JP3155448B2 - Method of manufacturing a L- amino acid or a salt thereof - Google Patents

Method of manufacturing a L- amino acid or a salt thereof

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【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 [0001]

【産業上の利用分野】本発明は、L−アミノ酸またはその塩の製造方法に関する。 The present invention relates to a process for the preparation of L- amino acid or a salt thereof.

【0002】 [0002]

【従来の技術】L−アミノ酸は、各種医薬中間体や食品添加物として有用な化合物である。 BACKGROUND ART L- amino acids are useful compounds as various pharmaceutical intermediates and food additives. こうしたなか、化学的に合成されたアミノ酸のラセミ体から該L−アミノ酸を選択的に得る有利な方法として、このラセミ体を構成する各アミノ酸のアミノ基を保護基で一旦修飾し、次いで、酵素反応により、該アミノ基が保護されたアミノ酸のラセミ体の内のL体の保護基のみを脱離させ、上記目的物を採取する方法が考えられる。 Under these circumstances, as an advantageous method for obtaining the racemic chemically synthesized amino acids selectively the L- amino acid, once modified amino group of each amino acid constituting the racemate with a protecting group, then the enzyme the reaction by, only the L-form protecting groups of racemic amino acids the amino group is protected desorbed method for collecting the target compound can be considered. その際、上記アミノ基の保護基としては、その汎用性から、下記一般式(I) In that case, the protecting group of the amino group, from its versatility, the following general formula (I)

【0003】 [0003]

【化2】 ## STR2 ##

【0004】(但し、Rはアルキル基またはベンジル基である。)で示される基を利用することが考えられる。 [0004] (wherein, R is an alkyl group or a benzyl group.) It is conceivable to use a group represented by.

【0005】ここで、上記一般式(I)で示される基でアミノ基が保護されたアミノ酸を基質とし、その保護基を酵素作用により加水分解して脱離させアミノ酸を得る方法としては、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー(Agric.Biol.Che [0005] Here, as a method for obtaining the amino acid was the amino acid which amino group is protected by groups represented by the general formula (I) as a substrate, it is hydrolyzed desorbed protecting group by enzymatic action, Agri Cultural and biological chemistry (Agric.Biol.Che
m. m. ),49巻,3643(1985年)に記載される方法が公知である。 ), Vol. 49, it is known a method described in 3643 (1985). 即ち、この刊行物には、N−ベンジルオキシカルボニル−D,L−アミノ酸またはN−t− That is, in this publication, N- benzyloxycarbonyl -D, L-amino acids or N-t-
ブトキシカルボニル−D,L−アミノ酸からL体のみを酵素的に分解する方法が示されている。 Butoxycarbonyl -D, to decompose from L- amino acids L form only enzymatically are shown.

【0006】 [0006]

【発明が解決しようとする課題】ところで、この方法によれば、反応は、pH5.8の酸性条件下、反応温度5 [SUMMARY OF THE INVENTION Incidentally, according to this method, reaction under acidic conditions of pH 5.8, the reaction temperature of 5
5度、反応時間10分で行っている。 5 degrees, are carried out in a reaction time of 10 minutes. ところが、このような酸性で高温の条件下に上記一般式(I)で示される基でアミノ基が保護されたアミノ酸を晒した場合、該保護基は、化学的に加水分解して脱離するようになる。 However, when exposed amino acids amino group is protected by groups represented by the above general formula under the conditions of high temperature such acid (I), the protecting group is eliminated by chemical hydrolysis so as to. 従って、上記ラセミ体である基質を、かかる酸性、高温下の条件の反応に供した場合、反応を長時間持続させると、そのD体の化学的な加水分解も生じ、結果としてD Accordingly, the substrate is the above racemate and such acidic, when subjected to the reaction of the high temperature conditions, maintained for a long time reaction, occur chemical hydrolysis of the D-form, D as a result
−アミノ酸も副生してくる問題が生じていた。 - amino acids are also byproduct come a problem has occurred. このようにD−アミノ酸が副生されると、反応物からのL−アミノ酸の単離に煩雑な精製操作を施すことが必要になる。 With such D- amino acid by-product, it is necessary to perform a complicated purification operation to isolate the L- amino acid from the reaction product.

【0007】こうした背景にあって本発明は、アミノ基が保護されたL−アミノ酸のみを酵素的に加水分解してL−アミノ酸を製造する方法において、D−アミノ酸の副生を抑制することを目的とする。 [0007] There are the invention this background, only the L- amino acid is an amino group is protected in a method of producing enzymatically hydrolyze L- amino acids, to suppress by-production of D- amino acids for the purpose.

【0008】 [0008]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる欠点を解決すべく鋭意検討を続けてきた。 In order to achieve the object of the present inventors have continued intensive studies in order to solve the above drawbacks. その結果、前記基質混合物に対し、特定のpH及び温度の範囲で、特定の微生物の培養液、菌体または菌体処理物を作用させることにより、上記課題が解決できることを見いだし、本発明を完成するに至った。 As a result, with respect to the substrate mixture, the range of specific pH and temperature, cultures of a particular microorganism, by the action of bacteria or treated microbial cell, found that the above problems can be solved, completed the present invention This has led to the.

【0009】即ち、下記一般式(I) [0009] In other words, the following general formula (I)

【0010】 [0010]

【化3】 [Formula 3]

【0011】(但し、Rはアルキル基またはベンジル基である。)で示される基でアミノ基が保護されたアミノ酸またはその塩のD体とL体との混合物に作用させた時、そのL体を選択的に加水分解してL−アミノ酸またはその塩を生成する能力を有する、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、バシルス属、シゾサッカロマイセス属に属する微生物、またはその培養液もしくは菌体処理物を、pHが6〜10で、温度が10〜50℃ [0011] (wherein, R represents an alkyl group or a benzyl group.) When allowed to act on a mixture of amino acids the amino group is protected with a group represented by or D-form and L-form of the salt thereof, the L-form selectively having hydrolyzing ability to produce L- amino acids or a salt thereof, Corynebacterium, the genus Microbacterium, the genus Bacillus, Schizosaccharomyces microorganism belonging to Streptomyces genus, or a culture broth or a treated microbial cell, things, a pH of 6 to 10, temperature 10 to 50 ° C.
の条件下で、該一般式(1)で示される基でアミノ基が保護されたアミノ酸またはその塩のD体とL体の混合物に作用させ、生成したL−アミノ酸またはその塩を採取することを特徴とするL−アミノ酸またはその塩の製造方法である。 Under the conditions of, harvesting allowed to act on a mixture of D-form and L-form of the amino group is protected amino acid or a salt thereof represented by the general formula (1), the resulting L- amino acid or a salt thereof which is a method for producing L- amino acids or salts thereof, wherein.

【0012】本発明において、一般式(I)で示される基においてRは、アルキル基またはベンジル基である。 [0012] In the present invention, R in the group represented by the formula (I), an alkyl group or a benzyl group.
ここで、上記アルキル基としては、特に制限されるものではないが、好適にはメチル基、エチル基、イソプロピル基、t−ブチル基等の炭素数1〜4のものを挙げることができる。 Here, as the alkyl group, it is not particularly limited, preferably mention may be made of 1 to 4 carbon atoms such as a methyl group, an ethyl group, an isopropyl group, t- butyl group.

【0013】本発明において、一般式(I)で示される保護基で保護されるアミノ酸としては、公知のものが何等制限なく用いられる。 [0013] In the present invention, the amino acid is protected with a protecting group represented by formula (I), those known can be used without any limitation. これらを具体的に例示すると、 When these specific examples,
グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、シスチン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、 Glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, cysteine, cystine, methionine, asparagine, glutamine, aspartic acid,
グルタミン酸、リジン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、トリプトファン、ヒスチジン等を挙げることができる。 Glutamic acid, lysine, arginine, phenylalanine, can be mentioned tyrosine, proline, hydroxyproline, tryptophan, histidine and the like. またこれらのアミノ酸の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等を挙げることができる。 As the salts of these acids include sodium salts, potassium salts, ammonium salts and the like.

【0014】本発明では、一般式(I)で示される基でアミノ基が保護されたアミノ酸またはその塩のD体とL [0014] In the present invention, the general formula (I) an amino acid amino group is protected with a group represented by or D-form of a salt thereof with L
体の混合物(以下、単に基質混合物とも言う)に、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、バシルス属、シゾサッカロマイセス属に属し、該基質混合物に作用させた時、そのL体を選択的に加水分解してL−アミノ酸またはその塩を生成する能力を有する微生物、またはその培養液もしくは菌体処理物を作用させる。 Mixtures of the body (hereinafter, simply referred to as substrate mixture), the genus Corynebacterium, the genus Microbacterium, the genus Bacillus, belonging to Schizosaccharomyces genus, when allowed to act on said substrate mixture and selectively the L-isomer microorganism having hydrolyzing ability to produce L- amino acids or a salt thereof, or exert their culture or treated bacterial cells. それにより、該基質混合物は、そのL体のみが加水分解され、 Thereby, the substrate mixture, only the L-form is hydrolyzed,
選択的にL−アミノ酸またはその塩を得ることが可能になる。 It is possible to obtain a selectively L- amino acids or a salt thereof.

【0015】その際、本発明では、かかる酵素反応を実施する媒体のpHを6〜10好適には6〜9、温度を1 [0015] At this time, in the present invention, the 6-10 preferably the pH of the medium to carry out such enzyme reactions 6-9, a temperature 1
0〜50℃好適には15〜45℃にする。 0 to 50 ° C. Suitably to 15 to 45 ° C.. 即ち、前記特定の菌体に由来する加水分解の酵素反応は、至適pHが6〜10、多くは6〜9の間にある。 In other words, the enzymatic reaction of hydrolysis from the specific cell, the optimum pH of 6-10, most is between 6-9. 従って、上記の如く反応媒体のpHをこの範囲にすることにより、L−アミノ酸またはその塩は良好な反応速度で得られる。 Therefore, by this range the pH of the reaction medium as described above, L- amino acids or salts thereof obtained in good reaction rates. そして、かかるpH範囲で、且つ上記穏和な反応温度で反応を行うことにより、基質混合物中のD体のアミノ酸において前記保護基が化学的な加水分解により脱離したり、 Then, in such a pH range, or and by conducting the reaction in the mild reaction temperatures, the protective group in the amino acid D-form of the substrate mixture is eliminated by chemical hydrolysis,
一旦生成したL−アミノ酸がラセミ化したりすることが抑制される。 Once generated L- amino acids or to racemization is suppressed. その結果、本発明では、L−アミノ酸またはその塩をD体が副生されることなく良好に得ることができる。 As a result, in the present invention, the L- amino acid or a salt thereof can be obtained satisfactorily without D-form is produced as a by-product.

【0016】ここで、反応媒体のpHが6より小さい場合、反応速度が低下する上に、化学的加水分解反応が促進されるようになり、また、このpHが10より大きい場合、同じく反応速度が低下する上に、生成したL−アミノ酸やその塩がラセミ化を起こす危険性が生じるようになる。 [0016] Here, if the pH is less than 6 of the reaction medium, on the reaction rate decreases, become chemical hydrolysis reaction is accelerated, and when the pH is greater than 10, also the reaction rate There over to drop, resulting L- amino acid or a salt thereof so arises risk of causing racemization. 一方、反応媒体の温度が10℃より小さい場合、十分な反応速度が得られなくなり、また、この温度が50℃より大きい場合、化学的加水分解反応が促進されるようになる他、酵素が失活する危険性も生じてくる。 On the other hand, when the temperature of the reaction medium is 10 ° C. less than sufficient reaction rate can not be obtained, and when the temperature is higher than 50 ° C., in addition to chemical hydrolysis reaction is to be accelerated, the enzyme lost risk of active even arise.

【0017】本発明において、上記基質混合物におけるD体とL体の混合割合は、特に限定されるものでない。 [0017] In the present invention, the mixing ratio of D-form and L-form in the substrate mixture is not particularly limited.
通常は、このD体とL体とが等量程度混合する、いわゆるラセミ体が使用される。 Normally, the the D-form and L-form is mixed about equal amounts, so-called racemate is used.

【0018】一方、本発明において、上記微生物としては、前記性状を有するものであれば、何等制限なく使用できる。 Meanwhile, in the present invention, examples of the microorganism, as long as it has the properties, what etc. without limitation can be used. 具体的には、コリネバクテリウム アクアティカム(Corynebacterium aquaticum IFO12154)、ミクロバクテリウム アルボレッセンス(Microbacterium arbo Specifically, Corynebacterium aquaticum (Corynebacterium aquaticum IFO12154), micro Corynebacterium arbovirus Re' sense (Microbacterium arbo
rescens IFO3750)、バシルス スファエリカス(Bacill rescens IFO3750), Bacillus sphaericus (Bacill
us sphaericus IFO3525)、シゾサッカロマイセス ポンベ(Schizosaccharomyces pombe IFO0358)等が好ましく用いられる。 us sphaericus IFO3525), Schizosaccharomyces pombe (Schizosaccharomyces pombe IFO0358) are preferably used.

【0019】上記の微生物を培養するにあたって使用する培地としては、公知のものが使用できる。 [0019] As a medium used when culturing the microorganisms, known materials can be used. 例えば、グルコース、シュクロース、フラクトース、グリセロール、ソルビトール、廃糖蜜、可溶性でんぷん等の炭素源、肉エキス、酵母エキス、ポリペプトン、硝酸塩類、 For example, glucose, sucrose, fructose, glycerol, sorbitol, molasses, carbon sources such as soluble starch, meat extract, yeast extract, polypeptone, nitrates,
アンモニウム塩類等の窒素源、及びリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸コバルト等の無機塩類を含有するものであれば何等問題はない。 Nitrogen sources such as ammonium salts, and the potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, sodium chloride, any problem is not as long as it contains magnesium sulfate, iron sulfate, inorganic salts such as cobalt sulfate.

【0020】培地の形態は液体、固体のいずれでもよい。 The medium in the form may be either a liquid, solid. また、培養の方法は静置培養、振とう培養、通気攪はん培養のいずれでもよいが、大量培養には通気攪はん培養による液体培養が適している。 Further, the method of culture stationary culture, shaking culture, may be any of aeration Stirring culture, liquid culture is suitable by insufflation Stirring culture for mass culture. 培養温度は、10〜 The culture temperature is 10 to
50℃、好ましくは15〜45℃で、通常10〜48時間培養する。 50 ° C., preferably at 15 to 45 ° C., cultured usually 10 to 48 hours.

【0021】本発明において、前記基質混合物に上記微生物、またはその培養液もしくは菌体処理物を作用させる方法は、微生物を利用した酵素反応において通常行われている基質への作用方法が何等制限なく採用される。 In the present invention, a method for applying a said substrate mixture to the microorganism or culture broth or the treated bacterial cells thereof, a microorganism usually without any limitation process action to the substrate being carried out in an enzyme reaction using It is adopted.
例えば、前記微生物の培地に上記基質混合物を添加することにより、作用させる方法が挙げられる。 For example, by adding the substrate mixture on a medium of the microorganism, and a method to act. この場合、 in this case,
基質混合物は、最初から培地に加えても良いし、培養途中で添加してもよい。 Substrate mixture, to initially from may be added to the medium, may be added during culture.

【0022】また、反応を阻害しない無機または有機の溶媒中、好ましくは水性溶媒中において、基質混合物に前記微生物、またはその培養液もしくは菌体処理物を作用させても良い。 Further, inorganic or organic solvent does not inhibit the reaction, preferably in an aqueous solvent, wherein the microorganism to the substrate mixture, or a culture broth or the treated bacterial cells may be allowed to act. なお、本発明において菌体処理物とは、例えば洗浄菌体、乾燥菌体、菌体磨砕物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物あるいは菌体抽出物等を精製して得た酵素等が特に制限されることなく使用される。 Note that the treated microbial cell in the present invention, for example, washed cells, dried cells, bacterial cell ground product, autolysate of cells, and purified the sonicates of bacterial cells or cell extract, etc. the resulting enzyme or the like is used without any particular limitation. ここで、菌体、菌体抽出物、該菌体抽出物を精製して得た酵素等は、公知の菌体、酵素の固定化方法により固定化したものを用いることもできる。 Here, cells, cell extracts, enzyme or the like obtained by purifying the microbial cells extract, known cells, the method for immobilizing enzymes can also be used as immobilized.

【0023】本発明において、このようにして微生物、 [0023] In the present invention, the microorganisms in this way,
またはその培養液もしくは菌体処理物を作用させる際の基質混合物の濃度は、特に制限されるものではない。 Or the concentration of substrate mixture during the action of the culture broth or the treated bacterial cells is not particularly limited. 通常、0.01〜20重量%の範囲、好ましくは0.05 Usually, 0.01 to 20 wt%, preferably in the range of 0.05
〜10重量%から適宜採択すればよい。 It may be selected as needed from 10 wt%.

【0024】また、本発明において、基質混合物に微生物、またはその培養液もしくは菌体処理物を作用させる際の微生物や菌体処理物の濃度は、菌体処理物の精製度等の違いにより一概には決定することはできないが、通常、タンパク質量で0.05〜10重量%の範囲から適宜選択される。 Further, in the present invention, the concentration of microorganisms and treated bacterial cells when the action of microorganisms or culture or treated bacterial cells thereof, the substrate mixture, the difference in purity, etc. of the treated bacterial cells flatly It can not be determined in, usually selected from a range of 0.05 to 10% by weight protein content. このとき、基質混合物と酵素との接触をよくするためにトリトン(半井化学社製)、ノニオン(日本油脂製)、スパン(関東化学製)等の界面活性剤を添加することも可能である。 At this time, Triton (Nakarai Chemical Co., Ltd.) in order to improve the contact between the substrate mixture and the enzyme, nonionic (manufactured by NOF), it is also possible to add a surfactant such as Span (product of Kanto Chemical). なお、作用時間については、基質濃度及び作用する菌株の種類によって決まるため一概に決めることはできないが、通常3〜100時間作用させれば十分である。 Incidentally, the operation time can not be determined unconditionally because depends on the type of strain that substrate concentration and action, it is sufficient to act normally 3 to 100 hours.

【0025】以上により、基質混合物の加水分解反応を行った後、生成したL−アミノ酸を定量すれば良い。 The [0025] above, after the hydrolysis of the substrate mixture, the resulting L- amino acid may be quantified. この反応物の定量は、特に制限されるものではなく、例えば反応終了後、遠心分離によって菌体を分離したのち、 Determination of the reaction is not particularly limited, for example, after completion of the reaction, after separating the cells by centrifugation,
反応溶液を高速液体クロマトグラフィー(以下、HPL The reaction solution by high performance liquid chromatography (hereinafter, HPL
Cと称す。 It referred to as C. )で分析することによって容易に定量できる。 Easily be quantified by analyzing in).

【0026】また、大量の反応物からのL−アミノ酸の採取は、遠心分離によって得られた反応溶液をアミノ酸の過飽和溶液になるまで濃縮した後、晶析によるのが最も一般的である。 Further, collection of L- amino acids from large quantities of the reactants, after concentration of the reaction solution obtained by centrifugation until a supersaturated solution of the amino acid, is most commonly due to crystallization.

【0027】なお、本反応によって得られた反応溶液の中には、前記一般式(I)で示された基で保護されたD It should be noted, D in the reaction solution obtained by the present reaction, which is protected with the indicated group by the general formula (I)
−アミノ酸が加水分解を受けることなく含まれている。 - have been included without amino acid is subjected to hydrolysis.
この保護されたD−アミノ酸は、塩化メチレン、酢酸エチル、ジエチルエーテル等の有機溶媒で反応液から抽出することが可能であり、得られた抽出溶液を濃縮した後、晶析によって単離することができる。 The protected D- amino acids, methylene chloride, ethyl acetate, it is possible to extract from the reaction solution with an organic solvent such as diethyl ether, after which the resulting extracted solution was concentrated, it is isolated by crystallization can.

【0028】即ち、本発明は前記一般式(I)で示された基で保護されたD−アミノ酸を製造する方法としても有効である。 [0028] Namely, the present invention is also effective as a method for producing a D- amino acids protected with a group shown by the general formula (I).

【0029】 [0029]

【発明の効果】本発明によれば、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、バシルス属、シゾサッカロマイセス属に属する微生物の培養液、菌体または菌体処理物を、前記した一般式(I)で示される基でアミノ基が保護されたアミノ酸またはその塩のD体とL体の混合物に作用させることにより、L−アミノ酸またはその塩を選択的に得ることができる。 According to the present invention, Corynebacterium, the genus Microbacterium, the genus Bacillus, culture of a microorganism belonging to Schizosaccharomyces genus, cells or treated microbial cell, wherein the general formula (I by an amino group with a group exerts a mixture of protected amino acid or D-form and L-form of the salt thereof represented by), it can be selectively obtained the L- amino acid or a salt thereof. この反応は、良好な反応速度で、D−アミノ酸の副生も良好に抑制された状態で実施でき、本発明は、極めて有用である。 This reaction is a good reaction rate, can also be carried out in a state of being satisfactorily suppressed byproduct of D- amino acids, the present invention is extremely useful.

【0030】 [0030]

【実施例】以下、実施例を掲げて本発明を説明するが、 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described by way of examples,
本発明はこれらの実施例に何等制限されるものではない。 The present invention is not construed as being limited to these Examples.

【0031】実施例1 菌の培養は1.0%ペプトン、0.7%肉エキス、0. [0031] Example 1 culture of bacteria 1.0% peptone, 0.7% meat extract, 0.
5%酵母エキス、0.3%塩化ナトリウム、0.03% 5% yeast extract, 0.3% sodium chloride, 0.03%
硫酸コバルト、pH7の培地5mlにコリネバクテリウム アクアティカム IFO 12154菌を2〜3白金耳接種し、30度で24時間振とう培養を行った。 Cobalt sulfate, pH7 Corynebacterium aquaticum IFO 12154 bacteria medium 5ml of 2-3 loopful inoculum was performed for 24 hours by shaking culture at 30 °. この培養液の5mlを、1.0%ペプトン、0.7%肉エキス、0.5%酵母エキス、0.3%塩化ナトリウム、 The 5ml of this culture, 1.0% peptone, 0.7% meat extract, 0.5% yeast extract, 0.3% sodium chloride,
0.03%硫酸コバルト、pH7の培地500mlを含む2L肩付きフラスコに加え、30℃で24時間振とう培養を行った。 0.03% cobalt sulfate, was added to the 2L shouldered flask containing medium 500ml of pH 7, it was carried out for 24 hours by shaking culture at 30 ° C.. 培養後、遠心分離によって上澄み液を除き、冷却下0.85%食塩水で1回洗浄した後、菌体懸濁液を凍結乾燥し、凍結乾燥菌体とした。 After culturing, the supernatant was removed by centrifugation, washed once with cold under 0.85% saline, the cell suspension was lyophilized and the lyophilized cells.

【0032】得られた凍結乾燥菌体を25mg、400 [0032] The resulting freeze-dried cells of the 25mg, 400
mMのN−t−ブトキシカルボニル−D,L−メチオニン水溶液(リン酸水素カリウムでpHを8に調整)を1 mM of N-t-butoxycarbonyl -D, L-methionine solution (adjusted to pH 8 with potassium hydrogen phosphate) 1
00μl、50mMの硫酸コバルト水溶液を100μ 00Myueru, cobalt sulfate aqueous solution of 50 mM 100 microns
l、10%トリトンX−100を40μl、水1760 l, 10% Triton X-100 a 40μl, water 1760
μl、計2mlの反応溶液を試験管に加え、30℃で6 [mu] l, and the reaction solution a total 2ml was added to a test tube, 6 at 30 ° C.
時間振とうし、反応を行った。 Time shaken, and the reaction was carried out. 反応後、反応液500μ After the reaction, the reaction solution 500μ
lを採取し、遠心分離で、菌体を沈澱させ、その上澄み液をHPLCによって分析し、得られたアミノ酸を定量したところ、反応液中のアミノ酸はすべてL−メチオニンであり、アミノ酸濃度は10mM(収率100%)であった。 The l were taken, by centrifugation, to precipitate the cells, the supernatant was analyzed by HPLC, was quantitatively analyzed the resulting amino acid in the reaction solution are all L- methionine, amino acid concentration is 10mM It was (100% yield).

【0033】また、本反応液中のN−t−ブトキシカルボニル−D−メチオニンを定量したところ10mMであり、全く加水分解を受けていなかった。 Further, the N-t-butoxycarbonyl -D- methionine in the reaction solution is 10mM was quantified, was not received at all hydrolysis.

【0034】比較例1 実施例1と同様の操作で得られた凍結乾燥菌体を25m [0034] 25m freeze dried cells obtained in the same manner as in Comparative Example 1 Example 1
g、400mMのN−t−ブトキシカルボニルオキシ− g, N-t-butoxycarbonyl-oxy 400 mM -
D,L−メチオニン水溶液(酢酸及び酢酸ナトリウムでpHを5.8に調整)を100μl、50mMの硫酸コバルト水溶液を100μl、10%トリトンX−100 D, L-methionine solution (pH adjusted to 5.8 with acetic acid and sodium acetate) 100 [mu] l, cobalt sulfate aqueous solution of 50 mM 100 [mu] l, 10% Triton X-100
を40μl、水1760μl、計2mlの反応溶液を試験管に加え、55℃で24時間振とうし、反応を行った。 The 40 [mu] l, water 1760Myueru, added to the tube and the reaction solution a total 2 ml, shaken for 24 hours at 55 ° C., the reaction was carried out. 反応後、反応液500μlを採取し、遠心分離で、 After the reaction, the reaction solution 500μl was taken and by centrifugation,
菌体を沈澱させ、その上澄み液中をHPLCによって分析し、得られたアミノ酸を定量したところ、メチオニン濃度は2mM(収率20%)にすぎず、そのうちの0. To precipitate the bacterial cells, the supernatant liquid was analyzed by HPLC, was quantitatively analyzed the resulting amino acid, methionine concentration is only 2 mM (20% yield), 0 of them.
3mMはD−メチオニンであった。 3mM was D- methionine.

【0035】実施例2 N−t−ブトキシカルボニル−D,L−メチオニンに代えて表1に示したN−t−ブトキシカルボニル−D,L [0035] Example 2 N-t-butoxycarbonyl -D, shown in Table 1 in place of L- methionine N-t-butoxycarbonyl -D, L
−アミノ酸及びその塩を用い、実施例1と同様な操作を行った。 - using an amino acid and salts thereof, it was subjected to the same procedure as in Example 1. 24時間反応後、加水分解によって生成したアミノ酸はすべてL−アミノ酸でり、N−t−ブトキシカルボニル−D−アミノ酸は全く加水分解を受けずに反応溶液中に存在した。 After 24 hours the reaction, all the amino acids produced by hydrolysis L- amino deli, N-t-butoxycarbonyl--D- amino acids were present at all in the reaction solution without being hydrolyzed. また、L−アミノ酸の収率を表1に示した。 Further, the yield of L- amino acids are shown in Table 1.

【0036】 [0036]

【表1】 [Table 1]

【0037】実施例3 N−t−ブトキシカルボニル−D,L−メチオニンに代えて表2に示したN−ベンジルオキシカルボニル−D, [0037] Example 3 N-t-butoxycarbonyl -D, shown in Table 2 in place of L- methionine N- benzyloxycarbonyl -D,
L−アミノ酸及びその塩を用い、実施例1と同様な操作を行った。 Using L- amino acids and salts thereof, it was subjected to the same procedure as in Example 1. 24時間反応後、加水分解によって生成したアミノ酸はすべてL−アミノ酸であり、N−ベンジルオキシカルボニル−D−アミノ酸は全く加水分解を受けずに反応溶液中に存在した。 After 24 hours the reaction, all the amino acids produced by hydrolysis is L- amino acids,-D-N-benzyloxycarbonyl amino acids were present in the reaction solution without being completely hydrolyzed. また、L−アミノ酸の収率を表2に示した。 Further, the yield of L- amino acids are shown in Table 2.

【0038】 [0038]

【表2】 [Table 2]

【0039】実施例4 実施例1で用いたN−t−ブトキシカルボニル−D,L [0039] used in Example 4 Example 1 N-t-butoxycarbonyl -D, L
−メチオニンの濃度を表3に示した濃度にした以外は実施例1と同様な操作を行った。 - except that the concentration of methionine to a concentration shown in Table 3 were subjected to the same procedure as in Example 1. 24時間後に生成したL L, which was produced after 24 hours
−メチオニンの反応液中の濃度と収率を表3に示した。 - the concentration and yield of the reaction solution of the methionine indicated in Table 3.
また、D−メチオニンは確認されず、すべてN−t−ブトキシカルボニル−D−アミノ酸として反応溶液中に存在した。 Furthermore, D- methionine was present in the reaction solution as not confirmed, all N-t-butoxycarbonyl -D- amino acids.

【0040】 [0040]

【表3】 [Table 3]

【0041】実施例5 実施例1で用いたコリネバクテリウム アクアティカム [0041] used in Example 5 Example 1 Corynebacterium aquaticum
IFO12154菌に代えて表4に示したバクテリアを用いた以外は実施例1と同様な操作を行った。 Except for using the bacteria shown in Table 4 in place of IFO12154 bacteria were subjected to the same procedure as in Example 1. 24時間後に生成したL−メチオニンの収率を表4に示した。 The resulting L- methionine yield after 24 hours are shown in Table 4. また、D−メチオニンは確認されず、すべてN−t−ブトキシカルボニル−D−アミノ酸として反応溶液中に存在した。 Furthermore, D- methionine was present in the reaction solution as not confirmed, all N-t-butoxycarbonyl -D- amino acids.

【0042】 [0042]

【表4】 [Table 4]

【0043】実施例6 実施例1で用いた培地に代えて、0.5%ペプトン、2 [0043] Instead of the medium used in Example 6 Example 1, 0.5% peptone, 2
%肉エキス、0.03%硫酸コバルト、pH6の培地5 % Meat extract, 0.03% cobalt sulfate, medium pH6 5
ml、コリネバクテリウム アクアティカムIFO12 ml, Corynebacterium aquaticum IFO12
154菌に代えて表5に示した酵母を用いた以外は、実施例1と同様な操作を行った。 Except for using the yeast shown in Table 5 instead of the 154 bacteria were subjected to the same procedure as in Example 1. 24時間後に生成したL L, which was produced after 24 hours
−メチオニンの収率を表5に示した。 - the yield of methionine is shown in Table 5. また、D−メチオニンは確認されず、すべてN−t−ブトキシカルボニル−D−アミノ酸として反応溶液中に存在した。 Furthermore, D- methionine was present in the reaction solution as not confirmed, all N-t-butoxycarbonyl -D- amino acids.

【0044】 [0044]

【表5】 [Table 5]

【0045】実施例7 実施例1と同様な操作でコリネバクテリウム アクアティカム IFO12154菌を培養した後、50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7)に懸濁後、超音波で破砕し、遠心分離して上澄み液を透析し、無細胞抽出液とした。 [0045] After culturing the Corynebacterium aquaticum IFO12154 bacteria in the same manner as in Example 7 Example 1, were suspended in 50mM potassium phosphate buffer (pH 7), disrupted by ultrasonic waves, and centrifuged supernatant dialyzed liquid, was used as a cell-free extract.

【0046】得られた無細胞抽出液100μl(蛋白質換算1.56mg)、400mMのN−t−ブトキシカルボニル−D,L−メチオニン水溶液(リン酸水素カリウムでpHを8に調整)を50μl、50mMの硫酸コバルト水溶液を70μl、水780μl、計1mlの反応溶液を試験管に加え、30℃で24時間振とうし、反応を行った。 The obtained cell-free extract 100 [mu] l (protein terms 1.56mg), N-t- butoxycarbonyl -D of 400 mM, L-methionine solution (adjusted to pH 8 with potassium hydrogen phosphate) 50 [mu] l, 50 mM 70μl cobalt sulfate aqueous solution, water 780Myueru, added to the tube and the reaction solution a total 1 ml, shaken for 24 hours at 30 ° C., the reaction was carried out. 反応後、反応液をHPLCによって分析し、得られたアミノ酸を定量したところ、反応液中のアミノ酸はすべてL−メチオニンであり、アミノ酸濃度は5.7mM(収率57%)であった。 After the reaction, the reaction solution was analyzed by HPLC, was quantitatively analyzed the resulting amino acid in the reaction solution are all L- methionine, amino acid concentration was 5.7 mM (57% yield). また、N−t−ブトキシカルボニル−D−アミノ酸は全く加水分解を受けず、すべて反応溶液中に存在した。 Further, N-t-butoxycarbonyl--D- amino without being totally hydrolysis was all present in the reaction solution.

【0047】実施例8 実施例7で用いたN−t−ブトキシカルボニル−D,L [0047] used in Example 8 Example 7 N-t-butoxycarbonyl -D, L
−メチオニンに代えて表6に示したN−t−ブトキシカルボニル−D,L−アミノ酸を用いた以外は実施例7と同様な操作を行った。 - instead of the methionine N-t-butoxycarbonyl -D shown in Table 6, except for using the L- amino acid was subjected to the same procedure as in Example 7. 24時間後に生成したアミノ酸はすべてL−アミノ酸であり、N−t−ブトキシカルボニル−D−アミノ酸は全く加水分解を受けず反応溶液中に存在した。 The amino acids produced after 24 hours are all L- amino acids, N-t-butoxycarbonyl--D- amino acids were totally present in the reaction solution without being hydrolyzed. L−アミノ酸の収率は表6に示した。 L- amino acid yields are shown in Table 6.

【0048】 [0048]

【表6】 [Table 6]

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. 7識別記号 FI (C12P 13/04 C12R 1:07) (C12P 13/04 C12R 1:645) (58)調査した分野(Int.Cl. 7 ,DB名) C12P 13/04 BIOSIS(DIALOG) WPI(DIALOG) ────────────────────────────────────────────────── ─── of the front page continued (51) Int.Cl 7 identification symbol FI (C12P 13/04 C12R 1:07). (C12P 13/04 C12R 1: 645) (58) investigated the field (Int.Cl. 7 , DB name) C12P 13/04 BIOSIS (DIALOG) WPI (DIALOG)

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】 (57) [the claims]
  1. 【請求項1】下記一般式(I) 【化1】 1. A following general formula (I) ## STR1 ## (但し、Rはアルキル基またはベンジル基である。)で示される基でアミノ基が保護されたアミノ酸またはその塩のD体とL体との混合物に作用させた時、そのL体を選択的に加水分解してL−アミノ酸またはその塩を生成する能力を有する、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、バシルス属、シゾサッカロマイセス属に属する微生物、またはその培養液もしくは菌体処理物を、 (Wherein, R represents an alkyl group or a benzyl group.) When allowed to act on a mixture of amino acids the amino group is protected with a group represented by or D-form and L-form of the salt thereof, selectively the L-isomer to have the hydrolyzing ability to produce L- amino acids or a salt thereof, Corynebacterium, the genus Microbacterium, the genus Bacillus, microorganisms belonging to Schizosaccharomyces genus, or a culture broth or the treated bacterial cells,
    pHが6〜10で、温度が10〜50℃の条件下で、該一般式(1)で示される基でアミノ基が保護されたアミノ酸またはその塩のD体とL体の混合物に作用させ、生成したL−アミノ酸またはその塩を採取することを特徴とするL−アミノ酸またはその塩の製造方法。 A pH of 6-10, under the conditions of temperature of 10 to 50 ° C., to act on a mixture of D-form and L-form of the amino group is protected amino acid or a salt thereof represented by the general formula (1) , L- amino acids or a salt thereof, characterized by collecting the generated L- amino acids or a salt thereof.
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