーは、アカ
バネウイルスS RNAの19-38残基に対応する。
Therefore, two types of reverse primers were synthesized. That is, a primer AKSRS: 5'-AGTAGTGTGCTCCAC-3 'was synthesized as the Bunya virus common type, and a primer AKSRL: 5'-AGTAGTGTGGCTCCAC-3' was synthesized as the Aino virus type. Amplification of the 5 'end of Akabane virus S RNA by RT-PCR was performed using the forward primer AKSF19: TAACTACGCATTGCAATG.
GC-3 'and the above two reverse primers (AKSRS and AK
SRL). This forward primer corresponds to residues 19-38 of Akabane virus S RNA.

【0048】RT-PCRは、GeneAmp熱安定性rTth逆転写酵
素RNAPCRキット(Perkin-Elmer Cetus社)を使用
し、最終容量100μl中で、94℃で30秒、55℃で30秒及び
72℃で1分を1サイクルとし、これを25サイクル行った。
reverseプライマーとしてAKSRSを使用した場合のRT−PC
R産物の量は、reverseプライマーとしてAKSRLを使用し
た場合の4倍以上であった(データは示さず)。このRT-
PCRの結果から、アカバネウイルスS RNAの5'末端配列
は、「・・・CACCUCGUGUGAUGA」であると結論した。
RT-PCR was performed using GeneAmp thermostable rTth reverse transcriptase RNA PCR kit (Perkin-Elmer Cetus) in a final volume of 100 μl for 30 seconds at 94 ° C., 30 seconds at 55 ° C.
One minute was defined as one cycle at 72 ° C., and this cycle was performed 25 times.
RT-PC when AKSRS is used as reverse primer
The amount of R product was more than 4 times that when AKSRL was used as the reverse primer (data not shown). This RT-
From the results of PCR, it was concluded that the 5 'terminal sequence of Akabane virus S RNA was "... CACCUCGUGUGAUGA".

【0049】従って、forwardプライマー及びreverseプ
ライマーとしてAKSF19及びAKSRSを用いて得られたRT-PC
R産物を、TAクローニングキット(Invitrogen社)を
使用して直接プラスミドベクターpCRII中へクローニ
ングし、373SDNAシークエンサー(Applied Biosyst
ems社)を使用してその塩基配列を決定した。決定され
たcDNAの塩基配列を、配列番号1に示す。なお、配
列番号1記載の塩基配列は、ポジティブ鎖cDNAの塩
基配列により記載してある。
Therefore, RT-PCs obtained using AKSF19 and AKSRS as forward and reverse primers
The R product was cloned directly into the plasmid vector pCRII using a TA cloning kit (Invitrogen) and a 373S DNA sequencer (Applied Biosyst
ems) was used to determine its nucleotide sequence. The nucleotide sequence of the determined cDNA is shown in SEQ ID NO: 1. In addition, the base sequence of SEQ ID NO: 1 is described by the base sequence of positive strand cDNA.

【0050】〔実施例2〕プライマーの作製 実施例1で決定されたアカバネウイルスOBE-1株のS RNA
の塩基配列と既に公知であるアイノウイルスJaNAr28株
のS RNAの塩基配列(Akashi,H.ら Virus Research 1.51
-63 (1984))とを比較し、両者間で相同性の低い部分を
コンピュータープログラム(GENETYXプログラム(Softw
are Development社))を用いて検索した。この結果に
基づき、プライマーをOligo 1000 DNA Synthesizer(Be
ckman社)により合成した。合成したプライマーの塩基
配列、及び対応するウイルスS RNA中の位置を以下の表
1に示す。
Example 2 Preparation of Primers S RNA of Akabane Virus OBE-1 Strain Determined in Example 1
Nucleotide sequence and the already known nucleotide sequence of S RNA of the inovirus JaNAr28 strain (Akashi, H. et al. Virus Research 1.51
-63 (1984)), and the portion of low homology between the two was compared with a computer program (GENETYX program (Softw
are Development Co.)). Based on this result, primers were used for Oligo 1000 DNA Synthesizer (Be
ckman). The base sequences of the synthesized primers and the corresponding positions in the viral S RNA are shown in Table 1 below.

【0051】[0051]

【表1】 [Table 1]

【0052】〔実施例3〕ウイルスS RNA特異的プライ
マーを使用したRT-PCR及びnested PCRによるウイルスS
RNAの検出 (1)RNAの抽出 アカバネウイルスとしてOBE-1株を、アイノウイルスと
してJaNAr28株を使用した。
[Example 3] Virus S by RT-PCR and nested PCR using virus S RNA-specific primers
Detection of RNA (1) RNA extraction OBE-1 strain was used as Akabane virus and JaNAr28 strain was used as Ainovirus.

【0053】また、上記プライマーの特異性を確認する
ために、アカバネウイルス及びアイノウイルスと同一の
ウイルス群(シンブ(Simbu)血清群ウイルス)に属す
る5種のウイルス、すなわちDouglas(DOU)ウイルスのCS
IRO150株(Division of Animal Health, Australia)、
Peaton(PEA)ウイルスのCSIRO110株(Division of Anima
l Health, Australia)、Tinaroo(TIN)ウイルスのCSIRO
153株(Division of Animal Health, Australia)、Fac
ey's Paddock(FP)ウイルスのCh16129株(Berrimah Agri
cultural Research Center, Northern Territory, Aust
ralia)、及びThimiri(THI)ウイルスのCSIRO1株(Berri
mah Agricultural Research Center, Northern Territo
ry, Australia)を対照として使用した。5×106PFUの
各ウイルス感染培養液から、RNA STAT-50LS(TEL-TEST
社)及びSepaGene(三光純薬社)を使用して、各ウイルス
のRNAを抽出した。
In order to confirm the specificity of the primers, five kinds of viruses belonging to the same virus group (Simbu serogroup virus) as Akabane virus and Aino virus, namely, CS of Douglas (DOU) virus
IRO150 strain (Division of Animal Health, Australia),
Peaton (PEA) virus strain CSIRO110 (Division of Anima
l Health, Australia), Tinaroo (TIN) virus CSIRO
153 strains (Division of Animal Health, Australia), Fac
Ch16129 strain of ey's Paddock (FP) virus (Berrimah Agri
cultural Research Center, Northern Territory, Aust
ralia) and the CSIRO1 strain of the Thimiri (THI) virus (Berri
mah Agricultural Research Center, Northern Territo
ry, Australia) was used as a control. From 5 × 10 6 PFU of each virus-infected culture, RNA STAT-50LS (TEL-TEST
) And SepaGene (Sanko Junyaku) to extract RNA of each virus.

【0054】(2)RT-PCR及びnested PCRによるウイル
スS RNAの検出 上記7種のウイルスのRNAに対して、上記RT-PCR用プ
ライマーを使用したRT-PCRを実施した。RT-PCRは、Gene
Amp RNA PCRキット(Perkin-Elmer Cetus社)を使用し
て行った。RT-PCRは以下の条件で行った。
(2) Detection of virus S RNA by RT-PCR and nested PCR The RNAs of the above seven viruses were subjected to RT-PCR using the RT-PCR primers. RT-PCR
This was performed using an Amp RNA PCR kit (Perkin-Elmer Cetus). RT-PCR was performed under the following conditions.

【0055】すなわち、ランダムヘキサマー、RNaseイ
ンヒビター、MgCl2、4種のデオキシヌクレオチド及び逆
転写酵素を含有する総容量19μlの1× PCRバッファー
中に各ウイルスRNA1μlを混合し、室温で10分間、4
2℃で15分間、99℃で5分間、及び5℃で5分間インキュベ
ーションした。これに、バッファー、MgCl2及びTaqDNA
ポリメラーゼを追加して最終容量100μlとし、上記RT-P
CR用プライマーを用いて、94℃で30秒、55℃で30秒及び
72℃で1分の1サイクルを25サイクル行った。
That is, 1 μl of each virus RNA was mixed in a total volume of 19 μl of 1 × PCR buffer containing random hexamer, RNase inhibitor, MgCl 2 , four kinds of deoxynucleotides and reverse transcriptase, and incubated at room temperature for 10 minutes.
Incubation was performed at 2 ° C for 15 minutes, 99 ° C for 5 minutes, and 5 ° C for 5 minutes. Add buffer, MgCl 2 and TaqDNA
Add polymerase to a final volume of 100 μl, and add RT-P
Using primers for CR, 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 55 ° C and
One-half cycle was performed at 72 ° C. for 25 cycles.

【0056】RT-PCR反応液を72℃でさらに7分間保持し
た後、PCR産物をMagic PCR Preps(Promega社)によっ
て精製し、これをnested PCRの鋳型DNAとして使用し
た。nested PCRは、TaqDNAポリメラーゼ(Amersham社)
を用いて上記と同様の方法により行った。得られたPCR
産物を2%アガロースゲル中で電気泳動し、臭化エチジ
ウムにより染色した。制限酵素による消化は、製造業者
の指示する条件に従って行った。
After keeping the RT-PCR reaction solution at 72 ° C. for further 7 minutes, the PCR product was purified by Magic PCR Preps (Promega) and used as template DNA for nested PCR. Nested PCR is performed by Taq DNA polymerase (Amersham)
And the same method as described above. PCR obtained
The product was electrophoresed in a 2% agarose gel and stained with ethidium bromide. Digestion with restriction enzymes was performed according to the conditions specified by the manufacturer.

【0057】電気泳動の結果を図2に示す。なお、図2
中、レーンMは分子量マーカー、レーン1及び9はアイ
ノウイルス由来のRNA、レーン2及び10はアカバネウ
イルス由来のRNA、レーン3及び11はDOUウイルス由
来のRNA、レーン4及び12はFPウイルス由来のRN
A、レーン5及び13はPEAウイルス由来のRNA、レー
ン6及び14はTHIウイルス由来のRNA、レーン7及び1
5はTINウイルス由来のRNA、レーン8及び16は培養液
上清を表す。また、図2の上部の「RT」はRT-PCRの結果
を表し、「nested」はnested PCRの結果を表す。また、
図2中のAはアイノウイルスS RNA特異的プライマーを
使用した場合の結果を表し、BはアカバネウイルスS RN
A特異的プライマーを使用した場合の結果を表す。
FIG. 2 shows the results of the electrophoresis. Note that FIG.
In the middle, lane M is a molecular weight marker, lanes 1 and 9 are RNAs derived from inovirus, lanes 2 and 10 are RNAs derived from Akabane virus, lanes 3 and 11 are RNAs derived from DOU virus, and lanes 4 and 12 are RNAs derived from FP virus. RN
A, lanes 5 and 13 are RNAs derived from PEA virus, lanes 6 and 14 are RNAs derived from THI virus, lanes 7 and 1
5 represents RNA derived from TIN virus, and lanes 8 and 16 represent culture supernatant. “RT” at the top of FIG. 2 represents the result of RT-PCR, and “nested” represents the result of nested PCR. Also,
A in FIG. 2 shows the results when the inovirus S RNA-specific primer was used, and B shows the Akabane virus S RN.
The result when the A-specific primer was used is shown.

【0058】図2に示すように、アカバネウイルスS RN
A特異的プライマーを使用したRT-PCR及びnested PCRの
結果、アカバネウイルスRNA及びTINウイルスRNA
を用いた場合に増幅産物が検出された。そこで、両ウイ
ルスのRT-PCR産物を同定するために、両ウイルスのS RN
Aの塩基配列に基づいて、制限酵素(Hph I及びBst EI
I)を選択した。
As shown in FIG. 2, Akabane virus S RN
As a result of RT-PCR and nested PCR using A-specific primers, Akabane virus RNA and TIN virus RNA
The amplification product was detected when was used. Therefore, to identify the RT-PCR products of both viruses, the SRN
Based on the nucleotide sequence of A, restriction enzymes (Hph I and Bst EI
I) selected.

【0059】アカバネウイルスのRT-PCR産物は、Hph I
によってのみ消化されたが、TINウイルスのRT-PCR産物
は、Bst EIIによってのみ消化された。これにより、両
ウイルスのRT-PCR産物は識別された。また、アイノウイ
ルスS RNA特異的プライマーを使用したRT-PCR及びneste
d PCRの結果、RT-PCR産物及びnested PCR産物は、アイ
ノウイルス及びPEAウイルスの両方で検出された。
The RT-PCR product of Akabane virus was Hph I
The TIN virus RT-PCR product was digested only by Bst EII. As a result, RT-PCR products of both viruses were identified. RT-PCR using inovirus S RNA-specific primers and neste
As a result of dPCR, RT-PCR products and nested PCR products were detected in both inovirus and PEA virus.

【0060】そこで、両ウイルスのnested PCR産物を同
定するために、3種の制限酵素(Ava II、Eco RI、及び
Hae II)を選択した。PEAウイルスのnested PCR産物
は、制限酵素(Ava II、Eco RI、及びHae II)により消
化されなかったが、アイノウイルスのnested PCR産物
は、制限酵素(Ava II、Eco RI、及びHae II)により消
化された。これにより、両ウイルスのnested PCR産物は
識別された。以上のように、ウイルスS RNA特異的プラ
イマーによるRT-PCR及びnested PCRと制限断
片長多型とを組み合わせることにより、アカバネウイル
スS RNAおよびアイノウイルスS RNAを感度よく検
出でき、また両者を容易に識別できることが示された。
Therefore, in order to identify nested PCR products of both viruses, three types of restriction enzymes (Ava II, Eco RI, and
Hae II) was selected. The nested PCR products of PEA virus were not digested by restriction enzymes (Ava II, Eco RI, and Hae II), whereas the nested PCR products of Ainovirus were digested by restriction enzymes (Ava II, Eco RI, and Hae II). Digested. This identified the nested PCR products of both viruses. As described above, by combining RT-PCR and nested PCR with viral S RNA-specific primers and restriction fragment length polymorphism, Akabane virus S RNA and Ainovirus S RNA can be detected with high sensitivity, and both can be easily detected. It was shown that it could be identified.

【0061】〔実施例4〕マウスへの応用 野外応用を目指すため、アカバネウイルスおよびアイノ
ウイルスを6週齢マウスの脳内及び腹腔内に接種した。
この際、脳内には各ウイルス液0.1ml(105.5 TCID50/m
l)を、また腹腔内には同ウイルス液0.2mlを接種した。
接種5日後にマウスを安楽殺させ、臓器(脳、心臓、
肺、脾臓、腎臓、肝臓)及び血液を採取した。
Example 4 Application to Mice To aim for field application, Akabane virus and Aino virus were inoculated into the brain and intraperitoneal cavity of 6-week-old mice.
At this time, 0.1 ml of each virus solution (10 5.5 TCID 50 / m
l) and 0.2 ml of the virus solution was inoculated intraperitoneally.
Five days after inoculation, mice were euthanized and their organs (brain, heart,
Lung, spleen, kidney, liver) and blood were collected.

【0062】これらの臓器及び血液中のウイルスを検出
するため、ウイルス力価測定を行うとともに、ウイルス
RNAを抽出し、ウイルスS RNA特異的プライマーを使
用したRT-PCR及びnested PCRを行った。なお、各臓器及
び血液サンプルからのRNAの抽出は、RNAzolB(TEL-T
EST社)を用いて行った。その結果を、以下の表2に示
す。
In order to detect the virus in these organs and blood, virus titer was measured, virus RNA was extracted, and RT-PCR and nested PCR using virus S RNA-specific primers were performed. The extraction of RNA from each organ and blood sample was performed using RNAzolB (TEL-T
EST). The results are shown in Table 2 below.

【0063】[0063]

【表2】 [Table 2]

【0064】表2に示すように、ウイルス力価測定によ
れば、アカバネウイルス及びアイノウイルスの双方とも
脳内接種マウスの脳サンプルからのみ検出された。これ
に対して、nested PCRによれば、これ以外の多数の臓器
からも各ウイルスのゲノムS RNAを検出することができ
た。これにより、ウイルスS RNA特異的プライマーを使
用したnested PCRによるウイルスS RNA検出の高感度が
証明された。
As shown in Table 2, according to the virus titration, both Akabane virus and Aino virus were detected only from the brain samples of mice inoculated into the brain. On the other hand, according to nested PCR, genomic SRNA of each virus could be detected from many other organs. This demonstrated the high sensitivity of virus S RNA detection by nested PCR using virus S RNA specific primers.

【0065】[0065]

【発明の効果】本発明により、ウシ、ヒツジ、ヤギ等の
動物におけるアカバネウイルス感染及びアイノウイルス
感染を簡易かつ高精度に判別できる方法を提供される。
本発明によれば、従来、流行予測や診断が困難であった
アカバネウイルス及びアイノウイルス感染症の流行予測
や診断が簡易かつ高精度にでき、これによりウイルス感
染に対して早期に対処(ワクチン接種等)できる。
According to the present invention, there is provided a method for easily and accurately discriminating Akabane virus infection and Ainovirus infection in animals such as cows, sheep and goats.
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the epidemic prediction and diagnosis of Akabane virus and Ainovirus infection, which had been difficult to predict and diagnose in the past, can be performed easily and with high accuracy, thereby coping with the virus infection early (vaccine vaccination). Etc.)

【0066】[0066]

【配列表】[Sequence list]

配列番号:1 配列の長さ:858 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA 起源 生物名:アカバネウイルスOBE-1株 配列 AGTAGTGAAC TCCACTATTA ACTACGCATT GCAATGGCAA ATCAATTCAT TTTCAACGAT 60 GTTCCACAAC GGAATGCAGC TACATTTAAT CCGGATGCAG GGTATGTGGC ATTTATCAGT 120 AAGTATGGGC AGCAGCTCAA CTTTACTGTT GCTAGAGTCT TCTTCCTCAA CCAGAAGAAG 180 GCCAAGATGG TCTTACATAA GACGCCACAA CCAAGTGTCG ATCTTACTTT TGCAGGGGTC 240 AAATTTACAG TGGTTAATAA CCATTTTCCC CAGTACACTG CAAATCCAGT GTCAGACACT 300 GCCTTTACGC TTCACCGCAT CTCGGGCTAC TTAGCTCGCT GGGTTGCTGA GCAGTGCAAG 360 GCTAATCAGA TCAAATTTGC AGAGGCAGCT GCCACAATTG TGATGCCACT GGCTGAGGTG 420 AAGGGTTGCA CTTGGAGTGA CGGGTATGCA ATGTACCTGG GATTTGCCCC TGGTGCTGAG 480 ATGTTTCTGG AAACCTTTGA GTTTTACCCA CTGGTTATCG ACATGCACCG TGTGATAAAG 540 GATGGAATGG ATGTCAACTT CATGAGGAAG GTCTTACGTC AGAGGTATGG GCAGCTGACT 600 GCAGAAGAGT GGATGACATC TAAGTTGGAC GCAGTCAAGG CTGCATTTGG CTCAGTTGCC 660 CAAATATCCT GGGCTAAATC TGGCTTCTCA CCTGCAGCTA GAGCTTTCCT GGCTCAATTT 720 GGTATCCAGA TCTAAGCTTA ACTGATTCTC CAGTTTTTTC TTTTTTCTCT TCCTAAGTGC 780 ACCATGTCTA TGTGGTGCAC ACCTTTGTTC AGCTGCTTGG ATTTTATTGT TTATAGTTAA 840 TTAGTGGAGC ACACTACT 858 SEQ ID NO: 1 Sequence length: 858 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: cDNA Origin Organism name: Akabane virus OBE-1 strain Sequence AGTAGTGAAC TCCACTATTA ACTACGCATT GCAATGGCAA ATCAATTCAT TTTCAACGAT 60 GTTCCACAAC GGAATGCAGC TACATTTAAT CCGGATGCAG GGTATGTGGC ATTTATCAGT 120 AAGTATGGGC AGCAGCTCAA CTTTACTGTT GCTAGAGTCT TCTTCCTCAA CCAGAAGAAG 180 GCCAAGATGG TCTTACATAA GACGCCACAA CCAAGTGTCG ATCTTACTTT TGCAGGGGTC 240 AAATTTACAG TGGTTAATAA CCATTTTCCC CAGTACACTG CAAATCCAGT GTCAGACACT 300 GCCTTTACGC TTCACCGCAT CTCGGGCTAC TTAGCTCGCT GGGTTGCTGA GCAGTGCAAG 360 GCTAATCAGA TCAAATTTGC AGAGGCAGCT GCCACAATTG TGATGCCACT GGCTGAGGTG 420 AAGGGTTGCA CTTGGAGTGA CGGGTATGCA ATGTACCTGG GATTTGCCCC TGGTGCTGAG 480 ATGTTTCTGG AAACCTTTGA GTTTTACCCA CTGGTTATCG ACATGCACCG TGTGATAAAG 540 GATGGAATGG ATGTCAACTT CATGAGGAAG GTCTTACGTC AGAGGTATGG GCAGCTGACT 600 GCAGAAGAGT GGATGACATC TAAGTTGGAC GCAGTCAAGG CTGCATTTGG CTCAGTTCTC TGCAGCATATCTC CA CCTGCAGCTA GAGCTTTCCT GGCTCAATTT 720 GGTATCCAGA TCTAAGCTTA ACTGATTCTC CAGTTTTTTC TTTTTTCTCT TCCTAAGTGC 780 ACCATGTCTA TGTGGTGCAC ACCTTTGTTC AGCTGCTTGG ATTTTATTGT TTATAGTTAA 840 TTAGTGGAGC ACACTACT 858

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図1】アカバネウイルスS RNAの塩基配列とアイノウ
イルスS RNAの塩基配列とを比較した図である。
FIG. 1 is a diagram comparing the nucleotide sequence of Akabane virus S RNA with the nucleotide sequence of Ainovirus S RNA.

【図2】RT-PCR産物及びnested PCR産物の電気泳動の結
果を表す写真である。
FIG. 2 is a photograph showing the results of electrophoresis of an RT-PCR product and a nested PCR product.

フロントページの続き (56)参考文献 蛋白質 核酸 酵素、Vol.41[5 ](1996)p.696−699 Virus Res.,Vol.50 [2](1997)p.205−213 J.Vet.Med.Sci.,Vo l.59[9](1997)p.837−840 Res.Virol.,Vol.146 [5](1995)p.355−362 臨床と微生物,Vol.24[5 ](1997)p.557−565 Virus Research,Vo l.1(1984)p.51−63 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12N 15/40 - 15/50 C12Q 1/68 BIOSIS(DIALOG) GenBank/EMBL/DDBJ/P IR/SwissProt/Genese q JICSTファイル(JOIS) MEDLINE(STN) WPI(DIALOG)Continued on the front page (56) References Protein Nucleic Acid Enzyme, Vol. 41 [5] (1996) p. 696-699 Virus Res. , Vol. 50 [2] (1997) p. 205-213J. Vet. Med. Sci. , Vol. 59 [9] (1997) p. 837-840 Res. Virol. , Vol. 146 [5] (1995) p. 355-362 Clinical and Microbial Studies, Vol. 24 [5] (1997) p. 557-565 Virus Research, Vol. 1 (1984) p. 51-63 (58) Fields surveyed (Int. Cl. 7 , DB name) C12N 15/40-15/50 C12Q 1/68 BIOSIS (DIALOG) GenBank / EMBL / DDBJ / PIR / SwissProt / Geneseq JICST file (JOIS) MEDLINE (STN) WPI (DIALOG)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項1】 以下の工程: (a)対象動物の細胞及び/又は血液からRNAを含有
する試料を調製する工程、 (b)上記試料に対して、次のプライマー: 5'− TAACTACGCATTGCAATGGC −3' 5'− TAAGCTTAGATCTGGATACC −3' を用いたRT-PCRを行う工程、及び (c)工程(b)で得られる増幅断片の有無により、対
象動物がアカバネウイルスに感染しているか否かを判別
する工程、 を含んでなることを特徴とする、アカバネウイルス感染
の判別方法。
1. The following steps: (a) a step of preparing a sample containing RNA from cells and / or blood of a target animal; and (b) the following primer for the sample : 5′-TAACTACGCATTGCAATGGC-3 Based on the step of performing RT-PCR using ' 5'-TAAGCTTAGATCTGGATACC-3' and (c) the presence or absence of the amplified fragment obtained in step (b), it is determined whether or not the target animal is infected with Akabane virus. A method for determining Akabane virus infection, comprising the steps of:
【請求項2】 前記工程(b)において、RT-PCR産物に
対して、次のプライマー: 5'− GAAGGCCAAGATGGTCTTAC −3' 5'− GGCATCACAATTGTGGCAGC −3' を用いたnested PCRをさらに行うことを特徴とする請求
項1記載の判別方法。
2. In the step (b), the RT-PCR product is further subjected to nested PCR using the following primers: 5'-GAAGGCCAAGATGGTCTTAC- 3'5'-GGCATCACAATTGTGGCAGC-3 '. Request
Item 1. The determination method according to Item 1 .
【請求項3】 前記工程(c)において、工程(b)で
得られる増幅断片を制限酵素で処理し、その制限断片長
多型により、対象動物がアカバネウイルスに感染してい
るか否かを判別することを特徴とする請求項1又は2
載の判別方法。
3. In the step (c), the amplified fragment obtained in the step (b) is treated with a restriction enzyme, and whether the target animal is infected with the Akabane virus is determined based on the restriction fragment length polymorphism. The method according to claim 1, wherein the determination is performed.
【請求項4】 以下の工程: (a)対象動物の細胞及び/又は血液からRNAを含有
する試料を調製する工程、 (b)上記試料に対して、次のプライマー: 5'− CCCAACTCAATTTCGATACC −3' 5'− TTTGGAACACCATACTGGGG −3' を用いたRT-PCRを行う工程、及び (c)工程(b)で得られる増幅断片の有無により、対
象動物がアイノウイルスに感染しているか否かを判別す
る工程、 を含んでなることを特徴とする、アイノウイルス感染の
判別方法。
4. The following steps: (a) a step of preparing a sample containing RNA from cells and / or blood of a target animal; and (b) a primer with the following primer: 5'-CCCAACTCAATTTCGATACC-3 Based on the step of performing RT-PCR using ' 5'-TTTGGAACACCATACTGGGG-3' and (c) the presence or absence of the amplified fragment obtained in step (b), it is determined whether or not the target animal is infected with an inovirus. A method for determining inovirus infection, comprising the steps of:
【請求項5】 前記工程(b)において、RT-PCR産物に
対して、次のプライマー: 5'− CCATCGTCTCTCAGGATATC −3' 5'− ACAGCATTGAAGGCTGCACG −3' を用いたnested PCRをさらに行うことを特徴とする請求
項4記載の判別方法。
5. wherein in the step (b), with respect to RT-PCR products, the following primers: and characterized by further performing nested PCR using 5'- CCATCGTCTCTCAGGATATC -3 '5'- ACAGCATTGAAGGCTGCACG -3' Request
Item 4. The determination method according to Item 4 .
【請求項6】 前記工程(c)において、工程(b)で
得られる増幅断片を制限酵素で処理し、その制限断片長
多型により、対象動物がアイノウイルスに感染している
か否かを判別することを特徴とする請求項4又は5記載
の判別方法。
6. in the step (c), to process the amplified fragments obtained in step (b) with a restriction enzyme, by its restriction fragment length polymorphism, determines whether the target animal is infected with Aino virus The method according to claim 4, wherein the determination is performed.
JP10442098A 1998-04-15 1998-04-15 Total nucleotide sequence of Akabane virus S RNA and primer sequences for abnormal production related virus disease gene diagnosis Expired - Lifetime JP3227475B2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP10442098A JP3227475B2 (en) 1998-04-15 1998-04-15 Total nucleotide sequence of Akabane virus S RNA and primer sequences for abnormal production related virus disease gene diagnosis

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP10442098A JP3227475B2 (en) 1998-04-15 1998-04-15 Total nucleotide sequence of Akabane virus S RNA and primer sequences for abnormal production related virus disease gene diagnosis

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH11290080A JPH11290080A (en) 1999-10-26
JP3227475B2 true JP3227475B2 (en) 2001-11-12

Family

ID=14380212

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP10442098A Expired - Lifetime JP3227475B2 (en) 1998-04-15 1998-04-15 Total nucleotide sequence of Akabane virus S RNA and primer sequences for abnormal production related virus disease gene diagnosis

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP3227475B2 (en)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106978512B (en) * 2017-05-24 2020-12-04 广西壮族自治区兽医研究所 RT-PCR primer for detecting bamboo rat source acarbovirus and kit thereof

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J.Vet.Med.Sci.,Vol.59[9](1997)p.837−840
Res.Virol.,Vol.146[5](1995)p.355−362
Virus Res.,Vol.50[2](1997)p.205−213
Virus Research,Vol.1(1984)p.51−63
臨床と微生物,Vol.24[5](1997)p.557−565
蛋白質 核酸 酵素、Vol.41[5](1996)p.696−699

Also Published As

Publication number Publication date
JPH11290080A (en) 1999-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110423844B (en) Methods and compositions for detecting BK virus
WO2002099130A2 (en) Virus detection using degenerate pcr primers
EP0633321A1 (en) HCV related oligonucleotides and uses thereof in methods for detecting and genotyping of HCV, and kits used in these methods
Callahan et al. A new class of genetically transmitted retravirus isolated from Mus cervicolor.
JP3227475B2 (en) Total nucleotide sequence of Akabane virus S RNA and primer sequences for abnormal production related virus disease gene diagnosis
CN114480411B (en) COL4A5 pathogenic mutant gene of Alport syndrome patient and detection reagent thereof
JP5315519B2 (en) Koi herpesvirus (KHV) detection method
Ermine et al. Polymerase chain reaction amplification of rabies virus nucleic acids from total mouse brain RNA
JP3494509B2 (en) Nucleic acid synthesis method
KR20060116825A (en) Detection of mutations in a gene associated with resistance to viral infection, oas1
JPH09107970A (en) Nucleic acid derived from hepatitis virus c and detection of virus using the same
JP2785164B2 (en) Human papillomavirus detection method
CN116064765B (en) Application of substance for detecting LOXL1gene mutation in preparation of hepatic fibrosis patient molecular typing product
JP3103882B2 (en) A base sequence specific to Babesia obata and a method for detecting Babesia obata using it
KR102012212B1 (en) Primer set for detecting Panicum distortion mosaic virus and method for detecting said viruses using the same
JP3038433B2 (en) Purification method and gene of Yamanoimo nematode mosaic virus
KR100386135B1 (en) Detection of Nephrotic Hemorrhagic Fever Virus
JP4194147B2 (en) TT virus genotyping method
JP3069691B2 (en) Japanese citrus viroid 2 (JCVd2) gene
JP2869018B2 (en) Detection method of renal symptomatic hemorrhagic fever virus
JP2004516018A (en) Mutations in the ferroportin 1 gene associated with hereditary hemochromatosis
JPH07250700A (en) Simple quantification of nucleic acid by competitive pcr process
KR20230048760A (en) Primer sets for diagnosing of novel garlic virus and diagnostic methods using thereof
JP3373549B2 (en) Hepatitis virus gene
JP2022519345A (en) CMI sequences as early markers for future development of cancer, atherosclerosis, diabetes and CNS diseases and as targets for the treatment and prevention of these diseases

Legal Events

Date Code Title Description
S533 Written request for registration of change of name

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

S533 Written request for registration of change of name

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

EXPY Cancellation because of completion of term