JP2896494B2 - 無藻ミドリゾウリムシの創製方法及び得られた無藻ミドリゾウリムシ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞質内に多量の
共生藻を有する繊毛虫ミドリゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅ
ｃｉｕｍ ｂｒｕｓａｒｉａ）から共生藻を除去し、共
生藻を有しないミドリゾウリムシ（以下、無藻ミドリゾ
ウリムシという）を創製する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】単一のミドリゾウリムシはその細胞質内
に、数百にも及ぶ多数のクロレラ属に属する藻を有する
ことが知られている。これらの内部共生藻（以下、「内
共生藻」とも言う）は、宿主の特殊な膜（ｐｅｒｉａｌ
ｇａｌ ｖａｃｕｏｌｅ）内に個々に封入されており、
接合の際に保持され、細胞分裂において両娘細胞に伝達
される。ミドリゾウリムシの細胞質から共生藻を除去す
ることは可能であり、又、共生藻もその宿主とは独立し
て生育することができることも知られている。共生藻の
除去されたミドリゾウリムシを培養して得られる株には
外部共生藻を或いはその他の微生物さえも再感染させる
ことができる。更に、無藻ミドリゾウリムシに共生藻を
経口摂取させることにより共生関係を確立させることが
可能である。即ち、無藻ミドリゾウリムシが共生藻を口
から取り入れると、共生藻のほとんどはその後消化され
るが、幾つかはｐｅｒｉａｌｇａｌ ｖａｃｕｏｌｅに
包まれ、消化されずに共生が開始（＝再共生）される。
この過程を研究するには、先ずミドリゾウリムシから共
生藻を除去して無藻ミドリゾウリムシを取得することが
必要である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】共生藻の除去に関して
は、既に幾つかの研究が報告されている。例えば、ジェ
ニングス（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）は、内部共生藻よりもミ
ドリゾウリムシが急速に繁殖し得るような過剰の食物を
提供すれば、ゾウリムシの一連の急速な分裂によって内
部共生藻を宿主から除去し得ることを見いだした［Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，２４：
１１２−１２０（１９３８）］。その後、数人の研究者
が、種々の方法、例えば、暗黒下でミドリゾウリムシの
分裂を繰り返させる方法［Ｋａｒａｋａｓｈｉａｎ
Ｍ．Ｗ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｚｏｏｌ，３６：５２−６
８（１９６３）等］や、Ｘ線を照射する方法［Ｗｈｉｃ
ｈｔｅｒｍａｎ Ｒ，Ｂｉｏｌ．Ｂｕｌｌ．，９４：１
１３−１２７（１９４８）］、或いは光合成阻害剤であ
る３−（３，４−ジクロロフェニル）−１，１−ジメチ
ル尿素（ＤＣＭＵ）に暴露する方法［Ｒｅｉｓｓｅｒ
Ｗ，，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０７：３５
７−３６０（１９７６）］によって除去し得ることを報
告した。しかしながら、これらの方法は、株が一連の分
裂により老化してしまう可能性があること、長時間を必
要とすること、大型の装置が必要となることなどの他、
実際に追試が困難であるなど、幾つかの問題点がある。
更に、従来の方法は一般に再現性がなく、ミドリゾウリ
ムシの年齢や生育期は全く問題にされておらず、又、株
間で「共生藻の除去され易さ」に差異があるのかどうか
という点についても触れられていない。

【０００４】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者等は、
共生藻を有しないミドリゾウリムシ、即ち、無藻ミドリ
ゾウリムシの創製を指向して鋭意研究を重ね、ＤＣＭＵ
等の光合成阻害剤に比べて短時間で強力な除草作用を持
つ除草剤の主成分であるパラコート（１，１′−ジメチ
ル−４，４′−ビピリジリウム塩）に着目し、ミドリゾ
ウリムシを老化或いは損傷することなく、内共生藻を短
時間で、簡便かつ確実に除去することに成功し、本発明
を完成したものである。

【０００５】即ち、本発明の無藻ミドリゾウリムシの創
製方法は、バクテリアを接種した培地を用いて、ミドリ
ゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ ｂｒｕｓａｒｉ
ａ）をその内部共生藻を破壊し得る有効量で且つ該ミド
リゾウリムシの生存許容量のパラコートの存在下に培養
することを特徴とする。ここで、特に「生存許容量」と
は、パラコートの動物毒性によりミドリゾウリムシに有
意な損傷或いは死滅の危険を実質的に与えない程度の量
を意味するものと解すべきである。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明方法に用いる培地に予め接
種される前記バクテリアはミドリゾウリムシの有機栄養
源となるもので、特にクレブシエラ・ニューモニアイ
（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が好
適である。

【０００７】前記培地は、野菜、特に緑色野菜の浸出液
に少量の無機成分を含む半合成培地であることが好まし
く、このような野菜浸出液としてはレタス浸出液が最も
好ましい。更に上記無機成分としては炭酸カルシウム等
のカルシウムを用いることがよい。このような野菜浸出
液は、例えば乾葉レタス粉末に少量のＣａＣＯ₃ を加
え、約１０００〜１５００倍容の水で数分間煮沸浸出
し、濾過した後、オートクレーブして調製する。その
他、酵母抽出物、ペプトン、グルコース等、微生物用培
地に慣用される有機成分を適宜添加してもよいことは言
うまでもない。

【０００８】本発明方法により、ミドリゾウリムシ（Ｐ
ａｒａｍｅｃｉｕｍ ｂｒｕｓａｒｉａ）の共生藻を除
去するには、上記のバクテリアを接種した培地を用い
て、ミドリゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ ｂｒｕ
ｓａｒｉａ）を、その生存許容量のパラコートの存在下
に培養する。広葉除草剤パラコートは、酸化されたフェ
レドキシンに優先的に対抗して、照明された葉緑体の光
システム１からの電子流の転換により植物に作用するの
で、この除草剤は内共生藻の葉緑体中の電子流に影響を
及ぼしてそれを損傷すると思われる。

【０００９】共生藻をミドリゾウリムシより完全に除去
するには、ミドリゾウリムシの生育段階によって異なる
が、一般にはパラコートの濃度を高々１０⁵ μｇ／ｌと
なし、少なくとも５日間培養すればよい。特に対数期に
あるミドリゾウリムシの場合には、約１０³ μｇ／ｌ〜
１０⁵ μｇ／ｌのパラコートの濃度で、約５日間培養す
れば完全無藻ミドリゾウリムシを得ることができる。パ
ラコート濃度を１０²μｇ／ｌ程度に減少した場合に
は、培養期間を少なくとも１０日、場合によっては１５
日程度とすることによって共生藻の除去が可能である。

【００１０】一方、定常期にあるミドリゾウリムシの場
合、少なくとも１０⁰ μｇ／ｌのパラコート濃度におい
て、少なくとも１０日間、好ましくは、少なくとも１５
日間の培養期間を要する。

【００１１】上記パラコートの濃度及び培養期間が増加
する程、共生藻の除去率は増大することが一応想定され
る。しかしながら、パラコート濃度と培養期間が共生藻
除去率と必ずしも比例的関係にはないことが実験的に確
認されている。ミドリゾウリムシの増殖期の他に、株
種、株の年齢、パラコートの毒性等の及ぼす影響の可能
性を考慮しても、通常は高々１０⁵ μｇ／ｌ程度のパラ
コート濃度と、少なくとも５日間の培養期間を以て目的
を達成することができる。然し乍ら、パラコート濃度及
び培養期間を必要以上に増大することは、ミドリゾウリ
ムシに対する動物毒性の観点から、或いは経済面からも
避けるべきである。

【００１２】本発明方法により処理したミドリゾウリム
シの共生藻の有無は、ニコン社製ノマルスキー（Ｎｏｍ
ａｒｓｋｉ）微分干渉コントラスト顕微鏡（ＤＩＣ）に
よる観察で確認することができる。即ち、Ｂ２フィルタ
ーを標本と接眼レンズとの間に置いて紫外光を除けば、
ミドリゾウリムシ中の共生藻のクロロフィルは赤色に蛍
光を発するので、赤色の像として観察される。この蛍光
顕微鏡検査に基づき「無藻」を確認されたミドリゾウリ
ムシを取り出し、０．０５％（ｖ／ｖ）のファント・ホ
ッフ人工海水で数回洗浄して除草剤を除去し、培養基中
に保存する。

【００１３】

【実施例】本発明方法を以下の実施例について詳述す
る。実施例には、ミドリゾウリムシの同種異系の４種類
の株（ＯＫ−３１２，交配型Ｉ；Ｈ−４，II；ＨＫ−４
８，II；ＯＺ−３，III ；ＯＫ−１ａ，ＩＶ）を用い
た。株ＯＫ−３１２とＨ−４は１９９１年に広島県東広
島市奥田大池から、又１９９２年に広島県加茂郡の白竜
湖からそれぞれ採集した。株ＯＺ−３は１９９４年に広
島県大竹市の小瀬川から採集した。その他の２株（ＨＫ
−４８とＯＫ−１ａ）は、それぞれ株Ｈ−４×Ｋ−８と
Ｋ−３１２×ＯＫ−２２３のハイブリッド形成によって
本発明者等が新たに生成したものである。株Ｋ−８とＯ
Ｋ−２２３もそれぞれ１９９１年に広島県世羅郡の池及
び東広島市奥田大池から採集した。これらの株は、バク
テリア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅ）を接種した培地中で２４−４８時間２３℃で培養し
た後に使用した。培地の調製に使用する野菜浸出液は次
のようにして作った。即ち、レタスの葉を洗浄し３０−
６０秒間煮沸し、６０−８０℃で乾燥した後、粉末とな
しデシケーターに貯えた。この乾燥レタス粉末０．５ｇ
をＣａＣＯ₃ （片山化学）２ｍｇと共に再蒸留水０．７
リットル中で５−１０分煮沸して浸出液を調製し、室温
まで冷却後濾過する。濾液に再蒸留水を加えて全容１０
００ｍｌとし、及びオートクレーブ処理（約１５分）
後、培地に使用した。

【００１４】また、以下の実施例中で、ミドリゾウリム
シの個体数の測定は、ガラスシャーレを振動させて培養
液内の細胞の分布を一様にした後、マイクロピペットで
０．１ｍｌを、窪みスライドに取り、捕れた個体を一体
ずつガラスシャーレに戻し、個体数を測定した。この操
作を５回繰り返し、その平均値を０．１ｍｌ中の個体数
とし、それを１ｍｌに換算してその時点での細胞密度と
した。なお、窪みスライドに残った培養液は全てガラス
シャーレに戻した。

【００１５】ミドリゾウリムシ一個体中の共生藻数の測
定は、スライドグラスの上に培養液がなるべく少なくな
るように細胞を乗せ、その上にカバーグラスを乗せてミ
ドリゾウリムシを押し潰し、顕微鏡下で共生藻の数を測
定した。数個体について測定し、平均値を求めてその値
をその時点の一個体中の共生藻数とした。

【００１６】（実施例１）パラコートとして、和光純薬
のＰａｒａｑｕａｔ Ｓｔａｎｄａｒｄを使用した。こ
のパラコート１００ｍｇを二重脱イオン水（ＤＤＷ）１
ｍｌに溶かして、１０⁸ μｇ／ｌ濃度となし、これを１
０⁷ 〜１０μｇ／ｌになるように１０倍ごとにＤＤＷで
希釈した。次に１０⁷ μｇ／ｌのパラコート溶液を２０
μｌとり、ミドリゾウリムシを含む培養液２ｍｌと混合
してパラコートの最終濃度を１０⁵μｇ／ｌとし、３ｃ
ｍプラスチックシャーレ中で培養した。同様にして最終
濃度１０⁵ 〜１０^-2μｇ／ｌの濃度シリーズを作成し
た。これを５、１０及び１５日間培養し、個体密度の変
化と共生藻が除去された個体の割合を求めた。培養に際
しては、全ての標準培養基に昼光色蛍光ランプの人工照
明（４００−５０００ルックス）を１日当たり１２時間
与え、残りは暗黒とした。処理されるミドリゾウリムシ
としては、株ＯＫ−３１２及びＨＫ−４８を用い、それ
ぞれ対数期及び定常期のものについて実験を行った。

【００１７】その結果を図１（定常期）及び図２（対数
期）に示す。これらの図において、横軸はパラコートの
濃度（μｇ／ｌ）を、縦軸は、各濃度でパラコート処理
した後のミドリゾウリムシ個体数の変化をコントロール
を１とした比率で示す。●、■はその濃度で共生藻が除
去された個体が得られたことを、また、○、□は、その
濃度では共生藻が除去されなかったことを示す。定常期
のミドリゾウリムシＯＫ−３１２を種々のパラコート濃
度で処理したところ、１０μｇで１０日或いは１５日間
の培養期間で共生藻が除去された（図１）。しかし、対
数期のＯＫ−３１２では、パラコート濃度１０² μｇ／
ｌで１０日間培養、或いは１０³ μｇ／ｌで１５日間培
養により無藻ミドリゾウリムシの生成が観察されるとい
う結果が得られた（図２）。このことから、ＯＫ−３１
２では定常期の方が対数期よりも共生藻が除かれ易いこ
とが分かる。この傾向はＨＫ−４８でもほぼ同様であっ
た。即ち、ＨＫ−４８についての同様な結果を示す図３
および図４において、定常期ではパラコート濃度１０⁰
μｇ／ｌで１５日間培養により除去された（図３）が、
対数期では、濃度１０² μｇ／ｌで１０日間培養、或い
は濃度１０³ μｇ／ｌで１５日間培養でないと共生藻は
除去されなかった（図４）ことが分かる。しかしなが
ら、ＨＫ−４８の場合には、定常期では、１０日で全く
共生藻が除去されないなどの現象に鑑みれば、定常期の
方が対数期よりも共生藻を除去し易いという傾向は、Ｏ
Ｋ−３１２程顕著ではないといえる。このような共生藻
の除去され易さの差異の生ずる機序は、未だ完全には解
明されていないが、ミドリゾウリムシの増殖期に伴い細
胞質内の共生藻の形態が変化するという事実と関係があ
るものと推定される。

【００１８】更に、共生藻が除去された個体が得られる
頻度が、ＯＫ−３１２の方がＨＫ−４８よりも高かっ
た。このように株間でも、共生藻の除去され易さに差異
があると思われる。しかし、この差異が、真に株の種類
による差異なのか、或いは株の年齢によるものかは明ら
かではない。また、パラコートの低濃度で共生藻が除去
され、高濃度で除去されないという現象が観察された。
低濃度で共生藻が除去されることから、パラコート耐性
を持った共生藻が存在或いは出現したとは考え難い。高
濃度のパラコートはミドリゾウリムシにも影響を与えた
と考えられるので、このことと、共生藻が除去されない
ということの間に何らかの関係があるとも推定される。
何れにせよ、従来全く問題視されなかった共生藻の除去
され易さについて、増殖期、或いは、株の種類により差
異があることが解明された。

【００１９】（比較例）シーゲル［Ｓｉｅｇｅｌ Ｒ
Ｗ：Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，１９，２３９−２５
２（１９６０）］は、前掲ジェニングスが報告した連続
暗所における藻を含まないミドリゾウリムシの創製技法
を改変した。そこで、本発明者等は共生藻を含まないミ
ドリゾウリムシを創製するその技法を再実験した。１２
日間連続的に暗所に置いた後では、ミドリゾウリムシ
（株Ｈ−４；定常期）当たり藻の数は４００から１５０
に減少し、その後は一定を保った。ミドリゾウリムシの
別の株（株ＯＫ−３１２；定常期）においては、連続暗
所中で１０日までの間、内共生藻は全く除去されなかっ
た。その結果を図５に示す。同図は、連続的暗所中、長
期間の飢餓状態下で培養したゾウリムシ当たり共生藻の
平均数を縦軸にとり、連続暗所中の日数を横軸としてプ
ロットしたものである。●はＯＫ−３１２、○はＨ−４
を示す。又、垂直の棒線は１標準偏差を表す。ゾウリム
シ（２株共）当たり共生藻の平均数は暗所中１０日まで
は徐々に減少し、その後、一定を保った。結果は２−４
個のゾウリムシの平均として表した。この期間中、両方
の株において藻を含まないゾウリムシは何れの株でも観
察されなかった。

【００２０】（実施例２）対数期にあるミドリゾウリム
シＯＫ−３１２を１０^-1〜１０⁵ μｇ／ｌの種々の濃度
のパラコートと共に培養した。ノマルスキーＤＩＣの像
においては、パラコート処理された資料中に藻を含まな
いミドリゾウリムシがパラコートの添加後５日目に観察
されたことを示した。結果を図６に示す。同図はミドリ
ゾウリムシ（ＯＫ−３１２）をパラコート（■；１０⁵
μｇ／ｌ，○；１０³ μｇ／ｌ，□；１０¹ μｇ／ｌ，
●；１０^-1μｇ／ｌ）と共に培養し、藻を有しないゾウ
リムシを数え、横軸にパラコート添加後の日数をとり、
縦軸に（藻除去ゾウリムシの数）／（ゾウリムシ全数）
（％）をプロットしたものである。濃度１０³ μｇ／ｌ
以上のパラコートの存在において処理されたミドリゾウ
リムシは全く藻を有しなかった。

【００２１】処理されたミドリゾウリムシが藻を全く含
まないことを確認するために、我々は更に、それらを蛍
光顕微鏡で観察した。細胞を水素ランプで照明すると、
藻中のクロロフィルは放射線を吸収して励起され、より
長い波長の放射線を再放射する。そこでミドリゾウリム
シ中の藻のクロロフィルは赤色に蛍光を発する。図７
は、有藻（Ａ及びＢ）及び無藻（Ｃ及びＤ）のミドリゾ
ウリムシ（ＯＫ−３１２）のノマルスキー微分干渉コン
トラスト顕微鏡映像（Ａ及びＣ）及びそれらの蛍光映像
（Ｂ及びＤ）を示す。無藻ミドリゾウリムシはパラコー
ト１０³ μｇ／ｌ添加後５日で生成した。その細胞は紫
外光源で照明されている。フィルター（Ｂ２）を試料と
接眼レンズとの間に置いて、紫外光を除去したので、蛍
光色だけが見える。ここで、藻のクロロフィルは（Ｂ）
に見られるように赤色の蛍光を発する。パラコートで処
理された細胞は赤色の蛍光を発しない（Ｄ）。標線の長
さは２０μm である。このような蛍光顕微鏡観察で、パ
ラコートと共に５日間培養した後のゾウリムシ中には藻
は全く存在しないことが分かった。この蛍光顕微鏡検査
に基づいて「無藻」として予め採点されたゾウリムシ
を、０．０５％（ｖ／ｖ）のファント・ホッフ人工海水
で３回洗浄して除草剤を除去し、一個の培養基当たり一
個のゾウリムシとして別々に保存した。１週間後、各培
養基中で増殖した数個のゾウリムシを再び蛍光顕微鏡で
観察し、内共生藻の不存在を確認した。

【００２２】また、本発明方法によって株ＯＫ−３１２
より得られた無藻ミドリゾウリムシの株（ＯＫｗ−３１
２）はバクテリアの供給に依存して生存し、相補的交配
型の共生ミドリゾウリムシ（ＯＺ−３）と混合すると接
合体に入る。接合対を単離して、それぞれの外接合体を
新鮮な培地中で培養した。２週間後に、藻を含まない外
接合体の生存率を正常な緑色外部接合体の生存率と対比
した。ミドリゾウリムシと無藻ミドリゾウリムシの生存
率は９４．０〜９８．５％であった（４回の実験）。次
いで、共生藻を持たない接合完了体の子孫を培養する。
このようにしてクローンを確立させた無藻ミドリゾウリ
ムシを以下の実験に用いた。

【００２３】［感染率の測定］以下の応用例において、
無藻ミドリゾウリムシに共生藻を感染させるには共生藻
を経口摂取させて行った。無藻ミドリゾウリムシに、共
生藻を持つミドリゾウリムシを破砕して得た共生藻を与
えて感染率を求める方法は次のようである。まず、個体
群成長の各期のミドリゾウリムシを１０００ｒｐｍ、５
分間遠心し、ミドリゾウリムシを集め、上清を捨てた後
に超音波によりミドリゾウリムシの細胞を破砕する。そ
の後、共生藻の濃度を測定し、３．３×１０⁶ ／ｍｌに
なるように調整し、１５μｌの水滴に分け、それぞれの
水滴に、個体群の成長各期の無藻ミドリゾウリムシを一
体ずつ入れる。これでミドリゾウリムシ一個体につき
５．０×１０⁴ 個の共生藻を与えることになる。２４時
間培養した後（共生藻を無藻ミドリゾウリムシに与えた
時間と感染率との関係を調べた実験では培養時間を６、
１２、及び２４時間と変える）、体外の共生藻を除去す
る為に一つの水滴中のミドリゾウリムシを３回洗う。洗
浄後、ミドリゾウリムシをマイクロプレート１ウェルに
入れたレタス浸出液（バクテリア接種済み）に接種す
る。３回洗うことで体外の共生藻が全て除去されること
は、洗浄に用いた後の塩類溶液を寒天を含むＣＡ培地に
撒き、後に共生藻のコロニーが検出されないことで確認
した。２週間後、１ウェル内に共生藻を持ったものが一
体もいない場合は感染しなかったとしてＵ（ｕｎｉｎｆ
ｅｃｔｅｄ）、共生藻を持ったものが一体でもいた場合
は感染したとしてＩ（ｉｎｆｅｃｔｅｄ）とした。感染
率（ＩＲ）は下記の式で求めた。 ＩＲ（％）＝｛Ｉ／（Ｕ＋Ｉ）｝×１００ さらに、ＣＡ培地中で培養した共生藻についても同じよ
うに無藻ミドリゾウリムシに与え、感染率を求めた。

【００２４】ここに用いたＣＡ培地の組成は次の通りで
ある Ｃａ（ＮＯ₃ ）₂ ・４Ｈ₂ ０ ２０ｍｇ ＫＮＯ₃ １００ｍｇ β−Ｎａ₂ グリセロ燐酸塩５水和物 ３０ｍｇ ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ２０ｍｇ ビタミンＢ₁ １０μｇ ビタミンＢ₁₂ ０．１μｇ ビオチン ０．１μｇ Ｐ ＩＶ ｍｅｔａｌｓ ｓｏｌ． １ｍｌ Ｆｅ（as EDTA；１：１モル）ｓｏｌ． １．５ｍｌ ＨＥＰＥＳ ４００ｍｇ ＮＨ₄ ＮＯ₃ １００ｍｇ 再蒸留水（ＲＤＷ） ９９９ｍｌ ｐＨ：７．２に調整 但し、 Ｐ ＩＶ ｍｅｔａｌｓ ｓｏｌ．： ＦｅＣｌ₃ ・６Ｈ₂ Ｏ １９．４ｍｇ ＭｎＣｌ₂ ・４Ｈ₂ Ｏ ８．２ｍｇ ＺｎＣｌ₂ １ｍｇ ＣｏＣｌ₂ ０．４ｍｇ Ｎａ₂ Ｍｏ₄ ・２Ｈ₂ Ｏ ０．８ｍｇ Ｎａ₂ ＥＤＴＡ・２Ｈ₂ Ｏ １５０ｍｇ ＲＤＷ １００ｍｌ Ｆｅ（ａｓ ＥＤＴＡ；１：１モル）ｓｏｌ．： Ｆｅ（ＮＨ₄ ）₂ （ＳＯ₄ ）₂ ・６Ｈ₂ Ｏ７０．２ｍｇ Ｎａ₂ ＥＤＴＡ ６６ｍｇ ＲＤＷ １００ｍｌ

【００２５】（応用例１） ［共生の確立と生育期の関係］定常期のＯＫ−３１２を
５μｍのメッシュを用いて集め、洗浄後、超音波破砕
し、共生藻の濃度が３．３ｘ１０⁶ ａｌｇａｅ／ｍｌと
なるように、共生藻を含む破砕懸濁液を調製した。この
懸濁液１５μｌに対し、定常期のＯＫｗ−３１２を１個
体加え（５．０ｘ１０⁴ ａｌｇａｅ／ｐａｒａｍｅｃｉ
ｕｍ）、２４時間培養した。その後、洗浄し、１個体ず
つウェルに移し、細胞除去液中で培養した。１５日後、
各ウェルのミドリゾウリムシについて、共生藻の有無を
確認し、１ウェル中に１個体でも共生藻を持ったものが
いれば、そのウェル中のミドリゾウリムシは、共生藻が
感染、共生したものとして、共生を確立したものの割合
を求めた。同様にして、定常期のＯＫ−３１２より得ら
れた共生藻を対数期のＯＫｗ−３１２に与えた場合、対
数期のＯＫ−３１２より得られた共生藻を定常期、対数
期のＯＫｗ−３１２に与えた場合のそれぞれの共生を確
立する割合を求めた。

【００２６】対数期のＯＫ−３１２より得られた共生藻
を、対数期のＯＫｗ−３１２に与えた場合、８６．４％
と高い割合でミドリゾウリムシが共生を確立した。一
方、定常期のＯＫ−３１２より得られた共生藻を、対数
期のＯＫｗ−３１２に与えた場合、表１に示すように、
明かに共生を確立する割合が低いことが分かった。

【００２７】

【表１】

【００２８】共生藻、ミドリゾウリムシ共に、定常期の
ものを用いた場合でも、かなり高い割合で共生を確立す
ることが分かったので、以下の実験では、ＯＫ−３１
２，ＯＫｗ−３１２とも定常期のものを用いた。

【００２９】（応用例２） ［共生藻のミドリゾウリムシへの再共生］ （ｉ）共生藻を含む細胞質画分の調製 定常期のミドリゾウリムシ（ＯＫ−３１２）をキムワイ
プ、３７μｍのメッシュで濾過しゴミなどを除去した。
次に、５μｍのメッシュで濾過し、メッシュ上に残った
ミドリゾウリムシに人工海水（０．０５％）を加え、数
回洗った。この操作でミドリゾウリムシが１×１０³ 〜
５×１０³ ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように調整した。こ
れを超音波破砕し、共生藻を得た。超音波破砕はＳＯＮ
ＩＦＩＥＲ４５０（ＢＲＡＮＳＯＮ）を用い、出力２
で、３０秒間とした。

【００３０】（ii）無藻ミドリゾウリムシの調製 定常期の無藻ミドリゾウリムシ（ＯＫｗー３１２）をキ
ムワイプで濾過し手回し遠心して１０００〜５０００ｃ
ｅｌｌｓ／ｍｌとした。

【００３１】(iii)無藻ミドリゾウリムシによる共生藻
の補食と共生 上記（ｉ）で得られた共生藻を含む溶液１ｍｌに対し
（ii）で得られた無藻ミドリゾウリムシを約５．０×１
０⁴ ａｌｇａｅ／ｐａｒａｍｅｃｉｕｍとなるように数
百ｃｅｌｌｓ加え、１．５ｍｌチューブ中で２４時間培
養した。２４時間後ミドリゾウリムシをピペット操作に
より３回洗浄した後、細胞除去液中に移し、培養を続け
た。細胞除去液に移した日を０日とし、０、２、４及び
１０日目に、５個体ずつとり、個体中のａｌｇａｅ数を
数えて平均し、１個体中のａｌｇａｅ数を調べた。ａｌ
ｇａｅは、紫外線により強い赤色の自家蛍光を発するた
め、ａｌｇａｅ数の観察は蛍光顕微鏡下の観察により行
った。

【００３２】（iv）細胞除去液 餌としてバクテリア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅ）を接種したレタス浸出液中でゾウリムシ
Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ ｃａｕｄａｔｕｍ（ＫＩ−１
４）、Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ ｔｅｔｒａｕｒｅｌｉａ
（Ｖ−１）及び、Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ ｔｒｉｃｈｉ
ｕｍ（ＭＭ−６）をそれぞれ培養し、定常期あるいは死
滅期のものを濾過後、オートクレーブした。

【００３３】（応用例３） ［ミドリゾウリムシ共生藻のゾウリムシへの共生］ （ｉ）共生藻を含む細胞質画分の調製 前記応用例２の（ｉ）と同様にしてミドリゾウリムシよ
り共生藻を得た。 （ii）ゾウリムシの調製 前記応用例２の（ii）と同様にしてゾウリムシを得た。 (iii)ゾウリムシによる共生藻の捕食と共生 前記応用例２の（iii)と同様にして観察を行った。

【００３４】上記応用例２及び３の結果は次の通りであ
った。即ち、共生藻を無藻ミドリゾウリムシに与えた場
合、無藻ミドリゾウリムシは２４時間共生藻を与えた直
後の観察では、体内に数十個の共生藻を取り込んでい
た。蛍光顕微鏡観察では、そのうちの幾つかはミドリゾ
ウリムシにより消化されているようであった。しかし、
培養液から共生藻を除去した後も、１個体中のａｌｇａ
ｅ数が増加した。一方、共生藻をＫＩ−１４，Ｖ−１，
ＭＭ−６に与えた場合、２日までに速やかに消化され
た。これら３種の場合、２４時間共生藻を与えた直後
（０日）の観察で、体内のａｌｇａｅの数が少ないが、
顕微鏡観察で、多くの食胞が観察されたことから、これ
は、取り込まれたａｌｇａｅが速やかに消化されたため
と考えられる。或いは、これら３種は、もともと共生藻
を取り込まなかったとも思われる。ゾウリムシ１個体当
たりの共生藻の個体数の変化を図８に示す。同図におい
て、横軸は、培養液から共生藻を除去した日を０日とし
た以降の日数を、縦軸はゾウリムシ１個体当たりの共生
藻の個体数を示す。バーは標準偏差を示す。

【００３５】（応用例４） ［クロレラのゾウリムシへの共生］ （ｉ）クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏ
ｉｄｅａ）の調製 マイヤース−４ＮＡ５培地中で培養したＣｈｌｏｒｅｌ
ｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａを遠心（１７００×ｇ，
５分）し、細胞除去液中に再懸濁した。マイヤース−４
ＮＡ５培地の組成は次の通りである。 ＫＮＯ₃ ５．０ｇ ＫＨ₂ ＰＯ₄ １．２５ｇ ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ２．５ｇ Ｆｅ ｓｏｌ． １．０ｍｌ Ａ₅ ｓｏｌ． １．０ｍｌ 再蒸留水（ＲＤＷ） １０００ｍｌ ｐＨ：５．０〜５．８に調整 但し、 Ｆｅ ｓｏｌ．：ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ２．８ｇ ｃｏｎｃ．Ｈ₂ ＳＯ₄ １．０ｍｌ ＲＤＷ １０００ｍｌ Ａ₅ ｓｏｌ．：ＨＢＯ₃ ２．８６ｇ ＭｎＣｌ₂ ・４Ｈ₂ Ｏ １．８１ｇ ＺｎＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．２２ｇ ＣｕＳＯ₄ ・５Ｈ₂ Ｏ ０．０８ｇ Ｎａ₂ Ｍｏ₄ ０．０２１ｇ ｃｏｎｃ．Ｈ₂ ＳＯ₄ １．０ｍｌ ＲＤＷ １０００ｍｌ （ii）無藻ミドリゾウリムシの調製 前記応用例２の（ii）と同様にして無藻ミドリゾウリム
シ（ＯＫｗ−３１２）を得た。 (iii) 無藻ミドリゾウリムシによるクロレラの捕食と
共生 前記応用例２の (iii)と同様にして観察を行った。

【００３６】クロレラ（Ｃ．ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）
をそれぞれゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ）へ与え
た場合、いずれも殆どが２日までに速やかに消化され、
４日後では体内に留まっているものは観察されなかった
（図９）。

【００３７】（応用例５） ［抗血清の作成と共生に与える影響］ （ｉ）抗クロレラ血清の作成 マイヤース−４ＮＡ５中で培養したクロレラ（Ｃ．ｅｌ
ｌｉｐｓｏｉｄｅａ）約１ｍｌを、１７００×ｇ、５分
間、遠心した。得られたＣ．ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａの
ペレットにアジュバント（１回目、２回目はＴｉｔｅｒ
Ｍａｘ、３回目、４回目はフロイントの不完全アジュ
バント）を加え、シリンジを用いて乳化させた。これを
抗原とし、ウサギに注射した。抗原の注射は、２回ず
つ、計４回行った。１回目の注射から約２５日後に２回
目の注射、約８０日後に３回目、約１００日後に４回目
の注射を行った。２回目の注射から約２５日後に１回
目、４回目の注射から約２０日後に２回目の採血を行っ
た。採血した血液を、１７００×ｇ、１５分間、遠心
し、上清を抗血清として用いた。

【００３８】（ii）抗血清のタイターアッセイ マイヤース−４ＮＡ５中で培養したクロレラ（Ｃ．ｅｌ
ｌｉｐｓｏｉｄｅａ）を１７００×ｇ、１５ｍｉｎ、遠
心し、Ｃ．ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａのペレット２００μ
ｌに、２００μｌのドデシル硫酸ソーダ（ＳＤＳ）と少
量のフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳ
Ｆ）を加え、ＢＲＡＮＳＯＮの超音波洗浄機を用いて、
３０分超音波破砕した。これに、ＳＤＳ２００μｌと少
量のＰＭＳＦを加え、３分間煮沸した後、１７００×
ｇ、１５分、遠心した。この上清に２００μｌに、ＲＤ
Ｗ２００μｌを加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（２５
ｍＡ、１．５時間）。ゲルは、マルチゲル１０／２０
（Ｍｕｌｔｉ ｇｅｌ １０／２０：第一化学）を用い
た。これを、メンブレン（Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂ
ｒａｎｅｓ．ＭＩＬＬＰＯＲＥ）に転写（１００ｍＡ、
２時間）し、ウェスタンブロッティングを行った。１ｓ
ｔ ａｎｔｉｂｏｄｙには、１回目の採血による血清
と、非免疫血清を用い、それぞれ、×１０、×１００、
×１０００の濃度で用いた（３７℃、３０分）。２ｎｄ
ａｎｔｉｂｏｄｙには、Ｂｉｏｔｉｎ Ｒａｂｂｉｔ
（ＢＩＯＴＩＮＹＬＡＴＥＤ ＡＮＴＩ ＲＡＢＢＩＴ
ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）．ＶＥＣＴＯＲ）を３７℃、３０
分、発色にはＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮＡＢＣＫＩＴ（ＶＥ
ＣＴＯＲ）を用いた（３７℃、３０分）。

【００３９】得られた抗血清のタイターアッセイを行っ
たところ、抗原であるＣ．ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａに由
来すると考えられる特異的なバンドは検出されなかっ
た。そこでこの抗血清において藻類の共生に影響を与え
るかどうかという点について、バイオアッセイを行っ
た。

【００４０】(iii) 抗血清のバイオアッセイ 前記応用例２の（ｉ）と同様にして共生藻或いはクロレ
ラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）を
調製し、これに１回目或いは２回目に採血により得られ
た血清を１０％、１％、或いは２．５％の割合で、３７
℃、３０分混合した後、細胞除去液で３回洗浄した（１
７００×ｇ、５分）。得られた共生藻或いはクロレラを
前記応用例２の（ii）， (iii)と同様にして、無藻ミド
リゾウリムシに与え、共生に与える影響を検討した。

【００４１】共生藻の共生に与える影響を図１０に示
す。同図の横軸は、培養液から共生藻を除去した日を０
日として以降の日数を、縦軸はＰａｒａｍｅｃｉｕｍ１
個当たりの共生藻の個体数を示し、バーは標準偏差を示
す。図中、＋血清は１１．３０（４回目の抗原注射から
約２０日目）に採血した血清を作用させた結果、ｎｏｎ
は非免疫血清を作用させた結果、ｃｏｎｔｒｏｌは、血
清を作用させなかったものを示す。同図が示す通り、抗
血清を作用させた共生藻の共生の過程は、コントロール
（ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べ、差異が見られなかった。

【００４２】図１１は、クロレラ（Ｃ．ｅｌｌｉｐｓｏ
ｉｄｅａ）の共生に与える影響を示す。図の横軸、縦軸
は図１０のものと同じである。同図から明らかな通り、
抗血清を作用させたＣ．ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａは、コ
ントロールと同様に、速やかに消化され、共に、共生を
確立することができなかった。

【００４３】（応用例６） ［共生藻の単離培養］前記応用例２の（ｉ）と同様にし
てミドリゾウリムシを濃縮した後、細胞除去液で３回洗
浄した。これを試験管中に移し、超音波洗浄機により破
砕し、懸濁液を２％寒天で固めたＣＡ培地、マイヤース
−４ＮＡ５培地に撒き、２０℃、２４時間照明下で培養
した。約８０日後形成されたコロニーを液体ＣＡ培地、
マイヤース−４ＮＡ５培地に溶き、２６℃、２４時間照
明下で震盪培養した。一部は再び寒天ＣＡ培地、マイヤ
ース−４ＮＡ５培地に撒き、２６℃、２４時間照明下で
培養した。

【００４４】ミドリゾウリムシの破砕懸濁液を、ＣＡ培
地（２％寒天）に撒いたところ、約８０日でコロニーを
形成した。これを、ＣＡ培地、マイヤース−４ＮＡ５培
地に溶き、６０日以上震盪培養したが、いずれも共生藻
の増殖は見られなかった。また、一部は再び寒天で固め
たＣＡ培地に撒いたところ、約２０日で再びコロニーを
形成した。

【００４５】

【発明の効果】上述の実施例で例証した通り、本発明方
法により、除草剤パラコートに適宜に暴露すると、対数
期にあるミドリゾウリムシの共生藻を含まない株が生成
する。除草剤の動物毒性理論は完全には解明されていな
いが、本発明者等の観察では、共生藻はその宿主よりも
パラコートに対してより敏感であることを明瞭に示し
た。本発明者等の予備実験においては、本発明方法によ
り処理された定常期にあるミドリゾウリムシも共生藻を
全く有しなかった。これらの知見は、共生藻は宿主の生
育サイクルの段階を通じてパラコートに敏感であること
を示唆する。

【００４６】従来提案された方法により、ミドリゾウリ
ムシを暗所（図５）或いは光合成阻害剤（ＤＣＭＵ）に
暴露して生育が長引くと、共生藻が消滅しないことがあ
るにも拘わらず、本発明方法によれば、除草剤パラコー
トの添加後５日で共生藻は確実に然も短期間に消滅する
という顕著な効果が認められる。前述のジェニングスは
ミドリゾウリムシ中の内部共生藻は、藻よりもゾウリム
シが急速に繁殖し得るような過剰の食物を提供すること
によってミドリゾウリムシから完全に除去し得ることを
報告した。その結果得られる無藻ミドリゾウリムシはそ
のような一連の急速な分裂によって極めて老化する。然
し乍ら、本発明方法によれば、無藻ミドリゾウリムシは
老化することなく数日内に確立させることができ、更に
これらの確立した無藻ミドリゾウリムシの株は、正常な
ミドリゾウリムシと同等の生存率を示す。これらの結果
は、除草剤パラコートが、無藻ミドリゾウリムシ株を有
意な損傷を与えずに生成することを示唆する。

【００４７】また、過去の研究で、ボンフォード［Ｂｏ
ｍｆｏｒｄ Ｒ：Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ．，１２，２
２１−２２４（１９６５）］、ニース等，［Ｎｉｅｓｓ
ｅｔ ａｌ．：Ｐｌａｎｔａ．１５６，４７５−４８
０ （１９８２）〕は、共生藻以外にも自由生活性の藻
類がミドリゾウリムシに共生することを報告している。
しかし、自由生活性の藻類の種名が明らかにされておら
ず、共生を確立したとする基準も不明であるなど、不明
瞭な点が多い。本発明者等は、前記の応用例で述べたよ
うに、共生藻の他に種名の判っている藻類をミドリゾウ
リムシやその他のゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ）
に与え、その共生の有無を調べ、自由生活性の藻類がミ
ドリゾウリムシに共生できるのか、又ミドリゾウリムシ
以外のＰａｒａｍｅｃｉｕｍには藻類は共生できないの
か、即ち、共生における種の特異性を検討した。

【００４８】更に、無藻ミドリゾウリムシの共生藻によ
る感染は、研究の端緒を得た所であり、本発明方法によ
って得られた無藻ミドリゾウリムシは、動物細胞中の内
細胞生態における細胞間認識および伝達の性質を研究す
るのに極めて有用な信頼性ある試験を可能とすることが
期待される。このように、本発明方法は、ゾウリムシを
始め動物内細胞生態における感染過程を解明するための
頗る重要な研究材料を提供するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明方法により、定常期のミドリゾウリムシ
ＯＫ−３１２からのパラコートによる共生藻の除去比率
を示すグラフである。

【図２】本発明方法により、対数期のミドリゾウリムシ
ＯＫ−３１２からの、パラコートによる共生藻の除去比
率を示すグラフである。

【図３】本発明方法により、定常期のミドリゾウリムシ
ＨＫ−４８からの、パラコートによる共生藻の除去比率
を示すグラフである。

【図４】本発明方法により、対数期のミドリゾウリムシ
ＨＫ−４８からの、パラコートによる共生藻の除去比率
を示すグラフである。

【図５】従来公知の方法により、連続的暗所中、長期間
の飢餓状態下で培養したゾウリムシ（ＯＫ−３１２およ
びＨ−４）中の個体当たり共生藻の数を示すグラフであ
る。

【図６】本発明方法により処理したミドリゾウリムシ
（ＯＫ−３１２）中の共生藻に対するパラコートの影響
を示すグラフである。

【図７】未処理の共生藻を有するミドリゾウリムシ（Ａ
及びＢ）及び本発明方法によって創製された無藻ミドリ
ゾウリムシＯＫ−３１２（Ｃ及びＤ）のノマルスキー微
分干渉コントラスト映像（Ａ及びＣ）及びそれらの蛍光
映像（Ｂ及びＤ）の写真である。

【図８】共生藻のミドリゾウリムシへの再共生を示すグ
ラフである。本発明方法によって得られた無藻ミドリゾ
ウリムシは体内に数十個の共生藻を取り込み、引き続き
ａｌｇａｅ数が増加する。通常のゾウリムシは共生藻を
速やかに消化する。

【図９】ゾウリムシ１個体当たりのクロレラ（Ｃ．ｅｌ
ｌｉｐｓｏｉｄｅａ）個体数の経日変化を示すグラフで
ある。

【図１０】抗血清が共生藻の共生に及ぼす影響を示すグ
ラフである。

【図１１】抗血清がクロレラの共生に及ぼす影響を示す
グラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:22） (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 1/10 C12N 1/12 C12N 1/20

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 バクテリアを接種した培地を用いて、ミ
   ドリゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ ｂｒｕｓａｒ
   ｉａ）を、その内部共生藻を破壊し得る有効量で且つ該
   ミドリゾウリムシの生存許容量のパラコートの存在下に
   培養することを特徴とする無藻ミドリゾウリムシの創製
   方法。
2. 【請求項２】 前記バクテリアがクレブシエラ・ニュー
   モニアイ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
   ｅ）である請求項１の方法。
3. 【請求項３】 前記培地が野菜浸出液に少量の無機成分
   を含む半合成培地である請求項１の方法。
4. 【請求項４】 野菜浸出液がレタス浸出液であり、無機
   成分がカルシウムである請求項３の方法。
5. 【請求項５】 １０³ μｇ／ｌ〜１０⁵ μｇ／ｌの濃度
   のパラコートの存在下に少なくとも５日間培養する請求
   項１の方法。
6. 【請求項６】 パラコートの濃度を少なくとも１０² μ
   ｇ／ｌとなし、少なくとも１０日間培養する請求項１の
   方法。
7. 【請求項７】 パラコートの濃度を少なくとも１０¹ μ
   ｇ／ｌとなす請求項６の方法。
8. 【請求項８】 前記培養期間を少なくとも１５日間とな
   す請求項６または７の何れか１項の方法。
9. 【請求項９】 前記請求項１〜８の何れか１項によって
   創製された無藻ミドリゾウリムシ。