JP3035572B2 - コレステロールセンサ - Google Patents
コレステロールセンサInfo
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- JP3035572B2 JP3035572B2 JP2257192A JP25719290A JP3035572B2 JP 3035572 B2 JP3035572 B2 JP 3035572B2 JP 2257192 A JP2257192 A JP 2257192A JP 25719290 A JP25719290 A JP 25719290A JP 3035572 B2 JP3035572 B2 JP 3035572B2
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- cholesterol
- enzyme
- electrode
- bpg
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、コレステロールオキシダーゼ酵素を固定し
てなるコレステロールセンサに係り、特に、コレステロ
ールオキシダーゼ酵素膜をグルタルアルデヒド架橋法に
より形成してなるコレステロールセンサに関する。
てなるコレステロールセンサに係り、特に、コレステロ
ールオキシダーゼ酵素膜をグルタルアルデヒド架橋法に
より形成してなるコレステロールセンサに関する。
血液中のコレステロール濃度はグルコース濃度（血糖
値）とともに、糖尿病検査、成人病の診断で重要な診断
項目となってきている。
値）とともに、糖尿病検査、成人病の診断で重要な診断
項目となってきている。
従来、このコレステロール濃度の測定は、酵素を用い
た比色法またはクラール電極法により行われていた。
た比色法またはクラール電極法により行われていた。
比色法は、臨床化学分析装置に利用されており、酵素
と発色色素を用い、酵素反応による色の変化を光学的に
検出してコレステロール濃度を測定するものである。酵
素としては、ペルオキシダーゼ（PDD）やカタラーゼ（C
AT）が用いられている。一方、クラーク電極法は、遊離
コレステロールの濃度を、コレステロールオキシダーゼ
（分解酵素）含有コラーゲン膜とクラーク電極とを組み
合わせた酵素電極により測定するものである。
と発色色素を用い、酵素反応による色の変化を光学的に
検出してコレステロール濃度を測定するものである。酵
素としては、ペルオキシダーゼ（PDD）やカタラーゼ（C
AT）が用いられている。一方、クラーク電極法は、遊離
コレステロールの濃度を、コレステロールオキシダーゼ
（分解酵素）含有コラーゲン膜とクラーク電極とを組み
合わせた酵素電極により測定するものである。
〔発明が解決しようとする課題〕 上述の従来の方法には、それぞれ次のような問題があ
った。まず、比色法は前処理などの繁雑な操作と時間を
要し、血清中に含まれるエステル型コレステロールや多
くの妨害物質が共存するなどの問題を有する。たとえば
ペルオキシダーゼによる比色法では還元性物質の影響を
著しく受ける。また、カタラーゼによる比色法では、反
応時間が長くかかりすぎ、検体盲検の原因となる。さら
に両比色法では、溶血によりビリルビンが検体中に混入
し測定妨害の原因となる。
った。まず、比色法は前処理などの繁雑な操作と時間を
要し、血清中に含まれるエステル型コレステロールや多
くの妨害物質が共存するなどの問題を有する。たとえば
ペルオキシダーゼによる比色法では還元性物質の影響を
著しく受ける。また、カタラーゼによる比色法では、反
応時間が長くかかりすぎ、検体盲検の原因となる。さら
に両比色法では、溶血によりビリルビンが検体中に混入
し測定妨害の原因となる。
一方、クラーク電極法では電極自体が内部電解液を必
要とするので、この電解液が漏れ出し、そのため汚染し
やすく、また小型化が困難であるという問題があった。
要とするので、この電解液が漏れ出し、そのため汚染し
やすく、また小型化が困難であるという問題があった。
また、コレステロールオキシダーゼ（CHOX）酵素固定
化学修飾電極（Immobilized Enzyme Chemically Modifi
ed Electrode,IECME）を用いたコレステロールセンサが
開発されているが、このセンサでは、酵素反応によって
生じる過酸化水素（H2O2）を酸化することによってコレ
ステロール濃度を測定する原理を利用している。そのた
め、このセンサでは、アルコルビン酸（ビタミンＣ）や
尿酸などの血清中に存在する妨害物質の影響を受け易い
という問題があった。
化学修飾電極（Immobilized Enzyme Chemically Modifi
ed Electrode,IECME）を用いたコレステロールセンサが
開発されているが、このセンサでは、酵素反応によって
生じる過酸化水素（H2O2）を酸化することによってコレ
ステロール濃度を測定する原理を利用している。そのた
め、このセンサでは、アルコルビン酸（ビタミンＣ）や
尿酸などの血清中に存在する妨害物質の影響を受け易い
という問題があった。
さらに、酵素反応で消費される酵素（O2）の量よりコ
レステロール濃度を被検液中で直接測定するようにした
酵素膜被覆白金電極があるが、このセンサは妨害物質の
影響を受けないものの、白金電極表面が汚染しやすく、
またH+イオンにより影響を受けやすい。
レステロール濃度を被検液中で直接測定するようにした
酵素膜被覆白金電極があるが、このセンサは妨害物質の
影響を受けないものの、白金電極表面が汚染しやすく、
またH+イオンにより影響を受けやすい。
なお、特開昭57−12359号公報には導電性基板の上
に、金属錯体からなる層および酵素固定化膜を形成して
なる電極が開示されており、この電極では、上記問題点
を解消することは可能である。しかしながら、この電極
では、酵素（グルコースオキシダーゼ）を固定化する際
に、グルコースオキシダーゼ液を成形体の表面に塗布し
た後、架橋試薬としてグルタルアルデヒドを作用させて
乾燥させており、このグルタルアルデヒドの余剰成分が
残存していると、固定化酵素が安定せずに、センサの寿
命が低下するという問題がある。
に、金属錯体からなる層および酵素固定化膜を形成して
なる電極が開示されており、この電極では、上記問題点
を解消することは可能である。しかしながら、この電極
では、酵素（グルコースオキシダーゼ）を固定化する際
に、グルコースオキシダーゼ液を成形体の表面に塗布し
た後、架橋試薬としてグルタルアルデヒドを作用させて
乾燥させており、このグルタルアルデヒドの余剰成分が
残存していると、固定化酵素が安定せずに、センサの寿
命が低下するという問題がある。
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたもので、その
目的は、コレステロール濃度の測定を長期間、精度良く
行うことができるコレステロールセンサを提供すること
にある。
目的は、コレステロール濃度の測定を長期間、精度良く
行うことができるコレステロールセンサを提供すること
にある。
本発明は、導電性基体と、金属錯体を含み、導電性基
体上に形成された酸化還元応答膜と、該酸化還元応答膜
上に設けられ、グルタルアルデヒド架橋法により形成さ
れたコレステロールオキシダーゼ酵素固定化膜とを備え
たコレステロールセンサであって、余剰のグルタルアル
デヒドは界面活性剤、防腐剤を含むリン酸緩衝溶液に浸
漬して除去されていることを特徴とするものであり、こ
れにより固定化酵素が安定し、コレステロールを精度良
く、長期間測定することが可能になる。
体上に形成された酸化還元応答膜と、該酸化還元応答膜
上に設けられ、グルタルアルデヒド架橋法により形成さ
れたコレステロールオキシダーゼ酵素固定化膜とを備え
たコレステロールセンサであって、余剰のグルタルアル
デヒドは界面活性剤、防腐剤を含むリン酸緩衝溶液に浸
漬して除去されていることを特徴とするものであり、こ
れにより固定化酵素が安定し、コレステロールを精度良
く、長期間測定することが可能になる。
金属錯体としては、具体的には、コバルトイオン（Co
III）にメソ−テトラ（ｏ−アミノフェニル）ポルフィ
リン（配位化合物）が配位結合してなるメソ−テトラ
（ｏ−アミノフェニル）コバルトポリフィリン（以下、
Co−TAPPと略す）またはそのポリマー（以下、ポリ（Co
−TAPP）と略す）が用いられる。酸化還元応答膜はこの
金属錯体中のコバルトイオンのCoIIIからCoIIへの還元
反応により導電性基体に一定電位を発生させるものであ
る。
III）にメソ−テトラ（ｏ−アミノフェニル）ポルフィ
リン（配位化合物）が配位結合してなるメソ−テトラ
（ｏ−アミノフェニル）コバルトポリフィリン（以下、
Co−TAPPと略す）またはそのポリマー（以下、ポリ（Co
−TAPP）と略す）が用いられる。酸化還元応答膜はこの
金属錯体中のコバルトイオンのCoIIIからCoIIへの還元
反応により導電性基体に一定電位を発生させるものであ
る。
導電性基体としては、BPG（ベーサル・プレーン・ピ
ロリティック・グラファイト）等の導電性炭素材料や
金、白金、パラジウム等の貴金属を用いることができる
が、H+イオンの影響を受けにくいBPGが最も好ましい。
ロリティック・グラファイト）等の導電性炭素材料や
金、白金、パラジウム等の貴金属を用いることができる
が、H+イオンの影響を受けにくいBPGが最も好ましい。
本発明のコレステロールセンサにおいては、酵素固定
化膜中のコレステロールオキシダーゼと検体中のコレス
テロールとにより酵素反応が生じ、この酵素反応によっ
て酸素（水系中の溶存酸素）が消費される。一方、酸化
還元応答膜中では、金属錯体、具体的にはCo−TAPPにお
けるCoIIIがCoIIへ還元反応する。このときに生じる電
流値が酵素反応により消費される酸素量、すなわちコレ
ステロールの酵素反応量に比例するので、その電流値を
計測することによりコレステロールの濃度を測定するこ
とができる。なお、この電流値の計測は、本発明のコレ
ステロールセンサを作用極とするとともに基準極（SSC
E）との間を定電位としてアンペロメトリック法（電流
法）により行うことができる。
化膜中のコレステロールオキシダーゼと検体中のコレス
テロールとにより酵素反応が生じ、この酵素反応によっ
て酸素（水系中の溶存酸素）が消費される。一方、酸化
還元応答膜中では、金属錯体、具体的にはCo−TAPPにお
けるCoIIIがCoIIへ還元反応する。このときに生じる電
流値が酵素反応により消費される酸素量、すなわちコレ
ステロールの酵素反応量に比例するので、その電流値を
計測することによりコレステロールの濃度を測定するこ
とができる。なお、この電流値の計測は、本発明のコレ
ステロールセンサを作用極とするとともに基準極（SSC
E）との間を定電位としてアンペロメトリック法（電流
法）により行うことができる。
また、本発明のコレステロールセンサでは、導電性基
体（BPG）上のコバルト金属錯体のCOIIIのCoIIへの還元
反応は、未被覆導電性基体（BPG）の還元電位よりも約
＋300mV（対飽和塩化ナトリウムカロメル電極（以下、S
SCEと略す））ほど正電位側（酸化側）へシフトする。
このことから、ポリCo−TAPP膜中のCoIII/IITAPPサイト
を介して溶存酸素が触媒還元していることがわかる。し
たがって、水系中のコレステロール濃度測定が水の分解
反応に影響を受けずに観測することができる。
体（BPG）上のコバルト金属錯体のCOIIIのCoIIへの還元
反応は、未被覆導電性基体（BPG）の還元電位よりも約
＋300mV（対飽和塩化ナトリウムカロメル電極（以下、S
SCEと略す））ほど正電位側（酸化側）へシフトする。
このことから、ポリCo−TAPP膜中のCoIII/IITAPPサイト
を介して溶存酸素が触媒還元していることがわかる。し
たがって、水系中のコレステロール濃度測定が水の分解
反応に影響を受けずに観測することができる。
さらに、本発明のコレステロールセンサでは、コレス
テロール濃度を酵素（コレステロールオキシダーゼ）反
応時の酸素消費量から求めるが、このとき酸化還元応答
膜中のCoIIIのCoIIへの還元反応による電流値を、基準
極（SSCE）との間を定電位としてアンペロメトリック法
により計測する構成としているので、ポテンシトメトリ
ック（電位）法と違ってアルコルビン酸、尿酸、尿素等
のような、H+イオンを発生し被検液中のpH濃度を変化さ
せる妨害物質（酸化物質）の影響を受けずに測定するこ
とができる。
テロール濃度を酵素（コレステロールオキシダーゼ）反
応時の酸素消費量から求めるが、このとき酸化還元応答
膜中のCoIIIのCoIIへの還元反応による電流値を、基準
極（SSCE）との間を定電位としてアンペロメトリック法
により計測する構成としているので、ポテンシトメトリ
ック（電位）法と違ってアルコルビン酸、尿酸、尿素等
のような、H+イオンを発生し被検液中のpH濃度を変化さ
せる妨害物質（酸化物質）の影響を受けずに測定するこ
とができる。
第２図は金属錯体としてCo−TAPPを用いた場合の本発
明のコレステロールセンサとコレステロールとの反応状
態を概略的に示すものである。すなわち、検体中のコレ
ステロールはコレステロールオキシダーゼ（CHOX）によ
り次式のように分解される。
明のコレステロールセンサとコレステロールとの反応状
態を概略的に示すものである。すなわち、検体中のコレ
ステロールはコレステロールオキシダーゼ（CHOX）によ
り次式のように分解される。
次いで、コレステロールオキシダーゼ固定化膜を透過
してきた酵素反応後の酸素が内部の酸化還元応答膜（ポ
リ（Co−TAPP））により触媒還元され、次式のような反
応を生じる。
してきた酵素反応後の酸素が内部の酸化還元応答膜（ポ
リ（Co−TAPP））により触媒還元され、次式のような反
応を生じる。
2CoIIITAPP＋2H+＋O2 →2CoIITAPP＋H2O2 …（２） したがって、（１）式のコレステロールとコレステロ
ールオキシダーゼとの反応による間の酸素消費量を
（２）式のCoIIIからCoIIへ還元反応するときの電流ピ
ークより求めることができる。
ールオキシダーゼとの反応による間の酸素消費量を
（２）式のCoIIIからCoIIへ還元反応するときの電流ピ
ークより求めることができる。
本発明のコレステロールセンサによる濃度の検出可能
な領域は実験から０〜200mg/dl（０〜5mM）である。人
間の血清中における遊離コレステロール濃度は35〜72mg
/dlであり、本電極を用いて十分測定することができ
る。
な領域は実験から０〜200mg/dl（０〜5mM）である。人
間の血清中における遊離コレステロール濃度は35〜72mg
/dlであり、本電極を用いて十分測定することができ
る。
以下、本発明の実施例を図面を参照して具体的に説明
する。
する。
（実施例１） 第１図は本発明の一実施例に係るコレステロールセン
サの断面構造を表わすものである。図中、１は電極とな
る円柱状のBPG基体（断面積2.5×10-3cm2）１であり、
このBPG基体１の一方の端面にはポリ（Co−TAPP）から
なる酸化還元応答膜２が形成されるとともに、この酸化
還元応答膜２上に酵素固定化膜３が被覆形成されてい
る。酵素固定化膜３には酵素としてコレステロールオキ
シダーゼが固定されている。BPG基体１の他方の端面に
は銀ペースト４を介して銅のリード線５の一端部が接続
されている。リード線５は絶縁性チューブ７で被覆され
ている。リード線５の接続部を含むBPG基体１は熱収縮
チューブ８で被覆され、この熱収縮チューブ８とBPG基
体１との間は熱硬化エポキシ接着剤６により固定されて
いる。
サの断面構造を表わすものである。図中、１は電極とな
る円柱状のBPG基体（断面積2.5×10-3cm2）１であり、
このBPG基体１の一方の端面にはポリ（Co−TAPP）から
なる酸化還元応答膜２が形成されるとともに、この酸化
還元応答膜２上に酵素固定化膜３が被覆形成されてい
る。酵素固定化膜３には酵素としてコレステロールオキ
シダーゼが固定されている。BPG基体１の他方の端面に
は銀ペースト４を介して銅のリード線５の一端部が接続
されている。リード線５は絶縁性チューブ７で被覆され
ている。リード線５の接続部を含むBPG基体１は熱収縮
チューブ８で被覆され、この熱収縮チューブ８とBPG基
体１との間は熱硬化エポキシ接着剤６により固定されて
いる。
次に、上記構成のコレステロールセンサの製造方法に
ついて説明する。
ついて説明する。
（１）酸化還元応答膜の形成 まず、BPG基体１上に酸化還元応答膜２としてのポリ
（Co−TAPP）膜を次のように形成した。すなわち、円柱
状のBPG基体１を作成し、その一端に銀ペースト４によ
りリード線５の一端部を接続させ、続いてその周囲を熱
収縮チューブ８で覆った。このBPG基体１と、熱収縮チ
ューブ８との間を熱硬化エポキシ接着剤６で固め、これ
を真空下50〜60℃で、70分間乾燥させ、さらに140℃、3
0分間焼成してBPG電極を作成した。
（Co−TAPP）膜を次のように形成した。すなわち、円柱
状のBPG基体１を作成し、その一端に銀ペースト４によ
りリード線５の一端部を接続させ、続いてその周囲を熱
収縮チューブ８で覆った。このBPG基体１と、熱収縮チ
ューブ８との間を熱硬化エポキシ接着剤６で固め、これ
を真空下50〜60℃で、70分間乾燥させ、さらに140℃、3
0分間焼成してBPG電極を作成した。
このBPG電極を作用極として、参照電極には飽和塩化
ナトリウムカロメル電極（SSCE）、対極には白金線の３
電極を用い、下記の電解溶液が入った３電極式ガラスセ
ル中で下記の条件で電界重合を行い、BPG電極上にポリ
（Co−TAPP）膜を被覆形成した。
ナトリウムカロメル電極（SSCE）、対極には白金線の３
電極を用い、下記の電解溶液が入った３電極式ガラスセ
ル中で下記の条件で電界重合を行い、BPG電極上にポリ
（Co−TAPP）膜を被覆形成した。
溶液:2.0mM Co−TAPP 0.2 M CF3COONa（トリフルオロ酢酸ナトリウム） ＋CF3COOH（トリフルオロ酢酸） （pH＝1.0） 電位掃引範囲は０〜1.7V（対SSCE）、掃引速度50mV/S
で、３回の電位掃引を行った。そのときのサイクリック
ボルタモグラムを第３図に示す。これにより酸化重合反
応による電流が約0.8V（対SSCE）より観察される。ま
た、BPG電極の表面には濃青色の有機金属膜が生成して
いることが確認できた。
で、３回の電位掃引を行った。そのときのサイクリック
ボルタモグラムを第３図に示す。これにより酸化重合反
応による電流が約0.8V（対SSCE）より観察される。ま
た、BPG電極の表面には濃青色の有機金属膜が生成して
いることが確認できた。
（２）酵素固定化膜の形成 上述のポリCo−TAPP膜被覆BPG電極を水洗いし、乾燥
させた後、この電極表面にグルタルアルデヒド架橋法を
用いてコレステロールオキシダーゼ固定化アルブミン膜
を被覆した。すなわち、ポリCo−TAPP膜上に、25％グル
タルアルデヒド（GA）水溶液（0.6μ）と酵素溶液
（1.0μ）とを混ぜて滴下し、酵素固定化を行った。
酵素溶液は以下の組成のものを用いた。
させた後、この電極表面にグルタルアルデヒド架橋法を
用いてコレステロールオキシダーゼ固定化アルブミン膜
を被覆した。すなわち、ポリCo−TAPP膜上に、25％グル
タルアルデヒド（GA）水溶液（0.6μ）と酵素溶液
（1.0μ）とを混ぜて滴下し、酵素固定化を行った。
酵素溶液は以下の組成のものを用いた。
コレステロールオキシダーゼ（CHOX） （和光純薬（株）製）50mg/ml 牛血清アルブミン（BSA） （コダック（株）製）15重量％ リン酸緩衝溶液（pH＝7.0） 0.05M 酵素を固定化した後、このBPG電極を0.1Mリン酸緩衝
溶液（pH＝7.0）〔但し、50mg/lのトリトン−Ｘ−100
（界面活性剤）、20mg/dlのアジ化ナトリウム（防腐
剤）を含む〕中に30分間浸漬し、上記酵素固定化膜中の
過剰グルタルアルデヒドを除去した。このようにして第
３図に概略構成を示したコレステロールセンサが得られ
た。
溶液（pH＝7.0）〔但し、50mg/lのトリトン−Ｘ−100
（界面活性剤）、20mg/dlのアジ化ナトリウム（防腐
剤）を含む〕中に30分間浸漬し、上記酵素固定化膜中の
過剰グルタルアルデヒドを除去した。このようにして第
３図に概略構成を示したコレステロールセンサが得られ
た。
次に、このコレステロールセンサにより以下の実験を
行った。
行った。
実験例１ 1.69mMコレステロールが50mMリン酸緩衝溶液（pH＝7.
0）に滴下混入されたときのサイクリックボルタモグラ
ムを第４図のＡに示す。但し、溶存酸素系中での実験で
ある。電位掃引は掃引速度100mV/Sで行った。なお、Ｂ
は50mMリン酸緩衝溶液（pH＝7.0）中におけるサイクリ
ックボルタモグラムを示すものである。第４図において
コレステロール溶液の滴下に伴う酸化還元電流の減少が
観測される。このことは、本発明のコレステロールセン
サがコレステロールセンサとして作動していることを示
している。
0）に滴下混入されたときのサイクリックボルタモグラ
ムを第４図のＡに示す。但し、溶存酸素系中での実験で
ある。電位掃引は掃引速度100mV/Sで行った。なお、Ｂ
は50mMリン酸緩衝溶液（pH＝7.0）中におけるサイクリ
ックボルタモグラムを示すものである。第４図において
コレステロール溶液の滴下に伴う酸化還元電流の減少が
観測される。このことは、本発明のコレステロールセン
サがコレステロールセンサとして作動していることを示
している。
実験例２ 第５図は50mMリン酸緩衝溶液（pH＝7.0）中におい
て、ポリ（Co−TAPP）膜が形成されていないBPG基体お
よびポリ（Co−TAPP）膜が形成されたBPG基体のそれぞ
れで得られた典型的サイクリックボルタモグラムを示
す。ここに、Ａ、Ｂはそれぞれポリ（Co−TAPP）膜が形
成されていないBPG基体の場合、またＣ、Ｄはそれぞれ
ポリ（Co−TAPP）膜被覆BPG基体の場合を示している。
また、Ａ、Ｃはそれぞれ窒素溶存系、Ｂ、Ｄはそれぞれ
酵素溶存系での結果を示している。その結果、ポリCo−
TAPP膜をBPG電極上に電解重合で直接被覆させることに
より、酸素還元電位は未被覆BPGのそれよりも約300mVだ
け正電位側へシフトし、そのときの電位は−0.45V（対S
SCE）であることがわかった。また、酸素還元電流ピー
クの値も増加することがわかった。
て、ポリ（Co−TAPP）膜が形成されていないBPG基体お
よびポリ（Co−TAPP）膜が形成されたBPG基体のそれぞ
れで得られた典型的サイクリックボルタモグラムを示
す。ここに、Ａ、Ｂはそれぞれポリ（Co−TAPP）膜が形
成されていないBPG基体の場合、またＣ、Ｄはそれぞれ
ポリ（Co−TAPP）膜被覆BPG基体の場合を示している。
また、Ａ、Ｃはそれぞれ窒素溶存系、Ｂ、Ｄはそれぞれ
酵素溶存系での結果を示している。その結果、ポリCo−
TAPP膜をBPG電極上に電解重合で直接被覆させることに
より、酸素還元電位は未被覆BPGのそれよりも約300mVだ
け正電位側へシフトし、そのときの電位は−0.45V（対S
SCE）であることがわかった。また、酸素還元電流ピー
クの値も増加することがわかった。
実験例３ 第６図に、実施例２のコレステロールセンサの典型的
な電流−時間応答曲線を示す。ここに、電流値１、２、
…18はそれぞれ50mMリン酸緩衝溶液（pH＝7.0）中のコ
レステロール濃度が０、10、20、…150、161、188、200
mg/dlの場合に相当している。なお、図の矢印はコレス
テロールの注入ポイントを示している。この結果によれ
ば、コレステロール量の注入量を増加させるに伴い、還
元電流値は減少する。なお、この電流値は、一定電位
（−0.55V対SSCE）での電解反応における酸素還元電流
より測定した。また、第７図にコレステロール濃度（mg
/dl）−飽和酸素還元電流値（mA）の関係を示す。その
結果、コレステロール濃度０〜200mg/dlまでの広い範囲
に渡ってほぼ直線の関係を示すことがわかった。
な電流−時間応答曲線を示す。ここに、電流値１、２、
…18はそれぞれ50mMリン酸緩衝溶液（pH＝7.0）中のコ
レステロール濃度が０、10、20、…150、161、188、200
mg/dlの場合に相当している。なお、図の矢印はコレス
テロールの注入ポイントを示している。この結果によれ
ば、コレステロール量の注入量を増加させるに伴い、還
元電流値は減少する。なお、この電流値は、一定電位
（−0.55V対SSCE）での電解反応における酸素還元電流
より測定した。また、第７図にコレステロール濃度（mg
/dl）−飽和酸素還元電流値（mA）の関係を示す。その
結果、コレステロール濃度０〜200mg/dlまでの広い範囲
に渡ってほぼ直線の関係を示すことがわかった。
実験例４ 実施例１のコレステロールセンサの第１回測定（実験
例３）より10日後に、電流応答速度と電流値との関係を
検討した。その結果を第８図に示す。実験例３と同程度
の電流応答では、コレステロール濃度は、実験例３では
200mg/dlであるのに対して、10日後においては最大100m
g/dlとなり、実験例３のときより感度が約半分に低下し
た。しかし、この期間が経過してもコレステロール濃度
の測定は可能であることが確められた。
例３）より10日後に、電流応答速度と電流値との関係を
検討した。その結果を第８図に示す。実験例３と同程度
の電流応答では、コレステロール濃度は、実験例３では
200mg/dlであるのに対して、10日後においては最大100m
g/dlとなり、実験例３のときより感度が約半分に低下し
た。しかし、この期間が経過してもコレステロール濃度
の測定は可能であることが確められた。
（実施例２） コレステロールオキシダーゼの固定化量を各々0mg/cm
2、25mg/cm2、50mg/cm2（BPG電極面積2.5×10-3cm2）と
変えた以外は実施例１と同様にしてコレステロールセン
サを作製した。
2、25mg/cm2、50mg/cm2（BPG電極面積2.5×10-3cm2）と
変えた以外は実施例１と同様にしてコレステロールセン
サを作製した。
実験例５、６ 実施例１および実施例２の各々のコレステロールセン
サを用い、実験例２と同じ方法でコレステロール濃度と
酸素還元電流値との関係を調べた。その結果を第９図に
示す。ここに、○はコレステロールオキシダーゼの固定
化量が50mg/cm2の場合、△は同じく25mg/cm2の場合、□
は同じく0mg/cm2の場合をそれぞれ示している。この結
果によれば、コレステロールオキシダーゼの固定化量が
4mg/cm2の酵素反応による酸素の電流ピークの減少量は1
3.5nA、また固定化量が8mg/cm2の場合のそれは25.5nA
（但し、コレステロール濃度０〜100mg/dl）であり、酵
素固定化量が大きい8mg/cm2の方が高感度応答を示し、
固定化量を２倍にすることにより電流感度は1.89倍とな
る。なお、コレステロールオキシダーゼの固定化量が0m
g/cm2（酸素無添加）では、酸素還元電流は変化しない
ことが確かめられた。
サを用い、実験例２と同じ方法でコレステロール濃度と
酸素還元電流値との関係を調べた。その結果を第９図に
示す。ここに、○はコレステロールオキシダーゼの固定
化量が50mg/cm2の場合、△は同じく25mg/cm2の場合、□
は同じく0mg/cm2の場合をそれぞれ示している。この結
果によれば、コレステロールオキシダーゼの固定化量が
4mg/cm2の酵素反応による酸素の電流ピークの減少量は1
3.5nA、また固定化量が8mg/cm2の場合のそれは25.5nA
（但し、コレステロール濃度０〜100mg/dl）であり、酵
素固定化量が大きい8mg/cm2の方が高感度応答を示し、
固定化量を２倍にすることにより電流感度は1.89倍とな
る。なお、コレステロールオキシダーゼの固定化量が0m
g/cm2（酸素無添加）では、酸素還元電流は変化しない
ことが確かめられた。
実験例７（妨害物質の影響の検討） 実施例１のコレステロールセンサを用いて最初、濃度
55.6mg/dlのコレステロールを滴下したところ還元電流
値が減少した。次いで、0.05mMアルコルビン酸、0.32mM
尿酸、2.59mM尿素を含むコレステロール溶液を滴下し
た。なお、このときのコレステロール濃度は最初と同じ
とした。このときの電流量変化は観測されず、したがっ
てこれら妨害物質の影響を受けずにコレステロール濃度
を測定できることがわかった。なお、これら酸化還元反
応活性物質はヒト血清中に含まれる濃度の平均値であ
る。
55.6mg/dlのコレステロールを滴下したところ還元電流
値が減少した。次いで、0.05mMアルコルビン酸、0.32mM
尿酸、2.59mM尿素を含むコレステロール溶液を滴下し
た。なお、このときのコレステロール濃度は最初と同じ
とした。このときの電流量変化は観測されず、したがっ
てこれら妨害物質の影響を受けずにコレステロール濃度
を測定できることがわかった。なお、これら酸化還元反
応活性物質はヒト血清中に含まれる濃度の平均値であ
る。
実験例８ 実施例１のコレステロールセンサを用いて還元電流−
時間応答曲線を検討した。第10図にその結果を示す。こ
こに、図において、１、２はそれぞれ濃度が０、1.4mM
のコレステロール溶液を滴下した場合の結果であり、ま
た、３、４はさらにそれぞれ1.4、2.8mMの過酸化水素を
滴下した場合の結果を示す。すなわち、コレステロール
と同濃度の過酸化水素を滴下した場合には還元電流は変
化しなかったが、２倍の濃度のコレステロールおよび過
酸化水素を滴下したところ還元電流値は増加した。この
増加は過剰の過酸化水素による電流応答である。ただ
し、実際の酵素反応による過酸化水素の生成量はごくわ
ずかであった。
時間応答曲線を検討した。第10図にその結果を示す。こ
こに、図において、１、２はそれぞれ濃度が０、1.4mM
のコレステロール溶液を滴下した場合の結果であり、ま
た、３、４はさらにそれぞれ1.4、2.8mMの過酸化水素を
滴下した場合の結果を示す。すなわち、コレステロール
と同濃度の過酸化水素を滴下した場合には還元電流は変
化しなかったが、２倍の濃度のコレステロールおよび過
酸化水素を滴下したところ還元電流値は増加した。この
増加は過剰の過酸化水素による電流応答である。ただ
し、実際の酵素反応による過酸化水素の生成量はごくわ
ずかであった。
以上説明したように本発明によれば、導電性基体と、
金属錯体を含み、導電性基体上に形成された酸化還元応
答膜と、該酸化還元応答膜上に設けられ、グルタルアル
デヒド架橋法により形成されたコレステロールオキシダ
ーゼ酵素固定化膜とを備えたコレステロールセンサにお
いて、余剰のグルタルアルデヒドは界面活性剤、防腐剤
を含むリン酸緩衝溶液に浸漬して除去されているものと
したので、固定化酵素が安定化し、コレステロールを精
度良く、長期間測定することが可能になる。
金属錯体を含み、導電性基体上に形成された酸化還元応
答膜と、該酸化還元応答膜上に設けられ、グルタルアル
デヒド架橋法により形成されたコレステロールオキシダ
ーゼ酵素固定化膜とを備えたコレステロールセンサにお
いて、余剰のグルタルアルデヒドは界面活性剤、防腐剤
を含むリン酸緩衝溶液に浸漬して除去されているものと
したので、固定化酵素が安定化し、コレステロールを精
度良く、長期間測定することが可能になる。
また、このコレステロールセンサでは、金属錯体中の
金属の還元電流値をアンペロメトリック法により計測す
ることにより、酵素反応による酸素消費量よりコレステ
ロールの濃度を求めることができ、アスコルビン酸、尿
酸、尿素等の妨害物質（酸化物質）の影響を受けない
で、安定した測定を行うことができる。
金属の還元電流値をアンペロメトリック法により計測す
ることにより、酵素反応による酸素消費量よりコレステ
ロールの濃度を求めることができ、アスコルビン酸、尿
酸、尿素等の妨害物質（酸化物質）の影響を受けない
で、安定した測定を行うことができる。
図面は本発明の実施例を示すもので、第１図は実施例１
に係るコレステロールセンサの縦断面図、第２図は本発
明のコレステロールセンサとコレステロールとの反応状
態を示す概略構成図、第３図は実施例１において酸化還
元応答膜形成時のサイクリックボルタモグラムを示す
図、第４図は実験例１におけるコレステロールセンサの
サイクリックボルタノグラムを示す図、第５図は実験例
２におけるコレステロールセンサのサイクリックボルタ
ノグラムを示す図、第６図は実験例３における電流−時
間応答曲線を表わす図、第７図は実験例３におけるコレ
ステロール濃度と電流値との関係を示す図、第８図は実
験例４における電流−時間応答曲線を示す図、第９図は
実験例５、６におけるコレステロール濃度と電流応答値
との関係を示す図、第10図は実験例８における電流−時
間応答曲線を示す図である。 １……BPG基体 ２……酸化還元応答膜（Co−TAPP膜） ３……酵素固定化膜
に係るコレステロールセンサの縦断面図、第２図は本発
明のコレステロールセンサとコレステロールとの反応状
態を示す概略構成図、第３図は実施例１において酸化還
元応答膜形成時のサイクリックボルタモグラムを示す
図、第４図は実験例１におけるコレステロールセンサの
サイクリックボルタノグラムを示す図、第５図は実験例
２におけるコレステロールセンサのサイクリックボルタ
ノグラムを示す図、第６図は実験例３における電流−時
間応答曲線を表わす図、第７図は実験例３におけるコレ
ステロール濃度と電流値との関係を示す図、第８図は実
験例４における電流−時間応答曲線を示す図、第９図は
実験例５、６におけるコレステロール濃度と電流応答値
との関係を示す図、第10図は実験例８における電流−時
間応答曲線を示す図である。 １……BPG基体 ２……酸化還元応答膜（Co−TAPP膜） ３……酵素固定化膜
Claims (1)
- 【請求項１】導電性基体と、金属錯体を含み、前記導電
性基体上に形成された酸化還元応答膜と、該酸化還元応
答膜上に設けられ、グルタルアルデヒド架橋法により形
成されたコレステロールオキシダーゼ酵素固定化膜とを
備えたコレステロールセンサであって、 余剰のグルタルアルデヒドは界面活性剤、防腐剤を含む
リン酸緩衝溶液に浸漬して除去されていることを特徴と
するコレステロールセンサ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2257192A JP3035572B2 (ja) | 1990-09-28 | 1990-09-28 | コレステロールセンサ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2257192A JP3035572B2 (ja) | 1990-09-28 | 1990-09-28 | コレステロールセンサ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04136749A JPH04136749A (ja) | 1992-05-11 |
| JP3035572B2 true JP3035572B2 (ja) | 2000-04-24 |
Family
ID=17302960
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2257192A Expired - Lifetime JP3035572B2 (ja) | 1990-09-28 | 1990-09-28 | コレステロールセンサ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3035572B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5830341A (en) * | 1996-01-23 | 1998-11-03 | Gilmartin; Markas A. T. | Electrodes and metallo isoindole ringed compounds |
| JP3933189B2 (ja) * | 2002-02-25 | 2007-06-20 | 日立化成工業株式会社 | マイクロ流体システム用支持ユニット |
-
1990
- 1990-09-28 JP JP2257192A patent/JP3035572B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04136749A (ja) | 1992-05-11 |
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