JP3061480B2 - 胚性未分化細胞 - Google Patents
胚性未分化細胞Info
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Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、キメラマウスの作成に
用いられる胚性未分化（ＥＳ）細胞に関する。
用いられる胚性未分化（ＥＳ）細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】マウス
４日胚の内部細胞（ＩＣＭ）に近いと考えられる未分化
な細胞（ＥＳ細胞）を正常に培養することができる。培
養されたＥＳ細胞を４日胚胚膣内に再注入し偽妊娠させ
た仮親の子宮で発生・生育させると、体の各組織が注入
したＥＳ細胞と宿主４日胚のＩＣＭ両者由来の細胞より
構成されるキメラマウスが得られる。キメラマウスでは
ＥＳ細胞の生殖細胞への分化も起こり、したがってその
子孫でＥＳ細胞由来のマウスを得られる。〔Ａ．ブラド
レー（Ｂｒａｄｌｅｙ）ら：Ｎａｔｕｒｅ ３０９，２
５５（１９８４）〕。一般の体細胞と異なり、ＥＳ細胞
は分裂低下−クライシスを示すことなくおそらく無限に
分裂する〔Ｙ．須田（Ｓｕｄａ）ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐ
ｈｙｓｉｏｌ．，１３３，１９７（１９８７）〕。ＥＳ
細胞は１匹１匹のマウス個体を１個１個の培養された細
胞として培養器内で扱えることを意味する。
４日胚の内部細胞（ＩＣＭ）に近いと考えられる未分化
な細胞（ＥＳ細胞）を正常に培養することができる。培
養されたＥＳ細胞を４日胚胚膣内に再注入し偽妊娠させ
た仮親の子宮で発生・生育させると、体の各組織が注入
したＥＳ細胞と宿主４日胚のＩＣＭ両者由来の細胞より
構成されるキメラマウスが得られる。キメラマウスでは
ＥＳ細胞の生殖細胞への分化も起こり、したがってその
子孫でＥＳ細胞由来のマウスを得られる。〔Ａ．ブラド
レー（Ｂｒａｄｌｅｙ）ら：Ｎａｔｕｒｅ ３０９，２
５５（１９８４）〕。一般の体細胞と異なり、ＥＳ細胞
は分裂低下−クライシスを示すことなくおそらく無限に
分裂する〔Ｙ．須田（Ｓｕｄａ）ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐ
ｈｙｓｉｏｌ．，１３３，１９７（１９８７）〕。ＥＳ
細胞は１匹１匹のマウス個体を１個１個の培養された細
胞として培養器内で扱えることを意味する。
【０００３】しかし４日胚から培養されるすべての未分
化細胞が生殖細胞に分化するわけではなく、いまだ１２
９マウス由来のいくつかの限られた細胞株が一般に用い
られているに過ぎない。白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａ）阻
害因子の同定によりその培養は容易になったとはいえ、
良好な生殖細胞分化能を持つＥＳ細胞の樹立は簡単では
ない。また現在の培養条件でＥＳ細胞の生殖細胞分化能
を安定に保つには、注意深い培養を必要とする。ＥＳ細
胞の生殖細胞への分化効率は、キメラマウス作成に際し
てのＥＳ細胞一宿主胚のマウス系統の組合せによっても
影響され、ＥＳ細胞が生殖細胞に効率よく分化するか否
かは依然として何よりの課題である。
化細胞が生殖細胞に分化するわけではなく、いまだ１２
９マウス由来のいくつかの限られた細胞株が一般に用い
られているに過ぎない。白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａ）阻
害因子の同定によりその培養は容易になったとはいえ、
良好な生殖細胞分化能を持つＥＳ細胞の樹立は簡単では
ない。また現在の培養条件でＥＳ細胞の生殖細胞分化能
を安定に保つには、注意深い培養を必要とする。ＥＳ細
胞の生殖細胞への分化効率は、キメラマウス作成に際し
てのＥＳ細胞一宿主胚のマウス系統の組合せによっても
影響され、ＥＳ細胞が生殖細胞に効率よく分化するか否
かは依然として何よりの課題である。
【０００４】そこで本発明の目的は、１２９マウス以外
の系統のマウスに由来し、しかも子孫マウスを効率良く
生じる胚性未分化（ＥＳ）細胞を提供することにある。
の系統のマウスに由来し、しかも子孫マウスを効率良く
生じる胚性未分化（ＥＳ）細胞を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、Ｃ５７ＢＬ／
６マウス雌とＣＢＡマウス雄を交配して得られた４日胚
由来であり、３日胚（８細胞胚）ではキメラマウスを生
じ、４日胚（胚盤胞胚）ではキメラマウスを生じない、
平成４年５月２５日に工業技術院微生物工業研究所に受
託番号微工研菌寄第１２９７１号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２
９７１）として寄託されたＴＴ２胚性未分化細胞を３日
胚に注入してキメラマウスを得、得られたキメラマウス
を交配して前記細胞由来の子孫マウスを製造する方法に
関する。本発明の製造方法に用いる胚性未分化細胞は、
３日胚に注入してキメラマウスを得ることができ、さら
に得られたキメラマウス、特に雄のキメラマウスを他の
マウスと交配すると、後述の実施例に示すとおり、非常
に高い率で本発明の胚性未分化細胞由来の子孫マウスを
得ることが見出され、この新たな知見に基づき本発明の
製造方法は完成された。
６マウス雌とＣＢＡマウス雄を交配して得られた４日胚
由来であり、３日胚（８細胞胚）ではキメラマウスを生
じ、４日胚（胚盤胞胚）ではキメラマウスを生じない、
平成４年５月２５日に工業技術院微生物工業研究所に受
託番号微工研菌寄第１２９７１号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２
９７１）として寄託されたＴＴ２胚性未分化細胞を３日
胚に注入してキメラマウスを得、得られたキメラマウス
を交配して前記細胞由来の子孫マウスを製造する方法に
関する。本発明の製造方法に用いる胚性未分化細胞は、
３日胚に注入してキメラマウスを得ることができ、さら
に得られたキメラマウス、特に雄のキメラマウスを他の
マウスと交配すると、後述の実施例に示すとおり、非常
に高い率で本発明の胚性未分化細胞由来の子孫マウスを
得ることが見出され、この新たな知見に基づき本発明の
製造方法は完成された。
【０００６】
【０００７】以下本発明のＴＴ２ＥＳ細胞について具体
的に説明する。 （ａ）由来 Ｃ５７ＢＬ／６マウス雌とＣＢＡマウス雄を交配して得
られた４日胚である。
的に説明する。 （ａ）由来 Ｃ５７ＢＬ／６マウス雌とＣＢＡマウス雄を交配して得
られた４日胚である。
【０００８】（ｂ）調製法 ｉ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス雌とＣＢＡ雄マウスを交配し
て４日胚を得た。 ｉｉ）４日胚をフィーダー細胞上で５日間培養した（八
木ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８７，９９１８−９９２２（１９９０））。生育した円
筒状構造体よりトロフェクトダーム様細胞を機械的に顕
微鏡下除き、トリプシン分散後フィーダー細胞上で再び
培養した。（八木ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７，９９１８−９９２２（１９９
０））。なおフィーダー細胞はＢＡＬＢ／ｃマウス１５
日胚より培養した繊維芽様細胞をマイトマイシン処理し
て作成した。 ｉｉｉ）４日培養後未分化細胞様形態を示す細胞塊を顕
微鏡下細管を用いて集め、トリプシン分散後再びフィー
ダー細胞上で培養した。 ｉｖ）４日培養後ｉｉｉ）を繰り返した。 ｖ）４日培養後全細胞を継代し、更に３日後継代し、以
下継代ごとに大部分を凍結してＴＴ２細胞を保存した。
て４日胚を得た。 ｉｉ）４日胚をフィーダー細胞上で５日間培養した（八
木ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８７，９９１８−９９２２（１９９０））。生育した円
筒状構造体よりトロフェクトダーム様細胞を機械的に顕
微鏡下除き、トリプシン分散後フィーダー細胞上で再び
培養した。（八木ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７，９９１８−９９２２（１９９
０））。なおフィーダー細胞はＢＡＬＢ／ｃマウス１５
日胚より培養した繊維芽様細胞をマイトマイシン処理し
て作成した。 ｉｉｉ）４日培養後未分化細胞様形態を示す細胞塊を顕
微鏡下細管を用いて集め、トリプシン分散後再びフィー
ダー細胞上で培養した。 ｉｖ）４日培養後ｉｉｉ）を繰り返した。 ｖ）４日培養後全細胞を継代し、更に３日後継代し、以
下継代ごとに大部分を凍結してＴＴ２細胞を保存した。
【０００９】（ｃ）性質 分化段階として４日胚の未分
化細胞・内部細胞塊に近い性質（生殖細胞を含む３胚葉
の全ての細胞に分化し得る未分化細胞）を持つ培養され
た正常な未分化細胞である。従来報告されているＥＳ細
胞同様の形態を示し、同様の条件で培養でき、また試験
管内、あるいは同系マウス、ヌードマウスの皮下で分化
するが、従来報告されているＥＳ細胞（Ｅ１４、Ｄ３、
ＣＣＥ等）より少し早い発生段階にあるＥＳ細胞と思わ
れ、３日胚（８細胞胚）に注入したとき子孫マウスを極
めて高い効率で生じる。
化細胞・内部細胞塊に近い性質（生殖細胞を含む３胚葉
の全ての細胞に分化し得る未分化細胞）を持つ培養され
た正常な未分化細胞である。従来報告されているＥＳ細
胞同様の形態を示し、同様の条件で培養でき、また試験
管内、あるいは同系マウス、ヌードマウスの皮下で分化
するが、従来報告されているＥＳ細胞（Ｅ１４、Ｄ３、
ＣＣＥ等）より少し早い発生段階にあるＥＳ細胞と思わ
れ、３日胚（８細胞胚）に注入したとき子孫マウスを極
めて高い効率で生じる。
【００１０】従来報告されているＥＳ細胞は４日胚（胚
盤胞胚）に注入したときキメラマウスを生じるが、ＴＴ
２細胞は４日胚に注入してもキメラマウスを生じない。
逆に前者は３日胚に注入してもキメラマウスを生じない
が、ＴＴ２細胞は３日胚に注入したとき主としてＴＴ２
由来の細胞により構成されるマウスを７０％以上の頻度
で生じ、この様な雄マウスからの子孫は殆ど１００％Ｔ
Ｔ２由来の子孫である。この様に高率に子孫マウスを生
じるＥＳ細胞の報告はこれ迄なく、近いものとしてＡＢ
細胞があるが、ＡＢ細胞は４日胚に注入する。
盤胞胚）に注入したときキメラマウスを生じるが、ＴＴ
２細胞は４日胚に注入してもキメラマウスを生じない。
逆に前者は３日胚に注入してもキメラマウスを生じない
が、ＴＴ２細胞は３日胚に注入したとき主としてＴＴ２
由来の細胞により構成されるマウスを７０％以上の頻度
で生じ、この様な雄マウスからの子孫は殆ど１００％Ｔ
Ｔ２由来の子孫である。この様に高率に子孫マウスを生
じるＥＳ細胞の報告はこれ迄なく、近いものとしてＡＢ
細胞があるが、ＡＢ細胞は４日胚に注入する。
【００１１】注入を受ける４日胚としてＩＣＲマウス胚
（３日胚）を用い得ることもＴＴ２細胞の利点である
（これまでのＥＳ細胞はＣ５７ＢＬ／６マウス胚（４日
胚）を用いなければならずコスト高であった）。従来の
子孫マウスを生じるＥＳ細胞は何れも１２９マウスに由
来しているがＴＴ２細胞は他の系統のマウスに由来する
子孫マウスを生じるＥＳ細胞として最初である。
（３日胚）を用い得ることもＴＴ２細胞の利点である
（これまでのＥＳ細胞はＣ５７ＢＬ／６マウス胚（４日
胚）を用いなければならずコスト高であった）。従来の
子孫マウスを生じるＥＳ細胞は何れも１２９マウスに由
来しているがＴＴ２細胞は他の系統のマウスに由来する
子孫マウスを生じるＥＳ細胞として最初である。
【００１２】
【実施例】ＴＴ２ＥＳ細胞を用いたキメラマウスの作成
について説明する。 ａ）過排卵処理したＩＣＲ雌マウスを雄マウスと交配し
３日目に胚を採取した。 ｂ）ＴＴ２細胞（若しくはＴＴ２由来変異細胞）をトリ
プシンで分散し氷冷下維持した（八木ら，Ｐｒｏ．Ｎｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｕ．ＵＳＡ８７，９９１８−９９２２
（１９９０））。 ｃ）マイクロマニピュレーターを用い３日胚透明帯下に
ＴＴ２（若しくはＴＴ２由来変異細胞）細胞を１０ケ程
注入した。 ｄ）注入後胚を１日培養し胚盤胞胚に生育したものを偽
妊娠した仮親（ＩＣＲ）の子宮に移植した。 ｅ）仮親から出産した雄マウス中毛色が５０％以上野ネ
ズミ色であるもののみをＢＡＬＢ／ｃ雌マウスと交配し
た。 ｆ）出産したマウス中のネズミ色毛色のものについて遺
伝的変異を有するものを、尾よりＤＮＡを抽出してサザ
ン法により解析した。変異を有するマウスを相互に交配
して子孫マウスを得た。以下交配によりマウスを維持し
た。
について説明する。 ａ）過排卵処理したＩＣＲ雌マウスを雄マウスと交配し
３日目に胚を採取した。 ｂ）ＴＴ２細胞（若しくはＴＴ２由来変異細胞）をトリ
プシンで分散し氷冷下維持した（八木ら，Ｐｒｏ．Ｎｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｕ．ＵＳＡ８７，９９１８−９９２２
（１９９０））。 ｃ）マイクロマニピュレーターを用い３日胚透明帯下に
ＴＴ２（若しくはＴＴ２由来変異細胞）細胞を１０ケ程
注入した。 ｄ）注入後胚を１日培養し胚盤胞胚に生育したものを偽
妊娠した仮親（ＩＣＲ）の子宮に移植した。 ｅ）仮親から出産した雄マウス中毛色が５０％以上野ネ
ズミ色であるもののみをＢＡＬＢ／ｃ雌マウスと交配し
た。 ｆ）出産したマウス中のネズミ色毛色のものについて遺
伝的変異を有するものを、尾よりＤＮＡを抽出してサザ
ン法により解析した。変異を有するマウスを相互に交配
して子孫マウスを得た。以下交配によりマウスを維持し
た。
【００１３】結果を表１に示す。比較のためＥ１４、Ｄ
３及びＣＣＥの各細胞についての結果も併記する。又Ｉ
ＣＲ３日胚の代わりにＣ５７ＢＬ／６マウス４日胚を用
いた場合の結果を表２に示す。表１及び２から、ＴＴ２
ＥＳ細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス４日胚では子孫を生
じない（表２）のに対し、ＩＣＲ３日胚を用いた場合に
は高い頻度で子孫を生じる（表１）。それに対して、他
のＥ１４、Ｄ３及びＣＣＥの各細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６
マウス４日胚で子孫を生じ（表２、頻度は高くない）る
が、ＩＣＲ３日胚では全く子孫を生じなかった。
３及びＣＣＥの各細胞についての結果も併記する。又Ｉ
ＣＲ３日胚の代わりにＣ５７ＢＬ／６マウス４日胚を用
いた場合の結果を表２に示す。表１及び２から、ＴＴ２
ＥＳ細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス４日胚では子孫を生
じない（表２）のに対し、ＩＣＲ３日胚を用いた場合に
は高い頻度で子孫を生じる（表１）。それに対して、他
のＥ１４、Ｄ３及びＣＣＥの各細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６
マウス４日胚で子孫を生じ（表２、頻度は高くない）る
が、ＩＣＲ３日胚では全く子孫を生じなかった。
【００１４】
【表１】
【００１５】
【表２】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 井川 洋二 茨城県つくば市高野台３丁目１番１ 理 化学研究所ライフサイエンス筑波研究セ ンター内 (56)参考文献 Ｊｐｎ．Ａｎｉｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．37 （４），（1991）ｐ285−290 Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒ．34（５）ｐ561−566 （1992) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A01K 67/027 C12N 5/00 E
Claims (1)
- 【請求項１】 Ｃ５７ＢＬ／６マウス雌とＣＢＡマウス
雄を交配させて得られた４日胚由来であり、３日胚では
キメラマウスを生じ、４日胚ではキメラマウスを生じな
い、微工研菌寄第１２９７１号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２９
７１）のＴＴ２細胞を３日胚に注入してキメラマウスを
得、得られたキメラマウスを交配して前記細胞由来の子
孫マウスを製造する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4158593A JP3061480B2 (ja) | 1992-05-26 | 1992-05-26 | 胚性未分化細胞 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4158593A JP3061480B2 (ja) | 1992-05-26 | 1992-05-26 | 胚性未分化細胞 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05328878A JPH05328878A (ja) | 1993-12-14 |
| JP3061480B2 true JP3061480B2 (ja) | 2000-07-10 |
Family
ID=15675079
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4158593A Expired - Lifetime JP3061480B2 (ja) | 1992-05-26 | 1992-05-26 | 胚性未分化細胞 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3061480B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE455179T1 (de) * | 1997-02-28 | 2010-01-15 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | Humanes chromosomfragment und ein vektor, der dies enthält |
-
1992
- 1992-05-26 JP JP4158593A patent/JP3061480B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒ．３４（５）ｐ５６１−５６６（１９９２） |
| Ｊｐｎ．Ａｎｉｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．３７（４），（１９９１）ｐ２８５−２９０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05328878A (ja) | 1993-12-14 |
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