JP3014295B2 - Ｃｎｋ１遺伝子 - Google Patents
Ｃｎｋ１遺伝子Info
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- JP3014295B2 JP3014295B2 JP7138152A JP13815295A JP3014295B2 JP 3014295 B2 JP3014295 B2 JP 3014295B2 JP 7138152 A JP7138152 A JP 7138152A JP 13815295 A JP13815295 A JP 13815295A JP 3014295 B2 JP3014295 B2 JP 3014295B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、細胞周期を調節する遺
伝子であるＣＮＫ１遺伝子及び該遺伝子を組み込んだ組
換え体プラスミドに関する。
伝子であるＣＮＫ１遺伝子及び該遺伝子を組み込んだ組
換え体プラスミドに関する。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡ複製及び細胞分裂は、真核生物及
び原核生物の両者にとって普遍的な現象である。真核生
物の個々の細胞は、有糸分裂をする際に第一間期（Ｇ
１）、ＤＮＡ合成期（Ｓ）、第二間期（Ｇ２）、分裂期
（Ｍ）と呼ばれる４段階の質的に異なった状態を暫時経
過しながら増殖する。すなわち、細胞は、Ｇ１−Ｓ−Ｇ
２−Ｍ−Ｇ１の状態を正確に繰り返すことにより自己複
製を行っている。この繰り返しを細胞周期という。ま
た、細胞周期に関与する遺伝子群を総称して細胞周期遺
伝子というが、これらの遺伝子は、互いに入れ替えるこ
とができるほど多細胞生物から単細胞生物まで種を越え
て高度に保存されていることが多い。
び原核生物の両者にとって普遍的な現象である。真核生
物の個々の細胞は、有糸分裂をする際に第一間期（Ｇ
１）、ＤＮＡ合成期（Ｓ）、第二間期（Ｇ２）、分裂期
（Ｍ）と呼ばれる４段階の質的に異なった状態を暫時経
過しながら増殖する。すなわち、細胞は、Ｇ１−Ｓ−Ｇ
２−Ｍ−Ｇ１の状態を正確に繰り返すことにより自己複
製を行っている。この繰り返しを細胞周期という。ま
た、細胞周期に関与する遺伝子群を総称して細胞周期遺
伝子というが、これらの遺伝子は、互いに入れ替えるこ
とができるほど多細胞生物から単細胞生物まで種を越え
て高度に保存されていることが多い。
【０００３】細胞周期については、酵母であるサッカロ
ミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae (S.ce
rv.)) 及びシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccha
romyces pombe (Sch.pombe))に関する研究（Murray,J.
and Hunt,T.(1993) Oxford University Press, UK ）、
さらに、哺乳動物を含む高等真核生物における研究が行
われている（Sherr,C.J.(1994) Cell,79,551-555）。
ミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae (S.ce
rv.)) 及びシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccha
romyces pombe (Sch.pombe))に関する研究（Murray,J.
and Hunt,T.(1993) Oxford University Press, UK ）、
さらに、哺乳動物を含む高等真核生物における研究が行
われている（Sherr,C.J.(1994) Cell,79,551-555）。
【０００４】細胞周期の進行は、主にＧ１期及びＧ２期
で制御されている。Ｇ１期制御の主な役割は、様々な外
界からのシグナル（例えば、栄養状態、ホルモン、増殖
・分化因子等）に応答して、増殖若しくは静止又は異な
る性質を持った細胞への分化を決定することである。一
方、Ｇ２期制御の主な役割は、ＤＮＡ複製の完了や、Ｄ
ＮＡに損傷がある場合にはその修復の完了を確認して、
細胞分裂の開始時期を決定することである。
で制御されている。Ｇ１期制御の主な役割は、様々な外
界からのシグナル（例えば、栄養状態、ホルモン、増殖
・分化因子等）に応答して、増殖若しくは静止又は異な
る性質を持った細胞への分化を決定することである。一
方、Ｇ２期制御の主な役割は、ＤＮＡ複製の完了や、Ｄ
ＮＡに損傷がある場合にはその修復の完了を確認して、
細胞分裂の開始時期を決定することである。
【０００５】細胞周期の進行の原動力として知られてい
る物質としては、タンパク質キナーゼであるS.cerev.Cd
c28 又はSch.pombe cdc2及びこれらと同系統のCdkが知
られている（岡山博人（1994）生化学,66,126-136）。H
artwellらのグループによる酵母S.cerv.の遺伝学的研究
により、Ｇ１において、ＣＤＣ28遺伝子、ＣＤＣ４遺伝
子、そしてＣＤＣ７遺伝子の各々の産物がこの順で機能
することを示した（Hartwell,L.H.(1976) J.Mol.Biol.,
104,807-817）。そして、分子クローニングにより、Ｃ
ＤＣ７遺伝子産物は、構造的に２個の長いキナーゼ挿入
物の存在を特徴とする58ｋＤのタンパク質キナーゼであ
ることが明らかとなった。かかるキナーゼ活性は、有糸
分裂の細胞周期においてＧ１／Ｓ移行に機能し、ＤＮＡ
複製の開始に必要である。しかし、この分子は極めて稀
にしか発現していないためあまり研究が進められておら
ず、細胞周期の研究でよく引き合いに出されるタンパク
質キナーゼCdc28/Cdc2の影にかくれた存在となってい
る。哺乳類でもCdc28/Cdc2の遺伝子ホモログの産物の含
有量が比較的高いため、これらの解析は進んでいるが、
はたして哺乳動物においても、ＣＤＣ７遺伝子産物と相
同な機能および構造を有する分子が存在するか否かにつ
いては、未だ明らかではない。
る物質としては、タンパク質キナーゼであるS.cerev.Cd
c28 又はSch.pombe cdc2及びこれらと同系統のCdkが知
られている（岡山博人（1994）生化学,66,126-136）。H
artwellらのグループによる酵母S.cerv.の遺伝学的研究
により、Ｇ１において、ＣＤＣ28遺伝子、ＣＤＣ４遺伝
子、そしてＣＤＣ７遺伝子の各々の産物がこの順で機能
することを示した（Hartwell,L.H.(1976) J.Mol.Biol.,
104,807-817）。そして、分子クローニングにより、Ｃ
ＤＣ７遺伝子産物は、構造的に２個の長いキナーゼ挿入
物の存在を特徴とする58ｋＤのタンパク質キナーゼであ
ることが明らかとなった。かかるキナーゼ活性は、有糸
分裂の細胞周期においてＧ１／Ｓ移行に機能し、ＤＮＡ
複製の開始に必要である。しかし、この分子は極めて稀
にしか発現していないためあまり研究が進められておら
ず、細胞周期の研究でよく引き合いに出されるタンパク
質キナーゼCdc28/Cdc2の影にかくれた存在となってい
る。哺乳類でもCdc28/Cdc2の遺伝子ホモログの産物の含
有量が比較的高いため、これらの解析は進んでいるが、
はたして哺乳動物においても、ＣＤＣ７遺伝子産物と相
同な機能および構造を有する分子が存在するか否かにつ
いては、未だ明らかではない。
【０００６】この背景には、哺乳類において、ＤＮＡ複
製開始がいかにして起こるかという事象そのものがほと
んど解明されていないことが挙げられる。従って、哺乳
類でのＣＤＣ７類似分子の機能解析は、ＤＮＡ複製開始
の解明に大いに有益であると考えられる。
製開始がいかにして起こるかという事象そのものがほと
んど解明されていないことが挙げられる。従って、哺乳
類でのＣＤＣ７類似分子の機能解析は、ＤＮＡ複製開始
の解明に大いに有益であると考えられる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、哺乳動物由
来で細胞周期を調節するＣＤＣ７と相同な遺伝子、すな
わち、プロテインキナーゼの酵素活性をもたらすポリペ
プチドをコードする遺伝子を提供することを目的とす
る。
来で細胞周期を調節するＣＤＣ７と相同な遺伝子、すな
わち、プロテインキナーゼの酵素活性をもたらすポリペ
プチドをコードする遺伝子を提供することを目的とす
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
に基づいて鋭意研究を行った結果、ラット由来繊維芽細
胞株ＮＲＫのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングす
ることにより、一般に稀にしか発現していない本プロテ
インキナーゼをコードする遺伝子を単離することに成功
し、本発明を完成するに至った。これまで哺乳類におけ
る本酵素があまり検討されてこなかったのは、その含有
量が極めて低いため、その同定が困難であったからであ
ると考えられる。
に基づいて鋭意研究を行った結果、ラット由来繊維芽細
胞株ＮＲＫのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングす
ることにより、一般に稀にしか発現していない本プロテ
インキナーゼをコードする遺伝子を単離することに成功
し、本発明を完成するに至った。これまで哺乳類におけ
る本酵素があまり検討されてこなかったのは、その含有
量が極めて低いため、その同定が困難であったからであ
ると考えられる。
【０００９】本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸
配列を実質的に含み、プロテインキナーゼの酵素活性を
もたらすポリペプチドをコードするＣＮＫ１遺伝子であ
る。さらに、本発明は、前記ＣＮＫ１遺伝子を組み込ん
だ組換え体プラスミドである。以下、本発明を詳細に説
明する。
配列を実質的に含み、プロテインキナーゼの酵素活性を
もたらすポリペプチドをコードするＣＮＫ１遺伝子であ
る。さらに、本発明は、前記ＣＮＫ１遺伝子を組み込ん
だ組換え体プラスミドである。以下、本発明を詳細に説
明する。
【００１０】本発明において、ＣＮＫ１遺伝子とは、配
列番号１で表されるアミノ酸配列を実質的に含み、プロ
テインキナーゼの酵素活性をもたらすポリペプチドをコ
ードする遺伝子をいう。ＣＮＫ１遺伝子は、例えばラッ
ト由来繊維芽細胞株ＮＲＫから単離することができ、Ｎ
ＲＫ細胞のｃＤＮＡライブラリーをポリメラーゼ・チェ
イン・リアクション（ＰＣＲ）及びコロニーハイブリダ
イゼションによりスクリーニングすることによって得る
ことができる。
列番号１で表されるアミノ酸配列を実質的に含み、プロ
テインキナーゼの酵素活性をもたらすポリペプチドをコ
ードする遺伝子をいう。ＣＮＫ１遺伝子は、例えばラッ
ト由来繊維芽細胞株ＮＲＫから単離することができ、Ｎ
ＲＫ細胞のｃＤＮＡライブラリーをポリメラーゼ・チェ
イン・リアクション（ＰＣＲ）及びコロニーハイブリダ
イゼションによりスクリーニングすることによって得る
ことができる。
【００１１】ここで、「アミノ酸配列を実質的に含
み、」とあるのは、このペプチドが所期プロテインキナ
ーゼの酵素活性をもたらす限り、配列番号１のアミノ酸
配列におけるいくつかのアミノ酸について欠失、置換、
付加等があってもよいことを示すものである。従って、
例えば、この酵素の第１番目のアミノ酸（メチオニン）
が欠失しているものの他、縮重コドンにおいてのみ異な
る同一のポリペプチドをコードする縮重異性体をも包含
するものである。
み、」とあるのは、このペプチドが所期プロテインキナ
ーゼの酵素活性をもたらす限り、配列番号１のアミノ酸
配列におけるいくつかのアミノ酸について欠失、置換、
付加等があってもよいことを示すものである。従って、
例えば、この酵素の第１番目のアミノ酸（メチオニン）
が欠失しているものの他、縮重コドンにおいてのみ異な
る同一のポリペプチドをコードする縮重異性体をも包含
するものである。
【００１２】但し、本発明の遺伝子は、プロテインキナ
ーゼの酵素活性をもたらす限り、遺伝子の由来は特に限
定されず、ヒト、ウシ、ラット、マウス等由来のもので
あってもよい。なお、他種の哺乳類（例えばヒト、ウ
シ、マウス等）でも、これと相同な遺伝子の存在がゲノ
ムサザンブロット法により確認されており、このこと
は、本発明の遺伝子が、これらの哺乳類においても保存
されていることを意味するものである。 （１）ｃＤＮＡライブラリー 本発明に用いられるｃＤＮＡライブラリーは、各種細胞
又は組織から調製されるポリ(A)+ ＲＮＡを用いて公知
の方法によりｃＤＮＡを調製し、これを適当なベクタ
ー、例えばプラスミドベクターやファージベクター等に
組み込んで組換え体を得、該組換え体を宿主細胞に形質
転換することにより作製することができる。
ーゼの酵素活性をもたらす限り、遺伝子の由来は特に限
定されず、ヒト、ウシ、ラット、マウス等由来のもので
あってもよい。なお、他種の哺乳類（例えばヒト、ウ
シ、マウス等）でも、これと相同な遺伝子の存在がゲノ
ムサザンブロット法により確認されており、このこと
は、本発明の遺伝子が、これらの哺乳類においても保存
されていることを意味するものである。 （１）ｃＤＮＡライブラリー 本発明に用いられるｃＤＮＡライブラリーは、各種細胞
又は組織から調製されるポリ(A)+ ＲＮＡを用いて公知
の方法によりｃＤＮＡを調製し、これを適当なベクタ
ー、例えばプラスミドベクターやファージベクター等に
組み込んで組換え体を得、該組換え体を宿主細胞に形質
転換することにより作製することができる。
【００１３】ポリ(A)+ ＲＮＡは、ＮＲＫ細胞株から調
製することができる。ＮＲＫ細胞株は、ATCCから入手可
能である（NRK-49F; ATCC CRL-1570) 。これを通常の細
胞培養手法、例えば、５％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含
む培地ＤＭＥＭ中で、35℃、５％CO2 の条件下で継代す
る。次に対数増殖期の細胞を集め、全ＲＮＡを単離す
る。ポリ(A)+ ＲＮＡの単離は各種公知の方法（例え
ば、Chomczynski & Sacchi(1987) Anal.Biochem.,162,1
56-159) により行うことができ、市販のキットを用いる
ことも可能である。
製することができる。ＮＲＫ細胞株は、ATCCから入手可
能である（NRK-49F; ATCC CRL-1570) 。これを通常の細
胞培養手法、例えば、５％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含
む培地ＤＭＥＭ中で、35℃、５％CO2 の条件下で継代す
る。次に対数増殖期の細胞を集め、全ＲＮＡを単離す
る。ポリ(A)+ ＲＮＡの単離は各種公知の方法（例え
ば、Chomczynski & Sacchi(1987) Anal.Biochem.,162,1
56-159) により行うことができ、市販のキットを用いる
ことも可能である。
【００１４】ｃＤＮＡライブラリーは、上記単離された
ポリ(A)+ ＲＮＡをもとに合成したｃＤＮＡを、微生物
由来のレプリコンをもつ適当なベクターにつないだ後、
宿主細胞に形質転換することにより作製することができ
る。ライブラリー作製用ベクターとしては、プラスミド
ベクター、ファージベクター等が挙げられるが、本発明
では、例えばプラスミドベクターであるｐｃＤ２ベクタ
ー等を用いることができる。また、宿主としては、種々
の大腸菌が挙げられ、例えばＤＨ５株やXL1 Blue株等を
用いることができる。
ポリ(A)+ ＲＮＡをもとに合成したｃＤＮＡを、微生物
由来のレプリコンをもつ適当なベクターにつないだ後、
宿主細胞に形質転換することにより作製することができ
る。ライブラリー作製用ベクターとしては、プラスミド
ベクター、ファージベクター等が挙げられるが、本発明
では、例えばプラスミドベクターであるｐｃＤ２ベクタ
ー等を用いることができる。また、宿主としては、種々
の大腸菌が挙げられ、例えばＤＨ５株やXL1 Blue株等を
用いることができる。
【００１５】上記ｃＤＮＡ断片をプラスミドベクターに
組み込むには、公知技術を用いることができ、例えば、
Okayama らの方法（(1987),Methods Enzymol.,154,3-2
8) などにより、ｐｃＤ２ベクターを用いてｃＤＮＡラ
イブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリーの作製
は、上記のほか、市販のキットを用いることも可能であ
る。
組み込むには、公知技術を用いることができ、例えば、
Okayama らの方法（(1987),Methods Enzymol.,154,3-2
8) などにより、ｐｃＤ２ベクターを用いてｃＤＮＡラ
イブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリーの作製
は、上記のほか、市販のキットを用いることも可能であ
る。
【００１６】なお、後述するノーザンブロット解析結果
から、ラット精巣由来のポリ(A)+ＲＮＡもＣＮＫ１遺伝
子のｃＤＮＡライブラリー作製のための適した材料とな
りうる。 （２）ＰＣＲ及びコロニーハイブリダイゼーションによ
るスクリーニング 本発明のＣＮＫ１遺伝子ｃＤＮＡ断片は、当初ラットＭ
ＥＫ１／２ ｃＤＮＡを得る目的でラットＮＲＫ細胞由
来ｃＤＮＡライブラリーをＰＣＲでスクリーニングして
いた際に、意外にも見出すことができたものである。
から、ラット精巣由来のポリ(A)+ＲＮＡもＣＮＫ１遺伝
子のｃＤＮＡライブラリー作製のための適した材料とな
りうる。 （２）ＰＣＲ及びコロニーハイブリダイゼーションによ
るスクリーニング 本発明のＣＮＫ１遺伝子ｃＤＮＡ断片は、当初ラットＭ
ＥＫ１／２ ｃＤＮＡを得る目的でラットＮＲＫ細胞由
来ｃＤＮＡライブラリーをＰＣＲでスクリーニングして
いた際に、意外にも見出すことができたものである。
【００１７】本発明において、作成したｃＤＮＡライブ
ラリーから目的とするｃＤＮＡをスクリーニングするに
は、アミノ酸配列から予想される合成縮重プローブを32
Ｐ等で標識した後にスクリーニングする方法の他、縮重
プライマーを用いてＰＣＲを行い、得られるＤＮＡ断片
をプローブとしてスクリーニング方法により行うことが
できる。後者の場合、タンパク質キナーゼでよく保存さ
れているアミノ酸配列：メチオニン−ヒスチジン−アル
ギニン−アスパラギン酸−バリン−リジン−プロリン
（センス）と、アスパラギン酸−フェニルアラニン−グ
リシン−バリン−セリン−グリシン−グルタミン（アン
チセンス）とに対応した20マーのプライマーを、それぞ
れ500ngと上記ｃＤＮＡ100ng を用い、50μlスケールで
ＰＣＲを行って該当するｃＤＮＡ断片を増幅する。増幅
したｃＤＮＡ断片をプラスミド、例えばpGEM3Zf(+)(Pro
mega) に組み込み、配列決定キットで塩基配列を決定す
る。得られたＣＮＫ１ｃＤＮＡ断片の内部塩基配列をも
とにオリゴヌクレオチドを合成し、これらをプローブと
して上記ＮＲＫｃＤＮＡライブラリーをコロニーハイブ
リダイゼーションによりスクリーニングする。この結
果、所期のｃＤＮＡ（長い）を含むクローンを入手する
ことができる（Sambrook et al.(1989)MolecularClonin
g, Cold Spring Harbor Lab.Press,NY,USA ）。
ラリーから目的とするｃＤＮＡをスクリーニングするに
は、アミノ酸配列から予想される合成縮重プローブを32
Ｐ等で標識した後にスクリーニングする方法の他、縮重
プライマーを用いてＰＣＲを行い、得られるＤＮＡ断片
をプローブとしてスクリーニング方法により行うことが
できる。後者の場合、タンパク質キナーゼでよく保存さ
れているアミノ酸配列：メチオニン−ヒスチジン−アル
ギニン−アスパラギン酸−バリン−リジン−プロリン
（センス）と、アスパラギン酸−フェニルアラニン−グ
リシン−バリン−セリン−グリシン−グルタミン（アン
チセンス）とに対応した20マーのプライマーを、それぞ
れ500ngと上記ｃＤＮＡ100ng を用い、50μlスケールで
ＰＣＲを行って該当するｃＤＮＡ断片を増幅する。増幅
したｃＤＮＡ断片をプラスミド、例えばpGEM3Zf(+)(Pro
mega) に組み込み、配列決定キットで塩基配列を決定す
る。得られたＣＮＫ１ｃＤＮＡ断片の内部塩基配列をも
とにオリゴヌクレオチドを合成し、これらをプローブと
して上記ＮＲＫｃＤＮＡライブラリーをコロニーハイブ
リダイゼーションによりスクリーニングする。この結
果、所期のｃＤＮＡ（長い）を含むクローンを入手する
ことができる（Sambrook et al.(1989)MolecularClonin
g, Cold Spring Harbor Lab.Press,NY,USA ）。
【００１８】このようにしてクローニングされたｃＤＮ
Ａの塩基配列は、放射標識や蛍光標識を行い、ジデオキ
シ法、マキサム−ギルバート法等により塩基配列を決定
することができる。使用するｃＤＮＡライブラリーはｐ
ｃＤ２というプラスミドベクターで構築してあるので、
コロニーハイブリダイゼーションにプローブとして使用
した２つのオリゴヌクレオチドを、今度は塩基配列決定
のためのプライマーとして用いる。そして、Hattori &
Sakaki((1986) Annl.Biochem.,152,232-238)の方法でプ
ラスミドＤＮＡを処理し、配列決定キット(USB Biochem
icals)で塩基配列を決定する。得られる塩基配列から更
にオリゴヌクレオチドを合成し、上記の方法を繰り返す
ことにより最終的に全塩基配列を決定することができ
る。この他に、得られるｃＤＮＡ断片を、より使いやす
いＭ13系、ｐＵＣ系、pBluescript 系などのベクターＤ
ＮＡに組み込んで、ユニバーサルプライマー、リバース
プライマーなどを用いて塩基配列を決定することもでき
る。
Ａの塩基配列は、放射標識や蛍光標識を行い、ジデオキ
シ法、マキサム−ギルバート法等により塩基配列を決定
することができる。使用するｃＤＮＡライブラリーはｐ
ｃＤ２というプラスミドベクターで構築してあるので、
コロニーハイブリダイゼーションにプローブとして使用
した２つのオリゴヌクレオチドを、今度は塩基配列決定
のためのプライマーとして用いる。そして、Hattori &
Sakaki((1986) Annl.Biochem.,152,232-238)の方法でプ
ラスミドＤＮＡを処理し、配列決定キット(USB Biochem
icals)で塩基配列を決定する。得られる塩基配列から更
にオリゴヌクレオチドを合成し、上記の方法を繰り返す
ことにより最終的に全塩基配列を決定することができ
る。この他に、得られるｃＤＮＡ断片を、より使いやす
いＭ13系、ｐＵＣ系、pBluescript 系などのベクターＤ
ＮＡに組み込んで、ユニバーサルプライマー、リバース
プライマーなどを用いて塩基配列を決定することもでき
る。
【００１９】なお、ここで示す塩基配列が公知となった
時点からは、ＣＮＫ１タンパク質をコードする塩基配列
のみを入手するのであれば、該当する開始コドンと停止
コドンとをそれぞれ含む５'-及び３'-プライマーを用い
てＰＣＲにて増幅して容易に単離することができる。 （３）ＣＮＫ１遺伝子のS.cerv. ＣＤＣ７遺伝子に対す
る相同性の同定 本発明のＣＮＫ１遺伝子については、S.cerv. CDC7遺伝
子と構造比較を行うことにより、相同性を同定すること
ができる。相同性については、FASTA プログラムを用い
たスイスプロットデータベースの検索により行うことが
できる。 （５）ＣＮＫ１遺伝子の発現の確認 ＮＲＫ細胞由来の全ＲＮＡ20μg及びポリ(A)+ ＲＮＡ２
μgのノーザンブロット法による解析結果では、全ＲＮ
Ａでは全くバンドが検出されない場合が多く、また、２
μgポリ(A)+ ＲＮＡで低レベルのバンド（3.5kb)しか検
出されず、種々の臓器での発現レベルをみても全般に低
い場合が多い。従って、ＣＮＫ１遺伝子の発現は極めて
低いことが予想される。
時点からは、ＣＮＫ１タンパク質をコードする塩基配列
のみを入手するのであれば、該当する開始コドンと停止
コドンとをそれぞれ含む５'-及び３'-プライマーを用い
てＰＣＲにて増幅して容易に単離することができる。 （３）ＣＮＫ１遺伝子のS.cerv. ＣＤＣ７遺伝子に対す
る相同性の同定 本発明のＣＮＫ１遺伝子については、S.cerv. CDC7遺伝
子と構造比較を行うことにより、相同性を同定すること
ができる。相同性については、FASTA プログラムを用い
たスイスプロットデータベースの検索により行うことが
できる。 （５）ＣＮＫ１遺伝子の発現の確認 ＮＲＫ細胞由来の全ＲＮＡ20μg及びポリ(A)+ ＲＮＡ２
μgのノーザンブロット法による解析結果では、全ＲＮ
Ａでは全くバンドが検出されない場合が多く、また、２
μgポリ(A)+ ＲＮＡで低レベルのバンド（3.5kb)しか検
出されず、種々の臓器での発現レベルをみても全般に低
い場合が多い。従って、ＣＮＫ１遺伝子の発現は極めて
低いことが予想される。
【００２０】本発明においてＣＮＫ１遺伝子の発現を確
認するには、従来からのノーザンブロット法（主として
ホルムアルデヒド／ホルムアミド法又はグリオキサール
／ＤＭＳＯ法の２つの手法がある）の他、ＲＴ−ＰＣＲ
法、ＲＮａｓｅマッピング法等により行い得るが、感度
が良好である限り、いずれかの方法により行い得る。
認するには、従来からのノーザンブロット法（主として
ホルムアルデヒド／ホルムアミド法又はグリオキサール
／ＤＭＳＯ法の２つの手法がある）の他、ＲＴ−ＰＣＲ
法、ＲＮａｓｅマッピング法等により行い得るが、感度
が良好である限り、いずれかの方法により行い得る。
【００２１】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されな
い。 〔実施例１〕ＣＮＫ１遺伝子のクローニング (1) ｃＤＮＡライブラリーの調製 ラットＮＲＫ−49Ｆ細胞株（ATCC CRL-1570)をＤＭＥＭ
−５％ＦＣＳ，35℃，５％CO2 の条件下で継代培養す
る。対数増殖期の細胞から公知の方法（例えばChomczyn
ski & Sacchi(1987) Anal.Biochem.,162,156-159) で全
ＲＮＡを単離し、更にオリゴ(dT)セルロース(Collabora
tive Research Co.)を用いてｍＲＮＡを精製する。
説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されな
い。 〔実施例１〕ＣＮＫ１遺伝子のクローニング (1) ｃＤＮＡライブラリーの調製 ラットＮＲＫ−49Ｆ細胞株（ATCC CRL-1570)をＤＭＥＭ
−５％ＦＣＳ，35℃，５％CO2 の条件下で継代培養す
る。対数増殖期の細胞から公知の方法（例えばChomczyn
ski & Sacchi(1987) Anal.Biochem.,162,156-159) で全
ＲＮＡを単離し、更にオリゴ(dT)セルロース(Collabora
tive Research Co.)を用いてｍＲＮＡを精製する。
【００２２】このポリ(A)+ ＲＮＡのうち５μgを用いて
Okayama らの方法に従ってｃＤＮＡを合成した(Chayama
et al.(1987),Methods Enzymol.154,3-28) 。得られた
ベクター／ｃＤＮＡをＤＨ５株へトランスフォームし、
５×106個のクローンからなるｃＤＮＡライブラリーを
作製した（Otsu et al.(1993) FEBS Lett.,320,246-25
0) 。 (2) ＰＣＲ及びコロニーハイブリダイゼーションによる
スクリーニング ラットＮＲＫ細胞ｃＤＮＡライブラリーをＰＣＲ産物配
列からのオリゴヌクレオチドを用いてスクリーニングし
た。手法は、以下の通りである。
Okayama らの方法に従ってｃＤＮＡを合成した(Chayama
et al.(1987),Methods Enzymol.154,3-28) 。得られた
ベクター／ｃＤＮＡをＤＨ５株へトランスフォームし、
５×106個のクローンからなるｃＤＮＡライブラリーを
作製した（Otsu et al.(1993) FEBS Lett.,320,246-25
0) 。 (2) ＰＣＲ及びコロニーハイブリダイゼーションによる
スクリーニング ラットＮＲＫ細胞ｃＤＮＡライブラリーをＰＣＲ産物配
列からのオリゴヌクレオチドを用いてスクリーニングし
た。手法は、以下の通りである。
【００２３】ＰＣＲにより上記ＮＲＫｃＤＮＡをスクリ
ーニングするにあたり、オリゴ１（配列番号２）及びオ
リゴ２（配列番号３）を縮重プライマーとして用いた。
94℃で１分、55℃で１分及び72℃で２分を１サイクルと
してこれを40サイクルのＰＣＲを行った（Vent DNA pol
ymerase(New England Biolabs)を使用) 。得られた約85
bpのバンドを同条件で再度ＰＣＲで増幅し、最終的に、
ベクターpGEM3Zf(+)(Promega Co)へ組み込んだ。インサ
ートの塩基配列の決定から、当初の目的であったＭＥＫ
１／２とともに他のいくつかのタンパク質キナーゼに由
来するｃＤＮＡ断片が得られていることがわかった。そ
のうちの一つがＣＮＫ１のｃＤＮＡであった（図１）。
このＣＮＫ１由来ｃＤＮＡ断片の塩基配列から、二つの
オリゴヌクレオチドを合成した。すなわち、センスオリ
ゴ（配列番号４）及びアンチセンスオリゴ（配列番号
５）である。これらを５’末端ラベリングキット（Prom
egaCo.)及び[γ-32P]ＡＴＰ（Amersham) でラベルして
プローブとして用い、上記ＮＲＫｃＤＮＡライブラリー
をコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニン
グした。
ーニングするにあたり、オリゴ１（配列番号２）及びオ
リゴ２（配列番号３）を縮重プライマーとして用いた。
94℃で１分、55℃で１分及び72℃で２分を１サイクルと
してこれを40サイクルのＰＣＲを行った（Vent DNA pol
ymerase(New England Biolabs)を使用) 。得られた約85
bpのバンドを同条件で再度ＰＣＲで増幅し、最終的に、
ベクターpGEM3Zf(+)(Promega Co)へ組み込んだ。インサ
ートの塩基配列の決定から、当初の目的であったＭＥＫ
１／２とともに他のいくつかのタンパク質キナーゼに由
来するｃＤＮＡ断片が得られていることがわかった。そ
のうちの一つがＣＮＫ１のｃＤＮＡであった（図１）。
このＣＮＫ１由来ｃＤＮＡ断片の塩基配列から、二つの
オリゴヌクレオチドを合成した。すなわち、センスオリ
ゴ（配列番号４）及びアンチセンスオリゴ（配列番号
５）である。これらを５’末端ラベリングキット（Prom
egaCo.)及び[γ-32P]ＡＴＰ（Amersham) でラベルして
プローブとして用い、上記ＮＲＫｃＤＮＡライブラリー
をコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニン
グした。
【００２４】その結果、百万コロニーから５つの陽性ク
ローン（クローン３，６，９，12および15）を最終的に
単離した。 (3) スクリーニングされた遺伝子の塩基配列の決定 上記(2)で単離したクローンを基に、塩基配列の決定を
行った。すなわち、単離した５つのｃＤＮＡプラスミド
のクローンのＤＮＡから、公知の方法(Hattori& Sakaki
(1986) Annl.Biochem.,152,232-238)でテンプレートを
調製し、配列決定キット（USB Biochemicals) を用いて
これらの塩基配列を決定した。使用したプライマーは、
はじめにライブラリースクリーニングに用いた２つのオ
リゴヌクレオチドである。その後は、得られた塩基配列
をもとに順次オリゴヌクレオチドをＡＢＩ（アプライド
バイオシステムス）社のＤＮＡ合成機（＃394 ）を用い
て合成し、それらをプライマーとして用いた。コーディ
ング配列については特にセンスおよびアンチセンスの鎖
を少なくとも２回読み、塩基配列を確認した。
ローン（クローン３，６，９，12および15）を最終的に
単離した。 (3) スクリーニングされた遺伝子の塩基配列の決定 上記(2)で単離したクローンを基に、塩基配列の決定を
行った。すなわち、単離した５つのｃＤＮＡプラスミド
のクローンのＤＮＡから、公知の方法(Hattori& Sakaki
(1986) Annl.Biochem.,152,232-238)でテンプレートを
調製し、配列決定キット（USB Biochemicals) を用いて
これらの塩基配列を決定した。使用したプライマーは、
はじめにライブラリースクリーニングに用いた２つのオ
リゴヌクレオチドである。その後は、得られた塩基配列
をもとに順次オリゴヌクレオチドをＡＢＩ（アプライド
バイオシステムス）社のＤＮＡ合成機（＃394 ）を用い
て合成し、それらをプライマーとして用いた。コーディ
ング配列については特にセンスおよびアンチセンスの鎖
を少なくとも２回読み、塩基配列を確認した。
【００２５】結果を配列番号１に示す。また、かかる配
列から推定されるアミノ酸配列も同時に記載した。ここ
で、上記５つのクローンのいずれも完全長のｃＤＮＡを
含んでいなかったので、このうちの２つのクローン（ク
ローン３及び12）をもとに完全長ｃＤＮＡを再構成し
た。配列番号１の配列中、塩基配列番号687 の位置のＡ
paＩサイトと1847の位置のＢglIIサイトを用いて両クロ
ーンを消化し、この結果生ずるクローン３で欠失したイ
ンサート部ＡpaＩ−ＢglIIへクローン12由来のＡpaＩ−
ＢglII断片を挿入した。これにより、クローン12で欠失
していた５’側部（配列番号１の塩基配列(G)nから塩基
配列番号27の位置までのｃＤＮＡ部分を補った。最終的
に、本発明の遺伝子は、プラスミドベクターｐＣＤ２に
組み込まれた組換え体として得られた。
列から推定されるアミノ酸配列も同時に記載した。ここ
で、上記５つのクローンのいずれも完全長のｃＤＮＡを
含んでいなかったので、このうちの２つのクローン（ク
ローン３及び12）をもとに完全長ｃＤＮＡを再構成し
た。配列番号１の配列中、塩基配列番号687 の位置のＡ
paＩサイトと1847の位置のＢglIIサイトを用いて両クロ
ーンを消化し、この結果生ずるクローン３で欠失したイ
ンサート部ＡpaＩ−ＢglIIへクローン12由来のＡpaＩ−
ＢglII断片を挿入した。これにより、クローン12で欠失
していた５’側部（配列番号１の塩基配列(G)nから塩基
配列番号27の位置までのｃＤＮＡ部分を補った。最終的
に、本発明の遺伝子は、プラスミドベクターｐＣＤ２に
組み込まれた組換え体として得られた。
【００２６】なお、再構成したｃＤＮＡによりコードさ
れるタンパク質が本来のＮＲＫ１タンパク質と合致して
いることは、この再構成ｃＤＮＡをレチキュロサイトラ
イゼートで発現した分子の大きさが、ＮＲＫ細胞より調
製したライゼートを用いてこの分子に特異的抗体により
免疫沈降して得られた分子とほぼ同じ大きさの68kDaを
示したことより支持された。
れるタンパク質が本来のＮＲＫ１タンパク質と合致して
いることは、この再構成ｃＤＮＡをレチキュロサイトラ
イゼートで発現した分子の大きさが、ＮＲＫ細胞より調
製したライゼートを用いてこの分子に特異的抗体により
免疫沈降して得られた分子とほぼ同じ大きさの68kDaを
示したことより支持された。
【００２７】配列番号１に示す通り、配列番号１のｃＤ
ＮＡ配列は全体で約2.8 kbであり、75bpの５’非翻訳領
域、約1.7kbのコーディング領域及び約１kbの３’非翻
訳領域、それに続くポリ(A) 鎖により構成されていた。
推定アミノ酸配列は565 個のアミノ酸残基を有してお
り、算定分子量は62.3kDであった。Ｎ末端の51アミノ酸
残基に続くキナーゼ配列は、２つの長い挿入（ＫＩ−１
及びＫＩ−２）によって分断されており、結果として３
つの分割キナーゼ配列となった（ＫＳ−１，ＫＳ−２及
びＫＳ−３；図１参照）。ＫＳ−１，ＫＳ−２及びＫＳ
−３は、それぞれ配列番号１記載のアミノ酸配列番号の
52〜201番目、359〜434 番目、527〜563番目に相当し、
キナーゼサブドメインのＩ〜VII 、VIII〜Ｘ、及びXIで
あった。
ＮＡ配列は全体で約2.8 kbであり、75bpの５’非翻訳領
域、約1.7kbのコーディング領域及び約１kbの３’非翻
訳領域、それに続くポリ(A) 鎖により構成されていた。
推定アミノ酸配列は565 個のアミノ酸残基を有してお
り、算定分子量は62.3kDであった。Ｎ末端の51アミノ酸
残基に続くキナーゼ配列は、２つの長い挿入（ＫＩ−１
及びＫＩ−２）によって分断されており、結果として３
つの分割キナーゼ配列となった（ＫＳ−１，ＫＳ−２及
びＫＳ−３；図１参照）。ＫＳ−１，ＫＳ−２及びＫＳ
−３は、それぞれ配列番号１記載のアミノ酸配列番号の
52〜201番目、359〜434 番目、527〜563番目に相当し、
キナーゼサブドメインのＩ〜VII 、VIII〜Ｘ、及びXIで
あった。
【００２８】なお、本発明の遺伝子を保有するプラスミ
ドｐＣＤ２により形質転換された大腸菌株XL1-Blueは
「pcD2-CNK1 」と称し、工業技術院生命工学工業技術研
究所に、FERM P- 14969 として寄託されている。 (4) ＣＮＫ１遺伝子産物のS.cerv. CDC7遺伝子産物に対
する相同性の同定 データベース検索により、ＣＮＫ１遺伝子産物とS.cer
v. の遺伝子であるCDC7のタンパク質との相同性の比較
を行った。
ドｐＣＤ２により形質転換された大腸菌株XL1-Blueは
「pcD2-CNK1 」と称し、工業技術院生命工学工業技術研
究所に、FERM P- 14969 として寄託されている。 (4) ＣＮＫ１遺伝子産物のS.cerv. CDC7遺伝子産物に対
する相同性の同定 データベース検索により、ＣＮＫ１遺伝子産物とS.cer
v. の遺伝子であるCDC7のタンパク質との相同性の比較
を行った。
【００２９】その結果、ＫＳ−１及びＫＳ−２における
アミノ酸配列の相同性は、それぞれ43％、53％であり、
高い相同性を示した（図２参照）。 (5) ＣＮＫ１遺伝子の発現の確認 ＮＲＫ４遺伝子の発現を確認するため、ＮＲＫ４細胞の
ＲＮＡブロット解析を行った。すなわち、対数増殖期に
あるＮＲＫ細胞から精製した全ＲＮＡ及びポリ(A)+ Ｒ
ＮＡを、グリオキサール／ＤＭＳＯ法によるアガロース
ゲル電気泳動にかけて大きさごとに分け、ハイボンドＮ
フィルター（Amersham) へ常法に従って移しとる。一
方、ＣＮＫ１のＫＳ−１由来のｃＤＮＡ断片を、キット
(Amersham製Multiprime DNA labelling system)を用い
て[α-32P]dCTP(Amersham) でラベルし、プローブを作
製する。ハイブリダイゼーションとフィルターの洗浄は
公知の方法により行った(Otsu et al.(1993)FEBS Lett.
320,246-250)。この後、フィルターをＸ線フィルム（Ko
dak XAR)に露光した。
アミノ酸配列の相同性は、それぞれ43％、53％であり、
高い相同性を示した（図２参照）。 (5) ＣＮＫ１遺伝子の発現の確認 ＮＲＫ４遺伝子の発現を確認するため、ＮＲＫ４細胞の
ＲＮＡブロット解析を行った。すなわち、対数増殖期に
あるＮＲＫ細胞から精製した全ＲＮＡ及びポリ(A)+ Ｒ
ＮＡを、グリオキサール／ＤＭＳＯ法によるアガロース
ゲル電気泳動にかけて大きさごとに分け、ハイボンドＮ
フィルター（Amersham) へ常法に従って移しとる。一
方、ＣＮＫ１のＫＳ−１由来のｃＤＮＡ断片を、キット
(Amersham製Multiprime DNA labelling system)を用い
て[α-32P]dCTP(Amersham) でラベルし、プローブを作
製する。ハイブリダイゼーションとフィルターの洗浄は
公知の方法により行った(Otsu et al.(1993)FEBS Lett.
320,246-250)。この後、フィルターをＸ線フィルム（Ko
dak XAR)に露光した。
【００３０】その結果、図３に示すとおり、全ＲＮＡ量
が20μｇの場合はバンドを観察することができなかった
が、２μｇのポリ(A)+ ＲＮＡを用いて〜3.5 kbのバン
ド（図の「←」部）を検出することができた。また、数
種類のラット組織におけるＲＮＡの発現を、ＫＳ−１プ
ローブを用いて解析した。その結果、図４に示す通り、
精巣が他の組織よりも高いレベルの発現を示した。脳、
脾臓、肺、骨格筋、腎臓及び心臓についてもまた、発現
を示した。これに対し、肝臓では、明らかなバンドは観
察されなかった。 (6) ＣＮＫ１遺伝子の他の哺乳類での保存性 ＣＮＫ１遺伝子が他の哺乳類でも存在していることを確
認するため、ヒト、ウシ、マウスおよびラットの４種類
のゲノムＤＮＡを用いてサザンブロット解析を行った。
これらゲノムＤＮＡを制限酵素ＥcoＲＩで消化後、常法
に従ってアガロースゲル電気泳動およびニトロセルロー
スフィルター（BA85，Schleicher & Schull)へのトラン
スファーを行った。プローブにはＫＳ−１由来、ＫＩ−
１由来及びＫＩ−２／ＫＳ−３由来の３種類のｃＤＮＡ
断片（それぞれprobe A 、probeB 、probe C とした)
を用いた。これらプローブの32P-ラベル、ハイブリダイ
ゼーション、洗浄などは公知の方法(Otsu et al.(1993)
FEBS Lett.320,246-250)に従った。なお、洗浄は0.5×
ＳＳＣ、0.1 ％ＳＤＳを含む溶液中で50℃で洗浄した条
件（"Low"）、および0.1×ＳＳＣ、0.1 ％ＳＤＳを含む
溶液中で65℃で洗浄した条件("High")で行った。
が20μｇの場合はバンドを観察することができなかった
が、２μｇのポリ(A)+ ＲＮＡを用いて〜3.5 kbのバン
ド（図の「←」部）を検出することができた。また、数
種類のラット組織におけるＲＮＡの発現を、ＫＳ−１プ
ローブを用いて解析した。その結果、図４に示す通り、
精巣が他の組織よりも高いレベルの発現を示した。脳、
脾臓、肺、骨格筋、腎臓及び心臓についてもまた、発現
を示した。これに対し、肝臓では、明らかなバンドは観
察されなかった。 (6) ＣＮＫ１遺伝子の他の哺乳類での保存性 ＣＮＫ１遺伝子が他の哺乳類でも存在していることを確
認するため、ヒト、ウシ、マウスおよびラットの４種類
のゲノムＤＮＡを用いてサザンブロット解析を行った。
これらゲノムＤＮＡを制限酵素ＥcoＲＩで消化後、常法
に従ってアガロースゲル電気泳動およびニトロセルロー
スフィルター（BA85，Schleicher & Schull)へのトラン
スファーを行った。プローブにはＫＳ−１由来、ＫＩ−
１由来及びＫＩ−２／ＫＳ−３由来の３種類のｃＤＮＡ
断片（それぞれprobe A 、probeB 、probe C とした)
を用いた。これらプローブの32P-ラベル、ハイブリダイ
ゼーション、洗浄などは公知の方法(Otsu et al.(1993)
FEBS Lett.320,246-250)に従った。なお、洗浄は0.5×
ＳＳＣ、0.1 ％ＳＤＳを含む溶液中で50℃で洗浄した条
件（"Low"）、および0.1×ＳＳＣ、0.1 ％ＳＤＳを含む
溶液中で65℃で洗浄した条件("High")で行った。
【００３１】結果を図５に示す。図５のように３つのプ
ローブのいずれを用いても、ラット以外のヒト、ウシお
よびマウスにＣＮＫ１遺伝子と相同な遺伝子が保存され
ていることを示した。すなわち、Low 条件で洗浄した場
合にヒト、ウシ、ラット、マウスのいずれにおいてもバ
ンドは現れたのに対し、High条件で洗浄するとラット以
外ではバンドを検出しにくくなることから、ラット以外
の種（ヒト、ウシ、マウス）においてもＣＮＫ１遺伝子
と相同な遺伝子が保存されていることを意味する。
ローブのいずれを用いても、ラット以外のヒト、ウシお
よびマウスにＣＮＫ１遺伝子と相同な遺伝子が保存され
ていることを示した。すなわち、Low 条件で洗浄した場
合にヒト、ウシ、ラット、マウスのいずれにおいてもバ
ンドは現れたのに対し、High条件で洗浄するとラット以
外ではバンドを検出しにくくなることから、ラット以外
の種（ヒト、ウシ、マウス）においてもＣＮＫ１遺伝子
と相同な遺伝子が保存されていることを意味する。
【００３２】
【発明の効果】本発明により、プロテインキナーゼを実
質的にコードする遺伝子および該遺伝子を保有するプラ
スミドが提供される。
質的にコードする遺伝子および該遺伝子を保有するプラ
スミドが提供される。
【００３３】
配列番号：１ 配列の長さ：2800 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源： 生物名：ラット 株名：NRK-49F 細胞株 配列：
【００３４】配列番号：２ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ATGCAYMGNG AYGTNAARCC 20
【００３５】配列番号：３ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TGNCCNGANA CNCCRAARTC 20
【００３６】配列番号：４ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AGTAACTTTT TATACAATAG ACGC 24
【００３７】配列番号：５ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GTCCACCAAG GCATACTTT TTCAG 24
【図１】本発明の遺伝子のｃＤＮＡの構造を示す図であ
る。
る。
【図２】ＣＮＫ１とＣＤＣ７およびＣＤＣ28との間の相
同性の比較を示す図である。
同性の比較を示す図である。
【図３】ラットＮＲＫ細胞でのノーザンブロット解析に
よるＣＮＫ１発現の検討結果を示す図である（電気泳動
の写真）。
よるＣＮＫ１発現の検討結果を示す図である（電気泳動
の写真）。
【図４】ラット各組織におけるＣＮＫ１ｍＲＮＡの発現
を、ノーザンブロット法による解析した結果を示す図で
ある（電気泳動の写真）。
を、ノーザンブロット法による解析した結果を示す図で
ある（電気泳動の写真）。
【図５】ヒト、ウシ、ラット、マウスの４哺乳類でのＣ
ＮＫ１遺伝子の保存性をゲノムサザンブロット法により
解析した結果を示す図である（電気泳動の写真）。
ＮＫ１遺伝子の保存性をゲノムサザンブロット法により
解析した結果を示す図である（電気泳動の写真）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/12 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (2)
- 【請求項１】 配列番号１で表されるアミノ酸配列をコ
ードするＣＮＫ１遺伝子。 - 【請求項２】 請求項１記載のＣＮＫ１遺伝子を組み込
んだ組換え体プラスミド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7138152A JP3014295B2 (ja) | 1995-06-05 | 1995-06-05 | Ｃｎｋ１遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7138152A JP3014295B2 (ja) | 1995-06-05 | 1995-06-05 | Ｃｎｋ１遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08322571A JPH08322571A (ja) | 1996-12-10 |
| JP3014295B2 true JP3014295B2 (ja) | 2000-02-28 |
Family
ID=15215239
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7138152A Expired - Fee Related JP3014295B2 (ja) | 1995-06-05 | 1995-06-05 | Ｃｎｋ１遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3014295B2 (ja) |
-
1995
- 1995-06-05 JP JP7138152A patent/JP3014295B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08322571A (ja) | 1996-12-10 |
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