JP3006856B2 - Method for producing phospholipase DK - Google Patents
Method for producing phospholipase DKInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、リン脂質の定量や食品物性の改善等に用い
られるホスホリパーゼD−Kの新規製造法に関する。Description: TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel method for producing phospholipase DK used for quantification of phospholipids, improvement of food properties, and the like.
従来技術 ホスホリパーゼD(EC3.1.4.4)は、ホスファチジル
コリン特にグリセロリン脂質を加水分解し、ホスファチ
ジン酸とコリンを生じる反応やホスファチジル基の転移
反応を触媒する酵素である。2. Prior Art Phospholipase D (EC 3.1.4.4) is an enzyme that hydrolyzes phosphatidylcholine, particularly glycerophospholipid, and catalyzes a reaction to generate phosphatidic acid and choline and a transfer reaction of a phosphatidyl group.
ホスホリパーゼDは、ニンジン、キャベツ等の植物、
ストレプトマイセス属〔ジャーナル オブ バイオケミ
ストリー(Journal of Biochemistry;Tokyo),78巻,363
頁,1975年;同,85巻,79頁,1979年;アグリカルチュラル
アンド バイオロジカル ケミストリー(Agricultur
al and Biological Chemistry),37巻,1667頁,1973年;
同,53巻,3083頁,1989年〕ならびにアクチノマジュラ属
およびノカルディア属〔Agricultural and Biological
Chemistry,48巻,2181頁(1984年)〕などに属する微生
物に存在することが知られている。Phospholipase D is used for plants such as carrots and cabbage;
Streptomyces [Journal of Biochemistry; Tokyo, 78, 363]
85, 79, 1979; Agricultural and Biological Chemistry (Agricultur)
al and Biological Chemistry), 37, 1667, 1973;
Ibid., 53, p. 3083, 1989) and the genera Actinomadura and Nocardia (Agricultural and Biological
Chemistry, 48, 2181 (1984)].
ストレプトマイセス・アシドマイセティカス株の生産
するホスホリパーゼD−Kは、分子量54,000で、ホスフ
ァチジルコリン,ホスファチジルエタノールアミン,ホ
スファチジルセリン,ホスファチジリル−グリセロー
ル,リゾホスファチジルコリン等を基質として、そのリ
ン酸エステルを加水分解する酵素である〔特願平1−44
394号〕。Phospholipase DK produced by Streptomyces acidumyticus strain has a molecular weight of 54,000 and hydrolyzes its phosphate ester using phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidyl-glycerol, lysophosphatidylcholine or the like as a substrate. Enzyme [Japanese Patent Application No. 1-44
394].
該酵素は至適温度が50〜75℃と高く、pH4.0〜8.5の範
囲で温度50℃で1時間加熱しても活性が低下しない耐熱
性酵素であり、Caイオンまたは界面活性剤により活性化
されないなど、前述のホスホリパーゼDと異なる性質を
有する新規なホスホリパーゼDである〔特願平1−4439
4号〕。またかかる性質を有するホスホリパーゼD−K
は、食品の乳化に有用であり、該酵素を用いた卵の改質
が行われている〔特願平2−124637号〕。The enzyme is a thermostable enzyme whose optimal temperature is as high as 50 to 75 ° C and its activity does not decrease even when heated at a temperature of 50 ° C for 1 hour in a pH range of 4.0 to 8.5, and it is activated by Ca ions or surfactants. This is a novel phospholipase D having properties different from the above-mentioned phospholipase D, for example, it is not converted to a phospholipase D (Japanese Patent Application No. 1-4439).
No. 4]. In addition, phospholipase DK having such properties
Is useful for emulsifying food, and eggs are modified using the enzyme [Japanese Patent Application No. 2-124637].
家畜病のエンドトキシンであるコリネバクテリウム属
微生物由来のホスホリパーゼDに関して、該酵素のDNA
を抽出して大腸菌へクローニングしたこと〔インフェク
ション アンド イミュニティ(Infection and Immuni
ty),58巻,131頁,1990年〕が報告されているが、該酵素
の生産量はスフィンゴミエリンを基質とした場合培養液
中0.005U/mlと著しく少ない。該酵素のDNAをクローニン
グした大腸菌から得たコリネバクテリウム属微生物由来
のホスホリパーゼDのDNAの塩基配列も報告されている
〔ジャーナル オブ バクテリオロジー(Journal of B
acteriology),172巻,1256頁,1990年(以下、文献1と
いう)〕。Regarding phospholipase D derived from a microorganism of the genus Corynebacterium, which is an endotoxin for livestock diseases, the DNA of the enzyme
Was extracted and cloned into E. coli [Infection and Immunity
ty), vol. 58, p. 131, 1990], but the production of the enzyme is as low as 0.005 U / ml in the culture broth when sphingomyelin is used as a substrate. The nucleotide sequence of the DNA of phospholipase D derived from Corynebacterium microorganism obtained from Escherichia coli in which the DNA of the enzyme has been cloned has also been reported [Journal of Bacteriology (Journal of B.
acteriology), vol. 172, p. 1256, 1990 (hereinafter referred to as reference 1)].
文献1によれば、コリネバクテリウム属微生物由来の
ホスホリパーゼDはホスホリパーゼD−K〔特願平1−
44394号〕と異なり、分子量31.7Kdalで活性の発現にカ
ルシウムイオンを必要とする。文献1に示されたコリネ
バクテリウム属微生物由来のホスホリパーゼDの塩基配
列(上段)およびそれに対応するアミノ酸配列(下段)
を第1表に示す。According to Document 1, phospholipase D derived from a microorganism of the genus Corynebacterium is phospholipase DK [Japanese Patent Application No.
No. 44394], and requires a calcium ion for expression of activity at a molecular weight of 31.7 Kdal. Base sequence of phospholipase D derived from Corynebacterium genus microorganism shown in Reference 1 (upper row) and its corresponding amino acid sequence (lower row)
Are shown in Table 1.
発明が解決しようとする課題 ストレプトマイセス属微生物由来のホスホリパーゼD
−Kは食品加工等に有用であるが、ストレプトマイセス
属微生物での該酵素の生産量が少なく供給が限られてい
る。該酵素を大量に生産するためにより生産量の多い微
生物、特に培養液中に容易に該酵素を分泌することので
きる微生物を用いた製造法の開発が望まれている。 PROBLEM TO BE SOLVED BY THE INVENTION Phospholipase D derived from Streptomyces microorganism
Although -K is useful for food processing and the like, the production amount of the enzyme in a microorganism of the genus Streptomyces is small and the supply is limited. In order to produce the enzyme in large quantities, it is desired to develop a production method using a microorganism having a higher production amount, particularly a microorganism capable of easily secreting the enzyme into a culture solution.
課題を解決するための手段 本発明はストレプトマイセス属微生物に由来するホス
ホリパーゼD−KをコードするDAN、ストレプトマイセ
ス属微生物に由来するホスホリパーゼD−Kをコードす
るDNAをベクターDNAに組み込んだ組換えDNA、ストレプ
トマイセス属微生物に由来するホスホリパーゼD−Kを
コードするDNAをベクターDNAに組み込んだ組換えDNAを
含む微生物およびストレプトマイセス属微生物に由来す
るホスホリパーゼD−KをコードするDNAをベクターDNA
に組み込んだ組換えDNAを含むストレプトマイセス属に
属する微生物を、栄養培地に培養し、培養物中にホスホ
リパーゼD−Kを生成蓄積させ、該培養物からホスホリ
パーゼD−Kを採取することを特徴とするホスホリパー
ゼD−Kの製造法に関する。Means for Solving the Problems The present invention relates to a DAN encoding phospholipase DK derived from a Streptomyces genus microorganism, and a set in which a DNA encoding a phospholipase DK derived from a Streptomyces genus microorganism is incorporated into a vector DNA. A recombinant DNA, a microorganism containing a recombinant DNA obtained by incorporating a DNA encoding a phospholipase DK derived from a microorganism of the genus Streptomyces into a vector DNA, and a DNA encoding a phospholipase DK derived from a microorganism belonging to the genus Streptomyces. DNA
A microorganism belonging to the genus Streptomyces containing the recombinant DNA incorporated into the medium is cultured in a nutrient medium, phospholipase DK is produced and accumulated in the culture, and phospholipase DK is collected from the culture. And a method for producing phospholipase DK.
以下に本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. ストレプトマイセス属微生物に由来するホスホリパ
ーゼD−KをコードするDNAの抽出および該DNAをベクタ
ーDNAに組み込んだ組換えDNAの構造: ストレプトマイセス属に属する微生物からのホスホリ
パーゼD−K遺伝子を含む染色体DANの単離は常法によ
って、例えばカレント トピックス イン マイクロバ
イオロジー アンド イミュノロジー(Current Topics
in Microbiology and Immunology),96巻,1982年(以
下、文献2という)、72頁に記載の方法によって行うこ
とができる。1. Extraction of DNA encoding phospholipase DK derived from a microorganism belonging to the genus Streptomyces and structure of recombinant DNA obtained by incorporating the DNA into vector DNA: Phospholipase DK gene from a microorganism belonging to the genus Streptomyces Isolation of the chromosome DAN containing the chromosome DAN is carried out by a conventional method, for example, by using Current Topics in Microbiology and Immunology (Current Topics
in Microbiology and Immunology), vol. 96, 1982 (hereinafter referred to as reference 2), p. 72.
染色体DNAを供与する微生物としてはホスホリパーゼ
D−Kの生産能を有する微生物であればすべて使用可能
で、好適にはストレプトマイセス属微生物があげられ
る。As the microorganism that provides chromosomal DNA, any microorganism capable of producing phospholipase DK can be used, and a Streptomyces microorganism is preferred.
ついで、該染色体DNAの組み込みは常法に従って、例
えば染色体DNAおよびベクターDNAを制限酵素で切断して
両DNAの断片を調製した後、両者の混合物をDNAリガーゼ
で処理することによって行うことができる〔モレキュラ
ー クローニング(Molecular Cloning),ティー マ
ニアティス(T.Maniatis)ら編,コールド スプリング
ハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Labor
atory)刊,1982年(以下、文献3という)〕。Then, the chromosomal DNA can be integrated by a conventional method, for example, by cutting a chromosomal DNA and a vector DNA with a restriction enzyme to prepare a fragment of both DNAs, and then treating the mixture of the two with DNA ligase [ Molecular Cloning, edited by T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratories
atory), 1982 (hereinafter referred to as Reference 3)].
ここで用いられるベクターDNAとしては、ストレプト
マイセス属に属する微生物内で組み込んだDNAを発現さ
せることができるものであれば、いずれも用いることが
できる。好ましくはストレプトマイセス・リビダンスを
宿主とすることが可能なプラスミドが用いられ、とりわ
けpEN101(特願平1−304885号公報),pIJ702(文献1,7
2頁)等を用いることが好ましい。As the vector DNA used here, any vector DNA can be used as long as it can express the DNA incorporated in a microorganism belonging to the genus Streptomyces. Preferably, a plasmid capable of using Streptomyces lividans as a host is used. In particular, pEN101 (Japanese Patent Application No. 1-304885) and pIJ702 (References 1, 7)
2) is preferably used.
また、DNAの切断に用いる制限酵素としては、例えば
市販のBgl II,BamH I,Pst I,Sau3A I等があげられる。S
au3A Iによる切断部位はBgl IIおよびBamH Iによる切断
部位と同じ構造の突出末端を生じるので、染色体DNAをS
au3A Iにより限定分解して得られるDNA断片とBgl IIま
たはBamH Iで切断したベクターDNA断片とは、容易に連
結することができる。DNAリガーゼとしては市販のT4フ
ァージ感染大腸菌由来のT4DNAリガーゼが用いられる。Examples of the restriction enzyme used for cutting DNA include commercially available Bgl II, Bam H I, Pst I, Sau3A I, and the like. S
The au3A I cleavage site produces a protruding end with the same structure as the Bgl II and Bam HI cleavage sites,
A DNA fragment obtained by limited digestion with au3A I and a vector DNA fragment cut with Bgl II or Bam HI can be easily ligated. As the DNA ligase, a commercially available T4 ligase derived from Escherichia coli infected with T4 phage is used.
このようにして得られた組換えDNAの例として例えば
プラスミドpPLD1があげられる。An example of the recombinant DNA thus obtained is the plasmid pPLD1.
2. 組換えDNAのストレプトマイセス属微生物への導入
および該微生物によるホスホリパーゼD−Kの構造: 組換えDNAは、常法、例えば文献2、78頁に記載の形
質転換方法によってストレプトマイセス属微生物に導入
する〔特開平2−131577号公報〕。2. Introduction of recombinant DNA into a microorganism of the genus Streptomyces and structure of phospholipase DK by the microorganism: Recombinant DNA can be prepared by a conventional method, for example, by a transformation method described in Reference 2, p. It is introduced into microorganisms (JP-A-2-131577).
該組み換えDNAを含有する微生物は形質転換を施した
ストレプトマイセス属微生物のコロニーの中から例えば
下記のスクリーニング法によって選択する。The microorganism containing the recombinant DNA is selected from the transformed Streptomyces microorganism colonies by, for example, the following screening method.
スクリーニング方法; 再生培地上に再生してきたストレプトマイセス属の形
質転換株をチオペプトン10μg/mlを含有する適当な栄養
寒天培地に植菌し、30℃で2日間培養を行う。コロニー
が生育してきたところで42℃に保温した卵黄寒天培地
(卵黄10%,寒天0.8%)を重層する。組換えDNAを含有
する菌株のコロニーでは、ホスホリパーゼD−K活性に
より卵黄が分割され透明なゾーンが周囲に形成されるの
で、このようなコロニーを選択する。該スクリーニング
で得られるホスホリパーゼD−K活性が、プラスミドベ
クターに連結されたストレプトマイセス属に属するホス
ホリパーゼD−K生産菌株の染色体由来の遺伝情報によ
ることは、該菌株から抽出されたプラスミドDNAを用い
て、再びストレプトマイセス・リビダンスの形質転換を
行うと、得られる形質転換体の全てがホスホリパーゼD
−K生産性を示していることから確認される。Screening method: The transformed strain of Streptomyces sp. Regenerated on the regeneration medium is inoculated on a suitable nutrient agar medium containing 10 μg / ml of thiopeptone, and cultured at 30 ° C. for 2 days. When the colony has grown, overlay the egg yolk agar medium (yolk 10%, agar 0.8%) kept at 42 ° C. In a colony of a strain containing the recombinant DNA, such a colony is selected because the yolk is divided by the phospholipase DK activity and a transparent zone is formed around the yolk. The fact that the phospholipase DK activity obtained by the screening depends on the chromosome-derived genetic information of the phospholipase DK producing strain belonging to the genus Streptomyces linked to the plasmid vector is based on the plasmid DNA extracted from the strain. When Streptomyces lividans is again transformed, all of the resulting transformants are phospholipase D
It is confirmed by showing -K productivity.
このようにして得られた組換えDNAを含有する微生物
の例として、例えばストレプトマイセス・リビダンスPL
D1株(微工研条寄第2936号 平成2年5月25日)があげ
られる。Examples of microorganisms containing the recombinant DNA thus obtained include, for example, Streptomyces lividans PL
The D1 strain (Jikoken No. 2936, May 25, 1990) can be mentioned.
このようにして得られたPLD1等の微生物を、栄養培地
で液体培養することにより培養上清中の著量のホスホリ
パーゼD−Kが蓄積される。By subjecting a microorganism such as PLD1 thus obtained to liquid culture in a nutrient medium, a considerable amount of phospholipase DK in the culture supernatant is accumulated.
培養に用いられる培地としては、炭素源、窒素源、無
機物を含有する合成培地、または、天然培地のいずれも
使用できる。As a medium used for the culture, any of a synthetic medium containing a carbon source, a nitrogen source, and an inorganic substance, or a natural medium can be used.
炭素源としては、例えばグルコース、でんぷん、でん
ぷん加水分解物、グリセロール、糖蜜など種々の炭水化
物が用いられ、その使用量は5〜70g/程度が好まし
い。また、窒素源としては、例えば硫酸アンモニウム、
リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニ
ウム、ペプトン、酵母エキス、コーン・スティープ・リ
カー、カゼイン加水分解物、肉エキス等の窒素含有有機
物等が用いられ、その使用量は5〜20g/程度が好まし
い。さらに無機物としては、例えばリン酸第一水素カリ
ウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩
化マグネシウム等が用いられ、その使用量は0.05g/〜
5g/程度が好ましい。As the carbon source, various carbohydrates such as glucose, starch, starch hydrolyzate, glycerol, molasses, and the like are used, and the amount of use is preferably about 5 to 70 g / about. As the nitrogen source, for example, ammonium sulfate,
Nitrogen-containing organic substances such as ammonium phosphate, ammonium carbonate, ammonium acetate, peptone, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, meat extract and the like are used, and the use amount thereof is preferably about 5 to 20 g / g. Further, as the inorganic substance, for example, potassium hydrogen phosphate, potassium hydrogen phosphate, magnesium sulfate, magnesium chloride and the like are used, the amount of which is 0.05 g / ~
About 5 g / preferably.
ホスホリパーゼD−Kは、培養上清から精製して得る
ことができる。Phospholipase DK can be obtained by purifying from the culture supernatant.
ホスホリパーゼD−Kの精製は、該培養液から遠心分
離等の方法で菌体を除いた培養上清を、硫安塩析法、有
機溶媒沈澱法、イオン交換樹脂を用いるクロマトグラフ
ィー、ゲル過、アフィニティークロマトグラフィー等
の常法を用いて行う。Phospholipase DK can be purified by removing the cells from the culture solution by centrifugation or the like, and then removing the culture supernatant by ammonium sulfate precipitation, organic solvent precipitation, chromatography using an ion exchange resin, gel permeation, affinity. This is performed using a conventional method such as chromatography.
3. ホスホリパーゼD−KをコードするDNAの塩基配列
の決定: ホスホリパーゼD−KをコードするDNAの塩基配列の
決定は、組換えDNAを含有するストレプトマイセス・リ
ビダンス中に存在する挿入プラスミドをBamH Iによって
切り出した2.3kbのDNA断片を、大腸菌プラスミドのBamH
I断片部位にクローン化した後、決定しようとするDNA
断片の両末端側からの種々な欠失プラスミドを作成し、
これらのプラスミドを保持する形質転換株に、二本鎖DN
Aを一本鎖ファージに変換させるためのヘルパーファー
ジを感染させて一本鎖DNA(以下ssDNA)を調製し、該ss
DNAの塩基配列をダイデオキシ法の変法にしたがって決
定することにより行う。3. Determination of nucleotide sequence of DNA encoding phospholipase DK: The nucleotide sequence of DNA encoding phospholipase DK was determined by inserting the insertion plasmid present in Streptomyces lividans containing recombinant DNA into BamH. The 2.3 kb DNA fragment excised by I was ligated with BamH
DNA to be determined after cloning into the I fragment site
Create various deletion plasmids from both ends of the fragment,
Transformants carrying these plasmids should have double-stranded DN
A single-stranded DNA (hereinafter referred to as ssDNA) was prepared by infecting a helper phage for converting A into a single-stranded phage.
It is performed by determining the nucleotide sequence of the DNA according to a modification of the dideoxy method.
以下実施例をあげて本発明を具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to examples.
実施例1. ホスホリパーゼD−K遺伝子のクローニング (1) ホスホリパーゼD−K遺伝子を含む染色体DNA
の調製 ストレプトマイセス・アシドマイセスティカスIFO312
5株をSK#2培地〔スタビロースK 20g/、ペプトン
5g/、肉エキス 3g/、KH2PO40.2g/、MgCl20.6g
/(pH7.6)〕30ml中、30℃で3日間振盪培養した。得
られた培養物を冷却遠心分離機(SCR18B;日立工機製)
を用いて4℃、1000rpmの条件下10分間遠心分離して集
菌した。上清を除いた後、10.3%ショ糖溶液で洗浄後再
び遠心分離して菌体を集めた。該菌体から文献2,72頁に
記載された方法に従って染色体DNAの抽出を行ない、約1
mgの染色体DNAを得た。Example 1. Cloning of phospholipase DK gene (1) Chromosomal DNA containing phospholipase DK gene
Preparation of Streptomyces acidomycesticus IFO312
5 strains were used in SK # 2 medium [Stabilose K 20g /, peptone
5g /, meat extract 3g /, KH 2 PO 4 0.2g /, MgCl 2 0.6g
/(PH7.6)] in 30 ml with shaking at 30 ° C for 3 days. The obtained culture is cooled and centrifuged (SCR18B; manufactured by Hitachi Koki)
The cells were centrifuged at 4 ° C. and 1000 rpm for 10 minutes to collect the cells. After removing the supernatant, the cells were washed with a 10.3% sucrose solution and centrifuged again to collect the cells. Chromosomal DNA was extracted from the cells according to the method described on page 2, 72
mg of chromosomal DNA was obtained.
(2) 染色体DNA断片のベクターDNAへの導入(1)で
得られた染色体DNA10μgを、M緩衝液〔トリス−塩酸
緩衝液(pH7.5)10mM、MgCl210mM、NaCl50mM、ジチオス
レイトール(以下DTTという)1mM〕500μに溶解し
た。このDNA溶液に制限エンドヌクレアーゼSau3A I(宝
酒造社製)10単位を添加し、37℃で30分間部分分解を行
った。(2) Introduction of chromosomal DNA fragment into vector DNA 10 μg of the chromosomal DNA obtained in (1) was added to an M buffer [Tris-HCl buffer (pH 7.5) 10 mM, MgCl 2 10 mM, NaCl 50 mM, dithiothreitol (hereinafter referred to as “dithiothreitol”). DTT) (1 mM). To this DNA solution, 10 units of restriction endonuclease Sau3A I (Takara Shuzo) was added and partially digested at 37 ° C. for 30 minutes.
部分分解されたDNAを文献3に記載されている方法に
従って、10−40%ショ糖密度勾配遠心分離を行った。遠
心分離(SCR18B;日立工機製)は20℃、26000rpmで16時
間行い、遠心終了後分画を行った。The partially digested DNA was subjected to 10-40% sucrose density gradient centrifugation according to the method described in Reference 3. Centrifugation (SCR18B; manufactured by Hitachi Koki) was performed at 20 ° C. and 26000 rpm for 16 hours, and fractionation was performed after completion of centrifugation.
文献3の方法に従うアガロースゲル電気泳動により各
分画に含まれるDNA断片の大きさを測定した。3〜6kbの
DNA断片を含む分画のみを集めてエタノール沈澱を行っ
た後、エタノールを除き残存する沈澱(DNA断片)4μ
gを得た。得られた沈澱をライゲーション緩衝液〔トリ
ス−塩酸緩衝液(pH7.6)66mM、MgCl25mM、DTT5mM、ATP
1mM〕60μに溶解し保存した。The size of the DNA fragment contained in each fraction was measured by agarose gel electrophoresis according to the method of Reference 3. 3-6kb
After collecting only the fractions containing the DNA fragment and performing ethanol precipitation, 4 μl of the remaining precipitate (DNA fragment) except ethanol was removed.
g was obtained. The obtained precipitate was subjected to ligation buffer [Tris-HCl buffer (pH 7.6) 66 mM, MgCl 2 5 mM, DTT 5 mM, ATP
1 mM] and stored.
ベクターはpEN101を用い、その5μgをM緩衝液150
μに溶解した。これに制限エンドヌクレアーゼ Bgl
II(ベーリンガーマンハイム社製)20単位を添加し、37
℃で3時間反応させて部分分解した後、1Mトリス−塩酸
緩衝液(pH8.6)20μと仔牛小腸由来アルカリ性ホス
ファターゼ(ベーリンガーマンハイム社製)2単位を添
加し、37℃で1時間脱リン酸下反応を行った。反応液を
65℃で10分間加熱して酵素を完全に失活させた後、エタ
ノール沈澱にて収集した沈澱をライゲーション緩衝液40
μに溶解した。The vector used was pEN101, and 5 μg thereof was added to M buffer 150.
dissolved in μ. This is the restriction endonuclease Bgl
Add 20 units of II (Boehringer Mannheim) and add 37 units
After 3 hours of reaction at 37 ° C. for partial decomposition, 20 μl of 1M Tris-HCl buffer (pH 8.6) and 2 units of calf intestinal alkaline phosphatase (Boehringer Mannheim) were added, followed by dephosphorylation at 37 ° C. for 1 hour. The following reaction was performed. Reaction solution
After heating at 65 ° C. for 10 minutes to completely inactivate the enzyme, the precipitate collected by ethanol precipitation was added to the ligation buffer solution 40.
dissolved in μ.
染色体DNAをSau3A Iで部分分解した溶液16μとpEN1
01をBgl IIで部分分解した溶液5μとを混合し、ライ
ゲーション緩衝液で全量75μにした後、T4DNAリガー
ゼ(ベーリンガーマンハイム社製)2単位を添加し、16
℃で16時間連結反応を行い組換えDNAを得た。Chromosomal DNA partially digested with Sau3A I 16μ and pEN1
5 was mixed with 5 μl of a solution obtained by partially decomposing 01 with Bgl II, and the mixture was adjusted to a total volume of 75 μl with a ligation buffer.
A ligation reaction was performed at 16 ° C. for 16 hours to obtain a recombinant DNA.
(3) ホスホリパーゼD−KをコードするDNAを含む
組換えDNAによるストレプトマイセス・リビダンスTK23
株の形質転換 ホスホリパーゼD−KをコードするDNAを含む組換えD
NAをストレプトマイセス・リビダンスTK23株を形質転換
に供した。(3) Streptomyces lividans TK23 by recombinant DNA containing DNA encoding phospholipase DK
Transformation of strain Recombinant D containing DNA encoding phospholipase DK
NA was used for transformation of Streptomyces lividans TK23 strain.
ストレプトマイセス・リビダンスTK23株のプロトプラ
ストは、文献2,78頁に記載の方法に従って調製した。Protoplasts of Streptomyces lividans TK23 strain were prepared according to the method described on page 2, 78 of the literature.
(2)で得た組換えDNA標品10μとP緩衝液〔ショ
糖 10.3%,N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−2
−アミノエタンスルホン酸(以下TMSという)(pH7.2)
(別蒸)25mM,MgCl210mM,CaCl2(別蒸)25mM,KH2PO
4(別蒸) 0.005%,ZnCl280μg/l,FeCl3・6H2O 200μ
g/l,CuCl2・2H2O 10μg/l,MnCl2・4H2O 10μg/l,Na2B
4O7・10H2O 10μg/l,(NH4)6MO7O24・4H2O10μg/l〕
に懸濁したストレプトマイセス・リビダンスTK23株のプ
ロトプラスト100μ(約1010個/ml)を混合し、室温で
1分間放置後、440μのT緩衝液(ポリエチレングリ
コール1000を25%となるようにP緩衝液に溶解した溶
液)を添加混合した。該プロトプラスト溶液にP緩衝液
を加え全量を10mlに希釈した後、R5再生寒天培地〔ショ
糖103g/l,グルコース10g/l,イースト エクストラクト
(Difco社製)5g/l,カザミノ酸(Difco社製)0.1g/l,
K2SO40.25g/l,MgCl2・6H2O10.1g/l,CaCl2・2H2O2.94g/l
(別蒸),KH2PO40.05g/l(別蒸),NaNO30.3g/l(別
蒸),グルタミン酸ナトリウム0.03g/l(別蒸),NaOH3g
/l,TES5.73g/l,ZnCl280μg/l,FeCl3・6H2O200μg/l,CuC
l2・2H2O10μg/l,MnCl2・4H2O10μg/l,Na2B4O7・10H2O1
0μg/l,(NH4)6MO7O24・4H2O10μg/l,バクトアガー(D
ifco社製)22g/(pH7.2)〕に100μ/プレートずつ
塗布し、該培地を30℃で16時間培養した。該プロトプラ
ストと組換えDNAの混合溶液を塗布した培地に、42℃に
保温したチオペプチン含有軟寒天重層培地〔普通ブイヨ
ン培地(Difco社製)8g/,バクトアガー(Difco社
製)5g/,チオペプチド200mg/〕を1プレートあた
り、2.5ml重層した後30℃で4日間培養を行った。プロ
トプラストに組換えDNAが導入されるとチオペプチド耐
性を示すようになるが、このような形質転換株が、約30
000株得られた。10 μm of the recombinant DNA sample obtained in (2) and a P buffer [sucrose 10.3%, N-tris (hydroxymethyl) methyl-2
-Aminoethanesulfonic acid (hereinafter referred to as TMS) (pH 7.2)
(Separate steam) 25 mM, MgCl 2 10 mM, CaCl 2 (Separate steam) 25 mM, KH 2 PO
4 (another steam) 0.005%, ZnCl 2 80μg / l, FeCl 3 · 6H 2 O 200μ
g / l, CuCl 2 · 2H 2 O 10μg / l, MnCl 2 · 4H 2 O 10μg / l, Na 2 B
4 O 7・ 10H 2 O 10μg / l, (NH 4 ) 6 MO 7 O 24・ 4H 2 O 10μg / l]
100 μl (approximately 10 10 cells / ml) of Streptomyces lividans TK23 suspended in a suspension, and left at room temperature for 1 minute. (A solution dissolved in a buffer). After adding a P buffer to the protoplast solution to dilute the total volume to 10 ml, R5 regenerated agar medium [103 g / l sucrose, 10 g / l glucose, 5 g / l yeast extract (Difco), 5 g / l casamino acid (Difco) 0.1g / l,
K 2 SO 4 0.25 g / l, MgCl 2・ 6H 2 O 10.1 g / l, CaCl 2・ 2H 2 O 2.94 g / l
(Another steam), KH 2 PO 4 0.05g / l ( separate steam), NaNO 3 0.3 g / l (separate steam), sodium glutamate 0.03 g / l (separate steam), NaOH3g
/l,TES5.73g/l,ZnCl 2 80μg / l, FeCl 3 · 6H 2 O200μg / l, CuC
l 2 · 2H 2 O10μg / l , MnCl 2 · 4H 2 O10μg / l, Na 2 B 4 O 7 · 10H 2 O1
0 μg / l, (NH 4 ) 6 MO 7 O 24・ 4H 2 O 10 μg / l, Bacto agar (D
(ifco) 22 g / (pH 7.2)] at 100 μ / plate, and the medium was cultured at 30 ° C. for 16 hours. On a medium coated with the mixed solution of the protoplast and the recombinant DNA, thiopeptin-containing soft agar overlay medium (normal broth medium (Difco) 8 g /, Bacto agar (Difco) 5 g /, thiopeptide 200 mg) kept at 42 ° C. /] Was overlaid with 2.5 ml per plate and cultured at 30 ° C. for 4 days. When recombinant DNA is introduced into protoplasts, it becomes resistant to thiopeptides.
000 shares were obtained.
(4) ホスホリパーゼD−KをコードするDNAを含む
組換えDNAを含有する形質転換体の選択 (3)に示した方法により得られたストレプトマイセ
ス・リビダンスTK23株の形質転換株を滅菌した金属製の
針を用いてチオペプチド10μg/mlを含有するGPL培地
〔グリセロール20g/,ペプトン20g/,粗レシチン10
g/,KNO30.5g/,KH2PO40.5g/,MgSO4・7H2O0.5g/,
FeSO4・7H2O2×10-5g/,MnCl2・4H2O2×10-5g/,ZnSO
4・7H2O2×10-5g/,寒天20g/,(pH7.2)〕に植菌
し、30℃で2日間培養を行った。コロニーが生育してき
たところで、スリーニングのため、24℃に保温した卵黄
寒天培地(卵黄10%,寒天0.8%)を1プレートあたり1
0ml重層し、37℃で約15時間保温した。卵黄が分解され
周囲に透明なゾーンを形成しているコロニー5株を選出
し、該形質転換株をチオペプチン10μg/mlを含有するSK
#2培地10mlを入れた太型試験管に植菌し、30℃で2日
間振盪培養を行った。この培養液を冷却遠心機(SCR18
B;日立工機製)を用いて、4℃10,000rpmで10分間遠心
分離し、培養上清を得た。該培養上清中のホスホリパー
ゼD活性を特願平1−44394号に記載した方法に準じて
測定し、ホスホリパーゼD活性を強く発現する形質転換
株(PLD1株,微工研条寄第2936号 平成2年5月25日)
を取得した。(4) Selection of Transformant Containing Recombinant DNA Containing Phospholipase DK-Encoding DNA The transformant of Streptomyces lividans TK23 strain obtained by the method shown in (3) was sterilized with a metal. GPL medium containing thiopeptide 10 μg / ml [glycerol 20 g /, peptone 20 g /, crude lecithin 10
g /, KNO 3 0.5g /, KH 2 PO 4 0.5g /, MgSO 4・ 7H 2 O0.5g /,
FeSO 4 · 7H 2 O2 × 10 -5 g /, MnCl 2 · 4H 2 O2 × 10 -5 g /, ZnSO
4 · 7H 2 O2 × 10 -5 g /, agar 20 g /, was inoculated into (pH 7.2)] were cultured for 2 days at 30 ° C.. When the colony has grown, add 1 egg / agar medium (10% egg yolk, 0.8% agar) incubated at 24 ° C for screening.
The mixture was overlaid with 0 ml and kept at 37 ° C. for about 15 hours. Five colonies in which the yolk was decomposed to form a transparent zone around them were selected, and the transformed strain was SK containing 10 μg / ml thiopeptin.
The cells were inoculated into a large test tube containing 10 ml of # 2 medium and cultured at 30 ° C. for 2 days with shaking. This culture solution is cooled and centrifuged (SCR18
B; manufactured by Hitachi Koki Co., Ltd.), and centrifuged at 10,000 rpm at 4 ° C. for 10 minutes to obtain a culture supernatant. Phospholipase D activity in the culture supernatant was measured according to the method described in Japanese Patent Application No. 1-444394, and a transformant that strongly expresses phospholipase D activity (PLD1 strain, Microkoken Kenjiro No. 2936 Heisei May 25, 2)
I got
ここで得られた形質転換株PLD1株より文献2,78頁に記
載されている方法に従ってプラスミドpPLD1を抽出し
た。プラスミドpPLD1を用いて、(3)に示した形質転
換法に従って、再びストレプトマイセス・リビダンスTK
23株の形質転換を行った。出現した形質転換株のホスホ
リパーゼ生産性を上述のスクリーニング法に従って測定
したところ、測定したすべての形質転換株は、ホスホリ
パーゼD−Kの生産性を示した。The plasmid pPLD1 was extracted from the thus obtained transformant strain PLD1 according to the method described on page 2, 78 of the literature. Using the plasmid pPLD1 according to the transformation method described in (3), Streptomyces lividans TK
Transformation of 23 strains was performed. The phospholipase productivity of the emerged transformants was measured according to the above-mentioned screening method, and all the measured transformants showed phospholipase DK productivity.
本形質転換株PLD1株の含有するプラスミドpPLD1の制
限酵素切断地図を第1図に示す。FIG. 1 shows a restriction map of the plasmid pPLD1 contained in the transformed strain PLD1.
(5) ホスホリパーゼD−KのDNAの塩基配列の決定 PLD1株中のプラスミド(pPLD1)のDNA10μgをM緩衝
液〔NaCl50mM,トリス−塩酸緩衝液(pH7.5)10mM,MgCl2
10mM,DTT1mM〕30μに溶解し、BamH I(ベーリンガー
マンハイム社製)30単位で切断後、文献3,150〜163頁に
記載の方法に従って、2.3kbのDNA断片3μgを回収し
た。(5) Determination of base sequence of phospholipase DK DNA 10 μg of plasmid (pPLD1) DNA in PLD1 strain was added to M buffer [NaCl 50 mM, Tris-HCl buffer (pH 7.5) 10 mM, MgCl 2
[10 mM, DTT1 mM] 30 µm, and cut with 30 units of BamHI (manufactured by Boehringer Mannheim), and 3 µg of a 2.3 kb DNA fragment was recovered according to the method described on pages 3,150 to 163 of the literature.
大腸菌プラスミドのpUC119〔宝酒造社より購入〕2μ
gをM緩衝液20μに溶解し、BamH I10単位で切断した
後、フェノール処理、エタノール沈澱を行った。得られ
た沈澱2μgをトリス−塩酸緩衝液(pH8.6)200mM20μ
に溶解して、仔牛胸腺由来アルカリ性ホスファターゼ
(ベーリンガーマンハイム社製)1単位を用いて5′末
端の脱リン酸化をした後、65℃で15分間加熱し、さらに
フェノール処理、エタノール沈澱を行った。pPLD1からB
amH Iで切り出した2.3kbの断片とBamH Iで切断後脱リン
酸化したpUC119 1μgをそれぞれライゲーション緩衝液
20μに溶解した後混合し、T4DNAリガーゼ1単位を用
いてライゲーションを行った。E. coli plasmid pUC119 (purchased from Takara Shuzo) 2μ
g was dissolved in 20 μl of M buffer and cut with 10 units of BamHI, followed by phenol treatment and ethanol precipitation. 2 μg of the resulting precipitate was tris-hydrochloric acid buffer (pH 8.6) 200 mM 20 μm.
After dephosphorylation of the 5'-terminal using 1 unit of calf thymus-derived alkaline phosphatase (manufactured by Boehringer Mannheim), the mixture was heated at 65 ° C for 15 minutes, and further subjected to phenol treatment and ethanol precipitation. pPLD1 to B
A 2.3 kb fragment excised with amHI and 1 μg of pUC119 cleaved and dephosphorylated after digestion with BamHI were each ligated to ligation buffer.
After dissolving in 20μ, they were mixed and ligated using 1 unit of T4 DNA ligase.
該DNA標品を文献3,249〜251頁記載の方法に従って大
腸菌MV1184株〔宝酒造社より購入〕の形質転換を行った
ところ、両方向にホスホリパーゼD−Kの遺伝子を含む
2.3kbのBamH I切断片がpUC119のBamH I切断部位に挿入
されたプラスミドクローンpPLDseq1とpPLDseq7を得た。The DNA preparation was transformed with Escherichia coli MV1184 strain (purchased from Takara Shuzo Co., Ltd.) according to the method described on pages 3,249 to 251 of the literature, and it contained the phospholipase DK gene in both directions.
Plasmid clones pPLDseq1 and pPLDseq7 in which a 2.3 kb BamHI cleavage fragment was inserted into the BamHI cleavage site of pUC119 were obtained.
これらのプラスミドから〔メソド イン エンザイモ
ロジー(Method in Enzymology),155巻,156頁,1987
年〕に記載の方法に従って欠失プラスミドを作成した。From these plasmids [Method in Enzymology, 155, 156, 1987]
Year], a deletion plasmid was prepared.
該欠失プラスミドを用いて文献3,249頁記載の方法に
従って、大腸菌MV1184株の形質転換を行い、様々な大き
さの欠失プラスミドを有する形質転換株を作製した。Escherichia coli MV1184 strain was transformed using the deletion plasmid according to the method described on page 3,249 of the literature to prepare transformants having deletion plasmids of various sizes.
これらの形質転換株から〔Method in Enzymology,153
巻,3頁,1987年および同,101巻,20頁,1978年〕に記載の
方法に従って、ssDNA2μgを調製した。From these transformants, [Method in Enzymology, 153
Volume 3, page 1987, and 101, page 20, 1978], 2 μg of ssDNA was prepared.
該ssDNA断片の塩基配列の決定をSequanase (東洋紡
−U.S.Biochemical社製)を用いたダイオキシン法の変
法〔プロシーディングス オブ ナショナル アカデミ
ー オブ サイエンス,ユー・エス・エー(Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.),84巻,4767頁,1978年〕に従って行っ
た。 Determination of the base sequence of the ssDNA fragment was performed using Sequanase (Toyobo
-U.S.Biochemical Co., Ltd.)
Law [Proceedings of National Academy
ー of Science, USA (Proc. Natl.
Acad.Sci.U.S.A.), 84, 4767, 1978].
Was.
得られたストレプトマイセス由来のホスホリパーゼD
−Kの塩基配列(上段)およびそれに対応するアミノ酸
配列(下段)を第2表に示す。Phospholipase D derived from Streptomyces obtained
Table 2 shows the base sequence of -K (upper row) and the corresponding amino acid sequence (lower row).
第2表によれば、決定されたDNA塩基配列の中には、
ホスホリパーゼD−Kのタンパク質をエンドマン法〔ア
クタ ケミカ スカンジナビア(Acta.Chem.Scand.),2
27巻,283頁,1950年〕によって解析したときのN末端側
からの10個のアミノ酸配列(Asp Ser Pro Thr Pro His
Leu Asp Ala Ala)を示す塩基配列があり、タンパク質
による部分分析結果と塩基の部分分析結果が一致した。 According to Table 2, among the determined DNA base sequences,
The phospholipase DK protein was analyzed by the Endman method [Acta. Chem. Scand., 2
27, p. 283, 1950], the 10 amino acid sequence from the N-terminal side (Asp Ser Pro Thr Pro His
Leu Asp Ala Ala), and the results of partial analysis of proteins and the results of partial analysis of bases agreed.
また該塩基配列から推定されるホスホリパーゼD−K
のアミノ酸配列から分子量を計算すると53208となり、
該酵素の精製単一標品を電気泳動法〔ソディウム・ドデ
シル・サルフェイト・ポリアクリルアミドゲル(以下SD
S−PAGEという)〕によって測定した分子量54Kdalとほ
ぼ一致し、コリネバクテリウム属微生物由来のホスホリ
パーゼDの分子量31.7Kdalとは大きく異なった。さらに
ホスホリパーゼD−Kのアミノ酸配列とコリネバクテリ
ウム属微生物由来のホスホリパーゼDのアミノ酸配列
〔Journal of Bacteriology,172巻,1256頁 1990年〕の
間に相補性がなかった。Further, phospholipase DK deduced from the nucleotide sequence
Calculated molecular weight from the amino acid sequence of 53208,
A purified single sample of the enzyme was subjected to electrophoresis [Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel (hereinafter SD)
S-PAGE)] and a molecular weight of 54 Kdal, which is significantly different from the molecular weight of phospholipase D derived from Corynebacterium sp. 31.7 Kdal. Furthermore, there was no complementarity between the amino acid sequence of phospholipase DK and the amino acid sequence of phospholipase D derived from a microorganism of the genus Corynebacterium [Journal of Bacteriology, Vol. 172, p. 1256, 1990].
実施例2. 組換え体DNAを含む微生物によるホスホリパ
ーゼD−Kの発酵生産 (1) ホスホリパーゼD−K遺伝子を含む組換え体プ
ラスミドを含有するストレプトマイセス・リビダンス形
質転換株PLD1株の培養 実施例1により得られたストレプトマイセス・リビダ
ンス形質転換株PLD1株をチオペプチン10μg/mlを含有す
るSK#2培地10mlを入れた太型試験管に植菌し、30℃で
2日間振盪培養を行った。これを、チオペプチン10μg/
mlを含有するSK#2培地500mlを入れた21型バッフル付
三角フラスコに植菌し、30℃で16時間振盪培養を行っ
た。このようにして得られた培養液を冷却遠心機(SCR1
8B;日立工機製)を用いて4℃,8000rpmで20分間遠心
し、菌体を除いて培養上清400mlを得た。Example 2 Fermentative Production of Phospholipase DK by a Microorganism Containing Recombinant DNA (1) Culture of Streptomyces lividans Transformant PLD1 Containing a Recombinant Plasmid Containing Phospholipase DK Gene The Streptomyces lividans transformant PLD1 obtained in Step 1 was inoculated into a large test tube containing 10 ml of SK # 2 medium containing 10 μg / ml of thiopeptin, and cultured with shaking at 30 ° C. for 2 days. . This is thiopeptin 10μg /
The cells were inoculated into a 21-ml baffled Erlenmeyer flask containing 500 ml of SK # 2 medium containing ml, and cultured at 30 ° C. for 16 hours with shaking. The culture solution thus obtained is cooled and centrifuged (SCR1
8B; manufactured by Hitachi Koki Co., Ltd.) and centrifuged at 8,000 rpm for 20 minutes at 4 ° C. to remove the cells and obtain 400 ml of culture supernatant.
得られた培養上清中のホスホリパーゼD−K活性を特
願平1−44394号に記載された方法に準じて測定したと
ころ、15U/mlの最高力価を示した。この力価は形質転換
に用いたホスホリパーゼD−K遺伝子の供与菌株である
ストレプトマイセス・アシドマイセティカスIFO3125株
の場合の最高力価1U/mlより15倍高かった。When the phospholipase DK activity in the obtained culture supernatant was measured according to the method described in Japanese Patent Application No. 1-444394, the highest titer was 15 U / ml. This titer was 15 times higher than the highest titer of 1 U / ml in the case of the strain of Streptomyces acidomyceticas IFO3125 which is the donor strain of the phospholipase DK gene used for the transformation.
(2) 組換え体ホスホリパーゼD−Kの精製 本実施例で得た培養上清400mlに、硫酸アンモニウム1
20gを徐々に添加攪拌し1時間放置した。生じた沈澱を
冷却遠心機(SCR18B;日立工機製)を用い4℃,8000rpm
で20分間遠心した除去した。(2) Purification of recombinant phospholipase DK Ammonium sulfate 1 was added to 400 ml of the culture supernatant obtained in this example.
20 g was gradually added and stirred and left for 1 hour. The resulting precipitate was cooled at 8000 rpm at 4 ° C. using a cooling centrifuge (SCR18B; manufactured by Hitachi Koki).
And centrifuged for 20 minutes.
得られた上清に硫酸アンモニウム120gを添加攪拌し、
1時間放置した後前述と同様の条件で遠心し、沈澱を得
た。得られた沈澱を50mMトリス−マレイン酸緩衝液(pH
8.0)20mlに溶解し、透析による脱塩を行った。同硫安
画分での収率は約90%であった。120 g of ammonium sulfate was added to the obtained supernatant and stirred,
After standing for 1 hour, the mixture was centrifuged under the same conditions as described above to obtain a precipitate. The resulting precipitate is washed with 50 mM Tris-maleate buffer (pH
8.0) It was dissolved in 20 ml and desalted by dialysis. The yield in the same ammonium sulfate fraction was about 90%.
溶出画分を50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化
したDEAE−Sepharose CL6Bカラム(約100ml)に通塔し
た。カラムをさらに50mMトリス塩酸緩衝液で洗浄する
と、ホスホリパーゼD−Kを含む画分が溶出されこれを
採取した。The eluted fraction was passed through a DEAE-Sepharose CL6B column (about 100 ml) equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5). When the column was further washed with 50 mM Tris-HCl buffer, a fraction containing phospholipase DK was eluted and collected.
この段階でのホスホリパーゼD−Kの収率は90%であ
った。The yield of phospholipase DK at this stage was 90%.
該溶出画分の一部をSDS−PAGE電気泳動に付したとこ
ろホスホリパーゼD−Kに相当する位置に単一バンドが
示された。When a part of the eluted fraction was subjected to SDS-PAGE electrophoresis, a single band was shown at a position corresponding to phospholipase DK.
発明の効果 本発明によれば、ストレプトマイセス属由来のホスホ
リパーゼD−KをコードするDNAをベクターDNAに組み込
んだ組換え体DNAおよび該組換え体DNAを含む微生物が得
られ、これらはストレプトマイセス属由来のホスホリパ
ーゼD−Kの大量生産に利用することができる。Effects of the Invention According to the present invention, a recombinant DNA obtained by incorporating DNA encoding a phospholipase DK derived from Streptomyces into a vector DNA and a microorganism containing the recombinant DNA can be obtained. It can be used for mass production of phospholipase DK derived from the genus Seth.
第1図にホスホリパーゼD−Kの遺伝子を含むプラスミ
ドpPLD1の制限酵素切断地図を示す。FIG. 1 shows a restriction map of the plasmid pPLD1 containing the phospholipase DK gene.
Claims (4)
をコードするDNA。(1) A phospholipase DK comprising an amino acid sequence represented by
DNA that encodes
をコードするDNAをベクターDNAに組み込んだ組換えDN
A。(2) A phospholipase DK comprising an amino acid sequence represented by
DNA that incorporates DNA encoding DNA into vector DNA
A.
をコードするDNAをベクターDNAに組み込んだ組換えDNA
を含む微生物。(3) A phospholipase DK comprising an amino acid sequence represented by
DNA that incorporates DNA encoding DNA into vector DNA
Microorganisms containing.
をコードするDNAをベクターDNAに組み込んだ組換えDNA
を含む微生物を、栄養培地に培養し、培養物中にホスホ
リパーゼD−Kを生成蓄積させ、該培養物からホスホリ
パーゼD−Kを採取することを特徴とするホスホリパー
ゼD−Kの製造法。(4) A phospholipase DK comprising an amino acid sequence represented by
DNA that incorporates DNA encoding DNA into vector DNA
A method for producing phospholipase DK, comprising: culturing a microorganism containing, in a nutrient medium, producing and accumulating phospholipase DK in the culture, and collecting phospholipase DK from the culture.
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JP2201799A JP3006856B2 (en) | 1990-07-30 | 1990-07-30 | Method for producing phospholipase DK |
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---|---|---|---|---|
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