JP3083330B2 - マテバシイ種子由来レクチン及びその採取法 - Google Patents
マテバシイ種子由来レクチン及びその採取法Info
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、マテバシイ種子由来レ
クチン及びその採取法に関し、更に詳しくは、シアル酸
を有する糖に親和性を持つマテバシイ種子由来レクチン
及びその採取法に関する。
クチン及びその採取法に関し、更に詳しくは、シアル酸
を有する糖に親和性を持つマテバシイ種子由来レクチン
及びその採取法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】レクチ
ンは非免疫起源の糖結合蛋白質で、少なくとも二つの糖
結合部位を有し、従来、マメ科の種子から種々のものが
単離されている。レクチンは動物や植物の細胞の凝集、
あるいは多糖や複合糖質の沈降を起こす作用があり、そ
の特異性は単糖やオリゴ糖の構造により決まる。
ンは非免疫起源の糖結合蛋白質で、少なくとも二つの糖
結合部位を有し、従来、マメ科の種子から種々のものが
単離されている。レクチンは動物や植物の細胞の凝集、
あるいは多糖や複合糖質の沈降を起こす作用があり、そ
の特異性は単糖やオリゴ糖の構造により決まる。
【０００３】本発明者らは、マテバシイ種子由来のレク
チンの単離・精製について鋭意研究を重ねた結果、シア
ロ糖蛋白質を含むセファロースを用いたアフィニティー
クロマトグラフィーを利用することにより、レクチンを
単離することに成功し、このレクチンが糖蛋白質であ
り、ジスルフィド結合で結合した２つのサブユニットか
らなり、シアル酸を有する糖に親和性を持つ点で、従来
のレクチンにはみられなかった新しいタイプのレクチン
であることを見出し、本発明を完成するに至った。
チンの単離・精製について鋭意研究を重ねた結果、シア
ロ糖蛋白質を含むセファロースを用いたアフィニティー
クロマトグラフィーを利用することにより、レクチンを
単離することに成功し、このレクチンが糖蛋白質であ
り、ジスルフィド結合で結合した２つのサブユニットか
らなり、シアル酸を有する糖に親和性を持つ点で、従来
のレクチンにはみられなかった新しいタイプのレクチン
であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明のマテバシイ種子
由来レクチンは、次の理化学的性質を有することを特徴
とするものである。 （１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析に
おいて、３４ｋＤａと３０ｋＤａの２本の蛋白質バンド
を示し、これらのサブユニットがジスルフィド結合して
いる。また非還元下では６３ｋＤａの単一の蛋白バンド
を示す。 （２）ＨＲＰ−ＣｏｎＡで染色され、ＨＲＰ−ＰＮＡで
は染色されず、Ｎ−グリコシド結合糖鎖をもつ植物糖蛋
白質である。（ＨＲＰ：ホースラディッシュペルオキシ
ダーゼ） （３）アミノ酸分析では、Ｐｒｏ、１／２Ｃｙｓ、Ｍｅ
ｔは検出されない。 （４）シアル酸を有する糖に親和性を有する。 （５）等電点：５．８−６．３の酸性側
由来レクチンは、次の理化学的性質を有することを特徴
とするものである。 （１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析に
おいて、３４ｋＤａと３０ｋＤａの２本の蛋白質バンド
を示し、これらのサブユニットがジスルフィド結合して
いる。また非還元下では６３ｋＤａの単一の蛋白バンド
を示す。 （２）ＨＲＰ−ＣｏｎＡで染色され、ＨＲＰ−ＰＮＡで
は染色されず、Ｎ−グリコシド結合糖鎖をもつ植物糖蛋
白質である。（ＨＲＰ：ホースラディッシュペルオキシ
ダーゼ） （３）アミノ酸分析では、Ｐｒｏ、１／２Ｃｙｓ、Ｍｅ
ｔは検出されない。 （４）シアル酸を有する糖に親和性を有する。 （５）等電点：５．８−６．３の酸性側
【０００５】本発明のマテバシイ種子レクチン（以下ｐ
ａｓａｎｉｎという）は、次のようにして採取すること
ができる。即ち、ブナ科植物のマテバシイ（Pasania ed
ulis) 種子を、塩類水溶液中で破砕後、遠心分離して得
た上清を、シアロ糖蛋白質を結合させた担体を用いてア
フィニティークロマトグラフィーにより分離精製するこ
とにより採取することができる。
ａｓａｎｉｎという）は、次のようにして採取すること
ができる。即ち、ブナ科植物のマテバシイ（Pasania ed
ulis) 種子を、塩類水溶液中で破砕後、遠心分離して得
た上清を、シアロ糖蛋白質を結合させた担体を用いてア
フィニティークロマトグラフィーにより分離精製するこ
とにより採取することができる。
【０００６】破砕処理は、常法に従い、ブレンダーなど
を用いることにより行うことができる。塩類水溶液とし
ては、トリス−塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド（Ｇ
ＯＯＤ）の緩衝液などが挙げられる。
を用いることにより行うことができる。塩類水溶液とし
ては、トリス−塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド（Ｇ
ＯＯＤ）の緩衝液などが挙げられる。
【０００７】
【実施例】以下、実施例及び試験例により本発明を更に
詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら制限す
るものでない。
詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら制限す
るものでない。
【０００８】実施例１（１）抽出マテバシイ(Pasania e
dulis)の種子の粉末１０ｇを、０．１５M のＮａＣｌを
含む１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．８）５０mlに懸
濁させ、ブレンダーで１分間処理した後、４℃で一夜放
置し、Ｐａｓａｎｉｎを抽出した。ホモジェネートを、
９，０００xg、３０分間遠心分離し、上清を集めた。こ
の上清を抽出液とした。
dulis)の種子の粉末１０ｇを、０．１５M のＮａＣｌを
含む１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．８）５０mlに懸
濁させ、ブレンダーで１分間処理した後、４℃で一夜放
置し、Ｐａｓａｎｉｎを抽出した。ホモジェネートを、
９，０００xg、３０分間遠心分離し、上清を集めた。こ
の上清を抽出液とした。
【０００９】（２）アフィニティークロマトグラフィー
予め前記緩衝液で平衡化したシアロ糖タンパクを含むセ
ファロース、例えば、フェツイン−セファロース４Ｂ
（１．２×６．０cm）に抽出液を吸着させた。前記緩衝
液の充分量で洗浄した後、Ｐａｓａｎｉｎを０．１M ラ
クトース水溶液及び５０mMエチレンジアミン水溶液で溶
出した。図１にＰａｓａｎｉｎの溶出パターンを示し
た。図１において、○‥‥‥○は血球凝集活性を、●‥
‥‥●は２８０nmにおける吸収を表す。活性画分を集め
前記緩衝液に対して透析し、最終精製標品とした。
予め前記緩衝液で平衡化したシアロ糖タンパクを含むセ
ファロース、例えば、フェツイン−セファロース４Ｂ
（１．２×６．０cm）に抽出液を吸着させた。前記緩衝
液の充分量で洗浄した後、Ｐａｓａｎｉｎを０．１M ラ
クトース水溶液及び５０mMエチレンジアミン水溶液で溶
出した。図１にＰａｓａｎｉｎの溶出パターンを示し
た。図１において、○‥‥‥○は血球凝集活性を、●‥
‥‥●は２８０nmにおける吸収を表す。活性画分を集め
前記緩衝液に対して透析し、最終精製標品とした。
【００１０】試験例１（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＰ
ａｓａｎｉｎの分析ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動分析（ＰＡＧＥ）はＬａｅｍｍｌｉの方法（Natu
re, ２２７，６８０（１９７６））で行った。精製した
ＰａｓａｎｉｎをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、
３４ｋＤａと３０ｋＤａの２種のサブユニットからなる
蛋白質バンドが検出されたことから、蛋白成分の見掛け
の分子量は３０，０００と３４，０００であることが判
明した。また、これら２本のサブユニット及びＰａｓａ
ｎｉｎはＨＲＰ−ＣｏｎＡで染色され、ＨＲＰ−ＰＮＡ
では染色されなかった。このことから、植物糖蛋白質に
典型的なＮ−グリコシド型結合糖鎖を持つことがわかっ
た。またＰａｓａｎｉｎを非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥを行うと、６３ｋＤａに単一の蛋白質バンドが得ら
れたことから、Ｐａｓａｎｉｎの見掛けの分子量は６
３，０００と決定された。これらの実験結果は、Ｐａｓ
ａｎｉｎは糖含量の異なる同一のサブユニットがジスル
フィド結合で結合した二量体であることを示している。
ａｓａｎｉｎの分析ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動分析（ＰＡＧＥ）はＬａｅｍｍｌｉの方法（Natu
re, ２２７，６８０（１９７６））で行った。精製した
ＰａｓａｎｉｎをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、
３４ｋＤａと３０ｋＤａの２種のサブユニットからなる
蛋白質バンドが検出されたことから、蛋白成分の見掛け
の分子量は３０，０００と３４，０００であることが判
明した。また、これら２本のサブユニット及びＰａｓａ
ｎｉｎはＨＲＰ−ＣｏｎＡで染色され、ＨＲＰ−ＰＮＡ
では染色されなかった。このことから、植物糖蛋白質に
典型的なＮ−グリコシド型結合糖鎖を持つことがわかっ
た。またＰａｓａｎｉｎを非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥを行うと、６３ｋＤａに単一の蛋白質バンドが得ら
れたことから、Ｐａｓａｎｉｎの見掛けの分子量は６
３，０００と決定された。これらの実験結果は、Ｐａｓ
ａｎｉｎは糖含量の異なる同一のサブユニットがジスル
フィド結合で結合した二量体であることを示している。
【００１１】（２）等電点の測定等電点は、Ｖｅｓｔｅ
ｒｂｅｒｇの方法（Methods Enzymol., ２２，３８９
（１９７１））により、ＬＫＢ８１０１型等電点電気泳
動装置を用いて測定した。電気泳動キャリアアンフォラ
インはＬＫＢ３．０−１０．５を用いて、４℃、３００
Ｖの定電圧で２日間行った。泳動終了後、１mlの試料を
分取し、各分画について、２８０nmにおける吸収及び血
球凝集活性を測定した。Ｐａｓａｎｉｎの等電点（ｐ
Ｉ）は、５．８−６．３の酸性側と測定された。
ｒｂｅｒｇの方法（Methods Enzymol., ２２，３８９
（１９７１））により、ＬＫＢ８１０１型等電点電気泳
動装置を用いて測定した。電気泳動キャリアアンフォラ
インはＬＫＢ３．０−１０．５を用いて、４℃、３００
Ｖの定電圧で２日間行った。泳動終了後、１mlの試料を
分取し、各分画について、２８０nmにおける吸収及び血
球凝集活性を測定した。Ｐａｓａｎｉｎの等電点（ｐ
Ｉ）は、５．８−６．３の酸性側と測定された。
【００１２】（３）アミノ酸組成の分析精製した試料に
６N ＨＣｌを加え、１１０℃で２４時間加水分解した。
試料のアミノ酸は、日立アミノ酸分析機８３５型を用い
て分析した。Ｐａｓａｎｉｎのアミノ酸組成を表１に示
す。
６N ＨＣｌを加え、１１０℃で２４時間加水分解した。
試料のアミノ酸は、日立アミノ酸分析機８３５型を用い
て分析した。Ｐａｓａｎｉｎのアミノ酸組成を表１に示
す。
【００１３】
【表１】
【００１４】表１からＰａｓａｎｉｎは、アスパラギン
酸又はアスパラギン（Ａｓｘ）、セリン（Ｓｅｒ）、グ
ルタミン酸又はグルタミン（Ｇｌｘ）及びグリシン（Ｇ
ｌｙ）の含量が高く、チロシン（Ｔｙｒ）、ヒスチジン
（Ｈｉｓ）の含量が低く、また、プロリン（Ｐｒｏ）、
シスチン（１／２Ｃｙｓ）及びメチオニン（Ｍｅｔ）を
欠く点に特徴があることが判る。
酸又はアスパラギン（Ａｓｘ）、セリン（Ｓｅｒ）、グ
ルタミン酸又はグルタミン（Ｇｌｘ）及びグリシン（Ｇ
ｌｙ）の含量が高く、チロシン（Ｔｙｒ）、ヒスチジン
（Ｈｉｓ）の含量が低く、また、プロリン（Ｐｒｏ）、
シスチン（１／２Ｃｙｓ）及びメチオニン（Ｍｅｔ）を
欠く点に特徴があることが判る。
【００１５】（４）糖組成の分析精製したＰａｓａｎｉ
ｎに２．５M トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えて密封
し、１００℃で６時間加水分解した。中性糖の分析は、
Ｊｕｓｃｏ Ｆｉｎｅｐａｃｌｅ ＧＥＬ ＳＡ１２１
カラムを備えた高速液体クロマトグラフィーを用いて行
った。また、ヘキソサミンの分析は日立アミノ酸分析機
８３５型を用いて行った。糖組成はこの分析結果から、
マンノース、ガラクトース、フコース、キシロース及び
グルコサミンが検出された。糖組成を表２に示す。
ｎに２．５M トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えて密封
し、１００℃で６時間加水分解した。中性糖の分析は、
Ｊｕｓｃｏ Ｆｉｎｅｐａｃｌｅ ＧＥＬ ＳＡ１２１
カラムを備えた高速液体クロマトグラフィーを用いて行
った。また、ヘキソサミンの分析は日立アミノ酸分析機
８３５型を用いて行った。糖組成はこの分析結果から、
マンノース、ガラクトース、フコース、キシロース及び
グルコサミンが検出された。糖組成を表２に示す。
【００１６】
【表２】
【００１７】（５）糖結合特異性Ｐａｓａｎｉｎの糖結
合特異性は、種々の単糖、オリゴ糖及び配糖体を用い、
赤血球凝集阻止試験及びＨＲＰ−糖蛋白質との結合試験
により調べた。表３に種々の糖が凝集反応を阻止するた
めに要する最小濃度を示した。
合特異性は、種々の単糖、オリゴ糖及び配糖体を用い、
赤血球凝集阻止試験及びＨＲＰ−糖蛋白質との結合試験
により調べた。表３に種々の糖が凝集反応を阻止するた
めに要する最小濃度を示した。
【００１８】
【表３】
【００１９】種々の糖のうち、フェツインが、最も強力
な阻止能を有し、アシアロフェツインの１０倍以上の親
和性を持つことが示された。従ってこのレクチンは、シ
アル酸に特異的であることが示された。
な阻止能を有し、アシアロフェツインの１０倍以上の親
和性を持つことが示された。従ってこのレクチンは、シ
アル酸に特異的であることが示された。
【００２０】
【発明の効果】本発明によれば、従来の種子由来のレク
チンには見られなかった新しいタイプのレクチンを提供
することができる。本発明のＰａｓａｎｉｎは、公知の
レクチンであるＰＨＡ、コンカナバリンＡ、ＰＷＭなど
と同様に、検査試薬、診断薬、糖質の分離分析用特異的
吸着剤としての用途が期待されるほか、その親和性を利
用して制癌剤のミサイル療法への応用も期待される。
チンには見られなかった新しいタイプのレクチンを提供
することができる。本発明のＰａｓａｎｉｎは、公知の
レクチンであるＰＨＡ、コンカナバリンＡ、ＰＷＭなど
と同様に、検査試薬、診断薬、糖質の分離分析用特異的
吸着剤としての用途が期待されるほか、その親和性を利
用して制癌剤のミサイル療法への応用も期待される。
【図１】Ｐａｓａｎｉｎのアフィニティークロマトグラ
フィーにおける溶出パターンを示すグラフである。
フィーにおける溶出パターンを示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小川 温子 東京都中野区野方２−24−13 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/42 A61K 38/36 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (2)
- 【請求項１】 次の理化学的性質を有するマテバシイ種
子由来レクチン。 （１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析に
おいて、３４ｋＤａと３０ｋＤａの２本の蛋白質バンド
を示し、これらのサブユニットがジスルフィド結合して
いる。また非還元下では６３ｋＤａの単一の蛋白バンド
を示す。 （２）ＨＲＰ−ＣｏｎＡで染色され、ＨＲＰ−ＰＮＡで
は染色されず、Ｎ−グリコシド結合糖鎖をもつ植物糖蛋
白質である。 （３）アミノ酸分析では、Ｐｒｏ、１／２Ｃｙｓ、Ｍｅ
ｔは検出されない。 （４）シアル酸を有する糖に親和性を有する。 （５）等電点：５．８−６．３の酸性側 - 【請求項２】 マテバシイの種子を、塩類水溶液中で破
砕後、遠心分離して得た上清を、シアロ糖蛋白質を結合
させた担体を用いてアフィニティークロマトグラフィー
により精製することを特徴とするマテバシイ種子由来レ
クチンの採取法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03023762A JP3083330B2 (ja) | 1991-01-25 | 1991-01-25 | マテバシイ種子由来レクチン及びその採取法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03023762A JP3083330B2 (ja) | 1991-01-25 | 1991-01-25 | マテバシイ種子由来レクチン及びその採取法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04243900A JPH04243900A (ja) | 1992-08-31 |
| JP3083330B2 true JP3083330B2 (ja) | 2000-09-04 |
Family
ID=12119351
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03023762A Expired - Fee Related JP3083330B2 (ja) | 1991-01-25 | 1991-01-25 | マテバシイ種子由来レクチン及びその採取法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3083330B2 (ja) |
-
1991
- 1991-01-25 JP JP03023762A patent/JP3083330B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04243900A (ja) | 1992-08-31 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |