JP3007909B1 - 複合微生物系における特定菌株の存在量を測定する方法 - Google Patents
複合微生物系における特定菌株の存在量を測定する方法Info
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Abstract
【要約】
【目的】 複合微生物系において特定菌株の存在量を特
異的にそして簡便かつ迅速に測定する方法を提供するこ
と。 【解決手段】 複合微生物系に、酸化還元蛍光物質と特
定菌株に特異的な基質とを添加し、複合微生物系の、添
加した酸化還元蛍光物質に由来する蛍光色の強度を測定
することを特徴とする複合微生物系における特定菌株の
存在量を測定する方法。
異的にそして簡便かつ迅速に測定する方法を提供するこ
と。 【解決手段】 複合微生物系に、酸化還元蛍光物質と特
定菌株に特異的な基質とを添加し、複合微生物系の、添
加した酸化還元蛍光物質に由来する蛍光色の強度を測定
することを特徴とする複合微生物系における特定菌株の
存在量を測定する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、複合微生物系にお
ける特定菌株の存在量を測定する方法に関する。
ける特定菌株の存在量を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】最近、複数の微生物が混在している微生
物系を用いて特定物質を生産する方法が注目されている
（別府：平成１０年度農芸化学会大会講演要旨集；１２
０頁；平成１０年４月３日、名古屋大学）。それは、従
来の単独の微生物からなる微生物系では生産できなかっ
たものが、生産できるのではないかという期待からであ
る。しかしながら、かかる系において、系内の各々の微
生物の活性量や動態などを特異的に、そして簡便かつ迅
速に解析する方法はまだ確立されていないので、どの微
生物がどのように働いているのかなどは分からない。そ
のような事情により、当該方法は未だ一般化されていな
いのが現状である。
物系を用いて特定物質を生産する方法が注目されている
（別府：平成１０年度農芸化学会大会講演要旨集；１２
０頁；平成１０年４月３日、名古屋大学）。それは、従
来の単独の微生物からなる微生物系では生産できなかっ
たものが、生産できるのではないかという期待からであ
る。しかしながら、かかる系において、系内の各々の微
生物の活性量や動態などを特異的に、そして簡便かつ迅
速に解析する方法はまだ確立されていないので、どの微
生物がどのように働いているのかなどは分からない。そ
のような事情により、当該方法は未だ一般化されていな
いのが現状である。
【０００３】また、現在、地球上に存在する微生物の内
で、我々が単独の微生物として分離して利用しているの
は、その０．０１％位である言われている。その理由と
して、大部分の微生物は複数のものが相互作用し合い、
混在した状態で生存しており、単独の微生物として生存
できないので、単一の微生物として分離できるものは非
常に数が少ないからとされている。これらの単独の微生
物として生育できない微生物に目を向けることが今後の
微生物機能開発に必須であるとされている。
で、我々が単独の微生物として分離して利用しているの
は、その０．０１％位である言われている。その理由と
して、大部分の微生物は複数のものが相互作用し合い、
混在した状態で生存しており、単独の微生物として生存
できないので、単一の微生物として分離できるものは非
常に数が少ないからとされている。これらの単独の微生
物として生育できない微生物に目を向けることが今後の
微生物機能開発に必須であるとされている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、上記
の状況に鑑み、複合微生物系において特定菌株の存在量
を特異的にそして簡便かつ迅速に測定する方法を提供す
ることである。
の状況に鑑み、複合微生物系において特定菌株の存在量
を特異的にそして簡便かつ迅速に測定する方法を提供す
ることである。
【０００５】従来、５−シアノ−２，３−ジトリルテト
ラゾリウムクロライド（5-cyano-2,3-ditolyl tetrazol
ium chloride）（以下、ＣＴＣと略称する。）などの酸
化還元蛍光物質は、呼吸している微生物系に添加される
と、微生物菌体内に取り込まれた後、還元されて不溶化
し菌体内に留まり、培養液中に溶出しなくなるという現
象が知られていた。しかも、ＣＴＣの酸化型は無色であ
るが、還元体はＣＴＣ−ホーマザン（CTC-formazan）と
称され、４３０〜５３０ｎｍの励起光で励起されて赤い
蛍光（bright red）を発するようになる。この蛍光色で
標識された細胞の数をフローサイトメトリー的に計測す
る方法で、湖沼中の微生物を静菌状態で資化可能な基質
を添加することなく計測する方法が提案されている（P.
D. del Giorgio, Y.T. Prairie, D.F.Bird: Microb. Ec
ol．、３４巻、１４４〜１５４頁、１９９７年）。
ラゾリウムクロライド（5-cyano-2,3-ditolyl tetrazol
ium chloride）（以下、ＣＴＣと略称する。）などの酸
化還元蛍光物質は、呼吸している微生物系に添加される
と、微生物菌体内に取り込まれた後、還元されて不溶化
し菌体内に留まり、培養液中に溶出しなくなるという現
象が知られていた。しかも、ＣＴＣの酸化型は無色であ
るが、還元体はＣＴＣ−ホーマザン（CTC-formazan）と
称され、４３０〜５３０ｎｍの励起光で励起されて赤い
蛍光（bright red）を発するようになる。この蛍光色で
標識された細胞の数をフローサイトメトリー的に計測す
る方法で、湖沼中の微生物を静菌状態で資化可能な基質
を添加することなく計測する方法が提案されている（P.
D. del Giorgio, Y.T. Prairie, D.F.Bird: Microb. Ec
ol．、３４巻、１４４〜１５４頁、１９９７年）。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するにあたり、上記の現象に注目して、多数の実
験を重ねた。その結果、微生物がＣＴＣを還元する能力
は、ただ単に呼吸だけしている静菌状態でいるものよ
り、基質を資化して盛んに生命活動を営んでいるものの
方がはるかに高いという知見を得た。本発明はかかる知
見に基づいて完成されたものである。
を解決するにあたり、上記の現象に注目して、多数の実
験を重ねた。その結果、微生物がＣＴＣを還元する能力
は、ただ単に呼吸だけしている静菌状態でいるものよ
り、基質を資化して盛んに生命活動を営んでいるものの
方がはるかに高いという知見を得た。本発明はかかる知
見に基づいて完成されたものである。
【０００７】すなわち、本発明は、特定菌株を含む複合
微生物系に、酸化還元蛍光物質と特定菌株に特異的な基
質とを添加した後、当該複合微生物系の、当該酸化還元
蛍光物質に由来する蛍光色の強度を時間の関数として測
定し、次いで蛍光色の強度の変化速度を求め、当該速度
から特定菌株の存在量を測定することを特徴とする複合
微生物系における特定菌株の存在量を測定する方法を提
供する。
微生物系に、酸化還元蛍光物質と特定菌株に特異的な基
質とを添加した後、当該複合微生物系の、当該酸化還元
蛍光物質に由来する蛍光色の強度を時間の関数として測
定し、次いで蛍光色の強度の変化速度を求め、当該速度
から特定菌株の存在量を測定することを特徴とする複合
微生物系における特定菌株の存在量を測定する方法を提
供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】次に好ましい実施の形態を挙げて
本発明をさらに詳細に説明する。本発明においていう複
合微生物系とは、少なくとも２種以上の微生物が混在し
ており、特定菌株に特異的な基質を添加した場合に、特
定菌株だけが、特定菌株以外の菌株に比べてより一層の
生命活動を営むことができる系で、液体状態若しくは固
体状態の系のことを言う。固体状態の系とは、例えば、
ゼラチン若しくは寒天などの高分子物質などを用いて調
製される固体培地上に複数の微生物が存在する状態の系
のことである。そして、混在している特定菌株以外の微
生物は、特定菌株に特異的な基質が添加された場合にも
生育していてもよいが、静菌状態でもよい。また、当該
微生物としては培養状態から得た洗浄菌体を緩衝液に懸
濁した状態でもよい。本発明においては、培養状態から
得た洗浄菌体を緩衝液に懸濁した状態の系の方が好まし
い。そして、その数は理論的には細胞数としてその系に
少なくとも２種の微生物が各々１個以上存在していれば
よいが、少なくとも特定菌株が１０6個／ｍｌ以上の割
合で存在しているのが好ましい。当該系はｐＨが３〜１
２、好ましくは５〜１１であり、また、好気的でも嫌気
的でもよい。本発明において、ｐＨが１０〜１２の場合
の例として、好アルカリ性微生物をｐＨが３〜５の場合
の例として、乳酸菌などの耐酸性微生物を挙げることが
できる。
本発明をさらに詳細に説明する。本発明においていう複
合微生物系とは、少なくとも２種以上の微生物が混在し
ており、特定菌株に特異的な基質を添加した場合に、特
定菌株だけが、特定菌株以外の菌株に比べてより一層の
生命活動を営むことができる系で、液体状態若しくは固
体状態の系のことを言う。固体状態の系とは、例えば、
ゼラチン若しくは寒天などの高分子物質などを用いて調
製される固体培地上に複数の微生物が存在する状態の系
のことである。そして、混在している特定菌株以外の微
生物は、特定菌株に特異的な基質が添加された場合にも
生育していてもよいが、静菌状態でもよい。また、当該
微生物としては培養状態から得た洗浄菌体を緩衝液に懸
濁した状態でもよい。本発明においては、培養状態から
得た洗浄菌体を緩衝液に懸濁した状態の系の方が好まし
い。そして、その数は理論的には細胞数としてその系に
少なくとも２種の微生物が各々１個以上存在していれば
よいが、少なくとも特定菌株が１０6個／ｍｌ以上の割
合で存在しているのが好ましい。当該系はｐＨが３〜１
２、好ましくは５〜１１であり、また、好気的でも嫌気
的でもよい。本発明において、ｐＨが１０〜１２の場合
の例として、好アルカリ性微生物をｐＨが３〜５の場合
の例として、乳酸菌などの耐酸性微生物を挙げることが
できる。
【０００９】そして、微生物とは、細菌、放線菌、黴、
酵母、藍藻、プランクトン、およびそれらの細胞に付随
して増殖するファージ、マイコプラズマ、リッケキャな
ども含めるものとする。一般的には、複合微生物系に存
在する微生物を分離して特定できない場合が多い。即
ち、当該系においては、複数の微生物が相互作用して生
存していることが多いからである。このような場合、複
合微生物系における１６ＳｒＲＮＡの遺伝子ＤＮＡを常
法に従って解析して、それらを特定することができる
（Bulletin Japanese Society of Microbial Ecology、
１０巻、３１〜４２ページ、１９９５年）。
酵母、藍藻、プランクトン、およびそれらの細胞に付随
して増殖するファージ、マイコプラズマ、リッケキャな
ども含めるものとする。一般的には、複合微生物系に存
在する微生物を分離して特定できない場合が多い。即
ち、当該系においては、複数の微生物が相互作用して生
存していることが多いからである。このような場合、複
合微生物系における１６ＳｒＲＮＡの遺伝子ＤＮＡを常
法に従って解析して、それらを特定することができる
（Bulletin Japanese Society of Microbial Ecology、
１０巻、３１〜４２ページ、１９９５年）。
【００１０】本発明に使用する酸化還元蛍光物質とし
て、当該蛍光物質が酸化型と還元型で、発する蛍光色が
異なるものものであり、例えば、ＣＴＣ、シアノ−ジク
ロロフェニルホーマザン（cyano-dichlorophenyl forma
zan；ＣＣＰＣ）、シアノ−ジアニソイルテトラゾリウ
ムクロライド（cyano-dianisoyl tetrazolium chlorid
e；ＣＡＣ）などを挙げることができる。ＣＴＣの場
合、その酸化型は溶液が無色であるが、その還元型は赤
色を呈し、水に不溶である。複合微生物系に添加する酸
化還元蛍光物質の量は、系に存在する特定菌株の存在量
との相関において決まるが、その存在量が不明なために
添加量を経験的に決める必要がある。すなわち、各種の
量を添加して蛍光強度の変化速度を常法に従って測定す
る。最大の変化速度を与える添加量が本発明における最
適な添加量である。具体的には、これは、ラインウイー
ヴァ・バークのプロット（Lineweaver-Burk's plott）
から容易に求めることができる。しかしながら、一般的
には、特定菌株の存在量が細胞の個数として１０8〜１
０9個／ｍｌの場合、添加する酸化還元蛍光物質は終濃
度として２〜６ｍＭ濃度、好ましくは４〜５ｍＭ濃度を
与える量である。濃度が２ｍＭ未満の場合には十分な蛍
光色が出ない。濃度が６ｍＭを超える場合には微生物の
生育を阻害するようになるので好ましくない。酸化還元
蛍光物質を添加する場合、該蛍光物質を少量の水、緩衝
液、またはアセトン、アルコールなどの水溶性有機溶媒
などに溶かしてから添加してもよく、固体若しくは粉末
のまま添加してもよく、特に酸化還元蛍光物質の添加方
法は限定されない。
て、当該蛍光物質が酸化型と還元型で、発する蛍光色が
異なるものものであり、例えば、ＣＴＣ、シアノ−ジク
ロロフェニルホーマザン（cyano-dichlorophenyl forma
zan；ＣＣＰＣ）、シアノ−ジアニソイルテトラゾリウ
ムクロライド（cyano-dianisoyl tetrazolium chlorid
e；ＣＡＣ）などを挙げることができる。ＣＴＣの場
合、その酸化型は溶液が無色であるが、その還元型は赤
色を呈し、水に不溶である。複合微生物系に添加する酸
化還元蛍光物質の量は、系に存在する特定菌株の存在量
との相関において決まるが、その存在量が不明なために
添加量を経験的に決める必要がある。すなわち、各種の
量を添加して蛍光強度の変化速度を常法に従って測定す
る。最大の変化速度を与える添加量が本発明における最
適な添加量である。具体的には、これは、ラインウイー
ヴァ・バークのプロット（Lineweaver-Burk's plott）
から容易に求めることができる。しかしながら、一般的
には、特定菌株の存在量が細胞の個数として１０8〜１
０9個／ｍｌの場合、添加する酸化還元蛍光物質は終濃
度として２〜６ｍＭ濃度、好ましくは４〜５ｍＭ濃度を
与える量である。濃度が２ｍＭ未満の場合には十分な蛍
光色が出ない。濃度が６ｍＭを超える場合には微生物の
生育を阻害するようになるので好ましくない。酸化還元
蛍光物質を添加する場合、該蛍光物質を少量の水、緩衝
液、またはアセトン、アルコールなどの水溶性有機溶媒
などに溶かしてから添加してもよく、固体若しくは粉末
のまま添加してもよく、特に酸化還元蛍光物質の添加方
法は限定されない。
【００１１】本発明において特定菌株とは、複合微生物
系に存在している複数のものの中で、その存在量を求め
る菌株のことで、必ずしも一種の菌株でなくともよい。
即ち、少なくとも一種以上の微生物の菌株からなるもの
である。
系に存在している複数のものの中で、その存在量を求め
る菌株のことで、必ずしも一種の菌株でなくともよい。
即ち、少なくとも一種以上の微生物の菌株からなるもの
である。
【００１２】特定菌株に特異的な基質とは、その菌株
が、その基質を資化して生命活動のエネルギー源とする
ことができるが、特定菌株以外の当該系に存在する他の
微生物が資化できないか、できてもその能力が弱い場合
における基質のことをいう。例として、各種炭素若しく
は窒素化合物（高分子化合物も含む。）または無機物質
であり、より具体的には、各種炭素化合物としては、各
種糖質化合物、各種有機酸またはそれらの各種誘導体な
ど；窒素化合物としては、各種アミノ酸、各種含窒素化
合物、またはそれらの各種誘導体など；無機物質として
は、イオウ化合物、鉄化合物などの嫌気的呼吸の基質と
なり得るものなどを挙げることができる。
が、その基質を資化して生命活動のエネルギー源とする
ことができるが、特定菌株以外の当該系に存在する他の
微生物が資化できないか、できてもその能力が弱い場合
における基質のことをいう。例として、各種炭素若しく
は窒素化合物（高分子化合物も含む。）または無機物質
であり、より具体的には、各種炭素化合物としては、各
種糖質化合物、各種有機酸またはそれらの各種誘導体な
ど；窒素化合物としては、各種アミノ酸、各種含窒素化
合物、またはそれらの各種誘導体など；無機物質として
は、イオウ化合物、鉄化合物などの嫌気的呼吸の基質と
なり得るものなどを挙げることができる。
【００１３】特定菌株に対する特異的な基質を決定する
方法は、複合微生物系に存在する特定菌株を常法に従っ
て分離して、該分離した菌株の性質を調べればよい。し
かし、特定菌株が分離できないか、または分離できても
その生存を維持できないかなどして、資化できる特異的
な基質を特定できない場合には、複合微生物系における
１６ＳｒＲＮＡの遺伝子から、特定微生物を常法の通り
に特定してその特定微生物の既知菌株から判断すること
ができる（Bulletin Japanese Society of Microbial E
cology、１０巻、３１〜４２ページ、１９９５年）。
方法は、複合微生物系に存在する特定菌株を常法に従っ
て分離して、該分離した菌株の性質を調べればよい。し
かし、特定菌株が分離できないか、または分離できても
その生存を維持できないかなどして、資化できる特異的
な基質を特定できない場合には、複合微生物系における
１６ＳｒＲＮＡの遺伝子から、特定微生物を常法の通り
に特定してその特定微生物の既知菌株から判断すること
ができる（Bulletin Japanese Society of Microbial E
cology、１０巻、３１〜４２ページ、１９９５年）。
【００１４】上記基質の添加量は、複合微生物系におけ
る特定菌株の存在量に依存する。特定菌株の存在量が不
明である場合には、各種の量の基質を添加し、複合微生
物系の、添加した酸化還元蛍光物質に由来する蛍光色の
強度の変化速度を常法に従って測定することにより、基
質の添加量を経験的に決めることができる。そして、添
加した酸化還元蛍光物質を十分に還元できる量の基質を
添加すればよい。添加した酸化還元蛍光物質を十分に還
元できる基質の量とは、基質の添加量を増加させても、
複合微生物系の、添加した酸化還元蛍光物質に由来する
蛍光色の強度がそれ以上増加しない量である。しかし、
基質の添加量は、特定菌株の細胞数１０8個／ｍｌに対
して、一般的には終濃度として１〜１００ｍＭ、好まし
くは５〜２０ｍＭ濃度を与える量である。１ｍＭ未満の
場合には、添加した酸化還元蛍光物質を十分に還元でき
ず、特異的な基質を添加しない場合との差がない。基質
の添加量が１００ｍＭ超える場合には、添加した基質が
細胞毒性を示すようになり、特定菌株が正常な生命活動
を営むことができない。
る特定菌株の存在量に依存する。特定菌株の存在量が不
明である場合には、各種の量の基質を添加し、複合微生
物系の、添加した酸化還元蛍光物質に由来する蛍光色の
強度の変化速度を常法に従って測定することにより、基
質の添加量を経験的に決めることができる。そして、添
加した酸化還元蛍光物質を十分に還元できる量の基質を
添加すればよい。添加した酸化還元蛍光物質を十分に還
元できる基質の量とは、基質の添加量を増加させても、
複合微生物系の、添加した酸化還元蛍光物質に由来する
蛍光色の強度がそれ以上増加しない量である。しかし、
基質の添加量は、特定菌株の細胞数１０8個／ｍｌに対
して、一般的には終濃度として１〜１００ｍＭ、好まし
くは５〜２０ｍＭ濃度を与える量である。１ｍＭ未満の
場合には、添加した酸化還元蛍光物質を十分に還元でき
ず、特異的な基質を添加しない場合との差がない。基質
の添加量が１００ｍＭ超える場合には、添加した基質が
細胞毒性を示すようになり、特定菌株が正常な生命活動
を営むことができない。
【００１５】本発明においては、上記の複合微生物系
に、上記の酸化還元蛍光物質と特定微生物に特異的な基
質を添加した後、特定菌株が酸化還元蛍光物質を十分に
還元できるように、該複合微生物系をインキュベートす
るのが好適であるが、場合によりインキュベートせず、
複合微生物系の、添加した酸化還元蛍光物質に由来する
蛍光色の強度の測定を直ちに開始しても構わない。も
し、インキュベートが必要な場合、その時間は５〜３０
０分間、好ましくは５〜１００分間である。５分間未満
であると、添加した酸化還元蛍光物質の還元が不十分
で、測定して得られる蛍光色の強度の変化速度は、特定
菌株の存在量を十分に反映したものにはならない。３０
０分間を超えると、蛍光色の強度は高く測定できても、
もはや、変化速度は測定できない。また、インキュベー
トする場合、その温度は特定菌株が生命活動を営むこと
ができる温度である。例えば、通常は０〜１００℃、好
ましくは５〜９０℃である。本発明において、４５℃以
上の場合の例として耐熱性若しくは好熱性の微生物を挙
げることができる。１０℃以下の場合の例として低温性
若しくは好低温性微生物を挙げることができる。
に、上記の酸化還元蛍光物質と特定微生物に特異的な基
質を添加した後、特定菌株が酸化還元蛍光物質を十分に
還元できるように、該複合微生物系をインキュベートす
るのが好適であるが、場合によりインキュベートせず、
複合微生物系の、添加した酸化還元蛍光物質に由来する
蛍光色の強度の測定を直ちに開始しても構わない。も
し、インキュベートが必要な場合、その時間は５〜３０
０分間、好ましくは５〜１００分間である。５分間未満
であると、添加した酸化還元蛍光物質の還元が不十分
で、測定して得られる蛍光色の強度の変化速度は、特定
菌株の存在量を十分に反映したものにはならない。３０
０分間を超えると、蛍光色の強度は高く測定できても、
もはや、変化速度は測定できない。また、インキュベー
トする場合、その温度は特定菌株が生命活動を営むこと
ができる温度である。例えば、通常は０〜１００℃、好
ましくは５〜９０℃である。本発明において、４５℃以
上の場合の例として耐熱性若しくは好熱性の微生物を挙
げることができる。１０℃以下の場合の例として低温性
若しくは好低温性微生物を挙げることができる。
【００１６】還元された酸化還元蛍光物質は、特定の波
長で励起するとその物質特有の色の蛍光を発する。本発
明ではその色の強度を測定することになる。例えば、Ｃ
ＴＣの場合には、特定菌株の細胞内にＣＴＣが取り込ま
れ、取り込まれたＣＴＣが還元されて不溶化し、細胞内
にＣＴＣの還元体が粒子として留るようになる。当該還
元物質の粒子（ＣＴＣホーマザン（formazan）粒子とい
う。）を４２０〜５３０ｎｍの波長で励起すると、赤い
蛍光を発するので５８０〜６８０ｎｍの波長の蛍光色の
強度を常法に従って測定すればよい。測定機器は公知の
蛍光測定機器でよい。本発明においては蛍光色の強度の
変化速度を求めるために、時間を追って蛍光色の強度を
測定するとよい。
長で励起するとその物質特有の色の蛍光を発する。本発
明ではその色の強度を測定することになる。例えば、Ｃ
ＴＣの場合には、特定菌株の細胞内にＣＴＣが取り込ま
れ、取り込まれたＣＴＣが還元されて不溶化し、細胞内
にＣＴＣの還元体が粒子として留るようになる。当該還
元物質の粒子（ＣＴＣホーマザン（formazan）粒子とい
う。）を４２０〜５３０ｎｍの波長で励起すると、赤い
蛍光を発するので５８０〜６８０ｎｍの波長の蛍光色の
強度を常法に従って測定すればよい。測定機器は公知の
蛍光測定機器でよい。本発明においては蛍光色の強度の
変化速度を求めるために、時間を追って蛍光色の強度を
測定するとよい。
【００１７】上記のようにして測定された蛍光色の強度
を単位時間に対して、紙面上にプロットする。このプロ
ット図から蛍光色の強度の単位時間当りの変化量、即ち
変化速度を求めることができる。このようにして求めら
れた変化速度は、複合微生物系における特定菌株の活性
量を現わしているものである。この活性量が大きいとい
うことは、複合微生物系において特定菌株の存在量が大
きいことを示している。このようにして本発明の目的が
達成できる。
を単位時間に対して、紙面上にプロットする。このプロ
ット図から蛍光色の強度の単位時間当りの変化量、即ち
変化速度を求めることができる。このようにして求めら
れた変化速度は、複合微生物系における特定菌株の活性
量を現わしているものである。この活性量が大きいとい
うことは、複合微生物系において特定菌株の存在量が大
きいことを示している。このようにして本発明の目的が
達成できる。
【００１８】本発明の方法は、複数の微生物が混在して
生育している微生物系で、その系に存在する個々の微生
物が、単一の微生物として分離できない場合に好適に使
用できる。例えば、土壌微生物、湖沼、河川、汚水およ
び汚水処理などの水系微生物、腸内微生物などの微生物
集団として活躍している微生物系（ミクロフロラーと称
される。）などにである。また、好塩性微生物、好熱性
微生物、好アルカリ性微生物、好酸性微生物、また、耐
塩性微生物、耐熱性微生物、耐アルカリ性微生物、耐酸
性微生物などの微生物系にも好適に使用できる。このよ
うな微生物系は、当該系に存在する個々の微生物が相互
作用して特有の性質を獲得している場合が多いからであ
る。
生育している微生物系で、その系に存在する個々の微生
物が、単一の微生物として分離できない場合に好適に使
用できる。例えば、土壌微生物、湖沼、河川、汚水およ
び汚水処理などの水系微生物、腸内微生物などの微生物
集団として活躍している微生物系（ミクロフロラーと称
される。）などにである。また、好塩性微生物、好熱性
微生物、好アルカリ性微生物、好酸性微生物、また、耐
塩性微生物、耐熱性微生物、耐アルカリ性微生物、耐酸
性微生物などの微生物系にも好適に使用できる。このよ
うな微生物系は、当該系に存在する個々の微生物が相互
作用して特有の性質を獲得している場合が多いからであ
る。
【００１９】なお、本発明において、複合微生物系にお
ける微生物以外の成分としては、特定菌株に特異的な基
質を添加した場合、特定菌株が生命活動を営むことがで
きるものであればよいことは前記したが、例えば、ＫＨ
2ＰＯ4、Ｋ2ＨＰＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4など
のリン酸塩、硫安、硝安、尿素などの無機窒素類、マグ
ネシウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのイ
オンの各種塩類、マンガン、亜鉛、鉄、コバルトなどの
微量金属イオンの硫酸塩、塩酸、炭酸塩などの各種塩
類、さらにビタミン類などが、添加した酸化還元蛍光物
質の還元が阻害されないように適当に添加した組成をも
つものであればよく、特に限定されない。
ける微生物以外の成分としては、特定菌株に特異的な基
質を添加した場合、特定菌株が生命活動を営むことがで
きるものであればよいことは前記したが、例えば、ＫＨ
2ＰＯ4、Ｋ2ＨＰＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4など
のリン酸塩、硫安、硝安、尿素などの無機窒素類、マグ
ネシウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのイ
オンの各種塩類、マンガン、亜鉛、鉄、コバルトなどの
微量金属イオンの硫酸塩、塩酸、炭酸塩などの各種塩
類、さらにビタミン類などが、添加した酸化還元蛍光物
質の還元が阻害されないように適当に添加した組成をも
つものであればよく、特に限定されない。
【００２０】本発明においては、上記の成分以外に、リ
ン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液、トリス
・グリシン緩衝液、クエン酸緩衝液、グット緩衝液など
の各種緩衝液をも用いることができる。緩衝液の濃度
は、酸化還元蛍光物質の還元を阻害しない濃度である。
その濃度は緩衝液の種類と酸化還元蛍光物質の種類に依
存する。例えば、１０ｍＭ以上のリン酸緩衝液を用いた
場合には、ＣＴＣの還元を阻害するので、そのような濃
度は好ましくない（Journal of Applied Bacteriolog
y、８０巻、２０９〜２１５頁、１９９６年）。上記成
分および緩衝液のｐＨは４〜１２、好ましくは５〜９で
ある。
ン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液、トリス
・グリシン緩衝液、クエン酸緩衝液、グット緩衝液など
の各種緩衝液をも用いることができる。緩衝液の濃度
は、酸化還元蛍光物質の還元を阻害しない濃度である。
その濃度は緩衝液の種類と酸化還元蛍光物質の種類に依
存する。例えば、１０ｍＭ以上のリン酸緩衝液を用いた
場合には、ＣＴＣの還元を阻害するので、そのような濃
度は好ましくない（Journal of Applied Bacteriolog
y、８０巻、２０９〜２１５頁、１９９６年）。上記成
分および緩衝液のｐＨは４〜１２、好ましくは５〜９で
ある。
【００２１】
【実施例】次に実施例および比較例を挙げて本発明をさ
らに具体的に説明する。 実施例１ アグロバクテリウム（Agrobacterium）ｓｐ．ＫＹＭ−
８（ＦＥＲＭ Ｐ−１６８０６）とセルロモナス（Cell
ulomonus）ｓｐ．ＫＹＭ−７（ＦＥＲＭ Ｐ−１１３５
８）とが混在する複合微生物系モデルにおいて、特定菌
株としてＫＹＭ−８を採用し、ＫＹＭ−７菌株には資化
できないが、ＫＹＭ−８菌株にだけ資化できる特異的基
質として、コハク酸を選んだ場合、ＫＹＭ−８菌株は生
育できるが、ＫＹＭ−７は生育できない。この場合、複
合微生物系の、添加したＣＴＣの還元型ＣＴＣに由来す
る蛍光色の強度の変化速度はどのようになるか検討し
た。
らに具体的に説明する。 実施例１ アグロバクテリウム（Agrobacterium）ｓｐ．ＫＹＭ−
８（ＦＥＲＭ Ｐ−１６８０６）とセルロモナス（Cell
ulomonus）ｓｐ．ＫＹＭ−７（ＦＥＲＭ Ｐ−１１３５
８）とが混在する複合微生物系モデルにおいて、特定菌
株としてＫＹＭ−８を採用し、ＫＹＭ−７菌株には資化
できないが、ＫＹＭ−８菌株にだけ資化できる特異的基
質として、コハク酸を選んだ場合、ＫＹＭ−８菌株は生
育できるが、ＫＹＭ−７は生育できない。この場合、複
合微生物系の、添加したＣＴＣの還元型ＣＴＣに由来す
る蛍光色の強度の変化速度はどのようになるか検討し
た。
【００２２】ＫＹＭ−８とＫＹＭ−７の各々の斜面固体
培養物から１白金耳を取り、常法に従って調製したＮＢ
液体培地（Difco nutrient broth (NB) medium：０．０
８ｇ／１００ｍｌ）１００ｍｌを有する２個の５００ｍ
ｌ容三角フラスコに別々に接種した後、３７℃にて１６
時間別々に振蘯培養した。
培養物から１白金耳を取り、常法に従って調製したＮＢ
液体培地（Difco nutrient broth (NB) medium：０．０
８ｇ／１００ｍｌ）１００ｍｌを有する２個の５００ｍ
ｌ容三角フラスコに別々に接種した後、３７℃にて１６
時間別々に振蘯培養した。
【００２３】上記の如くにして培養して得られた培養物
の各々から、遠心分離機を使用して各菌株の菌体を得
た。１２０℃で１０分間オートクレーブで殺菌した１０
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で、上記の各菌
体を３回洗浄した。各菌体を同じＯ．Ｄ．６６０値にな
るように上記緩衝液に懸濁した。各菌体の懸濁液から等
量ずつ取り混合した。該混合液を上記緩衝液でＯ．Ｄ．
６６０値として１．０になるように希釈した。
の各々から、遠心分離機を使用して各菌株の菌体を得
た。１２０℃で１０分間オートクレーブで殺菌した１０
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で、上記の各菌
体を３回洗浄した。各菌体を同じＯ．Ｄ．６６０値にな
るように上記緩衝液に懸濁した。各菌体の懸濁液から等
量ずつ取り混合した。該混合液を上記緩衝液でＯ．Ｄ．
６６０値として１．０になるように希釈した。
【００２４】上記希釈液３００μｌ宛を１ｍｌ容の石英
セルに取った後、３０℃で１０分間インキュベートし
た。その後、１５０μｌの４０ｍＭコハク酸（基質）溶
液と１５０μｌの２０ｍＭのＣＴＣ溶液を加え、よく攪
拌した。そして、経時的に蛍光光度計で蛍光色の強度を
測定した。その際、励起光波長として４９０ｎｍを、蛍
光色の強度の測定波長として６２０ｎｍを採用した。な
お、対照（コントロール系）として上記の４０ｍＭコハ
ク酸溶液の代わりに蒸留水を用いた。その結果を図１に
示した。図１から分かるように、基質添加系では、対照
に比べて蛍光色の強度が強く測定され、明確な変化速度
を求めることができた。
セルに取った後、３０℃で１０分間インキュベートし
た。その後、１５０μｌの４０ｍＭコハク酸（基質）溶
液と１５０μｌの２０ｍＭのＣＴＣ溶液を加え、よく攪
拌した。そして、経時的に蛍光光度計で蛍光色の強度を
測定した。その際、励起光波長として４９０ｎｍを、蛍
光色の強度の測定波長として６２０ｎｍを採用した。な
お、対照（コントロール系）として上記の４０ｍＭコハ
ク酸溶液の代わりに蒸留水を用いた。その結果を図１に
示した。図１から分かるように、基質添加系では、対照
に比べて蛍光色の強度が強く測定され、明確な変化速度
を求めることができた。
【００２５】蛍光強度測定開始時と開始後１５分経過し
た時に、各々菌株の石英セルから菌液１０μｌずつ取
り、それらを適当に希釈してＮＢ平板寒天培地に塗沫し
た。３０℃で３日間培養し、出現するコロニーを数える
ことにより各々の菌株の菌数を計測した。なお、ＫＹＭ
−７とＫＹＭ−８菌株のコロニーは、特徴ある形態を示
すので、容易に識別できた。その結果、ＫＹＭ−８菌株
は開始後１５分経過した時には菌数で１．２倍に増加し
ていたが、ＫＹＭ−７菌株では殆ど変化はなかった。
た時に、各々菌株の石英セルから菌液１０μｌずつ取
り、それらを適当に希釈してＮＢ平板寒天培地に塗沫し
た。３０℃で３日間培養し、出現するコロニーを数える
ことにより各々の菌株の菌数を計測した。なお、ＫＹＭ
−７とＫＹＭ−８菌株のコロニーは、特徴ある形態を示
すので、容易に識別できた。その結果、ＫＹＭ−８菌株
は開始後１５分経過した時には菌数で１．２倍に増加し
ていたが、ＫＹＭ−７菌株では殆ど変化はなかった。
【００２６】実施例２ ＫＹＭ−７の最終菌体濃度が１．０×１０8でかつ一定
で、ＫＹＭ−８の最終菌体濃度を０．１×１０8〜３．
０×１０8に変化させた菌体混合液を調製した。次にこ
れらの各混合液における、ＫＹＭ−８の特異的基質であ
るコハク酸存在下と非存在下でのＣＴＣ還元速度の差を
求め、ＫＹＭ−８の定量を行なえるかどうかの検討を行
った。菌体の前培養と洗浄は実施例１と同様に行なっ
た。また、蛍光測定法、基質添加濃度などについても実
施例１と同様に行なった。その結果を図４に示す。コハ
ク酸存在下と非存在下でのＣＴＣ還元速度の差は、ＫＹ
Ｍ−８の菌体濃度と比例関係にあり、本方法で特定菌体
の定量化が可能であることが明らかになった。
で、ＫＹＭ−８の最終菌体濃度を０．１×１０8〜３．
０×１０8に変化させた菌体混合液を調製した。次にこ
れらの各混合液における、ＫＹＭ−８の特異的基質であ
るコハク酸存在下と非存在下でのＣＴＣ還元速度の差を
求め、ＫＹＭ−８の定量を行なえるかどうかの検討を行
った。菌体の前培養と洗浄は実施例１と同様に行なっ
た。また、蛍光測定法、基質添加濃度などについても実
施例１と同様に行なった。その結果を図４に示す。コハ
ク酸存在下と非存在下でのＣＴＣ還元速度の差は、ＫＹ
Ｍ−８の菌体濃度と比例関係にあり、本方法で特定菌体
の定量化が可能であることが明らかになった。
【００２７】比較例１ 実施例１において用いたＫＹＭ−７とＫＹＭ−８菌体の
混合液の替りに、各々の単独の菌液を、菌懸濁液を作製
した緩衝液で２倍に希釈したものを用いる以外は、実施
例１と全く同様にして蛍光色の強度の変化速度を測定し
た。その結果を、ＫＹＭ−７については図２に、また、
ＫＹＭ−８については図３に示した。各図から分かるよ
うに、ＫＹＭ−８については図１と同様な図が得られた
が、ＫＹＭ−７については基質添加系と対照系での差は
殆ど認められなかった。
混合液の替りに、各々の単独の菌液を、菌懸濁液を作製
した緩衝液で２倍に希釈したものを用いる以外は、実施
例１と全く同様にして蛍光色の強度の変化速度を測定し
た。その結果を、ＫＹＭ−７については図２に、また、
ＫＹＭ−８については図３に示した。各図から分かるよ
うに、ＫＹＭ−８については図１と同様な図が得られた
が、ＫＹＭ−７については基質添加系と対照系での差は
殆ど認められなかった。
【００２８】
【発明の効果】上記のように、複合微生物系に、酸化還
元蛍光物質と特定菌株に特異的な基質を添加し、複合微
生物系の、添加した酸化還元蛍光物質に由来する蛍光色
の強度の変化を測定することにより、複合微生物系にお
ける特定菌株の生育などの活性量、間接的にはその存在
量を特異的にそして簡便かつ迅速に測定できることが分
かる。
元蛍光物質と特定菌株に特異的な基質を添加し、複合微
生物系の、添加した酸化還元蛍光物質に由来する蛍光色
の強度の変化を測定することにより、複合微生物系にお
ける特定菌株の生育などの活性量、間接的にはその存在
量を特異的にそして簡便かつ迅速に測定できることが分
かる。
【図１】 複合微生物系における基質添加系と基質無添
加系での還元型ＣＴＣの蛍光色の強度の変化を示す図。
加系での還元型ＣＴＣの蛍光色の強度の変化を示す図。
【図２】 ＫＹＭ−７菌株の単独微生物系における基質
添加系と基質無添加系での還元型ＣＴＣの蛍光色の強度
の変化を示す図。
添加系と基質無添加系での還元型ＣＴＣの蛍光色の強度
の変化を示す図。
【図３】 ＫＹＭ−８菌株の単独微生物系における基質
添加系と基質無添加系での還元型ＣＴＣの蛍光色の強度
の変化を示す図。
添加系と基質無添加系での還元型ＣＴＣの蛍光色の強度
の変化を示す図。
【図４】 ＫＹＭ−８菌株の細胞濃度と基質添加による
ＣＴＣ還元速度の増加の関係を示す図。
ＣＴＣ還元速度の増加の関係を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 金川 貴博 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技 術院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 鎌形 洋一 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技 術院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 蔵田 信也 東京都千代田区東神田１−９−８ 環境 エンジニアリング株式会社内 (72)発明者 山田 一隆 東京都千代田区東神田１−９−８ 環境 エンジニアリング株式会社内 (72)発明者 横幕 豊一 東京都千代田区東神田１−９−８ 環境 エンジニアリング株式会社内 (72)発明者 小山 修 東京都千代田区東神田１−９−８ 環境 エンジニアリング株式会社内 (72)発明者 古庄 健太 東京都千代田区東神田１−９−８ 環境 エンジニアリング株式会社内 審査官 滝本 晶子 (56)参考文献 特開 昭54−132292（ＪＰ，Ａ)
Claims (8)
- 【請求項１】 特定菌株を含む複合微生物系に、酸化還
元蛍光物質と特定菌株に特異的な基質とを添加した後、
当該複合微生物系の、当該酸化還元蛍光物質に由来する
蛍光色の強度を時間の関数として測定し、次いで蛍光色
の強度の変化速度を求め、当該速度から特定菌株の存在
量を測定することを特徴とする複合微生物系における特
定菌株の存在量を測定する方法。 - 【請求項２】 複合微生物系が、洗浄菌体を緩衝液に懸
濁した系である請求項１に記載の複合微生物系における
特定菌株の存在量を測定する方法。 - 【請求項３】 酸化還元蛍光物質が、５−シアノ−２，
３−ジトリルテトラゾリウムクロライド（5-cyano-2,3-
ditolyl tetrazolium chloride）、シアノ−ジクロロフ
ェニルホーマザン（cyano-dichlorophenyl formazan）
および／またはシアノ−ジアニソイルテトラゾリウムク
ロライド（cyano-dianisoyl tetrazoliumchloride）で
ある請求項１に記載の複合微生物系における特定菌株の
存在量を測定する方法。 - 【請求項４】 酸化還元蛍光物質の添加量が、測定され
る蛍光色の強度の変化速度について、最大値を与える量
である請求項１に記載の複合微生物系における特定菌株
の存在量を測定する方法。 - 【請求項５】 測定される蛍光色の強度の変化速度につ
いて、最大値を与える酸化還元蛍光物質の添加量が、特
定菌株の細胞個数１０8〜１０9個／ｍｌに対して、終濃
度として２〜６ｍＭを与える量である請求項４に記載の
複合微生物系における特定菌株の存在量を測定する方
法。 - 【請求項６】 特定菌株に特異的な基質の添加量が、基
質の添加量を増加させても、複合微生物系の、添加した
酸化還元蛍光物質に由来する蛍光色の強度がそれ以上増
加しない量である請求項１に記載の複合微生物系におけ
る特定菌株の存在量を測定する方法。 - 【請求項７】 特定菌株に特異的な基質の添加量が、終
濃度として１〜１００ｍＭを与える量である請求項６に
記載の複合微生物系における特定菌株の存在量を測定す
る方法。 - 【請求項８】 複合微生物系に、酸化還元蛍光物質と特
定菌株に特異的な基質とを添加した後、５〜９０℃で５
〜３００分間インキュベーションを行う請求項１に記載
の複合微生物系における特定菌株の存在量を測定する方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29379598A JP3007909B1 (ja) | 1998-10-15 | 1998-10-15 | 複合微生物系における特定菌株の存在量を測定する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29379598A JP3007909B1 (ja) | 1998-10-15 | 1998-10-15 | 複合微生物系における特定菌株の存在量を測定する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP3007909B1 true JP3007909B1 (ja) | 2000-02-14 |
| JP2000116398A JP2000116398A (ja) | 2000-04-25 |
Family
ID=17799264
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29379598A Expired - Lifetime JP3007909B1 (ja) | 1998-10-15 | 1998-10-15 | 複合微生物系における特定菌株の存在量を測定する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3007909B1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102466847B1 (ko) * | 2020-07-27 | 2022-11-11 | 강영희 | 지압도구 |
-
1998
- 1998-10-15 JP JP29379598A patent/JP3007909B1/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102466847B1 (ko) * | 2020-07-27 | 2022-11-11 | 강영희 | 지압도구 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2000116398A (ja) | 2000-04-25 |
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